KR20240108061A

KR20240108061A - 케스토스를 포함하는 피부 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20240108061A
Application number: KR1020220191283A
Authority: KR
Inventors: 사순옥; 김고은; 류경헌; 박세영; 박지원; 한정숙; 황환주
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2024-07-09

Abstract

본 발명은 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물로서, 구체적으로 피부 광노화 개선 용도, 및 히알루로산 발현량 증가에 따른 피부 탄력 개선 용도에 관한 것이다.

Description

케스토스를 포함하는 피부 개선용 조성물{Composition for skin improvement comprising kestose}

본 발명은 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물, 그리고, 상기 조성의 광노화 개선 용도, 광노화 예를 들면 UV에 대한 피부 손상의 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.

최근 프로바이오틱스가 장내 유익균을 증식하고 유해균을 억제하는 효능으로 아토피 증상 완화, 면역력 강화 등에 효과가 좋다는 연구결과들에 따라 건강보조식품으로 주목을 받고 있다.

그러나, 프로바이오틱스는 일부 장막 손상, 면역저하 환자 등에서는 오히려 면역력을 악화시키는 등의 부작용이 우려돼 복용 시 주의가 필요하다는 보고가 되고 있다.

최근에는 프로바이오틱스 (probiotics) 라는 용어 이외에 프로바이오틱스의 먹이가 되는 영양분을 의미하는 것으로 장내 프로바이오틱스를 활성화함으로써 이의 기능을 극대화시킬 수 있는 프리바이오틱스(prebiotics)에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

프리바이오틱스 대부분은 올리고당이나 다당체의 형태를 띠는데 대표적으로 과거에는 이눌린, 프락토올리고당 등의 식이섬유가 비피더스균 등의 유익균의 먹이로 주로 활용되고 있다.

본 발명은 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 자외선에 의한 피부 상태 악화를 예방 또는 개선용 조성물로서, 피부 항산화, 항염, 보습, 피부 주름 개선, 피부 재생 활성, 및/또는 피부 탄력회복을 갖는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 광노화 개선 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 광노화의 예방, 치료 또는 개선 용도, 및 광노화로 인한 염증 조절용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 히알루로난 생합성증가에 따른 피부 탄력 개선 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 개선 용도에 관한 것이다. 상기 피부 상태는, 자외선에 의한 피부세포 손상, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 생성, 피부 산화, 피부 염증, 피부 광노화, 피부 주름, 및 피부 탄력감소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태일 수 있다.

본 발명의 구체예는, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 광노화 개선 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 광노화의 예방, 치료 또는 개선 용도, 및 광노화로 인한 염증 조절용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 구체예는, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 광노화의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 피부 광노화는 자외선에 의한 피부세포 손상, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 생성, 및/또는 피부 산화 포함한다.

추가 구체예는, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 광노화로 인한 염증 조절용 조성물에 관한 것이다.

추가 구체예는, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 탄력 개선용 조성물,자세하게는, 히알루론산 생합성 증가에 의한 피부 탄력 개선용 조성물, 피부 보습용 조성물, 피부 재생용 조성물, 또는 피부 주름개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 피부 상태 개선용 조성물은, 피부 외용, 경구 섭취 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 의약 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로 적용될 수 있다.

본 명세서에서, 피부 상태 개선은 케스토스의 자외선에 의한 피부세포의 보호능, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)의 제거능, 피부 항산화능, 피부 항염증, 피부 항광노화능, 피부 콜라겐 합성능, 및 피부 히알루로난 생합성의 증가능으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 효능에 의한 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 케스토스의 활성 산소종 제거능은, ROS로 인해 활성화되는 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자로서 PI3K, AKT, Nrf2 및 HO-1로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량이 증가하는 것이거나,

상기 항염증능은, 염증반응을 조절하는 NF-κB signaling과 관련된 인자로서p50, p65, TNF-α, IL-6, 및 COX-2로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량이 증가한 것이거나,

상기 피부 콜라겐 합성능은, 콜라겐을 분해 및 조절하는 MAPK-ERK/JNK/p38/AP-1 signaling과 관련된 인자로서 p38, ERK, JNK, c-Jun, c-Fos, MMP-1, MMP-2, MMP-3, 및 MMP-9 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현량 조절에 의한 것이거나,

상기 피부 콜라겐 합성능은, 콜라겐 합성을 유도하는 TGF-β1/Smad signaling과 관련된 인자로서 TGF-β1, Smad2/3, COL1A1, 및 COL2A1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량 조절에 의한 것이거나, 또는

상기 피부 히알루로난 생합성의 증가능은 히알루론산 합성과 관련된 인자로서HAS-1, HAS-2 및 HAS-3 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량 조절에 의한 것일 수 있다.

