KR20240107104A - 변형된 cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 - Google Patents
변형된 cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물Info
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Abstract
인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포와 비인간 동물 및 이러한 비인간 동물 세포와 비인간 동물을 사용하는 방법이 제공된다. 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포 또는 비인간 동물은 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 단편을 발현한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 11월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/275,582호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 통합된다.
서열 목록
11102WO01_ST26.txt 파일에 기록된 서열 목록은 79킬로바이트이고, 2022년 11월 4일에 생성되었으며, 그 전체가 참조로서 통합된다.
기술분야
인간 칼슘 전압-개폐식 채널 보조 서브유닛 감마 1(CACNG1) 단백질, 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 게놈을 가진 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 또는 랫트)이 기술된다. 따라서, 예를 들어 골격근 세포의 표면 상에서 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 발현하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 또한 기술된다. 예를 들어, 골격근 세포의 표면 상에서 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 발현하는 이러한 유전적으로 변형된 비인간 동물은 CACNG1-기반 치료제, 예를 들어 CACNG1-기반 항체의 전임상 시험을 위한 모델로서 사용될 수 있다.
골격근은 인체에서 3개의 유의한 근육 조직 중 하나이다. 각각의 골격근은 결합 조직 외피에 의해 함께 랩핑된 수천 개의 근섬유를 함유한다. 골격근은 인간이 움직이고 일상 활동을 수행할 수 있게 한다. 골격근은 호흡 역학에서 필수적인 역할을 하며 자세와 균형을 유지하는 데 도움이 된다. 골격근은 또한 신체의 필수 기관을 보호한다.
골격근 기능 이상의 결과로서 무수한 의학적 병태가 발생할 수 있고, 예를 들어 근육 특이적 표면 단백질을 표적화함으로써 비정상적인 근육 기능을 치료하는 것을 목표로 하는 요법을 시험할 수 있는 적절한 동물 모델이 골격근과 관련된 의학적 병태를 연구하는 데 도움이 될 수 있다.
인간 칼슘 전압-개폐식 채널 보조 서브유닛 감마 1(CACNG1) 단백질을 암호화하는 재조합 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 본원에 제공된다. 또한, 이러한 변형된 비인간 동물을 생성하고 사용하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다.
유전적으로 조작된 비인간 동물 게놈, 조작된 세포, 및 이종(예를 들어 인간) Cacng1 유전자 또는 이의 일부를 포함하는 비인간 동물이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 유전적으로 조작된 동물은 원하는 유전자좌로부터 (예를 들어 내인성 Cacng1 분절로부터) 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질을 발현한다. 비인간 동물은 설치류(예를 들어 마우스 또는 랫트)와 같은 포유동물일 수 있다. 비인간 동물 세포는 설치류 세포(예를 들어 마우스 세포 또는 랫트 세포)와 같은 포유류 세포일 수 있다. 비인간 동물 게놈은 설치류 핵산(예를 들어 마우스 핵산 또는 랫트 핵산)과 같은 포유류 핵산일 수 있다.
일부 구현예에서, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 추가로 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; (vii) 인간 CACNG1 유전자의 3’ 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 (게놈, 세포, 또는 비인간 동물의) 내인성 Cacng1 유전자좌 내에 통합된다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 (비인간 동물 게놈, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물의 내인성 유전자좌에서) 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 이종상동성 내인성 핵산 서열을 치환한다. 일부 구현예에서, 내인성 Cacng1 유전자좌는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열과 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과의 이형접합성 또는 동형접합성 치환을 포함하며, 여기서 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성이다.
일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함한다: (i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열; (ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열; (iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열; (iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열; (v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열; (vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열; (vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열; (viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열; (ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는 (x) (i) 내지 (ii)의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질은 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 세포는 세포 표면에서 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 발현하는데, 이종 CACNG1 단백질은 전장 인간 CACNG1 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 세포는 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하는 비인간 동물 골격근 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 세포는 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않는 비인간 동물 세포이고, 예를 들어 여기서 비인간 동물 세포는 골격 세포가 아니고/아니거나, 예를 들어 여기서 비인간 동물 세포는 다능성 세포, 배아 줄기 세포, 생식 세포 등이다.
일부 구현예에서, 비인간 동물 세포는 마우스 세포이고, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하는 골격근 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부(예: 전장 인간 CACNG1 단백질)를 세포 표면에서 발현하는 비인간 골격근 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은, 이종(예를 들어 인간) Cacng1 유전자 또는 이의 일부를 포함하고 이종(예를 들어 인간) Cacng1 유전자 또는 이의 일부로부터 암호화된 이종(예를 들어 인간) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않는 비인간 동물 세포, 예를 들어 골격근 세포가 아닌 비인간 동물 세포 및/또는 다능성 세포, 배아 줄기세포, 생식 세포 등인 비인간 동물 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 마우스이거나, 본원에 기술된 비인간 동물 세포는 마우스 세포이거나, 본원에 기술된 비인간 동물 게놈은 마우스 핵산이고, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
또한, 비인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 핵산 서열을 포함하는 기능적 CACNG1 단백질을 암호화하는 키메라 핵산 분자가 본원에 기술되며, 여기서 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자는 비인간 동물 CACNG1 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 상동성 핵산 서열과의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 핵산 분자는, (a) CACNG1 단백질을 암호화하고 (b) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 서열과 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 상동성 서열과의 치환을 포함하도록 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 키메라 핵산 분자는 기능적 CACNG1 단백질을 암호화하고, 임의로 키메라 핵산 서열은 비인간 동물 Cacng1 유전자의 프로모터 및/또는 조절 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 핵산 서열은 다음을 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; (vii) 인간 CACNG1 유전자의 3’ 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 변형된 Cacng1 유전자는 약물 선택 카세트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 핵산 분자는 다음을 추가로 포함한다: (i) 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 상류에 있는 5’ 상동성 아암 및 (ii) 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 하류에 있는 3’ 상동성 아암. 일부 경우에, 5’ 상동성 아암 및 3’ 상동성 아암은 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합을 거칠 수 있고, 여기서 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합 이후, 변형된 Cacng1 유전자는 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자를 치환할 수 있고, 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자의 발현을 유도하는 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 핵산은 다음을 갖는다: (i) 서열번호 25로서 제시된 핵산 서열을 포함하는 5’ 상동성 아암 및/또는 (ii) 서열번호 26으로서 제시된 핵산 서열을 포함하는 3’ 상동성 아암. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함한다.
또한, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물의 게놈, 비인간 동물 세포의 게놈, 또는 비인간 동물 게놈에 삽입함으로써 본원에 기술된 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈을 만드는 방법이 기술된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물 세포는 비인간 동물 배아 줄기(ES) 세포이고, 여기서 삽입하는 것은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물 ES 세포의 게놈 내에 삽입하여, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 게놈에 포함하는 변형된 비인간 동물 ES 세포를 형성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 변형된 비인간 동물 ES 세포를 시험관 내에서 숙주 배아 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적절한 비인간 대리모 동물에서, 변형된 비인간 동물 ES 세포를 포함하는 숙주 배아 세포를 임신시키는 단계, 및 비인간 대리모 동물이 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 생식 세포를 포함하는 비인간 동물 자손을 출산하게 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌에 삽입된다. 이러한 구현예에서, 삽입하는 단계는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열을 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 치환하는 단계를 포함하며, 여기서 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성이다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. 일부 경우에, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; (vii) 인간 CACNG1 유전자의 3’ 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함한다: (i) 서열번호 8(인간 세포질 도메인 1)로서 제시된 아미노산 서열; (ii) 서열번호 10(인간 막관통 1)으로서 제시된 아미노산 서열; (iii) 서열번호 12(인간 세포외 도메인 1)로서 제시된 아미노산 서열; (iv) 서열번호 14(인간 막관통 2)로서 제시된 아미노산 서열; (v) 서열번호 16(인간 세포질 도메인 2)으로서 제시된 아미노산 서열; (vi) 서열번호 18(인간 막관통 3)로서 제시된 아미노산 서열; (vii) 서열번호 20(인간 세포외 도메인 3)으로서 제시된 아미노산 서열; (viii) 서열번호 22(인간 막관통 4)로서 제시된 아미노산 서열; (ix) 서열번호 24(인간 세포질 도메인 4)로서 제시된 아미노산 서열; 또는 (x) (i) 내지 (ii)의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질은 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서; (i) 비인간 동물은 설치류와 같은 포유류이거나; (ii) 비인간 동물 세포는 설치류 세포와 같은 포유류 세포이거나; (iii) 비인간 동물 게놈은 설치류 핵산과 같은 포유류 핵산이다. 일부 구현예에서, (i) 비인간 동물은 랫트 또는 마우스이거나; (ii) 비인간 동물 세포는 랫트 세포 또는 마우스 세포이거나; (iii) 비인간 동물 게놈은 랫트 핵산 또는 마우스 핵산이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이거나, 비인간 동물 세포는 마우스 세포이거나, 비인간 동물 게놈은 마우스 핵산이고, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 핵산을 삽입하는 단계는 비인간 동물의 게놈, 비인간 동물 세포의 게놈, 또는 비인간 동물 게놈을 본 개시의 임의의 키메라 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 본 개시의 임의의 방법에 따라 만들어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 이종 CACNG1 단백질에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하며, 여기서 비인간 동물은 골격근 세포의 표면에서 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 세포외 도메인을 발현한다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질은 인간 CACNG1 단백질이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이다.
일부 구현예에서, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 내인성 Cacng1 유전자의 녹아웃 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 녹아웃 돌연변이는 Cacng1 유전자 또는 이의 일부의 결실을 포함한다. 특정 구현예에서, 녹아웃 돌연변이는 Cacng1 유전자의 전체 코딩 서열의 결실을 포함한다.
또한, 아무런 CACNG1 단백질을 발현하지 않는 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈이 본원에 제공된다.
또한, 골격근에 특이적인 단백질을 발현하지 않는 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈으로서, 임의의 현저한 돌연변이체 표현형을 나타내지는 않는 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 (i) 5’ 상동성 아암 및 (ii) 3’ 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터를 제공하며, 여기서 5’ 상동성 아암 및 3’ 상동성 아암은 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와 상동성 재조합을 거치고, 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합 후에, 표적화 벡터는 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자에 녹아웃 돌연변이를 삽입한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 CACNG1 녹아웃 비인간 동물을 만드는 방법을 제공하며, 상기 방법은 녹아웃 돌연변이를 포함하도록 비인간 동물의 내인성 Cacng1 유전자좌를 변형시키는 단계를 포함한다.
도 1은 CACNG1 발현(GTEx 포털)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 CACNG1 녹아웃을 생성하기 위한 전략을 도시한다(축척에 비례하지는 않음).
도 3a는 마우스에서 CACNG1의 유전적 결실(CACNG1-/-)이 야생형(WT) 대조군 동물과 비교하여 골격근 중량을 변경시키지 않음을 나타내는 그래프이다.
도 3b는 마우스에서 CACNG1의 유전적 결실(CACNG1-/-)이 야생형(WT) 대조군 동물과 비교하여 경련(1 Hz) 또는 강직(125 Hz) 수축력을 변경시키지 않음을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 CACNG1hu/hu 마우스의 인간화에 대한 개략도(축척에 비례하지는 않음)를 보여준다. 별표는 대립유전자의 획득 검정을 위한 상류(7450hTU) 및 하류(7450hTD) 프라이머의 위치를 나타낸다. 도면의 상단 부분은 비동물 게놈의 인간화를 위해 인간 CACNG1로부터 유래된 12,484 bp 서열을 나타낸다. 도면의 하단 부분은 결실을 위해 표적화된 Cacng1 유전자좌 내의 쥣과 12,795 bp 게놈 서열을 나타낸다.
도 4b는 Neo 자가 결실 카세트를 포함하는, 7450 대립유전자의 CACNG1 인간화를 위한 전략(축척에 비례하지는 않음)을 상세히 보여준다. 코딩 엑손 1, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 및 82 bp의 3’ 비번역 영역(UTR) 마우스 Cacng1의 일부와 상응하는 부분 코딩 엑손 1 서열, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 전체 3’ UTR, 및 인간 CACNG1의 3’ UTR 다음의 추가 158 bp의 치환. 코딩 서열의 시작부에 있는 15 bp는 마우스 서열로 유지됨. 인간 서열의 하류에 도시된 loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Neo-pA-loxP 카세트(4,805 bp), 마우스 3’ UTR의 나머지가 이어짐.
도 4c는 7451 대립유전자의 CACNG1 인간화를 위한 전략(축척에 비례하지는 않음)을 상세히 설명한 것으로서, 카세트는 결실되었고, LoxP 부위는 남아 있다. 코딩 엑손 1, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 및 82 bp의 3’ 비번역 영역(UTR) 마우스 Cacng1의 일부와 상응하는 부분 코딩 엑손 1 서열, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 전체 3’ UTR, 및 인간 CACNG1의 3’ UTR 다음의 추가 158 bp의 치환. 코딩 서열의 시작부에 있는 15 bp는 마우스 서열로 유지됨. 인간 서열의 하류에 도시된 loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Neo-pA-loxP 카세트(4,805 bp), 마우스 3’ UTR의 나머지가 이어짐. 카세트 결실 후, LoxP 및 클로닝 부위(77 bp)는 인간 3’ UTR 다음에 유지됨.
도 5는 마우스 CACNG1 단백질(mCACNG1; 서열번호 2)과 인간 hCACNG1 단백질(hCACNG1; 서열번호 4), 및 7451 대립유전자에 의해 암호화된 CACNG1 단백질(7451; 서열번호 4)의 정렬을 도시한다. 별표는 변화가 없는 잔기를 나타낸다. 굵은 실선은 막관통 도메인을 나타낸다. 밑줄로 표시된 잔기는 도입된 인간 엑손에 의해 암호화된 잔기이다. 세포질 및 세포외 도메인이 표지되고 표시되어 있다.
도 6a는 마우스 CACNG1(mCACNG1)의 발현이 CACNG1hu/hu 마우스 근육에서 qPCR에 의해 검출되지 않는 반면(좌측 그래프), 인간 CACNG1(hCACNG1)은 CACNG1hu/hu에서 발현되지만, WT 마우스 근육에서는 발현되지 않음(우측 그래프)을 입증하는 그래프이다.
도 6b는 100 nM의 Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab로 단일 골격 근섬유를 생염색하는 것이 CACNG1hu/hu 마우스로부터 단리된 근섬유에 대한 결합을 나타내지만, WT 마우스로부터 단리된 근섬유에 대한 결합을 나타내지 않음을 도시한 이미지이다.
도 6c는 10 mg/kg Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab를 주입한 CACNG1hu/hu 마우스의 동결-형광 단층촬영(CryoFT) 이미지로서, 주입 후 6일차에, 이소형 대조군 Ab와 비교하여 골격근에 대한 높은 특이성을 나타냄을 보여주는 이미지이다.
