KR20240094339A - 병원 내 2차 감염을 감소시키기 위한 혈액관류장치 - Google Patents
병원 내 2차 감염을 감소시키기 위한 혈액관류장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈액관류장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-mTFP 항체를 포함하여 mtfP를 제거함으로써 상기 mtFP와 PMN 막의 포르밀 펩티드 수용체 1(formyl peptide receptor1; FPR1)의 결합을 차단할 수 있으며, 호중구(polymorphonuclear leukocytes; PMN)의 화학 주성(chemotaxis)을 회복시킴으로써 병원 내 2차 감염의 발생을 억제할 수 있는 혈액관류장치에 관한 것이다.
본 발명은 급성기가 지난 후 회복 중인 패혈증 환자의 임상 경과를 호전시킴으로써 후기 사망을 줄이고 장기 생존을 향상시킬 수 있으며, 중증 외상 환자, 장기 이식 환자, 심정지 후 생존 환자 등 장기간의 중환자실 또는 병실에서의 입원 치료가 필요한 환자들의 병원 내 2차 감염의 발생을 억제함으로써 장기 생존을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 급성기가 지난 후 회복 중인 패혈증 환자의 임상 경과를 호전시킴으로써 후기 사망을 줄이고 장기 생존을 향상시킬 수 있으며, 중증 외상 환자, 장기 이식 환자, 심정지 후 생존 환자 등 장기간의 중환자실 또는 병실에서의 입원 치료가 필요한 환자들의 병원 내 2차 감염의 발생을 억제함으로써 장기 생존을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 혈액관류장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-mTFP 항체를 포함하여 mtfP를 제거함으로써 상기 mtFP와 PMN 막의 포르밀 펩티드 수용체 1(formyl peptide receptor1; FPR1)의 결합을 차단할 수 있으며, 호중구(polymorphonuclear leukocytes; PMN)의 화학 주성(chemotaxis)을 회복시킴으로써 병원 내 2차 감염의 발생을 억제할 수 있는 혈액관류장치에 관한 것이다.
면역 마비는 2차 감염에 대한 감수성을 증가시켜 초기 과염증 단계에서 살아남은 패혈성 쇼크 환자의 임상 결과를 악화시킨다. 2차 감염 부위로의 호중구(polymorphonuclear leukocytes; PMN) 이동(chemotaxis)은 패혈성 쇼크 환자의 2차 침습 감염으로의 진행을 예방하는 데 중요하다. 패혈성 쇼크 동안 다기관 손상은 주로 전신 염증으로 인해 발생하고, 이차적으로는 조직 관류저하로 인해 미토콘드리아 N-포르밀 펩티드(mitochontrial N-formyl peptide; mtFP)가 순환계로 방출된다. 순환하는 mtFP는 PMN 막의 포르밀 펩티드 수용체 1(formyl peptide receptor1; FPR1)에 결합한다. 이 결합은 FPR1(homologous internalization) 및 다른 케모카인 수용체(heterologous internalization)를 세포질 내로 내재화하고, FPR1이 새로 합성된 세균 펩타이드와 결합하는 것을 차단한다. 또한, 다른 케모카인 수용체와 새로 방출된 케모카인의 결합을 차단하며, 감염 부위로의 PMN 화학 주성(chemotaxis)을 이차적으로 억제한다. FPR1-mtFP 복합체의 내재화 후, mtFP는 엔도솜 구획에서 제거되고, FPR1은 PMN 막으로 빠르게 재순환되거나 리소좀에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 이전 연구에서 순환하는 mtFP 수준의 증가가 패혈성 쇼크에서 회복하는 환자의 2차 감염의 발병 및 90일 사망률과 독립적으로 관련이 있으며, 2차 감염에 대한 감수성 증가는 주로 FPR1 매개 PMN 화학 주성의 억제에 기인한다는 것을 확인하였고, 순환하는 mtFP가 PMN의 살균 활성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
나아가, 본 발명자들은 FPR1 차단이 비-FPR1 케모카인 수용체의 이종 내재화를 방지함으로써 PMN 막의 다른 케모카인 수용체를 보존할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 패혈성 쇼크 환자에서 FPR1 차단은 2차 감염 부위에 대한 PMN 화학주성을 구제(chemotaxis rescue)하는 효과적인 치료법이 아닐 수 있다. 기존 연구에서는 중증외상환자의 급성기 치료가 종료된 후 발생하는 병원 내 2차 감염을 감소시키기 위해 FPR1의 mtFP 결합 부위를 차단하는 길항제를 투여함으로써 FPR1의 활성을 포기하는 대신 타 화학 주성 수용체들의 세포 내 이동을 억제함으로써 2차 세균 감염 부위로의 중성구(neutrophil, PMN)의 이동을 유지하고자 하는 노력들이 있었다. 그러나, 패혈증 환자의 경우 전신 혈중 케모카인의 농도가 상대적으로 높아 2차 세균 감염 부위의 케모카인 농도와 전신 케모카인 농도의 차이가 크지 않아 FPR1 길항제의 사용 효과가 떨어진다. 실제로 이전 연구에서 혈장 케모카인 수준은 패혈성 쇼크가 있는 환자의 입원 시뿐만 아니라 패혈성 쇼크에서 회복된 환자의 2차 감염 발병 시점에서도 건강한 자원자보다 유의하게 높았다. 외상 환자와 달리 패혈성 쇼크에서 회복중인 환자의 경우 순환계에서 이차 감염 부위로의 케모카인 구배가 PMN 화학주성을 유도하기에 충분하지 않을 수 있다. 이러한 상황에서, 새로 합성된 세균 펩티드에 대한 포르밀 펩티드 수용체 1(FPR1) 매개 화학 주성은 이차 감염 부위로의 PMN 이동의 상당 부분을 담당할 것이다.
이에, 본 발명자들은 패혈성 쇼크에서 회복된 환자에서 PMN 화학 주성을 구제하고 2차 감염의 발병을 예방하기 위한 기술을 개발하기 위해 예의노력한 결과, 새로 합성된 세균 펩타이드에 결합할 수 있는 FPR1이 PMN 막에 최대한 보존되어야 하므로 항체를 통해 혈중 mtFP 자체를 제거함으로써 중성구 표면에 재발현된 FPR1에 대한 mtFP의 재결합을 차단하고, 중성구의 FPR1 매개 2차 세균 감염 부위로의 화학 주성(chemotaxis)를 회복시킴으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 병원 내 2차 감염을 감소시키기 위한 혈액관류장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 측면에서 본 발명은 혈액을 장치 내부로 흐르게 하는 혈액 유입부; 항-mTFP 항체(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)를 포함하는 흡착 매체; 및 혈액을 장치 외부로 흐르게 하는 혈액 유출부;를 포함하는 혈액관류장치를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치는 병원 내 2차 감염의 발생을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치의 대상 개체는 패혈증 환자, 패혈성 쇼크 환자, 중증외상환자, 장기 이식 환자, 출혈성 쇼크 환자, 심근경색 환자, 심인성 쇼크 환자, 뇌졸중 환자 및 심정지 후 생존 환자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 mtFP는 mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치는 산소, 혈액-항응고제 및 leukotriene B4(LTB4)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 leukotriene B4 (LTB4)는 10 ~ 100 pg/mL의 농도로 포함 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-mtFP 항체를 0.5 μg/mL ~ 20.0 μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 흡착 매체는 그 표면에 항-mTFP 항체가 부착 또는 코팅된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 흡착매체는 섬유 형태(fiber form), 비드 형태(bead form), 필름 형태(film form) 및 유공 섬유형태(hollow-fiber form)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 2차 감염 부위로의 중성구(neutrophil, PMN) 화학 주성(chemotaxis)을 회복시킴으로써 2차 감염된 세균에 대한 상기 중성구의 살균 효과로 전신적인 2차 감염의 진행을 억제할 수 있으며, 이는 급성기가 지난 후 회복 중인 패혈증 환자의 임상 경과를 호전시킴으로써 후기 사망을 줄이고 장기 생존을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 손상된 조직으로부터 mtFP들이 혈중으로 유리될 수 있는 병태 생리를 가지고 있는 질환에서 급성기 치료가 종료된 후 병원 내 2차 감염이 발생할 수 있는 경우 모두 적용이 가능하다는 장점이 있다. 특히, 중증 외상 환자, 장기 이식 환자, 심정지 후 생존 환자 등 장기간의 중환자실 또는 병실에서의 입원 치료가 필요한 환자들의 병원 내 2차 감염의 발생을 억제함으로써 장기 생존을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 개요에 관한 것이다. 도 1에서 패혈증 환자에서 말초순환장애로 인해 손상된 조직 또는 감염원에 의해 자극된 PBMC로부터 혈중으로 유리된 mitochondrial damage-associated molecular patterns (mtDAMPs)에서 특이 항체들을 이용하여 혈중 mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1)를 선택적으로 제거하면, 중성구 내에서 재활용되어 중성구 표면으로 재발현된 FPR1에 대한 상기 mtFP의 결합을 차단함으로써 mtDAMPs에 노출된 중성구의 chemotaxis를 회복시켜 급성기 이후 회복중인 패혈증 환자들에서의 2차적인 병원 내 감염의 발생을 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 혈액 관류 장치에 관한 것이다. Mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1) 에 특이적인 anti-mtFP 항체(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)를 포함한 혈액관류 장치로의 체외 혈액 관류를 통한 표적 물질의 제거가 가능하다. anti-mtFP 항체를 포함한 혈액관류 장비는 fiber form, bead form, film form, hollow-fiber form 등을 포함하며 그 외에도 다양한 형태의 혈액관류 채널의 혈액접촉 부위에 anti-mtFP 항체를 부착 또는 코팅하는 경우를 모두 포함할 수 있다.
도 3은 유동 세포 계측법(flow cytometry)에 의해 결정된 분리된 인간 호중구(다형핵 세포, PMN)의 순도에 관한 것이다. 세 번의 독립적인 실험에서 분리된 PMN의 평균 순도는 97.53 ± 0.55%(표준 편차)였다.