피부의 외인성 노화는 주로 자외선(UV) 조사로 인한 광손상 때문이다. UV 조사는 인간 피부의 급성 및 만성 질환의 주요 환경 요인입니다. 만성적인 UV 노출은 피부의 조기 노화, 이른바 광노화의 주요 원인이며 임상적으로 두꺼워짐, 거칠음, 거친 주름 및 얼룩덜룩한 색소침착을 특징으로 한다. UV에 의한 피부의 조직학적 변화에는 콜라겐 교차 결합, 비정상적인 탄성 섬유의 과도한 침착, 글리코사미노글리칸의 증가가 포함된다.

자외선은 UVA(320-400 nm), UVB(280-320 nm) 및 UVC(100-280 nm)로 구성된다. UVB는 DNA를 직접 손상시키고 피리미딘 이량체의 형성을 유도하는 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다. 활성 산소 종은 또한 DNA 복구 및 항산화 방어를 위한 신호를 활성화하고 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 발현을 유도한다. MMP는 노화와 같은 조직 파괴 과정, 예를 들면 피수 노화, 관절염 등과 구조적으로 관련된 매트릭스 분해 효소 계열에 포함된다. MMP는 또한 콜라겐 및 기타 세포외 기질 단백질을 분해하며, MMP-1은 피부의 콜라겐 유형 I, II 및 III을 표적으로 한다.

UVB는 활성산소종(ROS)의 생성을 자극하여 산화 스트레스와 피부 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 NF-kB(nuclear factor kappa B)와 AP-1(activator protein 1)과 같은 전사 인자의 상향 조절이 UVB 처리된 세포에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 위에서 언급한 효과는 ECM의 분해와 염증 사이토카인 생산의 유도로 이어진다. 진피 세포외 기질은 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 젤라틴 및 글리코사미노글리칸으로 구성된다. 콜라겐은 피부 결합 조직의 주요 구조 단백질로서, 진피 섬유아세포에서 합성되며 피부의 힘과 탄력을 부여하는 역할을 한다. 또한 히알루로난은 결합 조직에 널리 분포하는 주요 글리코사미노글리칸이며, 진피에서 HA는 높은 수분 보유력과 점도를 이용하여 피부 수분 조절과 세포 구조 유지를 담당하며, 이러한 점은 HA가 건강한 피부를 유지하는 데 중요한 물질임을 나타낸다.

자외선에 의한 광노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다. 또한, 전염증 사이토카인은 콜라겐의 합성을 방해하고, 콜라겐의 붕괴를 촉진시킨다. 타입 I 콜라겐은 연결 조직의 세포외 기질에서 가장 풍부한 단백질이다. 세포외 기질에는 타입 III, V, 및 VII 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 파이브로넥틴과 같은 다른 유형의 단백질을 포함한다.

본 발명에서 케스토스의 피부 상태 개선 효능은 구체적으로 케스토스에 대한 세포독성평가 및 UVB로부터 손상된 세포보호 효능 확인하였다. 구체적으로 Epidermal keratinocyte (HaCaT) 세포에 케스토스를 농도별로 처리하여 배양한 뒤 MTT assay를 진행하여 UVB 조사에 따른 HaCaT 세포에서 독성 없는 케스토스 농도에서 세포에 미치는 영향을 평가하였으며, UVB 대조군보다 케스토스는 약 20% 높은 세포 생존율을 보이며 UVB에 의한 손상을 효과적으로 보호함을 확인하였다.

또한, 케스토스의 reactive oxygen species(ROS) 제거 효능의 평가는, 2’,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) fluorescent probe를 사용하여 억제 효과를 확인한 결과, HaCaT 세포에 DCFH-DA 형광을 반응시킨 후 UVB에 활성화된 ROS에 대한 영향을 확인한 결과, UVB 대조군보다 케스토스 처리 시 약 30%의 ROS를 감소하는 것을 확인하였다.

케스토스의 UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 항산화 효능은, ROS로 인해 활성화되는 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자 (PI3K, AKT, Nrf2, HO-1)를 RT-PCR과 Western blot을 통해 유전자 및 단백질 발현량으로 분석하였다. 상기 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자의 발현량의 분석 결과, HaCaT세포에 UVB만 처리한 경우AKT와 PI3K인자는 증가하였고, Nrf2와 HO-1 인자 발현량이 감소하였으나, 스토스를 처리한 경우, AKT, PI3K, Nrf2, HO-1인자 발현이 케스토스를 처리하지 않은 대조구 (control)와 비슷한 양상을 보여 산화능 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다.

또한, UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 항염증 효능을 확인하고자, 염증반응을 조절하는 NF-κB signaling과 관련된 인자 (p50, p65, TNF-α, IL-6, COX-2)를 RT-PCR를 통해 유전자 발현량을 확인하였다. 그 결과 염증반응 조절 확인을 위해 활성화된 NF-κB 관련 인자 p50, p65, TNF-α, IL-6, COX-2의 유전자 발현은 케스토스에 의해 감소하였으며 그 중, 10 mM에서 우수한 항염증 효과가 있음을 확인하였다.

UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 항노화 효능을 평가하고자, 콜라겐을 분해 및 조절하는 MAPK-ERK/JNK/p38/AP-1 signaling과 관련된 인자 (p38, ERK, JNK, c-Jun, c-Fos, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9)의 단백질 발현량을 확인하였다. 대조구 (UVB)에서는 MAPK 단백질 인산화 (p-ERK, p-JNK, p-p38) 발현 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 케스토스 농도 별로 처리하였을 때 인산화 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 단백질 발현 밀도를 계산한 결과에서도 p-ERK/ERK, p-JNK/JNK, p-p38/p38 발현이 케스토스는 농도가 증가함에 따라 유의하게 발현량이 감소하는것을 확인하였다. 또한, UVB에 의한 ROS는 인산화된 ERK, JNK, p38 시그널을 통해 MAPK signaling pathway가 활성화되며, 케스토스에 의해 MAPK signaling 발현량을 유의하게 감소함을 확인하였다.

UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 피부보호 효능을 평가하고자, 콜라겐 합성을 유도하는 TGF-β1/Smad signaling과 관련된 인자 (TGF-β1, Smad2/3, COL1A1, COL2A1)의 발현량을 확인하였다. UVB 노출은 TGF-β1을 정상 세포보다 약 54 % 감소시켰다. 또한 UVB 노출 및 케스토스 처리를 수행한 실험군에서 TGF-β1 생산은 UVB만 조사한 세포보다 약 178%를 증가시켜, 상당히 높았다(도 10). TGF-β1 발현에 의한 Smad signaling을 확인한 결과, 케스토스에 의해 발현량이 증가하였고, 이것은 콜라겐 생성에 관여하는 인자인 형질전환 성장 인자(TGF)-β1의 수준을 증가를 나타낸다. 자세하게는, p-Smad 2/3 / Smad 2/3은 TGF-β1에 의해 활성화 되는 인자로 UVB 노출은 p-Smad 2/3 / Smad 2/3을 정상 세포보다 약 38 % 감소시켰다. 또한 UVB 노출 및 케스토스 처리를 수행한 실험군에서 p-Smad 2/3 / Smad 2/3을 UVB만 조사한 세포보다 약 50 %를 증가시켰다 (도 11). 이러한 결과는 자외선에 의해 저해되는 TGF-β1/Smad 신호전달 경로 전달 인자가 케스토스에 의해 증가됨을 입증하였으며 광노화 개선 효능을 확인하였다.

UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 히알루로난의 생합성과 관련된 인자 (HAS-1, HAS-2, HAS-3)의 발현량을 분석하였다. 피부 보습에 도움을 주는 히알루로난 생합성 관련 유전자 HAS-1, HAS-2, HAS-3의 발현량이 케스토스 10 mM 농도에서 유의하게 증가함을 확인하였다. 따라서, 케스토스는 히알루로난 생합성과 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 히알루로난 생합성을 촉진하고, 이에 피부 구조 및 기능 유지, 피부 보습, 피부 재생 및 피부 탄력을 증가시키는 효능을 가짐을 확인하였다.

본 발명은 피부상태 개선용 조성물의 유효성분으로서 케스토스 또는 1-케스토스를 포함하며, 케스토스는 케스토스 단독 또는 이를 포함하는 당 조성물로 사용될 수 있다. 케스토스는 액상 또는 분말 형태로 사용될 수 있으며, 상기 분말은 비결정 또는 결정일 수 있다. 상기 케스토스는 시판 제품을 구입하여 사용할 수 있거나 소정의 원료를 이용하여 제조한 것을 사용할 수도 있다.

상기 당 조성물의 일 예는 케스토스-함유 프락토올리고당 (fructo-oligosaccharide, FOS)일 수 있다. FOS는 β2→1 결합에 의해 수크로오스 분자에 연결된 1 내지 9개의 프룩토오스 잔기를 가진 선형 사슬로 구성되어 있다. 상기 케스토스-함유 프락토올리고당은 1-케스토스이 주성분인 것이 바람직하고, 예를 들면 고함량의 1-케스토스(1-kesotse, GF2)를 포함하고, 니스토스(Nystose, GF3) 및 1-F-프락토퓨라노실니스토스(1-F-Fructosyl nystose, GF4)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 사용 가능한 케스토스 또는 케스토스를 포함하는 당 조성물은 특별히 제한이 없으며, 통상 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 설탕을 기질로 하여 제조할 수 있다.

상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소는, 설탕을 포함하는 기질로부터 케스토스를 함유하는 프락토올리고당을 전환하는 활성을 가지는 효소로, 예를 들어 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 균주, 피키아 파리노사 (Pichia farinose) 균주, 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 밀레로지마 파리노사 (Millerozyma farinose), 및 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae) 균주로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 효소일 수 있다.

