KR20240100489A - 자가면역질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

자가면역질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20240100489A
KR20240100489A KR1020247011602A KR20247011602A KR20240100489A KR 20240100489 A KR20240100489 A KR 20240100489A KR 1020247011602 A KR1020247011602 A KR 1020247011602A KR 20247011602 A KR20247011602 A KR 20247011602A KR 20240100489 A KR20240100489 A KR 20240100489A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
seq
mol
enhancer
cells
Prior art date
Application number
KR1020247011602A
Other languages
English (en)
Inventor
지아 엘. 울프
조나톤 시미언 마크스-블루쓰
바비 개스퍼
퍼빈더 사구
키아라 레치
Original Assignee
오차드 테라퓨틱스 (유럽) 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오차드 테라퓨틱스 (유럽) 리미티드 filed Critical 오차드 테라퓨틱스 (유럽) 리미티드
Publication of KR20240100489A publication Critical patent/KR20240100489A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule

Abstract

자가면역질환을 갖거나 자가면역질환이 발생될 위험에 있는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용해서, CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포(예를 들어, Foxp3 프로모터)에서 활성인 계통-특이적 전사 조절 요소의 제어하에 자가항원-결합 모이어티(예를 들어, 키메라 항원 수용체)를 발현시키도록 유전자 변형된 만능 조혈모세포가 환자에게 제공될 수 있다.

Description

자가면역질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법
서열목록
본 출원은 XML 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전체가 참조에 의해 원용된 서열목록을 포함한다. 2022년 8월 24일자로 생성된 상기 XML 사본은 파일명이 51139-032WO2_Sequence_Listing_8_24_22이고, 용량이 25,567 바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 유전자 변형된 만능 조혈모세포(pluripotent hematopoietic cell)로부터 유래된 조절 T 세포에 의한 자가면역질환의 치료 방법뿐만 아니라 이러한 방법에서 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.
조절 T(Treg) 세포는 면역 반응을 억제하는 데 중요한 역할을 함으로써, 항상성 및 자가관용(self-tolerance)을 유지하는 T 세포의 서브세트이다. Treg 결핍증 또는 기능장애는 여러 자가면역질환의 병리에 관련되어 있고, Treg 세포 요법은 이러한 질환의 잠재적인 치료 패러다임으로서 연구되어 왔다. Treg 세포 요법의 개발은 Treg 세포의 지속성, 안정성, 실현 가능성, 제조 및 투약량과 관련된 어려움에 의해 방해를 받아왔다. 자가면역질환의 치료를 위한 개선된 Treg 세포 요법이 여전히 필요하다.
본 개시내용은 자가면역질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 제1 양상에서, 본 개시내용은 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포의 집단을 환자에게 투여함으로써 자가면역질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)의 자가면역질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포에서 활성인(즉, 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에 비해 Treg 계통의 세포에서 우선적으로 활성인) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)에서 자가반응성 효과기 면역 세포 집단의 활성 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)에서 자가반응성 효과기 면역 세포의 세포자멸사를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)에서 내인성 조직을 자가면역 반응으로부터 보호하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자(예를 들어, 포유류 환자, 예컨대, 인간 환자)에서 염증을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
임의의 위의 양상의 일부 실시형태에서, 만능세포는 만능 조혈모세포(예를 들어, 조혈모세포, 즉, 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell: HSC) 또는 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell: HPC))이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 배아 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 유도 만능 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 림프구 전구세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 CD34+ 세포(예를 들어, HSC)이다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포의 집단은 환자에게 전신 투여된다. 예를 들어, 만능 조혈모세포의 집단은 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포의 집단은 환자에게 국소 투여된다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 환자에 대해 자가유래이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 환자에 대해 동종이계(예를 들어, HLA-매칭된 동종이계 세포)이다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC, HPC, 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 림프구 전구세포 및/또는 CD34+ 세포)는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입된다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 레트로바이러스과 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 위형 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 위형 아데노바이러스, 위형 파보바이러스, 위형 코로나바이러스, 위형 랍도바이러스, 위형 파라믹소바이러스, 위형 피코르나바이러스, 위형 알파바이러스, 위형 헤르페스 바이러스, 위형 폭스바이러스 및 위형 레트로바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 위형 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), RD114 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 인간 거품형성 바이러스(HFV), 월아이 진피 육종 바이러스(WDSV), 셈리키 삼림열 바이러스(SFV), 광견병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스(ALV), 소면역결핍 바이러스(BIV), 소 백혈병 바이러스(BLV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 신놈브레 바이러스(SNV), 체리 트위스트 잎 바이러스(ChTLV), 유인원 T-세포 백혈병 바이러스(STLV), 메이슨-화이저 원숭이 바이러스(MPMV), 다람쥐 원숭이 레트로바이러스(SMRV), 라우스-육종 바이러스(RAV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 조류 육종 바이러스(MH2), 조류 뇌척수염 바이러스(AEV), 알파 모자이크 바이러스(AMV), 조류 육종 바이러스 CT10 및 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 선택된 바이러스로부터의 외피 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 VSV-G 외피 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC, HPC, 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 림프구 전구세포 및/또는 CD34+ 세포)는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 생체외에서 형질감염된다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 양이온성 중합체, 다이에틸아미노에틸덱스트란, 폴리에틸렌이민, 양이온성 지질, 리포솜, 인산칼슘, 활성화된 덴드리머 및/또는 자기 비드를 사용하여 형질감염된다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 전기천공법, 뉴클레오펙션, 스퀴즈-천공법(squeeze-poration), 초음파 천공법, 광학 형질감염, 자기주입 및/또는 임팔레펙션(impalefection)에 의해 형질감염된다.
일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 전위요소의 일부이다. 일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 만능 조혈 세포의 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 혼입을 위한 트랜스포사제 인식 및 절단 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 분자는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자이고, 트랜스포사제 인식 및 절단 요소는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자에의 혼입을 촉진시킨다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 세포의 게놈 내의 표적 위치에서 단일-가닥 파손 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 뉴클레아제를 세포에 전달함으로써 얻어진다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 세포의 게놈 내의 표적 위치에 혼성화하는 가이드 RNA(gRNA)와 조합하여 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문구조 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR)-관련 단백질이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CRISPR-관련 단백질은 CRISPR-관련 단백질 9(Cas9) 또는 CRISPR-관련 단백질 12a(Cas12a)이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제와 접촉되지만, 세포는 추가적으로 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 촉진시키기 위해, 각각, 표적 위치에 대해 5' 및 표적 위치에 대해 3'에 위치된 핵산 서열과 충분히 유사한 핵산 서열을 갖는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 세포와 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 세포에 전달된다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스 또는 레트로바이러스과 바이러스이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스는 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 레트로바이러스과 바이러스는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 1:
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 2:
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 3
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 4
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 5
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 6
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 7
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 8
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 9
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 10
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 11
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 12
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 13
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 14
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 15
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 16
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 17
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 18
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 19
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는다.
서열번호 20
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 억제한다.
일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 단일쇄 항체 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 분자(scFv))이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28, CD8, IgG1/IgG4, CD4, CD7 또는 IgD 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28, CD3 제타, CD8, FcRIγ, CD4, CD7, OX40 또는 MHC(H2-Kb) 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD28 세포내 신호전달 도메인이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인의 N-말단 리더 서열은 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인으로부터 절단된다.
일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질이다. 일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 나노바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 1형 당뇨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심장근육병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, 크레스트(CREST) 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근염-섬유근통, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, 연소성 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합결합조직질환, 다발성경화증, 중증근무력증, 시신경 척수염, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발동맥염, 다발 연골염, 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경변증, 건선, 레이노 현상, 리플리 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 타카야수 혈관염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 또는 베게너 육아종증이다.
일부 실시형태에서, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 아쿠아포린 4, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 다발성경화증이고, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 1형 당뇨병이고, 자가항원은 인슐린, GAD-65, IA-2 또는 ZnT8이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 류마티스성 관절염이고, 자가항원은 콜라겐 II, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드 또는 HSP65이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 중증근무력증이고, 자가항원은 AChR, MuSK 또는 LRP4이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 루푸스이고, 자가항원은 히스톤 II A이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 갑상선 기능 저하증이고, 자가항원은 갑상선에서 발현되는 단백질이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 그레이브스병이고, 자가항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 심상성천포창이고, 자가항원은 이중가닥 DNA이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 건선이고, 자가항원은 이중가닥 DNA이다.
일부 실시형태에서, 자가면역질환은 시신경 척수염이고, 자가항원은 아쿠아포린 4이다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하기 전에, 전구세포 집단은 환자 또는 공여자로부터 단리되고, 전구세포는 생체외에서 확장 및 유전자가 변형되어 환자에게 투여되는 세포 집단을 수득한다. 일부 실시형태에서, 전구세포는 CD34+ HSC이고, 전구세포는 HSC 기능적 잠재력의 실질적인 손실없이 확장된다. 일부 실시형태에서, 환자 또는 공여자로부터 전구세포를 단리시키기 전에, 환자 또는 공여자에게는 하나 이상의 만능 조혈 세포 동원제(mobilization agent)가 투여된다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하기 전에, 내인성 만능 조혈모세포의 집단은 하나 이상의 조건화제를 환자에게 투여함으로써 환자에서 제거된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하기 전에 하나 이상의 조건화제를 환자에게 투여함으로써 환자에서 내인성 만능 조혈모세포의 집단을 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 조건화제는 비-골수파괴 조건화제이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 조건화제는 환자에서 CD34+ 세포의 집단을 고갈시킨다. 일부 실시형태에서, 고갈된 CD34+ 세포는 림프구 전구세포이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 조건화제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD117, HLA-DR, CD34, CD90, CD45 또는 CD133에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD117에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독소에 접합된다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여 시, 투여되는 세포 또는 이의 자손은 CD4+CD25+ Treg 세포로 분화된다.
일부 실시형태에서, 환자는 포유류이고, 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시형태에서, 포유류는 인간이고, 세포는 인간 세포이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 (i) 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포(예를 들어, 만능 조혈모세포)의 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소, 및 (ii) 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
임의의 위의 양상의 일부 실시형태에서, 만능세포는 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC 또는 HPC)이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 배아 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 유도 만능 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 림프구 전구세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 CD34+ 세포(예를 들어, HSC)이다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 위형 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 위형 아데노바이러스, 위형 파보바이러스, 위형 코로나바이러스, 위형 랍도바이러스, 위형 파라믹소바이러스, 위형 피코르나바이러스, 위형 알파바이러스, 위형 헤르페스 바이러스, 위형 폭스바이러스 및 위형 레트로바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 위형 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), RD114 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 인간 거품형성 바이러스(HFV), 월아이 진피 육종 바이러스(WDSV), 셈리키 삼림열 바이러스(SFV), 광견병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스(ALV), 소면역결핍 바이러스(BIV), 소 백혈병 바이러스(BLV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 신놈브레 바이러스(SNV), 체리 트위스트 잎 바이러스(ChTLV), 유인원 T-세포 백혈병 바이러스(STLV), 메이슨-화이저 원숭이 바이러스(MPMV), 다람쥐 원숭이 레트로바이러스(SMRV), 라우스-육종 바이러스(RAV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 조류 육종 바이러스(MH2), 조류 뇌척수염 바이러스(AEV), 알파 모자이크 바이러스(AMV), 조류 육종 바이러스 CT10 및 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 선택된 바이러스로부터의 외피 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 VSV-G 외피 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 생체외에서 형질감염된다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 양이온성 중합체, 다이에틸아미노에틸덱스트란, 폴리에틸렌이민, 양이온성 지질, 리포솜, 인산칼슘, 활성화된 덴드리머 및/또는 자기 비드를 사용하여 형질감염된다. 일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 전기천공법, 뉴클레오펙션, 스퀴즈-천공법, 초음파 천공법, 광학 형질감염, 자기주입 및/또는 임팔레펙션에 의해 형질감염된다.
일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 전위요소의 일부이다. 일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 만능 조혈 세포의 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 혼입을 위한 트랜스포사제 인식 및 절단 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 분자는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자이고, 트랜스포사제 인식 및 절단 요소는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자에의 혼입을 촉진시킨다.
일부 실시형태에서, 만능 조혈모세포는 세포의 게놈 내의 표적 위치에서 단일-가닥 파손 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 뉴클레아제를 세포에 전달함으로써 얻어진다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 세포의 게놈 내의 표적 위치에 혼성화하는 가이드 RNA(gRNA)와 조합하여 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문구조 반복부(CRISPR)-관련 단백질이다. 일부 실시형태에서, CRISPR-관련 단백질은 CRISPR-관련 단백질 9(Cas9) 또는 CRISPR-관련 단백질 12a(Cas12a)이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 세포는 뉴클레아제와 접촉되지만, 세포는 추가적으로 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 촉진시키기 위해, 각각, 표적 위치에 대해 5' 및 표적 위치에 대해 3'에 위치된 핵산 서열과 충분히 유사한 핵산 서열을 갖는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 세포와 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 세포에 전달된다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스 또는 레트로바이러스과 바이러스이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스는 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 레트로바이러스과 바이러스는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 단일쇄 항체 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 분자(scFv))이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28, CD8, IgG1/IgG4, CD4, CD7 또는 IgD 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28, CD3 제타, CD8, FcRIγ, CD4, CD7, OX40 또는 MHC(H2-Kb) 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD28 세포내 신호전달 도메인이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인의 N-말단 리더 서열은 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인으로부터 절단된다.
일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질이다. 일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자이다.
일부 실시형태에서, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 아쿠아포린 4, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 키트의 사용자에게 약제학적 조성물을 자가면역질환을 갖는 인간 환자에게 투여하도록 지시하는 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 포장 삽입물은 키트의 사용자에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 수행하도록 지시할 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 제공한다. 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한(예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산 카세트는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 단일쇄 항체 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 분자(scFv))이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28, CD8, IgG1/IgG4, CD4, CD7 또는 IgD 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28, CD3 제타, CD8, FcRIγ, CD4, CD7, OX40 또는 MHC(H2-Kb) 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD28 세포내 신호전달 도메인이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인은 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 인식 도메인의 N-말단 리더 서열은 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인으로부터 절단된다.
일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질이다. 일부 실시형태에서, 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자이다.
일부 실시형태에서, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 아쿠아포린 4, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 위형 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 위형 아데노바이러스, 위형 파보바이러스, 위형 코로나바이러스, 위형 랍도바이러스, 위형 파라믹소바이러스, 위형 피코르나바이러스, 위형 알파바이러스, 위형 헤르페스 바이러스, 위형 폭스바이러스 및 위형 레트로바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 위형 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), RD114 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 인간 거품형성 바이러스(HFV), 월아이 진피 육종 바이러스(WDSV), 셈리키 삼림열 바이러스(SFV), 광견병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스(ALV), 소면역결핍 바이러스(BIV), 소 백혈병 바이러스(BLV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 신놈브레 바이러스(SNV), 체리 트위스트 잎 바이러스(ChTLV), 유인원 T-세포 백혈병 바이러스(STLV), 메이슨-화이저 원숭이 바이러스(MPMV), 다람쥐 원숭이 레트로바이러스(SMRV), 라우스-육종 바이러스(RAV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 조류 육종 바이러스(MH2), 조류 뇌척수염 바이러스(AEV), 알파 모자이크 바이러스(AMV), 조류 육종 바이러스 CT10 및 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 선택된 바이러스로부터의 외피 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 위형 바이러스 벡터는 VSV-G 외피 단백질을 포함한다.
도 1A 및 도 1B는 PoC 연구를 위한 구성적 프로모터의 제어하에 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 가능하게 하도록 설계된 렌티바이러스 벡터 작제물의 개략도이다. 도 1A는 렌티바이러스 작제물 설계의 기본 구성성분을 나타내는 개략도이다. 단일쇄 가변 단편(scFv)은 항원 특이성이 알려진 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 서열을 연결함으로써 생성되었다. His-태그는 CAR의 검출을 촉진시키기 위해 도입되었다. 2세대 CAR 신호전달 도메인은 조절 T 세포 기능과의 양립 가능성을 위해 선택되었다. PoC 연구를 위해, 무관한 항원(irrelevant antigen: Ag)에 대해 특이성을 갖는 scFv(도 1B)는 시험관내 분석의 최적화를 가능하게 하기 위해 그리고 생체내 CAR 생물학의 안전성 및 기능을 시험하기 위해 선택되었다. RRE(Rev 반응 요소); cPPT(중심 폴리퓨린관); EFS(신장인자 1a 짧은 결합 서열); VL(가변 경쇄; VH(가변 중쇄); 우드처크 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE).
도 2A 내지 도 2C는 인간 T 세포주에서 항원-특이적 CAR의 발현을 입증하는 일련의 그래프이다. Jurkat T 세포는 렌티바이러스 벡터 (MOI5)로 형질도입되어 항원-특이적 CAR(aAg-CAR)을 발현시켰다. 도 2A는 스트렙타비딘-PE 접합체로 염색 전에 세포와 50,000pg/㎖ 바이오틴일화된 CAR 리간드(전체 단백질)를 인큐베이션시킴으로써 유세포분석(FC)에 의해 평가될 때, 72시간 후에 CAR 발현을 나타내는 그래프의 세트이다. FC 플롯은 생 Jurkat T 세포 상에서 개폐되어, 비형질도입 세포(음성 대조군) 및 형질도입 세포를 도시한다. CAR 리간드의 적정을 사용하여, 평균 형광 강도(MFI)로서 정량화된 수용체 발현을 평가하였다. 도 2B는 상이한 수준의 Ag-특이적 CAR을 발현시키는 Jurkat T 세포의 라이브러리를 생성하기 위해 사용한 MOI 적정을 나타내는 그래프의 세트이다. 이식유전자 벡터 복제수(VCN)(좌측 그래프)는 ddPCR에 의해 측정되는 한편, CAR+ 세포%는 (a)에 나타낸 바와 같이 정량화되었다. 도 2C는 VCN이 증가함에 따라 CAR 발현이 증가되는 것을 나타내는 그래프이며, 사용한 MOI의 척도로서 MFI로서 정량화된 FC에 의한 CAR 발현을 평가함으로써 확인되었다.
도 3A 및 도 3B는 인간 T 세포주에서 시험관내에서 항원-특이적 CAR 기능의 확인을 보여주는 그래프이다. 상이한 수준의 aAg-CAR을 발현시키는 형질도입된 Jurkat T 세포(도 2A 내지 도 2C에 나타낸 형질도입 효율)는 24시간 동안 시험관내에서 증가된 양의 CAR 리간드로 처리되었다. 도 3A는 평균 형광 강도(MFI)로서 정량화된 발현된 T 세포 활성화 마커, CD69(좌측 그래프) 및 CD25(우측 그래프)의 FC 분석에 의해 평가된 바와 같이 CAR 함수를 나타내는 그래프의 세트이다. 도 3B는 배양된 Jurkat T 세포로부터의 상청액이 수집되고 효소결합면역흡착측정법(ELISA)에 의해 IL-2 생산에 대해 평가된 실험 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터 지점은 평균 +/- SEM(n=3)을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4D는 형질도입된 1차 뮤린 T 세포가 기능적 항원-특이적 CAR을 발현시킨다는 것을 나타내는 그래프이다. 정제된, CD4+CD25- 미경험 비장 T 세포를 aAg-CAR의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터(MOI10)의 첨가 전에 CD3/CD28 마이크로비드를 이용하여 시험관내에서 활성화시켰다. 도 4A는, 72시간 후에, aAg-CAR의 발현이 FC 분석에 의해 확인되었다는 것을 나타내는 그래프의 세트이다. 플롯은 생, CD4+ T 세포 상에서 개폐된다. 음성 대조군으로서 비형질도입 세포를 사용하였다. 도 4B는 생, CD4+ T 세포의 %로서 정량화된 형질도입된 세포의 %를 나타낸다(n=4). 도 4C 및 도 4D는 형질도입된 CD4+CD25- T 세포를 48시간 동안 시험관내에서 증가된 농도의 CAR 리간드로 처리한 실험 결과를 나타낸다. MFI로서 정량화된 FC에 의해 CD69(우측 그래프) 및 CD25(좌측 그래프) 발현을 측정함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다(도 4C). 배양된 세포로부터의 상청액을 IL-2 분비에 대해 동시에 평가하였다. 데이터 지점은 평균 +/- SEM(n=4)을 나타낸다(도 4D).
도 5A 및 도 5B는 시험관내 CAR의 활성화 후, 형질도입된 1차 뮤린 조절 T 세포가 면역억제 사이토카인인 IL-10을 분비한다는 것을 나타내는 그래프이다. 정제된, CD4+CD25+ Tregs는 aAg-CAR의 발현을 위한 렌티바이러스 형질도입(MOI10) 전에 CD3/CD28 마이크로비드를 사용하여 시험관내에서 활성화되었다. 도 5A는, 72시간 후에, aAg-CAR의 발현이 FC 분석에 의해 확인되었다는 것을 나타내는 그래프이다. 플롯은 생, CD4+ T 세포 상에서 개폐된다. 도 5B는 형질도입된 CD4+CD25+ Treg가 배지 단독 또는 10㎍ CAR 리간드에서 48시간 동안 배양된 실험의 결과를 나타내는 그래프이다. 상청액을 수집하였고, IL-10 분비를 정량화하였다. 막대는 개개 데이터 지점이 표시된 평균 +/- SEM을 나타낸다(n=4). 통계학적 유의도는 독립표본 T 검정(unpaired T test)에 의해 평가하였다: ** p = 0.0019
도 6A 내지 도 6C는 형질도입된 뮤린 골수 HSC의 이식이 재구성된 면역 구획 내의 우선적인 FoxP3 프로모터 지시 이식유전자 발현을 갖는 조절 T 세포의 생성을 야기한다는 것을 나타낸다.　계통- BM 세포를 단리시켰고, Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현시키도록 설계된 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 이식 10주 후에, 재구성된 면역 구획 내에서 GFP의 발현을 평가하였다. 도 6A는 Treg 프로모터 설계를 나타내는 개략도이다. 작제물 내의 보존된 비암호 서열(CNS) 도메인 1, 2 및 3, Foxp3 프로모터 및 3'UTR 서열 요소는 Treg 구획 내의 이식유전자 발현을 향상시키는 한편, 다른 면역 서브세트 내에서 이식유전자 발현을 제한하도록 설계된다. GFP의 발현에 의해 평가된 프로모터 활성. 도 6B는 이식된 동물의 비장으로부터 유래된 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 GFP 발현 프로파일을 도시하는 대표적인 FC 플롯이다. 도 6C는 FC에 의해 표시된 면역 세포에서 평가된 Foxp3-프로모터의 활성을 나타낸다. GFP 발현은 MFI로서 정량화되었다. 개개 데이터 지점은 생물학적 복제를 나타내며, 막대는 평균 +/- SEM(n=4)을 나타낸다. BM(골수); DP(이중 양성); SP(단일 양성); MLN(장간막 림프절); pLN(말초 림프절).
도 7A 내지 도 7C는 형질도입된 뮤린 골수 HSC의 이식이 생체내 조절 T 세포를 발현시키는 CAR의 생성을 야기한다는 것을 나타낸다. 계통- BM 세포를 단리시켰고, 렌티바이러스 작제물로 형질도입하여 Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시켰다. 이식 10주 후에, 면역 구획 전체적으로 CAR 발현을 평가하였다. 골수 키메라 마우스에서 Treg 발생 및 기능의 변화를 생체내에서 측정하였다. 도 7A는 Treg 프로모터 설계의 구성성분을 나타내는 개략도이다. 항원-특이적 CAR의 발현에 의해 평가된 프로모터 활성. 도 7B는 이식된 동물의 비장으로부터 유래된 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 CAR 발현 프로파일을 도시하는 대표적인 FC 플롯이다. 도 7C는 생체외 FC 분석에 의해 평가할 때, CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 비장 조절 T 세포의 비슷한 수 및 표현형이 검출된다는 것을 나타내는 그래프의 세트이다. 정량화된 비장당 조절 세포의 총 수(좌측 그래프). 전사인자 Foxp3 및 표면 마커 CD25를 포함하는 중요한 조절 T 세포 유전자의 발현 수준은 각각 MFI로서 정량화한다(중간 및 우측 그래프). 개개 데이터 지점은 생물학적 복제를 나타내며, 막대는 평균 +/- SEM(CAR- n=4; CAR+ n=6)을 나타낸다. 유의미한 차이가 검출되지 않은 독립표본 T 세포 검정에 의해 통계학적 차이를 평가하였다.
도 8A 및 도 8B는 CAR을 발현시키는 형질도입된 뮤린 골수 HSC 유래 Treg가 관련없는 이식유전자를 발현시키는 Treg에 대해 비슷한 면역억제 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 계통- BM 세포를 단리시켰고, 렌티바이러스 작제물로 형질도입하여 Treg (Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시켰다. 이식 10주 후에, 말초 면역 기관으로부터 조절 T 세포를 단리시켰고, 시험관내에서 면역 기능의 변화에 대해 평가하였다. 도 8A는 Treg를 세포 추적자 바이올렛(cell tracer violet) 표지 효과기 T 세포와 함께 배양시킴으로써 CAR 발현 Treg를 면역억제 능력에 대해 평가한 실험의 결과를 나타낸다. 효과기 T 세포를 대조군 CAR- 또는 Ag-CAR+ Treg의 존재하에 96시간 동안 CD3/CD28 마이크로비드로 자극하였다. 대표적인 히스토그램은 표시된 실험 조건에 대한 세포 추적자 염료 프로파일을 도시한다. 도 8B는 세포 추적자 염료(Cell Tracer dye)의 희석에 의해 증식 반응이 정량화된 실험 결과를 나타낸다. 데이터는 분열을 겪은 세포 추적자 표지 세포의 백분율("증식%")로 나타낸다. 개개 데이터 지점은 생물학적 복제를 나타내며, 막대는 평균 +/- SEM(CAR- n=4; CAR+ n=6)을 나타낸다. 유의미한 차이가 검출되지 않은 세포의 각각의 비슷한 비에 대해 대응표본 T 검정에 의해 통계학적 유의도를 평가하였다.
도 9A 내지 도 9D는 형질도입된 뮤린 골수 HSC 유래 Treg가 항원-특이적 CAR 자극에 의해 활성화될 수 있고, 향상된 면역억제 잠재력을 입증한다는 것을 나타낸다. 계통- BM 세포를 단리시켰고, 렌티바이러스 작제물로 형질도입되어 Treg 특이적(Foxp3) 프로모터 또는 관련없는 이식유전자(대조군 CAR-)의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+)을 발현시켰다. 형질도입 후 10주에, 조절 T 세포를 말초 면역 기관으로부터 단리시켰고, CAR 리간드로 48시간 동안 시험관내에서 배양시켜 활성화를 평가하였다. 도 9A는 대표적인 히스토그램이 10㎍ CAR 리간드로 자극 후의 CD25 발현 수준 변화를 도시한다는 것을 나타낸다. 도 9B에서 MFI로서 대조군 CAR- 및 CAR+ 발현 조절 T 세포 상에서의 CD25 수준을 정량화한다. 도 9C 및 도 9D는 48시간 동안 CD3/CD28 마이크로비드의 부재(도 9C) 또는 존재하에(도 9D) 대조군(검정 원) 및 CAR 발현 Treg(흰색 정사각형)를 10㎍ CAR 리간드에 노출시킨 실험 결과를 나타낸다. 상청액을 수집하였고, IL10 분비를 ELISA에 의해 결정하였다. 통계학적 유의도는 p값이 나타난 대응표본 T 검정에 의해 평가하였다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "만능 세포"는 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발생되는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 만능 세포는 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)과 같은 조혈 계통의 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발생되는 능력을 갖는 만능 조혈 세포일 수 있다. 만능 조혈모세포의 예는 ESC, iPSC, 림프구 전구세포 및 CD34+ 세포이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "줄기세포" 및 "미분화 세포"는 여러 세포 유형으로 분화하는 발생 잠재력을 갖는 미분화 또는 부분적으로 분화된 상태의 세포를 지칭한다. 줄기세포는 기능적 잠재력을 유지하면서 증식할 수 있고, 더 많은 이러한 줄기세포를 생성할 수 있다. 줄기세포는 비대칭으로 분열할 수 있는데, 이는 필연적 비대칭 분화로 알려져 있으며, 하나의 딸 세포가 모 줄기세포의 기능적 잠재력을 보유하고, 다른 딸 세포는 모세포로부터 일부 분명한 다른 특정 기능, 표현형 및/또는 발생 잠재력을 발현시킨다. 딸 세포 자체는 증식하여 후속적으로 하나 이상의 성숙 세포 유형으로 분화되는 자손을 생산하도록 유도되는 한편, 또한 모 발생 잠재력을 갖는 하나 이상의 세포를 보유한다. 분화된 세포는 다능성 세포로부터 유래될 수 있으며, 그 자체가 다능성 세포 등으로부터 유래된다. 대안적으로, 집단 내 줄기세포의 일부는 대칭적으로 2개의 줄기세포로 분열될 수 있다. 따라서, 용어 "줄기세포"는 특정 환경하에서, 더 전문화 또는 분화된 표현형으로 분화되는 발생 잠재력을 갖고, 특정 환경하에서 실질적으로 분화되는 일 없이 증식하는 능력을 보유하는 세포의 임의의 서브세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 줄기세포라는 용어는 일반적으로 배아 세포 및 조직의 점진적인 다양화에서 발생되는 것과 같이, 분화에 의해, 예를 들어, 완전히 개별적인 특징을 획득함으로써, 후손(자손 세포)이 종종 다른 방향으로 전문화되는 자연 발생적 모세포를 지칭한다. 일부 분화 세포는 또한 더 큰 발생 잠재력이 있는 세포를 생성하는 능력을 갖는다. 이러한 능력은 자연적일 수 있거나, 다양한 인자로 치료 시 인공적으로 유도될 수도 있다. 줄기세포로 시작하는 세포는 분화된 표현형으로 진행될 수 있지만, 그 다음에, 줄기세포 표현형을 "반전"시키고 재발현시키도록 유도될 수 있으며, 반전이라는 용어는 당업자에 의해 "탈분화" 또는 "재프로그래밍" 또는 "역분화"로도 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "조혈줄기세포" 및 "HSC"는 자기재생되는 능력과 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 계통의 성숙 혈액 세포로 분화되는 능력을 갖는 미숙 혈액 세포를 지칭한다. 이러한 세포가 CD34+ 세포를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다는 것은 당업계에 알려져 있다. CD34+ 세포는 CD34 세포 표면 마커를 발현시키는 미숙 세포이다. 인간에서, CD34+ 세포는 위에 정의된 줄기세포 특성을 갖는 세포 하위집단을 포함하는 것으로 여겨지는 반면, 마우스에서, HSC는 CD34-이다. 또한, HSC는 또한 장기 재증식 HSC(LT-HSC) 및 단기 재증식 HSC(ST-HSC)를 지칭한다. LT-HSC 및 ST-HSC는 기능적 잠재력 및 세포 표면 마커 발현에 기반하여 분화된다. 예를 들어, 인간 HSC는 CD34+, CD38-, CD45RA-, CD90+, CD49F+ 및 lin-(CO2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11B, CD19, CD20, CD56, CD235A를 포함하는 성숙 계통 마커에 대해 음성)일 수 있다. 마우스에서, 골수 LT-HSC는 CD34-, SCA-1+, C-kit+, CD135-, Slamf1/CD150+, CD48- 및 lin-(Ter119, CD11b, Gr1, CD3, CD4, CD8, B220, IL-7ra를 포함하는 성숙 계통 마커에 대해 음성)일 수 있지만, ST-HSC는 CD34+, SCA-1+, C-kit+, CD135-, Slamf1/CD150+ 및 lin-(Ter119, CD11b, Gr1, CD3, CD4, CD8, B220, IL-7ra를 포함하는 성숙 계통 마커에 대해 음성)일 수 있다. 또한, ST-HSC는 항상성 조건하의 L T-HSC보다 덜 휴지상태(즉, 더 활성)이고, 더 증식성이다. 그러나, LT-HSC는 더 큰 자기 갱신 잠재력(즉, 이들은 성인기 내내 생존하고, 연속적 수용자를 통해 연속적으로 이식될 수 있음)을 갖는 반면, ST-HSC는 자기재생이 제한된다(즉, 이들은 제한된 기간 동안만 생존하고, 연속 이식 잠재력을 갖지 않음). 이러한 HSC 중 어느 것은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 선택적으로, ST-HSC는 이들의 상당히 증식성이기 때문에 유용하고, 따라서, 분화된 자손을 더 빠르게 생성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "조혈전구세포" 및 "HPC"는 자기재생되는 능력과 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 계통의 성숙 혈액 세포로 분화되는 능력을 갖는 미숙 혈액 세포를 지칭한다. 조혈전구세포의 예는 림프구 전구세포 및 골수성 전구세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "배아 줄기세포" 및 "ES 세포"는 적합한 조건하에 시험관내 배양물에서 유지될 수 있는 배반포의 속세포덩이(inner cell mass)로부터 유래된 배아-유래 재생성 또는 만능 줄기세포를 지칭한다. ES 세포는 3개의 척추동물 배엽, 예를 들어, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 중 어느 것의 세포로 분화할 수 있다. ES 세포는 또한 적합한 시험관내 배양 조건하에 무기한으로 증식하는 이들의 능력을 특징으로 한다. ES 세포는, 예를 들어, 문헌[Thomson et al., Science 282:1145 (1998)]에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 배아 줄기세포의 구조 및 기능성에 속하는 경우 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "유도 만능 줄기세포," "iPS 세포" 및 "iPSC"는 분화된 체세포로부터 직접 유래될 수 있는 만능 줄기세포를 지칭한다. 인간 iPS 세포는, 예를 들어, Oct3/4, Sox 패밀리 전사인자(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Soxl5), Myc 패밀리 전사인자(예를 들어, c-Myc, 1-Myc, n-Myc), Kruppel-유사 패밀리(KLF) 전사인자(예를 들어, KLF1, KLF2, KLF4, KLF5) 및/또는 관련된 전사인자, 예컨대, NANOG, LIN28 및/또는 Glis1을 포함할 수 있는 비-만능 세포에 리프로그래밍(reprogramming) 인자의 특정 세트를 도입함으로써 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 또한, 예를 들어, 전사인자 또는 계통 지정자의 작용을 모방하는 소분자인 miRNA의 사용에 의해 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 3개의 척추동물 배엽, 예를 들어, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 중 어느 것의 세포로 분화되는 이들의 능력을 특징으로 한다. 인간 iPS 세포는 또한 적합한 시험관내 배양 조건하에 무기한으로 증식하는 이들의 능력을 특징으로 한다. 인간 iPS 세포는, 예를 들어, 문헌[hashi and Yamanaka, Cell 126:663(2006)]에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 iPS 세포의 구조 및 기능성에 속하는 경우 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "자가유래"는 개체 자체의 세포, 조직, 핵산 분자 등으로부터 얻어지거나 유래된 세포, 조직, 핵산 분자 또는 다른 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단백질을 발현시키는 세포 집단(예를 들어, 만능세포 집단)과 관련하여, 자가유래 세포는 다음에 관심의 하나 이상의 단백질의 발현을 지시하는 벡터로 형질도입 또는 형질감염되는 요법을 받는 환자로부터 얻어진 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "동종이계"는 동일한 종의 상이한 대상체로부터 얻어지거나 유래된 세포, 조직, 핵산 분자 또는 다른 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단백질을 발현시키는 세포 집단(예를 들어, 만능세포 집단)과 관련하여, 동종이계 세포는 (i) 요법을 받고 있지 않은 대상체로부터 얻고, 이어서, (ii) 하나 이상의 목적하는 단백질의 발현을 지시하는 벡터로 형질도입 또는 형질감염된 것을 포함한다. 어구 "발현을 지시하다"는 발현될 하나 이상의 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 포함을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 관심 단백질의 발현을 향상시키는 추가 서열 모티프를 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "HLA-매칭된"은, 공여자가 조혈줄기세포 이식 요법을 필요로 하는 수용자에게 조혈줄기세포 접합을 제공하는 공여자와 같이, HLA 항원 중 어느 것도 공여자와 수용자 간에 미스매칭되지 않는 공여자-수용자 쌍을 지칭한다. HLA-매칭(즉, 6개의 대립유전자 모두가 매칭된 경우) 공여자-수용자 쌍은 내인성 T 세포 및 NK 세포가 들어오는 이식편을 외래종으로 인식할 가능성이 적기 때문에 이식 거부 위험이 감소되었고, 따라서, 이식에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성이 적다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "HLA-미스매칭된"은 조혈줄기세포 이식 요법을 필요로 하는 수용자에게 조혈줄기세포 접합을 제공하는 공여자와 같이, 적어도 하나의 HLA 항원이, 특히 HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-DR에 대해, 공여자와 수용자 간에 미스매칭되는 공여자-수용자 쌍을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하나의 일배체형은 매칭되고, 다른 하나는 미스매칭된다. HLA-미스매칭 공여자-수용자 쌍은, 내인성 T 세포 및 NK 세포가 HLA-미스매칭 공여자-수용자 쌍의 경우에 들어오는 이식편을 외래종으로서 인식할 가능성이 더 크기 때문에, HLA-매칭 공여자-수용자 쌍에 비해 이식거부 위험이 증가될 수 있으며, 따라서, 이러한 T 세포 및 NK 세포는 이식편에 대해 면역 반응을 일으킬 가능성이 더 크다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "기능적 잠재력"은 이것이 만능 세포, 예컨대, 조혈줄기세포에 속하는 경우, 1) 다분화능(과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 여러 상이한 혈액 계통으로 분화되는 능력을 지칭함); 2) 자기재생(모세포와 동등한 잠재력을 갖는 딸세포를 생성하는 줄기세포의 능력을 지칭하며, 이 능력은 소진없이 개체의 평생 동안 반복적으로 발생될 수 있음); 및 3) 줄기세포 또는 이의 자손이 이식받는 사람에게 재도입되어, 이들이 줄기세포 틈새에 있고 생산적이고 지속적인 세포 성장 및 분화를 재확립하는 능력을 포함하는 줄기세포의 기능적 특성을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "제거하다", "제거하는", "제거", "조건", "조건화" 등은 생체내 또는 생체외의 세포 집단에서의 하나 이상의 세포 고갈을 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 세포의 치료 집단과 같은 치료 조성물을 환자에게 투여하기 전에 환자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 질환에 대한 치료를 받고 있는 환자) 내에서 내인성 세포를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 새로-투여된 세포에 세포가 생착될 수 있는 환경을 제공하는 데 도움이 될 수 있다. 내인성 세포 집단의 제거는, 예를 들어, 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 결합하고 후속적으로 표적 세포의 사멸을 불러일으키는 항체 또는 항체-약물 접합체를 이용하여 특정 세포 유형을 선택적으로 표적화하는 방식으로 수행될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 제거는 특정 세포 유형으로 국한되지 않고 대신에 다양한 상이한 세포에 대한 이들의 세포독성 효과를 발휘할 수 있는 세포독성을 이용하여 비특이적 방식으로 수행될 수 있다. 제거의 예는 생체내 또는 시험관내 세포 집단에서 세포의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상)의 고갈을 포함한다. 세포 샘플 내의 세포 수를 정량화하는 것은 다양한 세포-계수 기법을 이용하여, 예컨대, 카운팅 챔버, 쿨터 계수기, 유세포 분석기 또는 당업계에 알려진 다른 세포 계수 방법의 사용을 통해 수행될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법에 따라 환자에서 세포 집단을 "제거하기 위해"(즉, 치료를 위해 환자를 조건화시키기 위해) 사용될 수 있는 예시적인 제제는 알킬화제, 예컨대, 질소 머스터드(예를 들어, 벤다무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 메클로르에타민 또는 멜팔란), 니트로소유레아(예를 들어, 카무스틴, 로무스틴 또는 스트렙토조신), 알킬 설포네이트(예를 들어, 부설판), 트라이아진(예를 들어, 다카바진 또는 테모졸로마이드) 또는 에틸렌이민(예를 들어, 알트레타민 또는 티오테파)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 조건화제는 내인성 만능세포의 특정 집단, 예컨대, 내인성 CD34+ HSC 또는 HPC의 집단을 선택적으로 표적화 및 제거하는 비-골수파괴 조건화제이다. 예를 들어, 하나 이상의 조건화제는 사이타라빈, 항흉선세포 글로불린, 플루다라빈 또는 이다루비신을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "조건" 및 "조건화"는 세포 집단(예를 들어, 만능세포, 예컨대, CD34+ 세포의 집단)을 함유하는 이식물의 수용자에 대해 대상체가 준비하는 과정을 지칭한다. 이러한 절차는, 예를 들어, 내인성 세포(예를 들어, 특히, 내인성 CD34+ 세포)를 선택적으로 고갈시켜 외인성 세포 이식에 의해 채워지는 빈 자리를 생성함으로써, 세포 이식물의 생착을 촉진시킨다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라서, 대상체는 내인성 세포(예를 들어, 특히 CD34+ 세포)를 제거할 수 있는 하나 이상의 제제, 방사선 요법 또는 이들의 조합을 대상체에게 투여함으로써 세포 이식 절차에 대해 조건화될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 유용한 조건화 요법은 골수제거성 또는 비-골수파괴성일 수 있다. 당업계에 잘 알려진 다른 세포-제거제 및 방법(예를 들어, 항체 및 항체-약물 접합체)이 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "골수제거성" 또는 "골수제거"는 전형적으로 세포독성제 또는 방사선에 대한 노출에 의해 조혈계를 실질적으로 손상 또는 파괴하는 조건화 요법을 지칭한다. 골수제거는 조혈계를 파괴하는 고용량의 세포독성제 또는 전신 방사선 조사에 의해 초래되는 완전한 골수제거를 포괄한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "비-골수파괴" 또는 "골수억제"는 숙주 유래의 모든 조혈 세포를 실질적으로 제거하지 않는 조건화 요법을 지칭한다.