도 4는 포르밀 펩티드 수용체 1(FPR1) 작용제 및 길항제에 관한 것이다. 도 4a는 100nM의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 탈수소효소 서브유닛-6(ND6) 및 100nM의 N-포르밀-메티오닌-류신-페닐알라닌(fMLF) 즉, FPR1 작용제에 의해 자극된 PMN 칼슘 동원에 관한 것이다. PMN 칼슘 동원은 FPR1 길항제(10μM의 사이클로스포린 H, CsH) 전처리를 통해 억제된다. 도 4b는 소포체(ER) 칼슘 고갈의 150초 동안 곡선 아래 면적((AUC150) 및 100초 칼슘 유입(AUC100)에 대한 area under the curve (AUC)에 관한 것이다. ND6 및 fMLF는 ER 칼슘 고갈 및 그에 따른 칼슘 유입을 유도하는 데 유사한 효능을 보였지만 둘 다 ND6 및 fMLF 처리 1분 전에 투여한 10 μM CsH 전처리에 의해 완전히 억제되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 5는 포르밀 펩티드 수용체 1(FPR1)-매개 칼슘 동원 및 호중구(다형핵 세포, PMN) 주화성에 관한 것이다. 도 5a는 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit-6 (ND6) 및 후속 N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine (fMLF)에 의해 자극되는 PMN 칼슘 동원에 관한 것이다. 도 5b는 소포체(ER) 칼슘 고갈의 150초 동안 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하여 각각 ND6(AUC150 1차) 및 fMLF(AUC150 2차)에 의해 자극된 ER 칼슘 고갈량을 정량화한 것이다. 칼슘 유입량을 정량화하기 위해 100초 동안의 AUC(AUC100)를 계산하였다. 도 5c는 fMLF에 대한 반응으로 ND6로 처리된 PMN의 주화성에 관한 것이다. 처리되지 않은 PMN(tx 없음)에 0.1% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하였다. PMN 주화성에서 FPR1의 역할을 결정하기 위해 PMN 이동을 위한 배양 15분 전에 10 μM의 cyclosporine H(CsH)를 전처리하였다. ND6 처리는 ER 칼슘 고갈을 유도하였지만, fMLF에 의해 자극된 2차 ER 칼슘 고갈 및 그에 따른 칼슘 유입을 용량 의존적으로 억제하였다. PMN에 대한 ND6 처리는 또한 용량 의존적으로 fMLF에 대한 반응으로 PMN 주화성을 억제하였다. 상기 결과는 ND6에 의한 FPR1 점유 후 fMLF가 나머지 FPR1에 결합하여 칼슘 유입 및 PMN 주화성을 유발함을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 6은 FPR1 매개 ER 칼슘 고갈의 총량에 관한 것이다. 150초 동안 100nM, 10nM, 5nM, 0nM ND6 자극(AUC150 1차) 및 후속 100nM fMLF 자극(AUC150 2차)에 대한 반응에서의 ER 칼슘 고갈의 합은 실험군 간에 차이가 없었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 7은 순환하는 ND6의 원심 제거 후 PMN 주화성의 구조에 관한 것이다. 도 7a는 원심분리 ND6 제거 후 30분, 60분 및 90분 후 PMN 칼슘 동원의 변화에 관한 것이다. 30분의 ND6 노출 후, PMN을 원심분리하고 상등액을 버렸다. 그런 다음, PMN 펠릿을 0.1% DMSO 함유 배지(ND6-DMSO 그룹) 또는 ND6 함유 배지(ND6-ND6 그룹)에 재현탁시켰다. 도 7b는 ER 칼슘 고갈의 150초 동안의 AUC(AUC150) 및 칼슘 유입의 100초 동안의 AUC(AUC100)에 관한 것이다. ND6 제거 30분 후, ER 칼슘 고갈이 완전히 회복되었다. ER 칼슘 고갈과는 달리, 칼슘 유입은 30분 및 60분 후에 여전히 억제되었지만, ND6 제거 90분 후에 완전히 회복되었다. 도 7c는 원심분리 ND6 제거 후 30분 및 90분 후 PMN 주화성의 변화에 관한 것이다. 30분 및 90분에서의 PMN 주화성은 각각 30분에서 90분 및 90분에서 150분까지 60분 배양 동안 이동된 PMN의 수로 측정하였다. 또 다른 그룹의 PMN은 FPR1-매개 PMN 주화성의 용량을 추정하기 위해 배양 15분 전에 10 μM의 CsH로 처리하였다. 칼슘 유입과 일치하게, fMLF에 대한 PMN 주화성은 ND6 제거 후 30분 후에 억제되었지만 ND6 제거 후 90분 후에 완전히 회복되었다. 도 7d는 PMN 막에서 FPR1을 검출하는 유동 세포 계측법의 대표적인 수치에 관한 것이다. 도 7e는 유세포 분석의 평균 형광 강도(MFI)에 관한 것이다. PMN 막의 FPR1 발현은 ND6 제거 30분 후에 완전히 회복되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 8은 PMN 주화성과 칼슘 동원 단계 사이의 상관관계에 관한 것이다. 도 8a는 ND6 및 fMLF에 의해 순차적으로 자극된 PMN에서 PMN 주화성과 칼슘 동원 단계 사이의 상관관계에 관한 것이다. Spearman의 상관 계수(r)를 사용하여 상관 관계를 분석하였다. PMN 주화성은 fMLF로 유발된 ER 칼슘 고갈(AUC150 2차) 및 후속 칼슘 유입(AUC100)과 직접적으로 관련이 있었지만, ND6로 유발된 ER 칼슘 고갈(AUC150 1차)과는 반비례 관계가 있었다. 도 8b는 ND6 노출 30분 후(following 30-minutes ND6 exposure) ND6 제거 30분 후(30 minutes after ND6 removal) PMN의 상관관계에 관한 것이다. FPR1 발현(MFI)은 ER 칼슘 고갈(AUC150)과 상관관계가 있었지만 칼슘 유입(AUC100) 및 주화성과는 상관관계가 없었다. 도 8c는 ND6 노출 30분 후(following 30-minutes ND6 exposure) ND6 제거 90분 후(90 minutes after ND6 removal) PMN의 상관관계에 관한 것이다. FPR1 발현, ER 칼슘 고갈, 칼슘 유입 및 화학주성은 서로 상관관계가 있었다. 상기 결과는 재활용된 FPR1이 순환 mtFP 제거 직후 PMN 막에 재배치되었지만 ER 칼슘 고갈에서 칼슘 유입으로의 경로를 조절하는 간섭 분자로 인해 칼슘 유입 회복이 지연되었음을 나타낸다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 9는 직접적인 항-ND6 항체 처리 후 혈장 ND6 수준의 변화에 관한 것이다. 혈장에 대한 직접적인 항-ND6 항체 처리는 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 혈장의 ND6 수치를 변화시키지 않았다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 10은 단백질 A/세파로스와 미토콘드리아 N-포르밀 펩티드(mtFP)에 특이적인 항체를 결합한 비드-항체 복합체에 관한 것이다. 패혈성 쇼크 환자의 혈장에 비드-항-mtFP 항체 복합체를 투여한 다음 원심분리하여 표적 mtFP를 혈장에서 성공적으로 제거하였다.
도 11은 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에서 비드-항-ND6 항체 처리를 통한 ND6 제거에 관한 것이다. 도 11a는 비드-항-ND6 항체 처리 후 원심분리 후 혈장 ND 수준에 관한 것이다. 도 11b는 비드-항-ND6 항체 복합체에 의해 제거된 ND6 수준을 평가한 것이다. 비드-항-ND6 항체 처리는 용량 의존적 방식으로 혈장에서 ND6을 제거하였다. 4.0 μg/mL의 항-ND6 항체 농도는 100 pM에서 150 pM 사이에서 혈장 ND6 수준을 감소시켰다. 임상 적용을 위한 최적의 항체 농도로 5.0 μg/mL를 선택하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 12는 비드-항-mtFP 혼합제(Beads-anti-mtFP cocktail)의 치료 효과에 관한 것이다. 도 12a는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후에 입원 시 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 혈장의 mtFP 수준에 관한 것이다. 도 12b는 비드-항-mtFP 혼합제에 의해 제거된 mtFP의 양에 관한 것이다. 비드-항-mtFP 혼합제는 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에서 순환하는 mtFP를 성공적으로 제거하였다. 도 12c는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후의 혈장 사이토카인 및 케모카인 수준에 관한 것이다. 비드-항-mtFP 혼합제에 의한 사이토카인 및 케모카인의 비특이적 제거를 조사하기 위해, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-10, 성장 조절 종양 유전자(GRO)-α에 의한 IL-8 및 류코트리엔 B4(LTB4) 수준을 측정하였다. Beads-anti-mtFP 혼합제는 사이토카인과 케모카인을 유의하게 제거하지 않았다. 도 12d는 PMN 주화성 회복에 대한 비드-항-mtFP 혼합 처리의 효과에 관한 것이다. 건강한 지원자로부터 분리된 PMN을 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에 30분 동안 노출시켰다. 그런 다음 PMN을 미처리 혈장, 직접 항-mtFP 칵테일 처리 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재현탁하고 90분 동안 배양하였으며, PMN 주화성을 측정하였다. 비드-항-mtFP 혼합제 처리된 혈장에 노출된 별도의 PMN을 화학주성 실험 15분 전에 10 μM의 CsH로 전처리하였다. 패혈성 쇼크 환자의 처리되지 않은 혈장은 fMLF에 대한 반응으로 건강한 지원자의 PMN 주화성을 억제하였다. 직접적인 항-mtFP 항체 처리는 PMN 주화성을 회복시킬 수 없었지만, 비드-항-mtFP 혼합제 처리는 PMN 주화성을 상당히 회복시켰다. 미처리 혈장에 노출된 CsH 처리 PMN 화학주성은 미처리 혈장에 노출된 CsH 없는 PMN 화학주성과 크게 다르지 않았다. 상기 결과는 비드-항-mtFP 칵테일 처리를 통한 PMN 주화성의 구조가 mtFP를 순환하여 재활용된 FPR1 점유를 방지함으로써 주로 매개됨을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. ELISA는 이중으로 수행하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01.
도 13는 비드-항-mtFP 혼합제 처리를 통해 이차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 PMN 주화성의 구조에 관한 것이다. 도 13a는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후에 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자 및 2차 감염 음성 환자로부터 얻은 혈장의 mtFP 수준에 관한 것이다. 도 13b는 비드-항-mtFP 혼합제에 의해 제거된 mtFP의 양, 도 13c는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후의 혈장 사이토카인 및 케모카인 수준에 관한 것이다. 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에서 비드-항-mtFP는 순환하는 mtFP를 성공적으로 제거했지만 사이토카인과 케모카인을 유의하게 제거하지는 않았다. 도 13d는 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 PMN 주화성의 구조에 관한 것이다. 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자로부터 분리된 PMN을 자신의 혈장에 30분 동안 노출시켰다. 그런 다음 PMN을 비드-항-mtFP 혼합제가 처리되지 않은 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리된 혈장에 재현탁하고 90분 동안 배양하였다. 이차 감염 음성 환자의 혈장은 비드-항-mtFP 처리를 하지 않았다. 이차 감염 음성 환자로부터 분리된 PMN도 자체 혈장과 함께 배양하였으며, PMN 주화성을 측정하였다. 혈장에 노출되었을 때 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 분리된 PMN의 주화성은 2차 감염 음성 환자에서 분리된 PMN의 주화성보다 현저히 낮았다. 그러나 2차 감염이 발생하고 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 노출된 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 PMN에서는 주화성의 유의한 차이가 사라졌다. 추가 50 pg/mL 재조합 leukotriene B4(LTB4)는 처리되지 않은 혈장에 노출된 PMN과 비교하여 PMN 주화성을 상당히 회복시켰다. 상기 결과는 비드-항-mtFP 혼합제 처리가 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 PMN 주화성을 적어도 부분적으로 구제할 수 있고 LTB4가 순환 mtfp 제거 후 FPR 매개 PMN 주화성의 회복에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. ELISA는 이중으로 수행하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01.
도 2는 본 발명의 혈액 관류 장치에 관한 것이다. Mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1) 에 특이적인 anti-mtFP 항체(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)를 포함한 혈액관류 장치로의 체외 혈액 관류를 통한 표적 물질의 제거가 가능하다. anti-mtFP 항체를 포함한 혈액관류 장비는 fiber form, bead form, film form, hollow-fiber form 등을 포함하며 그 외에도 다양한 형태의 혈액관류 채널의 혈액접촉 부위에 anti-mtFP 항체를 부착 또는 코팅하는 경우를 모두 포함할 수 있다.