본 발명에 있어서, 케스토스의 섭취량(투여량)으로서는, 예를 들면 케스토스의 섭취량(투여량)으로서는, 예를 들면 0.01∼0.34g/ｋg체중, 바람직하게는 0.01∼0.30g/ｋg체중, 더 바람직하게는 0.01∼0.24g/ｋg체중, 0.03∼0.34g/ｋg체중, 0.05∼0.34g/ｋg체중, 0.06∼0.34g/ｋg체중, 0.03∼0.24g/ｋg체중, 0.05∼0.24g/ｋg체중, 0.06∼0.24g/ｋg체중 0.03 ~ 0.30 g/kg체중, 0.05 ~ 0.30 g/kg체중, 0.06∼0.30g/ｋg체중, 0.03 ~ 0.26 g/kg체중, 0.05 ~ 0.26 g/kg체중, 또는 0.06 ~ 0.26 g/kg체중 등을 들 수 있다. 이러한 섭취량은, 1일 1회에 한하지 않고 복수 회로 분할하여 섭취하더라도 좋다.

케스토스를 그대로 혹은 음식물이나 의약품의 형태로 인간 또는 동물에게 경구섭취시키는 방법을 들 수 있다.

상기 케스토스 조성물에서 활성성분으로 케스토스를 60 kg 성인을 기준으로 하루에 총 1g 내지 30g, 1g 내지 20 g, 1g 내지 15 g, 2 g 내지 15 g, 1g 내지 10 g, 2g 내지 10 g, 1 내지 7 g, 2 내지 7 g 을 함유하는 조성물일 수 있다.

또한 상기 케스토스 조성물은 케스토스, 니스토즈, 및 프락토퓨라노실니스토즈를 합한 양으로 400 mg/ g이상, 500 mg/ g이상, 800 mg/ g이상, 또는 900 mg/ g이상 함유하는 조성물일 수 있다.

본 발명에 사용 가능한 케스토스는 액상 또는 분말 형태를 모두 사용할 수 있으며, 다양한 함량으로 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있다. 상기 케스토스는 단독 성분으로 사용하거나, 다른 당류를 함께 포함하는 혼합 조성물로 사용될 수 있으며, 예를 들면 프락토올리고당(FOS)일 수 있다.

상기 액상 또는 분말 형태의 케스토스는 총고형분을 기준으로 50(w/w) % 이상, 60(w/w) % 이상, 70(w/w) % 이상, 80(w/w) % 이상, 바람직하게는 85(w/w) % 이상의 함량을 갖는 조성물일 수 있다. 또한, 결정 형태의 케스토스는 총고형분을 기준으로 98% 이상의 함량을 갖는 조성물일 수 있다.

케스토스를 함유하는 의약품이나 의약부외품, 서플리먼트의 제형은 특별하게 한정되지 않고, 투여방법에 적합한 제형을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면 경구투여의 경우에는, 가루약, 정제, 당의제, 캡슐제, 과립제, 드라이 시럽제, 물약(液劑), 시럽제, 드롭제, 드링크제 등의 고형 또는 액상 제형으로 할 수 있다.

케스토스는, 각종 음식물이나 식품첨가물, 동물사료의 통상의 제조과정에 첨가하여 사용할 수 있다. 1-케스토스의 감미도는 30으로, 그 미질(quality of taste))·물성·가공성은 자당에 가깝기 때문에, 각종 음식물의 제조과정에 있어서 설탕의 일부 또는 전부를 1-케스토스로 치환하는 등, 설탕과 마찬가지로 취급하여 각종 음식물, 음료, 식품 첨가물, 의약, 또는 사료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 구체적인 태양으로서는, 예를 들면 음료, 유제품, 식용으로 제공하는 과립, 페이스트, 조미료, 레토르트식품, 베이비푸드(baby food), 발효식품, 보존식, 수산가공품, 식육가공품, 곡식가공품 등의 가공식품, 식품첨가물, 건강식품, 동물사료 등을 들 수 있다.

본 발명은 부작용이나 안전성을 거의 걱정하지 않고, 간편하고 또한 효과적으로 인간이나 동물의 광노화를 개선시킴으로써 피부 면역을 개선시킬 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 케스토스에 대한 세포독성평가 및 UVB로부터 손상된 세포보호 효능을 보여주는 도면이다.
도 2는 실시예 2에 따라 DCFH-DA assay를 통한, 케스토스의 ROS 제거능을 보여주는 도면이다.
도 3은 실시예 3에 따라 ROS로 인해 활성화되는 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자 (PI3K, AKT, Nrf2, HO-1)를 RT-PCR과 Western blot을 통해 유전자 및 단백질 발현량을 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 실시예 4에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항염증 효능으로서, 염증반응을 조절하는 NF-κB signaling과 관련된 인자를 RT-PCR를 통해 유전자 발현량을 분석한 도면이다.
도 5 및 도 6은, 실시예 5에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, 케스토스의 MAPK signaling 인자의 발현량에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.
도 5 및 도 6은, 실시예 5에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, 케스토스의 MAPK signaling 인자의 발현량에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.
도 7 및 도 8은, 실시예 5에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, 케스토스의 activator protein (AP)-1 signaling 인자의 발현량에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.
도 9는 실시예 6에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 피부보호 효능으로서, 케스토스의 MMP 발현 감소능을 보여주는 도면이다.
도 10은 실시예 7에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, TGF-β1/Smad signaling 인자의 발현량을 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11은 실시예 7에 따라 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 콜라겐 합성 단백질 발현량 증가를 보여주는 도면이다.
도 12는 실시예 8에 따라 히알루론산 합성과 관련된 인자 (HAS-1, HAS-2, HAS-3)의 발현량을 분석하여 케스토스의 히알루론산 생합성 증가능을 평가한 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: 케스토스의 UV에 의한 손상 보호능 평가