조혈 줄기 및/또는 전구세포와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "동원"은, 세포가 전형적으로 존재하는 줄기세포 틈새(예를 들어, 골수)로부터 말초 순환으로 이러한 세포를 방출하는 것을 지칭한다. "동원제"는 줄기세포 틈새로부터 말초 순환으로 조혈 줄기 및/또는 전구세포의 방출을 유도할 수 있는 제제이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "확장제"는 생체외에서 주어진 세포 유형의 증식을 촉진시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 따라서, "조혈줄기세포 확장제" 또는 "HSC 확장제"는 생체외 조혈줄기세포 집단의 증식을 촉진시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 조혈줄기세포 확장제는 세포가 조혈줄기세포 기능적 잠재력을 보유하도록 조혈줄기세포의 집단 증식을 유발하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 조혈줄기세포 확장제는 아릴 탄화수소 수용체 길항제, 예컨대, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 미국 특허 제8,927,281호 및 제9,580,426호에 기재된 것, 및 특히 화합물 SR1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 추가적인 조혈줄기세포 확장제는 화합물 UM-171 및 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 미국 특허 제9,409,906호에 기재되어 있는 다른 화합물을 포함한다. 조혈줄기세포 확장제는 추가로 화합물 UM-171, 예컨대, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 US 2017/0037047에 기재된 화합물의 구조적 및/또는 입체이성질체 변이체를 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 추가적인 조혈줄기세포 확장제는 특히, 예를 들어, 개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2000/023567에 기재된 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제, 예컨대, 트리코스타틴 A, 트라폭신, 트라폭신 A, 클라미독신, 뷰티르산나트륨, 다이메틸 설폭사이드, 수베르아니리로하이드록삼산, m-카복시신남산 비스하이드록사마이드, HC-독소, Cyl-2, WF-3161, 데퓨데신(depudecin) 및 라디시콜(radicicol)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "T 세포"는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하는 림프구 유형을 지칭한다. T 세포는 세포 표면 상의 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대, B 세포 및 NK 세포와 구별될 수 있다. T 세포 수용체는 주조직 적합성 복합체(MHC) 내에서 유전자에 의해 암호화된 자기-분자와 관련된 항원을 인식함으로써 T 세포에 항원 특이성을 부여한다. 항원은 항원 제시 세포(APC), 바이러스 감염 세포 등의 표면 상에서 MHC 분자와 함께 나타날 수 있다. 각각 별개의 기능을 갖는 T 세포의 여러 서브세트(예를 들어, 효과기 T 세포, 조절 T 세포, T 헬퍼 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 자연살해 T(NKT) 세포, 점막 관련 불변 T 세포(MAIT) 및 감마 델타 T 세포(γδ T 세포))가 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 면역계를 조절하고, 자가-항원에 대한 관용을 유지하고, 자가면역질환을 예방하는 면역억제 T 세포의 하위집단을 지칭한다. 예를 들어, Treg 세포는 다른 T 세포 집단의 증식 및/또는 효과기 기능을 억제하는 능력을 갖는다. Treg 세포는 이들의 독특한 표면 단백질 제시에 기반하여 구별될 수 있다. 예를 들어, Treg 세포는 CD4, CD25, FOXP3 및/또는 CD17 바이오마커를 발현시키는 T 세포일 수 있다. Treg 세포는, 예를 들어, IL-2/IL-2 수용체-의존적 메커니즘을 통해 그리고 저해 사이토카인(예를 들어, IL-10, IL-35 및 TGF-β)의 생성에 의해 이들의 면역억제 효과를 실행한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "자가반응성 효과기 세포" 또는 "자가반응성 효과기 면역 세포"는 면역 효과기 반응의 촉진(예를 들어, 표적에 대한 면역 반응의 촉진)에 관련되고 자가항원을 인식하는 세포를 지칭한다. 자가반응성 효과기 면역 세포의 예는 B 세포, T 세포 및 자연살해(NK) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "세포 유형"은 유전자 발현 데이터에 기반하여 통계학적으로 분리 가능한 표현형을 공유하는 세포 그룹을 지칭한다. 예를 들어, 통상적인 세포 유형의 세포는 유사한 구조 및/또는 기능적 특징, 예컨대, 유사한 유전자 활성화 패턴 및 항원 제시 프로파일을 공유할 수 있다. 통상적인 세포 유형의 세포는 통상적인 조직(예를 들어, 상피조직, 신경조직, 결합조직 또는 근육조직)으로부터 단리된 것 및/또는 유기체에서 통상적인 기관, 조직계, 혈관 또는 다른 구조 및/또는 영역으로부터 단리된 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "자가항원-결합 단백질"은 대상체(예를 들어, 포유류 대상체, 예컨대, 인간 대상체)에서 내인성으로 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 단백질(예를 들어, 단일쇄 단백질 또는 복수의 폴리펩타이드 서브유닛으로 이루어진 단백질)을 지칭한다. 자가항원-결합 단백질의 예는 자가면역질환을 갖는 대상체에서 내인성으로 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 단일쇄 단백질, 예컨대, 키메라 항원 수용체 및 단일쇄 항체 단편이다. 자가항원-결합 단백질의 추가적인 예는 자가면역질환을 갖는 대상체에서 내인성으로 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 다중쇄 단백질, 예컨대, T 세포 수용체 및 전장 항체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "항체"(Ab)는 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자를 지칭하며, 키메라 항체, 인간화된 항체, 영장류화된 항체, 이형접합체 항체(예를 들어, 이중- 삼중- 및 사중-특이적 항체, 다이어바디, 트라이어바디 및 테트라바디) 및, 예를 들어, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG 및 scFv 단편을 포함하는, 항체의 항원-결합 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다클론성, 단클론성, 유전자 조작 및 다르게 변형된 형태의 항체를 포함한다. 또한, 달리 표시되지 않는 한, 용어 "단클론성 항체"(mAb)는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 무손상 분자뿐만 아니라 항체 단편(예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편)을 둘 다 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 무손상 항체의 Fc 단편을 결여하며, 동물의 순환으로부터 더 빠르게 제거되고, 무손상 항체보다는 비-특이적 결합을 적게 가질 수 있다(문헌[Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316 (1983)]; 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "항원-결합 단편"은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체 단편은 Fab, F(ab')2, scFv, SMIP, 다이어바디, 트라이어바디, 애피바디, 나노바디, 앱타머 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포괄된 결합 단편의 예는: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAb; (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb; (viii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (ix) 선택적으로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더 나아가, Fv 단편, VL 및 VH의 두 도메인이 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 짝지어져서 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426 (1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 생성될 수 있도록 하는 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기법을 이용하여 얻어질 수 있고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 효용을 위해 선별될 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기법, 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학적 절단에 의해, 또는 일부 실시형태에서, 당업계에 알려진 화학적 펩타이드 합성 절차에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "VH"는 Fv, scFv 또는 Fab의 중쇄를 포함하는 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL"에 대한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 경쇄를 포함하는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. 항체(Ab) 및 면역글로불린(Ig)는 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 표적에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 표적 특이성이 없는 항체와 다른 항체-유사 분자를 둘 다 포함한다. 천연 항체 및 면역글로불린은 보통 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이형사량체 당단백질이다. 천연 항체의 각 중쇄는 아미노 말단에서 가변 도메인(VH) 다음에 다수의 불변 도메인을 갖는다. 천연 항체의 각 경쇄는 아미노 말단에 가변 도메인(VL) 및 카복시 말단에 불변 도메인을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "상보성 결정 영역"(CDR)은 경쇄와 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 발견되는 초가변 영역을 지칭한다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 당업계에 인식되는 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 설명하는 아미노산 위치는 문맥 및 당업계에 알려진 다양한 정의에 따라 달라질 수 있다. 가변 도메인 내의 일부 위치는 이러한 위치가 한 세트의 기준 하에 초가변 영역 내에 있는 것으로 여겨질 수 있는 반면, 다른 기준 세트하에서는 초가변 영역 외부에 있는 것으로 여겨진다는 점에서 혼성 초가변 위치로 볼 수 있다. 이러한 위치 중 하나 이상은 연장된 초가변 영역에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체는 이러한 혼성 초가변 위치에 변형을 포함할 수 있다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에 이의 부분을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 입체배치를 주로 채택하는 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 각 사슬에서 CDR은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 FR 영역에 의해 근위에 함께 보유되고, 다른 항체 사슬로부터의 CDR에 의해, 항체의 표적 결합 부위 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987]; 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 표시되지 않는 한 Kabat 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 행해진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "가변 영역 CDR"은 서열 또는 구조 기반 방법을 사용하여 확인된 바와 같은 CDR 또는 상보성 결정 영역에 아미노산을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접 항원-결합 부위를 지칭한다. 이러한 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616, 1977 및 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242, 1991]에 의해; 문헌[Chothia et al., (J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987)]에 의해, 그래서 문헌[MacCallum et al., (J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996)]에 의해 기재되었으며, 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트를 포함한다. 용어 "CDR"은, 예를 들어, 서열 비교에 기반한 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FW 영역"은 CDR에 인접한 아미노산 잔기를 포함한다. FW 영역 잔기는, 예를 들어, 특히 인간 항체, 설치류-유래 항체(예를 들어, 뮤린 항체), 인간화된 항체, 영장류화된 항체, 키메라 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab 단편), 단일쇄 항체 단편(예를 들어, scFv 단편), 항체 도메인 및 이중특이성 항체에 존재할 수 있다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "힌지 영역"은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 항원-결합 부분(들) 사이에 위치된 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, IgG2 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 영역의 도메인, 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아이소타입, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fc 영역에 영향을 미치는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 단클론성 항체과 관련하여, 힌지 영역은 CH1 도메인을 CH2 및 CH3 도메인에 연결하는 각 중쇄 중심에 거의 위치된 폴리펩타이드이다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 힌지 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사슬 사이에 화학적 연결을 제공할 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체에서, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기는 쇄간 이황화결합을 형성함으로써, 중쇄 사이에 분명한 공유 결합을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체 힌지 영역은 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)]의 넘버링 시스템에 따라 넘버링되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체(예를 들어, 단클론성, 종종 인간 또는 인간화된 항체)를 지칭한다. 예를 들어, 결합 특이성 중 하나는 자가항원(예를 들어, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질)으로 향할 수 있고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 예를 들어, 세포-표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직-특이적 항원, 바이러스 유래 단백질, 바이러스로 암호화된 외피 단백질, 박테리아 유래 단백질 또는 박테리아 표면 단백질 등에 대한 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "키메라" 항체는 하나의 공급원 유기체, 예컨대, 래트 또는 마우스로부터 유래된 가변 도메인 서열(예를 들어, CDR 서열), 및 상이한 유기체(예를 들어, 특히 인간, 다른 영장류, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 고양이, 개, 기니피그, 소과의 구성원(예컨대, 특히 소, 들소, 버팔로, 엘크 및 야크), 소, 양, 말 또는 들소)의 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Morrison, Science. 229(4719):1202-7 (1985); Oi et al. BioTechniques. 4:214-221 (1986); Gillies et al. J. Immunol. Methods. 125:191-202 (1985)]; 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호 참조.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "다이어바디"는 각 폴리펩타이드 사슬이 동일한 펩타이드 사슬 상의 VH 및 VL 도메인의 분자내 결합을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커(예를 들어, 5개의 아미노산으로 구성된 링커)에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하는, 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 2가 항체를 지칭한다. 이런 입체배치는 동형이량체 구조를 형성하기 위해 다른 폴리펩타이드 사슬 상에서 각 도메인이 상보적 도메인과 짝을 이루도록 한다. 따라서, 용어 "트라이어바디"는 3개의 펩타이드 사슬을 포함하는 3가 항체를 지칭하며, 이의 각각은 동일한 펩타이드 사슬 내에서 VH 및 VL 도메인의 분자내 결합을 가능하게 하는 극도로 짧은 링커(예를 들어, 1 내지 2개의 아미노산으로 구성된 링커)에 의해 연결된 1개의 VH 도메인 및 1개의 VL 도메인을 포함한다. 이들의 천연 구조로 폴딩되기 위해, 이 방법에서 구성된 펩타이드는 전형적으로 적절한 폴딩을 가능하게 하기 위해 서로 공간적으로 근위인 이웃하는 펩타이드 사슬의 VH 및 VL 도메인을 위치시키도록 삼량체화된다(본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이중 가변 도메인 면역글로불린"("DVD-Ig")은 링커를 통해 2개의 단클론성 항체의 표적-결합 가변 도메인을 합하여 4가, 이중-표적화 단일 제제를 생성하는 항체를 지칭한다. (Gu et al., Meth. Enzymol., 502:25-41, 2012; 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 본 명세서에 기재된 DVD의 경쇄에서 사용하기 위한 적합한 링커는 문헌[Gu et al.]의 30페이지 표 2.1에서 확인되는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "인간 항체"는 단백질의 실질적으로 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이 인간에서 실질적으로 비면역원성이며, 약간의 서열만이 변화 또는 변형된, 항체를 지칭한다. 인간 항체는 인간 세포에서(예를 들어, 재조합 발현에 의해), 또는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현시킬 수 있는 비인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생성될 수 있다. 추가로, 인간 항체가 단일쇄 항체일 때, 이는 미경험 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결하는 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기과 같은 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩타이드는 인간 유래인 것으로 간주된다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 본 명세서에 참조에 의해 원용된 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공개 WO 1998/46645; WO 1998/50433; WO 1998/24893; WO 1998/16654; WO 1996/34096; WO 1996/33735; 및 WO 1991/10741 참조. 인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현시킬 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자이식 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, PCT 간행물 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625, 126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호를 참조하며; 이들은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 표적-결합 서브도메인)인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하는, 실질적으로 모든 또는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 또한 인간 면역글로불린 서열의 영역일 수 있다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 공통 서열의 일부를 포함할 수 있다. 항체 인간화 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-7, 1988]; 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 Queen 등의 제6,180,370호; EP239400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; EP592106; 및 EP519596을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "영장류화된 항체"는 영장류-유래 항체로부터의 프레임워크 영역 및 다른 영역, 예컨대, CDR 및/또는 비영장류 공급원의 항체로부터의 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 영장류화된 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된, 미국 특허 제5,658,570호; 제5,681,722호; 및 제5,693,780호를 참조한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 영장류화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비영장류 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR을 영장류의 하나 이상의 프레임워크 영역을 함유하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 삽입함으로써 생성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 이를 생산하는 방법을 지칭하지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "scFv"는 항체로부터의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 연결되어 하나의 사슬을 형성하는 단일쇄 Fv 항체를 지칭한다. scFv 단편은 링커에 의해 분리되는 항체 경쇄의 가변 영역(VL)(예를 들어, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3) 및 항체 중쇄의 가변 영역(VH)(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2 및/또는 CDR-H3)을 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄를 함유한다. scFv 단편의 VL과 VH 영역을 연결하는 링커는 단백질 생성 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커일 수 있다. 대안의 링커는 단백질 분해에 대한 scFv 단편(예를 들어, D-아미노산을 함유하는 링커)의 저항성을 증가시키기 위해, scFv 단편(예를 들어, 친수성 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜-함유 링커 또는 반복 글리신 및 세린 잔기를 함유하는 폴리펩타이드)의 가용성을 향상시키기 위해, 분자(예를 들어, 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하는 링커)의 생물물리학적 안정성을 개선시키기 위해, 또는 scFv 단편(예를 들어, 글리코실화 부위를 함유하는 링커)의 면역원성을 약화시키기 위해 사용될 수 있다. scFv 분자는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호, 문헌[Flo et al., (Gene 77:51, 1989); Bird et al., (Science 242:423, 1988); Pantoliano et al., (Biochemistry 30:10117, 1991); Milenic et al., (Cancer Research 51:6363, 1991); 및 Takkinen et al., (Protein Engineering 4:837, 1991)]에 기재되어 있다. scFv 분자의 VL 및 VH 도메인은 하나 이상의 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 또한 본 명세서에 기재된 scFv 분자의 가변 영역이, 이들이 유래된 항체 분자로부터의 아미노산 서열에서 달라지도록, 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 아미노산 잔기에서 보존적 치환 또는 변화로 이어지는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환이 (예를 들어, CDR 및/또는 프레임워크 잔기에서) 이루어질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 당업계에 인식된 기법을 이용하여 항원 결합을 최적화하기 위해 CDR 아미노산 잔기에 돌연변이가 만들어진다. scFv 단편은, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2011/084714에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "키메라 항원 수용체"("CAR")는 주어진 항원(예를 들어, 자가항원)을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 인식 영역(예를 들어, 하나 이상의 CDR)을 함유하는 재조합 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR은 일반적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는, 적어도 세포외 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인(본 명세서에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 함유한다. 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 사슬일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 아래에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 공자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 공자극 분자는, 예를 들어, 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 포함한다. CAR은, 예를 들어, 세포외 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 공-자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질을 포함한다. CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단에 리더 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 추가로 세포막에 대한 CAR의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인, 예를 들어, (scFv)로부터 절단될 수 있는 세포외 항원 인식 도메인의 N-말단에 리더 서열을 포함한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "세포내 도메인" 및 "세포질 도메인"은 상호 호환 가능하게 사용된다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 전령을 생성하거나 이러한 전령에 반응함으로써 효과기로서 기능함으로써 정해진 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 CAR은 다양한 형태로 존재할 수 있는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 인식 도메인은, 예를 들어, 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일쇄 항체(예를 들어, scFv), 및 인간화된 항체를 포함하는 인접한 폴리펩타이드 쇄의 부분으로서 발현될 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
CAR과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "힌지 도메인"은 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 T 세포 표면으로부터 떨어져서 항원 인식 도메인을 위치시키는 데 어떤 역할을 하는 CAR의 세포외 부분을 지칭한다. CAR은 일반적으로 항원 인식 도메인과 막관통 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인의 예는 CD28, CD8(예를 들어, CD8α), IgG1/IgG4(힌지-Fc 부분), CD4, CD7 및 IgD로부터 유래된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "막관통 도메인"은 세포외 항원 인식 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 융합되고 T 세포의 CAR에 고정되는 CAR의 부분을 지칭한다. 막관통 도메인의 예는 CD28, CD3 제타, CD8(예를 들어, CD8α), FcRIγ, CD4, CD7, OX40 및 MHC(H2-Kb)로부터 유래된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "자극 분자"는 T 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양상에 대한 자극 방법에서 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현된 분자를 지칭한다. 일 양상에서, 1차 신호는, 예를 들어, 펩타이드가 로딩되고 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 반응의 매개를 야기하는 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시된다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열("1차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로도 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 ITAM-함유 1차 세포질 신호전달 서열의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로도 알려짐) 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 예시적인 CAR 분자에서, 본 개시내용의 임의의 하나 이상의 CAR 분자에서 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어, CD3-제타의 1차 신호전달 서열을 포함한다. 본 개시내용의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 인간 서열 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR-함유 세포, 예를 들어, CAR Treg 세포의 면역억제 기능을 촉진시키는 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, Treg 세포에서 면역억제 기능의 예는 자가반응성 효과기 면역 세포의 활성 및/또는 증식 억제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 초래하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호, 또는 항원 의존적 자극을 초래하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, CAR Treg의 경우에, 1차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공-수용체 또는 공자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank 수탁번호 BAG36664.1로 제공되는 단백질, 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하는 데 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로 정의된다. 일 양상에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 수탁번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 이의 기능적 오솔로그인 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다.
"공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합함으로써, 증식과 같지만 이것으로 제한되지 않는 T 세포에 의한 공자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 상대를 지칭한다. 공자극 분자는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 효율적인 면역 반응에 필요한 이들의 리간드이다. 공자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 부분으로부터 유래될 수 있다. 공자극 분자는 다음의 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD83 등과 특이적으로 결합하는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 및 리간드를 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "자가면역질환"은 자신의 면역계가 자신의 조직을 잘못 공격하여 생기는 질환의 그룹을 지칭한다. 자가면역장애의 비제한적 예는 1형 당뇨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심장근육병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근염-섬유근통, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, 연소성 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합결합조직질환, 다발성경화증, 중증근무력증, 시신경 척수염, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발동맥염, 다발 연골염, 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경변증, 건선, 레이노 현상, 리플리 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 타카야수 혈관염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "염증"은 감염성 제제(예를 들어, 병원균), 독소, 종양 세포, 자극물 및 스트레스에 의한 세포 손상에 대한 신호-매개 반응을 지칭한다. 급성 염증은 해로운 자극(예를 들어, 병원균, 손상된 세포, 암/종양 세포, 스트레스 또는 자극물)으로부터의 신체의 방어 및 보호에 중요하지만, 만성 및 부적절하게 높은 염증은 (예를 들어, 자가면역, 염증 질환, 신경퇴행성 질환 또는 심혈관계 질환에서) 조직 파괴를 야기할 수 있다. 염증은 체액 축적(부종) 및 백혈구 동원으로 인한 모세혈관 확장의 결과를 나타낸다. 본 명세서의 사용 목적을 위해, 염증의 증가 또는 감소는 백혈구 동원의 증가 또는 감소, 및/또는 면역 세포 활성의 증가 또는 감소(예를 들어, T 세포 분극화; T 세포 활성화; 수지상 세포 활성화; 호중구 활성화; 호산구 활성화; 호염기구 활성화; T 세포 증식; B 세포 증식; 단핵구 증식; 대식세포 증식; 수지상 세포 증식; NK 세포 증식; ILC 증식, 비만 세포 증식; 호중구 증식; 호산구 증식; 호염기구 증식; 세포독성 T 세포 활성화; 순환 단핵구; 말초 혈액 조혈줄기세포; 대식세포 분극화; 대식세포 식세포 작용; 대식세포 ADCP, 호중구 식세포 작용; 단핵구 식세포 작용; 비만 세포 식세포 작용; B 세포 식세포 작용; 호산구 식세포 작용; 수지상 세포 식세포 작용; 대식세포 활성화; 항원 제시(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포 항원 제시); 항원 제시 세포 이동(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포 이동); 림프절 면역 세포 귀소(homing) 및 유출(egress)(예를 들어, T 세포, B 세포, 수지상 세포 또는 대식세포의 림프절 귀소 및 유출); NK 세포 활성화; NK 세포 ADCC, 비만 세포 탈과립화; NK 세포 탈과립화; ILC 활성화, ILC ADCC, ILC 탈과립화, 세포독성 T 세포 탈과립화; 호중구 탈과립화; 호산구 탈과립화; 호염기구 탈과립화; 호중구 동원; 호산구 동원; NKT 세포 활성화; B 세포 활성화; 조절 T 세포 분화; 수지상 세포 성숙; HEV의 발생; 또는 이소성 또는 3차 임파상 기관(TLO)의 발생 중 하나 이상)에 의해 평가된다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 대상체 또는 자가면역질환을 앓고 있지 않은 대상체에서 염증을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "백혈구 동원"은 순환계 밖으로 그리고 조직 손상, 감염, 상처 또는 스트레스 부위를 향한 백혈구의 움직임 또는 이동을 지칭한다. 호중구 수송이 손상되는 병태 부류인 백혈구 부착 결핍증을 앓고 있는 환자의 재발성 감염 및 불량한 생존율에 의해 입증되는 바와 같이, 혈류로부터 조직 내의 염증 병소로의 백혈구 동원은 성공적인 염증 반응을 일으키는 데 필수적이며 선천성 면역 반응의 필수 부분을 형성한다. 단핵구는 또한 대식세포로의 이들의 발생 동안 감염 또는 조직 손상 없이 이 과정을 사용한다. 백혈구 동원은 백혈구수송을 조절하는 분자가 우선적으로 발현되는 모세혈관 후 정맥에서 주로 발생된다. 백혈구 동원 과정 동안에, 백혈구는 혈관 내피에 부착되고, 후속적으로 화학유인물질(예를 들어, 케모카인)에 의해 유도된 경내피 이동에 의해 순환계를 떠나며, 이 과정은 혈구 누출(diapedesis)로 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "발현시키다"는 다음의 사건 중 하나 이상을 지칭한다: (1) (예를 들어, 전사에 의한) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산; (2) (예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 가공에 의한) RNA 전사체의 가공; (3) RNA의 폴리펩타이드 또는 단백질로의 번역; 및 (4) 폴리펩타이드 또는 단백질의 번역 후 변형. 단백질 산물을 암호화하는 유전자와 관련하여, 용어 "유전자 발현" 등은 용어 "단백질 발현" 등과 상호 호환 가능하게 사용된다. 대상체에서 관심 유전자 또는 단백질의 발현은, 예를 들어, 대상체로부터 얻은 샘플에서 (예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 RNA 검출 절차, 예컨대, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 RNA seq 기법을 사용하여 평가된 바와 같은) 상응하는 단백질을 암호화하는 mRNA의 양 또는 농도의 증가, (예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 단백질 검출 방법, 예컨대, 특히 효소결합면역흡착측정법(ELISA)를 사용하여 평가된 바와 같은) 상응하는 단백질의 양 또는 농도의 증가, 및/또는 (예를 들어, 효소의 경우에, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 효소 활성 분석을 사용하여 평가된 바와 같은) 상응하는 단백질 활성의 증가를 검출함으로써 나타날 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포는 위의 사건 중 하나 이상 또는 모두가 세포에서 또는 세포가 존재하는 배지에서 검출될 수 있는 경우 관심 유전자 또는 단백질을 "발현"시키는 것으로 간주된다. 예를 들어, 관심 유전자 또는 단백질은 (i) 세포 또는 세포 집단에 의해 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 RNA 검출 절차를 이용하여) 상응하는 RNA 전사체, 예컨대, mRNA 주형의 생산의 생산; (ii) RNA 전사체의 가공(예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 가공, 예컨대, 본 명세서에 기재된 RNA 검출 절차를 사용); (iii) (예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질 검출 절차를 사용하여) 단백질 산물로 RNA 주형의 번역; 및/또는 (iv) 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질 검출 절차를 사용하여) 단백질 산물의 번역 후 변형을 검출할 수 있는 경우, 세포 또는 세포 집단에 의해 "발현되는" 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "핵산 카세트"는 유전자 산물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자 산물)을 암호화하는 재조합 핵산(예를 들어, DNA 또는 cDNA)을 지칭한다. 유전자 산물은 RNA, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 유전자 산물에 대한 암호화 영역에 추가로, 핵산 카세트는 발현을 촉진 또는 향상시키기 위해 하나 이상의 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서(들), 탈안정화 도메인(들), 반응 요소(들), 리포터 요소(들), 절연체 요소(들), 폴리아데닐화 신호(들) 및/또는 다른 기능적 요소를 포함하거나, 이들에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 개시내용의 실시형태는 임의의 알려진 적합한 프로모터, 인핸서(들), 탈안정화 도메인(들), 반응 요소(들), 리포터 요소(들), 절연체 요소(들), 폴리아데닐화 신호(들) 및/또는 다른 기능적 요소를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 분자에 연결된 제1 분자를 지칭하되, 분자는 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 두 분자는 단일 인접 분자의 일부일 수도 있고 일부가 아닐 수도 있고, 인접할 수도 있고 인접하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심의 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자의 전사를 조절하는 경우 프로모터는 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동 가능하게 연결된다. 추가로, 전사 조절 요소의 두 부분은, 한 부분의 전사-활성화 기능성이 다른 부분의 존재에 의해 부정적으로 영향받지 않도록 이들이 연결된 경우에 서로 작동 가능하게 연결된다. 두 전사 조절 요소는 링커 핵산(예를 들어, 개재 비-암호화 핵산)에 의해 서로 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 존재하는 개재 뉴클레오타이드 없이 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "전사 조절 요소"는, 적어도 부분적으로, 관심 유전자의 전사를 제어하는 핵산을 지칭한다. 전사 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 및 유전자 전사를 제어하거나 제어하는 것을 돕는 다른 핵산(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 전사 조절 요소의 예는, 예를 들어, 문헌[Mantel et al., J. Immunol. 176(6):3593-602 (2006); Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018); Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007); Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010); Tone et al., Nat. Immunol. 9(2):194-202 (2008); Dikiy et al., Immunity. 54(5):931-946 (2021); Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021); 및 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)]에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 이들의 전문이 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "계통-특이적"은 다른 세포 유형보다 특정 세포 유형에 선택적임을 의미한다. 예를 들어, 용어 "계통-특이적 전사 조절 요소"는 적어도 부분적으로, 특정 세포 유형에서 발견되는 유전자의 전사를 제어하는 핵산을 지칭한다. 계통-특이적 전사 조절 요소의 예는 Treg 세포의 분명한 특징인 Foxp3 유전자의 전사를 제어하는 Foxp3 프로모터, CNS1 인핸서, CNS2 인핸서, CNS3 인핸서 및 CNS0 인핸서를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소에 의해 결합된 DNA 상의 인식 부위를 지칭한다. 중합효소는 핵산 카세트의 전사를 유도한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 프로모터는, 예를 들어, 문헌[Mantel et al., J. Immunol. 176(6):3593-602 (2006); Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018); Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007); 및 Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재되어 있다. 추가적으로, 용어 "프로모터"는 생물학적 시스템에서 자연적으로 발생되지 않는 조절 DNA 서열인 합성 프로모터를 지칭할 수 있다. 합성 프로모터는 자연에서 생기지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열과 조합된 자연 발생적 프로모터의 부분을 포함하고, 다양한 핵산 카세트, 벡터 및 표적 세포 유형을 사용하여 재조합 DNA를 발현시키도록 최적화될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "인핸서"는 전사 개시 부위에 대해 인핸서의 거리 또는 배향에 상관없이 전사 효율을 증가시킬 수 있는 조절 요소의 유형을 지칭한다. 따라서, 인핸서는 전사 개시 부위의 상류 또는 하류에 또는 프로모터로부터 상당한 거리에 위치될 수 있다. 인핸서는 또한 프로모터와 물리적 및 기능적으로 중복될 수 있다. 프로모터 서열(예를 들어, Foxp3 프로모터 서열)을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오타이드는 또한 인핸서 서열(예를 들어, CNS1 인핸서 서열)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "Foxp3 프로모터"는 Treg 세포에서 Foxp3 유전자의 전사를 활성화시키는 프로모터를 지칭한다. 예시적인 인간 Foxp3 프로모터는, 예를 들어, 문헌[Mantel et al., J. Immunol. 176(6):3593-602 (2006)]에 기재된 서열번호 1에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 Foxp3 프로모터의 다른 예는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 서열번호 2에 제시된 핵산을 포함한다. 예시적인 뮤린 Foxp3 프로모터는, 예를 들어, 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 서열번호 3에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 3의 정렬에 의해, 인간 Foxp3 프로모터의 추가 예는 서열번호 4에 제시된 핵산을 포함한다. Foxp3 프로모터 핵산의 추가 예는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "CNS0 인핸서"는 Treg 세포에서 Foxp3 유전자의 전사 효율을 증가시키는 인핸서를 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5를 보충하는(recruit) 것을 포함한다. 예시적인 뮤린 CNS0 인핸서는, 예를 들어, 문헌[Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이 서열번호 17에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 17의 정렬에 의해, 예시적인 인간 CNS0 인핸서는, 예를 들어, 서열번호 18에 제시된 핵산을 포함한다. 뮤린 CNS0 인핸서의 다른 예는 문헌[Dikiy et al., Immunity. 54(5):931-946 (2021)]에 기재된 서열번호 19에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 19의 정렬에 의해, 인간 CNS0 인핸서의 추가 예는 서열번호 20에 제시된 핵산을 포함한다. CNS0 인핸서 핵산의 추가 예는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "CNS1 인핸서"는 Treg 세포에서 Foxp3 유전자의 전사 효율을 증가시키는 인핸서를 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo(예를 들어, Foxo1 및 Foxo3)를 보충하는 것을 포함한다. CNS1 인핸서는 Treg 세포 및 점막 면역관용의 말초 유도에 기여하는 것으로 여겨진다. 예시적인 인간 CNS1 인핸서는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 -500 내지 +100을 포함한다. 예시적인 뮤린 CNS1 인핸서는, 예를 들어, 문헌[Tone et al., Nat. Immunol. 9(2):194-202 (2008)]에 기재된 서열번호 5에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 5의 정렬에 의해, 인간 CNS1 인핸서의 추가 예는 서열번호 6에 제시된 핵산을 포함한다. 뮤린 CNS1 인핸서의 다른 예는 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 서열번호 7에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 7의 정렬에 의해, 인간 CNS1 인핸서의 추가 예는 서열번호 8에 제시된 핵산을 포함한다. CNS1 인핸서 핵산의 추가 예는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "CNS2 인핸서"는 Treg 세포에서 Foxp3 유전자의 전사 효율을 증가시키는 인핸서를 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel를 보충하는 것을 포함한다. CNS2 인핸서는 기능적 Treg 세포에서 상당히 탈메틸화되고, T 세포 수용체 자극에 반응하여 Treg 세포 증식 동안 Foxp3 발현의 안정성을 초래하는 것으로 여겨진다. 예시적인 인간 CNS2 인핸서는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 +2,022 내지 +2,721을 포함한다. 예시적인 뮤린 CNS2 인핸서는, 예를 들어, 문헌[Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이 서열번호 9에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 9의 정렬에 의해, 인간 CNS2 인핸서의 추가 예는 서열번호 10에 제시된 핵산을 포함한다. 뮤린 CNS2 인핸서의 다른 예는 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 서열번호 11에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 11의 정렬에 의해, 인간 CNS2 인핸서의 추가 예는 서열번호 12에 제시된 핵산을 포함한다. CNS2 인핸서 핵산의 추가 예는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "CNS3 인핸서"는 Treg 세포에서 Foxp3 유전자의 전사 효율을 증가시키는 인핸서를 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo(예를 들어, Foxo1 및 Foxo3) 및/또는 c-Rel를 보충하는 것을 포함한다. CNS3 인핸서는 Foxp3 발현에 필요한 임계값 TCR 자극에서 어떤 역할을 하고 말초 및 흉선 Treg 세포 생성에 중요한 것으로 여겨진다. 예시적인 인간 CNS3 인핸서는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 +4,301 내지 +4,500을 포함한다. 예시적인 뮤린 CNS3 인핸서는, 예를 들어, 문헌[Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이 서열번호 13에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 13의 정렬에 의해, 인간 CNS3 인핸서의 추가 예는 서열번호 14에 제시된 핵산을 포함한다. 뮤린 CNS3 인핸서의 다른 예는 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 서열번호 15에 제시된 핵산을 포함한다. 인간 게놈에 대한 서열번호 15의 정렬에 의해, 인간 CNS3 인핸서의 추가 예는 서열번호 16에 제시된 핵산을 포함한다. CNS3 인핸서 핵산의 추가 예는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 및 유전자(들)의 전사 또는 번역을 제어하는 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Perdew et al., Regulation of Gene Expression (Humana Press, New York, NY, (2014))]에 기재되어 있다.