도 3은 유동 세포 계측법(flow cytometry)에 의해 결정된 분리된 인간 호중구(다형핵 세포, PMN)의 순도에 관한 것이다. 세 번의 독립적인 실험에서 분리된 PMN의 평균 순도는 97.53 ± 0.55%(표준 편차)였다.
도 4는 포르밀 펩티드 수용체 1(FPR1) 작용제 및 길항제에 관한 것이다. 도 4a는 100nM의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 탈수소효소 서브유닛-6(ND6) 및 100nM의 N-포르밀-메티오닌-류신-페닐알라닌(fMLF) 즉, FPR1 작용제에 의해 자극된 PMN 칼슘 동원에 관한 것이다. PMN 칼슘 동원은 FPR1 길항제(10μM의 사이클로스포린 H, CsH) 전처리를 통해 억제된다. 도 4b는 소포체(ER) 칼슘 고갈의 150초 동안 곡선 아래 면적((AUC150) 및 100초 칼슘 유입(AUC100)에 대한 area under the curve (AUC)에 관한 것이다. ND6 및 fMLF는 ER 칼슘 고갈 및 그에 따른 칼슘 유입을 유도하는 데 유사한 효능을 보였지만 둘 다 ND6 및 fMLF 처리 1분 전에 투여한 10 μM CsH 전처리에 의해 완전히 억제되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 5는 포르밀 펩티드 수용체 1(FPR1)-매개 칼슘 동원 및 호중구(다형핵 세포, PMN) 주화성에 관한 것이다. 도 5a는 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit-6 (ND6) 및 후속 N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine (fMLF)에 의해 자극되는 PMN 칼슘 동원에 관한 것이다. 도 5b는 소포체(ER) 칼슘 고갈의 150초 동안 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하여 각각 ND6(AUC150 1차) 및 fMLF(AUC150 2차)에 의해 자극된 ER 칼슘 고갈량을 정량화한 것이다. 칼슘 유입량을 정량화하기 위해 100초 동안의 AUC(AUC100)를 계산하였다. 도 5c는 fMLF에 대한 반응으로 ND6로 처리된 PMN의 주화성에 관한 것이다. 처리되지 않은 PMN(tx 없음)에 0.1% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하였다. PMN 주화성에서 FPR1의 역할을 결정하기 위해 PMN 이동을 위한 배양 15분 전에 10 μM의 cyclosporine H(CsH)를 전처리하였다. ND6 처리는 ER 칼슘 고갈을 유도하였지만, fMLF에 의해 자극된 2차 ER 칼슘 고갈 및 그에 따른 칼슘 유입을 용량 의존적으로 억제하였다. PMN에 대한 ND6 처리는 또한 용량 의존적으로 fMLF에 대한 반응으로 PMN 주화성을 억제하였다. 상기 결과는 ND6에 의한 FPR1 점유 후 fMLF가 나머지 FPR1에 결합하여 칼슘 유입 및 PMN 주화성을 유발함을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 6은 FPR1 매개 ER 칼슘 고갈의 총량에 관한 것이다. 150초 동안 100nM, 10nM, 5nM, 0nM ND6 자극(AUC150 1차) 및 후속 100nM fMLF 자극(AUC150 2차)에 대한 반응에서의 ER 칼슘 고갈의 합은 실험군 간에 차이가 없었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 7은 순환하는 ND6의 원심 제거 후 PMN 주화성의 구조에 관한 것이다. 도 7a는 원심분리 ND6 제거 후 30분, 60분 및 90분 후 PMN 칼슘 동원의 변화에 관한 것이다. 30분의 ND6 노출 후, PMN을 원심분리하고 상등액을 버렸다. 그런 다음, PMN 펠릿을 0.1% DMSO 함유 배지(ND6-DMSO 그룹) 또는 ND6 함유 배지(ND6-ND6 그룹)에 재현탁시켰다. 도 7b는 ER 칼슘 고갈의 150초 동안의 AUC(AUC150) 및 칼슘 유입의 100초 동안의 AUC(AUC100)에 관한 것이다. ND6 제거 30분 후, ER 칼슘 고갈이 완전히 회복되었다. ER 칼슘 고갈과는 달리, 칼슘 유입은 30분 및 60분 후에 여전히 억제되었지만, ND6 제거 90분 후에 완전히 회복되었다. 도 7c는 원심분리 ND6 제거 후 30분 및 90분 후 PMN 주화성의 변화에 관한 것이다. 30분 및 90분에서의 PMN 주화성은 각각 30분에서 90분 및 90분에서 150분까지 60분 배양 동안 이동된 PMN의 수로 측정하였다. 또 다른 그룹의 PMN은 FPR1-매개 PMN 주화성의 용량을 추정하기 위해 배양 15분 전에 10 μM의 CsH로 처리하였다. 칼슘 유입과 일치하게, fMLF에 대한 PMN 주화성은 ND6 제거 후 30분 후에 억제되었지만 ND6 제거 후 90분 후에 완전히 회복되었다. 도 7d는 PMN 막에서 FPR1을 검출하는 유동 세포 계측법의 대표적인 수치에 관한 것이다. 도 7e는 유세포 분석의 평균 형광 강도(MFI)에 관한 것이다. PMN 막의 FPR1 발현은 ND6 제거 30분 후에 완전히 회복되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 8은 PMN 주화성과 칼슘 동원 단계 사이의 상관관계에 관한 것이다. 도 8a는 ND6 및 fMLF에 의해 순차적으로 자극된 PMN에서 PMN 주화성과 칼슘 동원 단계 사이의 상관관계에 관한 것이다. Spearman의 상관 계수(r)를 사용하여 상관 관계를 분석하였다. PMN 주화성은 fMLF로 유발된 ER 칼슘 고갈(AUC150 2차) 및 후속 칼슘 유입(AUC100)과 직접적으로 관련이 있었지만, ND6로 유발된 ER 칼슘 고갈(AUC150 1차)과는 반비례 관계가 있었다. 도 8b는 ND6 노출 30분 후(following 30-minutes ND6 exposure) ND6 제거 30분 후(30 minutes after ND6 removal) PMN의 상관관계에 관한 것이다. FPR1 발현(MFI)은 ER 칼슘 고갈(AUC150)과 상관관계가 있었지만 칼슘 유입(AUC100) 및 주화성과는 상관관계가 없었다. 도 8c는 ND6 노출 30분 후(following 30-minutes ND6 exposure) ND6 제거 90분 후(90 minutes after ND6 removal) PMN의 상관관계에 관한 것이다. FPR1 발현, ER 칼슘 고갈, 칼슘 유입 및 화학주성은 서로 상관관계가 있었다. 상기 결과는 재활용된 FPR1이 순환 mtFP 제거 직후 PMN 막에 재배치되었지만 ER 칼슘 고갈에서 칼슘 유입으로의 경로를 조절하는 간섭 분자로 인해 칼슘 유입 회복이 지연되었음을 나타낸다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 9는 직접적인 항-ND6 항체 처리 후 혈장 ND6 수준의 변화에 관한 것이다. 혈장에 대한 직접적인 항-ND6 항체 처리는 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 혈장의 ND6 수치를 변화시키지 않았다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 10은 단백질 A/세파로스와 미토콘드리아 N-포르밀 펩티드(mtFP)에 특이적인 항체를 결합한 비드-항체 복합체에 관한 것이다. 패혈성 쇼크 환자의 혈장에 비드-항-mtFP 항체 복합체를 투여한 다음 원심분리하여 표적 mtFP를 혈장에서 성공적으로 제거하였다.
도 11은 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에서 비드-항-ND6 항체 처리를 통한 ND6 제거에 관한 것이다. 도 11a는 비드-항-ND6 항체 처리 후 원심분리 후 혈장 ND 수준에 관한 것이다. 도 11b는 비드-항-ND6 항체 복합체에 의해 제거된 ND6 수준을 평가한 것이다. 비드-항-ND6 항체 처리는 용량 의존적 방식으로 혈장에서 ND6을 제거하였다. 4.0 μg/mL의 항-ND6 항체 농도는 100 pM에서 150 pM 사이에서 혈장 ND6 수준을 감소시켰다. 임상 적용을 위한 최적의 항체 농도로 5.0 μg/mL를 선택하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다.
도 12는 비드-항-mtFP 혼합제(Beads-anti-mtFP cocktail)의 치료 효과에 관한 것이다. 도 12a는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후에 입원 시 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 혈장의 mtFP 수준에 관한 것이다. 도 12b는 비드-항-mtFP 혼합제에 의해 제거된 mtFP의 양에 관한 것이다. 비드-항-mtFP 혼합제는 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에서 순환하는 mtFP를 성공적으로 제거하였다. 도 12c는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후의 혈장 사이토카인 및 케모카인 수준에 관한 것이다. 비드-항-mtFP 혼합제에 의한 사이토카인 및 케모카인의 비특이적 제거를 조사하기 위해, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-10, 성장 조절 종양 유전자(GRO)-α에 의한 IL-8 및 류코트리엔 B4(LTB4) 수준을 측정하였다. Beads-anti-mtFP 혼합제는 사이토카인과 케모카인을 유의하게 제거하지 않았다. 도 12d는 PMN 주화성 회복에 대한 비드-항-mtFP 혼합 처리의 효과에 관한 것이다. 건강한 지원자로부터 분리된 PMN을 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에 30분 동안 노출시켰다. 그런 다음 PMN을 미처리 혈장, 직접 항-mtFP 칵테일 처리 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재현탁하고 90분 동안 배양하였으며, PMN 주화성을 측정하였다. 비드-항-mtFP 혼합제 처리된 혈장에 노출된 별도의 PMN을 화학주성 실험 15분 전에 10 μM의 CsH로 전처리하였다. 패혈성 쇼크 환자의 처리되지 않은 혈장은 fMLF에 대한 반응으로 건강한 지원자의 PMN 주화성을 억제하였다. 직접적인 항-mtFP 항체 처리는 PMN 주화성을 회복시킬 수 없었지만, 비드-항-mtFP 혼합제 처리는 PMN 주화성을 상당히 회복시켰다. 미처리 혈장에 노출된 CsH 처리 PMN 화학주성은 미처리 혈장에 노출된 CsH 없는 PMN 화학주성과 크게 다르지 않았다. 상기 결과는 비드-항-mtFP 칵테일 처리를 통한 PMN 주화성의 구조가 mtFP를 순환하여 재활용된 FPR1 점유를 방지함으로써 주로 매개됨을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. ELISA는 이중으로 수행하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01.