케스토스에 대한 세포독성평가 및 UVB로부터 손상된 세포보호 효능을 확인하고자, HaCaT 세포에 UVB와 농도별 케스토스를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양한 뒤 MTT assay로 측정하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 96-well plates에 5 × 10⁴ cells/well 농도로 seeding하고 24시간동안 5% CO₂와 37℃의 조건으로 배양하였다. 40 mJ UVB와 동시에 케스토스 4 mM, 6 mM, 10 mM, 14 mM, 18 mM의 농도별로 각각 처리하여 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포배지를 제거하고 0.5 mg/ml의 MTT 용액을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 200 μl/well을 첨가하여 10분 동안 상온에서 formazan을 용해한 후 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포활성 (%)을 산출하였고, 시료를 첨가한 세포의 활성과 첨가하지 않은 세포의 활성을 비교하여 MTT를 측정하였다.

상기 실험결과 얻어진 결과로서 케스토스에 대한 세포독성평가 및 UVB로부터 손상된 세포보호 효능을 나타내는 것으로서, 구체적으로 케스토스 농도별 및 UVB 조사에 따른 독성 평가를 도 1에 나타냈다.

케스토스 4 mM, 6 mM, 10 mM, 14 mM, 18 mM에 대하여 세포독성 여부를 확인하였으며, 4 mM, 6 mM, 10mM 농도에 독성이 없는 것을 확인하였다.

또한, UVB 조사에 따른 HaCaT 세포에서 독성 없는 케스토스 농도에서 세포에 미치는 영향을 평가하였으며, UVB 대조군보다 케스토스는 약 20% 높은 세포 생존율을 보이며 UVB에 의한 손상을 효과적으로 보호하는 것을 확인하였다.

실시예 2: 캐스토스의 ROS 제거능 평가

케스토스의 reactive oxygen species(ROS) 제거 효능 확인하고자, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay를 통한 ROS 활성 제거 능력을 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 96-well plates에 5 × 10⁴ cells/well 농도로 seeding하고 24시간동안 5% CO₂와 37℃의 조건으로 배양하였다. 40 mJ UVB와 동시에 케스토스 4 mM, 6 mM, 10 mM, 14 mM, 18 mM의 농도별로 각각 처리하여 12시간동안 배양하였다. 상기 배양된 세포배지를 제거하고 HaCaT 배양배지인 DMEM배지에 희석된 DCFH-DA 20 μM 농도를 각 well에 첨가하여 30분 동안 5% CO₂와 37℃의 조건으로 배양하였다. PBS로 씻어낸 세포를 형광 흡광도를 이용하여 excitation 488 nm와 emission 535 nm에서 ROS 생성량을 측정하였다.

상기 실험결과 얻어진 결과로서 DCFH-DA assay를 통한 케스토스의 ROS 활성 제거능의 분석 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2에서 대조구 (-)는 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 상기 ROS 활성 제거능을 분석한 결과를 나타내고, 대조구 (+)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과로부터, HaCaT 세포에 DCFH-DA 형광을 반응시킨 후 UVB에 활성화된 ROS에 대한 영향을 확인한 결과, UVB 대조군보다 케스토스 처리 시 약 30%의 ROS를 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 3: 케스토스의 UV에 의한 항산화능 평가

(ROS에 의해 억제된 항산화능의 증가)

UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 항산화 효과 확인하고자, ROS로 인해 활성화되는 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자 (PI3K, AKT, Nrf2, HO-1)를 RT-PCR 유전자 발현량을 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 24-well plates에 2 × 10⁵ cells/well 농도로 seeding하고 24시간동안 5% CO₂와 37℃의 조건으로 배양하였다. 40 mJ UVB와 동시에 케스토스 4 mM, 6 mM, 10 mM, 14 mM, 18 mM의 농도별로 각각 처리하여 12시간동안 배양하였다. 배양 후, PBS로 세포를 세척 후, 세포는 Trizol을 이용하여 RNA 추출 후 cDNA 합성키트를 이용하여 cDNA로 합성 후 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자 (PI3K, AKT, Nrf2, HO-1) 유전자에 맞게 제작된 primer를 이용하여 qRT-PCR를 방법으로 유전자의 발현량을 확인하였다. 사용된 PCR 조건은 denaturation 95℃에서 15초, annealing 62℃ 30초 동안 실시하였고, 72℃에서 1분간 elongation 과정을 거쳤다. 로 실험하였다.