참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 관해 "서열 동일성 백분율(%)"은, 필요한 경우 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열의 핵산 또는 아미노산의 백분율로 정의된다. 핵산 또는 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하는 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2 또는 Megalign 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 당업자의 능력 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교 중인 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 서열 동일성 백분율 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용하여 생성될 수 있다. 예로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A의 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B와의 또는 이에 대한 서열 동일성 백분율(대안적으로 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B와 또는 이에 대해 특정 서열 동일성을 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기(분수 X/Y)
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 매칭으로 점수화된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수이고, 여기서 Y는 B에서 핵산의 총 수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 서열 동일성 백분율은 A에 대한 B의 서열 동일성 백분율과 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "저해제"는 표적 분자에 결합하고/하거나 다르게는 이의 활성을 억제하는 제제(예를 들어, 소분자, 펩타이드 단편, 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "내인성"은 특정 유기체(예를 들어, 인간)에서 또는 유기체(예를 들어, 기관, 조직 또는 세포, 예컨대, 인간 세포) 내의 특정 위치에서 자연적으로 발견되는 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, 핵산 또는 보조인자)를 기재한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "외인성"은 특정 유기체(예를 들어, 인간)에서 또는 유기체(예를 들어, 기관, 조직 또는 세포, 예컨대, 인간 세포) 내의 특정 위치에서 자연적으로 발견되지 않는 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, 핵산 또는 보조인자)를 기재한다. 외인성 물질은 외부 공급원으로부터 유기체로 또는 이로부터 추출된 배양 물질로 제공되는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "형질도입" 및 "형질도입하다"는 바이러스 벡터 작제물 또는 이의 부분을 세포 내로 도입하고, 후속적으로 세포에서 벡터 작제물 또는 이의 부분에 의해 암호화된 핵산 카세트를 발현시키는 방법을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "폴록사머"는 폴리옥시에틸렌의 2개의 친수성 쇄에 의해 측접되는 폴리옥시프로필렌의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼중블록 공중합체를 지칭한다. 폴록사머는 상표명 "Pluronics" 또는 "Synperonics"(BASF)로도 알려져 있다. 블록 공중합체는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다: HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH. 중합체 블록의 길이는 맞춤될 수 있다. 결과로서, 다수의 상이한 폴록사머가 존재한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용하는 데 적합한 폴록사머는 평균 분자량이 적어도 약 10,000g/㏖, 적어도 약 11,400g/㏖, 적어도 약 12,600g/㏖, 적어도 약 13,000g/㏖, 적어도 약 14,600g/㏖ 또는 적어도 약 15,000g/㏖인 것을 포함한다. 블록 공중합체는 하나의 배취(batch)로부터 다른 배취까지의 자연적 변화 정도와 관련되기 때문에, 위에 열거한 수치적 값(및 주어진 폴록사머를 특성규명하기 위해 본 명세서에서 사용된 것)은 합성 시 정확히 달성되지 않을 수도 있고, 평균값은 특정 정도로 다를 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴록사머"는 달리 분명하게 언급되지 않는 한, 용어 "폴록사머들"(폴록사머들의 혼합물로도 지칭되는 여러 폴록사머의 독립체를 나타냄)과 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다. (a) 본 명세서에 사용되는 바와 같은 폴록사머(들)의 단량체 단위 또는 분자량의 수에 관해 용어 "평균"은 모두 동일한 조성을 갖고, 따라서 동일한 분자량을 갖는 폴록사머를 생성하는 기술적 불능의 결과이다. 최신 방법에 따라 생산된 폴록사머는 각각 이들의 분자량에 관해 가변성을 나타내는 폴록사머의 혼합물로서 존재할 것이지만, 혼합물은 전체로서 본 명세서에 명시된 평균 분자량을 나타낸다. BASF 및 Sigma Aldrich는 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 폴록사머의 적합한 공급원이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 단백질 키나제 C(PKC) 저해제, 예컨대, 스타우로스포린과 관련하여, 용어 "변이체"는 참조 제제에 대해 하나 이상의 변형을 포함하고, (i) 참조 제제의 기능적 특성(예를 들어, PKC 활성을 저해하는 능력)을 보유하고/하거나 (ii) 세포(예를 들어, CD34+ 세포와 같은 본 명세서에 기재된 유형의 세포) 내에서 참조 제제로 전환되는 제제를 지칭한다. 소분자 PKC 저해제, 예컨대, 스타우로스포린과 관련하여, 참조 화합물의 구조적 변이체는 하나 이상의 치환체의 포함 및/또는 위치에 따라 참조 화합물과 다른 것 및 참조 화합물의 이성질체, 예컨대, 구조적 이성질체(예를 들어, 위치이성질체) 또는 입체이성질체(예를 들어, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체)의 변이체뿐만 아니라 참조 화합물의 프로드러그를 포함한다. 간섭 RNA 분자와 관련하여, 변이체는 모 간섭 RNA 분자에 대해 하나 이상의 핵산 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 히스톤 탈아세틸화를 저해하는 제제는 히스톤 데아세틸라제의 활성, 더 구체적으로는 직접 상호작용을 통해 또는 간접 수단을 통해, 예컨대, 세포에서 생성된 히스톤 데아세틸라제의 양의 감소를 야기함으로써 또는 히스톤 데아세틸라제와 아세틸화된 히스톤 기질 사이의 상호작용을 저해에 의해 이의 효소 활성을 약화시키거나 또는 막을 수 있는 물질 또는 조성물(예를 들어, 소분자, 단백질, 간섭 RNA, 전령 RNA, 또는 다른 천연 또는 합성 화합물, 또는 조성물, 예컨대, 바이러스 또는 여러 물질로 구성된 다른 물질)을 지칭한다. 히스톤 데아세틸라제 효소 활성을 저해하는 것은 히스톤 잔기(예를 들어, 모노-, 다이- 또는 트라이-메틸화된 라이신 잔기; 히스톤 단백질 내의 모노메틸화된 아르기닌 잔기 또는 대칭/비대칭 다이메틸화된 아르기닌 잔기)로부터의 아세틸기의 제거를 촉매하는 히스톤 데아세틸라제의 능력을 감소시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 저해는 히스톤 탈아세틸화를 저해하는 제제가 다른, 관련없는 생물학적 효과를 생성하는 데 필요한 저해제의 농도보다 더 낮은 농도에서 히스톤 잔기로부터 아세틸기를 제거하는 히스톤 데아세틸라제의 능력을 감소시키도록, 특이적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "히스톤 데아세틸라제" 및 "HDAC"는 히스톤의 N-말단에서 라이신 잔기의 ε-아미노기로부터 아세틸기의 제거를 촉매하는 효소 패밀리 중 어느 하나를 지칭한다. 문맥에 의해 달리 표시되지 않는 한, 용어 "히스톤"은 임의의 종으로부터의 HI, H2A, H2B, H3, H4 및 H5를 포함하는 임의의 히스톤 단백질을 지칭하는 것을 의미한다. 인간 HDAC 단백질 또는 유전자 산물은, HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 및 HDAC-11을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로스타글란딘 E 수용체 신호전달을 활성화시키는" 화합물 등은 명시된 화합물과 접촉되지 않은 프로스타글란딘 E 수용체-발현 세포의 프로스타글란딘 E 수용체 신호 전달 활성에 비해서 명시된 화합물과 접촉된 프로스타글란딘 E 수용체-발현 세포에서 프로스타글란딘 E 수용체의 신호 전달 활성을 증가시키는 능력을 갖는 화합물을 지칭한다. 프로스타글란딘 E 수용체 신호 전달을 측정하기 위해 사용될 수 있는 분석은, 예를 들어, WO 2010/108028에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달을 평가하는 방법과 관련되는 경우 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공법, 리포펙션, 인산칼슘 침전, DEAE- 덱스트란 형질감염, 뉴클레오펙션, 스퀴즈-천공법, 초음파 천공법, 광학 형질감염, 자기주입, 임팔레펙션 등을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "벡터"는 핵산 벡터, 예를 들어, DNA 벡터, 예컨대, 플라스미드, RNA 벡터, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘(예를 들어, 바이러스 벡터)을 포함한다. 다양한 벡터는 외인성 단백질을 암호화하는폴리뉴클레오타이드를 원핵 또는 진핵 세포에 전달하기 위해 개발되었다. 이러한 발현 벡터의 예는, 예를 들어, WO 1994/011026에 개시되어 있으며; 이는 관심 유전자의 발현에 적합한 벡터에 관한 것인 경우 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질의 발현 및/또는 포유류 세포 게놈 내로 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 통합을 위해 사용되는 추가 서열 요소를 포함한다. 본 명세서에 기재된 단백질 또는 단백질들의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터는 유전자 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 영역과 같은 조절 서열을 포함하는 플라스미드를 포함한다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 단백질 또는 단백질들의 발현에 유용한 벡터는 상응하는 유전자 또는 유전자들의 전사 속도를 향상시키거나, 유전자 전사로부터 초래되는 mRNA의 안정성 또는 핵 유출을 개선시키는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소의 예는 발현 벡터 상에 운반되는 유전자 또는 유전자들의 효율적인 전사를 지시하기 위한 5' 및 3' 비번역 영역, IRES 및 폴리아데닐화 신호 부위이다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하는 데 적합한 발현 벡터는 또한 이러한 벡터를 포함하는 세포의 선택을 위한 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 적합한 마커의 예는 특히 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 노르세오트리신 또는 제오신과 같은 항생제에 대한 내성을 암호화하는 유전자이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "플라스미드"는 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰되는 염색체외 원형 이중가닥 DNA 분자를 지칭한다. 플라스미드는 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자인 벡터의 유형이다. 특정 플라스미드는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제기점을 갖는 박테리아 플라스미드 및 에피솜 포유류 플라스미드). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 특정 플라스미드는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 호환 가능하게 사용되고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 자가면역질환과 같은 질환이 발생될 위험에 있거나, 이러한 질환을 갖는 것으로 진단된 적이 있고/있거나 이러한 질환에 대한 치료를 받고 있는 유기체(예를 들어, 포유류, 예컨대, 인간)을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "투여하는", "투여" 등은 임의의 효과적인 경로에 의해 치료제(예를 들어, 세포 집단, 예컨대, 만능세포 집단(예를 들어, 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 또는 CD34+ 세포))를 환자에게 직접 제공하는 것을 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 본 명세서에 기재되어 있고, 특히 정맥내 주사와 같은 전신 투여 경로를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료" 및 "치료하는"은 유리한 또는 목적하는 결과, 예를 들어, 임상 결과를 얻기 위한 접근을 지칭한다. 유리한 또는 목적하는 결과는 검출 가능하든 가능하지 않든, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 개선; 질환 또는 병태 정도의 감소; 질환, 장애 또는 병태의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태; 질환 또는 병태 확산 방지; 질환 또는 병태 진행의 지연 또는 늦춤; 질환 또는 병태의 개선 또는 완화; 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 질환 또는 병태를 "개선시키는" 또는 "완화시키는"은 치료가 존재하지 않을 때의 정도 또는 시간 과정에 비해 질환, 장애 또는 병태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 줄어들고 그리고/또는 진행의 시간 과정이 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존과 비교할 때 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 병태 또는 장애가 있는 대상체뿐만 아니라 병태 또는 장애가 발생되는 경향이 있거나 위험에 있는 대상체뿐만 아니라 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "약제학적 조성물"은 포유류에 영향을 미치는 특정 질환 또는 병태, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 자가면역질환을 예방, 치료 또는 제어하기 위해 대상체, 예컨대, 포유류, 예를 들어, 인간에게 투여될 수 있는 치료제(예를 들어, 세포 집단, 예컨대, 만능 조혈모세포(예를 들어, 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 림프구 전구세포 또는 CD34+ 세포) 집단)을 함유하는 조성물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 합리적인 유해/유익비와 비례하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 다른 문제 합병증 없이 포유류(예를 들어, 인간)와 같은 대상체의 조직과 접촉되는 데 적합한 해당 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 표본(예를 들어, 혈액, 혈액 성분(예를 들어, 혈청 또는 혈장), 소변, 타액, 양수, 뇌척수액, 조직 (예를 들어, 태반 또는 진피), 췌액, 융모막융모 샘플 및 세포)를 지칭한다. 샘플이라는 용어는 또한 mRNA- 또는 cDNA-함유 샘플과 같은 제조 또는 가공된 샘플에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "약"은 참조량에 대해 30%(예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)만큼 변하는 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬"은 1가, 선택적으로 분지된 알킬기, 예컨대, 1 내지 6개 이상의 탄소 원자을 갖는 것을 지칭한다. 상기 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, tert-뷰틸, n-헥실 등과 같은 기로 예시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아릴"은 단일 고리(예를 들어, 페닐) 또는 다중 축합 고리(예를 들어, 나프틸)를 갖는 6 내지 14개의 탄소 원자의 불포화 방향족 탄소환식기를 지칭한다. 바람직한 아릴은 페닐, 나프틸, 페난트렌일 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아랄킬" 및 "아릴 알킬"은 상호 호환 가능하게 사용되고, 아릴 모이어티를 포함하는 알킬기를 지칭한다. 유사하게, 용어 "아릴 저급 알킬" 등은 아릴 모이어티를 포함하는 저급 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 아릴"은 벤질, 펜에틸 등을 포함하는 아릴 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "헤테로아릴"은 단환식 헤테로방향족 또는 이환식 또는 삼환식 축합고리 헤테로방향족기를 지칭한다. 헤테로방향족기의 특정 예는 선택적으로 치환된 피리딜, 피롤릴, 퓨릴, 티엔일, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 피라졸릴, 1,2,3-트라이아졸릴, 1,2,4-트라이아졸릴, 1,2,3-옥사다이아졸릴, 1,2,4-옥사다이아졸릴, 1,2,5-옥사다이아졸릴, 1,3,4-옥사다이아졸릴,l,3,4-트라이아진일, 1,2,3-트라이아진일, 벤조퓨릴, [2,3-다이하이드로]벤조퓨릴, 아이소벤조퓨릴, 벤조티엔일, 벤조트라이아졸릴, 아이소벤조티엔일, 인돌릴, 아이소인돌릴, 3H-인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 이미다조[1,2-a]피리딜, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴놀리진일, 퀸아졸린일, 프탈라진일, 퀴녹살린일, 신놀린일, 나프티리딘일, 피리도[3,4-b]피리딜, 피리도[3,2-b]피리딜, 피리도[4,3-b]피리딜, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 테트라졸릴, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀릴, 5,6,7,8-테트라하이드로아이소퀴놀릴, 퓨린일, 프테리딘일, 카바졸릴, 잔텐일, 벤조퀴놀릴 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 헤테로아릴"은 2-퓨릴메틸, 2-티엔일메틸, 2-(1H-인돌-3-일)에틸 등을 포함하는 헤테로아릴 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "저급 알켄일"은 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 알켄일 불포화의 적어도 1 또는 2개의 부위를 갖는 알켄일기를 지칭한다. 예시적인 알켄일기는 에텐일(-CH=CH2), n-2-프로펜일(알릴, -CH2CH=CH2) 등이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알켄일 아릴"은 2- 페닐비닐 등을 포함하는 아릴 치환체를 갖는 알켄일기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알켄일 헤테로아릴"은 2-(3-피리딘일)비닐 등을 포함하는 헤테로아릴 치환체를 갖는 알켄일기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "저급 알킨일"은 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 알킨일 불포화의 적어도 1 내지 2개 부위를 갖는 알킨일기를 지칭하고, 바람직한 알킨일기는 에틴일(-C≡CH), 프로파길(-CH2C≡CH) 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킨일 아릴"은 페닐에틴일 등을 포함하는 아릴 치환체를 갖는 알킨일기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킨일 헤테로아릴"은 2-티엔일에틴일 등을 포함하는 헤테로아릴 치환체를 갖는 알킨일기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 단환식 사이클로알킬기, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸 등을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "저급 사이클로알킬"은 단일 고리(예를 들어, 사이클로헥실) 또는 다중 축합 고리(예를 들어, 노르보닐)를 갖는 3 내지 8개의 탄소 원자의 포화 탄소환식기를 지칭한다. 바람직한 사이클로알킬은 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 노르보닐 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "헤테로사이클로알킬"은 하나 이상의 고리 탄소 원자가 질소 원자, 산소 원자, 황 원자 등으로 대체된 사이클로알킬기를 지칭한다. 예시적인 헤테로사이클로알킬기는 피롤리딘일, 피페리딘일, 옥소피페리딘일, 몰폴린일, 피페라진일, 옥소피페라진일, 티오몰폴린일, 아제판일, 다이아제판일, 옥사제판일, 티아제판일, 다이옥소티아제판일, 아조칸일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로피란일 등이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 사이클로알킬"은 사이클로헥실메틸, 사이클로펜틸프로필 등을 포함하는 사이클로알킬 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 헤테로사이클로알킬"은 2-(1-피롤리딘일)에틸, 4-몰폴린일메틸, (1-메틸-4- 피페리딘일)메틸 등을 포함하는 헤테로사이클로알킬 치환체를 갖는 C1-C6-알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "카복시"는 -C(O)OH 기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 카복시"는 2-카복시에틸 등을 포함하는 카복시 치환체를 갖는 C1-C5-알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아실"은 -C(O)R 기를 지칭하되, R은, 예를 들어, 치환체 중에서도 C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아실옥시"는 -OC(O)R 기를 지칭하되, R은, 예를 들어, 치환체 중에서도 C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알콕시"는 -O-R기를 지칭하되, R은, 예를 들어, 선택적으로 치환된 알킬기, 예컨대, 치환체 중에서도 선택적으로 치환된 C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴이다. 예시적인 알콕시기는 예로서 메톡시, 에톡시, 페녹시 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알콕시카보닐"은 -C(O)OR기를 지칭하되, R은, 예를 들어, 다른 가능한 치환체 중에서도 수소, C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 알콕시카보닐"은 2-(벤질옥시카보닐)에틸 등을 포함하는 알콕시카보닐 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아미노카보닐"은 -C(O)NRR'기를 지칭하되, R 및 R'의 각각은 독립적으로, 예를 들어, 치환체 중에서도 수소, C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 아미노카보닐"은 2-(다이메틸아미노카보닐)에틸 등을 포함하는 아미노카보닐 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아실아미노"는 -NRC(O)R'기를 지칭하되, R 및 R'의 각각은 독립적으로, 예를 들어, 치환체 중에서도 수소, C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 아실아미노"는 2-(프로피오닐아미노)에틸 등을 포함하는 아실아미노 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "유레이도"는 -NRC(O)NR'R"기를 지칭하되, R, R' 및 R"의 각각은 독립적으로, 예를 들어, 치환체 중에서도 수소, C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴, C1-C6-알킬 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬일 수 있다. 예시적인 유레이도기는 R' 및 R"가 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 3 내지8원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하는 모이어티를 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 유레이도"는 2-(N'-메틸유레이도)에틸 등을 포함하는 유레이도 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "아미노"는 -NRR'기를 지칭하되, R 및 R'의 각각은 독립적으로, 예를 들어, 치환체 중에서도 수소, C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴, C1-C6-알킬 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬일 수 있다. 예시적인 아미노기는 R' 및 R'가 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 3 내지8원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성할 수 있는 모이어티를 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 아미노"는 2-(1-피롤리딘일)에틸 등을 포함하는 아미노 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "암모늄"은 양으로 하전된 기 -N+RR'R"를 지칭하되, R, R' 및 R"의 각각은 독립적으로, 예를 들어, 치환체 중에서도 C1-C6-알킬, C1-C6-알킬 아릴, C1-C6-알킬 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬일 수 있다. 예시적인 암모늄기는 R' 및 R'가 이들이 부착된 질소 원자와 함께, 3 내지 8원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하는 모이어티를 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도 원자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "설폰일옥시"는 -OSO2-R기를 지칭하되, R은 수소, C1-C6-알킬, 할로겐으로 치환된 C1-C6-알킬, 예를 들어, -OSO2-CF3 기, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 및 C1-C6-알킬 헤테로아릴로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 설폰일옥시"는 2-(메틸설폰일옥시)에틸 등을 포함하는 설폰일옥시 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "설폰일"은 "-SO2-R"기를 지칭하되, R은 수소, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬, 할로겐으로 치환된 C1-C6-알킬, 예를 들어, -SO2-CF3　기, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 설폰일"은 2-(메틸설폰일)에틸 등을 포함하는 설폰일 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "설핀일"은 "-S(O)-R"기를 지칭하되, R은 수소, C1-C6-알킬, 할로겐으로 치환된 C1-C6-알킬, 예를 들어, -SO-CF3 기, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6- 알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 설핀일"은 2-(메틸설핀일)에틸 등을 포함하는 설핀일 치환체를 갖는 C1-C5-알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "설판일"은 -S-R기를 지칭하되, R은, 예를 들어, 치환체 중에서 알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴이다. 예시적인 설판일기는 메틸설판일, 에틸설판일 등이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 설판일"은 2-(에틸설판일)에틸 등을 포함하는 설판일 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "설폰일아미노"는 -NRSO2-R'기를 지칭하되, R 및 R'의 각각은 치환체 중에서 독립적으로 수소, C1-C6-알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C6-알킬 아릴 또는 C1-C6-알킬 헤테로아릴일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "알킬 설폰일아미노"는 2-(에틸설폰일아미노)에틸 등을 포함하는 설폰일아미노 치환체를 갖는 알킬기를 지칭한다.
개개 치환체의 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, "알킬", "알켄일", "알킨일", "아릴" 및 "헤테로아릴" 등의 기와 같은 위에 제시된 기는, 예를 들어, 하나 이상의 치환체, 결합가가 허용되는 경우, 예컨대, 알킬(예를 들어, C1-C6-알킬), 알켄일(예를 들어, C2-C6-알켄일), 알킨일(예를 들어, C2-C6-알킨일), 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 알킬 아릴(예를 들어, C1-C6-알킬 아릴), 알킬 헤테로아릴(예를 들어, C1-C6-알킬 헤테로아릴, 알킬 사이클로알킬(예를 들어, C1-C6-알킬 사이클로알킬), 알킬 헤테로사이클로알킬(예를 들어, C1-C6-알킬 헤테로사이클로알킬), 아미노, 암모늄, 아실, 아실옥시, 아실아미노, 아미노카보닐, 알콕시카보닐, 유레이도, 아릴, 헤테로아릴, 설핀일, 설폰일, 알콕시, 설판일, 할로겐, 카복시, 트라이할로메틸, 사이아노, 하이드록시, 머캅토, 나이트로 등으로부터 선택된 치환체로 선택적으로 치환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치환은 이웃하는 치환체가 고리 폐쇄를 겪고, 예컨대, 근처의 기능적 치환체가 관여되어, 예를 들어, 특히 락탐, 락톤, 환식 무수물, 아세탈, 티오아세탈 및 아민알을 형성하는 것.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "선택적으로 축합된"은 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴과 같은 고리계와 축합될 수 있는 환식 화학기를 지칭한다. 선택적으로 축합된 화학기에 축합될 수 있는 예시적인 고리계는, 예를 들어, 인돌릴, 아이소인돌릴, 벤조퓨란일, 아이소벤조퓨란일, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조아이소옥사졸릴, 벤조아이소티아졸릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 프탈라진일, 퀴녹살린일, 퀸아졸린일, 신놀린일, 인돌리진일, 나프티리딘일, 프테리딘일, 인단일, 나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸, 인돌린일, 아이소인돌린일, 2,3,4,5-테트라하이드로벤조[b]옥세핀일, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-벤조사이클로헵텐일, 크로만일 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 염이 형성된 비이온화된 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 본 명세서에 기재된 화합물의 염과 같은 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 무기산(예를 들어, 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 질산 등)에 의해 형성된 산 부가염, 및 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 석신산, 말산, 퓨마르산, 말레산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팜산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 설폰산, 나프탈렌 다이설폰산 및 폴리갈락투론산과 같은 유기산에 의해 형성된 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 4차 염, 예컨대, 화학식 -NR,R',R"　+Z-의 4차 암모늄염으로서 투여될 수 있되, R, R' 및 R"의 각각은 독립적으로, 예를 들어, 수소, 알킬, 벤질, C1-C6- 알킬, C2-C6-알켄일, C2-C6-알킨일, C1-C6-알킬 아릴, C1-C6-알킬 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬 등일 수 있고, Z는 반대이온, 예컨대, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, -O-알킬, 톨루엔설포네이트, 메틸 설포네이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실레이트(예컨대, 벤조에이트, 석시네이트 아세테이트, 글리콜레이트, 말리에이트, 말레이트, 퓨마레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 아스코르베이트, 신나모에이트, 만델로에이트 및 다이페닐아세테이트) 등일 수 있다.
본 명세서에 기재된 구조 조성물은 또한 호변이성질체, 기하 이성질체(예를 들어, E/Z 이성질체 및 시스/트랜스 이성질체), 거울상 이성질체, 부분입체이성질체 및 라세미 형태뿐만 아니라 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 이러한 염은, 예를 들어, 염산, 브로민화수소산, 설페이트 또는 바이설페이트, 포스페이트 또는 인산수소, 아세테이트, 벤조에이트, 석시네이트, 퓨마레이트, 말리에이트, 락테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 글루코네이트, 메탄설포네이트, 벤젠설포네이트 및 파라-톨루엔설포네이트 염과 같은 약제학적으로 허용 가능한 산에 의해 형성된 산 부가염을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물의 입체화학적 입체배체를 도시하지 않는 화학적 구조식은 표시된 화합물의 입체이성질체 중 어느 하나, 또는 하나 이상의 이러한 입체이성질체의 혼합물(예를 들어, 거울상 이성질체 또는 표시된 화합물의 부분입체이성질체 중 어느 하나, 또는 거울상 이성질체의 혼합물(예를 들어, 라세미 혼합물) 또는 부분입체이성질체의 혼합물)을 포괄하는 것으로 해석될 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물의 입체화학적 입체배치를 구체적으로 도시하는 화학적 구조식은 나타낸 특정 입체이성질체의 실질적으로 순수한 형태를 지칭하는 것으로 해석될 것이다. "실질적으로 순수한" 형태는, 예를 들어, 당업계에 알려진 크로마토그래피 및 핵 자기 공명 기법을 사용해서 평가할 때, 85% 초과의 순도, 예컨대, 85% 내지 99%, 85% 내지 99.9%, 85% 내지 99.99% 또는 85% 내지 100%의 순도, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999% 또는 100%의 순도를 갖는 화합물을 지칭한다.
상세한 설명
본 개시내용은 자가면역질환, 예컨대, 특히 1형 당뇨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심장근육병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근염-섬유근통, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, 연소성 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합결합조직질환, 다발성경화증, 중증근무력증, 시신경 척수염, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발동맥염, 다발 연골염, 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경변증, 건선, 레이노 현상, 리플리 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 타카야수 혈관염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 따르면, 환자(예를 들어, 인간 환자)는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능세포 집단(예를 들어, 만능 조혈모세포)이 투여될 수 있다. 핵산 카세트는 앞서 언급한 병태 중 하나 이상과 같은 자가면역질환을 치료 또는 예방하기 위해 CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 치료적 처치와 관련하여, 만능 조혈모세포는 질환의 하나 이상의 증상을 경감하고/하거나 질환과 관련된 기저 분자 병리를 치료하기 위해, 예컨대, 자가반응성 효과기 면역 세포 집단의 활성 및/또는 증식을 억제하기 위해, 자가반응성 효과기 면역 세포의 세포자멸사를 유도하기 위해, 자가면역 반응으로부터 내인성 조직을 보호하기 위해 또는 염증을 감소시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 Treg 세포 요법을 이용하여 자가면역질환을 치료하는 현재의 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 지금까지, 인간 다클론성 Treg 세포는 자가면역질환을 치료하기 위해 임상시험에서 사용되어 왔다. 그러나, 다클론성 Treg 세포 요법은 Treg 세포의 생체내 확장 및 지속성의 결여뿐만 아니라 표적 조직에 대한 Treg 세포의 특이성 결여로 인해 비효과적인 것으로 증명되었다. 다클론성 Treg 세포의 특이성 결여를 극복하기 위해, Treg 세포는 특정 항원을 인식할 수 있는 키메라 항원 수용체 또는 항원-특이적 T 세포 수용체를 비롯한 수용체를 발현시키도록 유전자 조작되었다. 이러한 진보에도 불구하고, 자가면역질환을 치료하기 위한 현재의 Treg 세포 요법의 사용과 관련된 장애물 중 하나는 환자에 직접 투여되는 Treg 세포의 지속성이다. 현재의 연구는 세포가 생체내에서 3 내지 5년만 지속될 수 있다는 것을 시사하는데, 이는 만성 자가면역질환과 관련하여 특히 우려가 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 Treg 세포의 특정 억제 잠재력을 조혈줄기세포 유전자 요법의 증명된 지속성과 조합함으로써 자가면역질환을 치료하기 위해 유전자 조작된 항원-특이적 Treg 세포를 사용하기 위한 기존의 패러다임을 개선한다. 특히, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 생체내 조혈 세포의 분화 시, Treg 세포에서 우선적으로 발현되는 항원-결합 단백질을 포함하도록 유전자 조작된 만능 조혈모세포를 제총한다. 만능 조혈모세포가 다양한 계통의 성숙 혈액 세포로 분화될 수 있지만, 항원-결합 단백질은 CD4+CD25+ 조절 Treg 세포에서 우선적으로 활성인 계통-특이적 전사 조절 요소(예를 들어, Foxp3 프로모터)의 발현으로 인해 Treg 세포에서 특이적으로 발현된다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 또한 자가항원 결합-단백질 발현의 조직-특이적 조절을 제공함으로써 Treg 세포에 대해 개선된 안정성을 부여할 수 있다. 따라서, 자가항원-결합 단백질의 발현은 Treg 세포 표현형에 반응성이다. 대조적으로, 환자에게 직접 투여되는 항원-특이적 Treg 세포는 Treg 세포에서 활성이고 효과기 T 세포가 되는 계통-특이적 전사 조절 요소를 상실할 수 있다. 따라서, 자가면역질환을 앓고 있는 환자에 대한 Treg 세포의 직접 투여는 면역 반응을 억제하기보다는 면역 반응을 추가로 활성화시키는 것의 위험과 관련된다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 또한 제조 및 실현 가능성에 대해 이점을 제공할 수 있다. 현재 Treg 세포의 단일 마커가 없기 때문에, 직접 Treg 세포 요법은 매우 다량의 세포에 대한 다중-파라미터 세포 분류를 필요로 하여, 상당한 제조 상의 어려움을 야기한다. 추가적으로, 자가면역질환을 갖는 환자는 보다 소수의 불량하게 기능성인 Treg 세포를 가져서, 자가유래 Treg 세포 요법에 대한 상당한 제조 상의 어려움을 야기한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 의해 제공되는 바와 같은 조혈줄기세포는 분명한 제조 프로토콜 및 양호한 제조 실행을 갖는다.
더 나아가, 조혈줄기세포 투약량은 잘 확립되지만, 효과적인 Treg 세포 투약량은 불분명하게 남아있고, 각 질환에 대해 상이할 가능성이 있을 것이다. 환자에게 직접 투여되는 Treg 세포의 장기간 효능은 또한 다회 용량 및 결과적으로 다회 조건화 요법을 필요로 할 수 있다.
자가면역질환의 치료 방법
자가면역질환은 자신의 조직에 대한 자신의 면역계의 부적절한 공격의 결과이다. 이러한 질환은 자가 항원에 대해 반응성을 부적절하게 나타내는 T- 및 B-림프구에 의해 매개된다. 조절 T(Treg) 세포는 "자기" 주조직적합복합체(MHC) 단백질 및 다른 양성 항원과 교차반응성인 면역 세포의 활성을 저해함으로써, 면역계를 유지하고, 자가-항원에 대한 내성을 유지하고, 자가면역질환을 예방하기 위해 진화되었다. Treg 세포는 이들의 고유 표면 단백질 제시에 기반하여 구별될 수 있는 T-세포의 이질적 분류를 나타낸다. Treg 세포의 가장 잘 이해되는 집단은 CD4+, CD25+, FoxP3+ Treg 세포 및 CD17+ Treg 세포를 포함한다. Treg 세포가 자가반응성 효과기 면역 세포(예를 들어, 효과기 T 세포, B 세포 및 NK 세포)의 억제를 매개하는 정확한 메커니즘은 진행 중인 연구의 대상이지만, Treg 억제 기능은 접촉-의존적 세포-대-세포 크로스토크(crosstalk) 메커니즘을 통해 그리고 IL-10, IL-35 및 TGF-β와 같은 저해 사이토카인의 분비를 통해 일어나는 것으로 여겨진다. 또한 특정 부류의 Treg 세포는 표적 T-세포에서 증식-유도 사이토카인 IL-2의 집단을 저해하고 IL-2에 대한 CD25(IL-2 수용체의 서브도메인)의 친화도에 의해 자가반응성 세포로부터 IL-2를 추가로 격리시킬 수 있다는 것이 나타났다. 게다가, CD4+, CD25+, FoxP3+ Treg 세포는 또한 B-세포 풍부 영역에 존재하고 TH2-세포 활성을 약화시키는 이들의 능력과 독립적인 면역글로불린 생산을 직접 억제할 수 있다는 것이 나타났다.
Treg 세포 요법이 자가면역질환에 대한 잠재적 치료 패러다임으로서 연구되었지만, Treg 세포 요법에 의한 한 가지 문제는 Treg 세포가 이들의 표현형(예를 들어, CD25+ 표현형)을 상실하는 경향이 있다는 것이다. 따라서, Treg 세포는 이들의 억제 기능을 상실하고 자가반응성 효과기 면역 세포(예를 들어, 효과기 T 세포)로 전환시켜, 면역 반응의 활성화 및 자가면역질환의 악화를 초래할 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 만능세포, 예컨대, 자가면역질환의 치료를 위한 조혈 계통의 다양한 세포로 분화될 수 있는 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC)를 제공함으로써 이 문제에 대한 해결책을 제공한다. 예를 들어, 만능 조혈모세포는 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)로 분화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 만능 조혈모세포는 조직을 표적화하도록 국재화를 제공하는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함한다. 만능 조혈모세포가 조혈 계통의 여러 세포 유형으로 분화될 수 있지만, 자가항원-결합 단백질의 발현은 Treg 세포로 분화되는 세포로 제한된다. 자가항원-결합 단백질의 Treg-특이적 발현은 CD4+CD25+ Treg 세포에서 우선적으로 활성인 전사 조절 요소의 제어하에 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 위치시킴으로써 달성된다. 자가항원-결합 단백질은 자가면역 부위에 존재하는 자가항원에 Treg 세포를 보냄으로써, 이러한 부위에서 Treg 억제자 기능에 중점을 두어 자가면역질환을 치료할 수 있다.