도 13는 비드-항-mtFP 혼합제 처리를 통해 이차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 PMN 주화성의 구조에 관한 것이다. 도 13a는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후에 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자 및 2차 감염 음성 환자로부터 얻은 혈장의 mtFP 수준에 관한 것이다. 도 13b는 비드-항-mtFP 혼합제에 의해 제거된 mtFP의 양, 도 13c는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후의 혈장 사이토카인 및 케모카인 수준에 관한 것이다. 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 혈장에서 비드-항-mtFP는 순환하는 mtFP를 성공적으로 제거했지만 사이토카인과 케모카인을 유의하게 제거하지는 않았다. 도 13d는 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 PMN 주화성의 구조에 관한 것이다. 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자로부터 분리된 PMN을 자신의 혈장에 30분 동안 노출시켰다. 그런 다음 PMN을 비드-항-mtFP 혼합제가 처리되지 않은 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리된 혈장에 재현탁하고 90분 동안 배양하였다. 이차 감염 음성 환자의 혈장은 비드-항-mtFP 처리를 하지 않았다. 이차 감염 음성 환자로부터 분리된 PMN도 자체 혈장과 함께 배양하였으며, PMN 주화성을 측정하였다. 혈장에 노출되었을 때 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 분리된 PMN의 주화성은 2차 감염 음성 환자에서 분리된 PMN의 주화성보다 현저히 낮았다. 그러나 2차 감염이 발생하고 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 노출된 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 PMN에서는 주화성의 유의한 차이가 사라졌다. 추가 50 pg/mL 재조합 leukotriene B4(LTB4)는 처리되지 않은 혈장에 노출된 PMN과 비교하여 PMN 주화성을 상당히 회복시켰다. 상기 결과는 비드-항-mtFP 혼합제 처리가 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 PMN 주화성을 적어도 부분적으로 구제할 수 있고 LTB4가 순환 mtfp 제거 후 FPR 매개 PMN 주화성의 회복에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. ELISA는 이중으로 수행하였다. 화학주성 관련 실험은 4번의 반복실험을 독립적으로 3회 수행하였다. *P < 0.05. **P < 0.01.
이하, 본 발명은 상세히 설명한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
패혈증 환자에서 손상된 조직으로부터 혈중으로 유리된 미토콘드리아 포르밀펩티드(mitochondrial N-formyl peptide, mtFP)는 중성구(neutrophil, PMN) 표면의 formyl peptide receptor 1 (FPR1)에 결합하여 2차적으로 침입한 세균에 대한 중성구의 화학 주성(chemotaxis)을 억제함으로써 침입한 세균의 병원 내 2차 감염으로의 진행을 유발한다. 그 기전은 mtFP와 결합한 FPR1의 세포 내 이동으로 인한 중성구 표면의 수용체 감소(homologous internalization) 및 이와 동반된 타 화학 주성 수용체들의 세포 내 이동(heterologous internalization)에 의한 중성구 표면의 화학 주성 수용체 감소에 기인한다.
본 발명자들은 이전 연구에서 순환하는 mtFP 수준의 증가가 패혈성 쇼크에서 회복하는 환자의 2차 감염의 발병 및 90일 사망률과 독립적으로 관련이 있으며, 2차 감염에 대한 감수성 증가는 주로 FPR1 매개 중성구(neutrophil, PMN) 화학 주성의 억제에 기인한다는 것을 확인하였고, 순환하는 mtFP가 PMN의 살균 활성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
나아가, 본 발명자들은 FPR1 차단이 비-FPR1 케모카인 수용체의 이종 내재화를 방지함으로써 PMN 막의 다른 케모카인 수용체를 보존할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 패혈성 쇼크 환자에서 FPR1 차단은 2차 감염 부위에 대한 PMN 화학주성을 구제(chemotaxis rescue)하는 효과적인 치료법이 아닐 수 있다.
이에, 본 발명자들은 PMN 막에 재활용된 FPR1을 재배치하기 전에 mtFP 특이적 항체에 의해 순환하는 mtFP를 제거하면 충분한 양의 재활용된 FPR1이 새로 합성된 세균 펩티드에 결합할 수 있다고 가정하였으며, 이로써 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서도 2차 세균 감염에 대한 반응으로 PMN 화학주성을 구제(chemotaxis rescue)할 것이라는 가설을 세웠다. 따라서, 본 발명자들은 mtFP 특이적 항체를 통해 혈장에서 순환하는 mtFP를 제거하는 것이 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크에서 회복하는 환자에서 2차 세균 감염에 대한 FPR1 매개 PMN 화학주성을 구제할 수 있는지 여부를 조사하였다.
우선, mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1)들에 특이적인 항체 치료의 효과를 확인하기 위해 패혈증 환자의 혈장을 분리하여 이에 노출된 정상인 및 패혈증 환자의 중성구의 chemotaxis의 변화를 측정하였다. 기존의 항-mtFP 항체를 혈장에 직접 투여하였을 때에는 치료효과가 나타나지 않았다. 다시 말해 기존에 항-mtFP 항체는 mtFP의 N-terminal의 FPR1결합을 차단하지 못하므로 직접 투여할 시 치료 효과가 없는 것을 확인하였다. 이에 비드(bead)와 항체를 결합한 후 원심분리로 제거하였을 때 혈중 mtFP를 제거할 수 있는 지 여부를 확인하였다. 그 결과, Bead와 4개의 항-mtFP 특이 항체를 결합하여 패혈증 환자의 혈장에 투여하였을 때, 효과적으로 혈중 mtFP를 제거할 수 있음을 확인하였다(도 10 및 11). 그러나, 비드-항체 복합체는 분자량이 크고 체내 투여시 많은 부작용이 예상되어 직접 체내로 투여할 수 없다는 문제점이 있다. 이에, 비드-항체 복합체 또는 다른 형태의 항체 결합 물질을 체외순환 막필터를 제작하여 체외로 혈액관류를 시킬 시 체내로 이물질들이 들어가지 못할 것이므로 안전하게 혈중 mtFP를 제거할 수 있을 것이다. 패혈증 환자의 중성구를 분리하여 4개의 혈중 mtFP(ND6, ND3, ND4, ND5)를 제거한 혈장에 노출시켰을 때 중성구의 화학 주성이 회복됨을 확인하였다(도 12 및 13). 이는, 4개 또는 5개의 미토콘드리아 포르밀펩티드들에 특이적인 기존의 항체들을 포함한 혈액관류 장비로의 체외 혈액 관류를 통하여 표적 물질의 제거(도 12 및 13)가 가능하고, 중성구의 2차 세균 감염 부위로의 화학 주성의 회복 및 이를 통한 전신적인 병원 내 2차 감염 진행의 억제가 가능할 수 있음을 나타낸다.
MtFP와 결합한 FPR1은 세포 내로 들어가며 endosome에서 mtFP를 제거한 후 중성구 표면으로 다시 재활용되어 발현하게 된다. 따라서 다시 중성구 표면으로 발현된 FPR1에 대한 혈중 mtFP의 재결합을 차단함으로써 2차적으로 침범한 세균감염 부위로의 중성구의 이동을 촉진하여 2차적으로 침범한 세균의 제거 및 전신적인 2차 감염으로의 진행을 억제하고자 한다(도 1).
본 발명에서 용어 “관류”(perfusion)는 순환계통이나 림프계통을 통해 유체를 장기나 신체조직으로 흘려 보내는 것을 의미하며, 특히 혈액을 조직 내 모세혈관계에 전달하는 것을 나타낸다.
본 발명에서 용어 “항-mTFP 항체”(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)는 미토콘드리아 N-포르밀 펩티드(mitochontrial N-formyl peptide; mtFP) 특이적 항체라고도 하며, 상기 mtFP 특이적 항체를 통해 혈액에 포함되어 있는 미토콘드리아 N-포르밀 펩티드(mitochontrial N-formyl peptide; mtFP)를 제거할 수 있다. 상기 mtfP를 제거함으로써 상기 mtFP와 PMN 막의 포르밀 펩티드 수용체 1(formyl peptide receptor1; FPR1)의 결합을 차단할 수 있으며, 호중구(polymorphonuclear leukocytes; PMN)의 화학 주성(chemotaxis)을 회복시킬 수 있다. 상기 mtFP는 손상된 조직 및 감염원에 의해 자극된 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)들로부터 혈중으로 유리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "흡착 매체"는 세포, 생물, 바이러스, 독소, 병원체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 화학 분자, 소분자, 생물학적 분자 또는 이들의 단편 등이 그 표면에 부착될 수 있는 물질을 의미한다.
이에, 본 발명은 일 관점에서, 혈액을 장치 내부로 흐르게 하는 혈액 유입부; 항-mTFP 항체(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)를 포함하는 흡착 매체; 및 혈액을 장치 외부로 흐르게 하는 혈액 유출부;를 포함하는 혈액관류장치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치는 병원 내 2차 감염의 발생을 억제할 수 있다. 따라서, 상기 혈액관류 장치는 병원 내 2차 감염으로 인해 증상, 임상결과 등이 악화될 수 있는 환자를 대상으로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치의 대상 개체는 패혈증 환자, 패혈성 쇼크 환자, 중증외상환자, 장기 이식 환자, 출혈성 쇼크 환자, 심근경색 환자, 심인성 쇼크 환자, 뇌졸중 환자 및 심정지 후 생존 환자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 이외 급성기 치료 후에도 상당 기간의 입원 치료가 필요한 환자들을 대상으로 상기 혈액관류장치를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 mtFP는 mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치는 혈액을 개체로부터 꺼내고, 이를 개체로 돌려보내기 전에, 이에 제한되지는 않으나 산소, 혈액-항응고제, 마취제 등과 같은 원하는 물질을 혈액에 첨가할 수 있다. 또한, 자연적으로 발생하는 독소 또는 독과 같은 원치 않는 물질을 혈액으로부터 제거할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치는 산소, 혈액-항응고제 및 leukotriene B4(LTB4)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 leukotriene B4 (LTB4)는 10 ~ 100 pg/mL의 농도로 포함 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-mtFP 항체를 0.5 ~ 20.0 μg/mL, 바람직하게는 1.0 ~ 15.0 μg/mL, 더 바람직하게는 2.0 ~ 10.0 μg/mL, 가장 바람직하게는 4.0 ~ 8.0 μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 특징으로 할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 상기 항-mtFP 항체를 0.5 μg/mL 미만 및/또는 20.0 μg/mL 초과의 농도로 포함하는 경우 혈액 내 mtFP를 효과적으로 제거하지 못하거나 부작용을 야기할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 흡착 매체는 그 표면에 항-mtFP 항체가 부착 또는 코팅된 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 흡착매체는 fiber form, bead form, film form, hollow-fiber form 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않으며, 그 외에도 혈액접촉 부위에 항-mTFP 항체를 부착 또는 코팅하는 다양한 형태를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액관류장치는 혈액투석장치, continuous renal replacement therapy (CRRT) 장치, extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) 장치, 또는 그 외의 다양한 체외순환장치에 연결하여 혈액관류를 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은, 다른 관점에서 병원 내 2차 감염을 감소시키는 생체 외 방법:
(a) 개체로부터 수득한 혈액을 항-mTFP 항체(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)를 포함하는 흡착 매체를 포함하는 장치에 통과시키는 단계;
(b) 상기 혈액 내의 mTFP 수준이 감소된 혈액을 생성하는 단계; 및
(c) 상기 mtFP 수준이 감소된 혈액을 개체 내로 주입하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 개체는 패혈증 환자, 패혈성 쇼크 환자, 중증외상환자, 장기 이식 환자, 출혈성 쇼크 환자, 심근경색 환자, 심인성 쇼크 환자, 뇌졸중 환자 및 심정지 후 생존 환자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 이외 급성기 치료 후에도 상당 기간의 입원 치료가 필요한 환자들을 대상으로 상기 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 mtFP는 mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항-mtFP 항체를 0.5 ~ 20.0 μg/mL, 바람직하게는 1.0 ~ 15.0 μg/mL, 더 바람직하게는 2.0 ~ 10.0 μg/mL, 가장 바람직하게는 4.0 ~ 8.0 μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 특징으로 할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 상기 항-mtFP 항체를 0.5 μg/mL 미만 및/또는 20.0 μg/mL 초과의 농도로 포함하는 경우 혈액 내 mtFP를 효과적으로 제거하지 못하거나 부작용을 야기할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 흡착 매체는 그 표면에 항-mTFP 항체가 부착 또는 코팅된 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 흡착매체는 fiber form, bead form, film form, hollow-fiber form 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않으며, 그 외에도 혈액접촉 부위에 항-mTFP 항체를 부착 또는 코팅하는 다양한 형태를 모두 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않은 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
[실시예]
실험 재료 및 방법
(실시예 1-1) 윤리학
건강한 지원자와 패혈성 쇼크(septic shock) 환자의 혈액 시료(blood sample) 채취는 서울대학교 의과대학/서울대학교 병원의 기관심사위원회(IRB)(IRB 번호: 1605-044-760)의 승인을 받았다. 패혈성 쇼크 환자를 위한 임상 데이터 저장소 프로토콜도 IRB(IRB 번호: 1707-012-865)에 의해 승인되었으며 ClinicalTrials.gov(NCT01670383)에 등록되었다. 또한, 건강한 지원자, 패혈성 쇼크 환자 또는 법적으로 승인된 대리인으로부터 서면 동의를 받았다.