도 7은 10 mg/kg Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab가 투여된 CACNG1hu/hu 마우스의 조직학적 절편을 도시한 이미지로서, 주입 후 6일차에 골격근에 결합하는 것을 보여준다. 상단 패널은 생체 내 주입된 Ab로부터 내인성 Alexa 647 신호를 나타내고, 하단 패널은 근육 형태를 시각화하기 위한 라미닌 및 DAPI 공동 염색과 결합하는 Alexa647-Ab의 오버레이를 나타낸다.
도 8a는 NP_031608.1에 의해 참조된 마우스 Cacng1 단백질의 세포질 도메인(아미노산 1~10, 131~135, 및 206~223), 막관통 도메인(아미노산 11~29, 110~130, 136~156, 및 181~205), 및 세포외 도메인(아미노산 30~109 및 157~180)의 주석을 제공한다.
도 8b는 마우스 코딩 DNA 서열(CDS)의 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열(핵산 1~30, 391~405, 및 616~669), 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열(핵산 31~87, 328~390, 406~468, 및 541~615), 및 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열(핵산 88~327 및 469~540)의 주석을 제공한다.
도 9a는 NP_000718.1의해 참조된 인간 CACNG1 단백질의 세포질 도메인(아미노산 1~10, 130~134, 및 205~222), 막관통 도메인(아미노산 11~29, 109~129, 135~155, 및 180~204), 및 세포외 도메인(아미노산 30~108 및 156~179)의 주석을 제공한다.
도 9b는 인간 코딩 DNA 서열(CDS)의 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열, 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열, 및 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열의 주석을 제공한다.
도 10a는 7451 대립유전자에 의해 암호화된 CACNG1 단백질에 대한 예시적인 서열을 제공한다.
도 10b는 3’ 비번역 서열을 포함하여, 마우스/인간 CACNG1 핵산 코딩 서열(CDS)에 대한 예시적인 서열을 제공한다.
도 11은 7450 대립유전자에 대한 핵산 서열을 제공한다. Neo 자가 결실 카세트를 갖는 CACNG1 인간화 영역 = 마우스 (소문자)_HUMAN_XhoI_LoxP_Prm_Crei_sv40 폴리a (소문자)-hUbi-em7 (소문자)-NEO-PGK 폴리A _LoxP_ICeUI_마우스 (소문자).
도 12은 7450 대립유전자에 대한 핵산 서열을 제공한다. Neo 자가 결실 카세트를 갖는 CACNG1 인간화 영역 = 마우스 (소문자)_HUMAN_XhoI_LoxP_Prm_ Crei _sv40 폴리a (소문자)- hUbi -em7 (소문자)-NEO-PGK 폴리A _LoxP_ICeUI_마우스 (소문자).
도 2는 CACNG1 녹아웃을 생성하기 위한 전략을 도시한다(축척에 비례하지는 않음).
도 3a는 마우스에서 CACNG1의 유전적 결실(CACNG1-/-)이 야생형(WT) 대조군 동물과 비교하여 골격근 중량을 변경시키지 않음을 나타내는 그래프이다.
도 3b는 마우스에서 CACNG1의 유전적 결실(CACNG1-/-)이 야생형(WT) 대조군 동물과 비교하여 경련(1 Hz) 또는 강직(125 Hz) 수축력을 변경시키지 않음을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 CACNG1hu/hu 마우스의 인간화에 대한 개략도(축척에 비례하지는 않음)를 보여준다. 별표는 대립유전자의 획득 검정을 위한 상류(7450hTU) 및 하류(7450hTD) 프라이머의 위치를 나타낸다. 도면의 상단 부분은 비동물 게놈의 인간화를 위해 인간 CACNG1로부터 유래된 12,484 bp 서열을 나타낸다. 도면의 하단 부분은 결실을 위해 표적화된 Cacng1 유전자좌 내의 쥣과 12,795 bp 게놈 서열을 나타낸다.
도 4b는 Neo 자가 결실 카세트를 포함하는, 7450 대립유전자의 CACNG1 인간화를 위한 전략(축척에 비례하지는 않음)을 상세히 보여준다. 코딩 엑손 1, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 및 82 bp의 3’ 비번역 영역(UTR) 마우스 Cacng1의 일부와 상응하는 부분 코딩 엑손 1 서열, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 전체 3’ UTR, 및 인간 CACNG1의 3’ UTR 다음의 추가 158 bp의 치환. 코딩 서열의 시작부에 있는 15 bp는 마우스 서열로 유지됨. 인간 서열의 하류에 도시된 loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Neo-pA-loxP 카세트(4,805 bp), 마우스 3’ UTR의 나머지가 이어짐.
도 4c는 7451 대립유전자의 CACNG1 인간화를 위한 전략(축척에 비례하지는 않음)을 상세히 설명한 것으로서, 카세트는 결실되었고, LoxP 부위는 남아 있다. 코딩 엑손 1, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 및 82 bp의 3’ 비번역 영역(UTR) 마우스 Cacng1의 일부와 상응하는 부분 코딩 엑손 1 서열, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 전체 3’ UTR, 및 인간 CACNG1의 3’ UTR 다음의 추가 158 bp의 치환. 코딩 서열의 시작부에 있는 15 bp는 마우스 서열로 유지됨. 인간 서열의 하류에 도시된 loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Neo-pA-loxP 카세트(4,805 bp), 마우스 3’ UTR의 나머지가 이어짐. 카세트 결실 후, LoxP 및 클로닝 부위(77 bp)는 인간 3’ UTR 다음에 유지됨.
도 5는 마우스 CACNG1 단백질(mCACNG1; 서열번호 2)과 인간 hCACNG1 단백질(hCACNG1; 서열번호 4), 및 7451 대립유전자에 의해 암호화된 CACNG1 단백질(7451; 서열번호 4)의 정렬을 도시한다. 별표는 변화가 없는 잔기를 나타낸다. 굵은 실선은 막관통 도메인을 나타낸다. 밑줄로 표시된 잔기는 도입된 인간 엑손에 의해 암호화된 잔기이다. 세포질 및 세포외 도메인이 표지되고 표시되어 있다.
도 6a는 마우스 CACNG1(mCACNG1)의 발현이 CACNG1hu/hu 마우스 근육에서 qPCR에 의해 검출되지 않는 반면(좌측 그래프), 인간 CACNG1(hCACNG1)은 CACNG1hu/hu에서 발현되지만, WT 마우스 근육에서는 발현되지 않음(우측 그래프)을 입증하는 그래프이다.
도 6b는 100 nM의 Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab로 단일 골격 근섬유를 생염색하는 것이 CACNG1hu/hu 마우스로부터 단리된 근섬유에 대한 결합을 나타내지만, WT 마우스로부터 단리된 근섬유에 대한 결합을 나타내지 않음을 도시한 이미지이다.
도 6c는 10 mg/kg Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab를 주입한 CACNG1hu/hu 마우스의 동결-형광 단층촬영(CryoFT) 이미지로서, 주입 후 6일차에, 이소형 대조군 Ab와 비교하여 골격근에 대한 높은 특이성을 나타냄을 보여주는 이미지이다.
도 7은 10 mg/kg Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab가 투여된 CACNG1hu/hu 마우스의 조직학적 절편을 도시한 이미지로서, 주입 후 6일차에 골격근에 결합하는 것을 보여준다. 상단 패널은 생체 내 주입된 Ab로부터 내인성 Alexa 647 신호를 나타내고, 하단 패널은 근육 형태를 시각화하기 위한 라미닌 및 DAPI 공동 염색과 결합하는 Alexa647-Ab의 오버레이를 나타낸다.
도 8a는 NP_031608.1에 의해 참조된 마우스 Cacng1 단백질의 세포질 도메인(아미노산 1~10, 131~135, 및 206~223), 막관통 도메인(아미노산 11~29, 110~130, 136~156, 및 181~205), 및 세포외 도메인(아미노산 30~109 및 157~180)의 주석을 제공한다.
도 8b는 마우스 코딩 DNA 서열(CDS)의 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열(핵산 1~30, 391~405, 및 616~669), 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열(핵산 31~87, 328~390, 406~468, 및 541~615), 및 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열(핵산 88~327 및 469~540)의 주석을 제공한다.
도 9a는 NP_000718.1의해 참조된 인간 CACNG1 단백질의 세포질 도메인(아미노산 1~10, 130~134, 및 205~222), 막관통 도메인(아미노산 11~29, 109~129, 135~155, 및 180~204), 및 세포외 도메인(아미노산 30~108 및 156~179)의 주석을 제공한다.
도 9b는 인간 코딩 DNA 서열(CDS)의 세포질 도메인을 암호화하는 핵산 서열, 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열, 및 세포외 도메인을 암호화하는 핵산 서열의 주석을 제공한다.
도 10a는 7451 대립유전자에 의해 암호화된 CACNG1 단백질에 대한 예시적인 서열을 제공한다.
도 10b는 3’ 비번역 서열을 포함하여, 마우스/인간 CACNG1 핵산 코딩 서열(CDS)에 대한 예시적인 서열을 제공한다.
도 11은 7450 대립유전자에 대한 핵산 서열을 제공한다. Neo 자가 결실 카세트를 갖는 CACNG1 인간화 영역 = 마우스 (소문자)_HUMAN_XhoI_LoxP_Prm_Crei_sv40 폴리a (소문자)-hUbi-em7 (소문자)-NEO-PGK 폴리A _LoxP_ICeUI_마우스 (소문자).
도 12은 7450 대립유전자에 대한 핵산 서열을 제공한다. Neo 자가 결실 카세트를 갖는 CACNG1 인간화 영역 = 마우스 (소문자)_HUMAN_XhoI_LoxP_Prm_ Crei _sv40 폴리a (소문자)- hUbi -em7 (소문자)-NEO-PGK 폴리A _LoxP_ICeUI_마우스 (소문자).
정의
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 암호화 및 비암호화된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도된 아미노산을 포함하는, 임의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드와 같은, 변형된 중합체를 포함한다. 용어 도메인은 특정 기능 또는 구조를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드의 임의의 부분을 지칭할 수 있다.
단백질은 “N-말단” 및 “C-말단”을 갖는 것으로 언급된다. 용어 “N-말단”은 유리 아민기(-NH2)를 갖는 아미노산으로 종결된, 단백질 또는 폴리펩티드의 시작부에 관한 것이다. 용어 “C-말단”은 유리 카르복실기(-COOH)를 갖는 아미노산으로 종결된, 아미노산 사슬(단백질 또는 폴리펩티드)의 단부에 관한 것이다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하는, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함한다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 단일-, 이중, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함할 수 있다.
핵산은 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 갖는 것으로 언급되는데, 이는 하나의 모노뉴클레오티드 오탄당 고리의 5’ 포스페이트가 포스포디에스테르 결합을 통해 이의 이웃의 3’ 산소에 한 방향으로 부착되는 방식으로, 모노뉴클레오티드를 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 만들기 때문이다. 올리고뉴클레오티드의 5’ 포스페이트가 모노뉴클레오티드 오탄당 고리의 3’ 산소에 연결되지 않는 경우, 올리고뉴클레오티드의 단부는 “5’ 단부”로서 지칭된다. 올리고뉴클레오티드의 3’ 산소가 또 다른 모노뉴클레오티드 오탄당 고리의 5’ 포스페이트에 연결되지 않는 경우, 올리고뉴클레오티드의 단부는 “3’ 단부”로서 지칭된다. 핵산 서열이 더 큰 올리고뉴클레오티드의 내부에 있더라도, 핵산 서열은 5’ 및 3’ 단부를 갖는 것으로 언급될 수도 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 이산된 요소는 “하류” 또는 3’ 요소의 “상류” 또는 5’에 있는 것으로서 지칭된다.
용어 “게놈적으로 통합된”은 뉴클레오티드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되고 이의 자손에 의해 유전될 수 있도록 세포 내에 도입된 핵산을 지칭한다. 세포의 게놈 내로의 핵산을 안정적으로 통합하기 위해 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다.
용어 “표적화 벡터”는 상동성 재조합, 비상동성-단부-결합-매개 결찰, 또는 세포의 게놈에서 표적 위치에 대한 임의의 다른 재조합 수단에 의해 도입될 수 있는 재조합 핵산을 지칭한다.
용어 “바이러스 벡터”는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고, 바이러스 벡터 입자로 패키징하기에 충분하거나 패키징이 허용되는 요소를 포함하는 재조합 핵산을 지칭한다. 벡터 및/또는 입자는 생체 외에서 또는 생체 내에서 DNA, RNA, 또는 다른 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터가 알려져 있다.
용어 “야생형”은 정상적인(돌연변이체, 질환에 걸린 것, 변경된 것과 대조됨) 상태 또는 맥락에서 발견되는 것과 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 엔티티를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩티드는 흔히 다수의 상이한 형태(예: 대립 유전자)로 존재한다.
“현저한 돌연변이체 표현형”이라는 표현은 본 개시의 조작된 비인간 마우스와 “야생형” 간의 표현형에 있어서의 유의한 차이 또는 변이를 지칭한다.
용어 “내인성”은 세포 또는 비인간 동물 내에서 자연 발생하는 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 비인간 동물의 내인성 Cacng1 서열은 비인간 동물의 Cacng1 유전자좌에서 자연 발생하는 고유한 Cacng1 서열을 지칭한다.
"외인성" 분자 또는 서열은 해당 형태의 세포에 정상적으로는 존재하지 않은 분자 또는 서열을 포함한다. 정상적으로 존재하는 것은 세포의 특정한 발달 단계 및 환경 조건과 관련해서 존재하는 것을 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은, 예를 들어 내인성 서열의 인간화 버전과 같이, 세포 내에 있는 상응하는 내인성 서열의 돌연변이된 버전을 포함할 수 있거나, 세포 내에 있는 내인성 서열에 상응하지만 형태가 상이한(즉, 염색체 내에 없는) 서열을 포함할 수 있다. 대조적으로, 내인성 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에 있는 특정 세포에 해당 형태로 정상적으로 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
핵산 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때의 용어 "이종"은, 핵산 또는 단백질이 동일한 분자 내에서는 함께 자연 발생하지 않는 적어도 2개의 부분을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 핵산의 일부 또는 단백질의 일부와 관련하여 사용될 때의 용어 “이종”은, 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로에 대해 동일한 관계(예를 들어, 함께 결합된 상태)로 발견되지 않은 2개 이상의 하위 서열을 포함하는 것을 나타낸다. 일례로, 핵산 벡터의 “이종” 영역은 자연에서 다른 분자와 연관되어 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 이에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 벡터의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과 연관되어 발견되지 않는 서열이 측면에 위치한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 단백질의 “이종” 영역은 자연에서 다른 펩티드 분자(예를 들어, 융합 단백질, 또는 태그를 갖는 단백질)와 연관되어 발견되지 않는 또 다른 펩티드 분자 내에 있거나 이에 부착된 아미노산의 분절이다. 유사하게, 핵산 또는 단백질은 이종 표지를 포함하거나 이종 분비 서열 또는 국소화 서열을 포함할 수 있다.