분화된 Treg 세포 상류인 환자(예를 들어, 자가면역질환을 앓고 있는 인간 환자)에 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC)를 전달하는 것의 이점은, Treg 세포가 자가항원-결합 단백질의 발현을 제어하는 CD4+CD25+ Treg-특이적 전사 조절 요소로 인해 자가반응성 효과기 면역 세포(예를 들어, 효과기 T 세포)로 전환되는 경우, HSC-유래 Treg 세포가 자가항원-결합 단백질을 발현시킨다는 것이다. 대조적으로, 자가항원-결합 단백질을 발현시키고 환자(예를 들어, 자가면역질환을 앓고 있는 인간 환자)에게 직접 전달되는 Treg 세포는 이들의 표현형을 상실하고 자가항원-결합 단백질을 계속해서 발현시키는 자가반응성 효과기 면역 세포로 전환될 수 있었다. 자가항원-결합 단백질을 발현시키는 자가반응성 효과기 면역 세포(예를 들어, 효과기 T 세포)는 자가면역 부위로 보내져서, 면역 반응의 활성화 및 자가면역질환의 악화를 야기할 것이다. 따라서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 자가면역질환의 치료를 위한 상당한 이점을 제공한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 자가면역질환은 특히 1형 당뇨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심장근육병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, 크레스트 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근염-섬유근통, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, 연소성 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합결합조직질환, 다발성경화증, 중증근무력증, 시신경 척수염, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발동맥염, 다발 연골염, 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경변증, 건선, 레이노 현상, 리플리 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 타카야수 혈관염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함한다.
다발성경화증의 치료 방법
다발성경화증(MS)은 뇌 및 척수에서 신경 세포의 절연 커버가 손상된 자가면역 탈수초성 질환이다. 이 손상은 신경계의 일부가 소통하는 능력을 붕괴시키고, 지속적인 신경학적 손상을 초래한다. MS를 갖는 환자는, 예를 들어, 수족냉증 또는 아린감, 쇠약, 현기증, 진전, 협응 결여, 불안정 보행, 시력 문제, 통증 및 피로를 포함하는 매우 다양한 증상을 나타낼 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여, MS를 앓고 있는 인간 환자와 같은 환자는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질에 결합하고 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC)와 같은 만능세포의 집단이 투여될 수 있다. 만능 조혈모세포는 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키고/시키거나, 질환의 진행을 늦추거나 멈추고 그리고/또는 질환의 하나 이상의 기저 생리학적 원인을 치료할 수 있다.
1형 당뇨병의 치료 방법
당뇨병은 혈당 수준의 정상 조절을 막는 인슐린 결핍증을 특징으로 하는 중증의 자가면역질환이다. 인슐린은 췌장의 랑게르한스섬 내의 β 세포(β-섬 세포)에 의해 생산되는 펩타이드 호르몬이다. 인슐린은 글루코스 이용, 단백질 합성, 형성 및 중성 지질의 저장을 촉진시키고, 뇌 및 근육조직에 대한 에너지의 주요 공급원이다. 1형 당뇨병은 인슐린 생산을 제거하거나 감소시키고 종국적으로 고혈당증 및 케톤산증을 야기하는 췌장의 β-섬 세포의 파괴를 초래하는 자가면역 반응에 의해 야기된다. 1형 당뇨병 증상의 예는 증가된 갈증, 잦은 배뇨, 극도의 배고픔, 체중감소, 피로 및 흐린시야를 포함한다. 1형 당뇨병의 만성 고혈당증은 또한 눈, 신장, 신경 및 혈관에서의 상당한 그리고 종종 파괴적인 장기간 합병증과 관련된다.
본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여, 1형 당뇨병을 앓고 있는 인간 환자와 같은 환자는 인슐린, GAD-65, IA-2 또는 ZnT8에 결합하고 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC)와 같은 만능세포의 집단이 투여될 수 있다. 만능 조혈모세포는 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키고/시키거나, 질환의 진행을 늦추거나 멈추고 그리고/또는 질환의 하나 이상의 기저 생리학적 원인을 치료할 수 있다.
류마티스성 관절염의 치료 방법
류마티스성 관절염은 관절을 감싸고 있는 윤활막에 염증이 생기는 자가면역질환이다. 시간이 지남에 따라, 염증은 관절 조직을 파괴하여 장애를 초래할 수 있다. 류마티스성 관절염 증상의 예는 염증, 피로, 쇠약 및 통증, 부종 및/또는 압통 관절을 포함한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여, 류마티스성 관절염을 앓고 있는 인간 환자와 같은 환자는 콜라겐 II, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드 또는 HSP65에 결합하고 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC)와 같은 만능세포의 집단이 투여될 수 있다. 만능 조혈모세포는 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키고/시키거나, 질환의 진행을 늦추거나 멈추고 그리고/또는 질환의 하나 이상의 기저 생리학적 원인을 치료할 수 있다.
자가항원-결합 단백질의 계통-특이적 발현을 위한 세포
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 추가 분화를 겪을 수 있는 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포의 한 가지 유형은 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발생되는 능력을 갖는 만능 세포이다. 만능 세포의 예는 조혈 계통의 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발생되는 능력을 갖는 만능 조혈 세포를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 만능 조혈 세포는, 예를 들어, HSC, HPC, ESC, iPSC, 림프구 전구세포 및 CD34+ 세포를 포함한다. HSC는 자기재생되는 능력과 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 계통을 포함하는 성숙 혈액 세포로 분화되는 능력을 갖는 미숙 혈액 세포를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC)를 사용하는 한 가지 이점은 이러한 세포가 Treg 세포로 분화되는 능력을 갖는다는 것이다. 만능 조혈모세포가 또한 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 Treg 세포와 별개인 계통의 혈액 세포로 분화될 수 있지만, 자가항원-결합 단백질은 Treg 세포로 분화되는 세포에서 우선적으로 발현될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 CD4+CD25+ Treg 세포에서 우선적으로 활성인 계통-특이적 조절 요소로 자가항원-결합 단백질의 발현을 제어함으로써 Treg 세포에서 자가항원-결합 단백질의 우수한 특이성을 달성할 수 있다.
계통-특이적 전사 조절 요소
Foxp3 전사인자의 발현은 Treg 세포의 독특한 특징이고, 이러한 세포가 나타내는 면역억제 표현형의 대부분을 담당한다. 전사 조절 요소(예를 들어, Foxp3 프로모터, CNS1 인핸서, CNS2 인핸서, CNS3 인핸서 및/또는 CNS0 인핸서)에 의한 Foxp3 발현의 조절은 Treg-세포-매개 면역 반응의 항상성을 유지하는 데 중요하다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 구체적으로는 Treg 세포에서 본 명세서에 기재된 바와 같이, 자가항원 결합-단백질을 암호화하는 핵산 카세트의 발현을 유도하기 위해, Treg-특이적 전사 조절 요소, 예컨대, Foxp3 전사 조절 요소를 이용한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 전사 조절 요소는 서로 작동 가능하게 연결된 다양한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터 또는 이의 기능적 부분을 포함할 수 있다. Foxp3 프로모터는 Treg 세포에서 Foxp3 유전자의 전사를 활성화시킨다. 전사인자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 Foxp3 프로모터 영역에 결합할 수 있고, Foxp3 유전자를 전사활성화시킨다. Foxp3 프로모터 영역에 결합하는 전사인자의 예는 문헌[Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018)]에 기재된 바와 같이 Foxo 전사인자 패밀리 구성원(예를 들어, Foxo1 및 Foxo3) 및 Nr4a 핵 수용체 패밀리 구성원(예를 들어, Nr4a1 (Nur77), Nr4a2 및 Nr4a3)을 포함한다. 인간 Foxp3 프로모터 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는 서열번호 1에 제시된 바와 같이 그리고 문헌[Mantel et al., J. Immunol. 176(6):3593-602 (2006)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 -511 내지 +176을 포함한다. 인간 Foxp3 프로모터 영역을 포함하는 조절 요소의 다른 예는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 2에 제시되어 있다. 뮤린 Foxp3 프로모터 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 3에 제시되어 있다. 인간 게놈에 대한 서열번호 3의 정렬에 의해, 인간 Foxp3 프로모터 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 4에 제시되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가 핵산 조절 요소는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
Foxp3의 Treg-특이적 발현의 기저를 이루는 메커니즘은 다른 시스-조절 요소, 예컨대, 보존된 비암호화 서열(CNS)을 수반할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기재된 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서 또는 이의 기능적 부분을 포함할 수 있다. CNS1은 Treg 세포의 말초 유도 및 점막 면역 관용에 기여하는 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 반응 요소를 포함한다. CNS1의 결실은 장연관림프조직에서 Treg 세포 집단을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 전사인자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 CNS1 인핸서 영역에 결합할 수 있고, Foxp3 유전자를 전사활성화시킨다. CNS1 인핸서 영역에 결합하는 전사인자의 예는 문헌[Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018)]에 기재된 바와 같이 AP-1, NFAT, Smad3 및 Foxo(예를 들어, Foxo1 및 Foxo3) 전사인자를 포함한다. 인간 CNS1 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 -500 내지 +100을 포함한다. 뮤린 CNS1 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[Tone et al., Nat. Immunol. 9(2):194-202 (2008)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 5에 제시되어 있다. 인간 게놈에 대한 서열번호 5의 정렬에 의해, 인간 CNS1 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 6에 제시되어 있다. 뮤린 CNS1 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 다른 예는 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 바와 같이 서열번호 7에 제시된다. 인간 게놈에 대한 서열번호 7의 정렬에 의해, 인간 CNS1 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 8에 제시되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가 핵산 조절 요소는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기재된 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서 또는 이의 기능적 부분을 포함할 수 있다. CNS2는 기능적 Treg 세포에서만 고도로 탈메틸화된 CpG 섬을 포함한다. CNS2의 탈메틸화는 Treg 세포 계통에 대한 가장 확실한 마커인 것으로 간주된다. CNS2는 T 세포 수용체 자극에 반응하여 그리고 Treg 세포 증식 동안 Foxp3 발현의 안정성을 담당한다. 전사인자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 CNS2 인핸서 영역에 결합할 수 있고, Foxp3 유전자를 전사활성화시킨다. CNS2 인핸서 영역에 결합하는 전사인자의 예는 문헌[Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018)]에 기재된 바와 같이 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및 c-Rel를 포함한다. 인간 CNS2 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 +2,022 내지 +2,721을 포함한다. 뮤린 CNS2 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 9에 제시되어 있다. 인간 게놈에 대한 서열번호 9의 정렬에 의해, 인간 CNS2 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 10에 제시되어 있다. 뮤린 CNS2 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 다른 예는 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 바와 같이 서열번호 11에 제시된다. 인간 게놈에 대한 서열번호 11의 정렬에 의해, 인간 CNS2 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 12에 제시되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가 핵산 조절 요소는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기재된 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서 영역 또는 이의 기능적 부분을 포함할 수 있다. CNS3은 Foxp3 발현에 필요한 임계값 TCR 자극에서 어떤 역할을 하고, 말초 및 흉선 Treg 세포 생성에 중요하다. 전사인자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 CNS3 인핸서 영역에 결합할 수 있고, Foxp3 유전자를 전사활성화시킨다. CNS3 인핸서 영역에 결합하는 전사인자의 예는 문헌[Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018)]에 기재된 바와 같이 Foxo (예를 들어, Foxo1 및 Foxo3) 및 c-Rel를 포함한다. 인간 CNS3 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는 문헌[Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007)]에 기재된 바와 같이, 인간 Foxp3 좌위의 Foxp3 전사 개시 부위에 대해, 예를 들어, 핵산 +4,301 내지 +4,500을 포함한다. 뮤린 CNS3 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 13에 제시되어 있다. 인간 게놈에 대한 서열번호 13의 정렬에 의해, 인간 CNS3 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 14에 제시되어 있다. 뮤린 CNS3 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 다른 예는 문헌[Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010)]에 기재된 바와 같이 서열번호 15에 제시된다. 인간 게놈에 대한 서열번호 15의 정렬에 의해, 인간 CNS3 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 16에 제시되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가 핵산 조절 요소는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기재된 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서 또는 이의 기능적 부분을 포함할 수 있다. CNS0는 Treg-세포 특이적 인핸서이다. 전사인자는 CNS0 인핸서 영역에 결합할 수 있고, Foxp3 유전자를 전사활성화시킨다. CNS0 인핸서 영역에 결합하는 전사인자의 예는 문헌[Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018) 및 Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이, Satb1 및 Stat5를 포함한다. 염색질 형성자(chromatin organizer)인 Satb1은 CNS0에 결합하는 것으로 발견되었고, 흉선 Treg 세포 분화의 초기에 Foxp3 유전자 및 Ctla4 및 Il2ra와 같은 다른 Treg 세포 관련 유전자의 Treg 세포-특이적 인핸서를 활성화시키기 위한 개척 인자(pioneer factor)로서 작용한다. Satb1은 폐쇄된 염색질에 결합하고 Foxp3 좌위의 후생적 상태를 안정된 상태로 변형시킴으로써 조절 요소에 다른 전사 인자가 결합하는 것을 허용한다. 뮤린 CNS0 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 17에 제시되어 있다. 인간 게놈에 대한 서열번호 17의 정렬에 의해, 인간 CNS0 인핸서 영역을 포함하는 예시적인 조절 요소는, 예를 들어, 서열번호 18에 제시되어 있다. 뮤린 CNS0 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 다른 예는 문헌[Dikiy et al., Immunity. 54(5):931-946 (2021)]에 기재된 바와 같이, 서열번호 19에 제시된다. 인간 게놈에 대한 서열번호 19의 정렬에 의해, 인간 CNS0 인핸서 영역을 포함하는 조절 요소의 추가 예는 서열번호 20에 제시되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가 핵산 조절 요소는 상기 핵산 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 이상의 서열 동일성)을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
전사 조절의 추가 방법
추가 전사 조절 요소는 본 명세서에 기재된 바와 같이 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트의 발현을 조절하기 위해 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 카세트 발현은 소분자 활성체 또는 약물 유도제의 존재 하에 DNA-결합 도메인 및 약물-결합 도메인을 포함하는, 키메라 전사인자의 결합 시 핵산 카세트의 발현을 촉진 또는 방지하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열 요소, 예컨대, DNA 결합 도메인에 의해 전사 수준에서 제어될 수 있다. 약물-유도성 시스템의 예는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[ et al., Front. Immunol. 11:2044 (2020)에 기재되어 있다.
조작된 리보스위치는 또한 본 명세서에 기재된 핵산 카세트의 전사를 제어하기 위해 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 조절 요소는 리간드로서 대사물질 또는 금속 이온에 결합할 수 있고, 리간드 결합에 반응하여 대안의 구조를 형성함으로써 mRNA 발현을 조절한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용해서, 리간드와 같은 외인성 제제는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된 핵산 카세트의 전사를 유도할 수 있다. 예시적인 리보스위치는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Strobel et al. ACS Synth. Biol. 9(6):1292-1305 (2020)]에 기재되어 있다. 유도제 리간드의 예는 테트라사이클린, 테트라사이클린 유도체, 라파마이신, 테오필린 및 구아닌을 포함한다. 유도제 리간드의 추가 예는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Tickner et al. Pharmaceuticals. 14(6):554 (2021)]에 기재되어 있다.
자살 유전자 안전 스위치는 유전자 변형된 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 지속 및 생존을 제어하기 위해 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 카세트는 형질도입된 유전자 변형된 세포(예를 들어, 핵산 카세트를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 만능 조혈모세포)의 선택적 제거를 위해 유도성 카스파제 9 시스템(iCasp9) 또는 단순포진-티미딘-키나제(HSV-TK)와 같은 유전자 안전 스위치에 작동 가능하게 연결될 수 있다. iCasp9의 유도는 이량체 약물 AP1903과 같은 소분자의 투여에 따른다. 이량체화는 형질도입된 세포에서 세포자멸사의 빠른 유도를 초래하고, 세포자멸사 경로의 구성성분과 프레임 내에서 연결된 약물 결합 도메인으로 구성된 키메라 단백질은 비치료적 소분자 이량체화제의 투여 후 형질도입된 세포의 조건적 이량체화 및 세포자멸사를 가능하게 할 수 있다. HSV-TK와 병용되는 간시클로버와 같은 뉴클레오사이드 유사체는 또한 세포자멸사를 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 자살 유전자 안전 스위치는 개시내용이 참조에 의해 원용되는 문헌[Jones et al. Front. Pharmacol. 5:254 (2014)]에 기재되어 있다.
추가로, 저해 RNA(RNAi) 서열은 Treg 세포에서 핵산 카세트의 전사를 조절하기 위해 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, RNAi는 마이크로RNA, 예컨대, 마이크로RNA-17(miR-17)을 표적화하는 데 사용될 수 있다. miR-17은 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Yang et al. Immunity. 45(1):83-93. (2016)]에 기재된 바와 같이, Foxp3 공동 조절제, 예컨대, Eos를 표적화함으로써 Treg 세포 억제 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. miR-17의 표적화는 유전자 변형된 Treg 세포의 억제 기능을 최적화하고, 잠재적 전염증 또는 병리학적 세포 활성을 제한한다.
자가항원-결합 단백질
본 명세서에 기재된 바와 같이, 만능세포(예를 들어, 만능 조혈모세포)로부터 유래된 Treg 세포는 세포를 조직-특이적 자가항원에 결합시키고 자가면역 부위에 수송하여, 질환 부위에서 Treg 억제자 기능을 특별히 집중시키는 자가항원-결합 단백질을 발현시킬 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 유용한 자가항원-결합 단백질의 예는 대상체에서 내인성으로 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 단일쇄 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체 및 단일쇄 항체 단편) 및 다중쇄 단백질(예를 들어, T 세포 수용체, 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 및 F(ab')2 분자)를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 자가항원-결합 단백질은 자가항원, 예컨대, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 아쿠아포린 4, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 및 갑상선에서 발현되는 단백질에 결합할 수 있다. 자가항원의 추가 예는 문헌[Quintana et al., J. Autoimmun. 17(3):191-7 (2001) 및 Riedhammer et al., Front Immunol. 6:322 (2015)]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
항체
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 항체는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩타이드-함유 분자, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 내인성으로 발현되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드-결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 또는 이들의 임의의 부분을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 분자의 둘 이상의 부분은, 예를 들어, 아마이드 결합, 티오에터 결합, 탄소-탄소 결합, 이황화 브리지를 통해 또는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 링커와 같은 링커에 의해 서로 공유 결합될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 항체는 다클론성, 단클론성, 유전자 조작, 및 달리 변형된 형태의 항체, 예컨대, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 영장류화된 항체, 및 이형접합체 항체(예를 들어, 이중- 삼중- 및 사중-특이적 항체, 다이어바디, 트라이어바디 및 테트라바디), 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 키메라 항체는 하나의 공급원 유기체, 예컨대, 래트 또는 마우스로부터 유래된 가변 도메인 서열(예를 들어, CDR 서열), 및 상이한 유기체(예를 들어, 특히 인간, 다른 영장류, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 고양이, 개, 기니피그, 소과의 구성원(예컨대, 특히 소, 들소, 버팔로, 엘크 및 야크), 소, 양, 말 또는 들소)의 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역을 가질 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison, Science. 229(4719):1202-7 (1985); Oi et al. BioTechniques. 4:214-221 (1986); Gillies et al. J. Immunol. Methods. 125:191-202 (1985)]; 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호 참조.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 인간 항체는 단백질의 실질적으로 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이 인간에서 실질적으로 비면역원성이며, 약간의 서열만이 변화 또는 변형된, 항체를 포함한다. 인간 항체는 인간 세포에서(예를 들어, 재조합 발현에 의해), 또는 능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현시킬 수 있는 비인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생성될 수 있다. 추가로, 인간 항체가 단일쇄 항체일 때, 이는 미경험 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결하는 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기과 같은 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩타이드는 인간 유래인 것으로 간주된다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공개 WO 1998/46645; WO 1998/50433; WO 1998/24893; WO 1998/16654; WO 1996/34096; WO 1996/33735; 및 WO 1991/10741 참조. 인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현시킬 수 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자이식 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, PCT 간행물 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625, 126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호를 참조한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 표적-결합 서브도메인)인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 포함한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하는, 실질적으로 모든 또는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 또한 인간 면역글로불린 서열의 영역일 수 있다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 공통 서열의 일부를 포함할 수 있다. 항체 인간화 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-7, 1988]; 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 Queen 등의 제6,180,370호; EP239400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; EP592106; 및 EP519596을 참조한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 항체의 예시적인 항원-결합 단편은, 예를 들어, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG, scFv, SMIP, 다이어바디, 트라이어바디, 애피바디, 나노바디, 앱타머 또는 도메인 항체를 포함한다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기법을 이용하여 얻어질 수 있고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 효용을 위해 선별될 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기법, 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학적 절단에 의해, 또는 일부 실시형태에서, 당업계에 알려진 화학적 펩타이드 합성 절차에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 단일쇄 Fv(scFv) 분자는 항체로부터의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 연결되어 하나의 쇄를 형성하는 항체를 포함한다. scFv 단편은 링커에 의해 분리되는 항체 경쇄의 가변 영역(VL)(예를 들어, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3) 및 항체 중쇄의 가변 영역(VH)(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2 및/또는 CDR-H3)을 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄를 함유한다. scFv 단편의 VL과 VH 영역을 연결하는 링커는 단백질 생성 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커일 수 있다. 대안의 링커는 단백질 분해에 대한 scFv 단편(예를 들어, D-아미노산을 함유하는 링커)의 저항성을 증가시키기 위해, scFv 단편(예를 들어, 친수성 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜-함유 링커 또는 반복 글리신 및 세린 잔기를 함유하는 폴리펩타이드)의 가용성을 향상시키기 위해, 분자(예를 들어, 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하는 링커)의 생물물리학적 안정성을 개선시키기 위해, 또는 scFv 단편(예를 들어, 글리코실화 부위를 함유하는 링커)의 면역원성을 약화시키기 위해 사용될 수 있다. scFv 분자는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호, 문헌[Flo et al., (Gene 77:51, 1989); Bird et al., (Science 242:423, 1988); Pantoliano et al., (Biochemistry 30:10117, 1991); Milenic et al., (Cancer Research 51:6363, 1991); 및 Takkinen et al., (Protein Engineering 4:837, 1991)]에 기재되어 있다. scFv 분자의 VL 및 VH 도메인은 하나 이상의 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 또한 본 명세서에 기재된 scFv 분자의 가변 영역이, 이들이 유래된 항체 분자로부터의 아미노산 서열에서 달라지도록, 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 아미노산 잔기에서 보존적 치환 또는 변화로 이어지는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환이 (예를 들어, CDR 및/또는 프레임워크 잔기에서) 이루어질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 당업계에 인식된 기법을 이용하여 항원 결합을 최적화하기 위해 CDR 아미노산 잔기에 돌연변이가 만들어진다. scFv 단편은, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2011/084714에 기재되어 있다.
항체-유사 단백질 스캐폴드는 또한 항체 CDR에 대해 구조 및 용매 접근성이 유사한 BC, DE 및 FG 구조 루프를 포함하는 제10 피브로넥틴 III형 도메인(10Fn3)과 같은 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
키메라 항원 수용체
CAR Treg 세포는 전구세포, 예컨대, 만능 세포(예를 들어, 만능 조혈 세포)를 조작함으로써 생산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 만능 조혈모세포는 분화된 세포가 Treg 세포인 경우, 자가항원과 같은 표적 항원에 특이적인 CAR을 발현시키는 세포로 분화될 수 있다. CD4+CD25+ Treg 세포(예를 들어, Foxp3 프로모터)에서 활성인 CAR 발현은 계통-특이적 전사 조절 요소에 의한 CAR 발현의 제어는 CAR의 Treg-특이적 발현을 가능하게 한다.
구조적으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 항원 인식 도메인은, 주어진 항원(예를 들어, 자가항원)을 인식하고 이에 특이적으로 결합함으로써, 표적 세포에 대해 특이성을 부여하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 항원 인식 도메인의 예는 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일쇄 항체(예를 들어, scFv) 및 인간화된 항체를 포함한다. 힌지 도메인은 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 T 세포 표면으로부터 떨어져서 항원 인식 도메인을 위치시킨다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 예시적인 힌지 도메인은 CD8(예를 들어, CD8α), CD28, IgG1/IgG4(힌지-Fc 부분), CD4, CD7 및 IgD로부터 유래된 것을 포함한다. 막관통 도메인은 세포외 항원 인식 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 융합하고, T 세포의 원형질막에 CAR을 고정시킨다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 예시적인 막관통 도메인은 CD3 알파, CD3 베타, CD3 엡실론, CD3 제타, CD4, CD5, CD8(예를 들어, CD8α), CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, PD-1, CD4, FcRIγ, CD7, OX40 및 MHC(H2-Kb)로부터 유래된 것을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR-함유 Treg 세포의 면역억제 기능을 촉진시키고 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 신호를 생성할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 초래하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12로부터 유래될 수 있다. 예시적인 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호, 또는 항원 의존적 자극을 초래하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 또는 Toll 리간드 수용체로부터 유래될 수 있다.
만능 조혈 세포는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 다양한 게놈 편집 기법에 의해 특정 자가항원에 특이적으로 결합하는 Treg 세포 상에서 항원 수용체를 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다. 키메라 항원 수용체를 암호화하는 유전자를 혼입시키기 위해 만능 조혈 세포 게놈을 변형하기 위한 예시적인 기법은 CRISPR/Cas, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 및 ARCUS™ 플랫폼을 포함한다.
바이러스 형질도입 방법
폴록사머를 사용하는 형질도입
형질도입 효율을 향상시키기 위한 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 폴록사머가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 폴록사머는 2,050g/㏖ 초과의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량(예를 들어, 약 2,055g/㏖, 2,060g/㏖, 2,075g/㏖, 2,080g/㏖, 2,085g/㏖, 2,090g/㏖, 2,095g/㏖, 2,100g/㏖, 2,200g/㏖, 2,300g/㏖, 2,400g/㏖, 2,500g/㏖, 2,600g/㏖, 2,700g/㏖, 2,800g/㏖, 2,900g/㏖, 3,000g/㏖, 3,100g/㏖, 3,200g/㏖, 3,300g/㏖, 3,400g/㏖, 3,500g/㏖, 3,600g/㏖, 3,700g/㏖, 3,800g/㏖, 3,900g/㏖, 4,000g/㏖, 4,100g/㏖, 4,200g/㏖, 4,300g/㏖, 4,400g/㏖, 4,500g/㏖, 4,600g/㏖, 4,700g/㏖, 4,800g/㏖, 4,900g/㏖ 또는 5,000g/㏖의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량)을 갖는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 2,250g/㏖ 초과의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량(예를 들어, 약 2,300g/㏖, 2,400g/㏖, 2,500g/㏖, 2,600g/㏖, 2,700g/㏖, 2,800g/㏖, 2,900g/㏖, 3,000g/㏖, 3,100g/㏖, 3,200g/㏖, 3,300g/㏖, 3,400g/㏖, 3,500g/㏖, 3,600g/㏖, 3,700g/㏖, 3,800g/㏖, 3,900g/㏖, 4,000g/㏖, 4,100g/㏖, 4,200g/㏖, 4,300g/㏖, 4,400g/㏖, 4,500g/㏖, 4,600g/㏖, 4,700g/㏖, 4,800g/㏖, 4,900g/㏖ 또는 5,000g/㏖의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 2,750g/㏖ 초과의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량(예를 들어, 약 2,800g/㏖, 2,900g/㏖, 3,000g/㏖, 3,100g/㏖, 3,200g/㏖, 3,300g/㏖, 3,400g/㏖, 3,500g/㏖, 3,600g/㏖, 3,700g/㏖, 3,800g/㏖, 3,900g/㏖, 4,000g/㏖, 4,100g/㏖, 4,200g/㏖, 4,300g/㏖, 4,400g/㏖, 4,500g/㏖, 4,600g/㏖, 4,700g/㏖, 4,800g/㏖, 4,900g/㏖ 또는 5,000g/㏖의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 3,250g/㏖ 초과의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량(예를 들어, 약 3,300g/㏖, 3,400g/㏖, 3,500g/㏖, 3,600g/㏖, 3,700g/㏖, 3,800g/㏖, 3,900g/㏖, 4,000g/㏖, 4,100g/㏖, 4,200g/㏖, 4,300g/㏖, 4,400g/㏖, 4,500g/㏖, 4,600g/㏖, 4,700g/㏖, 4,800g/㏖, 4,900g/㏖ 또는 5,000g/㏖의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 3,625g/㏖ 초과의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량(예를 들어, 약 3,700g/㏖, 3,800g/㏖, 3,900g/㏖, 4,000g/㏖, 4,100g/㏖, 4,200g/㏖, 4,300g/㏖, 4,400g/㏖, 4,500g/㏖, 4,600g/㏖, 4,700g/㏖, 4,800g/㏖, 4,900g/㏖ 또는 5,000g/㏖의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 2,050g/㏖ 내지 약 4,000g/㏖(예를 들어, 약 2,050g/㏖, 2,055g/㏖, 2,060g/㏖, 2,065g/㏖, 2,070g/㏖, 2,075g/㏖, 2,080g/㏖, 2,085g/㏖, 2,090g/㏖, 2,095g/㏖, 2,100g/㏖, 2,105g/㏖, 2,110g/㏖, 2,115g/㏖, 2,120g/㏖, 2,125g/㏖, 2,130g/㏖, 2,135g/㏖, 2,140g/㏖, 2,145g/㏖, 2,150g/㏖, 2,155g/㏖, 2,160g/㏖, 2,165g/㏖, 2,170g/㏖, 2,175g/㏖, 2,180g/㏖, 2,185g/㏖, 2,190g/㏖, 2,195g/㏖, 2,200g/㏖, 2,205g/㏖, 2,210g/㏖, 2,215g/㏖, 2,220g/㏖, 2,225g/㏖, 2,230g/㏖, 2,235g/㏖, 2,240g/㏖, 2,245g/㏖, 2,250g/㏖, 2,255g/㏖, 2,260g/㏖, 2,265g/㏖, 2,270g/㏖, 2,275g/㏖, 2,280g/㏖, 2,285g/㏖, 2,290g/㏖, 2,295g/㏖, 2,300g/㏖, 2,305g/㏖, 2,310g/㏖, 2,315g/㏖, 2,320g/㏖, 2,325g/㏖, 2,330g/㏖, 2,335g/㏖, 2,340g/㏖, 2,345g/㏖, 2,350g/㏖, 2,355g/㏖, 2,360g/㏖, 2,365g/㏖, 2,370g/㏖, 2,375g/㏖, 2,380g/㏖, 2,385g/㏖, 2,390g/㏖, 2,395g/㏖, 2,400g/㏖, 2,405g/㏖, 2,410g/㏖, 2,415g/㏖, 2,420g/㏖, 2,425g/㏖, 2,430g/㏖, 2,435g/㏖, 2,440g/㏖, 2,445g/㏖, 2,450g/㏖, 2,455g/㏖, 2,460g/㏖, 2,465g/㏖, 2,470g/㏖, 2,475g/㏖, 2,480g/㏖, 2,485g/㏖, 2,490g/㏖, 2,495g/㏖, 2,500g/㏖, 2,505g/㏖, 2,510g/㏖, 2,515g/㏖, 2,520g/㏖, 2,525g/㏖, 2,530g/㏖, 2,535g/㏖, 2,540g/㏖, 2,545g/㏖, 2,550g/㏖, 2,555g/㏖, 2,560g/㏖, 2,565g/㏖, 2,570g/㏖, 2,575g/㏖, 2,580g/㏖, 2,585g/㏖, 2,590g/㏖, 2,595g/㏖, 2,600g/㏖, 2,605g/㏖, 2,610g/㏖, 2,615g/㏖, 2,620g/㏖, 2,625g/㏖, 2,630g/㏖, 2,635g/㏖, 2,640g/㏖, 2,645g/㏖, 2,650g/㏖, 2,655g/㏖, 2,660g/㏖, 2,665g/㏖, 2,670g/㏖, 2,675g/㏖, 2,680g/㏖, 2,685g/㏖, 2,690g/㏖, 2,695g/㏖, 2,700g/㏖, 2,705g/㏖, 2,710g/㏖, 2,715g/㏖, 2,720g/㏖, 2,725g/㏖, 2,730g/㏖, 2,735g/㏖, 2,740g/㏖, 2,745g/㏖, 2,750g/㏖, 2,755g/㏖, 2,760g/㏖, 2,765g/㏖, 2,770g/㏖, 2,775g/㏖, 2,780g/㏖, 2,785g/㏖, 2,790g/㏖, 2,795g/㏖, 2,800g/㏖, 2,805g/㏖, 2,810g/㏖, 2,815g/㏖, 2,820g/㏖, 2,825g/㏖, 2,830g/㏖, 2,835g/㏖, 2,840g/㏖, 2,845g/㏖, 2,850g/㏖, 2,855g/㏖, 2,860g/㏖, 2,865g/㏖, 2,870g/㏖, 2,875g/㏖, 2,880g/㏖, 2,885g/㏖, 2,890g/㏖, 2,895g/㏖, 2,900g/㏖, 2,905g/㏖, 2,910g/㏖, 2,915g/㏖, 2,920g/㏖, 2,925g/㏖, 