상기 실험결과 얻어진 결과로서 ROS로 인해 활성화되는 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자 (PI3K, AKT, Nrf2, HO-1)를 RT-PCR과 Western blot을 통해 유전자 및 단백질 발현량을 분석한 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3에서 대조구 (-)는 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (+)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과에 따르면, 케스토스에 의해 산화능 관련 인자 PI3K, AKT, Nrf2, HO-1의 유전자 발현을 감소하였으며, 이에 케스토스는 우수한 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 구체적으로 HaCaT세포에 UVB만 처리하여 발현량을 확인한 결과, AKT와 PI3K인자는 증가하였고, Nrf2와 HO-1 인자 발현량이 감소하였다. 케스토스를 처리하였을 때, AKT, PI3K, Nrf2, HO-1인자 발현이 케스토스를 처리하지 않은 대조구 (control)와 비슷한 양상을 보여 산화능 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다(p < 0.001). 이러한 결과를 통해 케스토스의 항산화 효과를 확인하였다.

실시예 4: UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 항염증 효과 확인

염증반응을 조절하는 NF-κB signaling과 관련된 인자 (p50, p65, TNF-α, IL-6, COX-2)를 RT-PCR를 통해 유전자 발현량을 확인하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 24-well plates에 2 × 10⁵ cells/well 농도로 seeding하고 24시간동안 5% CO₂와 37℃의 조건으로 배양하였다. 40 mJ UVB와 동시에 케스토스 4 mM, 6 mM, 10 mM, 14 mM, 18 mM의 농도별로 각각 처리하여 12시간동안 배양하였다. 배양 후, PBS로 세포를 세척 후, 세포는 Trizol을 이용하여 RNA 추출 후 cDNA 합성키트를 이용하여 cDNA로 합성 후 염증과 관련된 인자 (p50, p65, TNF-α, IL-6, COX-2) 유전자에 맞게 제작된 primer를 이용하여 qRT-PCR를 방법으로 유전자의 발현량을 확인하였다. 사용된 PCR 조건은 denaturation 95℃에서 15초, annealing 62℃ 30초 동안 실시하였고, 72℃에서 1분간 elongation 과정을 거쳐 실험하였다.

상기 실험결과 얻어진 결과로서 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항염증 효능으로서, 염증반응을 조절하는 NF-κB signaling과 관련된 인자를 RT-PCR를 통해 유전자 발현량을 분석한 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4에서 대조구 (-)는 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (+)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과에 따르면, 염증반응 조절 확인을 위해 활성화된 NF-κB 관련 인자 p50, p65, TNF-α, IL-6, COX-2의 유전자 발현은 케스토스에 의해 감소하였으며 그 중, 10 mM에서 우수한 항염증 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5: UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 항노화 효능 평가

5-1: MAPK signaling 인자의 발현능 감소

콜라겐 분해 및 조절하는 MAPK signaling 유전자 및 단백질 발현량을 확인하고자 하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 24-well plates에 2 × 10⁵ cells/well 농도로 seeding하고 24시간동안 5% CO₂와 37℃의 조건으로 배양하였다. 40 mJ UVB와 동시에 케스토스 4 mM, 6 mM, 10 mM, 14 mM, 18 mM의 농도별로 각각 처리하여 12시간동안 배양하였다. HaCaT 세포는 protease inhibitor가 포함된 RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 95℃에서 5분간 반응시켜 전처리한 후, SDS-PAGE에서 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 이후 PVDF membrane에 단백질을 이동시킨 후, 5 % (w/v) BSA 용액에서 1시간 blocking 과정을 거쳤고, 각 인자의 1차 항체를 5 % (w/v) BSA 용액으로 1:1000으로 희석하고 4℃에서 하루동안 반응시켰다. 1차 항체 반응시킨 membrane은 0.1% (v/v) Tween 20이 포함된 tris-buffered saline 용액을 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 밴드는 LAS 4000 system을 사용하여 감지하였고 발현 밀도는 이미지 감지 소프트웨어 (image J software)를 사용하여 계산하여 발현량을 계산하였다.

상기 실험결과 얻어진 결과로서 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, 케스토스의 MAPK signaling 인자의 발현량에 미치는 영향을 분석한 결과를 도 5 및 도 6에 나타냈다. 도 5 및 도 6에서, UVB 조사에 따른 MAPKs phosphorylation signal pathway 발현량 비교를 나타낸다. 도 6에서 대조구(control)은 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (UVB)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과에 따르면, 대조구 (UVB)에서는 MAPK 단백질 인산화 (p-ERK, p-JNK, p-p38) 발현 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 케스토스 농도 별로 처리하였을 때 인산화 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 단백질 발현 밀도를 계산한 결과에서도 p-ERK/ERK, p-JNK/JNK, p-p38/p38 발현이 케스토스는 농도가 증가함에 따라 유의하게 발현량이 감소하는것을 확인하였다. (p < 0.0001; 케스토스 10 mM). 또한, UVB에 의한 ROS는 인산화된 ERK, JNK, p38 시그널을 통해 MAPK signaling pathway가 활성화되며, 케스토스에 의해 MAPK signaling 발현량을 유의하게 감소함을 확인하였.