(실시예 1-2) 패혈성 쇼크 환자에 대한 정보
본 발명자들은 qSOFA(quick sequential organ failure assessment) 점수가 2 이상인 기준으로 응급실을 방문한 패혈증 환자를 선정하였다. 이후 본 발명자들은 SOFA 점수를 계산한 후 점수가 2 이상인 경우 30mL/kg 결정질을 주입하였다. 30mL/kg의 결정질 주입에도 불구하고 평균 동맥압(MAP)이 65mmHg 미만이고 혈청 젖산 수치가 2mmol/L 이상인 경우 환자를 패혈성 쇼크로 진단하였다. 패혈성 쇼크로 진단된 환자는 MAP을 65mmHg 이상으로 유지하기 위해 지속적으로 정맥 내 승압제를 주입하고 배양 연구를 위해 혈액 시료들을 채취한 후 1시간 이내에 광범위 항생제를 정맥 내 투여하고 가능한 한 빨리 중환자실에 입원시켰다. 중환자실에 입원시킨 환자로부터 인구 통계 및 실험실 데이터를 수집하였다.
(실시예 1-3) 인간 PMN 분리 및 무세포 혈장
인간 다형핵 백혈구(polymorphonuclear cells; PMN)은 하기 방법에 따라 분리하였다. 건강한 지원자와 패혈성 쇼크 환자로부터 채취한 헤파린(10U/mL) 처리된 전혈(whole blood samples) 시료들을 4°C에서 10분 동안 200g에서 원심분리하였다. 혈장 층을 수득하여 다시 4℃에서 20,000g으로 10분간 원심분리한 후 상층액(cell-free plasma)을 수득하였다.
5mL의 1-stepTM 다형체(AN221725, Accurate Chemical, Westbury, NY)에 중첩된 5mL의 연막(buffy coat)와 적혈구를 24°C에서 30분 동안 550g에서 원심분리 한 후 PMN 층을 별도로 수집하였다. 삼투압 농도를 복원하기 위해 얼음처럼 차가운 0.45% 염화나트륨(NaCl)을 동일한 부피로 5분 동안 혼합하였다. Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 배지(11875093, Thermo Fisher, Waltham, MA)로 세척한 후, 나머지 적혈구를 20mL의 얼음처럼 차가운 0.2% NaCl에 20초 동안 용해한 후 20mL의 얼음처럼 차가운 1.6% NaCl를 투여하였다. 4℃에서 10분 동안 200g에서 원심분리 한 후, 상층액을 버렸다.
(실시예 1-4) MtFP
ND6(N-formyl-methionine-methionine-tyrosine-alanine-leucine-phenylalanine, N-formyl-MMYALF), ND3(N-formyl-methionine-asparagine-phenylalanine-alanine-leucine-isoleucine, N-formyl-MNFALI), ND4(N-formyl-methionine-leucine-lysine-leucine-isoleucine-valine, N-formyl-MLKLIV), 및 ND5(N-formyl-methionine-threonine-methionine-histidine-threonine-threonine, N-formyl-MTMHTT)의 헥사 단백질(hexapeptide)은 Peptron(대전, 대한민국)에 의뢰하여 합성하였다. N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine(fMLF, 표준 세균 FP)은 Sigma-Aldrich(f3506, St. Louis, MO)에서 구입하였다.
(실시예 1-5) PMN 세포 내 칼슘 동원
PMN 세포 내 칼슘 동원(calciuim mobilization)은 하기와 방법에 따라 측정하였다. 분리된 PMN 펠렛(pellet)을 pH 7.4 hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid (HEPES) 완충 용액에 재현탁하였다. 이 HEPES 완충 용액은 20mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM 염화칼륨(KCl), 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 1mM 염화칼슘(CaCl2), 10mM 글루코스(glucose) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, A2058 Sigma-Aldrich)을 포함한다. PMN은 37°C에서 45분 동안 fura2-AM(F1221, Thermo Fisher, Waltham, MA)으로 로드(load)하였다.
분광형광계(FluoroMax Plus-C, Horiba, Ltd., Kyoto, Japan)를 사용하여 37°C에서 340/380 nm 이중 파장 여기로 505 nm에서 형광을 측정하였다. 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 칼슘 고갈(calcium depletion)의 정량적 측정을 위해 PMN을 4°C에서 10분 동안 200g에서 원심분리 하였다. 그 후 PMN 펠렛을 0.3mM ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA, E3889, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 칼슘이 없는 HEPES 완충 용액에서 재현탁하고, ND6 및 fMLF에 의해 자극시키거나, ND6 단독으로 자극시켰다. ND6 또는 fMLF가 없는 배지에서 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO)를 첨가하였다. 소포체 칼슘이 고갈된 후, 1.8mM CaCl2를 첨가하여 세포질 칼슘 유입을 유도하였다. 소포체 칼슘 고갈 및 칼슘 유입은 340 nm/380 nm 비율을 측정하여 평가하고 각각 150초 동안의 AUC(AUC150) 및 100초 동안의 AUC(AUC100)로 정량화하였다. 칼슘 동원에서 FPR1의 역할은 소포체 칼슘 고갈 유도 1분 전에 10 μM CsH로 전처리하여 결정하였다. 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다.
(실시예 1-6) PMN 화학 주성
PMN 화학 주성은 3μm 기공 멤브레인(MAMIC3S10, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 구성된 multiScreen 96-웰 플레이트를 사용하여 평가하였다. ND6 또는 환자의 혈장으로 사전 계획된 치료 후, 분리된 인간 PMN을 4°C에서 10분 동안 200g에서 원심분리 하였다. 이 후 PMN 펠렛을 10% 소태아혈청(FBS, F2442, Sigma-Aldrich)을 포함하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM, 11885-084, Thermo Fisher)에 재현탁 하였다. 사용 전 FBS는 56°C에서 1시간 동안 가열하여 불활성화시켰다. PMN은 플레이트의 상부 챔버(웰 당 75μL에서 0.1 × 106 PMN)에 배치하였고, 100nM fMLF를 포함하는 배지는 하단 챔버(웰 당 150μL)에 배치하였다. ND6 또는 fMLF가 없는 배지에서 0.1% DMSO를 첨가하였다.
플레이트를 5% 이산화탄소(CO2)와 함께 37°C의 인큐베이터에서 60분 동안 배양하였다. PMN 화학 주성에서 FPR1의 역할을 결정하기 위해 배양 15분 전에 PMN의 한 그룹에 10μM CsH를 첨가하였다. 60분 배양 후, 플레이트의 상부 및 하부 챔버를 분리하고, 하부 챔버의 배지를 1.5 mL-Eppendorf(EP) 튜브로 옮겼다. EP 튜브를 4°C에서 500g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입하였다. 펠렛을 세포 용해 완충 용액(1:20 희석) 및 CyQuant GR 염료(1:400 희석, C7026, Thermo Fisher)를 포함하는 200μL의 증류수에 재현탁 하였다. PMN을 볼텍싱(vortex)하고 암실에서 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 이 후 내용물을 96-웰 플레이트로 옮기고 515 nm에서 컷오프(cut-off)로 480/520 nm의 여기/방출 파장에서 형광을 측정하였다. 이동된(migrated) PMN의 수는 알려진 PMN 수에서 파생된 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 각 실험군 당 4 well 반복실험을 시행하였으며 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다.
(실시예 1-7) 유세포 분석
분리된 인간 PMN의 순도는 BD FACSCalibur(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 유세포 분석에 의해 평가하였다. 인간 골수 세포는 fluorescein(FITC)-접합된 항-인간 CD15 항체(301903, BioLegend, San Diego, CA)를 사용하여 분류하였다. 이들 세포 중 CD49d 음성 및 CD16 양성 세포를 PMN으로 계산하였다. Phycoerythrin/cyanine 7(PE/Cy7)-접합된 항-인간 CD49d 항체(304313, BioLegend)와 allophycocyanin(APC)-접합된 항-인간 CD16 항체(360705, BioLegend)를 사용하였다.
PMN 막 상의 FPR1 발현 및 균질화된 PMN 펠렛 내의 CaMK2 양 또한, 유세포 분석에 의해 검출하였다. PMN 막에서 FPR1을 검출하기 위해 PMN(200 μL에서 1.0 × 106)을 FITC-접합된 항-인간 FPR1 항체(2 μL, FAB3744F, R&D Systems, Minneapolis, MN)와 함께 암실에서 30분 동안 실온에서 배양하였다. FITC-접합된 마우스 IgG2a, κ 이소형 대조군 항체(400210, BioLegend, San Diego, CA)를 음성 대조군으로 사용하였다. 2회 세척 후 형광을 측정하였다. 4°C에서 30초 동안 1.0 x 106/1mL PMN 균질화 및 4°C에서 10분 동안 20,000g에서 원심분리하여 얻은 200μL의 균질화된 PMN 펠렛에서 CaMK2 양을 검출하기 위해 APC-접합된 항 -CaMK2 항체(2μL, ab225178, Abcam, Cambridge, UK)를 사용하였다. FlowJo 버전 10.0(FlowJo, LLC, Ashland, OR)을 사용하여 PMN 막의 FPR1 발현과 균질화된 PMN 펠렛의 CaMK2 양을 평균 형광 강도(MFI)로 정량화하였다. 최소한 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다.
(실시예 1-8) 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)
4°C에서 30초 동안 1.0 x 106/1mL PMN 균질화 및 4°C에서 20,000g에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 균질화된 PMN의 상등액에서 CaMK2 수준은 인간 칼슘/칼모듈린(calcium/calmodulin)-의존성 단백질 키나제 II(CAMK2) ELISA 키트(MBS005464, MyBioSource, San Diego, CA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다.
혈장 ND6, ND3, ND4 및 ND5 수준은 각각 human NADH ubiquinone oxidoreductase chain 6(MT-ND6) ELISA Kit(MBS7246296, MyBioSource), human NADH ubiquinone oxidoreductase chain 3(MT-ND38) ELISA Kit(MBS7244982, MyBioSource), human NADH ubiquinone oxidoreductase chain 4(MT-ND4) ELISA 키트 (MBS9715152, MyBioSource) 및 human NADH ubiquinone oxidoreductase chain 5(MT-ND5) ELISA 키트(MBS7236655, MyBioSource)를 사용하여 측정하였다.