2,930g/㏖, 2,935g/㏖, 2,940g/㏖, 2,945g/㏖, 2,950g/㏖, 2,955g/㏖, 2,960g/㏖, 2,965g/㏖, 2,970g/㏖, 2,975g/㏖, 2,980g/㏖, 2,985g/㏖, 2,990g/㏖, 2,995g/㏖, 3,000g/㏖, 3,005g/㏖, 3,010g/㏖, 3,015g/㏖, 3,020g/㏖, 3,025g/㏖, 3,030g/㏖, 3,035g/㏖, 3,040g/㏖, 3,045g/㏖, 3,050g/㏖, 3,055g/㏖, 3,060g/㏖, 3,065g/㏖, 3,070g/㏖, 3,075g/㏖, 3,080g/㏖, 3,085g/㏖, 3,090g/㏖, 3,095g/㏖, 3,100g/㏖, 3,105g/㏖, 3,110g/㏖, 3,115g/㏖, 3,120g/㏖, 3,125g/㏖, 3,130g/㏖, 3,135g/㏖, 3,140g/㏖, 3,145g/㏖, 3,150g/㏖, 3,155g/㏖, 3,160g/㏖, 3,165g/㏖, 3,170g/㏖, 3,175g/㏖, 3,180g/㏖, 3,185g/㏖, 3,190g/㏖, 3,195g/㏖, 3,200g/㏖, 3,205g/㏖, 3,210g/㏖, 3,215g/㏖, 3,220g/㏖, 3,225g/㏖, 3,230g/㏖, 3,235g/㏖, 3,240g/㏖, 3,245g/㏖, 3,250g/㏖, 3,255g/㏖, 3,260g/㏖, 3,265g/㏖, 3,270g/㏖, 3,275g/㏖, 3,280g/㏖, 3,285g/㏖, 3,290g/㏖, 3,295g/㏖, 3,300g/㏖, 3,305g/㏖, 3,310g/㏖, 3,315g/㏖, 3,320g/㏖, 3,325g/㏖, 3,330g/㏖, 3,335g/㏖, 3,340g/㏖, 3,345g/㏖, 3,350g/㏖, 3,355g/㏖, 3,360g/㏖, 3,365g/㏖, 3,370g/㏖, 3,375g/㏖, 3,380g/㏖, 3,385g/㏖, 3,390g/㏖, 3,395g/㏖, 3,400g/㏖, 3,405g/㏖, 3,410g/㏖, 3,415g/㏖, 3,420g/㏖, 3,425g/㏖, 3,430g/㏖, 3,435g/㏖, 3,440g/㏖, 3,445g/㏖, 3,450g/㏖, 3,455g/㏖, 3,460g/㏖, 3,465g/㏖, 3,470g/㏖, 3,475g/㏖, 3,480g/㏖, 3,485g/㏖, 3,490g/㏖, 3,495g/㏖, 3,500g/㏖, 3,505g/㏖, 3,510g/㏖, 3,515g/㏖, 3,520g/㏖, 3,525g/㏖, 3,530g/㏖, 3,535g/㏖, 3,540g/㏖, 3,545g/㏖, 3,550g/㏖, 3,555g/㏖, 3,560g/㏖, 3,565g/㏖, 3,570g/㏖, 3,575g/㏖, 3,580g/㏖, 3,585g/㏖, 3,590g/㏖, 3,595g/㏖, 3,600g/㏖, 3,605g/㏖, 3,610g/㏖, 3,615g/㏖, 3,620g/㏖, 3,625g/㏖, 3,630g/㏖, 3,635g/㏖, 3,640g/㏖, 3,645g/㏖, 3,650g/㏖, 3,655g/㏖, 3,660g/㏖, 3,665g/㏖, 3,670g/㏖, 3,675g/㏖, 3,680g/㏖, 3,685g/㏖, 3,690g/㏖, 3,695g/㏖, 3,700g/㏖, 3,705g/㏖, 3,710g/㏖, 3,715g/㏖, 3,720g/㏖, 3,725g/㏖, 3,730g/㏖, 3,735g/㏖, 3,740g/㏖, 3,745g/㏖, 3,750g/㏖, 3,755g/㏖, 3,760g/㏖, 3,765g/㏖, 3,770g/㏖, 3,775g/㏖, 3,780g/㏖, 3,785g/㏖, 3,790g/㏖, 3,795g/㏖, 3,800g/㏖, 3,805g/㏖, 3,810g/㏖, 3,815g/㏖, 3,820g/㏖, 3,825g/㏖, 3,830g/㏖, 3,835g/㏖, 3,840g/㏖, 3,845g/㏖, 3,850g/㏖, 3,855g/㏖, 3,860g/㏖, 3,865g/㏖, 3,870g/㏖, 3,875g/㏖, 3,880g/㏖, 3,885g/㏖, 3,890g/㏖, 3,895g/㏖, 3,900g/㏖, 3,905g/㏖, 3,910g/㏖, 3,915g/㏖, 3,920g/㏖, 3,925g/㏖, 3,930g/㏖, 3,935g/㏖, 3,940g/㏖, 3,945g/㏖, 3,950g/㏖, 3,955g/㏖, 3,960g/㏖, 3,965g/㏖, 3,970g/㏖, 3,975g/㏖, 3,980g/㏖, 3,985g/㏖, 3,990g/㏖, 3,995g/㏖ 또는 4,000g/㏖)의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 2,750g/㏖ 내지 약 4,000g/㏖(예를 들어, 약 2,750g/㏖, 2,755g/㏖, 2,760g/㏖, 2,765g/㏖, 2,770g/㏖, 2,775g/㏖, 2,780g/㏖, 2,785g/㏖, 2,790g/㏖, 2,795g/㏖, 2,800g/㏖, 2,805g/㏖, 2,810g/㏖, 2,815g/㏖, 2,820g/㏖, 2,825g/㏖, 2,830g/㏖, 2,835g/㏖, 2,840g/㏖, 2,845g/㏖, 2,850g/㏖, 2,855g/㏖, 2,860g/㏖, 2,865g/㏖, 2,870g/㏖, 2,875g/㏖, 2,880g/㏖, 2,885g/㏖, 2,890g/㏖, 2,895g/㏖, 2,900g/㏖, 2,905g/㏖, 2,910g/㏖, 2,915g/㏖, 2,920g/㏖, 2,925g/㏖, 2,930g/㏖, 2,935g/㏖, 2,940g/㏖, 2,945g/㏖, 2,950g/㏖, 2,955g/㏖, 2,960g/㏖, 2,965g/㏖, 2,970g/㏖, 2,975g/㏖, 2,980g/㏖, 2,985g/㏖, 2,990g/㏖, 2,995g/㏖, 3,000g/㏖, 3,005g/㏖, 3,010g/㏖, 3,015g/㏖, 3,020g/㏖, 3,025g/㏖, 3,030g/㏖, 3,035g/㏖, 3,040g/㏖, 3,045g/㏖, 3,050g/㏖, 3,055g/㏖, 3,060g/㏖, 3,065g/㏖, 3,070g/㏖, 3,075g/㏖, 3,080g/㏖, 3,085g/㏖, 3,090g/㏖, 3,095g/㏖, 3,100g/㏖, 3,105g/㏖, 3,110g/㏖, 3,115g/㏖, 3,120g/㏖, 3,125g/㏖, 3,130g/㏖, 3,135g/㏖, 3,140g/㏖, 3,145g/㏖, 3,150g/㏖, 3,155g/㏖, 3,160g/㏖, 3,165g/㏖, 3,170g/㏖, 3,175g/㏖, 3,180g/㏖, 3,185g/㏖, 3,190g/㏖, 3,195g/㏖, 3,200g/㏖, 3,205g/㏖, 3,210g/㏖, 3,215g/㏖, 3,220g/㏖, 3,225g/㏖, 3,230g/㏖, 3,235g/㏖, 3,240g/㏖, 3,245g/㏖, 3,250g/㏖, 3,255g/㏖, 3,260g/㏖, 3,265g/㏖, 3,270g/㏖, 3,275g/㏖, 3,280g/㏖, 3,285g/㏖, 3,290g/㏖, 3,295g/㏖, 3,300g/㏖, 3,305g/㏖, 3,310g/㏖, 3,315g/㏖, 3,320g/㏖, 3,325g/㏖, 3,330g/㏖, 3,335g/㏖, 3,340g/㏖, 3,345g/㏖, 3,350g/㏖, 3,355g/㏖, 3,360g/㏖, 3,365g/㏖, 3,370g/㏖, 3,375g/㏖, 3,380g/㏖, 3,385g/㏖, 3,390g/㏖, 3,395g/㏖, 3,400g/㏖, 3,405g/㏖, 3,410g/㏖, 3,415g/㏖, 3,420g/㏖, 3,425g/㏖, 3,430g/㏖, 3,435g/㏖, 3,440g/㏖, 3,445g/㏖, 3,450g/㏖, 3,455g/㏖, 3,460g/㏖, 3,465g/㏖, 3,470g/㏖, 3,475g/㏖, 3,480g/㏖, 3,485g/㏖, 3,490g/㏖, 3,495g/㏖, 3,500g/㏖, 3,505g/㏖, 3,510g/㏖, 3,515g/㏖, 3,520g/㏖, 3,525g/㏖, 3,530g/㏖, 3,535g/㏖, 3,540g/㏖, 3,545g/㏖, 3,550g/㏖, 3,555g/㏖, 3,560g/㏖, 3,565g/㏖, 3,570g/㏖, 3,575g/㏖, 3,580g/㏖, 3,585g/㏖, 3,590g/㏖, 3,595g/㏖, 3,600g/㏖, 3,605g/㏖, 3,610g/㏖, 3,615g/㏖, 3,620g/㏖, 3,625g/㏖, 3,630g/㏖, 3,635g/㏖, 3,640g/㏖, 3,645g/㏖, 3,650g/㏖, 3,655g/㏖, 3,660g/㏖, 3,665g/㏖, 3,670g/㏖, 3,675g/㏖, 3,680g/㏖, 3,685g/㏖, 3,690g/㏖, 3,695g/㏖, 3,700g/㏖, 3,705g/㏖, 3,710g/㏖, 3,715g/㏖, 3,720g/㏖, 3,725g/㏖, 3,730g/㏖, 3,735g/㏖, 3,740g/㏖, 3,745g/㏖, 3,750g/㏖, 3,755g/㏖, 3,760g/㏖, 3,765g/㏖, 3,770g/㏖, 3,775g/㏖, 3,780g/㏖, 3,785g/㏖, 3,790g/㏖, 3,795g/㏖, 3,800g/㏖, 3,805g/㏖, 3,810g/㏖, 3,815g/㏖, 3,820g/㏖, 3,825g/㏖, 3,830g/㏖, 3,835g/㏖, 3,840g/㏖, 3,845g/㏖, 3,850g/㏖, 3,855g/㏖, 3,860g/㏖, 3,865g/㏖, 3,870g/㏖, 3,875g/㏖, 3,880g/㏖, 3,885g/㏖, 3,890g/㏖, 3,895g/㏖, 3,900g/㏖, 3,905g/㏖, 3,910g/㏖, 3,915g/㏖, 3,920g/㏖, 3,925g/㏖, 3,930g/㏖, 3,935g/㏖, 3,940g/㏖, 3,945g/㏖, 3,950g/㏖, 3,955g/㏖, 3,960g/㏖, 3,965g/㏖, 3,970g/㏖, 3,975g/㏖, 3,980g/㏖, 3,985g/㏖, 3,990g/㏖, 3,995g/㏖ 또는 4,000g/㏖)의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 3,250g/㏖ 내지 약 4,000g/㏖(예를 들어, 약 3,250g/㏖, 3,255g/㏖, 3,260g/㏖, 3,265g/㏖, 3,270g/㏖, 3,275g/㏖, 3,280g/㏖, 3,285g/㏖, 3,290g/㏖, 3,295g/㏖, 3,300g/㏖, 3,305g/㏖, 3,310g/㏖, 3,315g/㏖, 3,320g/㏖, 3,325g/㏖, 3,330g/㏖, 3,335g/㏖, 3,340g/㏖, 3,345g/㏖, 3,350g/㏖, 3,355g/㏖, 3,360g/㏖, 3,365g/㏖, 3,370g/㏖, 3,375g/㏖, 3,380g/㏖, 3,385g/㏖, 3,390g/㏖, 3,395g/㏖, 3,400g/㏖, 3,405g/㏖, 3,410g/㏖, 3,415g/㏖, 3,420g/㏖, 3,425g/㏖, 3,430g/㏖, 3,435g/㏖, 3,440g/㏖, 3,445g/㏖, 3,450g/㏖, 3,455g/㏖, 3,460g/㏖, 3,465g/㏖, 3,470g/㏖, 3,475g/㏖, 3,480g/㏖, 3,485g/㏖, 3,490g/㏖, 3,495g/㏖, 3,500g/㏖, 3,505g/㏖, 3,510g/㏖, 3,515g/㏖, 3,520g/㏖, 3,525g/㏖, 3,530g/㏖, 3,535g/㏖, 3,540g/㏖, 3,545g/㏖, 3,550g/㏖, 3,555g/㏖, 3,560g/㏖, 3,565g/㏖, 3,570g/㏖, 3,575g/㏖, 3,580g/㏖, 3,585g/㏖, 3,590g/㏖, 3,595g/㏖, 3,600g/㏖, 3,605g/㏖, 3,610g/㏖, 3,615g/㏖, 3,620g/㏖, 3,625g/㏖, 3,630g/㏖, 3,635g/㏖, 3,640g/㏖, 3,645g/㏖, 3,650g/㏖, 3,655g/㏖, 3,660g/㏖, 3,665g/㏖, 3,670g/㏖, 3,675g/㏖, 3,680g/㏖, 3,685g/㏖, 3,690g/㏖, 3,695g/㏖, 3,700g/㏖, 3,705g/㏖, 3,710g/㏖, 3,715g/㏖, 3,720g/㏖, 3,725g/㏖, 3,730g/㏖, 3,735g/㏖, 3,740g/㏖, 3,745g/㏖, 3,750g/㏖, 3,755g/㏖, 3,760g/㏖, 3,765g/㏖, 3,770g/㏖, 3,775g/㏖, 3,780g/㏖, 3,785g/㏖, 3,790g/㏖, 3,795g/㏖, 3,800g/㏖, 3,805g/㏖, 3,810g/㏖, 3,815g/㏖, 3,820g/㏖, 3,825g/㏖, 3,830g/㏖, 3,835g/㏖, 3,840g/㏖, 3,845g/㏖, 3,850g/㏖, 3,855g/㏖, 3,860g/㏖, 3,865g/㏖, 3,870g/㏖, 3,875g/㏖, 3,880g/㏖, 3,885g/㏖, 3,890g/㏖, 3,895g/㏖, 3,900g/㏖, 3,905g/㏖, 3,910g/㏖, 3,915g/㏖, 3,920g/㏖, 3,925g/㏖, 3,930g/㏖, 3,935g/㏖, 3,940g/㏖, 3,945g/㏖, 3,950g/㏖, 3,955g/㏖, 3,960g/㏖, 3,965g/㏖, 3,970g/㏖, 3,975g/㏖, 3,980g/㏖, 3,985g/㏖, 3,990g/㏖, 3,995g/㏖ 또는 4,000g/㏖)의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 3,625g/㏖ 내지 약 4,000g/㏖(예를 들어, 약 3,625g/㏖, 3,630g/㏖, 3,635g/㏖, 3,640g/㏖, 3,645g/㏖, 3,650g/㏖, 3,655g/㏖, 3,660g/㏖, 3,665g/㏖, 3,670g/㏖, 3,675g/㏖, 3,680g/㏖, 3,685g/㏖, 3,690g/㏖, 3,695g/㏖, 3,700g/㏖, 3,705g/㏖, 3,710g/㏖, 3,715g/㏖, 3,720g/㏖, 3,725g/㏖, 3,730g/㏖, 3,735g/㏖, 3,740g/㏖, 3,745g/㏖, 3,750g/㏖, 3,755g/㏖, 3,760g/㏖, 3,765g/㏖, 3,770g/㏖, 3,775g/㏖, 3,780g/㏖, 3,785g/㏖, 3,790g/㏖, 3,795g/㏖, 3,800g/㏖, 3,805g/㏖, 3,810g/㏖, 3,815g/㏖, 3,820g/㏖, 3,825g/㏖, 3,830g/㏖, 3,835g/㏖, 3,840g/㏖, 3,845g/㏖, 3,850g/㏖, 3,855g/㏖, 3,860g/㏖, 3,865g/㏖, 3,870g/㏖, 3,875g/㏖, 3,880g/㏖, 3,885g/㏖, 3,890g/㏖, 3,895g/㏖, 3,900g/㏖, 3,905g/㏖, 3,910g/㏖, 3,915g/㏖, 3,920g/㏖, 3,925g/㏖, 3,930g/㏖, 3,935g/㏖, 3,940g/㏖, 3,945g/㏖, 3,950g/㏖, 3,955g/㏖, 3,960g/㏖, 3,965g/㏖, 3,970g/㏖, 3,975g/㏖, 3,980g/㏖, 3,985g/㏖, 3,990g/㏖, 3,995g/㏖ 또는 4,000g/㏖)의 폴리옥시프로필렌 서브유닛의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 질량 기준으로 40% 초과(예를 들어, 약 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 질량 기준으로 50% 초과(예를 들어, 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 질량 기준으로 60% 초과(예를 들어, 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 질량 기준으로 70% 초과(예를 들어, 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 40% 내지 약 90%(예를 들어, 약 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90%)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 50% 내지 약 85%(예를 들어, 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85%)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 60% 내지 약 80%(예를 들어, 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%)의 평균 산화에틸렌 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 10,000g/㏖ 초과(예를 들어, 약 10,100g/㏖, 10,200g/㏖, 10,300g/㏖, 10,400g/㏖, 10,500g/㏖, 10,600g/㏖, 10,700g/㏖, 10,800g/㏖, 10,900g/㏖, 11,000g/㏖, 11,100g/㏖, 11,200g/㏖, 11,300g/㏖, 11,400g/㏖, 11,500g/㏖, 11,600g/㏖, 11,700g/㏖, 11,800g/㏖, 11,900g/㏖, 12,000g/㏖, 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 11,000g/㏖ 초과(예를 들어, 약 11,100g/㏖, 11,200g/㏖, 11,300g/㏖, 11,400g/㏖, 11,500g/㏖, 11,600g/㏖, 11,700g/㏖, 11,800g/㏖, 11,900g/㏖, 12,000g/㏖, 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 12,000g/㏖ 초과(예를 들어, 약 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 12,500g/㏖ 초과(예를 들어, 약 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 10,000g/㏖ 내지 약 15,000g/㏖(예를 들어, 약 10,000g/㏖, 10,100g/㏖, 10,200g/㏖, 10,300g/㏖, 10,400g/㏖, 10,500g/㏖, 10,600g/㏖, 10,700g/㏖, 10,800g/㏖, 10,900g/㏖, 11,000g/㏖, 11,100g/㏖, 11,200g/㏖, 11,300g/㏖, 11,400g/㏖, 11,500g/㏖, 11,600g/㏖, 11,700g/㏖, 11,800g/㏖, 11,900g/㏖, 12,000g/㏖, 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 11,000g/㏖ 내지 약 15,000g/㏖(예를 들어, 약 11,000g/㏖, 11,100g/㏖, 11,200g/㏖, 11,300g/㏖, 11,400g/㏖, 11,500g/㏖, 11,600g/㏖, 11,700g/㏖, 11,800g/㏖, 11,900g/㏖, 12,000g/㏖, 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 11,500g/㏖ 내지 약 15,000g/㏖(예를 들어, 약 11,500g/㏖, 11,600g/㏖, 11,700g/㏖, 11,800g/㏖, 11,900g/㏖, 12,000g/㏖, 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 12,000g/㏖ 내지 약 15,000g/㏖(예를 들어, 약 12,000g/㏖, 12,100g/㏖, 12,200g/㏖, 12,300g/㏖, 12,400g/㏖, 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 약 12,500g/㏖ 내지 약 15,000g/㏖(예를 들어, 약 12,500g/㏖, 12,600g/㏖, 12,700g/㏖, 12,800g/㏖, 12,900g/㏖, 13,000g/㏖, 13,100g/㏖, 13,200g/㏖, 13,300g/㏖, 13,400g/㏖, 13,500g/㏖, 13,600g/㏖, 13,700g/㏖, 13,800g/㏖, 13,900g/㏖, 14,000g/㏖, 14,100g/㏖, 14,200g/㏖, 14,300g/㏖, 14,400g/㏖, 14,500g/㏖, 14,600g/㏖, 14,700g/㏖, 14,800g/㏖, 14,900g/㏖ 또는 15,000g/㏖)의 평균 몰질량을 갖는다.
폴록사머 P288, P335, P338 및 P407
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 폴록사머는 대략의 화학식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH를 갖는 "폴록사머 288"(당업계에서 "P 288" 및 폴록사머 "F98"로도 지칭됨)을 포함하되, x와 y의 합계는 약 236.36이고, z는 약 44.83이다. P288의 평균 분자량은 약 13,000g/㏖이다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 P288의 변이체, 예컨대, 식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH의 변이체이되, x와 y의 합계는 약 220 내지 약 250이고, z는 약 40 내지 약 50이다. 일부 실시형태에서, 폴록사머의 평균 분자량은 약 12,000g/㏖ 내지 약 14,000g/㏖이다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 폴록사머는 대략의 화학식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH를 갖는 "폴록사머 335"(당업계에서 "P 335" 및 폴록사머 "P105"로도 지칭됨)를 더 포함하되, x와 y의 합계는 약 73.86이고, z는 약 56.03이다. P335의 평균 분자량은 약 6,500g/㏖이다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 P335의 변이체, 예컨대, 식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH의 변이체이되, x와 y의 합계는 약 60 내지 약 80이고, z는 약 50 내지 약 60이다. 일부 실시형태에서, 폴록사머의 평균 분자량은 약 6,000g/㏖ 내지 약 7,000g/㏖이다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 폴록사머는 대략의 화학식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH를 갖는 "폴록사머 338"(당업계에서 "P 338" 및 폴록사머 "F108"로도 지칭됨)를 더 포함하되, x와 y의 합계는 약 265.45이고, z는 약 50.34이다. P335의 평균 분자량은 약 14,600g/㏖이다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 P338의 변이체, 예컨대, 식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH의 변이체이되, x와 y의 합계는 약 260 내지 약 270이고, z는 약 45 내지 약 55이다. 일부 실시형태에서, 폴록사머의 평균 분자량은 약 14,000g/㏖ 내지 약 15,000g/㏖이다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 폴록사머는 대략의 화학식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH를 갖는 "폴록사머 407"(당업계에서 "P 407" 및 폴록사머 "F127"로도 지칭됨)를 더 포함하되, x와 y의 합계는 약 200.45이고, z는 약 65.17이다. P335의 평균 분자량은 약 12,600g/㏖이다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 P407의 변이체, 예컨대, 식 HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH의 변이체이되, x와 y의 합계는 약 190 내지 약 210이고, z는 약 60 내지 약 70이다. 일부 실시형태에서, 폴록사머의 평균 분자량은 약 12,000g/㏖ 내지 약 13,000g/㏖이다.
명확하게 하기 위해, 용어 "평균 몰질량" 및 "평균 분자량"은 동일한 양을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴록사머의 평균 몰질량, 산화에틸렌 함량 및 산화프로필렌 함량은 개시내용이 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 문헌[Alexandridis and Hatton, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 96:1-46 (1995)]에 개시된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 키나제 C 조절제를 사용하는 형질도입
PKC 활성 및/또는 발현을 감소시키기 위해 다양한 제제가 사용될 수 있다. 메커니즘에 의해 제한되는 일 없이, 이러한 제제는 Akt 신호 전달을 자극하고/하거나 코피린을 탈인산화된 상태로 유지하여, 액틴 탈분극화를 촉진시킴으로써, 바이러스 형질도입을 증가시킬 수 있다. 이런 액틴 탈분극화 사건은 표적 세포의 핵 내로의 바이러스 벡터의 유입을 방해하는 물리적 장벽을 제거하는 역할을 할 수 있다.
스타우로스포린 및 이의 변이체
일부 실시형태에서, PKC의 활성 및/또는 발현을 감소시키는 물질은 PKC 저해제이다. PKC 저해제는 스타우로스포린 또는 이의 변이체일 수 있다. 예를 들어, PKC 저해제는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염으로 표시될 수 있다
식 중, R1은 H, OH, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아실옥시, 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 알킬아미노, 선택적으로 치환된 아미도, 할로겐, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알켄일, 선택적으로 치환된 C2-6 알킨일, 선택적으로 치환된 아실, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐, 옥소, 티오카보닐, 선택적으로 치환된 카복시 또는 유레이도이고;
R2는 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알켄일, 선택적으로 치환된 C2-6 알킨일 또는 선택적으로 치환된 아실이며;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로, H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알켄일 또는 선택적으로 치환된 C2-6 알킨일, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 아릴, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로아릴, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 사이클로알킬 또는 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로사이클로알킬이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 결합된 원자와 함께 연결되어 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
Rc는 O, NRd 또는 S이며;
Rd는 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-6 알켄일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 알킨일이고;
각각 X는 독립적으로, 할로겐, 선택적으로 치환된 할로아킬, 사이아노, 선택적으로 치환된 아미노, 하이드록실, 티올, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 아실옥시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐, 선택적으로 치환된 카복시, 유레이도, 선택적으로 치환된 알킬 설폰일, 선택적으로 치환된 아릴 설폰일, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 설폰일, 선택적으로 치환된 사이클로알킬 설폰일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 설폰일, 선택적으로 치환된 알킬 설판일, 선택적으로 치환된 아릴 설판일, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 설판일, 선택적으로 치환된 사이클로알킬 설판일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 설판일, 선택적으로 치환된 알킬 설핀일, 선택적으로 치환된 아릴 설핀일, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 설핀일, 선택적으로 치환된 사이클로알킬 설핀일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 설핀일, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 아릴, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로아릴, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 사이클로알킬 또는 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로사이클로알킬이며;
각각의 Y는 독립적으로, 할로겐, 선택적으로 치환된 할로아킬, 사이아노, 선택적으로 치환된 아미노, 하이드록실, 티올, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 아실옥시, 선택적으로 치환된 알콕시카보닐, 선택적으로 치환된 카복시, 유레이도, 선택적으로 치환된 알킬 설폰일, 선택적으로 치환된 아릴 설폰일, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 설폰일, 선택적으로 치환된 사이클로알킬 설폰일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 설폰일, 선택적으로 치환된 알킬 설판일, 선택적으로 치환된 아릴 설판일, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 설판일, 선택적으로 치환된 사이클로알킬 설판일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 설판일, 선택적으로 치환된 알킬 설핀일, 선택적으로 치환된 아릴 설핀일, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 설핀일, 선택적으로 치환된 사이클로알킬 설핀일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬 설핀일, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 아릴, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로아릴, 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 사이클로알킬 또는 선택적으로 치환 및 선택적으로 축합된 헤테로사이클로알킬이고;
는 선택적으로 존재하는 결합을 나타내며;
n은 0 내지 4의 정수이고; 그리고
m은 0 내지 4의 정수이다.
간섭 RNA
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 PKC 조절제는 PKC 유전자 발현을 감소시키는, 간섭 RNA 분자, 예컨대 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및/또는 마이크로 RNA(miRNA)를 포함한다. 간섭 RNA 분자를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, WO 2004/044136 및 미국 특허 제9,150,605호에 상세하게 기재되어 있고, 이의 개시내용 각각은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
HDAC 저해제를 사용하는 형질도입
다양한 제제는 바이러스 형질도입 동안 핵산 카세트의 발현을 증가시키기 위해 히스톤 데아세틸라제를 저해하는 데 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 바이러스 벡터로부터의 감소된 핵산 카세트 발현은 히스톤 데아세틸레이트에 의해 수행된 벡터 게놈의 후생적 침묵에 의해 야기될 수 있다. 하이드록삼산은 이러한 효소의 활성 부위 내에서 양이온성 아연에 결합하는 하이드록사메이트 작용기에 의해 이러한 효소를 저해하는 HDAC 저해제의 특히 강한 부류를 나타낸다. 예시적인 저해제는 트리코스타틴 A뿐만 아니라 보리노스탓(Vorinostat)(개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Marks et al., Nature Biotechnology 25, 84 to 90 (2007); Stenger, Community Oncology 4, 384-386 (2007)]에 기재된 N-하이드록시-N'-페닐-옥탄다이아마이드)을 포함한다. 다른 HDAC 저해제는 개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Drugs of the Future 32(4): 315-322 (2007)]에 기재된 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함한다.
히스톤 데아세틸라제의 하이드록삼산 저해제의 추가적인 예는 아래에 나타내며, 개시내용이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Bertrand, European Journal of Medicinal Chemistry 45:2095-2116 (2010)]에 기재된, 화합물을 포함한다.
발프론산(문헌[Gottlicher, et al., EMBO J. 20(24): 6969-6978(2001)] 및 문헌[Balasubramanian et al., Cancer Letters 280: 211-221 (2009))]에 기재된 모세티노스탓(N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸]벤즈아마이드를 포함하는, 하이드록사메이트 치환체를 포함하지 않는 다른 HDAC 저해제가 또한 개발되었고, 이들의 개시내용 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 하이드록사메이트와 별개의 화학적 작용기를 이용하는 다른 소분자 저해제는 문헌[Bertrand, European Journal of Medicinal Chemistry 45:2095-2116 (2010)]에 기재된 것을 포함하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 의해 유용한 히스톤 아세틸화의 화학적 조절제의 추가적인 예는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, Sirt1, Sirt2 및/또는 HAT의 조절제, 예컨대, 뷰티릴하이드록삼산, M344, LAQ824 (Dacinostat), AR-42, 벨리노스탓(PXD101), CUDC-101, 스크립타이드(Scriptaid), 페닐뷰티르산나트륨, 타스퀴니모드(Tasquinimod), 퀴시노스탓(Quisinostat)(JNJ-26481585), 프라시노스탓(Pracinostat)(SB939), CUDC-907, 엔티노스탓(Entinostat)(MS-275), 모세티노스탓(Mocetinostat)(MGCD0103), 투바스타틴 A(Tubastatin A) HCl, PCI-34051, 드록시노스탓(Droxinostat), PCI-24781(아벡시노스탓(Abexinostat)), RGFP966, 로실리노스탓(Rocilinostat)(ACY-1215), CI994 (타세디날린(Tacedinaline)), 투바신(Tubacin), RG2833(RGFP109), 레스미노스탓(Resminostat), 투바스타틴 A, BRD73954, BG45, 4SC-202, CAY10603, LMK-235, 넥스투라스탓 A(Nexturastat A), TMP269, HPOB, 캄비놀 및 아나카르드산이다.
일부 특정 실시형태에서, HDAC 저해제는 스크립타이드이다.
사이클로스포린을 사용하는 형질도입
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 치료적 세포는 사이클로스포린, 예컨대, 사이클로스포린 A(CsA) 또는 사이클로스포린 H(CsH)의 존재 하에 세포를 형질도입함으로써 생성된다.
일부 실시형태에서, 사이클로스포린의 농도는, 세포와 접촉될 때, 약 1μM 내지 약 10μM(예를 들어, 약 1μM, 1.1μM, 1.2μM, 1.3μM, 1.4μM, 1.5μM, 1.6μM, 1.7μM, 1.8μM, 1.9μM, 2μM, 2.1μM, 2.2μM, 2.3μM, 2.4μM, 2.5μM, 2.6μM, 2.7μM, 2.8μM, 2.9μM, 3μM, 3.1μM, 3.2μM, 3.3μM, 3.4μM, 3.5μM, 3.6μM, 3.7μM, 3.8μM, 3.9μM, 4μM, 4.1μM, 4.2μM, 4.3μM, 4.4μM, 4.5μM, 4.6μM, 4.7μM, 4.8μM, 4.9μM, 5μM, 5.1μM, 5.2μM, 5.3μM, 5.4μM, 5.5μM, 5.6μM, 5.7μM, 5.8μM, 5.9μM, 6μM, 6.1μM, 6.2μM, 6.3μM, 6.4μM, 6.5μM, 6.6μM, 6.7μM, 6.8μM, 6.9μM, 7μM, 7.1μM, 7.2μM, 7.3μM, 7.4μM, 7.5μM, 7.6μM, 7.7μM, 7.8μM, 7.9μM, 8μM, 8.1μM, 8.2μM, 8.3μM, 8.4μM, 8.5μM, 8.6μM, 8.7μM, 8.8μM, 8.9μM, 9μM, 9.1μM, 9.2μM, 9.3μM, 9.4μM, 9.5μM, 9.6μM, 9.7μM, 9.8μM, 9.9μM 또는 10μM)이다.
프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체를 사용하는 형질도입
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 치료적 세포는 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체의 존재 하에 세포를 형질도입함으로써 생성된다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 WO 2007/112084 또는 WO 2010/108028에 기재된 화합물과 같은 소분자이고, 이들 각각의 개시내용은 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달 활성체에 속하는 경우 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 작은 유기 분자, 프로스타글란딘, Wnt 경로 작용제, cAMP/PI3K/AKT 경로 작용제, Ca2+ 제2 전령 경로 작용제, 산화질소(NO)/안지오텐신 신호전달 작용제 또는 프로스타글란딘 신호전달 경로를 자극하는 것으로 알려진 다른 화합물, 예컨대, 메베베린(Mebeverine), 플루란드레놀라이드, 아테놀롤, 핀돌롤, 가복사돌, 키뉴렌산, 하이드랄라진, 티아벤다졸, 비쿠클린(Bicuclline), 베사미콜, 페루보사이드(Peruvoside), 이미프라민, 클로르프로파마이드, 1,5-펜탐에틸렌테트라졸, 4-아미노피리딘, 다이아족사이드, 벤포티아민, 12-메톡시도데센산, N-폼일-Met-Leu-Phe, 갈라민, IAA 94, 클로로트라이아니센 및 또는 임의의 이들 화합물의 유도체로부터 선택된 화합물과 같은 소분자이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 전형적으로 프로스타글란딘 E 수용체와 관련된 하류의 신호전달 경로 중 하나 이상의 활성화 또는 증가시키기 위해 프로스타글란딘 E 수용체에 결합하고/하거나 상호작용하는 자연발생적 또는 합성 화학 분자 또는 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 프로스타글란딘(PG) A2(PGA2), PGB2, PGD2, PGE1(알프로스타딜), PGE2, PGF2, PGI2(에포프로스텐올), PGH2, PGJ2, 및 이들의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 PGE2 또는 dmPGE2이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 15d-PGJ2, 델타l2-PGJ2, 2-하이드록시헵타데카트라이엔산(HHT), 트롬복산(TXA2 및 TXB2), PGI2 유사체, 예를 들어, 일로프로스트 및 트레프로스티닐, PGF2 유사체, 예를 들어, 트라보프로스트, 카보프로스트 트로메타민, 타플루프로스트, 라타노프로스트, 비마토프로스트, 우노프로스톤 아이소프로필, 클로프로스테놀, 오에스트로판(Oestrophan) 및 수퍼판(Superphan), PGE1 유사체, 예를 들어, 11-데옥시 PGE1, 미소프로스톨 및 부타프로스트, 및 코레이(Corey) 알코올-A([3aa,4a,5 ,6aa]-(-)-[헥사하이드로-4-(하이드록시메틸)-2-옥소-2H-사이클로펜타/b/퓨란-5-일][1,1'-바이페닐]-4-카복실레이트), 코레이 알코올-B(2H-사이클로펜타[b]퓨란-2-온,5-(벤조일옥시)헥사하이드로-4-(하이드록시메틸)[3aR-(3aa,4a,5 ,6aa)]) 및 코레이 다이올((3aR,4S,5R,6aS)-헥사하이드로-5-하이드록시-4-(하이드록시메틸)-2H-사이클로펜타[b]퓨란-2-온)이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 프로스타글란딘 E 수용체 리간드, 예컨대, 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또는 이들의 유사체 또는 유도체이다. 프로스타글란딘은 일반적으로 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 바와 같은 5-탄소 고리를 포함하는 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방산으로부터 유도된 호르몬-유사 분자를 지칭한다. PGE2 "유사체" 또는 "유도체"의 예시적인 예는 16,16-다이메틸 PGE2, 16,16-다이메틸 PGE2 p-(p-아세트아미도벤즈아미도) 페닐 에스터, 11-데옥시-16,16-다이메틸 PGE2, 9-데옥시-9-메틸렌-16,16-다이메틸 PGE2, 9-데옥시-9-메틸렌 PGE2, 9-케토 플루프로스텐올, 5-트랜스 PGE2, 17-페닐-오메가-트리너 PGE2, PGE2 세린올 아마이드, PGE2 메틸 에스터, 16-페닐 테트라노르 PGE2, 15(S)-15-메틸 PGE2, 15(R)-15-메틸 PGE2, 8-아이소-15-케토 PGE2, 8-아이소 PGE2 아이소프로필 에스터, 20-하이드록시 PGE2, 노클로프로스트, 설프로스톤, 부타프로스트, 15-케토 PGE2 및 19(R) 하이드록시 PGE2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 9-위치에서 할로겐으로 치환된 PGE2와 유사한 구조를 갖는 프로스타글란딘 유사체 또는 유도체(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 WO 2001/12596)뿐만 아니라 2-데카복시-2-포스피니코 프로스타글란딘 유도체, 예컨대, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 US 2006/0247214에 기재된 것)이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 비-PGE2-기반 리간드이다. 일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 CAY10399, ONO_8815Ly, ONO-AE1-259 또는 CP-533,536이다. 비-PGE2-기반 EP2 작용제의 추가 예는 제제의 개시내용에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2007/071456에 개시된 카바졸 및 플루오렌을 포함한다. 비-PGE2-기반 EP3 작용제의 예시적인 예는 AE5-599, MB28767, GR 63799X, ONO- NT012 및 ONO-AE-248을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비-PGE2-기반 EP4 작용제의 예시적인 예는 ONO-4819, APS-999 Na, AH23848 및 ONO-AE 1-329를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비-PGE2-기반 EP4 작용제의 추가적인 예는 WO 2000/038663; 미국 특허 제6,747,037호; 및 미국 특허 제6,610,719호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 이러한 작용제의 개시내용에 대해 참조로 원용된다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 Wnt 작용제이다. Wnt 작용제의 예시적인 예는 Wnt 폴리펩타이드 및 글리코겐 합성 키나제 3(GSK3) 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로스타글란딘 EP 수용체 신호전달 경로를 자극하는 화합물로서 사용하는 데 적합한 Wnt 폴리펩타이드의 예시적인 예는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt1Oa, Wnt1Ob, Wnt11, Wnt14, Wnt15, 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로스타글란딘 EP 수용체 신호전달 경로를 자극하는 제제로서 사용하는 데 적합한 GSK3 저해제는 GSK3a 또는 GSK3에 결합하고 이의 활성을 감소시킨다. GSK3 저해제의 예시적인 예는 미국 특허 제6,057,117호 및 제6,608,063호뿐만 아니라 US 2004/0092535 및 US 2004/0209878에 예시된 바와 같은 BIO(6- 브로모인디루빈-3'-옥심), LiCl, Li2CO3, 또는 기타 GSK-3 저해제, 및 ATP-경쟁적, 선택적 GSK-3 저해제 CHIR-911 및 CHIR-837(각각 CT-99021/CHIR-99021 및 CT-98023/CHIR-98023으로도 지칭됨)(Chiron Corporation(캘리포니아주 에머리빌 소재))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
CHIR-99021의 구조는 하기와 같다
또는 이의 염.
CHIR-98023의 구조는 하기와 같다
또는 이의 염.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포와 GSK3 저해제를 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 CHIR-99021 또는 CHIR-98023이다.
일부 실시형태에서, GSK3 저해제는 Li2CO3이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 cAMP/P13K/AKT 제2 전령 경로를 통해 신호전달을 증가시키는 제제, 예컨대, 다이뷰티릴 cAMP(DBcAMP), 포볼 에스터, 포스콜린, 스클라렐린(sclareline), 8-브로모-cAMP, 콜레라 독소(CTx), 아미노필린, 2,4-다이나이트로페놀(DNP), 노르에피네프린, 에피네프린, 아이소프로테레놀, 아이소뷰틸메틸잔틴(IBMX), 카페인, 테오필린(다이메틸잔틴), 도파민, 롤리프람, 일로프로스트, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩타이드(PACAP) 및 혈관작용 장 폴리펩타이드(VIP) 및 이러한 제제들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 Ca2+ 제2 전령 경로를 통해 신호전달을 증가시키는 제제, 예컨대, Bapta-AM, 펜딜린(Fendiline), 니카르디핀 및 이러한 제제들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제이다.
일부 실시형태에서, 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 NO/안지오텐신 신호전달을 통해 신호전달을 증가시키는 제제, 예컨대, L-Arg, 나이트로프루사이드나트륨, 바나듐산나트륨, 브라디키닌 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제이다.
폴리양이온성 중합체를 사용하는 형질도입
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 치료적 세포는 폴리양이온성 중합체의 존재 하에 세포를 형질도입함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, 폴리양이온성 중합체는 폴리브렌, 프로타민 설페이트, 폴리에틸렌이민 또는 폴리에틸렌 글리콜/폴리-L-라이신 블록 공중합체이다.
일부 실시형태에서, 폴리양이온성 중합체는 프로타민 설페이트이다.
일부 실시형태에서, 세포는 추가로 형질도입 절차 동안 확장제와 접촉된다. 세포는, 예를 들어, 조혈줄기세포일 수 있고, 확장제는 조혈줄기세포 확장제, 예컨대, 당업계에 알려져 있거나 본 명세서에 기재된 조혈줄기세포 확장제일 수 있다.