“코돈 최적화”는 아미노산을 구체화하는 3-염기쌍 코돈 조합의 다중성에 의해 나타나는 것과 같은 코돈의 축퇴성을 이용하며, 특히 숙주 세포에서의 강화된 발현을 위해, 고유 아미노산 서열을 유지하면서, 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 교체함으로써 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산은, 자연 발생 핵산 서열과 비교했을 때, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하여, 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서 사용 빈도가 더 높은 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 코돈 용도 표는 예를 들어 "Codon Usage Database"에서 쉽게 입수할 수 있다. 이들 표는 다수의 방식으로 조정될 수 있다. Nakamura 등의문헌[(2000) Nucleic Acids Research 28:292]를 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 특정 숙주에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘도 이용할 수 있다 (예를 들어 Gene Forge 참조).
용어 “유전자좌”는 유전자(또는 유의 서열), DNA 서열, 폴리펩티드 암호화 서열의 특정한 위치, 또는 유기체 게놈의 염색체 상에서의 위치를 지칭한다. 예를 들어, “Cacng1 유전자좌”는 Cacng1 유전자, Cacng1 DNA 서열, Cacng1 암호화 서열의 특정 위치, 또는 이러한 서열이 상주하는 위치에 대해 식별된 유기체 게놈의 염색체 상에서의 Cacng1 위치를 지칭할 수 있다. "Cacng1 유전자좌”는, 예를 들어 인핸서, 프로모터, 5’ 및/또는 3’ 비번역 영역(UTR), 또는 이들의 조합을 포함하여, Cacng1 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 “유전자”는 염색체 내의 DNA 서열로서, 산물(예: RNA 산물 및/또는 폴리펩티드 산물)에 대해 코딩하고, 유전자가 (5’ 및 3’ 비번역 서열을 포함하는) 전장 mRNA에 상응하도록 다음을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다: 비코딩 인트론에 의해 중단되는 코딩 영역; 및 5’ 및 3’ 단부 모두에서 코딩 영역에 인접하게 위치한 서열. 용어 “유전자”는 다음을 포함하는 비코딩 서열도 포함한다: 조절 서열(예컨대, 프로모터, 인핸서 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 유입 부위, 침묵화인자(silencers), 절연 서열(insulating sequence), 및 매트릭스 부착 영역. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 근접하거나(예를 들어 10 kb 이내) 먼 부위에 있을 수 있고, 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이체 형태를 지칭한다. 일부 유전자는 염색체 상의 동일한 위치 또는 유전자좌에 위치하는 다양한 상이한 형태를 갖는다. 이배체 유기체는 각각의 유전자좌에서 2개의 대립유전자를 갖는다. 대립유전자의 각각의 쌍은 특이적 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은, 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 존재하는 경우 동형접합체로서 기술되고, 2개의 대립유전자가 상이한 경우 이형접합체로서 기술된다.
“프로모터”는, 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 RNA 중합효소 II를 유도할 수 있는 TATA 박스를 일반적으로 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에 개시된 세포 유형 중 하나 이상(예컨대, 진핵 세포, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 다능성 세포, 1세포기 배아, 분화 세포, 또는 이들의 조합)에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성인 프로모터, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터(예를 들어 발달적으로 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터(예를 들어 세포 특이적 또는 조직 특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는, 예를 들어 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합되는 WO 2013/176772에서 찾을 수 있다.
“작동 가능한 연결” 또는 “작동 가능하게 연결된”은 2개 이상의 구성요소(예: 프로모터 및 또 다른 서열 요소)가 병치되어 두 구성요소 모두가 정상적으로 기능하고, 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소 중 적어도 하나에게 부여되는 기능을 매개할 수 있게 하는 가능성을 허용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대해 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 조절하는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능한 연결은 이러한 서열이 서로 연속하는 것 또는 트랜스에서 작용하는 것(예를 들어 조절 서열이 이격된 상태로 코딩 서열의 전사를 조절하도록 작용할 수 있는 것)을 포함할 수 있다.
용어 “변이체”는 집단에서 가장 우세한 서열과 (예를 들어 하나의 뉴클레오티드만큼) 상이한 뉴클레오티드 서열 또는 집단에서 가장 우세한 서열과 (예를 들어 하나의 아미노산만큼) 상이한 단백질 서열을 지칭한다.
단백질을 지칭할 때의 용어 "단편"은 전장 단백질보다 길이가 짧거나 더 적은 아미노산을 갖는 단백질을 의미한다. 핵산을 지칭할때의 용어 “단편”은 전장 핵산보다 길이가 짧거나 더 적은 뉴클레오티드를 갖는 핵산을 의미한다. 단편은, 예를 들어 N-말단 단편(즉, 단백질의 C 말단 단부의 일부가 제거된 것), C-말단 단편(즉, 단백질의 N 말단 단부의 일부가 제거된 것), 또는 내부 단편일 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 상기 2개 서열을 명시된 비교 창에 걸쳐 최대 상응성을 위해 정렬했을 때, 2개 서열에서 동일한 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환만큼 상이하며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환되므로 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 보존적 치환에 있어서 서열이 상이할 때, 서열 동일성 백분율은 치환의 보존적 성질에 대해 보정하도록 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환만큼 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다. 이러한 조정을 만들기 위한 수단은 잘 알려져 있다. 일반적으로, 여기에는 보존적 치환을 완전한 미스매치가 아닌 부분적 미스매치로서 점수를 매겨 서열 동일성 백분율을 증가시키는 것이 포함된다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1점이 주어지고 비보존적 치환에 0점이 주어지는 경우, 보존적 치환에는 0과 1사이의 점수가 주어진다. 보존적 치환에 점수를 매기는 것은, 예를 들어 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California)에서 구현되는 것과 같이 계산된다.
“서열 동일성 백분율”은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값(완벽하게 매치된 잔기들의 가장 큰 수)을 포함하며, 여기서 비교 창에 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교했을 때 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 2개 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매치된 위치의 수를 비교 창 내에 있는 위치의 총수로 나눈 후, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다. 달리 명시되지 않는 한(예를 들어, 더 짧은 서열이 연결된 이종 서열을 포함함), 비교 창은 비교되는 2개 서열 중 더 짧은 서열의 전장이다.
달리 언급하지 않은 한, 서열 동일성/유사성 값은 다음의 파라미터를 사용하여 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 포함한다: 50의 GAP 무게 및 3의 길이 무게, 및 nwsgapdna.cmp 스코어링 매트릭스를 사용하는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 백분율(%) 및 유사성 백분율(%); 8의 GAP 중량 및 2의 길이 중량, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용하는 아미노산 서열에 대한 동일성 백분율(%) 및 유사성 백분율(%); 또는 이와 동등한 임의의 프로그램. "동등한 프로그램"은, 임의의 2개의 해당 서열에 대해, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교했을 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 서열 동일성 백분율을 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 “보존적 아미노산 치환”은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 크기, 전하, 또는 극성이 유사한 상이한 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 이소류신, 발린, 또는 류신과 같은 비극성(소수성) 잔기를 또 다른 비극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는 하나의 극성 잔기(친수성)를 또 다른 극성 잔기로 치환하는 것, 예컨대 아르기닌과 리신 간의 치환, 글루타민과 아스파라긴 간의 치환, 또는 글리신과 세린 간의 치환을 포함한다. 추가적으로, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기를 또 다른 염기성 잔기로 치환하는 것, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 한 산성 잔기를 또 다른 산성 잔기로 치환하는 것도 보존적 치환의 추가적인 예이다. 비보존적 치환의 예는 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌과 같은 비극성(소수성) 아미노산 잔기를 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신과 같은 극성(친수성) 잔기로 치환하는 것 및/또는 극성 잔기를 비극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 일반적인 아미노산 분류가 아래에 요약되어 있다.
“상동성” 서열(예: 핵산 서열)은 알려진 기준 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 서열, 예를 들어 알려진 기준 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 상동성 서열은, 예를 들어 이종상동성 서열 및 동종상동성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상동성 유전자는 일반적으로 종분화 이벤트(이종상동성 유전자) 또는 유전자 복제 이벤트(동종상동성 유전자)를 통해 공통의 조상 DNA 서열로부터 이어져 내려온다. "이종상동성" 유전자는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자로부터 진화된 상이한 종의 유전자를 포함한다. 이종상동성은 일반적으로 진화 과정에서 동일한 기능을 유지한다. "동종상동성" 유전자는 게놈 내의 복제에 의해 관련된 유전자를 포함한다. 동종상동 유전자(paralog)는 진화 과정에서 새로운 기능을 진화시킬 수 있다.
용어 "시험관 내"는 인공 환경 및 인공 환경(예컨대, 시험관) 내에서 발생하는 프로세스 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체 내"는 천연 환경 및 천연 환경(예를 들어, 세포 또는 유기체 또는 신체) 내에서 발생하는 프로세스 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체 외"는 개인의 신체로부터 제거된 세포 및 이러한 세포 내에서 발생하는 프로세스 또는 반응을 포함한다.
용어 "리포터 유전자"는, 이종 프로모터 및/또는 인핸서 요소에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자 서열을 포함하는 작제물이 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 활성화에 필요한 요소를 함유하는 (또는 이를 함유하도록 만들어질 수 있는) 세포 내로 도입될 때, 용이하게 및 정량화할 수 있게 검정되는 유전자 산물(통상적으로 효소)을 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 리포터 유전자의 예는 베타-갈락토시다아제(lacZ)를 암호화하는 유전자, 박테리아 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(cat) 유전자, 반딧불이 루시퍼라아제 유전자, 베타-글루쿠로니다아제(GUS)를 암호화하는 유전자, 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. “리포터 단백질”은 리포터 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "형광 리포터 단백질"은 형광에 기초하여 검출될 수 있는 리포터 단백질을 의미하되, 형광은 리포터 단백질로부터의 직접적 형광, 형광발생 기질 상의 리포터 단백질의 활성으로부터의 형광이거나, 형광 태그된 화합물에 대한 결합 친화도를 갖는 단백질로부터의 형광일 수 있다. 형광 단백질의 예는 녹색 형광 단백질(예컨대, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드(Emerald), 아자미 그린(Azami Green), 단량체성(Monomeric) 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질(예컨대, YFP, eYFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, PhiYFP, 및 ZsYellowl), 청색 형광 단백질(예컨대, BFP, eBFP, eBFP2, 아주라이트(Azurite), mKalamal, GFPuv, 사파이어(Sapphire), 및 T-사파이어), 시안 형광 단백질(예컨대, CFP, eCFP, 세룰리안(Cerulean), CyPet, AmCyanl, 및 미도리시-시안(Midoriishi-Cyan)), 적색 형광 단백질(예컨대, RFP, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, 및 Jred), 오렌지색 형광 단백질(예컨대, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), 단량체성 쿠사비라-오렌지, mTangerine, tdTomato), 및 세포 내에서 존재가 유동 세포 측정법에 의해 검출될 수 있는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다.
용어 “재조합”은 2개의 폴리뉴클레오티드 간에 유전 정보를 교환하는 임의의 프로세스를 포함하며, 임의의 메커니즘에 의해 발생할 수 있다. 이중 가닥 절단(DSG)에 의한 재조합은 주로 다음 2개의 보존된 DNA 복구 경로를 통해 발생한다: 비상동성 단부 결합(NHEJ); 및 상동성 재조합(HR). Kasparek & Humphrey의 문헌[(2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897]을 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 마찬가지로, 외인성 공여자 핵산에 의해 매개되는 표적 핵산의 복구는 2개의 폴리뉴클레오티드 간에 유전 정보를 교환하는 임의의 프로세스를 포함할 수 있다.
NHEJ는 절단 단부들을 서로 직접 결찰하거나, 상동성 주형 없이 외인성 서열에 직접 결찰함으로써 핵산 내 이중-가닥 절단을 복구하는 것을 포함한다. NHEJ에 의한 비연속 서열의 결찰은 종종 이중 가닥 절단 부위 근처에서 결실, 삽입, 또는 전좌를 초래할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 절단 단부를 외인성 공여 핵산의 단부와 직접 결찰함으로써(즉, NHEJ-기반 포착) 외인성 공여자 핵산의 표적화된 통합을 야기할 수도 있다. 이러한 NHEJ-매개 표적화된 통합은, 상동성 유도 복구(HDR) 경로가 (예를 들어, 비분열 세포, 1차 세포, 및 상동성-기반 DNA 복구를 부실하게 수행하는 세포에서) 쉽게 사용할 수 없는 경우, 외인성 공여자 핵산을 삽입하기에 바람직할 수 있다. 또한, 상동성 유도 복구와 대조적으로, 절단 부위의 측면에 위치하는 서열 동일성의 큰 영역을 알 필요가 없는데, 이는 게놈 서열에 대해 알려진 것이 제한 적인 게놈을 가진 유기체 내에 표적화된 삽입을 시도하는 경우 유익할 수 있다. 통합은 외인성 공여자 핵산과 절단된 게놈 서열 사이의 뭉툭한 말단을 결찰하거나, 절단된 게놈 서열에서 뉴클레아제 제제에 의해 생성된 것과 비숫한 오버행이 측면에 위치하는 외인성 공여자 핵산을 사용하여 끈끈한 단부(즉, 5' 또는 3' 오버행을 갖는 단부)를 결찰하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, 및 Maresca 등의 문헌[(2013) Genome Res. 23(3):539-546]을 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 뭉툭한 말단이 결찰되면, 단편을 결합시키는 데 필요한 미세상동성 영역을 생성하기 위해 표적 및/또는 공여자 절단이 필요할 수 있는데, 이는 표적 서열에서 원치 않은 변경을 생성할 수 있다.
재조합은 또한 상동성 유도 복구(HDR) 또는 상동성 재조합(HR)을 통해 발생할 수도 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오티드 서열 상동성이 요구될 수 있는 핵산 복구의 형태를 포함하고, "표적" 분자(즉, 이중-가닥 절단을 경험한 분자)의 복구를 위한 템플릿으로서 "공여자" 분자를 사용하고, 공여자로부터 표적으로 유전 정보의 전달을 유발한다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이러한 전달은 절단된 표적과 공여자 사이에서 형성되는 이종이중체 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는데 공여자가 사용되는 합성-의존적 가닥 어닐링, 및/또는 관련 프로세스를 수반할 수 있다. 일부 경우에, 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부, 공여자 폴리뉴클레오티드의 사본, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 사본의 일부는 표적 DNA 내에 통합한다. Wang 등의 문헌[(2013) Cell 153:910-918]; Mandalos 등의 문헌[(2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9]; 및 Wang 등의 문헌[(2013) Nat Biotechnol. 31:530-532]을 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
용어 “항원 결합 단백질”은 항원에 결합하는 임의의 단백질을 포함한다. 항원 결합 단백질의 예는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 다중특이적 항체(예컨: 이중특이적 항체), scFV, 비스-scFV, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD(이중 가변 도메인 항원 결합 단백질), SVD(단일 가변 도메인 항원 결합 단백질), 이중특이적 T-세포 관여자(BiTE), 또는 데이비스바디(Davisbody)(모든 목적을 위하여 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제8,586,713호)를 포함한다.
항원 결합 단백질과 관련하여, 용어 "다중특이적" 또는 “이중특이적”은 단백질이 동일한 항원 상의 또는 상이한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 것을 의미한다. 다중특이적 항원 결합 단백질은 하나의 다기능성 폴리펩티드일 수 있거나, 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 결합되는 2개 이상의 폴리펩티드로 이루어진 다량체 복합체일 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합에 의해, 또는 달리) 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 예컨대 단백질 또는 그의 단편에 기능적으로 연결되어 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항원-결합 분자를 생산할 수 있다.