혈장 종양 괴사 인자(TNF)-α, interleukin(IL)-1β, IL-6 및 IL-10 수준은 각각 TNF alpha beta human ELISA Kit(KHC3011, Thermo Fisher), IL-1 beta human ELISA Kit(KHC0011, Thermo Fisher), IL-6 human ELISA Kit(KHC0061, Thermo Fisher) 및 IL-10 human ELISA Kit(KHC0101, Thermo Fisher)를 사용하여 측정하였다. 혈장 성장 조절 종양 유전자(growth regulated oncogene; GRO)-α, IL-8 및 leukotriene B4(LT B4) 수준은 각각 GRO alpha(CXCL1) human ELISA Kit(BMS2122, Thermo Fisher), IL-8 human ELISA Kit(KHC0081, Thermo Fisher) 및 LTB4 매개변수 분석 키트(KGE006B, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 측정하였다. 모든 실험은 이중으로 수행하였다.
(실시예 1-9) ND6의 원심 제거
10% FBS(대조 배지)를 함유하는 DMEM에서 건강한 지원자로부터 얻은 분리된 인간 PMN을 37°C에서 10rpm 회전기에서 30분 동안 ND6 100nM으로 처리하였다. 200g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버렸다. PMN 펠렛을 100 nM ND6 처리 배지(ND6-ND6 그룹) 또는 대조군 배지(ND6-DMSO 그룹)에 재현탁 하였다. ND6이 없는 대조군 배지에는 0.1% DMSO를 첨가하였다. 그 다음, PMN을 37°C에서 10rpm 회전기에서 90분 동안 배양하였다. 칼슘 동원 실험을 위해 ND6-ND6 및 ND6-DMSO 그룹에서 각각 30분, 60분, 90분에 PMN을 추출하였다. 화학주성 실험을 위해 30분과 90분에 PMN을 추출하였다.
(실시예 1-10) 필요한 항-ND6 항체 투여량 추정
상업용 다클론 항-ND6 항체(orb6548)는 Biorbyt Ltd.(Cambridge, UK)에서 구입하였다. protein A sepharose®는 Abcam(ab193256)에서 구입하였다. 먼저 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 혈장에 0.125μg/mL, 0.25μg/mL, 0.5μg/mL, 1.0μg/mL 또는 2.0μg/mL의 항 ND6 항체를 동맥 카테터(arterial catheter)를 통해 직접 투여하였다. 37℃에서 10rpm 회전기에서 2시간 배양 후, 항-ND6 항체를 함유하는 혈장을 4℃에서 10분 동안 20,000g에서 원심분리하고, 상층액을 수득하였다. 그런 다음, 혈장 ND6 수준을 ELISA로 측정하였다.
본 발명자들은 비드(beads)-항-ND6 항체 복합체를 제조하였다. 단백질 A 세파로스® 80 μL를 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, 10010023, Thermo Fisher)로 2회 세척하고 0.25 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1.0 μg/mL, 2.0㎍/mL 4.0㎍/mL 또는 8.0㎍/mL의 항-ND6 항체와 4°C에서 10rpm 회전기에서 4시간 동안 공동 배양하였다. 비드-항-ND6 항체 복합체를 4°C에서 2분 동안 3,000g에서 원심분리하고 상층액을 버렸다. 4°C에서 2분 동안 3,000g의 PBS로 2회 세척한 후, 비드-항-ND6 항체 복합체를 동맥 카테터를 통해 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 500μL 혈장과 함께 37°C에서 10rpm 회전기에서 2시간 동안 공동 배양하였다. 순환하는 ND6에 의해 부착될 수 있는 비드-항-ND6 항체 복합체를 4℃에서 10분 동안 20,000g에서 원심분리하여 제거하고, 상층액을 수득하였다. 비드-항-ND6 항체 복합체 처리 전후의 혈장 ND6 수준을 ELISA로 측정하였다. 세 번의 독립적인 실험을 수행하였으며, ELISA를 이중으로 수행하였다.
(실시예 1-11) 비드-항-mtFP 혼합제(beads-anti-mtFP cocktail) 제조
항-ND6 항체 외에 시판되는 다클론성 항-ND3(orb185335), anti-ND4(orb546348), anti-ND5(orb6547) 항체를 Biorbyt Ltd.에서 구입하였다. 필요한 항-ND6 항체 용량(500μL 혈장 중 80μL 비드가 있는 5.0μg/mL)를 추정한 실험 결과를 바탕으로, ND6, ND3, ND4 및 ND5에 특이적인 각 항체 5.0μg/mL를 4°C에서 10rpm 회전기에서 4시간 동안 320μL 비드와 공동 배양하였다. PBS로 2회 세척한 후, 500 μL 혈장을 비드-항-mtFP 항체 복합체(비드-항-mtFP 혼합제)에 첨가하고, 37℃에서 10 rpm 회전기에서 2시간 동안 공동 배양하였다. 그 다음, 비드-항-mtFP 혼합제를 함유하는 혈장을 4℃에서 10분 동안 20,000g에서 원심분리하고, 상층액을 수득하였다. 비드-항-mtFP 혼합제 처리 전후의 혈장 ND6, ND3, ND4 및 ND5 수준을 ELISA로 측정하였다. 혈장 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, GRO-α, IL-8 및 LTB4 수준도 측정하였다. 건강한 지원자로부터 얻은 혈장을 음성 대조군으로 사용하였다.
PMN 화학 주성 구제(chemotaxis rescue)에 대한 비드-항-mtFP 혼합제 처리의 효과를 분석하였다. 건강한 지원자로부터 얻은 혈액 시료들(samples)에서 PMS를 분리하고 37°C에서 10rpm 회전기로 30분 동안 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 미처리 혈장에 노출시켰다. 200g에서 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버렸다. PMN 펠렛을 미처리 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재현탁하고 37°C에서 10rpm 회전기에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음, 100 nM fMLF에 대한 PMN 화학주성을 측정하였다. 비 FPR1 매개 PMN 화학 주성의 용량을 추정하기 위해 비드 항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 노출된 별도의 PMN을 화학 주성 실험 15분 전에 10μM CsH로 전처리하였다. 각 실험군 당 4 well 반복실험을 시행하였으며 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다.
(실시예 1-12) 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 PMN 화학주성 구제(chemotaxis rescue)
실험 전, protein A sepharose® 320 μL을 PBS로 2회 세척하고 ND6, ND3, ND4 및 ND5에 특이적인 각 항체 5.0 μg/mL와 함께 4°C에서 10 rpm 회전기에서 4시간 동안 공동 배양하였다. 혈액 시료들은 2차 감염 발생을 인지한 패혈성 쇼크 환자 또는 2차 감염이 발생하지 않은 패혈성 쇼크 환자로부터 동맥 카테터(arterial catheter)를 통해 입원일 10-14일 사이에 체취하였다. 채혈 직후 혈장을 분리하여 무세포 혈장을 준비하였다. 혈장의 절반을 EP 튜브당 500μL로 나누고 37°C에서 10rpm 회전기에서 2시간 동안 비드-항-mtFP 혼합제와 함께 배양하였다. 혈장의 나머지 절반은 비드-항-mtFP 혼합제 없이 배양하였다. 2차 감염 음성 환자로부터 얻은 혈장도 비드-항-mtFP 혼합제 없이 배양하였다. 비드 항-mtFP 혼합제 처리 전후에 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 혈장과 2차 감염 음성 환자의 혈장 내 ND6, ND3, ND4, ND5 수치를 ELISA로 측정하였다. 혈장 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, GRO-α, IL-8 및 LTB4 수준도 측정하였다.
2시간의 혈장 잠복기(incubation period) 동안 환자의 PMN을 분리하였다. 이러한 준비 후, PMN은 37°C에서 10rpm 회전기에서 30분 동안 비드-항-mtFP 혼합제가 처리되지 않은 혈장에 노출되었다. 4°C에서 10분 동안 220g을 원심분리한 후 상층액을 버렸다. PMN 펠렛을 비드-항-mtFP 혼합제 미처리 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재현탁하고 37°C에서 10rpm 회전기에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음, 100 nM fMLF에 대한 PMN 화학주성을 측정하였다. 순환 mtFP 제거 후 FPR1 매개 PMN 화학 주성의 회복에서 LTB4의 역할을 조사하기 위해 PMN 이동을 위한 배양 시작 시 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 노출된 별도의 PMN에 50 pg/mL의 재조합 LTB4(L0517, Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 각 실험군 당 4 well 반복실험을 시행하였으며 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다.
(실시예 1-13) 통계
데이터는 Tukey의 사후 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석하였다. 최소한 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다(유의 수준: 양측(two-sided) 검정). 통계적 분석은 IBM SPSS 버전 27.0 for Windows(SPSS, Chicago, IL)를 사용하여 수행하였다.
FPR1 매개 칼슘 동원 및 PMN 화학 주성
FPR1 작용제에 의해 자극된 세포 내 칼슘 동원의 어느 단계가 PMN 화학 주성과 직접적인 상관 관계가 있는지 조사하기 위해 본 발명자들은 건강한 지원자로부터 얻은 분리된 인간 PMN에서 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 칼슘 고갈 및 세포질로의 후속 칼슘 유입의 양을 정량적으로 측정하였다. 3개의 독립적인 실험에서 분리된 PMN의 평균 순도는 97.5%이었다(도 3). 순환하는 mtFP의 존재 하에서 2차 감염이 발생하는 환경을 시뮬레이션하기 위해 100nM, 10nM, 5nM, 0nM의 ND6을 30초 동안 처리하였으며, 100nM N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine(fMLF, 표준 세균 FP)는 칼슘이 없는 조건에서 200초 동안 처리하였다. 13개의 인간 mtFP 중에서 ND6은 ER 칼슘 고갈 및 PMN 화학주성을 자극하는 데 가장 강력한 인간 mtFP로 알려져 있으며 ND3, ND4 및 ND5가 그 뒤를 따른다. 150초 동안 ER 칼슘 고갈의 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하여 각각 ND6(AUC150 1차) 및 fMLF(AUC150 2차)에 의해 자극된 ER 칼슘 고갈의 양을 정량화 하였다. 380초에 1.8mM 염화칼슘(CaCl2)을 처리하고 100초 동안의 AUC(AUC100)를 계산하여 SOCE(store-operated calcium entry)를 통한 칼슘 유입량을 정량화 하였다. ER 칼슘 고갈을 유도하는 100nM ND6 및 100nM fMLF의 효능(potency) 및 10μM cyclosporine H(CsH, FPR 길항제)의 FPR1 길항 효과는 실험 전에 테스트하였다(도 4A 및 4B). ND6 및 fMLF는 ER 칼슘 고갈 및 이에 따른 칼슘 유입을 유도하는 데 유사한 효능을 나타냈지만 둘 다 ND6 및 fMLF 처리 1분 전에 10 μM CsH 전처리에 의해 완전히 억제되었다. 이전 연구에서 본 발명자들은 100nM이 FPR1 매개 PMN 화학주성을 유도하기 위한 fMLF의 가장 강력한 농도이며 10M CsH가 FPR1 매개 ER 칼슘 고갈을 완전히 억제한다는 것을 확인하였다.