추가 형질도입 인핸서
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 형질도입 절차 동안, 세포는 mTOR 신호전달을 저해하는 제제와 추가로 접촉된다. mTOR 신호전달을 저해하는 제제는, 예를 들어, mTOR 신호전달의 억제자 중에서도 라파마이신일 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 추가 형질도입 인핸서는, 예를 들어, 타클로리무스 및 벡터퓨신(vectorfusin)을 포함한다.
스피노쿨레이션(Spinoculation)
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 형질도입을 위해 표적화된 세포는, 예를 들어, 원심분리에 의해 교반될 수 있는 한편, (예를 들어, 본 명세서에 기재된 1종 이상의 추가 제제와 조합된) 바이러스 벡터와 함께 배양된다. 이런 "스피노쿨레이션" 과정은, 예를 들어, 약 200×g 내지 약 2,000×g의 구심력으로 일어난다. 구심력은, 예를 들어, 약 300×g 내지 약 1,200×g(예를 들어, 약 300×g, 400×g, 500×g, 600×g, 700×g, 800×g, 900×g, 1,000×g, 1,100×g 또는 1,200×g 이상)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 약 10분 내지 약 3시간(예를 들어, 약 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 120분, 125분, 130분, 135분, 140분, 145분, 150분, 155분, 160분, 165분, 170분, 175분, 180분 이상) 동안 교반된다. 일부 실시형태에서, 세포는 실온, 예컨대, 약 25℃의 실온에서 교반된다.
스피노쿨레이션 단계를 수반하는 예시적인 형질도입 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Millington et al., PLoS One 4:e6461 (2009); Guo et al., Journal of Virology 85:9824-9833(2011); O'Doherty et al., Journal of Virology 74:10074-10080 (2000); 및 Federico et al., Lentiviral Vectors and Exosomes as Gene and Protein Delivery Tools, Methods in Molecular Biology 1448, Chapter 4 (2016)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
발현을 위한 바이러스 벡터
바이러스 게놈은 외인성 유전자를 포유류 세포에 효율적으로 전달하는 데 사용될 수 있는 벡터의 풍부한 공급원을 제공한다. 바이러스 게놈은 이러한 게놈 내에 포함된 폴리뉴클레오타이드가 일반화된 또는 전문화된 형질도입에 의해 포유류 세포의 핵 게놈에 전형적으로 혼입되기 때문에 유전자 전달을 위한 특히 유용한 벡터이다. 이러한 과정은 천연 바이러스 복제 주기의 부분으로서 일어나고, 유전자 통합을 유도하기 위해 단백질 또는 시약이 첨가되는 것을 필요로 하지 않는다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스(예를 들어, 레트로바이러스과 바이러스 벡터), 아데노바이러스(예를 들어, Ad5, Ad26, Ad34, Ad35 및 Ad48), 파보바이러스, 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 오쏘믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순포진 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바르 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아, 변형된 종두증 앙카라(MVA), 계두 및 카나리아 두창)이다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파보바바이러스, 헤파드나바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 인간 거품형성 바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈병 육종, 조류 C-type 바이러스, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, 종양레트로바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 알파레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 스푸마바이러스이다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Virology, Third Edition (Lippincott-Raven, Philadelphia, (1996))). 다른 예는 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 개코원숭이 내인성 바이러스, 깁본 유인원 백혈병 바이러스, 메이슨 화이저(Mason Pfizer) 원숭이 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 유인원 육종 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 렌티바이러스이다. 벡터의 다른 예는, 예를 들어, McVey 등(US 5,801,030)에 기재되어 있으며, 이의 교시는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
레트로바이러스 벡터
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 전달 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 한 유형은 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스의 서브세트인 렌티바이러스 벡터(LV)는 광범위한 분열 및 비분열 세포 유형을 높은 효율로 형질도입하여, 핵산 카세트의 안정적인, 장기간 발현을 부여한다. LV를 패키징 및 형질도입하기 위한 최적화 전략의 개요는 문헌[Delenda, The Journal of Gene Medicine 6: S125 (2004)]에 제공되며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
렌티바이러스-기반 유전자 전달 기법의 사용은 관심의 핵산 카세트가 수용되는 고도로 결실된 바이러스 게놈을 운반하는 재조합 렌티바이러스 입자의 시험관내 생산에 따른다. 특히, 재조합 렌티바이러스는, (1) 패키징 작제물, 즉, Rev(대안적으로 트랜스로 발현됨)와 함께 Gag-Pol 전구체를 발현시키는 벡터; (2) 일반적으로 이종성 특성의 외피 수용체를 발현시키는 벡터; 및 (3) 모든 오픈 리딩 프레임이 제거된 바이러스 cDNA로 이루어지지만, 발현될 서열이 삽입되는 복제, 이입(encapsidation) 및 발현에 필요한 서열을 유지하는 전달 벡터의, 허용성 세포주에서 트랜스 공동발현을 통해 회수된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 LV는 5'-긴 말단 반복부(LTR), HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위(SD), 델타-GAG 요소, Rev 반응 요소(RRE), 3'-스플라이스 부위(SA), 신장인자(EF) 1-알파 프로모터 및 3'-자기 비활성화 LTR(SIN-LTR) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 선택적으로 US 6,136,597에 기재된 바와 같이 중심 폴리퓨린관(cPPT) 및 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소(WPRE)를 포함하며, 이의 개시내용은 WPRE에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 렌티바이러스 벡터는, 예를 들어, 아래에 제공되는 바와 같이 포함될 수 있는 pHR' 골격을 추가로 포함할 수 있다.
문헌[Lu et al., Journal of Gene Medicine 6:963(2004)]에 기재된 렌티겐 LV는 DNA 분자를 발현시키고/시키거나 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 LV는 5'-긴 말단 반복부(LTR), HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위(SD), 델타-GAG 요소, Rev 반응 요소(RRE), 3'-스플라이스 부위(SA), 신장인자(EF) 1-알파 프로모터 및 3'-자기 비활성화 LTR(SIN-LTR)을 포함할 수 있다. 선택적으로 이러한 영역 중 하나 이상이 유사한 기능을 수행하는 다른 영역으로 치환된다는 것은 당업자에게 용이하게 분명하게 될 것이다.
인핸서 요소는 변형된 DNA 분자의 발현을 증가시키거나 렌티바이러스 통합 효율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 LV는 nef 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 LV는 벡터 통합을 향상시키는 cPPT 서열을 포함할 수 있다. cPPT는 (+)-가닥 DNA 합성의 제2 기점으로서 작용하고, 이의 천연 HIV 게놈의 중간에서 부분적 가닥 중복을 도입한다. 전달 벡터 골격에서 cPPT 서열의 도입은 핵 수송 및 표적 세포의 DNA에 통합된 게놈의 총량을 강하게 증가시킨다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 LV는 우드처크 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함할 수 있다. WPRE는 전사체의 핵 유출을 촉진시킴으로써 그리고/또는 발생기 전사체의 폴리아데닐화 효율을 증가시켜, 세포에서 mRNA의 총량을 증가시킴으로써, 전사 수준에서 작용한다. LV에 대한 WPRE의 첨가는 시험관내와 생체내 둘 다에서 여러 상이한 프로모터로부터의 핵산 카세트 발현 수준의 실질적인 개선을 초래한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 LV는 cPPT 서열과 WPRE 서열을 둘 다 포함할 수 있다. 벡터는 또한 단일 프로모터로부터의 다중 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 IRES 서열을 포함할 수 있다.
IRES 서열에 추가로, 다중 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 다른 요소가 유용하다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 벡터는 발현 하나 초과의 폴리펩타이드를 허용하는 다중 프로모터를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 벡터는 하나 초과의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 단백질 절단 부위를 포함할 수 있다. 하나 초과의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 단백질 절단 부위의 예는 문헌[Klump et al., Gene Ther.; 8:811 (2001), Osborn et al., Molecular Therapy 12:569 (2005), Szymczak and Vignali, Expert Opin Biol Ther. 5:627 (2005) 및 Szymczak et al., Nat Biotechnol. 22:589 (2004)]에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 하나 초과의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 단백질 절단 부위에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 장래에 확인되는 다중 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 다른 요소가 유용하며 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 벡터에서 이용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 용이하게 분명하게 될 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 벡터는 임상 등급 벡터일 수 있다.
생체외 형질감염 방법
포유류 세포에서의 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단백질의 치료적 유효량의 세포내 농도를 달성하는 데 사용될 수 있는 하나의 플랫폼은 (예를 들어, 포유류 세포의 핵 또는 미토콘드리아 게놈에 통합에 의해) 이러한 제제를 암호화하는 유전자의 안정한 발현을 통한다. 이러한 유전자는 상응하는 단백질의 1차 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 포유류 세포에 이러한 외인성 유전자를 도입하기 위해, 이러한 유전자가 벡터에 혼입될 수 있다. 벡터는 형질전환, 형질감염, 직접 흡수, 유전자총(projectile bombardment) 및 리포솜 내 벡터의 캡슐화에 의하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 세포의 형질감염 또는 형질전환의 적합한 방법의 예는 인산칼슘 침전, 전기천공법, 미량주사법, 감염, 리포펙션 및 직접 흡수이다. 이러한 방법은, 예를 들어, 문헌[Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor University Press, New York (2014)); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (2015))]에 더욱 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 개시내용의 치료 단백질을 암호화하는 유전자는 이러한 제제를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 세포막 인지질에 표적화함으로써 포유류 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 모든 세포막 인지질에 대한 친화도로 바이러스 단백질인 VSV-G 단백질에 벡터 분자를 연결함으로써 세포막의 세포외 표면 상의 인지질에 표적화될 수 있다. 이러한, 작제물은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
포유류 RNA 중합효소에 의한 본 개시내용의 하나 이상의 치료 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 인식 및 결합은 유전자 발현에 중요하다. 이렇게 해서, RNA 중합효소를 동원하고 전사 개시 부위에서 전사 복합체의 조립을 촉진시키는 전사인자에 대해 고친화도를 나타내는 폴리뉴클레오타이드 내에 서열 요소를 포함할 수 있다. 이러한 서열 요소는, 예를 들어, 포유류 프로모터를 포함하고, 이의 서열은 특정 전사 개시 인자 및 궁극적으로는 RNA 중합효소에 의해 인식 및 결합될 수 있다. 포유류 프로모터의 예는 문헌[Smith et al., Mol. Sys. Biol., 3:73, 온라인 공개]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일단 하나 이상의 치료 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 포유류 세포의 핵 DNA에 혼입되었다면, 이런 폴리뉴클레오타이드의 전사는 당업계에 알려진 방법에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 발현은 외부 화학 시약, 예컨대, 포유류 프로모터에 대한 전사인자 및/또는 RNA 중합효소의 결합을 조절하고 유전자 발현을 조절하는 제제에 포유류 세포를 노출시킴으로써 유도될 수 있다. 화학 시약은, 예를 들어, 프로모터에 결합된 리프레서 단백질을 제거함으로써 포유류 프로모터에 대한 RNA 중합효소 및/또는 전사인자의 결합을 촉진시키는 작용을 할 수 있다. 대안적으로, 화학적 시약은 프로모터의 하류에 위치된 유전자의 전사 속도가 화학적 시약의 존재 하에 증가되도록 RNA 중합효소 및/또는 전사인자에 대한 포유류 프로모터의 친화도를 향상시키는 작용을 할 수 있다. 위의 메커니즘에 의해 폴리뉴클레오타이드 전사를 강화시키는 화학적 시약의 예는 테트라사이클린 및 독시사이클린이다. 이러한 시약은 상업적으로 입수 가능하며(캘리포니아주 칼스베드 소재의 Life Technologies), 확립된 프로토콜에 따라 유전자 발현을 촉진시키기 위해 포유류 세포에 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 다른 DNA 서열 요소는 인핸서 서열이다. 인핸서는, DNA가 전사 개시 부위에서 전사인자 및 RNA 중합효소의 결합에 유리한 3차원 배향을 채택하도록 관심 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 입체구조 변화를 유도하는 다른 부류의 조절요소를 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 치료 단백질을 암호화하고 추가적으로 포유류 인핸서 서열을 포함하는 것을 포함한다. 다수의 인핸서 서열은 이제 포유류 유전자로부터 알려져 있으며, 예로는 포유류 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린을 암호화하는 유전자로부터의 인핸서가 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 인핸서는 또한 진핵 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스의 유전자 물질로부터 유래된 것을 포함한다. 예로는 복제기점의 후반부(bp 100 내지 270) 상의 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제기점의 후반부 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 진핵 유전자 전사의 활성화를 유도하는 추가적인 인핸서 서열은 문헌[Yaniv et al., Nature 297:17 (1982)]에 개시되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 추가 예는 문헌[Lee et al., Exp. Mol. Med. 50(3):e456 (2018); Kawakami et al., Immunity. 54(5):947-961 (2021); Kim et al., J. Exp. Med. 204(7):1543-51 (2007); Zheng et al., Nature. 463(7282):808-12 (2010); Tone et al., Nat. Immunol. 9(2):194-202 (2008); 및 Dikiy et al., Immunity. 54(5):931-946 (2021)]에 기재된 바와 같이, CNS1, CNS2, CNS3, 및 CNS0 인핸서를 포함한다.
발현 및 전달을 위한 세포
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 추가 분화를 겪을 수 있는 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포의 한 가지 유형은 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발생되는 능력을 갖는 만능 세포이다. 만능 세포의 예는 조혈 계통의 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 발생되는 능력을 갖는 만능 조혈 세포를 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 만능 조혈 세포의 예는 HSC, HPC, ESC, iPSC, 림프구 전구세포 및 CD34+ 세포를 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 조혈줄기세포 및 조혈전구세포를 포함한다. 조혈줄기세포(HSC)는 자기재생되는 능력과 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거핵아구, 혈소판 생성 거핵구, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 계통을 포함하는 성숙 혈액 세포로 분화되는 능력을 갖는 미숙 혈액 세포를 지칭한다. 인간 HSC는 CD34+이다. 또한, HSC는 또한 장기 재증식 HSC(LT-HSC) 및 단기 재증식 HSC(ST-HSC)를 지칭한다. 이러한 HSC 중 어느 것은 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
HSC 및 기타 만능 전구체가 혈액 생성물로부터 얻어질 수 있다. 혈액 생성물은 조혈 유래의 세포를 함유하는 신체 또는 신체 기관으로부터 얻어진 생성물이다. 이러한 공급원은 비분획 골수, 제대, 태반, 말초혈액, 또는 동원된 말초혈액을 포함한다. 모든 앞서 언급한 조질 또는 비분획 혈액 생성물은 다양한 방법으로 HSC 또는 림프구 전구세포 특징을 갖는 세포에 대해 풍부화될 수 있다. 예를 들어, 더 성숙하고, 분화된 세포는 이들이 발현시키는 세포 표면 분자에 기반하여 선택될 수 있다. 혈액 생성물은 자기 재생, 다분화능일 수 있는 조혈줄기세포의 하위집단을 포함하고, 이식 수용자에게 재도입될 수 있는 CD34+ 세포를 적극적으로 선택함으로써 분획화될 수 있으며, 그 후 이들은 조혈줄기 틈새로 귀소되고 생산적이고 지속적인 조혈작용을 재확립한다. 이러한 선택은, 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 자기 항-CD34 비드(Dynal, 뉴욕주 레이크 석세스 소재)를 사용하여 달성된다. 림프구 전구세포는 또한 이들이 발현시키는 마커에 기반하여 단리될 수 있다. 비분획 혈액 생성물은 공여자로부터 직접 얻어질 수 있거나, 동결보존 저장으로부터 회수될 수 있다. HSC 및 림프구 전구세포는 ES 세포, iPS 세포 또는 재프로그래밍된 성숙 세포 유형의 분화에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 동종이계 세포 및 자가유래 세포를 포함한다. 동종이계 세포가 사용될 때, 세포는 선택적으로 세포 치료를 받고 있는 대상체에 대해 HLA-매칭될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 CD34+/CD90+ 세포 및 CD34+/CD164+ 세포를 포함한다. 이러한 세포는 더 높은 백분율의 HSC를 함유할 수 있다. 이러한 세포는 문헌[Radtke et al. Sci. Transl. Med. 9: 1-10, 2017, 및 Pellin et al. Nat. Comm. 1-: 2395, 2019]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서 및 위에 기재된 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다양한 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 자가항원-결합 단백질(예를 들어, 단일쇄 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 단일쇄 항체 단편) 또는 다중쇄 단백질(예를 들어, 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자))를 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다. 일단 세포가 자가항원-결합 단백질의 생리적 또는 적합한 수준을 발현시키는 데 적합하였다면, 이러한 세포는 치료적 효용을 갖고, 본 명세서에서 "본 개시내용의 치료 세포"로 지칭된다.
유전자 편집 기법
위에 추가로, 만능 세포(예를 들어, 만능 조혈 세포)와 같은 세포 내로 관심 유전자의 혼입을 위해 사용될 수 있는 다양한 도구가 개발되었다. 표적 세포에 표적 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 혼입시키기 위해 사용될 수 있는 한 가지 이러한 방법은 트랜스포존의 사용을 수반한다. 트랜스포존은 트랜스포사제 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고, 5' 및 3' 절단 부위에 측접되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 관심 유전자를 함유한다. 일단 트랜스포존이 세포에 전달되었다면, 트랜스포사제 유전자의 발현이 시작되고, 트랜스포존으로부터 관심 유전자를 절단하는 활성 효소를 생성한다. 이 활성은 트랜스포사제에 의한 트랜스포존 절단 부위의 부위-특이적 인식에 의해 매개된다. 일부 예에서, 이러한 절단 부위는 말단 반복부 또는 역위 말단 반복부일 수 있다. 일단 트랜스포존으로부터 절단된다면, 관심 유전자는 세포의 핵 게놈 내에 존재하는 유사한 절단 부위의 트랜스포사제-촉매 절단에 의해 포유류 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 이는 상보적 절단 부위에서 관심 유전자가 절단된 핵 DNA에 도입되는 것을 가능하게 하며, 관심 유전자를 포유류 세포 게놈의 DNA에 연결시키는 포스포다이에스터 결합의 후속적 공유 결찰은 혼입 과정을 완성한다. 특정 경우에, 표적 유전자를 암호화하는 유전자가 처음 RNA 산물로 전사되고, 이어서, DNA로 역전사된 후 포유류 세포 게놈에서 혼입되도록, 트랜스포존은 레트로트랜스포존일 수 있다. 예시적인 트랜스포존 시스템은 피기백(piggybac) 트랜스포존(예를 들어, WO 2010/085699에서 상세하게 기재됨) 및 슬리핑뷰티(sleeping beauty) 트랜스포존(예를 들어, US 2005/0112764에서 상세하게 기재됨)이고, 이의 개시내용은 이들이 관심 세포에 대한 유전자 전달에서 사용하기 위한 트랜스포존에 관한 것인 경우 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
세포(예를 들어, 만능 조혈 세포)의 게놈에 표적 유전자의 통합을 위한 다른 유용한 도구는 바이러스 감염에 대한 박테리아 및 고세균에서의 적응 방어 메커니즘으로서 본래 진화된 시스템인 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문구조 반복부(CRISPR)/Cas 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드 DNA 및 CRISPR- 관련 단백질(Cas; 예를 들어, Cas9 또는 Cas12a) 내의 회문구조 반복부 서열을 포함한다. DNA와 단백질의 이러한 앙상블은 CRISPR 좌위에 외래 DNA를 처음 혼입시킴으로써 표적 서열의 부위 특이적 DNA 절단을 지시한다. CRISPR 좌위의 이러한 외래 서열 및 반복부-스페이서 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 결국 가이드 RNA를 생성하기 위해 숙주 세포에서 전사되고, 이는 후속적으로 표적 서열에 대해 어닐링되고 Cas 뉴클레아제를 이 부위에 국재화시킬 수 있다. 이런 방식으로, Cas를 표적 DNA 분자에 근접하게 만드는 상호작용이 RNA: DNA 혼성화에 의해 좌위되기 때문에, 고도로 부위-특이적인 Cas-매개 DNA 절단은 외래 폴리뉴클레오타이드에서 일어날 수 있다. 그 결과, 관심의 임의의 표적 DNA 분자를 절단하기 위해 CRISPR/Cas 시스템을 설계할 수 있다. 이 기법은 진핵 게놈을 편집하는 데 이용되었고(문헌[Hwang et al. Nature Biotechnology 31:227 (2013)], 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨), 표적 유전자를 암호화하는 유전자의 혼입 전에 DNA를 절단하기 위해 부위-특이적으로 편집하는 만능 줄기세포 게놈의 효율적인 수단으로서 사용될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위한 CRISPR/Cas의 사용은, 예를 들어, WO 2017/182881 및 US 8,697,359에 기재되었고, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
만능 조혈 세포에서 관심 유전자의 혼입 전에 게놈 DNA를 부위 특이적으로 절단하기 위한 대안의 방법은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)의 사용을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템과 달리, 이러한 효소는 특정 표적 서열에 국재화되는 가이딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 대신에 표적 특이성은 이러한 효소 내의 DNA 결합 도메인에 의해 제어된다. 게놈 편집 적용에서의 ZFN 및 TALEN의 사용은, 예를 들어, 문헌[Urnov et al. Nature Reviews Genetics 11:636 (2010); 및 Joung et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49 (2013)]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
표적 세포의 게놈에 표적 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 혼입시키는 데 사용될 수 있는 추가적인 게놈 편집은 게놈 DNA를 부위-특이적으로 절단하도록 합리적으로 설계될 수 있는 ARCUS™ 메가뉴클레아제의 사용을 포함한다. 포유류 세포의 게놈에 표적 유전자를 암호화하는 유전자의 혼입을 위한 이러한 효소의 사용은 이러한 효소에 대해 확립된 정해진 구조-활성 관계를 고려하여 유리하다. 단일쇄 메가뉴클레아제는 목적하는 위치에서 DNA를 선택적으로 절단하는 뉴클레아제를 생성하기 위해 특정 아미노산 위치에서 변형되어, 표적 세포의 핵 DNA에 표적 유전자의 부위 특이적 혼입을 가능하게 할 수 있다. 이러한 단일쇄 뉴클레아제는, 예를 들어, 미국 특허 제8,021,867호 및 US 8,445,251호에 광범위하게 기재되어 있고, 이들 각각의 개시내용은 이들이 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이라면 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
만능 세포 동원을 촉진시키는 제제
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 자가면역질환에 대해 치료 중인 대상체로부터(예를 들어, 자가유래 세포 집단의 경우에) 또는 공여자로부터(예를 들어, 동종이계 세포 집단의 경우에) 만능 세포(예를 들어, 만능 조혈 세포)의 단리 전에, 대상체 또는 공여자는 줄기세포 틈새, 예컨대, 골수로부터 말초 순환까지 만능 조혈모세포(예를 들어, CD34+ HSC 및 HPC)의 이동을 자극하는 하나 이상의 이동제가 투여된다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 세포 이동제는 본 명세서에 기재되어 있고, 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 이동제는 C-X-C 모티프 케모카인 수용체(CXCR) 2(CXCR2) 작용제일 수 있다. CXCR2 작용제는 Gro-베타, 또는 이들의 절단된 변이체일 수 있다. Gro-베타 및 이의 변이체는, 예를 들어, 미국 특허 제6,080,398호; 제6,447,766호; 및 제6,399,053호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 추가로 또는 대안적으로, 이동제는 CXCR4 길항제, 예컨대, 플레릭사포(plerixafor) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 플레릭사포 및 구조적으로 유사한 화합물은, 예를 들어, 미국 특허 제6,987,102호; 제7,935,692호; 및 제7,897,590호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 추가로 또는 대안적으로, 이동제는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)를 포함할 수 있다. 줄기세포 틈새로부터 말소 순환까지 만능 조혈모세포(예를 들어, CD34+ HSC 및/또는 HPC)의 이동을 유도하는 제제로서 G-CSF의 사용은, 예를 들어, US 2010/0178271에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
세포 생착을 향상시키는 제제
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 집단(예를 들어, CD34+ 세포)을 환자에게 투여하기 전에, 환자에게 CD34+ 세포의 내인성 집단을 제거하는 제제가 투여되어, 투여된 CD34+ 세포가 환자에서 생착되도록 허용한다. 조건화제의 예는 환자에서 매우 다양한 조혈 세포를 고갈시키는 골수제거 조건화제를 포함한다. 예를 들어, 환자는 알킬화제, 예컨대, 질소 머스터드(예를 들어, 벤다무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 메클로르에타민 또는 멜팔란), 니트로소유레아(예를 들어, 카무스틴, 로무스틴 또는 스트렙토조신), 알킬 설포네이트(예를 들어, 부설판), 트라이아진(예를 들어, 다카바진 또는 테모졸로마이드) 또는 에틸렌이민(예를 들어, 알트레타민 또는 티오테파)으로 사전치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 내인성 세포의 특정 집단, 예컨대, 내인성 CD34+ HSC 또는 HPC의 집단을 선택적으로 제거하는 조건화제가 투여된다.
일부 실시형태에서, 조건화제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD117, HLA-DR, CD34, CD90, CD45 또는 CD133(예를 들어, CD117)에 결합할 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독소에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자는 투여되는 세포의 생착을 촉진시키기 위해 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체로 전처리된다. 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달 활성체는, 예를 들어, 프로스타글란딘(PG) A2(PGA2), PGB2, PGD2, PGE1(알프로스타딜), PGE2, PGF2, PGI2(에포프로스텐올), PGH2, PGJ2 및 이들의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 PGE2 또는 dmPG2이다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 15d-PGJ2, 델타l2-PGJ2, 2-하이드록시헵타데카트라이엔산(HHT), 트롬복산(TXA2 및 TXB2), PGI2 유사체, 예를 들어, 일로프로스트 및 트레프로스티닐, PGF2 유사체, 예를 들어, 트라보프로스트, 카보프로스트 트로메타민, 타플루프로스트, 라타노프로스트, 비마토프로스트, 우노프로스톤 아이소프로필, 클로프로스테놀, 오에스트로판(Oestrophan) 및 수퍼판(Superphan), PGE1 유사체, 예를 들어, 11-데옥시 PGE1, 미소프로스톨 및 부타프로스트, 및 코레이(Corey) 알코올-A([3aa,4a,5,6aa]-(-)-[헥사하이드로-4-(하이드록시메틸)-2-옥소-2H-사이클로펜타/b/퓨란-5-일][1,1'-바이페닐]-4-카복실레이트), 코레이 알코올-B(2H-사이클로펜타[b]퓨란-2-온,5-(벤조일옥시)헥사하이드로-4-(하이드록시메틸)[3aR-(3aa,4a,5 ,6aa)]) 및 코레이 다이올((3aR,4S,5R,6aS)-헥사하이드로-5-하이드록시-4-(하이드록시메틸)-2H-사이클로펜타[b]퓨란-2-온)이다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 프로스타글란딘 E 수용체 리간드, 예컨대, 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또는 이들의 유사체 또는 유도체이다. 프로스타글란딘은 일반적으로 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 바와 같은 5-탄소 고리를 포함하는 20개의 탄소 원자를 함유하는 지방산으로부터 유도된 호르몬-유사 분자를 지칭한다. PGE2 "유사체" 또는 "유도체"의 예시적인 예는 16,16-다이메틸 PGE2, 16,16-다이메틸 PGE2 p-(p-아세트아미도벤즈아미도) 페닐 에스터, 11-데옥시-16,16-다이메틸 PGE2, 9-데옥시-9-메틸렌-16,16-다이메틸 PGE2, 9-데옥시-9-메틸렌 PGE2, 9-케토 플루프로스텐올, 5-트랜스 PGE2, 17-페닐-오메가-트리너 PGE2, PGE2 세린올 아마이드, PGE2 메틸 에스터, 16-페닐 테트라노르 PGE2, 15(S)-15-메틸 PGE2, 15(R)-15-메틸 PGE2, 8-아이소-15-케토 PGE2, 8-아이소 PGE2 아이소프로필 에스터, 20-하이드록시 PGE2, 노클로프로스트, 설프로스톤, 부타프로스트, 15-케토 PGE2 및 19 (R) 하이드록시 PGE2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 9-위치에서 할로겐으로 치환된 PGE2와 유사한 구조를 갖는 프로스타글란딘 유사체 또는 유도체(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 WO 2001/12596)뿐만 아니라 2-데카복시-2-포스피니코 프로스타글란딘 유도체, 예컨대, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 US 2006/0247214에 기재된 것)이다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 비-PGE2-기반 리간드이다. 일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 CAY10399, ONO_8815Ly, ONO-AE1-259 또는 CP-533,536이다. 비-PGE2-기반 EP2 작용제의 추가 예는 제제의 개시내용에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2007/071456에 개시된 카바졸 및 플루오렌을 포함한다. 비-PGE2-기반 EP3 작용제의 예시적인 예는 AE5-599, MB28767, GR 63799X, ONO- NT012 및 ONO-AE-248을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비-PGE2-기반 EP4 작용제의 예시적인 예는 ONO-4819, APS-999 Na, AH23848 및 ONO-AE 1- 329를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비-PGE2-기반 EP4 작용제의 추가적인 예는 WO 2000/038663; 미국 특허 제6,747,037호; 및 미국 특허 제6,610,719호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 이러한 작용제의 개시내용에 대해 참조로 원용된다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 Wnt 작용제이다. Wnt 작용제의 예시적인 예는 Wnt 폴리펩타이드 및 글리코겐 합성 키나제 3(GSK3) 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로스타글란딘 EP 수용체 신호전달 경로를 자극하는 화합물로서 사용하는 데 적합한 Wnt 폴리펩타이드의 예시적인 예는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt1Oa, Wnt1Ob, Wnt11, Wnt14, Wnt15, 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로스타글란딘 EP 수용체 신호전달 경로를 자극하는 제제로서 사용하는 데 적합한 GSK3 저해제는 GSK3a 또는 GSK3에 결합하고 이의 활성을 감소시킨다. GSK3 저해제의 예시적인 예는 미국 특허 제6,057,117호 및 제6,608,063호뿐만 아니라 US 2004/0092535 및 US 2004/0209878에 예시된 바와 같은 BIO(6- 브로모인디루빈-3'-옥심), LiCl, Li2CO3, 또는 기타 GSK-3 저해제, 및 ATP-경쟁적, 선택적 GSK-3 저해제 CHIR-911 및 CHlR-837(각각 CT-99021/CHIR-99021 및 CT-98023/CHIR-98023으로도 지칭됨)(Chiron Corporation(캘리포니아주 에머리빌 소재))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 cAMP/P13K/AKT 제2 전령 경로를 통해 신호전달을 증가시키는 제제, 예컨대, 다이뷰티릴 cAMP(DBcAMP), 포볼 에스터, 포스콜린, 스클라렐린, 8-브로모-cAMP, 콜레라 독소(CTx), 아미노필린, 2,4-다이나이트로페놀(DNP), 노르에피네프린, 에피네프린, 아이소프로테레놀, 아이소뷰틸메틸잔틴(IBMX), 카페인, 테오필린(다이메틸잔틴), 도파민, 롤리프람, 일로프로스트, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩타이드(PACAP) 및 혈관작용 장 폴리펩타이드(VIP) 및 이러한 제제들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제이다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 Ca2+ 제2 전령 경로를 통해 신호전달을 증가시키는 제제, 예컨대, Bapta-AM, 펜딜린, 니카르디핀 및 이러한 제제들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제이다.
일부 실시형태에서, 세포의 생착을 촉진시키는 것을 돕기 위해 사용된 프로스타글란딘 E 수용체 신호전달의 활성체는 NO/안지오텐신 신호전달을 통해 신호전달을 증가시키는 제제, 예컨대, L-Arg, 나이트로프루사이드나트륨, 바나듐산나트륨, 브라디키닌 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제이다.
투여 경로
본 명세서에 기재된 조성물은 하나 이상의 다양한 경로에 의해, 정맥내로 또는 골수 이식에 의해 환자(예를 들어, 자가면역질환을 앓고 있는 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에 투여하기 위한 가장 적합한 경로는 투여되는 특정 조성물, 환자, 약제학적 제형화 방법, 투여 방법(예를 들어, 투여 시간 및 투여 경로), 환자의 연령, 체중, 성별, 치료 중인 질환의 중증도, 환자의 식이요법 및 환자의 배설 속도에 따를 수 있다. 다양한 투여 경로는 단일 환자를 한 번에 치료하는 데 사용될 수 있거나, 환자는 처음에 하나의 투여 경로를 통해 치료를 받을 수 있고, 두 번째 약속 동안에, 예를 들어, 1주 후, 2주후, 1개월 후, 6개월 후 또는 1년 후 다른 투여 경로를 통해 치료를 받을 수 있다. 조성물은 대상체에게 한 번 투여될 수 있거나, 세포는 1주, 1개월 또는 1년당 1회 이상(예를 들어, 2 내지 10회) 투여될 수 있다.
공여자 세포의 선택
일부 실시형태에서, 치료를 받고 있는 환자에게 재투여되기 전에 본 개시내용의 1종 이상의 치료적 단백질을 발현시키도록 후속적으로 변형된 세포(예를 들어, 만능세포, 예컨대, 만능 조혈모세포(예를 들어, CD34+ 조혈 줄기 또는 전구세포))를 제공하는 공여자이다. 이러한 경우에, 회수된 세포(예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구세포)는, 예를 들어, 세포가 후속적으로 조혈 조직에 귀소될 수 있고, 생산적 조혈작용을 확립하도록 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트의 혼입 후 대상체에 재주입될 수 있고, 이에 의해 환자에서 결함있거나 결핍된 세포의 계통을 채우거나 다시 채울 수 있다. 치료를 받고 있는 환자가 또한 세포 공여자로서 작용하는 경우에, 이식된 세포(예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구세포)는 이식 거부될 가능성이 더 적다. 이는 주입된 세포가 환자로부터 유래되고 환자에 의해 발현되는 것과 동일한 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원을 발현시킨다는 사실로부터 유래된다는 사실로부터 나온다. 대안적으로, 환자와 공여자는 별개일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자 및 공여자는 관련되고, 예를 들어, HLA-매칭될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, HLA-매칭된 공여자-수용자 쌍은 이식 거부 위험이 감소되고, 이식 수용자 내의 내인성 T 세포 및 NK 세포가 들어오는 조혈 줄기 또는 전구세포 이식편을 외래종으로 인식할 가능성이 적기 때문에 이식 거부 위험이 감소되었고, 따라서, 이식에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성이 적다. 예시적인 HLA-매칭된 공여자-수용자 쌍은 가족성 공여자-수용자 쌍(예를 들어, 형제자매 공여자-수용자 쌍)과 같은 유전적으로 관련된 공여자 및 수용자이다. 일부 실시형태에서, 환자 및 공여자는 HLA-미스매칭되는데, 이는, 특히 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR에 대해, 적어도 하나의 HLA 항원이 환자와 공여자 사이에서 미스매칭될 때 생긴다. 이식 거부 가능성을 감소시키기 위해, 예를 들어, 공여자와 수용자 사이에 하나의 일배체형이 매칭될 수 있고, 다른 하나는 미스매칭될 수 있다.
약제학적 조성물 및 투약량
환자에게 본 개시내용의 하나 이상의 치료 단백질을 함께 발현시키는 세포 집단이 투여된 경우에, 투여된 세포의 수는, 예를 들어, 목적하는 단백질(들)의 발현 수준, 환자, 약제학적 제형화 방법, 투여 방법(예를 들어, 투여 시간 및 투여 경로), 환자의 연령, 체중, 성별, 치료 중인 질환의 중증도 및 내인성 만능세포(예를 들어, 특히 만능 조혈모세포, 예컨대, 내인성 CD34+ 세포, 조혈 줄기 또는 전구세포)를 제거하기 위해 제제로 치료된 적이 있는지의 여부에 따를 수 있다. 투여되는 세포의 수는, 예를 들어, 1×106개의 세포/㎏ 내지 1×1012개의 세포/㎏ 이상(예를 들어, 1×107개의 세포/㎏, 1×108개의 세포/㎏, 1x 109개의 세포/㎏, 1×1010개의 세포/㎏, 1×1011개의 세포/㎏, 1×1012개의 세포/㎏ 이상)일 수 있다. 세포는 미분화 상태로, 또는 미세아교세포로의 부분적 또는 완전한 분화 후에 투여될 수 있다. 만능세포의 수는 임의의 적합한 투약 형태로 투여될 수 있다.
세포는 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 담체, 희석제 및 부형제는, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2012, 22nd ed.) 및 The United States Pharmacopeia: The National Formulary (2015, USP 38 NF 33)]에 기재되어 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법이 사용되고, 제조되고 평가될 수 있는 방법의 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시하며, 순전히 본 개시내용의 예시인 것으로 의도되고, 본 발명자들이 이들의 개시내용으로 간주하려는 범주를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1. 개념증명(proof of concept: PoC) 연구에 대한 구성적 프로모터의 제어하에 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 가능하게 하기 위한 렌티바이러스 벡터 작제물의 설계.
목적
본 연구의 목적은 PoC 연구를 위한 구성적 프로모터의 제어하에 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 가능하게 하는 렌티바이러스 벡터 작제물을 설계하는 것이었다. 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조혈줄기세포-유래 조절 T 세포)에 항원-결합 능력을 부여하기 위해 사용될 수 있도록, 목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현시키기 위해 렌티바이러스 벡터 작제물을 설계하였다.