용어 "항원"은 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 생산을 유도할 수 있는 물질을 지칭하며, 전체 분자이거나 분자 내의 도메인인지 여부는 불문한다. 용어 항원은, 야생형 숙주 유기체가 자가-인식을 이용해 항체 생산을 유도하지는 않지만, 면역학적 내성을 절단하는 적절한 유전 공학에 의해 숙주 동물에서 이와 같은 반응을 유도할 수 있는 물질도 포함한다.
용어 "에피토프"는 항원-결합 단백질(예: 항체)이 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프로도 알려짐)는 변성 용매에 노출될 때 일반적으로 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프(형태 에피토프로도 알려짐)는 변성 용매로 처리될 때 상실된다. 에피토프는 일반적으로 적어도 3개, 더 흔하게는 적어도 5개 또는 8~10개의 아미노산을 고유한 공간적 형태로 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어 Glenn E. Morris(Ed.)의 문헌[(1996) Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66]을 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
본원에 기술된 바와 같은 항체 파라토프는 일반적으로 이종 에피토프를 특이적으로 인식하는 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 CDR3 영역)을 최소한으로 포함한다.
용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 다음 세 개의 도메인을 포함한다: CH1, CH2, 및 CH3. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존적인 영역이 사이 사이에 배치되는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 약칭될 수 있음). 용어 “고친화도” 항체는 이의 표적 에피토프에 대해 약 10-9 M 이하(예: 약 1×10-9 M, 1×10-10 M, 1×10-11 M, 또는 약 1×10-12 M)의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™에 의해 측정되고; 또 다른 구현예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 상이한 2개의 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 2개의 - 상이한 분자 상에서(예를 들어 2개의 상이한 항원 상에서) 또는 동일한 분자 상에서(예를 들어 동일한 항원 상에서) - 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 일반적으로 적어도 수 배 내지 수십 배 또는 수백 배 또는 수천 배 더 낮거나 그 반대일 것이다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상에) 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄들을 조합함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열들은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 일반적인 이중특이적 항체는 2개의 중쇄 및 하나의 면역글로불린 경쇄를 갖는데, 중쇄 각각은 3개의 중쇄 CDR에 이어서, (N-말단에서 C-말단 방향으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖고; 면역글로불린 경쇄는 항원 결합 특이성을 부여하지는 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 결합할 수 있고, 중쇄 항원 결합 영역에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 하나 또는 두 에피토프 모두에 결합시킬 수 있다.
용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하여, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편에는 CDR, CDR 및 FR 및 이들의 조합이 포함된다. 일반적인 중쇄는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음 가변 도메인을 갖는다: CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인. 중쇄의 기능적 단편은, 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있고 (예를 들어 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인식함), 세포로부터 발현 및 분비가 가능하고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 VH, DH, 및 JH 분절의 레파토리로부터 유래된 VH, DH, 및 JH 분절을 일반적으로 포함하는 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 다양한 유기체에 대한 V, D 및 J 중쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스에서 찾을 수 있으며, 인터넷을 통해 “www.imgt.org” URL에 접속할 수 있다.
용어 "경쇄"는 임의의 유기체의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않은 한 인간 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄 및 VpreB, 및 대용(surrogate) 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않은 한, 일반적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인, 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 생식선에 존재하는 V 및 J 유전자 분절의 레파토리로부터 유래된 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절을 일반적으로 포함하는, 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 유전자 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스에서 찾을 수 있으며, 인터넷을 통해 “www.imgt.org” URL에 접속할 수 있다. 경쇄는 예를 들어 이들이 나타나는 에피토프 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 에피토프 또는 제2 에피토프 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 경쇄는 또한 이들이 나타나는 에피토프 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 1개 이상의 에피토프에 결합하고 인식하거나, 중쇄가 이것과 결합하고 인식하는 것을 돕는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "상보성 결정 영역", 또는 "CDR"은 보통 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자 (예, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 2개의 프레임워크 영역 사이에 나타나는, 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어, 생식계열 서열 또는 재배열 서열에 의해 암호화될 수 있으며, 예를 들어, 미처리 B 세포 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. CDR은 체세포 돌연변이 (예를 들어, 동물의 생식선에서 암호화되는 서열에 따라 달라짐), 인간화, 및/또는 아미노산 치환, 부가, 또는 결실로 변형될 수 있다. 일부 경우에(예: CDR3의 경우), CDR은, (예컨대, 재배열되지 않은 핵산 서열에서는) 서로 인접하지 않지만 B 세포 핵산 서열 내에서는 인접하는 2개 이상의 서열(예: 생식계열 서열)에 의해, 예를 들어 서열의 접합 또는 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 암호화될 수 있다.
항원-결합 단백질의 그 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1의 친화도를 갖는 결합을 포함한다. 특이적 결합은 크기가 검출 가능하고, 적어도 하나의 관련되지 않은 표적에 발생하는 비특이적 결합과 구별될 수 있다. 특이적 결합은 특정 작용기 또는 특정 공간적 끼워맞춤(예를 들어, 열쇠와 자물쇠형) 사이의 결합 형성의 결과일 수 있는 반면에, 비특이적 결합은 일반적으로 반데르발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 항원-결합 단백질이 오직 하나의 표적에만 결합하는 것을 반드시 의미하지는 않는다.
“임의(optional 또는 optionally)"는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있는 것을 의미하고 그런 기술은 그 사건 또는 상황이 일어난 경우 및 일어나지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다.
값의 범위의 지정은 그 범위 이내 또는 상기를 한정하는 모든 정수, 그리고 그 범위 이내 정수에 의해 정의된 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 분명하지 않는 한, 용어 "약"은 언급된 값의 측정의 표준 오차 한계 (예를 들면, SEM) 이내 값을 포괄한다.
용어 "및/또는"은 관련된 열거된 항목들 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적으로 해석될 때 조합의 결핍 ("또는")을 나타내며 그러한 것들을 포함한다.
용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 한 구성원을 나타내며 또한 그 목록의 구성원들의 임의의 조합을 포함한다.
본문 중 단수 형태(“a”, “an”, 및 “the”)는 문맥상 명시적으로 달리 언급하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "단백질" 또는 "적어도 하나의 단백질"은, 이의 혼합물을 포함하는, 복수의 단백질을 포함할 수 있다
통계적으로 유의함은 p ≤0.05를 의미한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
I. 개요
골격근에서 특이적으로 발현되는 것으로 확인된 외인성 서열을 포함하는 비인간 동물 세포, 비인간 동물, 및 비인간 게놈, 및 이를 제조하기 위한 시약이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 외인성 서열은 유전자의 내인성 유전자좌에 통합된다.
골격근은 인체에서 3개의 유의한 근육 조직 중 하나이다. 각각의 골격근은 결합 조직 외피에 의해 함께 랩핑된 수천 개의 근섬유로 구성된다. 골격근 내의 개별 근섬유 다발은 근속(fasciculi)으로서 알려져 있다. 전체 근육을 둘러싸는 가장 바깥쪽의 결합 조직 외피는 근외막(epimysium)으로서 알려져 있다. 각 근속을 덮는 결합 조직 외피는 근주위막(perimysium)으로서 알려져 있고, 개별 근섬유를 둘러싸는 가장 안쪽의 외피는 근내막(endomysium)으로서 알려져 있다. 각각의 근섬유는 다수의 근필라멘트를 함유하는 근섬유를 함유한다.
근섬유들이 함께 다발화될 때, 모든 근섬유는 독특한 횡문 패턴으로 배열되어 골격근의 근본적인 수축 단위인 근절(sarcomer)을 형성한다. 두 개의 가장 중요한 근필라멘트는 구별되도록 배열되어 골격근 상에서 다양한 밴드를 형성하는 액틴 필라멘트와 및 미오신 필라멘트이다. 성숙한 근섬유로 분화되는 줄기 세포는 위성 세포(satellite cells)로서 알려져 있는데, 이는 기저막과 근섬유막(sarcolemma)(횡문근 섬유 세포를 둘러싸는 세포막) 사이에서 발견될 수 있다. 성장 인자에 의해 자극될 때, 줄기 세포는 분화하고 복제되어 새로운 근섬유 세포를 형성한다.
골격근의 주요 기능은 골격근의 고유한 흥분-근수축 결합 과정을 통해 일어난다. 근육은 골 건(bone tendon)에 부착되어 있으므로, 근육의 수축은 해당 골의 운동으로 이어지고, 이는 특정 운동을 수행할 수 있게한다. 골격근은 또한 구조적 지지를 제공하고 신체의 자세를 유지하는 데 도움을 준다. 골격근은 기관 특이적 단백질을 합성하기 위해 신체의 상이한 기관에 의해 사용될 수 있는 아미노산에 대한 저장원으로서의 작용도 한다. 골격근은 또한 체온항상성(thermostasis)을 유지하는 데 있어서 중심 역할을 하며, 배고플 때 에너지원의 역할을 한다. CACNG1 단백질은 골격근에서 특이적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물 세포 또는 비인간 동물의 게놈에서 이종 Cacng1 서열을 갖는 비인간 동물 세포 및 비인간 동물이 본원에 제공된다. 이종 Cacng1 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌 내에 삽입됨으로써, 유전적으로 변형된 내인성 Cacng1 유전자좌를 갖는 비인간 동물 세포 및 비인간 동물을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, Cacng1 서열의 적어도 일부를 암호화하는 이종 서열을 암호화하는 핵산, 및 이러한 핵산으로 비인간 동물 세포 및 비인간 동물을 만드는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산은 Cacng1 유전자를 암호화하는 서열의 측면에 위치하는 비인간 동물 부위(예: loxP 부위)의 편집을 용이하게 하는 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 비인간 동물 세포 및/또는 비인간 동물에 의해 생산된 키메라 CACNG1 단백질(들)에 대한 항체가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 이러한 비인간 동물(예를 들어 랫트 또는 마우스와 같은 설치류), 이러한 비인간 동물로부터 유래된 세포 및/또는 조직, 및 뉴클레오티드(예를 들어 표적화 벡터, 게놈 등)를 만드는 데 사용될 수 있는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 또한, 이종 Cacng11 서열을 갖는 유전적으로 변형된 내인성 CACNG1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 게놈을 제공한다. 일부 구현예에서, 이종 Cacng1 서열은 CACNG1 인간 단백질 서열을 암호화한다. 일부 경우에, CACNG1 도메인의 전부 또는 일부는, 결실되고 이종 Cacng1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하고 인간화 Cacng1 유전자좌로부터 인간화 또는 키메라 ASGR1 단백질을 발현하는 비인간 동물이 제공될 뿐만 아니라, 이러한 비인간 동물(예를 들어 랫트 또는 마우스와 같은 설치류), 이러한 비인간 동물로부터 유래된 세포 및/또는 조직, 및 이러한 동물을 만드는데 유용한 뉴클레오티드(예를 들어 표적화 벡터, 게놈 등)을 사용하는 방법도 제공된다.
일부 구현예에서, 변형된 CACNG1 단백질을 암호화하는 유전적으로 변형된 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물이 본원에 기술되며, 여기서 변형된 CACNG1 단백질은 인간 CACNG1 서열의 도메인을 포함하고, 상기 도메인의 전부 또는 일부는, 결실되고 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화되고, 비인간 동물은 변형된 Cacng1 단백질을 발현한다.
일부 구현예에서, 인간 CACNG1 서열의 도메인은, 결실되고 이종 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화된다. 이러한 도메인은 인간 Cacng1 세포외 도메인일 수 있다. 본 개시에 의해 고려되는 세포외 도메인을 암호화하는 적절한 서열은 세포 내에서 번역 후 CACNG1 단백질의 아미노산 30~108(서열번호 12), 아미노산 156~179(서열번호 20), 또는 둘 다에 상응하는 인간 세포외 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 CACNG1 서열의 적어도 2개의 도메인은 인간화 마우스 모델에서 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화된다. 인간 CACNG1 서열의 비제한적인 도메인의 예시적인 예는 세포질 도메인, 막관통 도메인, 및 세포외 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 각 도메인의 전부 또는 일부는, 결실되고 이종상동성 CACNG1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화될 수 있다. 다른 경우에, 세포질 도메인 및 세포외 도메인은 내인성 게놈에 의해 임의로 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포질 도메인 및 막관통 도메인 둘 다의 전부 또는 일부는, 결실되고 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 세포질 도메인, 막관통 도메인, 및 세포외 도메인의 전부는, 결실되고 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화된다. 후자는 인간 CACNG1 유전자의 다수의 인간화 도메인을 비인간 게놈에 통합하고; 전자는 막 내에 및 세포 내에 위치하는 것으로 이해되는 도메인 중 내인성 도메인을 보존하면서, 세포외 막을 인간화시킨다. 본 개시의 세포질 도메인(들)을 암호화하는 적절한 서열은, 세포 내에서 번역 후 CACNG1 단백질의 아미노산 1~10(서열번호 8), 아미노산 130~134(서열번호 16), 아미노산 205~222(서열번호 24), 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 인간 세포질 도메인을 생산한다. 본 개시의 막관통 도메인(들)을 암호화하는 적절한 서열은, 세포 내에서 번역 후 CACNG1 단백질의 아미노산 11~29(서열번호 10), 아미노산 109~129(서열번호 14), 아미노산 135~155(서열번호 18), 아미노산 180~204(서열번호 22), 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 인간 막관통 도메인(들)을 생산한다. 결과적으로, 일부 대안적인 구현예에서, 세포질 도메인 또는 막관통 도메인의 전부 또는 일부는 내인성 비인간 동물 Cacng1 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물 또는 비인간 동물 게놈은 내인성 마우스 Cacng1 서열 대신에 이종상동성 인간 CACNG1을 암호화한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물 또는 비인간 동물 게놈은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 CACNG1 서열은, 결실되고 전압 의존성 칼슘 채널의 전장 γ1 도메인을 암호화하는 인간 Cacng1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물 또는 비인간 동물 게놈은 유전적으로 변형된 내인성 Cacng1 유전자좌에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물 또는 비인간 동물 게놈은 유전적으로 변형된 내인성 Cacng1 유전자좌에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절은 결실되고 외인성 Cacng1 서열로 치환된다. 이들 경우 중 일부에서, 결실된 내인성 Cacng1 유전자좌는 3’ 비번역 영역의 분절, 코딩 엑손 1의 분절, 인트론 1의 분절, 코딩 엑손 2의 분절, 인트론 2의 분절, 코딩 엑손 3의 분절, 인트론 3의 분절, 코딩 엑손 4의 분절, 또는 내인성 Cacng1 유전자좌의 전술한 분절의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 CACNG1 서열은 비인간 동물 또는 비인간 세포 내의 유전자좌를 치환하는 데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 내인성 유전자좌의 분절을 치환하는 이종상동성 인간 CACNG1 서열은 인간 CACNG1 서열의 3’ 비번역 영역, 인간 CACNG1 서열의 엑손 1, 인간 CACNG1 서열의 인트론 1, 인간 CACNG1 서열의 엑손 2, 인간 CACNG1 서열의 인트론 2, 인간 CACNG1 서열의 엑손 2, 인간 CACNG1 서열의 인트론 3, 인간 CACNG1 서열의 엑손 3, 인간 CACNG1 서열의 인트론 4, 인간 CACNG1 서열의 엑손 4, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 분절을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유동물이거나, 비인간 동물 게놈은 포유류 게놈이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 설치류이거나, 비인간 동물 게놈은 설치류 게놈일 수 있다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 랫트 또는 마우스이거나, 비인간 동물 게놈은 랫트 게놈 또는 마우스 게놈일 수 있다.