5-2: activator protein (AP)-1 signaling 인자의 발현량

MAPK signaling은 activator protein (AP)-1 signaling pathway를 활성화함에 따라 UVB 대조군에서 subunit인 c-Fos, c-Jun의 발현량이 증가하지만, 케스토스는 c-Fos의 발현량이 감소함 하지만 c-Jun의 발현량은 UVB 대조군과 차이가 없었다.

구체적으로, HaCaT 세포는 protease inhibitor가 포함된 RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 95℃에서 5분간 반응시켜 전처리한 후, SDS-PAGE에서 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 이후 PVDF membrane에 단백질을 이동시킨 후, 5 % (w/v) BSA 용액에서 1시간 blocking 과정을 거쳤고, 각 인자의 1차 항체를 5 % (w/v) BSA 용액으로 1:1000으로 희석하고 4℃에서 하루동안 반응시켰다. 1차 항체 반응시킨 membrane은 0.1% (v/v) Tween 20이 포함된 tris-buffered saline 용액을 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 밴드는 LAS 4000 system을 사용하여 감지하였고 발현 밀도는 이미지 감지 소프트웨어 (image J software)를 사용하여 계산하여 발현량을 계산하였다.

상기 실험결과 얻어진 결과로서 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, 케스토스의 activator protein (AP)-1 signaling 인자의 발현량에 미치는 영향을 분석한 결과를 도 7 및 도 8에 나타냈다. 도 8에서 대조구(control)은 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (UVB)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과에 따르면, 대조구 (UVB)에서는 AP-1 신호 단백질인 c-Fos, c-Jun 및 인산화된 c-Fos, c-Jun의 발현이 증가하였지만, 케스토스를 처리하였을 때 c-Fos의 인산화를 약화시켰다.

단백질 발현 밀도를 계산한 결과에서도 케스토스 처리는 c-Fos/Fos 발현을 감소함을 보였다 (p < 0.0001). 하지만, 케스토스 처리는 p-c-Jun/c-Jun의 발현이 감소함을 보였다. 이는 MAPK 시그널에 의해 활성화하는 AP-1 염증반응에서 케스토스 처리에 의해 억제한다는 것을 입증하였다.

실시예 6: UVB로 손상된 HaCaT 세포에 대한 케스토스의 피부보호 효과 확인

케스토스의 MMP 발현 감소능을 통해 피부 광노화 억제 효능을 평가하였다.

상기 실험결과로서 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 피부보호 효능으로서, 케스토스의 MMP 발현 감소능을 도 9에 나타냈다. 도 9에서 대조구 (-)는 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (+)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과에 따르면, MMPs 발현량은 케스토스에 의해 감소하였으며, 광노화로 인한 피부 노화를 억제하였으며, 자세하게는 기저막의 I형 콜라겐을 분해 역할과 기저막 세포파괴에 가장 중요한 역할을 하는 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9의 유전자 발현량을 확인한 결과, UVB에 의해 증가된 발현량이 케스토스 농도 별 처리에 의해 감소하였으며, 10 mM에서 MMP-1 (p < 0.0001), MMP-2 (p < 0.05), MMP-3 (p < 0.001), MMP-9 (p < 0.001)의 유전자 발현이 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 케스토스가 자외선에 의한 노화에 효과가 있을 것으로 보인다.

실시예 7: UVB로 손상된 HaCaT 세포를 이용한 케스토스의 콜라겐 합성능 평가

7-1: TGF-β1/Smad signaling 유전자의 단백질 발현량 증가

콜라겐 합성을 유도하는 TGFβ1/Smad signaling 유전자 및 단백질 발현량을 확인하였다.

상기 실험결과로서 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 항노화 효능으로서, TGF-β1/Smad signaling 인자의 발현량을 분석한 결과를 도 10에 나타냈다. 도 10에서 대조구(control)은 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (UBV)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험결과에 따르면, UVB 노출은 TGF-β1을 정상 세포보다 약 54 % 감소시켰다. 또한 UVB 노출 및 케스토스 처리를 수행한 실험군에서 TGF-β1 생산은 UVB만 조사한 세포보다 약 178%를 증가시켜, 상당히 높았다(도 10).