물질 및 방법
렌티바이러스 벡터 작제물을 다음의 요소를 혼입함으로써 설계하였다: Rev 반응 요소(RRE); 중심 폴리퓨린관(cPPT); 신장인자 1a 짧은 결합 서열(EFS) 프로모터; Kozak 공통 서열; 단일쇄 가변 단편을 암호화하는 암호화 영역(가변 경쇄(VL), 링커, 가변 중쇄(VH) 및 2세대 CAR 신호전달 도메인(CD28 힌지 도메인, CD28막관통(TM) 및 신호 도메인 및 CD3ζ 신호 도메인) 포함); 및 우드처크 간염 바이러스 번역 후 조절 요소(WPRE). 단일쇄 가변 단편은 항원 특이성이 알려진 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 서열을 연결함으로써 생성되었다. His-태그는 CAR의 검출을 촉진시키기 위해 도입되었다. 2세대 CAR 신호전달 도메인은 조절 T 세포 기능과의 양립 가능성을 위해 선택되었다.
결과
위에 기재된 요소를 본 개시내용의 렌티바이러스 벡터 작제물에 혼입될 수 있는 예시적인 성분의 예시를 제공하는 도 1A에 나타낸다. 위에 논의한 요소를 사용하여 생성된 예시적인 렌티바이러스 벡터 작제물이 도 1B에 나타낸다. 도 1B가 나타내는 바와 같이, 생성한 렌티바이러스 벡터 작제물은 RRE, cPPT, EFS 프로모터, Kozak 공통 서열, 항원 특이성을 갖는 scFv를 암호화하는 암호화 서열 및 2세대 CAR 신호전달 도메인뿐만 아니라 WPRE를 포함하였다. 도 1B에서 생산된 작제물을 후속적으로 아래의 실시예 2 내지 9에 기재된 PoC 연구에서 사용하였다. 이러한 실시예의 목적을 위해, 무관한 항원(irrelevant antigen: Ag)에 대해 특이성을 갖는 scFv는 시험관내 분석의 최적화를 가능하게 하기 위해 그리고 생체내 CAR 생물학의 안전성 및 기능을 시험하기 위해 선택되었다.
실시예 2. 인간 T 세포주에서 항원-특이적 CAR을 발현시킨 후 유세포 분석기를 사용한 발현 수준의 평가.
목적
본 연구의 목적은 인간 T 세포주에서 항원-특이적 CAR을 발현시키고, 이어서, 유세포 분석기를 사용하여 발현 수준을 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
Jurkat T 세포를 비형질도입하거나, 렌티바이러스 벡터(감염 다중도, MOI5)로 형질도입하여 항원-특이적 CAR(αAg-CAR)을 발현시켰다. 72시간 후에, 스트렙타비딘-PE 접합체로 염색 전에 세포와 50,000pg/㎖ 바이오틴일화된 CAR 리간드(전체 단백질)를 인큐베이션시킴으로써 유세포분석(FC)에 의해 CAR 발현을 평가하였다. 이어서, CAR 리간드의 적정을 수행하여, 평균 형광 강도(MFI)로서 정량화된 수용체 발현을 평가하였다.
0 내지 5 범위의 MOI 적정을 사용하여 상이한 수준의 Ag-특이적 CAR을 발현시키는 Jurkat T 세포의 라이브러리를 생성하였다. 벡터 복제수(VCN)를 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 측정하였고, 사용한 MOI의 척도로서 CAR+ 세포%를 FC를 사용하여 정량화하였다.
항원-특이적 CAR(αAg-CAR)을 발현시키기 위해 0 내지 5 범위의 상이한 MOI를 갖는 렌티바이러스 벡터로 Jurkat T 세포를 형질도입하였다. 72시간 후에, 사용한 MOI의 척도로서 CAR 발현을, 스트렙타비딘-PE 접합체로 염색 전에 세포와 0pg/㎖ 또는 50,000pg/㎖ 바이오틴일화된 CAR 리간드(전체 단백질) 중 하나와 함께 인큐베이션시킴으로써 FC에 의해 평가하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 렌티바이러스 벡터(MOI5)로 형질도입된 Jurkat T세포가 항원-특이적 CAR(αAg-CAR)을 발현시켰다는 것을 관찰하였다(도 2A). FC 플롯은 생 Jurkat T 세포 상에서 개폐되어, 비형질도입 세포(음성 대조군) 및 형질도입 세포를 도시하며, 여기서 표면-결합된 CAR 리간드(CAR-R-PE-A)가 있는 세포 상에서 개폐함으로써 CAR 발현 세포의 비율을 결정하였다. 도 2A는 또한 평균 형광 강도(PE MFI)에 의해 정량화한 수용체 발현을 평가하기 위해 CAR 리간드의 적정(pg)을 사용하였다는 것을 나타낸다. 형질도입된 세포가 대부분의 리간드 농도(102 내지 106 보다 약간 적은 범위)에 걸쳐 비형질도입된 세포에 비해 더 높은 PE MFI를 가졌다는 것을 관찰하였다. 리간드 농도가 증가함에 따라 형질도입된 세포에 대한 PE MFI가 또한 증가되었다.
본 발명자들은 또한 MOI 적정이 0 내지 5 범위에서 증가함에 따라 ddPCR에 의해 측정한 Jurkat T 세포에서의 이식유전자 벡터 복제수(VCN)는(도 2B) 증가되었다는 것이 관찰되었다. MOI 적정을 이용하여 생성된 Jurkat T 세포의 라이브러리에서 MOI 적정의 척도로서 CAR+ 세포%를 정량화하였고, MOI 적정이 증가함에 따라 생 αAg-CAR+ 세포의 %가 증가되었다는 것이 관찰되었다. 더 나아가, 본 발명자들은 FC를 통해(도 2C) CAR 발현의 척도인 PE MFI가 1 내지 5 범위의 모든 MOI 값에서 리간드의 0pg/㎖와 비교할 때 리간드의 50,000pg/㎖ 농도에서 더 높았다는 것을 관찰하였다.
실시예 3. 인간 T 세포주에서 시험관내에서 항원-특이적 CAR 기능의 함수를 확인하는 것
목적
본 연구의 목적은 발현 후에 인간 T 세포주에서 시험관내 항원-특이적 CAR 기능의 함수를 확인하는 것이었다.
물질 및 방법
Jurkat T 세포를 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여 상이한 수준의 αAg-CAR(도 2에 나타낸 형질도입 효율)을 발현시켰고, 24시간 동안 시험관내에서 증가된 양의 CAR 리간드로 처리하였다. 그 후에, CAR 기능을 평가하기 위해 FC를 수행하였다. 0 내지 5 범위의 상이한 MOI 적정에서 발현된 T 세포 활성화 마커인 CD69 및 CD25의 수준으로서 CAR 기능을 측정하였다. 또한, 배양된 Jurkat T 세포로부터의 상청액을 수집하였고, 효소결합면역흡착측정법 (ELISA)에 의해 IL-2 생산에 대해 평가하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 MOI 값이 증가하고(1 내지 5의 범위) 리간드 농도가 증가함에 따라(0.01㎍에서 10㎍) FC를 통해 평균 MFI로서 본 명세서에서 측정한 CD69 발현(도 3A, 좌측 그래프)이 증가되었다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 MOI 값이 증가하고(1 내지 5의 범위) 리간드 농도가 증가함에 따라(0.01㎍에서 10㎍) CD25 발현이 증가된다는 것을 관찰하였다. 추가로, 도 3B에 나타나는 바와 같이, MOI 값(1,3,5)이 증가하고 리간드 농도가 증가함에 따라(0㎍에서 10㎍) ELISA를 통해 측정한 배양된 Jurkat 세포에 의해 생성된 IL-2 수준이 증가되었다. 종합하면, 이러한 데이터는 인간 T 세포에서 형질도입 후 항원-특이적 CAR 기능성을 확인한다.
실시예 4. 1차 뮤린 T 세포에서 항원-특이적 CAR의 발현 다음에 유세포 분석기를 사용하는 발현 수준 및 유세포 분석기 및 효소결합면역흡착측정법을 사용하는 기능 수준의 평가
목적
본 연구의 목적은 1차 뮤린 T 세포에서 항원-특이적 CAR을 발현시킨 다음에 유세포 분석기를 사용하는 발현 수준 및 유세포 분석기 및 효소결합면역흡착측정법을 사용하는 기능 수준을 평가하는 것이다.
물질 및 방법
정제된, CD4+CD25- 미경험 비장 T 세포를 αAg-CAR의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터(MOI10)의 첨가 전에 CD3/CD28 마이크로비드를 이용하여 시험관내에서 활성화시켰다. 72시간 후에, αAg-CAR의 발현을 FC 분석에 의해 확인하였다. 일부 세포를 음성 대조군으로서 작용하도록 비형질도입하였다.
형질도입된 CD4+CD25- T 세포를 시험관내에서 48시간 동안 증가된 농도의 CAR 리간드로 처리하였다. MFI로서 정량화된 FC에 의해 CD69 및 CD25 발현을 측정함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다. 배양된 세포로부터의 상청액을 IL-2 분비에 대해 ELISA를 통해 동시에 평가하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 형질도입된 CD4+CD25- 미경험 비장 T 세포가 형질도입된 세포의 상단 우측 사분면에서 FC 윤곽(28.77%)의 존재로부터 분명한 바와 같이 비형질도입 세포에 비해 더 높은 리간드 결합을 나타냈다는 것을 관찰하였다(도 4A). 본 명세서에서, T 세포를 확인하기 위해 TCRb Brilliant Violet 78 농도를 사용하고, 표면-결합된 CAR 리간드(CAR-R-PE-A)가 있는 세포 상에서 개폐에 의해 CAR 발현 세포의 비율을 결정하였다. 플롯은 생, CD4+ T 세포 상에서 개폐된다. 음성 대조군으로서 비형질도입 세포를 사용하였다. αAg-CAR+ 형질도입된 세포의 %를 생, CD4+ T 세포의 %로서 정량화하였고(n=4)(도 4B) 생, αAg-CAR+ CD4+ T 세포의 %가 형질도입 MOI10에서 더 높았고 형질도입 MOI0(비형질도입된 세포)에서 거의 무시할 정도였다는 것이 관찰되었는데, 이는 생, αAg-CAR+ CD4+ T 세포 %의 증가가 αAg-CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입의 직접적인 결과였다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 추가로, FC를 통한 평균 MFI로서 측정된 CD25 발현이(도 4C, 좌측 그래프) 형질도입된 세포(원)에서보다 형질도입된 세포(정사각형)에서 더 높았고 리간드 농도가 증가함에 따라(0.01㎍에서 10㎍) 이것이 증가되었다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한, FC를 통한 평균 MFI로서 측정된 CD69 발현이(도 4C, 우측 그래프) 형질도입된 세포(원)에서보다 형질도입된 세포(정사각형)에서 더 높았고 리간드 농도가 증가함에 따라(0.1㎍에서 10㎍) 이것이 증가되었다는 것을 관찰하였다. 또한, 형질도입에 의해서뿐만 아니라 리간드 농도가 증가함에 따라(0㎍에서 100㎍) ELISA를 통해 측정한 배양된 세포에 의해 생산된 IL-2의 수준은(도 4D) 증가되었다. 종합하면, 이러한 데이터는 1차 뮤린 T 세포의 형질도입이 기능적 항원-특이적 CAR의 발현을 초래한다는 것을 입증한다.
실시예 5. 1차 뮤린 조절 T 세포에서 항원-특이적 CAR의 발현 다음에 유세포 분석기를 사용하는 발현 수준 및 효소결합면역흡착측정법을 사용하는 기능 수준의 평가
목적
본 연구의 목적은 1차 뮤린 조절 T 세포에서 항원-특이적 CAR의 발현 다음에 유세포 분석기를 사용하는 발현 수준 및 효소결합면역흡착측정법을 사용하는 기능 수준을 평가하는 것이다.
물질 및 방법
정제된, αAg-CAR을 발현시키기 위한 렌티바이러스 형질도입(MOI10) 전에 CD4+CD25+ 조절 T 세포(Treg)를 CD3/CD28 마이크로비드를 사용하여 시험관내에서 활성화시켰다. 72시간 후에, αAg-CAR의 발현을 확인하기 위해 FC를 수행하였다.
배지 단독 또는 10㎍ CAR 리간드에서 48시간 동안 형질도입된 CD4+CD25+ Treg를 배양시켰다. 상청액을 수집하였고, ELISA로 IL-10 분비를 정량화하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 렌티바이러스 형질도입 후에, 도 5A의 상단 우측 사분면에서 FC 윤곽(32.43%)의 존재로부터 분명한 바와 같이, CD4+CD25+ Treg이 αAg-CAR을 발현시켰다는 것을 관찰하였다. 본 명세서에서, T 세포를 확인하기 위해 TCRb Brilliant Violet 78 농도를 사용하고, 표면-결합된 CAR 리간드(CAR-R-PE-A)가 있는 세포 상에서 개폐에 의해 CAR 발현 세포의 비율을 결정하였다. 플롯은 생, CD4+ T 세포 상에서 개폐된다.
본 발명자들은 또한 ELISA를 통해 측정한 형질도입된 CD4+CD25+ Treg에 의해 생성된 IL-10의 수준이(도 5B) 더 높은 리간드 농도에 의해 증가되었다(0㎍에서 10㎍)는 것을 관찰하였는데, 이는 IL-10 분비 수준이 CAR 기능의 결과라는 것을 시사한다. CAR 발현은 리간드 결합을 야기하고 더 많은 IL-10을 생성한다. 본 명세서에서, IL-10(pg/㎖) 농도를 리간드의 양(㎍)에 대해 플롯팅한다. 막대는 개개 데이터 지점이 표시된 평균 +/- SEM을 나타낸다(n=4). 통계학적 유의도는 독립표본 T 검정에 의해 평가하였다: ** p = 0.0019.
종합하면, 이러한 데이터는 항원-특이적 CAR을 발현시키기 위한 1차 뮤린 Treg 세포의 형질도입이 기능적 CAR 작제물을 발현시키는 형질도입된 Treg 세포를 초래한다는 것을 입증한다.
실시예 6. 형질도입된 뮤린 골수 HSC의 이식을 통해 재구성된 면역 구획 내에서 우선적인 FoxP3 프로모터-지시 이식유전자 발현에 의한 조절 T 세포의 생성
목적
본 연구의 목적은 형질도입된 뮤린 골수 형질도입된 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 이식을 통해 재구성된 면역 구획 내에서 우선적인 FoxP3 프로모터-지시 이식유전자 발현에 의한 조절 T 세포를 생성하는 것이었다.
물질 및 방법
계통- 골수(계통-BM) 세포를 단리시켰고, Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현시키도록 설계된 렌티바이러스 작제물로 형질도입하였다. 이식 10주 후에, 재구성된 면역 구획 내에서 GFP의 발현을 평가하였다. 렌티바이러스 작제물이 보존된 비암호화 서열(CNS) 도메인 1, 2 및 3(CNS1, CNS2 및 CNS3); Foxp3 프로모터; 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 암호화 서열 및 3'UTR 서열 요소를 포함하도록 설계하였다. 작제물이 Treg 구획 내의 이식유전자 발현을 향상시키는 한편, 다른 면역 서브세트 내에서 이식유전자 발현을 제한하도록 설계하였다. 그 다음에, GFP 발현을 측정하기 위해 이식된 동물의 비장으로부터 유래된 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 FC를 수행하였다. 면역 세포에서 Foxp3-프로모터의 활성을 측정하기 위해 FC를 다시 수행하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 렌티바이러스 작제물이 Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현시킬 수 있도록, 보존된 비암호화 서열(CNS) 도메인 1, 2 및 3(CNS1, CNS2 및 CNS3); Foxp3 프로모터; 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 암호화 서열 및 3'UTR 서열 요소를 포함하는 렌티바이러스 작제물을 얻었다(도 6A).
본 발명자들은, 도 6B의 상단 우측 영역에서 FC 음영(75.08%)의 존재로부터 분명한 바와 같이, 이식된 동물의 비장으로부터 유래된 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 GFP 발현을 관찰하였다. 본 명세서에서, CD4-Brilliant Violet 60 마커의 검출을 사용하여 T 세포를 확인하고, GFP (GFP-FITC-A) 상에서 개폐함으로써 GFP 발현 세포의 비율을 결정한다.
본 발명자들은 또한 GFP 수준(MFI)으로 측정한 Foxp3 프로모터 활성이 면역 세포 유형 및 조직 유형(흉선, 비장, MLN(장간막 림프절) 및 pLN(말초 림프절)에서 B 세포, T 세포, 단핵구 및 호중구)에 기반하여 다르다는 것을 관찰하였다(도 6C). 흉선, 비장, MLN 및 PLN의 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 가장 높은 GFP 수준이 관찰된다. 본 명세서에서, GFP 수준(MFI)을 특정 조직/세포 유형에서 면역 세포의 각 유형에 대해 플롯팅한다. 개개 데이터 지점은 생물학적 복제를 나타내며, 막대는 평균 +/- SEM(n=4)을 나타낸다. 도면 약어: BM(골수); DP(이중 양성); SP(단일 양성).
종합하면, 이러한 데이터는 FoxP3 프로모터에 의해 발현이 유도될 때 형질도입된 뮤린 골수 HSC의 이식이 Treg 세포에서 GFP의 우선적 발현으로 이어진다는 것을 입증한다.
실시예 7. 형질도입된 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 이식 후 생체내 조절 T 세포를 발현시키는 CAR 생성
목적
본 연구의 목적은 형질도입된 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 이식 후 생체내 조절 T 세포를 발현시키는 CAR 생성하는 것이었다.
물질 및 방법
계통- 골수(계통- BM) 세포를 단리시켰고, 렌티바이러스 작제물로 형질도입하여 Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시켰다. 이식 10주 후에, 면역 구획 전체적으로 CAR 발현을 평가하였다.
보존된 비암호화 서열(CNS) 도메인 1, 2 및 3(CNS1, CNS2 및 CNS3); Foxp3 프로모터; 항원-특이적 CAR(αAg-CAR) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)에 대한 암호화 서열 및 3'UTR 서열 요소를 포함하도록 렌티바이러스 작제물을 설계하였다. 그 다음에, CAR 발현을 측정하기 위해 이식된 동물의 비장으로부터 유래된 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 FC를 수행하였다.
골수 키메라 마우스에서 Treg 발생 및 기능의 변화를 측정하기 위해 생체외에서 FC를 수행하였다. 비장당 조절 세포의 총 수, 전사인자, Foxp3 및 표면 마커 CD25를 포함하는 중요한 조절 T 세포 유전자의 발현 수준을 측정하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 렌티바이러스 작제물이 Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시킬 수 있도록, 보존된 비암호화 서열(CNS) 도메인 1, 2 및 3(CNS1, CNS2 및 CNS3); Foxp3 프로모터; 항원-특이적 CAR(αAg-CAR) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)에 대한 암호화 영역 및 3'UTR 서열 요소을 포함하는 렌티바이러스 작제물(도 7A)을 얻었다.
본 발명자들은 결합된 CAR 리간드 농도가 높은 상단 우측 사분면에서 FC 음영(75.69%)의 존재로부터 분명한 바와 같이 이식된 동물의 비장으로부터 유래된 CD4+ CD25+ 조절 T 세포에서 CAR 발현을 관찰하였다(도 7B). 본 명세서에서, T 세포를 확인하기 위해 CD4-Brilliant Violet 60 마커의 검출을 사용하고, 표면-결합된 CAR 리간드(CAR-R-PE-A)가 있는 세포 상에서 개폐에 의해 CAR 발현 세포의 비율을 결정하였다.
추가로, 본 발명자들은 생체내 FC 분석에 의해 평가되는 바와 같이 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 비장 조절 T 세포의 수 및 표현형을 비교하였다(도 7C). CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 비장 조절 T 세포의 비슷한 수 및 표현형을 검출하였다. 비장당 조절 세포의 총 수를 정량화하였고, CAR+ 그룹과 CAR- 그룹 간의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(좌측 그래프). 본 명세서의 세포 수를 CAR 이식유전자 발현에 따라 플롯팅한다. 전사인자 Foxp3 및 표면 마커 CD25를 포함하는 중요한 조절 T 세포 유전자의 발현 수준은 각각 MFI로서 정량화하지만(중간 및 우측 그래프), 사례 둘 다에서 CAR+ 그룹과 CAR- 그룹 간의 유의미한 차이는 발견되지 않았다. 본 명세서에서 Foxp3 수준(MFI) 및 CD25 수준(MFI)을 CAR 이식유전자 발현에 따라 플롯팅한다. 개개 데이터 지점은 생물학적 복제를 나타내며, 막대는 평균 +/- SEM(CAR- n=4; CAR+ n=6)을 나타낸다. 유의미한 차이가 검출되지 않은 독립표본 T 세포 검정에 의해 통계학적 차이를 평가하였다.
실시예 8. Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 렌티바이러스 작제물에 의한 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 형질도입 후 조절 T 세포를 발현시키는 CAR의 생성 후에 이들의 면역억제 잠재력의 평가
목적
본 연구의 목적은 Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 렌티바이러스 작제물에 의한 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 형질도입 후 조절 T 세포를 발현시키는 CAR의 생성 후에 세포 추적자 바이올렛 증식 분석을 사용한 이들의 면역억제 능력을 평가하는 것이었다.
물질 및 방법
계통-골수(계통-BM) 세포를 단리시켰고, 렌티바이러스 작제물로 형질도입하여 Treg (Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시켰다. 이식 10주 후에, 말초 면역 기관으로부터 조절 T 세포를 단리시켰고, 시험관내에서 면역 기능의 변화에 대해 평가하였다. Treg를 세포 추적자 바이올렛 표지 효과기 T 세포와 함께 배양시킴으로써 면역억제 능력에 대해 CAR 발현 Treg를 평가하였다. 효과기 T 세포를 대조군 CAR- 또는 Ag-CAR+ Treg의 존재하에 96시간 동안 CD3/CD28 마이크로비드로 자극하였다. 세포 추적자 염료의 희석에 의해 증식 반응을 측정하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 CAR-(도 8A, 상단 우측)과 Ag-CAR+ Treg(도 8A, 하단 우측)가 둘 다 면역억제 능력을 가졌고, 히스토그램 프로파일 내에서 피크 수로 나타낸 세포 추적자 바이올렛 표지 효과기 T 세포 증식을 감소시킬 수 있었다는 것을 관찰하였고, 각 피크는 세포 분열을 나타낸다. 대표적인 히스토그램은 표시된 실험 조건에 대한 세포 추적자 염료 프로파일을 도시한다.
본 발명자들은 또한 효과기 T 세포에 대한 Treg의 농도가 증가함에 따라, 효과기 T 세포의 증식 능력%가 감소되었다는 것을 관찰하였다(도 8B). 세포 추적자 염료의 희석에 의해 증식 반응을 정량화하였다. 데이터는 분열을 겪은 세포 추적자 표지 세포의 백분율("증식%")로 나타낸다. 개개 데이터 지점은 생물학적 복제를 나타내며, 막대는 평균 +/- SEM(CAR- n=4; CAR+ n=6)을 나타낸다. 유의미한 차이가 검출되지 않은 세포의 각각의 비슷한 비에 대해 대응표본 T 검정에 의해 통계학적 유의도를 평가하였다.
실시예 9. Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 렌티바이러스 작제물에 의한 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 형질도입 후 조절 T 세포를 발현시키는 CAR의 생성 후에 이들의 항원-특이적 면역억제 잠재력의 평가
목적
본 연구의 목적은 Treg(Foxp3) 프로모터의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+) 또는 관련없는 이식유전자(CAR-)를 발현시키는 렌티바이러스 작제물에 의한 뮤린 골수 조혈줄기세포(HSC)의 형질도입 후 조절 T 세포를 발현시키는 CAR의 생성 후에 CAR에 의해 부여되는 항원-특이적 면역억제 기능을 평가하는 것이다.
물질 및 방법
계통- 골수(계통- BM) 세포를 단리시켰고, 렌티바이러스 작제물로 형질도입되어 Treg 특이적(Foxp3) 프로모터 또는 관련없는 이식유전자(대조군 CAR-)의 제어하에 항원-특이적 CAR(CAR+)을 발현시켰다. 형질도입 후 10주에, 조절 T 세포를 말초 면역 기관으로부터 단리시켰고, CAR 리간드로 48시간 동안 시험관내에서 배양시켜 활성화를 평가하였다. CD25-PE-Cy7-A 리간드를 사용하여 대조군 CAR-Treg와 αAg-CAR+ Treg 둘 다에서 10㎍ CAR 리간드로 자극 후 FC를 통해 CD25 발현 수준을 측정하였다. 그 후에, 대조군 CAR- Treg와 αAg-CAR+ Treg을 둘 다 48시간 동안 CD3/CD28 마이크로비드의 부재 또는 존재하에서 10㎍ CAR 리간드에 노출시켰다. 상청액을 수집하였고, ELISA에 의해 IL-10 분비를 결정하였다.
결과
결과에서, 본 발명자들은 상응하는 리간드로 자극하였을 때, αAg-CAR+ Treg(우측)가 대조군 CAR- Treg에 비해 CD25의 훨씬 더 높은 발현을 가졌다는 것을 관찰하였다(도 9A). 본 명세서에서, 표면-결합된 CD25-PE-Cy7-A에 의해 결정된 상이한 수준의 CD25를 발현시키는 세포의 수(계수)를 나타낸다. 평균 MFI로서 조절 T 세포를 발현시키는 대조군 CAR- 및 CAR+에서 CD25 수준을 정량화한다(도 9B).
본 발명자들은 또한 αAg-CAR+ Treg(정사각형)이 CD3/CD28 마이크로비드의 부재(도 9C) 또는 존재(도 9D)하에 48시간 동안 10㎍ CAR 리간드에 노출한 후에 대조군 CAR- Treg(원)에 비해 더 많은 IL-10(pg/㎖)을 분비하였다는 것을 관찰하였다. αAg-CAR+ Treg(정사각형)은 10㎍ CAR 리간드에 노출 후에 더 많은 IL-10(pg/㎖)를 분비하였지만, 리간드에 대한 노출 전 및 노출 후에 대조군 CAR+ Treg에 의해 분비된 IL-10 양의 유의미한 차이가 없었다. 통계학적 유의도는 p값이 나타난 대응표본 T 검정에 의해 평가하였다.
실시예 10. 자가면역질환의 치료를 위해 자가항원 결합 단백질을 발현시키는 만능세포의 생성
자가항원-결합 단백질을 발현시키는 만능세포, 예컨대, 만능 조혈모세포(예를 들어, 조혈줄기세포(HSC), 조혈전구세포(HPC), 배아 줄기세포(ESC), 유도 만능 줄기세포(iPSC), 림프구 전구세포 또는 CD34+ 세포)의 제조를 위한 예시적인 방법은 형질도입에 의한다. 예를 들어, 적합한 프로모터, 예컨대, 본 명세서에 기재된 Foxp3 프로모터, 적합한 인핸서, 예컨대, 본 명세서에 기재된 CNS1, CNS2, CNS3 및/또는 CNS0 인핸서 및 자가항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터)를 본 명세서에 기재되거나 당업계에 알려진 벡터 생산 기법을 사용하여 조작할 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 조작한 후에, 자가항원 결합 단백질을 발현시키는 만능 조혈모세포의 집단을 생성하기 위해 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC, HPC, ESC, iPSC, 림프구 전구세포 또는 CD34+ 세포)를 형질도입하는 데 레트로바이러스를 사용할 수 있다.
자가항원-결합 단백질을 발현시키는 만능 조혈모세포의 제조를 위한 추가적인 예시적 방법은 형질감염 기법이다. 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 분자 생물학 절차를 사용하여, 예를 들어, 프로모터, 하나 이상의 인핸서 및 자가항원 결합-단백질을 포함하는 플라스미드 DNA를 생성할 수 있다. 예를 들어, 자가항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산은 당업계에 알려진 PCR-기반 기법을 사용하여 인간 세포주로부터 증폭될 수 있거나, 또는 자가항원 결합-단백질을 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 고상 폴리뉴클레오타이드 합성 절차를 사용하여 합성될 수 있다. 이어서, 핵산, 프로모터 및 인핸서(들)를, 예를 들어, 적합한 제한 엔도뉴클레아제-매개 절단 및 결찰 프로토콜을 사용하여 관심의 플라스미드에 결찰시킬 수 있다. 플라스미드 DNA를 조작한 후에, 예를 들어, 암호화된 단백질(들)을 발현시키는 만능 조혈모세포의 집단을 생성하기 위해 전기천공법 또는 본 명세서에 기재된 다른 형질감염 기법을 사용하여 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC, HPC, ESC, iPSC, 림프구 전구세포 또는 CD34+ 세포)를 형질감염시키기 위해 플라스미드를 사용할 수 있다.
실시예 11. 자가면역질환을 앓고 있는 환자에 대한 치료 조성물의 투여
본 명세서에 개시된 방법에 따르면, 환자, 예컨대, 인간 환자는 자가면역질환의 증상을 감소 또는 경감하기 위해 그리고/또는 질환의 기저 생화학적 병인론을 표적화하기 위해 치료될 수 있다. 이를 위하여, 환자에게, 예를 들어, CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포에서 활성인 계통-특이적 전사 조절 요소의 제어하에 자가항원 결합 단백질을 발현시키는 만능세포의 집단, 예를 들어, 만능 조혈모세포(예를 들어, HSC, HPC, ESC, iPSC, 림프구 전구세포 또는 CD34+ 세포)를 투여할 수 있다. 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게, 예를 들어, 전신으로(예를 들어, 정맥내로) 투여할 수 있다. 세포를 치료적 유효량, 예컨대, 1×106개의 세포/㎏ 내지 1×1012개의 세포/㎏ 이상(예를 들어, 1×107개의 세포/㎏, 1×108개의 세포/㎏, 1x 109개의 세포/㎏, 1×1010개의 세포/㎏, 1×1011개의 세포/㎏, 1×1012개의 세포/㎏ 이상)로 투여할 수 있다.
세포 집단을 환자에게 투여하기 전에, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조건화제의 투여에 의해 환자의 내인성 조혈 세포 집단을 제거하기 위해 1종 이상의 제제가 환자에게 투여될 수 있다.
다양한 임상 지표에 의해 치료의 성공을 모니터링할 수 있다. 본 개시내용의 조성물을 사용하는 자가면역질환의 효과적인 치료는, 예를 들어, (i) 지속된 질환 관해, 예컨대, 적어도 1년 동안 지속된 질환 관해; (ii) 환자에서 감소된 염증 또는 통증의 경감의 관찰; 및/또는 (iii) 환자에서 감소된 조직 손상의 관찰로서 나타날 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시형태
본 발명의 예시적인 실시형태를 아래에 열거하는 단락에 기재한다.
1. 자가면역질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 자가면역질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 핵산 카세트는 CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포에서 활성인(즉, Treg 계통의 세포에서 특이적으로 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
2. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자의 자가반응성 효과기 면역 세포 집단의 활성 및/또는 증식을 억제하는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, Treg 계통의 세포에서 특이적으로 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
3. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자의 자가반응성 효과기 면역 세포의 세포자멸사를 유도하는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, Treg 계통의 세포에서 특이적으로 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
4. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자에서 자가면역질환으로부터 내인성 조직을 보호하는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, Treg 계통의 세포에서 특이적으로 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
5. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자의 염증을 감소시키는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, Treg 계통의 세포에서 특이적으로 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 조혈줄기세포(HSC) 또는 조혈전구세포(HPC)인, 방법.
7. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 배아 줄기세포인, 방법.
8. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 유도 만능 줄기세포인, 방법.
9. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 림프구 전구세포인, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 CD34+ 세포인, 방법.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포의 집단은 환자에게 전신 투여되는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 상기 만능 조혈모세포의 집단은 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여되는, 방법.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 환자에 대해 자가유래인, 방법.
14. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 환자에 대해 동종이계인, 방법.
15. 실시형태 14에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 환자와 HLA-매칭되는, 방법.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입되는, 방법.
17. 실시형태 16에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
18. 실시형태 17에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스 벡터인, 방법.
19. 실시형태 18에 있어서, 상기 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
20. 실시형태 18에 있어서, 상기 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
21. 실시형태 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함하는, 방법.
22. 실시형태 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 위형 바이러스 벡터인, 방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 위형 바이러스 벡터는 위형 아데노바이러스, 위형 파보바이러스, 위형 코로나바이러스, 위형 랍도바이러스, 위형 파라믹소바이러스, 위형 피코르나바이러스, 위형 알파바이러스, 위형 헤르페스 바이러스, 위형 폭스바이러스 및 위형 레트로바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
24. 실시형태 23에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 위형 렌티바이러스 벡터인, 방법.
25. 실시형태 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 위형 바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), RD114 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 인간 거품형성 바이러스(HFV), 월아이 진피 육종 바이러스(WDSV), 셈리키 삼림열 바이러스(SFV), 광견병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스(ALV), 소면역결핍 바이러스(BIV), 소 백혈병 바이러스(BLV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 신놈브레 바이러스(SNV), 체리 트위스트 잎 바이러스(ChTLV), 유인원 T-세포 백혈병 바이러스(STLV), 메이슨-화이저 원숭이 바이러스(MPMV), 다람쥐 원숭이 레트로바이러스(SMRV), 라우스-육종 바이러스(RAV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 조류 육종 바이러스(MH2), 조류 뇌척수염 바이러스(AEV), 알파 모자이크 바이러스(AMV), 조류 육종 바이러스 CT10 및 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 선택된 바이러스로부터의 외피 단백질을 포함하는, 방법.
26. 실시형태 25에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 VSV-G 외피 단백질을 포함하는, 방법.
27. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 폴리펩타이드로 생체외에서 형질감염된, 방법.
28. 실시형태 27에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 양이온성 중합체, 다이에틸아미노에틸덱스트란, 폴리에틸렌이민, 양이온성 지질, 리포솜, 인산칼슘, 활성화된 덴드리머 및/또는 자기 비드를 사용하여 형질감염된, 방법.
29. 실시형태 27 또는 28에서, 만능 조혈모세포는 전기천공법, 뉴클레오펙션, 스퀴즈-천공법, 초음파 천공법, 광학 형질감염, 자기주입 및/또는 임팔레펙션에 의해 형질감염된, 방법.
30. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 핵산 카세트는 전위요소의 일부인, 방법.
31. 실시형태 30에 있어서, 핵산 카세트는 만능 조혈 세포의 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 혼입을 위한 트랜스포사제 인식 및 절단 요소를 포함하는, 방법.
32. 실시형태 31에 있어서, DNA 분자는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자이고, 트랜스포사제 인식 및 절단 요소는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자에의 혼입을 촉진시키는, 방법.
33. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포는 세포의 게놈 내의 표적 위치에서 단일-가닥 파손 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 뉴클레아제를 세포에 전달함으로써 얻어진, 방법.
34. 실시형태 33에 있어서, 뉴클레아제는 세포의 게놈 내의 표적 위치에 혼성화하는 가이드 RNA(gRNA)와 조합하여 세포에 전달되는, 방법.
35. 실시형태 33 또는 34에 있어서, 뉴클레아제는 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문구조 반복부(CRISPR)-관련 단백질인, 방법.
36. 실시형태 35에 있어서, CRISPR-관련 단백질은 CRISPR-관련 단백질 9(Cas9) 또는 CRISPR-관련 단백질 12a(Cas12a)인, 방법.
37. 실시형태 33 또는 34에 있어서, 뉴클레아제는 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제인, 방법.
38. 실시형태 33 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 세포는 뉴클레아제와 접촉되지만, 세포는 추가적으로 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 접촉되는, 방법.
39. 실시형태 38에 있어서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 촉진시키기 위해, 각각, 표적 위치에 대해 5' 및 표적 위치에 대해 3'에 위치된 핵산 서열과 충분히 유사한 핵산 서열을 갖는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함하는, 방법.
40. 실시형태 38 또는 39에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 세포와 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 세포에 전달되는, 방법.
41. 실시형태 40에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스 또는 레트로바이러스과 바이러스인, 방법.
42. 실시형태 41에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스인, 방법.
43. 실시형태 42에 있어서, 레트로바이러스과 바이러스는 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
44. 실시형태 42 또는 43에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 레트로바이러스과 바이러스는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함하는, 방법.
45. 실시형태 40에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터인, 방법.
46. 실시형태 40에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV인, 방법.
47. 실시형태 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함하는, 방법.
48. 실시형태 47에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
49. 실시형태 48에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
50. 실시형태 49에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
51. 실시형태 50에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는, 방법.
52. 실시형태 47에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
53. 실시형태 52에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
54. 실시형태 53에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
55. 실시형태 54에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는, 방법.
56. 실시형태 47에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
57. 실시형태 56에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
58. 실시형태 57에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
59. 실시형태 58에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는, 방법.
60. 실시형태 47에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
61. 실시형태 60에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
62. 실시형태 61에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
63. 실시형태 62에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는, 방법.
64. 실시형태 47 내지 63 중 어느 하나에 있어서, Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 방법.
65. 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함하는, 방법.
66. 실시형태 65에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
67. 실시형태 66에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
68. 실시형태 67에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
69. 실시형태 68에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는, 방법.
70. 실시형태 65에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
71. 실시형태 70에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
72. 실시형태 71에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
73. 실시형태 72에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는, 방법.