일부 구현예에서, 비인간 동물의 게놈 또는 비인간 동물 게놈에 통합된 이종 서열은 인간 Cacng1 세포외 도메인, 인간 Cacng1 막관통 도메인, 및 인간 Cacng1 도메인을 암호화한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물의 게놈 또는 비인간 동물 게놈에 통합된 이종 서열은 인간 CACNG1 서열의 적어도 2개의 도메인을 암호화한다. 2개 이상의 도메인의 비제한적인 예는 제1 세포질 도메인, 제1 막관통 도메인, 제1 세포외 도메인, 제2 막관통 도메인, 제2 세포질 도메인, 제3 막관통 도메인, 제2 세포외 도메인, 제4 막관통 도메인, 제3 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물의 게놈 또는 비인간 동물 게놈에 통합된 이종 서열은 아미노산 1~10(세포질 도메인); 아미노산 11~29(막관통 도메인), 아미노산 30~108(세포외 도메인), 아미노산 109~129(막관통 도메인), 아미노산 130~134(세포질 도메인), 아미노산 135~155(막관통 도메인), 아미노산 156~179(세포외 도메인), 아미노산 180~204(막관통 도메인), 아미노산 205~222 세포질 도메인, 또는 이들의 임의의 적절한 조합을 암호화하기에 적절한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 CACNG1 단백질을 암호화하는 유전적으로 변형된 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포가 본원에 제공되며, 여기서 변형된 Cacng1 단백질은 인간 CACNG1 서열의 도메인을 포함하고, 상기 도메인의 전부 또는 일부는, 결실되고 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환된 내인성 Cacng1 유전자좌의 분절에 의해 암호화된다. 비인간 동물 세포는 골격근 세포, 다능성 세포, ES 세포, 또는 생식 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물을 만드는 방법, 또는 비인간 동물을 만드는 데 필요한 시약을 추가로 제공한다.
A. 칼슘 전압-개폐식 채널 보조 서브유닛 감마 1(CACNG1)
본원에 기술된 세포 및 비인간 동물은 일반적으로, CACNG1 단백질(예를 들어, 인간 CACNG1 단백질 도메인)의 분절을 암호화하는 외인성 서열을 함유한다. 전압 의존적 칼슘 채널은 일반적으로 5개의 서브유닛으로 구성된다. CACNG1 유전자에 의해 암호화된 단백질은 이들 서브유닛 중 하나를 나타낸다. 또한, CACNG1 유전자에 의해 암호화된 단백질인 감마(gamma)는 2개의 알려진 감마 서브유닛 단백질 중 하나이다. 이러한 특정 감마 서브유닛은 골격근 1,4-디하이드로피리딘-민감성 칼슘 채널의 일부이고 흥분-근수축 결합에 역할을 하는 일체형 막 단백질이다. 이 유전자는 PMP-22/EMP/MP20 계열의 기능적으로 다양한 8원 단백질 하위계열의 일부이며, 막관통 AMPA 수용체 조절 단백질(TARP)로서 기능하는 2개의 계열 구성원과 함께 클러스터 내에 위치한다.
인간 CACNG1을 암호화하는 유전자(CACNG1)는 염색체 17의 긴 아암 상에 위치한다. CACNG1은 4개의 엑손을 포함하고 대략 12,244 염기의 길이이다.
인간 CACNG1에 대한 예시적인 서열에는 NCBI 수탁 번호 NM_0007582.2가 할당된다(도 4a 참조). 마우스 Cacng1에 대한 예시적인 서열에는 NCBI 수탁 번호 NM_000727.4가 할당된다(도 4a 참조). 예시적인 인간 CACNG1 단백질에는 UniProt 수탁 번호 O70578이 할당된다(도 4a 및 도 5 참조). 예시적인 마우스 CACNG1 단백질에는 UniProt 수탁 번호 Q06432가 할당된다(도 4a 및 도 5 참조). 변형된 비인간 Cacng1 유전자좌(예: 7451)에 의해 암호화된 예시적인 인간 또는 인간화 CACNG1 단백질은 도 5에 제시되어 있다. 예시적인 랫트 CACNG1 단백질에는 NCBI 참조 서열: NP_062128.1이 할당된다. 예시적인 오랑우탄 Cacng1 단백질에는 NCBI 참조 서열: XP_002827789.2이 할당된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 이종 CACNG1 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈을 제공한다. 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 이러한 핵산 서열은 다음을 포함할 수 있다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합.
또한, 본원에 기술된 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈에 통합된 핵산 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; (vii) 인간 CACNG1 유전자의 3’ 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 CACNG1 단백질에 대한 인간화 코딩 영역(즉, 일부 마우스 조절 영역 및 선택 인간 비코딩/코딩 영역)을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 인간화 마우스/인간 CACNG1 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 에컨대 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 임의의 이러한 핵산은 내인성 Cacng1 유전자좌에 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 이종상동성 내인성 핵산 서열을 치환할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부가 다음을 포함하는 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 세포를 제공한다: (i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열; (ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열; (iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열; (iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열; (v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열; (vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열; (vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열; (viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열; (ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는 (x) (i) 내지 (ii)의 임의의 조합.
B. 변형된
Cacng1
비인간 동물
본 개시는 CACNG1 단백질의 기능 상실을 갖는 비인간 동물 및 키메라 동물(예를 들어 인간화 CACNG1 단백질을 발현하는 유전자이식 설치류)을 제공한다. 인간화 Cacng1 유전자좌는 전체 Cacng1 유전자가 상응하는 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환된 Cacng1 유전자좌이거나, Cacng1 유전자의 일부만이 상응하는 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환된(즉, 인간화된) Cacng1 유전자좌일 수 있다. 임의로, 상응하는 이종상동성 인간 CACNG1 서열은 비인간 동물에서의 코돈 사용에 기초하여 코돈 최적화되도록 변형된다. 치환된(즉, 인간화된) 영역은 엑손과 같은 코딩 영역, 인트론, 비번역 영역, 또는 조절 영역(예: 프로모터, 인핸서, 또는 전사 억제제-결합 요소)과 같은 비코딩 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일례로서, 인간 CACNG1 유전자의 1, 2, 3, 4, 또는 4개 모두의 엑손에 상응하는 엑손이 인간화될 수 있다. 예를 들어, 인간 CACNG1 유전자의 엑손 1~4에 상응하는 엑손이 인간화될 수 있다. 대안적으로, 항-인간-CACNG1 항원 결합 단백질에 의해 인식되는 에피토프를 암호화하는 Cacng1의 영역이 인간화될 수 있다. 또 다른 예로서, N-말단 세포질 도메인, 막관통 도메인, 또는 세포내 도메인 중 하나 이상 또는 전부가 인간화될 수 있다. 예를 들어, 세포외 도메인을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역의 전부 또는 일부가 인간화될 수 있고, 세포질 도메인을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역의 전부 또는 일부가 인간화될 수 있고/있거나, 막관통 도메인을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역의 전부 또는 일부가 인간화될 수 있다. 일 예에서, 막관통 도메인을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역의 전부 또는 일부만이 인간화될 수 있고, 세포질 도메인을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역의 전부 또는 일부만이 인간화될 수 있거나, 세포외 영역을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역(즉 에피토프로서 이용될 수 있는 영역)의 전부 또는 일부만이 인간화될 수 있다. 예를 들어, 내인성 N-말단 세포질 도메인, 내인성 막관통 도메인, 및 인간화 막관통 도메인(에피토프)을 갖는 키메라 Cacng1 단백질이 생산되도록 세포외 도메인을 암호화하는 Cacng1 유전자좌의 영역이 인간화될 수 있다. 마찬가지로, 인간 CACNG1 유전자의 1, 2, 3, 또는 4개 모두의 인트론에 상응하는 인트론이 인간화될 수 있다. 조절 서열을 포함하는 측면에 위치하는 비번역 영역도 인간화될 수 있다. 예를 들어, 5’ 비번역 영역(UTR), 3’ UTR, 또는 5’ UTR 및 3’ UTR 둘 다가 인간화될 수 있거나 5’ UTR, 3’ UTR, 또는 5’ UTR 및 3’ UTR 둘 다가 내인성으로 유지될 수 있다. 구체적인 일례에서, 3’ UTR은 인간화되지만, 5’ UTR은 내인성으로 유지된다. 이종상동성 서열에 의한 치환의 정도에 따라, 프로모터와 같은 조절 서열은 내인성이거나, 치환하는 인간 이종상동성 서열에 의해 공급될 수 있다. 예를 들어, 인간화 Cacng1 유전자좌는 내인성 비인간 동물 Cacng1 프로모터를 포함할 수 있다.
인간화 Cacng1 유전자좌에 의해 암호화된 Cacng1 단백질은 포유류(예: 인간) CACNG1 단백질로부터 유래되는 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cacng1 단백질은 인간 세포외 도메인, 인간 CACNG1 막관통 도메인, 및 인간 CACNG1 세포질 도메인 중 하나 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 일례로서, Cacng1 단백질은 인간 CACNG1 세포외 도메인만을 포함할 수 있다. 임의로, 인간화 Cacng1 유전자좌에 의해 암호화된 Cacng1 단백질은 내인성(즉, 고유한) 비인간 동물 Cacng1 단백질로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함할 수도 있다.
인간 CACNG1 단백질로부터 유래된 도메인은 완전히 인간화된 서열(즉, 해당 도메인을 암호화하는 전체 서열이 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환됨)에 의해 암호화될 수 있거나, 부분적으로 인간화된 서열(즉, 암호화된 도메인이 인간 CACNG1 단백질 내의 해당 도메인과 동일하도록, 해당 도메인을 암호화하는 서열의 일부가 이종상동성 인간 CACNG1 서열로 치환되고, 해당 서열을 암호화하는 나머지 내인성(즉, 고유한) 서열은 이종상동성 인간 CACNG1 서열과 동일한 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화될 수 있다.
일례로서, 인간화 Cacng1 유전자좌에 의해 암호화된 Cacng1 단백질은 인간 CACNG1 세포외 도메인(예: 인간 에피토프)을 포함할 수 있다. 임의로, 인간 CACNG1 막관통 도메인은 도 9a에 도시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지고, CACNG1 단백질은 고유 CACNG1의 활성을 유지한다(즉, 골격근에서 이의 기능을 유지함).
또 다른 예로서, 인간화 Cacng1 유전자좌에 의해 암호화된 CACNG1 단백질은 인간 막관통 또는 세포질 CACNG1 도메인을 포함할 수 있다. 임의로, 인간 CACNG1 세포외 도메인은 도 9a와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지고, Cacng1 단백질은 고유 CACNG1의 활성을 유지한다.
임의로, 인간화 Cacng1 유전자좌는 다른 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소의 예는 선택 카세트, 리포터 유전자, 재조합효소 인식 부위, 또는 다른 요소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간화 Cacng1 유전자좌는 다른 요소들을 결여될 수 있다(예를 들어 선택 마커 또는 선택 카세트가 결여될 수 있음). 적절한 리포터 유전자 및 리포터 단백질의 예는 본원의 다른 곳에 개시된다. 적절한 선택 마커의 예는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(neor), 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제(hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라아제(puror), 블라스티시딘 S 데아미나아제(bsrr), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt), 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-k)를 포함한다. 재조합효소의 예는 Cre, Flp, 및 Dre 재조합효소를 포함한다. Cre 재조합효소 유전자의 일 예는, 원핵 세포에서 Cre 재조합효소의 발현을 방지하기 위해 Cre 재조합효소를 암호화하는 2개의 엑손이 인트론에 의해 분리된 Crei이다. 이러한 재조합효소는 핵에 국소화하는 것(예컨대, NLS-Crei)을 용이하게 하기 위한 핵 국소화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 재조합효소 인식 부위는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인식되고 재조합 이벤트를 위한 기질의 역할을 할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 재조합효소 인식 부위의 예는 FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox, 및 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, 및 lox5171과 같은 lox 부위를 포함한다.
리포터 유전자 또는 선택 카세트와 같은 다른 요소는 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 자가-결실 카세트일 수 있다. 예를 들어, US 8,697,851 및 US 2013/0312129를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 일례로서, 자가-결실 카세트는, 마우스 Prm1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Crei 유전자(인트론에 의하여 분리되고, Cre 재조합효소를 암호화하는 두 엑손을 포함함) 및 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. Prm1 프로모터를 사용함으로써, 자가-결실 카세트는 F0 동물의 수컷 생식 세포에서 특이적으로 결실될 수 있다. 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표적화되는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본원의 다른 곳에서 기술된다. 또 다른 특정 예로서, 자가-결실 선택 카세트는 하나 이상의 프로모터(예를 들어, 인간 유비퀴틴 및 EM7 프로모터 둘 다)에 작동 가능하게 연결된 하이그로마이신 내성 유전자 암호화 서열, 이어서 폴리아데닐화 신호, 이어서 하나 이상의 프로모터(예를 들어, mPrm1 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 Crei 코딩 서열, 이어서 또 다른 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있고, 여기서 전체 카세트는 loxP 부위가 측면에 위치한다.
하나의 예시적인 인간화 Cacng1 유전자좌(예를 들어, 인간화 마우스 Cacng1 유전자좌)는 코딩 엑손 1~4가 Neo 자가-결실 카세트가 측면에 위치한 상응하는 인간 서열로 대체된 것이다. 이들 엑손은 Cacng1의 코딩 도메인을 암호화한다. 코딩 엑손 1, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 및 82 bp의 3’ 비번역 영역(UTR) 마우스 Cacng1의 일부를 상응하는 부분 코딩 엑손 1 서열, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 완전한 3’ UTR, 및 인간 CACNG1의 3’ UTR 다음의 추가 158 bp로 치환하고, 코딩 서열 시작부에 있는 15 bp를 마우스 서열로 유지하면, 이러한 비인간 동물이 제공된다. 도 4b 및 도 4c 참조.
Cacng1
hu/hu
마우스
본 개시는 외인성 Cacng1 유전자좌를 포함하는 세포 및 비인간 동물을 고려한다. 일부 구현예에서, 이종 Cacng1 유전자좌를 포함하는 세포 또는 비인간 동물은, 고유 Cacng1 단백질의 하나 이상의 단편이 이종 CACNG1 서열(예를 들어, 세포외 도메인의 전부 또는 일부; CACNG1 코딩 영역 전부)의 상응하는 단편으로 치환된 이종 CACNG1 단백질 또는 키메라 CACNG1 단백질을 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포 및 비인간 동물은 인간 CACNG1 단백질, 아미노산 1~10, 아미노산 11~29, 아미노산 30~108, 아미노산 109~129, 아미노산 130~134, 아미노산 135~155, 아미노산 156~179, 아미노산 180~204, 아미노산 205~222, 및/또는 이들의 조합을 암호화하는 외인성 핵산 서열을 포함한다.