ND6 처리는 ER 칼슘 고갈을 유도했지만 fMLF에 의해 자극된 이차 ER 칼슘 고갈과 그에 따른 칼슘 유입을 용량 의존적으로 억제하였다(도 5A 및 5B). 1차 ND6 및 2차 fMLF 자극에 의해 유도된 ER 칼슘 고갈의 총량은 1차 처리된 ND6 농도에 관계없이 유사하였다(도 6). PMN에 대한 ND6 처리는 용량 의존적으로 fMLF 100nM에 대한 반응으로 PMN 화학주성을 억제하였다(도 5C). 이러한 데이터는 ND6에 의한 FPR1 점유 후 fMLF가 FPR1의 나머지 부분에 결합하여 칼슘 유입 및 PMN 화학주성을 유도함을 나타낸다.
순환하는 ND6의 원심 제거 후 PMN 화학 주성 구제(chemotaxis rescue)
100nM의 ND6에 30분 동안 노출시킨 후 PMN을 4°C에서 220g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. PMN 펠렛을 0.1% dimethyl sulfoxide(DMSO) 함유 배지(ND6-DMSO 그룹) 또는 100 nM ND6 함유 배지(ND6-ND6 그룹)에 재현탁하고 37°C에서 10rpm 회전기에서 90분 동안 배양하였다. 100 nM fMLF에 반응하여 30분, 60분, 90분에 PMN 칼슘 동원의 연속 변화와 100 nM fMLF에 반응하여 30분과 90분에 PMN 화학주성의 연속 변화를 ND6-DMSO와 ND6-ND6 그룹 사이에서 비교하였다. 30분과 90분에서의 PMN 화학 주성은 각각 30분에서 90분, 90분에서 150분 사이의 60분 배양 동안 이동된 PMN의 수로 측정하였다. 또한, FPR1 매개 PMN 화학 주성의 용량을 추정하기 위해 다른 그룹의 PMN을 배양 15분 전에 10μM CsH로 처리하였다.
ND6 처리는 ND6-ND6 및 ND6-DMSO 그룹 모두에서 ER 칼슘 고갈, 칼슘 유입 및 PMN 화학주성을 억제하였다. 그러나 ND6의 원심 제거는 ND6-DMSO 그룹에서 모두 복원하였다(도 7A - 7C). ND6 제거 30분 후, ER 칼슘 고갈은 완전히 회복하였다. ER 칼슘 고갈과 달리 칼슘 유입은 30분 및 60분 후에도 여전히 억제되었지만 ND6 제거 90분 후에 완전히 회복되었다(도 7A 및 7B). ND6-DMSO 그룹에서 fMLF에 대한 PMN 화학 주성은 ND6 제거 30분 후에 억제되었지만 90분 후에 완전히 회복되었다(도 7C). ND6은 또한 ND6-ND6 및 ND6-DMSO 그룹 모두 PMN 막에서 FPR1 발현을 감소시켰지만(도 7D 및 7E), PMN 막에서 FPR1 발현은 ND6-DMSO 그룹에서 ND6 제거 30분 후에 완전히 회복되었다(도 7D 및 7E).
180초 미만의 단기 ND6 치료(도 5A 및 5B)와 달리 30분 이상 동안의 ND6 100nM 치료는 100nM fMLF에 대한 반응으로 ER 칼슘 고갈을 완전히 억제하지 못하였다(도 7A 및 7B). 또한, ND6 제거 90분 후 ND6-ND6 그룹의 PMN 막 상의 FPR1 발현은 30분 후보다 더 높은 것으로 나타났다(도 7D 및 7E). FPR1-ND6 복합체의 반복적인 내재화(internalization)와 FPR1의 재활용은 시간이 지남에 따라 ND6 수준을 감소시킬 수 있다. 임상 상황에서 mtFP는 지속적으로 및/또는 반복적으로 순환계로 방출될 수 있다. 이러한 상황은 비교 실험 초기에 ND6의 단일 투여량만을 처리한 실험 환경과 다를 수 있다.
PMN 화학 주성과 칼슘 동원 단계 간의 상관관계
ND6 및 fMLF에 의해 순차적으로 자극된 PMN에서 PMN 화학 주성과 칼슘 동원 단계 사이의 상관관계를 조사할 때 PMN 화학 주성은 fMLF 유도 ER 칼슘 고갈(AUC150 2차)(Spearman's rho = 0.930) 및 후속 칼슘 유입(AUC100)(rho = 0.853)과 직접적으로 상관관계가 있었으나, ND6-유도된 ER 칼슘 고갈(AUC150 1st) (rho = - 0.755)과 역 상관관계가 있었다(도 8A).
그러나 ND6에 노출된 PMN에서 30분의 원심 ND6 제거 후 FPR1 발현은 ER 칼슘 고갈(AUC150)(rho = 0.950)과 유의한 상관관계가 있었으나, 칼슘 유입(AUC100)(rho = 0.583) 및 화학 주성(rho = 0.467) 과 상관 관계가 없었다(도 8B). PMN 화학 주성은 칼슘 유입과만 상관관계가 있었다(rho = 0.867). 90분의 원심 ND6 제거 후, FPR1 발현, ER 칼슘 고갈, 칼슘 유입 및 화학 주성은 서로 상관 관계가 있었다(도 8C).
상기 결과는 순환 mtFP 제거 직후 PMN 막에 재활용된 FPR1이 재배치되었지만 ER 칼슘 고갈에서 칼슘 유입으로의 경로를 조절하는 간섭 분자로 인해 칼슘 유입 회복이 지연되었음을 나타낸다. 또한, 순환하는 mtFP를 제거하는 모든 요법이 패혈성 쇼크에서 회복 중인 환자의 PMN 화학 주성을 구제(chemotaxis rescue)하기 위해 최소 90분 동안 적용되어야 함을 나타낸다.
비드-항-mtFP 항체 혼합제 제조
임상 적용 가능성을 달성하기 위해 항 mtFP 항체, 특히 ND6, ND3, ND4 및 ND5를 포함한 강력한 인간 mtFP에 특이적인 순환하는 mtFP를 제거하려고 시도하였다. 항-mtFP 항체의 제거능을 추정하기 위해 항 ND6 항체 처리 전과 후 패혈성 쇼크 환자의 혈장에서 ND6 수준의 차이를 측정하였다. 혈장을 기증한 환자의 특성은 표 1과 같다. 혈액 시료들은 입원 시 동맥 카테터(arterial catheter)를 통해 환자로부터 채취하였다.
| Healthy volunteers | Patients with septic shock | ||||||
| Person 1 | Person 2 | Person 3 | Patient 1 | Patient 2 | Patient 3 | ||
| Age (years) | 52 | 48 | 63 | 72 | 61 | 58 | |
| Gender | Male | Female | Male | Male | Male | Female | |
| Comorbidity | |||||||
| HT | Yes | Yes | Yes | ||||
| DM | Yes | Yes | |||||
| Chronic liver disease | Yes | ||||||
| Malignancy | Yes | ||||||
| Charlson comorbidity index | 10 | 5 | 7 | ||||
| Primary infection pathogen | Gram (-) | Gram (-) | Gram (+) | ||||
| Bacteremia | Yes | Yes | Yes | ||||
| Primary infection site | Respiratory | Hepatobiliary | Gastrointestinal | ||||
| Lactate level (mmol/L) | 13.7 | 8.4 | 10.2 | ||||
| SOFA score at admission | 16 | 10 | 13 | ||||
| Respiratory | 4 | 1 | 3 | ||||
| Cardiovascular | 4 | 3 | 4 | ||||
| Liver | 1 | 3 | 2 | ||||
| Renal | 2 | 0 | 1 | ||||
| Coagulation | 2 | 3 | 2 | ||||
| Neurologic | 3 | 0 | 1 | ||||
| Management | |||||||
| Time to 1st antibiotics (hours) | 0.5 | 0.7 | 0.9 | ||||
| MV duration | 53 | 0 | 17 | ||||
| Renal replacement therapy | Yes | Yes | |||||
| Hydrocortisone | Yes | Yes | |||||
| Source control | Endoscopic | ||||||
| Blood sample (hospital day) | 1 | 2 | 1 | ||||
| Clinical outcome | |||||||
| 90-day survival | Death | Survival | Survival | ||||
| Survival days till 90 days (days) | 53 | 90 | 90 | ||||
HT = hypertension; DM = diabetes mellitus; SOFA = Sequential Organ Failure Assessment; MV = mechanical ventilation.
혈장에 대한 직접적인 항-ND6 항체 처리는 혈장의 ND6 수준에 영향을 미치지 않는다(도 9). 따라서, 본 발명자들은 4°C에서 10rpm 회전기에서 4시간 동안 protein A/sepharose (80μL)를 0.0.25μg/mL, 0.5μg/mL, 1.0μg/mL, 2.0μg/mL, 4.0μg/mL 또는 8.0μg/mL의 항-ND6 항체와 결합하여 비드-항-ND6 항체 복합체를 제조하였다. 37°C에서 10rpm 회전기에서 혈장과 함께 2시간 배양한 후, 4°C에서 10분 동안 20,000g에서 원심분리하여 비드-항-ND6 복합체를 혈장에서 제거하였다. mtFP의 비드에 대한 비특이적 결합을 조사하기 위해 비드만 처리한 혈장과 처리하지 않은 혈장 사이의 ND6 수준도 비교하였다. 비드-항-ND6 복합체는 비드에 대한 ND6의 비특이적 결합을 최소화하면서 용량 의존적으로 혈장에서 ND6을 제거하였다(도 11A 및 11B). 4.0μg/mL의 항-ND6 항체 농도는 100pM에서 150pM 사이의 혈장 ND6 수준을 감소시켰다(도 11B). 본 발명자들은 이전 연구에서 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자와 2차 감염 음성 환자 간의 혈장 ND6 수준의 차이는 87 pM이므로 임상 적용을 위한 최적의 항체 농도로 5.0 μg/mL를 선택하였다.