TGF-β1 발현에 의한 Smad signaling을 확인한 결과, 케스토스에 의해 발현량이 증가하였고, 이것은 콜라겐 생성에 관여하는 인자인 형질전환 성장 인자(TGF)-β1의 수준을 증가를 나타낸다. 자세하게는, p-Smad 2/3 / Smad 2/3은 TGF-β1에 의해 활성화 되는 인자로 UVB 노출은 p-Smad 2/3 / Smad 2/3을 정상 세포보다 약 38 % 감소시켰다. 또한 UVB 노출 및 케스토스 처리를 수행한 실험군에서 p-Smad 2/3 / Smad 2/3을 UVB만 조사한 세포보다 약 50 %를 증가시켰다 (도 11). 이러한 결과는 자외선에 의해 저해되는 TGF-β1/Smad 신호전달 경로 전달 인자가 케스토스에 의해 증가됨을 입증하였으며 광노화 개선 효능을 확인하였다.

7-2: 케스토스의 콜라겐 합성 단백질 발현량 증가

TGFβ1/Smad signaling에 의해 생성되는 콜라겐 합성 단백질 COL1A1, COL2A1 유전자 발현량을 확인한 결과, 케스토스 6 mM, 10 mM에서 모든 단백질 발현량이 증가함을 확인하였다.

상기 실험결과로서 UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 케스토스의 콜라겐 합성 단백질 발현량 증가를 보여주는 결과를 도 11에 나타냈다. 도 11에서 대조구 (-)는 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (+)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

실시예 8: 케스토스의 히알루로난 생합성 증가능 평가

피부 구조 및 기능 유지 역할을 하는 히알루로난 생합성과 관련된 인자에 대한 케스토스의 영향을 시험하고자, UVB로 손상된 HaCaT 세포에서 대한 케스토스의 HAS-1, HAS-2, HAS-3의 발현량을 분석하였다.

상기 실험결과로서 히알루로난 생합성과 관련된 인자 (HAS-1, HAS-2, HAS-3)의 발현량을 분석하여 케스토스의 히알루로난 생합성증가능을 평가한 결과를 도 12에 나타냈다. 도 12에서 대조구 (-)는 UVB 조사를 수행하지 않은 HaCaT 세포에서 실험결과를 분석한 것이고, 대조구 (+)는 상기 실험군과 동일하게 UVB 조사를 수행한 HaCaT 세포에서 케스토스를 처리하지 않은 실험군을 의미한다.

상기 실험 결과에 따르면, 피부 보습에 도움을 주는 히알루로난 생합성 관련 유전자 HAS-1, HAS-2, HAS-3의 발현량이 케스토스 10 mM 농도에서 유의하게 증가함을 확인하였다. 따라서, 케스토스는 히알루로난 생합성과 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 히알루로난 생합성을 촉진하고, 이에 피부 구조 및 기능 유지, 피부 보습, 피부 재생 및 피부 탄력을 증가시키는 효능을 가짐을 확인하였다.

Claims

케스토스를 유효성분으로 포함하는, 피부 상태의 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피부 상태는, 자외선에 의한 피부세포 손상, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS) 생성, 피부 산화, 피부 염증, 피부 광노화, 피부 주름, 및 피부 탄력감소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 케스토스의 자외선에 의한 피부세포의 보호능, 활성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)의 제거능, 피부 항산화능, 피부 항염증, 피부 항광노화능, 피부 콜라겐 합성능, 및 피부 히알루로난 생합성의 증가능으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 효능에 의한 것인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 활성 산소종 제거능은, ROS로 인해 활성화되는 Nrf2/HO-1 signaling과 관련된 인자로서 PI3K, AKT, Nrf2 및 HO-1로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량이 증가하는 것이거나,
상기 항염증능은, 염증반응을 조절하는 NF-κB signaling과 관련된 인자로서p50, p65, TNF-α, IL-6, 및 COX-2로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량이 증가한 것이거나,
상기 피부 콜라겐 합성능은, 콜라겐을 분해 및 조절하는 MAPK-ERK/JNK/p38/AP-1 signaling과 관련된 인자로서 p38, ERK, JNK, c-Jun, c-Fos, MMP-1, MMP-2, MMP-3, 및 MMP-9 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현량 조절에 의한 것이거나,
상기 피부 콜라겐 합성능은, 콜라겐 합성을 유도하는 TGF-β1/Smad signaling과 관련된 인자로서 TGF-β1, Smad2/3, COL1A1, 및 COL2A1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량 조절에 의한 것이거나, 또는
상기 피부 히알루로난 생합성의 증가능은 히알루론산 합성과 관련된 인자로서HAS-1, HAS-2 및 HAS-3 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현량 조절에 의한 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 광노화의 예방 또는 개선용인, 조성물.
제1항에 있어서, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 피부 광노화로 인한 염증 조절용인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은, 히알루론산 생합성 증가에 의한 피부 탄력 개선용 조성물, 피부 보습용 조성물, 피부 재생용 조성물, 또는 피부 주름개선용 조성물인, 피부 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 케스토스는 60 kg 성인을 기준으로 하루에 총 1g 내지 30g의 투여량으로 조성물에 포함되는 것이 조성물.
제1항에 있어서, 상기 케스토스는 케스토스를 함유하는 당시럽으로 제공되는 것인 조성물.