기능 상실 Cacng1
-/-
마우스
유전자 편집 기술을 사용해 CACNG1-/- 마우스를 생성하여, CACNG1의 결실이 골격근 질량 또는 기능에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. 본원에 기술된 비인간 동물 중 일부는 Cacng1 유전자좌가 결여되어 있기 때문에, 이러한 비인간 동물은 기능 상실이 Cacng1 단백질에 미치는 영향에 대한 전체론적 방식의 이해를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 내인성 Cacng1 유전자의 녹아웃 돌연변이를 포함하는 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 녹아웃 돌연변이는 Cacng1 유전자 또는 이의 일부의 결실을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 녹아웃 돌연변이는 Cacng1 유전자의 전체 코딩 서열의 결실을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cacng1-/- 인간 동물 게놈은 아무런 CACNG1 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 임의의 현저한 돌연변이체 표현형을 나타내지 않는다(즉, 야생형 상대에 비해 통계적으로 유의한 임의의 측정 가능한 형질, 특히 근육 강도, 구조, 또는 기능적 형질을 제시하지 않음).
C. 이종
Cacng1
유전자좌를 포함하는 비인간 세포 및 비인간 동물
본원에 기술된 바와 같은 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물 세포 및 비인간 동물이 제공된다. 세포 또는 비인간 동물은 인간화 Cacng1 유전자좌에 대해서 이형접합체 또는 동형접합체일 수 있다. 이배체 유기체는 각각의 유전자좌에서 2개의 대립유전자를 갖는다. 대립유전자의 각각의 쌍은 특이적 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은, 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 존재하는 경우 동형접합체로서 기술되고, 2개의 대립유전자가 상이한 경우 이형접합체로서 기술된다.
본원에 제공된 비인간 동물 세포는, 예를 들어, Cacng1 유전자좌를 포함하거나 인간 CACNG1 유전자좌에 대해 상동성 또는 이종상동성인 게놈 유전자좌를 포함하는 임의의 비인간 세포일 수 있다. 세포는 진핵 세포일 수 있고, 여기에는, 예를 들어 진균 세포(예: 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 및 인간 세포가 포함된다. 동물은, 예를 들어 포유동물, 어류, 또는 조류일 수 있다. 포유류 세포는, 예를 들어 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 또는 햄스터 세포일 수 있다. 다른 비인간 포유동물은, 예를 들어 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 토끼, 말, 황소, 사슴, 들소, 가축(예컨대, 소, 거세소 등과 같은 소 종; 양, 염소 등과 같은 양 종; 및 돼지 및 멧돼지와 같은 돼지 종)을 포함한다. 조류는, 예를 들어 닭, 칠면조, 타조, 거위, 오리 등을 포함한다. 가축 및 농업용 동물 또한 포함된다. 용어 “비인간”은 인간을 배제한다.
세포는 임의 유형의 미분화 상태 또는 분화된 상태일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능성 세포, 다능성 세포(예를 들어 인간 다능성 세포 또는 마우스 배아 줄기(ES) 세포 또는 랫트 ES 세포와 같은 비인간 다능성 세포), 또는 비다능성 세포일 수 있다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형을 생성할 수 있는 미분화 세포를 포함하고, 다능성 세포는 2개 이상의 분화된 세포 유형으로 발달하는 능력을 가진 미분화된 세포를 포함한다. 이러한 다능성 및/또는 전능성 세포는, 예를 들어 ES 세포 또는 ES-유사 세포, 예컨대 유도된 만능 줄기(iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는, 배아 내로 도입된 후 발달 배아의 임의의 조직에 기여할 수 있는 배아 유래 전능성 또는 다능성 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래될 수 있고 3개의 척추동물 배엽(내배엽, 외배엽, 및 중배엽)의 어느 하나의 세포로 분화할 수 있다.
본원에서 제공된 세포는 생식 세포(예: 정자 또는 난모세포)일 수도 있다. 세포는 유사분열 능력이 있는 세포 또는 유사분열 불활성 세포, 감수분열 능력이 있는 세포 또는 감수분열 불활성 세포일 수 있다. 유사하게, 본원에 개시된 세포는 일차 체세포이거나 일차 체세포가 아닌 세포일 수도 있다. 체세포는 생식 세포(gamete), 배세포(germ cell), 생식 모세포(gametocyte), 또는 미분화 줄기세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 세포는 골격근 세포와 같은 근육 세포일 수 있다.
본원에 제공된 적합한 세포는 일차 세포를 또한 포함한다. 일차 세포는 유기체, 기관, 또는 조직으로부터 직접 단리된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 일차 세포는 형질 전환되지 않았고 불멸도 아닌 세포를 포함한다. 일차 세포는 유기체, 기관, 또는 조직으로부터 수득된 임의의 세포로서, 조직 배양물에서 이전에 계대되지 않았거나, 조직 배양물에서 이전에 계대되었지만 조직 배양물에서 무한정 계대될 수는 없는 임의의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 종래의 기술에 의해 단리될 수 있고, 예를 들어 근육 세포(예를 들어 골격근 세포)를 포함한다.
본원에서 제공되는 다른 적합한 세포는 불멸화 세포를 포함한다. 불멸화 세포는 다세포 유기체 유래의 세포로서, 정상적으로는 무한정 증식하지 않지만, 돌연변이 또는 변경을 통해 정상적인 세포 노화를 피하고 대신에 분열을 계속할 수 있는 세포를 포함한다. 이러한 돌연변이 또는 변경은 자연적으로 발생하거나 의도적으로 유도될 수 있다. 불멸화 세포주의 예는 근섬유 세포주이다. 불멸화 세포 또는 일차 세포는, 배양을 위해 사용되거나 재조합 유전자 또는 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있는 세포를 포함한다.
본원에서 제공된 세포는 1세포기 배아(즉, 수정된 난모세포 또는 접합자)도 포함한다. 이러한 1세포기 배아는 임의의 유전적 배경(예를 들어, 마우스의 경우 BALB/c, C57BL/6, 129, 또는 이들의 조합)으로 부터 유래될 수 있고, 신선하거나 동결된 것일 수 있고, 자연 교배 또는 시험관 내 수정으로부터 유도될 수 있다.
본원에서 제공된 세포는 정상적인 건강한 세포일 수 있거나, 질환 세포 또는 돌연변이 보유 세포일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 본원의 다른 곳에 기술된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 동물은, 예를 들어 포유동물, 어류, 또는 조류일 수 있다. 비인간 포유동물은, 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 말, 황소, 사슴, 들소, 양, 토끼, 설치류(예: 마우스, 랫트, 햄스터, 및 기니피그), 및 가축(예: 소 및 거세우와 같은 소 종; 양, 염소와 같은 양 종; 및 돼지 및 멧돼지와 같은 돼지 종)을 포함한다. 조류는, 예를 들어 닭, 칠면조, 타조, 거위, 및 오리를 포함한다. 가축 및 농업용 동물 또한 포함된다. 용어 “비인간 동물”은 인간을 배제한다. 바람직한 비인간 동물은, 예를 들어 마우스 및 랫트와 같은 설치류를 포함한다.
비인간 동물은 임의의 유전적 배경으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 마우스는 129 계통, C57BL/6 계통, 129와 C57BL/6의 잡종, BALB/c 계통, 또는 Swiss Webster 계통으로부터 유래될 수 있다. 129 계통의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예: 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 포함한다. 예를 들어, Festing 등의 문헌[(1999) Mammalian Genome 10:836]을 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. C57BL 계통의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 포함한다. 적합한 마우스는 전술한 129 계통 및 전술한 C57BL/6 계통의 잡종(예: 50% 129 및 50% C57BL/6)으로부터 유래될 수도 있다. 마찬가지로, 적합한 마우스는 전술한 129 계통의 잡종 또는 전술한 BL/6 계통의 잡종(예: 129S6(129/SvEvTac) 잡종)으로부터 유래될 수 있다.
유사하게, 랫트는, 예를 들어 ACI 랫트 계통, 검은 아구티(Dark Agouti, DA) 랫트 계통, 위스타 랫트 계통, LEA 랫트 계통, 스프래그 다울리(SD) 랫트 계통, 또는 피셔 F344나 피셔 F6과 같은 피셔 랫트 계통을 포함하는 임의의 랫트 계통으로부터 유래될 수 있다. 랫트는 위에 인용된 둘 이상의 계통의 잡종으로부터 유래된 계통으로부터 수득될 수도 있다. 예를 들어, 적합한 랫트는 DA 계통 또는 ACI 계통으로부터 유래될 수 있다. ACI 랫트 계통은 흰 배와 다리 및 RT1 av1 일배체형을 가진 검은 아구티를 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 계통은 Harlan Laboratories를 포함하여 다양한 공급원으로부터 입수할 수 있다. 검은 아구티(DA) 랫트 계통은 아구티 외피(coat) 및 RT1 av1 일배체형을 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하여 다양한 공급원으로부터 입수할 수 있다. 일부 적합한 랫트는 근친 교배시킨 랫트 계통으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, US 2014/0235933를 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
III. 이종 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 만드는 방법
본원의 다른 곳에 개시된 바와 같은 이종 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 만드는 다양한 방법이 제공된다. 유전적으로 변형된 유기체를 생산하기 위한 임의의 편리한 방법 또는 프로토콜은 유전적으로 변형된 이러한 비인간 동물을 생산하는데 적합하다. 예를 들어, Cho 등의 문헌[(2009) Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22] 및 Gama Sosa 등의 문헌[(2010) Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109]을 참조하고, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 유전적으로 변형된 이러한 비인간 동물은, 예를 들어 표적화된 Cacng1 유전자좌에서 유전자 녹인(knock-in)을 통해 생성될 수 있다.
예를 들어, 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 생산하는 방법은 다음을 포함할 수 있다: (1) 다능성 세포의 게놈이 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하도록 이를 변형시키는 단계; (2) 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 유전적으로 변형된 다능성 세포를 식별 또는 선택하는 단계; (3) 유전적으로 변형된 다능성 세포를 시험관 내에서 비인간 동물 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 배아를 대리모에게 이식하고 및 임신시키는 단계. 임의로, 변형된 다능성 세포(예를 들어, 비인간 ES 세포)를 포함하는 숙주 배아는 배반포 단계에 도달할 때까지 배양된 후, F0 비인간 동물을 생산하기 위해 대리모에게 이식되고 임신될 수 있다. 그런 다음, 대리모는 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는 F0 세대 비인간 동물을 생산할 수 있다.
상기 방법은 변형된 표적 게놈 유전자좌를 갖는 세포 또는 동물을 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 표적화된 유전적 변형을 갖는 세포 및 동물을 동정하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다.
스크리닝 단계는, 예를 들어 부모 염색체의 대립유전자(MOA)의 변형을 평가하기 위한 정량 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량 검정은 실시간 PCR과 같은 정량적 PCR(qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 게놈 유전자좌를 인식하는 제1 프라이머 세트, 및 비-표적화된 기준 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다.
적절한 정량적 검정의 다른 예에는, 형광-매개 인시츄 혼성화(fluorescence-mediated in situ hybridization; FISH), 비교 게놈 혼성화(comparative genomic hybridization), 등온 DNA 증폭(isothermic DNA amplification), 고정 프로브(immobilized probe(s)), INVADER® 프로브, TAQMAN® 분자 비콘 프로브, 또는 ECLIPSE™ 프로브 기술이 포함된다(예를 들어, US 2005/0144655를 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합됨).
적절한 다능성 세포의 예는 배아 줄기(ES) 세포(예: 마우스 ES 세포 또는 랫트 ES 세포)이다. 변형된 다능성 세포는, 예를 들어 다음에 의한 재조합을 통해 생성될 수 있다: (a) 5’ 및 3’ 표적 부위에 상응하는 5’ 및 3’ 상동성 아암(arm)이 측면에 위치하는 삽입 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터를 세포 내에 도입하되, 삽입 핵산은 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함하는, 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전자좌에 통합된 삽입 핵산을 게놈에서 포함하는 적어도 하나의 세포를 동정하는 단계. 대안적으로, 변형된 다능성 세포는 다음에 의해 생성될 수 있다: (a) 다음을 세포 내로 도입하는 단계: (i) 표적 게놈 유전자좌 내의 인식 부위에서 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 뉴클레아제 제제; 및 (ii) 인식 부위에 충분히 근접하여 위치된 5’ 및 3’ 표적 부위에 상응하는 5’ 및 3’ 상동성 아암이 측면에 위치하는 삽입 핵산을 포함하는 하나 이상의 표적화 벡터로서, 삽입 핵산은 이종 Cacng1 유전자좌를 포함하는, 하나 이상의 표적화 벡터; 및 (c) 표적 게놈 유전자좌에서 변형(예를 들어, 삽입 핵산의 통합)을 포함하는 적어도 하나의 세포를 동정하는 단계. 원하는 인식 부위 내로 닉 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 임의의 뉴클레아제 제제를 사용할 수 있다. 적절한 뉴클레아제의 예는 전사 활성화제-유사 작동자 뉴클레아제(TALEN), 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, 및 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열(CRISPR)/CRISPR-연관 시스템(Cas) 또는 이러한 시스템의 구성요소(예: CRISPR/Cas9)를 포함한다. 예를 들어, US 2013/0309670 및 US 2015/0159175를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
공여자 세포는 배반포 단계 또는 상실배 전단계(즉, 4세포 단계 또는 8세포 단계)와 같은 임의의 단계에서 숙주 배아 내로 도입될 수 있다. 생식선을 통해 유전적 변형을 전달할 수 있는 자손이 생산된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호를 참조하고, 그 전체는 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
대안적으로, 본원의 다른 곳에서 기술된 비인간 동물을 생산하는 방법은 다음을 포함할 수 있다: (1) 다능성 세포를 변형시키기 위해, 1세포기 배아의 게놈이 이종 Cacng1 유전자좌를 포함하도록 상기 기술된 방법을 사용하여 이를 변형시키는 단계; (2) 유전적으로 변형된 배아를 선택하는 단계; 및 (3) 유전적으로 변형된 배아를 대리모에게 이식하고 임신시키는 단계. 생식선을 통해 유전적 변형을 전달할 수 있는 자손이 생산된다.