74. 실시형태 65에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
75. 실시형태 74에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
76. 실시형태 75에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
77. 실시형태 76에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는, 방법.
78. 실시형태 65에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
79. 실시형태 78에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
80. 실시형태 79에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
81. 실시형태 80에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열을 갖는, 방법.
82. 실시형태 65 내지 81 중 어느 하나에 있어서, CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 방법.
83. 실시형태 1 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함하는, 방법.
84. 실시형태 83에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
85. 실시형태 84에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
86. 실시형태 85에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
87. 실시형태 86에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는, 방법.
88. 실시형태 83에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
89. 실시형태 88에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
90. 실시형태 89에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
91. 실시형태 90에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열을 갖는, 방법.
92. 실시형태 83에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
93. 실시형태 92에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
94. 실시형태 93에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
95. 실시형태 94에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는, 방법.
96. 실시형태 83에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
97. 실시형태 96에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
98. 실시형태 97에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
99. 실시형태 98에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는, 방법.
100. 실시형태 83 내지 99 중 어느 하나에 있어서, CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 방법.
101. 실시형태 1 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함하는, 방법.
102. 실시형태 101에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
103. 실시형태 102에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
104. 실시형태 103에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
105. 실시형태 104에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열을 갖는, 방법.
106. 실시형태 101에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
107. 실시형태 106에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
108. 실시형태 107에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
109. 실시형태 108에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는, 방법.
110. 실시형태 101에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
111. 실시형태 110에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
112. 실시형태 111에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
113. 실시형태 112에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열을 갖는, 방법.
114. 실시형태 101에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
115. 실시형태 114에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
116. 실시형태 115에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
117. 실시형태 116에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열을 갖는, 방법.
118. 실시형태 101 내지 117 중 어느 하나에 있어서, CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 방법.
119. 실시형태 1 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함하는, 방법.
120. 실시형태 119에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
121. 실시형태 120에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
122. 실시형태 121에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
123. 실시형태 122에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열을 갖는, 방법.
124. 실시형태 119에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
125. 실시형태 124에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
126. 실시형태 125에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
127. 실시형태 126에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는, 방법.
128. 실시형태 119에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
129. 실시형태 128에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
130. 실시형태 129에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
131. 실시형태 130에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는, 방법.
132. 실시형태 119에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
133. 실시형태 132에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
134. 실시형태 133에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
135. 실시형태 134에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는, 방법.
136. 실시형태 119 내지 135 중 어느 하나에 있어서, CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합하는, 방법.
137. 실시형태 1 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 핵산 카세트는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된, 방법.
138. 실시형태 137에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 유도하는, 방법.
139. 실시형태 1 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드인, 방법.
140. 실시형태 1 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
141. 실시형태 140에 있어서, 키메라 항원 수용체는 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
142. 실시형태 141에 있어서, 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
143. 실시형태 141 또는 142에 있어서, 상기 항원 인식 도메인은 단일쇄 항체 단편이되, 선택적으로 상기 단일쇄 항체 단편은 단일쇄 Fv 분자(scFv)인, 방법.
144. 실시형태 141 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 힌지 도메인은 CD28, CD8, IgG1/IgG4, CD4, CD7 또는 IgD 힌지 도메인인, 방법.
145. 실시형태 144에 있어서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인인, 방법.
146. 실시형태 141 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28, CD3 제타, CD8, FcRIγ, CD4, CD7, OX40 또는 MHC(H2-Kb) 막관통 도메인을 포함하는, 방법.
147. 실시형태 146에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함하는, 방법.
148. 실시형태 142 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
149. 실시형태 148에 있어서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인인, 방법.
150. 실시형태 142 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
151. 실시형태 150에 있어서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD28 제타 세포내 신호전달 도메인인, 방법.
152. 실시형태 141 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 N-말단 리더 서열을 포함하는, 방법.
153. 실시형태 141 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 항원 인식 도메인은 N-말단 리더 서열을 포함하는, 방법.
154. 실시형태 153에 있어서, 항원 인식 도메인의 N-말단 리더 서열은 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인으로부터 절단된, 방법.
155. 실시형태 1 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질인, 방법.
156. 실시형태 155에서, 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자인, 방법.
157. 실시형태 1 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가면역질환은 1형 당뇨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심장근육병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, 크레스트(CREST) 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근염-섬유근통, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, 연소성 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합결합조직질환, 다발성경화증, 중증근무력증, 시신경 척수염, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발동맥염, 다발 연골염, 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경변증, 건선, 레이노 현상, 리플리 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 타카야수 혈관염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 또는 베게너 육아종증인, 방법.
158. 실시형태 1 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 아쿠아포린 4, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질인, 방법.
159. 실시형태 157에 있어서, 상기 자가면역질환은 다발성경화증이고, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질인, 방법.
160. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 1형 당뇨병이고, 자가항원은 인슐린, GAD-65, IA-2 또는 ZnT8인, 방법.
161. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 류마티스성 관절염이고, 자가항원은 콜라겐 II, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드 또는 HSP65인, 방법.
162. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 중증근무력증이고, 자가항원은 AChR, MuSK 또는 LRP4인, 방법.
163. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 루푸스이고, 자가항원은 히스톤 II A인, 방법.
164. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 갑상선 기능 저하증이고, 자가항원은 갑상선에서 발현되는 단백질인, 방법.
165. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 그레이브스병이고, 자가항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체인, 방법.
166. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 심상성천포창이고, 자가항원은 이중가닥 DNA인, 방법.
167. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 건선이고, 자가항원은 이중가닥 DNA인, 방법.
168. 실시형태 157에 있어서, 자가면역질환은 시신경 척수염이고, 자가항원은 아쿠아포린 4인, 방법.
169. 실시형태 1 내지 168 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하기 전에, 전구세포 집단은 환자 또는 공여자로부터 단리되고, 전구세포는 생체외에서 확장 및 유전자가 변형되어 환자에게 투여되는 세포 집단을 수득하는, 방법.
170. 실시형태 169에 있어서, 전구세포는 CD34+ HSC이고, 전구세포는 HSC 기능적 잠재력의 실질적인 손실없이 확장되는, 방법.
171. 실시형태 169 또는 170에 있어서, 환자 또는 공여자로부터 전구세포를 단리시키기 전에, 환자 또는 공여자에게는 하나 이상의 만능 조혈 세포 동원제가 투여되는, 방법.
172. 실시형태 1 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하기 전에, 내인성 만능 조혈모세포의 집단은 하나 이상의 조건화제를 환자에게 투여함으로써 환자에서 제거되는, 방법.
173. 실시형태 1 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하기 전에 하나 이상의 조건화제를 환자에게 투여함으로써 환자에서 내인성 만능 조혈모세포의 집단을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
174. 실시형태 172 또는 173에 있어서, 하나 이상의 조건화제는 비-골수파괴 조건화제인, 방법.
175. 실시형태 172 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 조건화제는 환자에서 CD34+ 세포의 집단을 고갈시키는, 방법.
176. 실시형태 175에 있어서, 고갈된 CD34+ 세포는 림프구 전구세포인, 방법.
177. 실시형태 172 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 조건화제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
178. 실시형태 177에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD117, HLA-DR, CD34, CD90, CD45 또는 CD133에 결합하는, 방법.
179. 실시형태 178에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD117에 결합하는, 방법.
180. 실시형태 177 내지 179 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독소에 접합된, 방법.
181. 실시형태 1 내지 180 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여 시, 투여되는 세포 또는 이의 자손은 CD4+CD25+ Treg 세포로 분화되는, 방법.
182. 실시형태 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 환자는 포유류이고, 세포는 포유류 세포인, 방법.
183. 실시형태 182에 있어서, 포유류는 인간이고, 세포는 인간 세포인, 방법.
184. 약제학적 조성물로서, (i) 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단으로서, 핵산 카세트가 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 상기 만능 조혈모세포의 집단, 및 (ii) 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
185. 실시형태 184에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 HSC 또는 HPC인, 약제학적 조성물.
186. 실시형태 184에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 배아 줄기세포인, 약제학적 조성물.
187. 실시형태 184에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 유도 만능 줄기세포인, 약제학적 조성물.
188. 실시형태 184에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 림프구 전구세포인, 약제학적 조성물.
189. 실시형태 184 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 CD34+ 세포인, 약제학적 조성물.
190. 실시형태 184 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입된, 약제학적 조성물.
191. 실시형태 190에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된, 약제학적 조성물.
192. 실시형태 191에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
193. 실시형태 192에 있어서, 상기 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
194. 실시형태 192에 있어서, 상기 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
195. 실시형태 191 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함하는, 약제학적 조성물.
196. 실시형태 191 내지 195 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 위형 바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
197. 실시형태 196에 있어서, 위형 바이러스 벡터는 위형 아데노바이러스, 위형 파보바이러스, 위형 코로나바이러스, 위형 랍도바이러스, 위형 파라믹소바이러스, 위형 피코르나바이러스, 위형 알파바이러스, 위형 헤르페스 바이러스, 위형 폭스바이러스 및 위형 레트로바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
198. 실시형태 197에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 위형 렌티바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
199. 실시형태 196 내지 198 중 어느 하나에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 VSV, RD114 바이러스, MLV, FeLV, VEE, HFV, WDSV, SFV, 광견병 바이러스, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, 조류 육종 바이러스 CT10 및 EIAV로부터 선택된 바이러스로부터의 외피 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
200. 실시형태 199에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 VSV-G 외피 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
201. 실시형태 184 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포는 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 폴리펩타이드로 생체외에서 형질감염된, 약제학적 조성물.
202. 실시형태 201에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 양이온성 중합체, 다이에틸아미노에틸덱스트란, 폴리에틸렌이민, 양이온성 지질, 리포솜, 인산칼슘, 활성화된 덴드리머 및/또는 자기 비드를 사용하여 형질감염된, 약제학적 조성물.
203. 실시형태 201 또는 202에서, 만능 조혈모세포는 전기천공법, 뉴클레오펙션, 스퀴즈-천공법, 초음파 천공법, 광학 형질감염, 자기주입 및/또는 임팔레펙션에 의해 형질감염된, 약제학적 조성물.
204. 실시형태 184 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 핵산 카세트는 전위요소의 일부인, 약제학적 조성물.
205. 실시형태 204에 있어서, 핵산 카세트는 만능 조혈 세포의 DNA 분자의 혼입을 위한 트랜스포사제 인식 및 절단 요소를 포함하는, 약제학적 조성물.
206. 실시형태 205에 있어서, DNA 분자는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자이고, 트랜스포사제 인식 및 절단 요소는 핵 또는 미토콘드리아 DNA 분자에의 혼입을 촉진시키는, 약제학적 조성물.
207. 실시형태 184 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 만능 조혈모세포는 세포의 게놈 내의 표적 위치에서 단일-가닥 파손 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 뉴클레아제를 세포에 전달함으로써 얻어진, 약제학적 조성물.
208. 실시형태 207에 있어서, 뉴클레아제는 세포의 게놈 내의 표적 위치에 혼성화하는 gRNA와 조합하여 세포에 전달되는, 약제학적 조성물.
209. 실시형태 207 또는 208에 있어서, 상기 뉴클레아제는 CRISPR-관련 단백질인, 약제학적 조성물.
210. 실시형태 209에 있어서, 상기 CRISPR-관련 단백질은 Cas9 또는 Cas12a인, 약제학적 조성물.
211. 실시형태 207 또는 208에 있어서, 뉴클레아제는 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제인, 약제학적 조성물.
212. 실시형태 207 내지 211 중 어느 하나에 있어서, 세포는 뉴클레아제와 접촉되지만, 세포는 추가적으로 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 접촉된, 약제학적 조성물.
213. 실시형태 212에 있어서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 촉진시키기 위해, 각각, 표적 위치에 대해 5' 및 표적 위치에 대해 3'에 위치된 핵산 서열과 충분히 유사한 핵산 서열을 갖는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함하는, 약제학적 조성물.
214. 실시형태 212 또는 213에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 세포와 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 세포에 전달되는, 약제학적 조성물.
215. 실시형태 214에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스 또는 레트로바이러스과 바이러스인, 약제학적 조성물.
216. 실시형태 215에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스인, 약제학적 조성물.
217. 실시형태 216에 있어서, 레트로바이러스과 바이러스는 렌티바이러스 벡터, 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
218. 실시형태 216 또는 217에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 레트로바이러스과 바이러스는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함하는, 약제학적 조성물.
219. 실시형태 214에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
220. 실시형태 214에 있어서, 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh74로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV인, 약제학적 조성물.
221. 실시형태 184 내지 220 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함하는, 약제학적 조성물.
222. 실시형태 221에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
223. 실시형태 222에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
224. 실시형태 223에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
225. 실시형태 224에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
226. 실시형태 221에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
227. 실시형태 226에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
228. 실시형태 227에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
229. 실시형태 228에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
230. 실시형태 221에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
231. 실시형태 230에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
232. 실시형태 231에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
233. 실시형태 232에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
234. 실시형태 221에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
235. 실시형태 234에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
236. 실시형태 235에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
237. 실시형태 236에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
238. 실시형태 221 내지 237 중 어느 하나에 있어서, Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
239. 실시형태 184 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
240. 실시형태 239에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
241. 실시형태 240에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
242. 실시형태 241에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
243. 실시형태 242에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
244. 실시형태 239에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
245. 실시형태 244에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
246. 실시형태 245에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
247. 실시형태 246에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
248. 실시형태 239에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
249. 실시형태 248에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
250. 실시형태 249에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
251. 실시형태 250에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
252. 실시형태 239에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
253. 실시형태 252에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
254. 실시형태 253에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
255. 실시형태 254에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
256. 실시형태 239 내지 255 중 어느 하나에 있어서, CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
257. 실시형태 184 내지 256 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
258. 실시형태 257에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
259. 실시형태 258에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
260. 실시형태 259에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
261. 실시형태 260에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
262. 실시형태 257에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
263. 실시형태 262에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
264. 실시형태 263에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
265. 실시형태 264에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
266. 실시형태 257에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
267. 실시형태 266에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
268. 실시형태 267에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
269. 실시형태 268에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
270. 실시형태 257에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
271. 실시형태 270에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
272. 실시형태 271에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
273. 실시형태 272에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
274. 실시형태 257 내지 273 중 어느 하나에 있어서, CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
275. 실시형태 184 내지 274 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
276. 실시형태 275에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
277. 실시형태 276에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
278. 실시형태 277에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
279. 실시형태 278에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
280. 실시형태 275에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
281. 실시형태 280에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
282. 실시형태 281에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
283. 실시형태 282에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
284. 실시형태 275에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
285. 실시형태 284에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
286. 실시형태 285에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
287. 실시형태 286에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
288. 실시형태 275에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
289. 실시형태 288에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
290. 실시형태 289에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
291. 실시형태 290에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
292. 실시형태 275 내지 291 중 어느 하나에 있어서, CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
293. 실시형태 184 내지 292 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
294. 실시형태 293에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
295. 실시형태 294에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
296. 실시형태 295에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
297. 실시형태 296에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
298. 실시형태 293에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
299. 실시형태 298에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
300. 실시형태 299에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
301. 실시형태 300에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
302. 실시형태 293에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
303. 실시형태 302에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
304. 실시형태 303에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
305. 실시형태 304에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
306. 실시형태 293에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
307. 실시형태 306에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
308. 실시형태 307에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
309. 실시형태 308에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
310. 실시형태 293 내지 309 중 어느 하나에 있어서, CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
311. 실시형태 184 내지 310 중 어느 하나에 있어서, 핵산 카세트는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된, 약제학적 조성물.
312. 실시형태 311에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 유도하는, 약제학적 조성물.
313. 실시형태 184 내지 312 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드인, 약제학적 조성물.
314. 실시형태 184 내지 313 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 CAR인, 약제학적 조성물.
315. 실시형태 314에 있어서, 키메라 항원 수용체는 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
316. 실시형태 315에 있어서, 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
317. 실시형태 315 또는 316에 있어서, 상기 항원 인식 도메인은 단일쇄 항체 단편이되, 선택적으로 상기 단일쇄 항체 단편은 scFv인, 약제학적 조성물.
318. 실시형태 315 내지 317 중 어느 하나에 있어서, 힌지 도메인은 CD28, CD8, IgG1/IgG4, CD4, CD7 또는 IgD 힌지 도메인인, 약제학적 조성물.
319. 실시형태 318에 있어서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인인, 약제학적 조성물.
320. 실시형태 315 내지 319 중 어느 하나에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28, CD3 제타, CD8, FcRIγ, CD4, CD7, OX40 또는 MHC(H2-Kb) 막관통 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
321. 실시형태 320에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
322. 실시형태 316 내지 321 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
323. 실시형태 322에 있어서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인인, 약제학적 조성물.
324. 실시형태 316 내지 323 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
325. 실시형태 324에 있어서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD28 제타 세포내 신호전달 도메인인, 약제학적 조성물.
326. 실시형태 315 내지 325 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 N-말단 리더 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
327. 실시형태 315 내지 326 중 어느 하나에 있어서, 항원 인식 도메인은 N-말단 리더 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
328. 실시형태 327에 있어서, 항원 인식 도메인의 N-말단 리더 서열은 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인으로부터 절단된, 약제학적 조성물.
329. 실시형태 184 내지 312 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질인, 약제학적 조성물.
330. 실시형태 329에서, 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자인, 약제학적 조성물.
331. 실시형태 184 내지 330 중 어느 하나에 있어서, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질인, 약제학적 조성물.
332. 실시형태 184 내지 331 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 포함하는 키트로서, 키트의 사용자에게 약제학적 조성물을 자가면역질환을 갖는 인간 환자에게 투여하도록 지시하는 포장 삽입물을 더 포함하는, 키트.
333. 실시형태 332에 있어서, 상기 포장 삽입물은 키트의 사용자에게 실시형태 1 내지 183 중 어느 하나의 방법을 수행하도록 지시하는, 키트.
334. 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트로서, CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인(즉, 구체적으로는 Treg 계통의 세포에서 활성이고 다른 세포 유형(예를 들어, 다른 조혈 세포)에서는 활성이 아닌) 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 핵산 카세트.
335. 실시형태 334에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함하는, 핵산 카세트.
336. 실시형태 335에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
337. 실시형태 336에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
338. 실시형태 337에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
339. 실시형태 338에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
340. 실시형태 335에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
341. 실시형태 340에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
342. 실시형태 341에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
343. 실시형태 342에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
344. 실시형태 335에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
345. 실시형태 344에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
346. 실시형태 345에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
347. 실시형태 346에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
348. 실시형태 335에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
349. 실시형태 348에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
350. 실시형태 349에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
351. 실시형태 350에 있어서, Foxp3 프로모터는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
352. 실시형태 335 내지 351 중 어느 하나에 있어서, Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
353. 실시형태 334 내지 352 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
354. 실시형태 353에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
355. 실시형태 354에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
356. 실시형태 355에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
357. 실시형태 356에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
358. 실시형태 353에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
359. 실시형태 358에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
360. 실시형태 359에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
361. 실시형태 360에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
362. 실시형태 353에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
363. 실시형태 362에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
364. 실시형태 363에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
365. 실시형태 364에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
366. 실시형태 353에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
367. 실시형태 366에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
368. 실시형태 367에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
369. 실시형태 368에 있어서, CNS1 인핸서는 서열번호 8의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
370. 실시형태 353 내지 369 중 어느 하나에 있어서, CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
371. 실시형태 334 내지 370 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
372. 실시형태 371에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
373. 실시형태 372에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
374. 실시형태 373에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
375. 실시형태 374에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
376. 실시형태 371에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
377. 실시형태 376에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
378. 실시형태 377에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
379. 실시형태 378에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 10의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
380. 실시형태 371에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
381. 실시형태 380에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
382. 실시형태 381에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
383. 실시형태 382에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
384. 실시형태 371에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
385. 실시형태 384에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
386. 실시형태 385에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
387. 실시형태 386에 있어서, CNS2 인핸서는 서열번호 12의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
388. 실시형태 371 내지 387 중 어느 하나에 있어서, CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
389. 실시형태 334 내지 388 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
390. 실시형태 389에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
391. 실시형태 390에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
392. 실시형태 391에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
393. 실시형태 392에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 13의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
394. 실시형태 389에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
395. 실시형태 394에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
396. 실시형태 395에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
397. 실시형태 396에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 14의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
398. 실시형태 389에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
399. 실시형태 398에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
400. 실시형태 399에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
401. 실시형태 400에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 15의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
402. 실시형태 389에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
403. 실시형태 402에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
404. 실시형태 403에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
405. 실시형태 404에 있어서, CNS3 인핸서는 서열번호 16의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
406. 실시형태 389 내지 405 중 어느 하나에 있어서, CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
407. 실시형태 334 내지 406 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
408. 실시형태 407에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
409. 실시형태 408에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
410. 실시형태 409에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
411. 실시형태 410에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 17의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
412. 실시형태 407에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
413. 실시형태 412에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
414. 실시형태 413에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
415. 실시형태 414에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 18의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
416. 실시형태 407에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
417. 실시형태 416에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
418. 실시형태 417에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
419. 실시형태 418에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 19의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
420. 실시형태 407에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
421. 실시형태 420에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
422. 실시형태 421에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 갖되, 선택적으로 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열과 적어도 96% 동일한, 97% 동일한, 98% 동일한, 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
423. 실시형태 422에 있어서, CNS0 인핸서는 서열번호 20의 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
424. 실시형태 407 내지 423 중 어느 하나에 있어서, CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
425. 실시형태 334 내지 424 중 어느 하나에 있어서, 핵산 카세트는 리보스위치에 작동 가능하게 연결된, 핵산 카세트.
426. 실시형태 425에서, 리보스위치에 대한 리간드의 결합은 핵산 카세트의 발현을 유도하는, 핵산 카세트.
427. 실시형태 334 내지 426 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드인, 핵산 카세트.
428. 실시형태 334 내지 427 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 CAR인, 핵산 카세트.
429. 실시형태 428에 있어서, 키메라 항원 수용체는 항원 인식 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인을 포함하는, 핵산 카세트.
430. 실시형태 429에 있어서, 하나 이상의 세포외 신호전달 도메인은 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 핵산 카세트.
431. 실시형태 429 또는 430에 있어서, 상기 항원 인식 도메인은 단일쇄 항체 단편이되, 선택적으로 상기 단일쇄 항체 단편은 scFv인, 핵산 카세트.
432. 실시형태 429 내지 431 중 어느 하나에 있어서, 힌지 도메인은 CD28, CD8, IgG1/IgG4, CD4, CD7 또는 IgD 힌지 도메인인, 핵산 카세트.
433. 실시형태 432에 있어서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인인, 핵산 카세트.
434. 실시형태 429 내지 433 중 어느 하나에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28, CD3 제타, CD8, FcRIγ, CD4, CD7, OX40 또는 MHC(H2-Kb) 막관통 도메인을 포함하는, 핵산 카세트.
435. 실시형태 434에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함하는, 핵산 카세트.
436. 실시형태 430 내지 435 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), CD66d, DAP10 및 DAP12 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 카세트.
437. 실시형태 436에 있어서, 하나 이상의 1차 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인인, 핵산 카세트.
438. 실시형태 430 내지 437 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, CD83, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 카세트.
439. 실시형태 438에 있어서, 하나 이상의 공자극 세포내 신호전달 도메인 중 적어도 하나는 CD28 제타 세포내 신호전달 도메인인, 핵산 카세트.
440. 실시형태 429 내지 439 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 N-말단 리더 서열을 포함하는, 핵산 카세트.
441. 실시형태 429 내지 440 중 어느 하나에 있어서, 항원 인식 도메인은 N-말단 리더 서열을 포함하는, 핵산 카세트.
442. 실시형태 441에 있어서, 항원 인식 도메인의 N-말단 리더 서열은 세포막에 대한 키메라 항원 수용체의 세포 가공 및 국재화 동안 항원 인식 도메인으로부터 절단된, 핵산 카세트.
443. 실시형태 334 내지 426 중 어느 하나에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질인, 핵산 카세트.
444. 실시형태 443에서, 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자인, 핵산 카세트.
445. 실시형태 334 내지 444 중 어느 하나에 있어서, 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질인, 핵산 카세트.
446. 실시형태 334 내지 445 중 어느 하나의 핵산 카세트를 포함하는, 바이러스 벡터.
447. 실시형태 446에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 코로나바이러스, 랍도바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된, 바이러스 벡터.
448. 실시형태 447에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스과 바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
449. 실시형태 448에 있어서, 상기 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
450. 실시형태 448에 있어서, 상기 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 알파레트로바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
451. 실시형태 447 내지 450 중 어느 하나에 있어서, 레트로바이러스과 바이러스 벡터는 중심 폴리퓨린관, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절요소, 5'-LTR, HIV 신호 서열, HIV Psi 신호 5'-스플라이스 부위, 델타-GAG 요소, 3'-스플라이스 부위 및 3'-자기 비활성화 LTR을 포함하는, 바이러스 벡터.
452. 실시형태 447 내지 451 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 위형 바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
453. 실시형태 452에 있어서, 위형 바이러스 벡터는 위형 아데노바이러스, 위형 파보바이러스, 위형 코로나바이러스, 위형 랍도바이러스, 위형 파라믹소바이러스, 위형 피코르나바이러스, 위형 알파바이러스, 위형 헤르페스 바이러스, 위형 폭스바이러스 및 위형 레트로바이러스과 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터.
454. 실시형태 453에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 위형 렌티바이러스 벡터인, 바이러스 벡터.
455. 실시형태 452 내지 454 중 어느 하나에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 VSV, RD114 바이러스, MLV, FeLV, VEE, HFV, WDSV, SFV, 광견병 바이러스, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, 조류 육종 바이러스 CT10 및 EIAV로부터 선택된 바이러스로부터의 외피 단백질을 포함하는, 바이러스 벡터.
456. 실시형태 455에 있어서, 상기 위형 바이러스 벡터는 VSV-G 외피 단백질을 포함하는, 바이러스 벡터.
기타 실시형태
기재된 개시내용의 다양한 변형 및 변화는 개시내용의 범주 및 사상으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에게 자명하게 될 것이다. 본 개시내용은 구체적 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 특허청구된 본 개시내용은 이러한 구체적 실시형태로 과도하게 제한되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 당업자에게 분명한 본 개시내용을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 본 개시내용의 범주 내인 것으로 의도된다.
기타 실시형태는 청구범위에 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (117)

  1. 자가면역질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 자가면역질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포(pluripotent hematopoietic cell)의 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
  2. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자의 자가반응성 효과기 면역 세포 집단의 활성 및/또는 증식을 억제하는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
  3. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자의 자가반응성 효과기 면역 세포의 세포자멸사를 유도하는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
  4. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자에서 자가면역질환으로부터 내인성 조직을 보호하는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
  5. 자가면역질환을 갖는 것으로 진단된 환자의 염증을 감소시키는 방법으로서, 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 카세트는 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell: HSC) 또는 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell: HPC)인, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 배아 줄기세포인, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 유도 만능 줄기세포인, 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 림프구 전구세포인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 CD34+ 세포인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포의 집단은 상기 환자에게 전신 투여되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포의 집단은 정맥내 주사에 의해 상기 환자에게 투여되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 환자에 대해 자가유래인, 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 환자에 대해 동종이계인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 환자와 HLA-매칭되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산 카세트를 포함하는 폴리펩타이드로 생체외에서 형질감염되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 세포의 게놈 내의 표적 위치에서 단일-가닥 파손 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 뉴클레아제를 상기 세포에 전달함으로써 얻어진, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 상기 세포의 게놈 내의 상기 표적 위치에 혼성화하는 가이드 RNA(gRNA)와 조합하여 상기 세포에 전달되는, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 일정한 간격으로 놓인 짧은 회문구조 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR)-관련 단백질인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 CRISPR-관련 단백질은 CRISPR-관련 단백질 9(Cas9) 또는 CRISPR-관련 단백질 12a(Cas12a)인, 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 뉴클레아제와 접촉되지만, 상기 세포는 추가적으로 상기 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산 카세트를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 접촉되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 주형 폴리뉴클레오타이드는, 상동성 재조합을 촉진시키기 위해, 각각, 상기 표적 위치에 대해 5' 및 상기 표적 위치에 대해 3'에 위치된 상기 핵산 서열과 충분히 유사한 핵산 서열을 갖는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포와 상기 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 상기 세포에 전달되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드인, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)인, 방법.
  42. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자인, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 1형 당뇨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 베체트병, 수포성 유천포창, 심장근육병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, 크레스트(CREST) 증후군, 한랭 응집소병, 크론병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근염-섬유근통, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 저하증, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, 연소성 관절염, 편평태선, 루푸스, 메니에르병, 혼합결합조직질환, 다발성경화증, 중증근무력증, 시신경 척수염, 심상성천포창, 악성빈혈, 결절성다발동맥염, 다발 연골염, 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경변증, 건선, 레이노 현상, 리플리 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 증후군, 타카야수 혈관염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 또는 베게너 육아종증인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 아쿠아포린 4(aquaporin 4), 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질인, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 다발성경화증이고, 상기 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질인, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 1형 당뇨병이고, 상기 자가항원은 인슐린, GAD-65, IA-2 또는 ZnT8인, 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염이고, 상기 자가항원은 콜라겐 II, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드 또는 HSP65인, 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 중증근무력증이고, 상기 자가항원은 AChR, MuSK 또는 LRP4인, 방법.
  50. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 루푸스이고, 상기 자가항원은 히스톤 II A인, 방법.
  51. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 갑상선 기능 저하증이고, 상기 자가항원은 갑상선에서 발현되는 단백질인, 방법.
  52. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 그레이브스병이고, 상기 자가항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체인, 방법.
  53. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 심상성천포창이고, 상기 자가항원은 이중가닥 DNA인, 방법.
  54. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 건선이고, 상기 자가항원은 이중가닥 DNA인, 방법.
  55. 제44항에 있어서, 상기 자가면역질환은 시신경 척수염이고, 상기 자가항원은 아쿠아포린 4인, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포의 집단을 상기 환자에게 투여 시, 투여되는 상기 세포 또는 이의 자손은 CD4+CD25+ Treg 세포로 분화되는, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 포유류이고, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 포유류는 인간이고, 상기 세포는 인간 세포인, 방법.
  59. 약제학적 조성물로서, (i) 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 만능 조혈모세포의 집단으로서, 상기 핵산 카세트가 CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 상기 만능 조혈모세포의 집단, 및 (ii) 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 HSC 또는 HPC인, 약제학적 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 배아 줄기세포인, 약제학적 조성물.
  62. 제59항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 유도 만능 줄기세포인, 약제학적 조성물.
  63. 제59항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 림프구 전구세포인, 약제학적 조성물.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 CD34+ 세포인, 약제학적 조성물.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입된, 약제학적 조성물.
  66. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산 카세트를 포함하는 폴리펩타이드로 생체외에서 형질감염된, 약제학적 조성물.
  67. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 조혈모세포는 상기 세포의 게놈 내의 표적 위치에서 단일-가닥 파손 또는 이중-가닥 파손을 촉매하는 뉴클레아제를 상기 세포에 전달함으로써 얻어진, 약제학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 상기 세포의 게놈 내의 상기 표적 위치에 혼성화하는 gRNA와 조합하여 상기 세포에 전달되는, 약제학적 조성물.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 CRISPR-관련 단백질인, 약제학적 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 CRISPR-관련 단백질은 Cas9 또는 Cas12a인, 약제학적 조성물.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 뉴클레아제와 접촉되지만, 상기 세포는 추가적으로 상기 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산 카세트를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 접촉된, 약제학적 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 주형 폴리뉴클레오타이드는, 상동성 재조합을 촉진시키기 위해, 각각, 상기 표적 위치에 대해 5' 및 상기 표적 위치에 대해 3'에 위치된 상기 핵산 서열과 충분히 유사한 핵산 서열을 갖는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함하는, 약제학적 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포와 상기 뉴클레아제, gRNA 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 바이러스 벡터를 접촉시킴으로써 상기 세포에 전달되는, 약제학적 조성물.
  74. 제59항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함하는, 약제학적 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  77. 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  80. 제59항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  83. 제59항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  86. 제59항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함하는, 약제학적 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  89. 제59항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드인, 약제학적 조성물.
  90. 제59항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 CAR인, 약제학적 조성물.
  91. 제59항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질인, 약제학적 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자인, 약제학적 조성물.
  93. 제59항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질인, 약제학적 조성물.
  94. 제59항 내지 제93항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트로서, 상기 키트의 사용자에게 상기 약제학적 조성물을 자가면역질환을 갖는 인간 환자에게 투여하도록 지시하는 포장 삽입물을 더 포함하는, 키트.
  95. 제94항에 있어서, 상기 포장 삽입물은 키트의 사용자에게 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 지시하는, 키트.
  96. 자가항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 카세트로서, CD4+CD25+ Treg 세포에서 활성인 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 핵산 카세트.
  97. 제96항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 Foxp3 프로모터를 포함하는, 핵산 카세트.
  98. 제97항에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 Foxp3 프로모터는 전사인자 Nr4a 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
  100. 제96항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS1 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
  101. 제100항에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 상기 CNS1 인핸서는 전사인자 AP-1, NFAT, Smad3 및/또는 Foxo에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
  103. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS2 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
  104. 제103항에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 상기 CNS2 인핸서는 전사인자 Runx, Foxp3, Ets-1, CREB, Stat5, NFAT 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
  106. 제96항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS3 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
  107. 제106항에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 상기 CNS3 인핸서는 전사인자 Foxo 및/또는 c-Rel에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
  109. 제96항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 계통-특이적 전사 조절 요소는 CNS0 인핸서를 포함하는, 핵산 카세트.
  110. 제109항에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 갖는, 핵산 카세트.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 CNS0 인핸서는 전사인자 Satb1 및/또는 Stat5에 특이적으로 결합하는, 핵산 카세트.
  112. 제96항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 단일쇄 폴리펩타이드인, 핵산 카세트.
  113. 제96항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 CAR인, 핵산 카세트.
  114. 제96항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 다중쇄 단백질인, 핵산 카세트.
  115. 제114항에 있어서, 상기 자가항원-결합 단백질은 전장 항체, 이중-가변 면역글로불린 도메인, 다이어바디, 트라이어바디, 항체-유사 단백질 스캐폴드, Fab 단편 또는 F(ab')2 분자인, 핵산 카세트.
  116. 제96항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 액틴, 튜불린, 미오신, 트로포미오신, 비멘틴, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 헤파린, 라미닌, 콜라게나제, 카디오리핀, 글루코세레브로사이드, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤, 엔올라제, 알돌라제, 산 포스파타제, 아넥신 33kDa, 아넥신 67kDa, 사이토크롬 P450C, 카탈라제, 퍼옥시다제, 타이로시나제, 리보뉴클레아제, 히스톤 II A, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 트랜스페린, 페투인, 인자 II, 인자 VII, 피브린, 피브리노겐, C1, C1q, 인터류킨 2, 인터류킨 10, 인터류킨 4, 인터페론-γ, TNFαR, HSP60, HSP65, GAD, 인슐린, IA-2, ZnT8, MBP, AchR, 미오글로불린, 티로글로불린, 헤모글로빈 A, 스펙트린, TB PPD, LPS, MuSK, LRP4, 면역글로불린의 Fc 부분, 시트룰린화된 펩타이드, 카바밀화된 펩타이드, 갑상선 자극 호르몬 수용체 또는 갑상선에서 발현되는 단백질인, 핵산 카세트.
  117. 제96항 내지 제116항 중 어느 한 항의 핵산 카세트를 포함하는, 바이러스 벡터.
KR1020247011602A 2021-09-08 2022-09-08 자가면역질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법 KR20240100489A (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/241,836 2021-09-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240100489A true KR20240100489A (ko) 2024-07-01

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11084880B2 (en) Anti-BCMA chimeric antigen receptor
AU2017295886B2 (en) Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
EP3443096B1 (en) Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
EP3194443B1 (en) Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US20230140802A1 (en) Novel platforms for co-stimulation, novel car designs and other enhancements for adoptive cellular therapy
TW202016139A (zh) Bcma 嵌合抗原受體及其用途
JP2017535261A (ja) Ｃａｒｔ細胞における遺伝子発現の改変およびその使用
JP2024503027A (ja) Ｃｄ８標的ウイルスベクターの使用方法
US20230257773A1 (en) Cd8-specific antibody constructs and compositions thereof
KR20200090151A (ko) 신규한 항-ｈｌａ-ａ2 항체 및 이의 용도
AU2022341119A1 (en) Compositions and methods for treating or preventing autoimmune diseases
KR20240100489A (ko) 자가면역질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법
CA3219352A1 (en) Hypoimmunogenic rhd negative primary t cells
CA3217914A1 (en) Chimeric antigen receptors with mage-a4 specificity and uses thereof
US20230330185A1 (en) Methods and compositions for transducing hematopoietic stem and progenitor cells in vivo
CA3231618A1 (en) Interleukin-9 signaling in chimeric antigen receptor (car) immune cells
WO2023150518A1 (en) Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
KR20230148837A (ko) Ror1 표적화 키메라 항원 수용체
WO2023164646A2 (en) Methods and compositions for treating cancer
CN117098849A (zh) 靶向cd8的病毒载体的用途
Leonard Ex vivo manipulation of CD8 T cells to improve adoptive cell therapy against cancer
Berinstein The Development Of A Novel Chimeric Antigen Receptor Specific For Syndecan-1