핵 전달 기술도 비인간 포유류 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게, 핵 전달을 위한 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (1) 난모 세포를 탈핵시키거나 탈핵된 난모 세포를 제공하는 단계; (2) 탈핵된 난모 세포와 결합될 공여자 세포 또는 핵을 단리하거나 제공하는 단계; (3) 공여자 세포 또는 핵을 탈핵된 난모 세포에 삽입하여 재구성된 세포를 형성시키는 단계; (4) 재구성된 세포를 동물의 자궁에 이식하여 배아를 형성시키는 단계; 및 (5) 배아를 발달시키는 단계. 이러한 방법에서, 난모 세포를 살아있는 동물의 난관(oviducts) 및/또는 난소(ovaries)에서 단리할 수도 있지만, 일반적으로는 죽은 동물로부터 수거한다. 탈핵된 난모 세포 내에 공여자 세포 또는 핵을 삽입하여 재구성된 세포를 형성하는 것은, 융합 이전에 투명대(zona pellucida) 아래에 공여자 세포를 미세주입하는 것에 의한 것일 수 있다. 융합은, 접촉/융합면에 걸쳐 DC 전기 펄스를 인가하거나(전기 융합), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합 촉진 화학물질에 세포를 노출시킴으로써 유도되거나, 센다이 바이러스(Sendai virus)와 같은 불활성화된 바이러스를 통해 유도될 수 있다. 재구성된 세포는 핵 공여자와 수여자 난모 세포의 융합 이전, 도중, 및/또는 이후에 전기적 및/또는 비전기적 수단에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 방법에는 전기 펄스, 화학적으로 유도된 충격, 정자에 의한 침투, 난모 세포에서 2가 양이온 수준을 증가시키는 것, 및 (키나아제 억제제를 통해) 난모 세포에서 세포 단백질의 인산화를 감소시키는 것이 포함된다. 활성화된 재구성된 세포 또는 배아는 배지에서 배양된 후, 동물의 자궁에 옮겨질 수 있다. 예를 들어, US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390, WO 2008/017234, 및 미국 특허 제7,612,250호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
본원에 제공된 다양한 방법을 사용해 유전적으로 변형된 비인간 F0 동물을 생산할 수 있으며, 여기서 유전적으로 변형된 F0 동물의 세포는 인간화 Cacng1 유전자좌를 포함한다. 이종 Cacng1 유전자좌를 갖는 F0 동물 내의 세포 수는 F0 동물을 생성하는 데 사용되는 방법에 따라 달라지는 것으로 인식된다. 예를 들어, VELOCIMOUSE® 방법을 통해 상응하는 유기체 유래의 상실배기 전 배아(예: 8세포기 마우스 배아) 내에 공여자 ES 세포를 도입하면, 더 높은 백분율의 F0 동물의 세포 집단이 표적화된 유전적 변형을 포함하는 관심 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포를 포함하게 할 수 있다. 예를 들어, 비인간 F0 동물에 기여한 세포의 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 표적화된 변형을 갖는 세포 집단을 포함할 수 있다.
유전적으로 변형된 F0 동물의 세포는 이종 Cacng1 유전자좌에 대한 이형접합체이거나, 이종 Cacng1 유전자좌에 대한 동형접합체일 수 있다.
상기 또는 하기에 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁 번호 등은 마치 각각의 개별 항목이 참조에 의해 구체적으로 및 개별적으로 그렇게 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조에 의해 통합된다. 상이한 버전의 서열이 다른 시점의 수탁 번호와 연관되는 경우, 본 출원의 유효 출원일 시점의 수탁 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는, 해당되는 경우, 수탁 번호가 언급된 우선 출원의 출원일 중 더 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로 다양한 버전의 간행물, 웹사이트 등이 다양한 시점에서 공개된 경우, 달리 지시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특징부, 단계, 요소, 구현예, 또는 구현예는 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명이 명료성 및 이해를 목적으로 예시와 예를 통해 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구범위의 범주 내에서 소정의 변화와 변형이 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈을 만드는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물의 게놈, 비인간 동물 세포의 게놈, 또는 비인간 동물 게놈에 삽입하는 단계를 포함한다.
다양한 키메라 핵산이 이러한 목적을 위해 특이적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 핵산 서열을 포함하는 기능적 CACNG1 단백질을 암호화하는 키메라 핵산 분자(변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자는 비인간 동물 CACNG1 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 상동성 핵산 서열과의 치환을 포함함)가 본원에 기술된 세포 또는 게놈을 유전적으로 편집하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 키메라 핵산 분자는 다음을 포함한다: (i) 인간 CACNG1 유전자는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열; (ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열; (iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열; (iv) 인간 CACNG1 유전자의 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열; (vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열; (v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; (vii) 인간 CACNG1 유전자의 3’ 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. 일부 경우에, 키메라 분자는 약물 선택 카세트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 핵산 분자는 다음을 포함한다: (i) 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 상류에 있는 5’ 상동성 아암 및 (ii) 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 하류에 있는 3’ 상동성 아암. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 아암 및 3’ 상동성 아암은 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합을 거치도록 구성되며, 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합 후에, 변형된 Cacng1 유전자는 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자를 치환하고, 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자의 발현을 유도하는 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 핵산 분자는 다음을 포함한다: (i) 서열번호 25로서 제시된 핵산 서열을 포함하는 5’ 상동성 아암 및/또는 (ii) 서열번호 26으로서 제시된 핵산 서열을 포함하는 3’ 상동성 아암. 일부 구현예에서, 키메라 핵산 분자는 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함한다.
서열의 간단한 설명
첨부하는 서열 목록에서 열거된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대한 3글자 코드를 사용하여 도시된다. 뉴클레오티드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부까지 정방향으로 (즉, 각 라인의 왼쪽에서 오른쪽 방향으로) 진행하는 표준 협약을 따른다. 각 뉴클레오티드 서열의 하나의 가닥만이 도시되어 있지만, 표시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 상보성 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단까지 정방향으로 (즉, 각 라인의 왼쪽에서 오른쪽 방향으로) 진행하는 표준 협약을 따른다.
| 서열번호 | 유형 | 설명 |
| 1 | DNA | mCacng1 - 코딩 서열 - NCBI 유전자 ID 12299 |
| 2 | 단백질 | mCACNG1 - UniProt ID O70578 |
| 3 | DNA | hCACNG1 코딩 서열 - NCBI 유전자 ID 786 |
| 4 | 단백질 | hCACNG1 - UniProt ID O70578 |
| 5 | DNA | 마우스/인간 CACNG1 cds의 인간 부분 |
| 6 | DNA | 마우스/인간 CACNG1 cds |
| 7 | 단백질 | 인간 CYT1의 아미노산 서열 |
| 8 | DNA | 인간 CYT1의 핵산 서열 |
| 9 | 단백질 | 인간 TM1의 아미노산 서열 |
| 10 | DNA | 인간 TM1의 핵산 서열 |
| 11 | 단백질 | 인간 EX1의 아미노산 서열 |
| 12 | DNA | 인간 EX1의 핵산 서열 |
| 13 | 단백질 | 인간 TM2의 아미노산 서열 |
| 14 | DNA | 인간 TM2의 핵산 서열 |
| 15 | 단백질 | 인간 CYT2의 아미노산 서열 |
| 16 | DNA | 인간 CYT2의 핵산 서열 |
| 17 | 단백질 | 인간 TM3의 아미노산 서열 |
| 18 | DNA | 인간 TM3의 핵산 서열 |
| 19 | 단백질 | 인간 EX2의 아미노산 서열 |
| 20 | DNA | 인간 EX2의 핵산 서열 |
| 21 | 단백질 | 인간 TM4의 아미노산 서열 |
| 22 | DNA | 인간 TM4의 핵산 서열 |
| 23 | 단백질 | 인간 CYT3의 아미노산 서열 |
| 24 | DNA | 인간 CYT3의 핵산 서열 |
| 25 | DNA | 마우스 5’ 아암 |
| 26 | DNA | 마우스 3’ 아암 |
| 27 | DNA | 7450 대립유전자 |
| 28 | DNA | 7451 대립유전자 |
| 29 | DNA | mCacng1 유전자좌 녹아웃 대립유전자(6866) |
| 30 | DNA | hCACNG1: 정방향- GGCGAGAGCTCGGAGATC |
| 31 | DNA | hCACNG1: 역방향- GGCTGCCCAGGATGATGAAG |
| 32 | DNA | hCACNG1: 프로브- TCGAATTCACCACTCAGAAGGAGTACA |
| 33 | DNA | mCACNG1: 정방향- CCGTGCACAACAAAGACAAGAG |
| 34 | DNA | mCACNG1: 역방향- GGCTGCCCAGGATGATGAAG |
| 35 | DNA | mCACNG1: 프로브- TGTGAGCACGTCACACCATCAGG |
실시예
실시예 1. CACNG1은 골격근에서 특이적으로 발현된다
골격근 디하이드로피리딘 수용체(DHPR)는 흥분-수축 결합에 관여하는 L형 칼슘 채널이다. 골격근 DHPR은 5개의 서브유닛으로 구성되는데, α1 서브유닛들은 리아노딘 수용체(ryanodine receptor)와의 물리적 상호작용을 통해 근육을 수축시켜 근질 망상으로부터의 칼슘 방출을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. γ1 서브유닛(CACNG1)은 골격근에서 고도로 및 특이적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 1a). 따라서, 다수의 상이한 접근법을 이용하여 상이한 치료제의 간-특이적 전달을 검증하는 데 사용하기 위해 인간화 Cacng1 마우스를 생성하였다.
실시예 2. CACNG1 녹아웃 마우스(CACNG1
-/-
)의 생성 및 분석
CACNG1-/- 마우스를 생성하고 자체 교배시켜 CACNG1의 결실이 골격근 질량 또는 기능에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. Cacng1 절제 작제물을 다음과 같이 설계하였다. 인간 UBC(유비퀴틴) 프로모터에 의해 조절되는 네오마이신 내성 유전자를 함유하고, lox 부위의 측면에 위치하는 lacZ 리포터 카세트가 시작 ATG 바로 다음에 시작되는 224 bp의 Cacng1 코딩 엑손 1을 대체하도록, Cacng1 게놈 서열을 함유하는 박테리아 인공 염색체를 변형시켰다. lacZ 코딩 서열이 시작 ATG와 같은 프레임에 있고 3’의 5 bp의 Cacng1 코딩 엑손 1이 카세트 다음에 유지되도록 카세트를 클로닝하였다. (도 2 참조) 이 작제물을 100% C57Bl/6NTac 배아 줄기 세포 내로 전기 천공하였다. 성공적으로 표적화된 클론은 TaqMan 분석에 의해 식별하였다. VelociGeneⓒ 방법(Valenzuela의 문헌[2003 Nat Biotech PMID:12730667]; Poueymirou의 문헌[2007 Nat Biotech PMID:17187059])을 사용해 Cacng1-/+ 마우스를 생성하고, 필요에 따라 동형접합성이 되도록(CACNG1-/-) 교배시켰다. 자가 결실 기술을 사용하여 F0 생식선에서 내성 카세트를 제거하였다.
성체(5 내지 7개월령) 수컷 WT 및 CACNG1-/- 마우스의 근육 조직을 조심스럽게 절개하고 칭량하여 근육량을 평가하였고, 단리된 장지 신근(EDL) 근육의 생체 외 수축성 측정을 수행하여 근육 기능을 평가하였다. 근육 수축성 측정은 Aurora Scientific 1300A 장치를 사용하여 수행하였다. EDL 근육을 조심스럽게 절제하고 봉합을 통해 근육 생리학적 장치에 부착하였다. 그런 다음, 95% O2/5% CO2로 산소화된 Krebs-Henseleit 완충액에서 최적의 길이로 근육을 평형화시키고, 이어서 최대 초과 이상성 전류로 자극하여 경련 반응을 유도하였다. 경련 자극 후, 40Hz, 60Hz, 80Hz, 100Hz, 및 125Hz에서의 자극을 통해 힘-주파수 강직 경련(tetanus) 곡선을 생성하되, 자극 사이에 2분의 휴식 시간을 두었다. 최대 힘 생성은 100Hz에서 기록하였다. 경련력 및 강직 경련력이 WT와 CACNG-/- 마우스 간에 유사하였으므로, CACNG1은 근육 기능을 조절하는 데 주요한 역할을 하는 것으로 보이지 않는다. 도 3a 및 3b 참조.
실시예 3. CACNG1 인간화 마우스(CACNG1
hu/hu
)의 생성 및 분석
Cacng1 표적화 작제물을 다음과 같이 설계하였다. 완전한 마우스 Cacng1 게놈 서열을 함유하는 박테리아 인공 염색체를 변형시켜 Cacng1 유전자좌를 인간화시켰다. 코딩 엑손 1의 일부, 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 및 82 bp의 3’ 비번역 영역(UTR) 마우스 Cacng1을 코딩 엑손 1 서열에서 첫 15 bp를 뺀 것(이 시작 서열은 마우스에서 유지됨), 인트론 1, 코딩 엑손 2~4(및 개재 인트론), 완전한 3’ UTR, 및 인간 CACNG1의 3’ UTR 다음의 추가의 158 bp로 이루어진 인간 CACNG1 서열로 치환하였다. 도 2a 내지 2c 참조. 자가 결실 네오마이신 내성 카세트를 인간 서열의 하류에 삽입하였고, 마우스의 3’ UTR의 나머지 부분도 따라서 삽입하였다. 자가 결실 네오마이신 내성 카세트의 결실 후 표적 부위를 도시하는 도 2a 내지 2c를 참조한다. 그런 다음, 이 표적화 벡터를 50% C57Bl/6NTac/50% 129SvEvTac 배아 줄기 세포주 내로 전기천공하였다. 성공적으로 표적화된 클론은 TaqMan 분석에 의해 식별하였다. Cacng1+/+ 마우스는 VelociGeneⓒ 방법(Valenzuela의 문헌[2003 Nat Biotech PMID:12730667]; Poueymirou의 문헌[2007 Nat Biotech PMID:17187059] 참조)을 사용해 생성하고, 필요에 따라 C57Bl/6NTac로 역교배하였다. 자가 결실 기술을 사용하여 F0 수컷 생식선에서 항생제 내성 카세트를 제거하였다.
유전자 발현 분석
TRIzol 균질화 및 클로로포름 상 분리를 통해 조직으로부터 총 RNA를 단리한 다음, 마이크로어레이 총 RNA 단리 키트용 MagMAX-96으로 정제하였다. RNAse-무함유 DNAse 세트를 사용하여 게놈 DNA를 제거하고, SuperScript VILO 마스터믹스를 사용하여 mRNA를 cDNA로 역전사시켰다. 12K Flex 시스템을 사용하여 SensiFAST 프로브 Lo-Rox로 cDNA를 증폭시켰다. Taqman 유전자 발현 검정을 사용하여 m18S(내인성 대조군)에 대비 인간(h) 및 마우스(m) CACNG1 발현을 결정하고, 비교 CT 방법(ΔΔCt)을 사용하여 데이터를 분석하였다. Taqman 프라이머/프로브 서열은 다음과 같았다: hCACNG1: 정방향- GGCGAGAGCTCGGAGATC (서열번호 30), 역방향- GGCTGCCCAGGATGATGAAG (서열번호 31), 프로브- TCGAATTCACCACTCAGAAGGAGTACA (서열번호 32); mCACNG1: 정방향- CCGTGCACAACAAAGACAAGAG (서열번호 33), 역방향- GCTCTCCCCTGGGTTGAAG (서열번호 34), 프로브- TGTGAGCACGTCACACCATCAGG (서열번호 35). 도 3a는 마우스 CACNG1(mCACNG1)의 발현이 CACNG1hu/hu 마우스 근육에서 qPCR에 의해 검출되지 않는 반면(좌측 그래프), 인간 CACNG1(hCACNG1)은 CACNG1hu/hu에서 발현되지만, WT 마우스 근육에서는 발현되지 않음(우측 그래프)을 입증하는 그래프이다.
단일 근섬유 단리 및 생염색
성체 수컷 CACNG1hu/hu 마우스의 비복근으로부터 단일 근섬유를 단리하였다. 근육을 조심스럽게 절제하고 DMEM 중 700U/mL 콜라게나제로 60분 동안 분해하였다. 화염-연마된 유리 파스퇴르 피펫으로 단일 근섬유를 단리하고, 여러 번의 분해 및 세척 라운드 후, 근섬유를 저접착성 조직 배양 플레이트에 밤새 도말하였다. 다음 날 아침, 인간-특이적, Alexa 647-접합된 CACNG1 항체를 살아 있는 단일 근섬유에 30분 동안 또는 4시간 동안 100 nM 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 근섬유를 DMEM으로 세척하고, 4% PFA에 고정시키고, DAPI에 대해 염색하였다. 그런 다음, 단일 섬유를 현미경 슬라이드에 옮기고, Fluoromount로 고정시키고, LSM880 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하였다. 도 3b 참조. 상기 실험은 100 nM의 Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1 Ab로 단일 골격 근섬유를 생염색하는 것이 CACNG1hu/hu 마우스로부터 단리된 근섬유에 대한 결합을 나타내지만, WT 마우스로부터 단리된 근섬유에 대한 결합을 나타내지 않음을 입증한다.
항체 분포에 대한 동결-형광 단층촬영(CryoFT) 영상화
성체 수컷 CACNG1hu/hu 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 10 mg/kg의 인간 특이적 Alexa 647-접합된 CACNG1 항체, Alexa 647-접합된 이소형 대조군 항체, 또는 식염수를 주입하였다. 주사 후 6일차에, CO2를 통해 마우스를 안락사시키고, 전체를 동결시키고, CryoFT 처리 및 영상화를 사용하여 평가하였다. 도 3c 참조. 10 mg/kg Alexa 647-접합된 인간-특이적 α-CACNG1-CACNG1 Ab를 주입한 CACNG1hu/hu 마우스의 이미지는, 주입 후 6일차에, 이소형 대조군 Ab와 비교하여 골격근에 대한 높은 특이성을 나타낸다.
항체 분포에 대한 면역형광 영상화
성체 수컷 CACNG1hu/hu 마우스에게 10 mg/kg의 인간 특이적 Alexa 647-접합된 CACNG1 항체, Alexa 647-접합된 이소형 대조군 항체, 또는 식염수를 피하 주입하였다. 주입 후 6일차에, 마우스를 PBS로 경심 관류시키고, 비복근/족저근/비장근 복합체를 OCT 포매 배지에 침지시키고, 액체 질소 냉각된 이소펜탄에서 동결시켰다. 조직을 12 μm 두께로 동결 절편화하고, 이어서 4% PFA로 고정시키고, 라미닌 및 DAPI에 대해 염색하였다. 슬라이드에 Fluoromount로 고정시키고, Axioscan 슬라이드 스캐너로 이미지를 촬영하였다. 도 3d 참조. 상단 패널은 생체 내 주입된 Ab로부터 내인성 Alexa 647 신호를 나타내고, 하단 패널은 근육 형태를 시각화하기 위한 라미닌 및 DAPI 공동 염색과 결합하는 Alexa647-Ab의 오버레이를 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (104)
- 비인간 동물 세포로서, 이종 칼슘 전압-개폐식 채널 보조 서브유닛 감마 1(CACNG1) 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 비인간 동물 세포.
- 제1항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 비인간 동물 세포:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는
(v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 비인간 동물 세포:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1을 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2를 포함하는 핵산 서열;
(v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3을 포함하는 핵산 서열;
(vii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열;
(viii) 인간 CACNG1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 핵산 서열; 또는
(ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌에 있는, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 이종상동성 내인성 핵산 서열을 치환하는, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 내인성 Cacng1 유전자좌를 포함하고, 내인성 Cacng1 유전자좌는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열과 이종 CACNG1단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 이형접합성 또는 동형접합성 치환을 포함하고,
내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성인, 비인간 동물 세포. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함하는, 비인간 동물 세포.
(i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열;
(v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열;
(vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열;
(viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열;
(ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는
(x) (i) 내지 (ix)의 임의의 조합. - 제1항 내지 제3항 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 포유류 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포는 설치류 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 세포는 랫트 세포 또는 마우스 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질은 전장 인간 CACNG1 단백질이고,
비인간 동물 세포는 그의 세포 표면에서 전장 인간 CACNG1 단백질을 발현하는, 비인간 동물 세포. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하는 비인간 동물 골격근 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않는 비인간 동물 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제13항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않고, 비인간 동물 세포는 골격근 세포가 아닌, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제13항 및 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않고, 비인간 동물 세포는 다능성 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제13항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않고, 비인간 동물 세포는 배아 줄기세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제13항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않고, 비인간 동물 세포는 생식 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 마우스 세포인, 비인간 동물 세포.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 마우스 세포이고, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 비인간 동물 세포.
- 이종 칼슘 전압-개폐식 채널 보조 서브유닛 감마 1(CACNG1) 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비인간 동물.
- 제23항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 비인간 동물:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는
(v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. - 제23항 또는 제24항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 비인간 동물:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1을 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2를 포함하는 핵산 서열;
(v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3을 포함하는 핵산 서열;
(vii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열;
(viii) 인간 CACNG1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 핵산 서열; 또는
(ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합. - 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌에 있는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 이종상동성 내인성 핵산 서열을 치환하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 내인성 Cacng1 유전자좌를 포함하고, 내인성 Cacng1 유전자좌는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열과 이종 CACNG1단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 이형접합성 또는 동형접합성 치환을 포함하고,
내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성인, 비인간 동물. - 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함하는, 비인간 동물:
(i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열;
(v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열;
(vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열;
(viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열;
(ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는
(x) (i) 내지 (ix)의 임의의 조합. - 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 포유 동물인, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 설치류인, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 랫트 또는 마우스인, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 전장 인간 CACNG1 단백질을 세포 표면에서 발현하는 비인간 근육 세포를 포함하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하는 비인간 동물 골격근 세포를 포함하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질은 전장 인간 CACNG1 단백질을 포함하고,
비인간 동물은 전장 인간 CACNG1 단백질을 세포 표면에서 발현하는 비인간 동물 골격근 세포를 포함하는, 비인간 동물. - 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 세포 표면에서 발현하지 않는 비인간 동물 세포를 포함하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제35항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 이의 골격근 세포의 세포 표면에서 발현하지 않는 비인간 동물 생식 세포를 포함하는, 비인간 동물.
- 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 랫트 또는 마우스인, 비인간 동물.
- 비인간 동물 게놈으로서, 이종 칼슘 전압-개폐식 채널 보조 서브유닛 감마 1(CACNG1) 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 비인간 동물 게놈.
- 제42항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 비인간 동물 게놈:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는
(v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. - 제42항 또는 제43항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 비인간 동물 게놈:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1을 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2를 포함하는 핵산 서열;
(v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3을 포함하는 핵산 서열;
(vii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열;
(viii) 인간 CACNG1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 핵산 서열; 또는
(ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합. - 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌에 있는, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 이종상동성 내인성 핵산 서열을 치환하는, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 게놈은 내인성 Cacng1 유전자좌를 포함하고, 내인성 Cacng1 유전자좌는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열과 이종 CACNG1단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 이형접합성 또는 동형접합성 치환을 포함하고,
내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성인, 비인간 동물 게놈. - 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함하는, 비인간 동물 게놈:
(i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열;
(v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열;
(vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열;
(viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열;
(ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는
(x) (i) 내지 (ix)의 임의의 조합. - 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 게놈은 포유류 핵산인, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 설치류 핵산인, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 랫트 게놈 또는 마우스 핵산인, 비인간 동물 게놈.
- 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 게놈은 마우스 핵산인, 비인간 동물 게놈.
- (a) CACNG1 단백질을 암호화하고, (b) CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 서열과 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 상동성 서열과의 치환을 포함하도록 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 핵산 서열을 포함하는 키메라 핵산 분자로서,
기능적 CACNG1 단백질을 암호화하는, 키메라 핵산 분자. - 제56항에 있어서, 키메라 핵산 서열은 비인간 동물 Cacng1 유전자의 프로모터 및/또는 조절 서열을 추가로 포함하는, 키메라 핵산 분자.
- 제57항에 있어서, 상동성 핵산 서열은 다음을 포함하는, 키메라 핵산 분자:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열;
(v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열;
(vii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열;
(viii) 인간 CACNG1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는
(ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합. - 제57항 또는 제58항에 있어서, 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자는 약물 선택 카세트를 추가로 포함하는, 키메라 핵산 분자.
- 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 추가로 포함하는 키메라 핵산 분자:
(i) 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 상류에 있는 5' 상동성 아암; 및
(ii) 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자의 하류에 있는 3' 상동성 아암. - 제60항에 있어서, 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암은 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와 상동성 재조합을 거치고,
관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합 이후, 변형된 비인간 동물 Cacng1 유전자는 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자를 치환할 수 있고, 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자의 발현을 유도하는 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 키메라 핵산 분자. - 제60항 또는 제61항에 있어서,
(i) 5' 상동성 아암은 서열번호 25로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나;
(ii) 3' 상동성 아암은 서열번호 26으로서 제시된 핵산 서열을 포함하는, 키메라 핵산. - 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 핵산의 핵산 서열은 서열번호 6으로 제시된 핵산 서열을 포함하는, 키메라 핵산 분자.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 비인간 동물 세포를 만드는 방법으로서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물 세포의 게놈 내에 삽입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제64항에 있어서, 비인간 동물 세포는 비인간 동물 배아 줄기(ES) 세포이고,
상기 삽입하는 단계는 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물 ES 세포의 게놈 내에 삽입하여, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물 ES 세포의 게놈에 포함하는 변형된 비인간 동물 ES 세포를 형성하는 것을 포함하는, 방법. - 제64항 또는 제65항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌 내에 삽입되는, 방법.
- 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입하는 단계는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열을 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 치환하는 단계를 포함하되,
내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성인, 방법. - 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 방법:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는
(v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. - 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 방법:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열;
(v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열;
(vii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열;
(viii) 인간 CACNG1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는
(ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합. - 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 방법.
- 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함하는, 방법:
(i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열;
(v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열;
(vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열;
(viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열;
(ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는
(x) (i) 내지 (ix)의 임의의 조합. - 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질은 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 포유류 세포인, 방법.
- 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포는 설치류 세포인, 방법.
- 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포인, 방법.
- 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물 세포는 마우스 세포이고, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 방법.
- 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입하는 단계는 비인간 동물 세포의 게놈을 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 키메라 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제64항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입하는 단계는 비인간 동물 세포의 게놈을 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항의 키메라 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항의 비인간 동물을 만드는 방법으로서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 내에 삽입하여, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 비인간 동물 ES 세포의 게놈에 포함하는 변형된 비인간 동물 ES 세포를 형성하는 단계;
시험관 내에서 비인간 동물 ES 세포를 숙주 배아 세포 내로 도입하는 단계; 및
비인간 대리모 동물에서, 변형된 비인간 동물 ES 세포를 포함하는 숙주 배아 세포를 임신시키는 단계로서, 임신 후, 비인간 대리모 동물은 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 생식 세포를 포함하는 비인간 동물 자손을 출산하는, 단계를 포함하는 방법. - 제80항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 Cacng1 유전자좌 내에 삽입되는, 방법.
- 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 삽입하는 단계는 내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열을 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 치환하는 단계를 포함하되,
내인성 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 핵산 서열 및 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 이종상동성인, 방법. - 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 방법:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열; 또는
(v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합. - 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함하는, 방법:
(i) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 1을 포함하는 핵산 서열;
(ii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 1의 핵산 서열;
(iii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 2를 포함하는 핵산 서열;
(iv) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 2의 핵산 서열;
(v) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 3을 포함하는 핵산 서열;
(vi) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 인트론 3의 핵산 서열;
(vii) 인간 CACNG1 유전자 또는 이의 일부의 엑손 4를 포함하는 핵산 서열;
(viii) 인간 CACNG1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)의 핵산 서열; 또는
(ix) (i) 내지 (viii)의 임의의 조합. - 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 5로서 제시된 핵산 서열, 서열번호 27로서 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 28로서 제시된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 방법.
- 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 인간 CACNG1 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부는 다음을 포함하는, 방법:
(i) 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 12로서 제시된 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 14로서 제시된 아미노산 서열;
(v) 서열번호 16으로서 제시된 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 18로서 제시된 아미노산 서열;
(vii) 서열번호 20으로서 제시된 아미노산 서열;
(viii) 서열번호 22로서 제시된 아미노산 서열;
(ix) 서열번호 24로서 제시된 아미노산 서열; 또는
(x) (i) 내지 (ix)의 임의의 조합. - 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질은 서열번호 4로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 포유동물인, 방법.
- 제80항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 설치류인, 방법.
- 제80항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포인, 방법.
- 제80항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 마우스이고, 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6으로서 제시된 핵산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어지는, 방법.
- 이종 CACNG1 단백질에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하되, 비인간 동물은 골격근 세포의 표면에서 이종 CACNG1 단백질 또는 이의 세포외 도메인을 발현하는, 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항의 비인간 동물, 또는 제80항 내지 제92항 중 어느 한 항의 방법에 따라 만들어진 비인간 동물.
- 제93항에 있어서, 이종 CACNG1 단백질은 인간 CACNG1 단백질인, 비인간 동물.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 비인간 동물은 마우스인, 비인간 동물.
- 내인성 Cacng1 유전자의 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
- 제96항에 있어서, 녹아웃 돌연변이는 Cacng1 유전자 또는 이의 일부의 결실을 포함하는, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
- 제96항 또는 제97항에 있어서, 녹아웃 돌연변이는 Cacng1 유전자의 전체 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
- 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 아무런 CACNG1 단백질을 발현하지 않는, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
- 제96항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 임의의 현저한 돌연변이체 표현형을 나타내지는 않는, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
- 제96항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈은 서열번호 29로서 제시된 서열을 포함하는 내인성 Cacng1 유전자좌를 포함하는, 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
- CACNG1 녹아웃 비인간 동물을 만드는 방법으로서, 녹아웃 돌연변이를 포함하도록 비인간 동물의 내인성 Cacng1 유전자좌를 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
- 표적화 벡터로서,
(i) 5' 상동성 아암; 및
(ii) 3' 상동성 아암을 포함하되,
5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암은 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와 상동성 재조합을 거치고,
관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌와의 상동성 재조합 후에, 표적화 벡터는 관심 비인간 동물 Cacng1 유전자좌에서 비인간 동물 Cacng1 유전자에 녹아웃 돌연변이를 삽입하는, 방법. - 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 만들어진 비인간 동물, 비인간 동물 세포, 또는 비인간 동물 게놈.
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