이러한 결과를 바탕으로 패혈성 쇼크 환자의 혈장에서 강력한 mtFPs를 한 번에 제거하기 위해 protein A/sepharose(320μL)와 4개의 mtFPs: ND6, ND3, ND4 및 ND5를 위한 특이적 항체를 결합하였다(비드-항-mtFP 혼합제). 각 항체는 2.5μg씩 투여하였고, 최종 농도는 500μL 혈장에서 5.0μg/mL로 조절하였다. 37°C에서 10rpm 회전기에서 혈장과 함께 2시간 배양한 후, 비드-항-mtFP 혼합제는 ND6, ND3, ND4 및 ND5의 혈장 수준을 각각 139pM, 112pM, 104pM 및 135pM까지 감소시켰다(도 12A 및 12B)(표 2). 그러나, 비드-항-mtFP 혼합제는 종양 괴사 인자(TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-6 및 IL-10과 같은 다른 사이토카인과 성장 조절 종양 유전자(GRO)-α, IL-8 및 leukotriene B4(LTB4)과 같은 케모카인을 유의하게 제거하지 않았다(도 12C)(표 2).
| Mean ± standard error (SE) | |||
| Healthy volunteers | Bead-anti-mtFP cocktail treatment | ||
| Pre | Post | ||
| N = 3 | N = 3 | N = 3 | |
| mtFPs | |||
| ND6 (pM) | 23.50 ± 1.41 | 160.36 ± 63.96 | 20.89 ± 0.99 |
| ND3 (pM) | 99.28 ± 12.32 | 278.10 ± 22.04 | 165.61 ± 12.32 |
| ND4 (pM) | 26.50 ± 5.42 | 136.70 ± 26.83 | 32.50 ± 5.81 |
| ND5 (pM) | 34.83 ± 12.95 | 235.25 ± 83.28 | 99.90 ± 46.88 |
| Cytokines | |||
| TNF-α (pg/mL) | 24.24 ± 2.69 | 831.44 ± 342.17 | 762.09 ± 299.46 |
| IL-1β (pg/mL) | 6.78 ± 2.24 | 111.35 ± 28.38 | 100.35 ± 24.50 |
| IL-6 (pg/mL) | 95.18 ± 0.73 | 13739.76 ± 5304.22 | 12767.96 ± 5024.85 |
| IL-10 (pg/mL) | 20.09 ± 3.54 | 5024.05 ± 882.42 | 4830.23 ± 884.33 |
| Chemokines | |||
| GRO-α (pg/mL) | 101.29 ± 4.75 | 7975.69 ± 3509.01 | 7434.75 ± 3099.85 |
| IL-8 (pg/mL) | 79.97 ± 2.84 | 3394.73.45 ± 1441.02 | 3207.63 ± 1345.04 |
| LTB4 (pg/mL) | 20.10 ± 2.54 | 87.86 ± 16.83 | 81.25 ± 16.37 |
ICU = intensive care unit; ND = nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit; pM = picomolar; TNF-α = tumor necrosis factor-α; IL-1β = interleukin-1β; IL-6 = interleukin 6; IL-10 = interleukin 10; GRO-α = growth-regulated oncogene-α; IL-8 = interleukin 8; LTB4 = leukotriene B4.
건강한 지원자로부터 얻은 PMN을 항 mtFP 혼합제 치료를 받은 패혈성 쇼크 환자의 혈장에 노출시킨 후 PMN 화학 주성을 항 mtFP 혼합제 치료를 받지 않은 혈장과 비교하여 PMN에 대한 항 mtFP 혼합제의 화학 주성 회복 효과를 조사하였다. 건강한 지원자로부터 얻은 PMN을 패혈성 쇼크 환자의 미처리 혈장에 30분 노출시킨 후, PMN을 4°C에서 10분 동안 220g 원심분리하고 상층액을 버렸다. PMN 펠렛을 미처리 혈장, 직접 항-mtFP 항체 처리 혈장 또는 비드 항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재현탁하고 37°C에서 10rpm 회전기에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음, 100 nM fMLF에 대한 PMN 화학주성을 측정하였다. 패혈성 쇼크 환자의 미처리 혈장은 fMLF에 대한 반응으로 건강한 자원자 PMN 화학주성을 억제하였다. 직접적인 항-mtFP 항체 처리는 PMN 화학 주성을 회복할 수 없었지만 비드-항-mtFP 혼합제 처리는 PMN 화학 주성을 유의하게 회복시켰다(도 12D). 배양 시작 시 PMN에 10 μM CsH이 추가로 첨가되었을 때, 미처리 혈장에 노출된 CsH-처리-PMN의 화학 주성은 미처리 혈장에 노출된 CsH가 없는 PMN의 화학 주성과 유의하게 상이하지 않았다(도 12D). 상기 결과는 비드-항-mtFP 혼합제 치료를 통한 PMN 화학 주성의 구제가 주로 순환하는 mtFP에 의해 재활용된 FPR1-점유(occupancy)를 방지함으로써 매개됨을 나타낸다.
비드-항-mtFP 혼합제 치료를 통해 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 PMN 화학 주성 구제
본 발명자들은 비드-항-mtFP 혼합제가 순환하는 mtFP를 제거하고 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 PMN 화학 주성을 2차 감염 음성 환자 수준으로 회복시키는지 여부를 연구하였다. PMN과 혈장을 기증한 환자의 특성은 표 3과 같다. ICU에 입원한 후 10 ~ 14일 입원일(n = 3) 사이 2차 감염이 발생한 것을 인지한 환자로부터 동맥 카테터를 통해 혈액 시료들을 채취하였다. 인공호흡기 관련 폐렴(centilator-associated pneumonia; VAP), 중심선 관련 혈류 감염(central line-associated blood stream infection; CLABSI) 및 카테터 관련 요로 감염(catgeter-associated urinary tract infection; CAUTI)을 포함한 이차 감염은 질병 통제 및 예방 센터에서 발표한 2019년 NHSN(National Healthcare Safety Network) 환자 안전 구성 요소 매뉴얼에 따라 정의하였다. 또한, 입원 10일 ~ 14일 사이에 2차 감염이 발생하지 않은 패혈성 쇼크 환자로부터 혈액 시료들을 채취하였다(n = 3).
| 2nd infection (-) | 2nd infection (+) | ||||||
| Patient 1 | Patient 2 | Patient 3 | Patient 1 | Patient 2 | Patient 3 | ||
| Age (years) | 71 | 81 | 64 | 66 | 73 | 77 | |
| Gender | Male | Male | Female | Female | Male | Male | |
| Comorbidity | |||||||
| HT | Yes | Yes | Yes | ||||
| DM | Yes | Yes | Yes | ||||
| Chronic liver disease | Yes | ||||||
| Malignancy | Yes | Yes | |||||
| Charlson comorbidity index | 11 | 5 | 6 | 7 | 11 | 10 | |
| Primary infection pathogen | Gram (-) | Gram (+) | Gram (-) | Gram (+) | Gram (-) | Gram (-) | |
| Bacteremia | Yes | Yes | Yes | Yes | |||
| Primary infection site | Hepatobiliary | Respiratory | Gastrointestinal | Respiratory | Gastrointestinal | Respiratory | |
| Lactate level (mmol/L) | 6.8 | 10.4 | 9.1 | 5.9 | 12.6 | 9.5 | |
| SOFA score at admission | 10 | 14 | 12 | 11 | 17 | 14 | |
| Respiratory | 0 | 3 | 2 | 4 | 2 | 4 | |
| Cardiovascular | 3 | 4 | 4 | 3 | 4 | 4 | |
| Liver | 4 | 1 | 3 | 1 | 3 | 2 | |
| Renal | 1 | 2 | 0 | 1 | 3 | 0 | |
| Coagulation | 2 | 1 | 2 | 0 | 3 | 2 | |
| Neurologic | 0 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | |
| Management | |||||||
| Time to 1st antibiotics (hours) | 0.7 | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.4 | 0.8 | |
| MV duration | 0 | 21 | 16 | 14 | 29 | 53 | |
| Renal replacement therapy | Yes | Yes | Yes | ||||
| Hydrocortisone | Yes | Yes | Yes | Yes | Yes | ||
| Source control | Radiologic | ||||||
| Secondary infection | |||||||
| Secondary infection site | VAP | CLABSI | VAP | ||||
| Isolated pathogen | Acinetobacter baumanii | Enterococcus faecium | Pseudomonas aeruginosa | ||||
| Detection (hospital day) | 10 | 13 | 11 | ||||
| Blood sample (hospital day) | 14 | 10 | 13 | 10 | 14 | 12 | |
| SOFA score at secondary infection | 7 | 12 | 6 | 9 | 14 | 13 | |
| Respiratory | 1 | 2 | 1 | 4 | 1 | 3 | |
| Cardiovascular | 2 | 2 | 1 | 3 | 2 | 3 | |
| Liver | 2 | 1 | 2 | 0 | 4 | 1 | |
| Renal | 1 | 2 | 0 | 1 | 2 | 2 | |
| Coagulation | 1 | 2 | 2 | 0 | 3 | 2 | |
| Neurologic | 0 | 3 | 0 | 1 | 2 | 2 | |
| Clinical outcome | |||||||
| 90-day survival | Survival | Death | Survival | Survival | Death | Death | |
| Survival days till 90 days (days) | 90 | 78 | 90 | 90 | 29 | 53 | |
2nd infection (-) = secondary infection-negative patients; 2nd infection (+) = patients with septic shock who developed secondary infection; HT = hypertension; DM = diabetes mellitus; SOFA = Sequential Organ Failure Assessment; MV = mechanical ventilation; VAP = ventilator-associated pneumonia; CLABSI = central line-associated blood stream infection.
패혈성 쇼크 환자로부터 채취한 혈액 시료들로에서 혈장을 분리하여 무세포 혈장을 준비하였다. 그런 다음, 무세포 혈장의 절반을 비드-항-mtFP 혼합제와 함께 37°C에서 10rpm 회전기에서 2시간 동안 배양하고, 무세포 혈장의 나머지 절반을 비드-항-mtFP 혼합제 없이 배양하였다. 2차 감염 음성 환자의 혈장은 비드 항-mtFP 혼합제를 처리하지 않았다. 혈장 배양 기간 동안 환자의 PMN을 분리하고 37°C에서 10rpm 회전기에서 30분 동안 미처리 혈장에서 배양하였다. 4°C에서 10분 동안 220g의 원심분리 후 상층액을 버렸다. PMN 펠렛을 미처리 혈장 또는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재현탁하고 37°C에서 10rpm 회전기에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음 fMLF에 대한 PMN 화학 주성의 변화를 비교하였다.
2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 혈장에서 비드 항-mtFP 혼합제 치료는 ND6, ND3, ND4 및 ND5의 혈장 수준을 각각 139pM, 112pM, 104pM 및 135pM 감소시켰으나(도 13A 및 13B)(표 4), 다른 사이토카인 및 케모카인을 유의하게 제거하지 않았다(도 13C)(표 4). 자체 혈장에 노출되었을 때 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 PMN의 화학 주성은 2차 감염 음성 환자에서 얻은 PMN의 화학 주성보다 유의하게 낮았다(도 13D). 그러나, 비드-항-mtFP 혼합제 처리된 자체 혈장에 노출된 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자로부터 얻은 PMN에서는 화학 주성의 유의한 차이가 사라졌다(도 13D).
| Mean ± standard error (SE) | |||
| 2nd infection (-) | 2nd infection (+) | ||
| No treatment | Bead-anti-mtFPs | ||
| N = 3 | N = 3 | N = 3 | |
| mtFPs | |||
| ND6 (pM) | 82.01 ± 9.80 | 180.47 ± 22.04 | 63.86 ± 18.42 |
| ND3 (pM) | 128.38 ± 18.00 | 257.99 ± 16.11 | 138.52 ± 24.42 |
| ND4 (pM) | 28.30 ± 1.22 | 44.89 ± 4.78 | 20.94 ± 3.13 |
| ND5 (pM) | 50.40 ± 11.18 | 108.93 ± 24.97 | 32.30 ± 6.73 |
| Cytokines | |||
| TNF-α (pg/mL) | 57.85 ± 17.49 | 65.28 ± 21.91 | 63.92 ± 21.69 |
| IL-1β (pg/mL) | 26.17 ± 7.99 | 18.41 ± 4.31 | 17.06 ± 3.18 |
| IL-6 (pg/mL) | 164.48 ± 32.00 | 460.13 ± 267.66 | 421.05 ± 238.59 |
| IL-10 (pg/mL) | 91.23 ± 34.50 | 190.40 ± 53.36 | 181.62 ± 55.95 |
| Chemokines | |||
| GRO-α (pg/mL) | 271.06 ± 104.09 | 136.39 ± 46.37 | 125.28 ± 41.90 |
| IL-8 (pg/mL) | 149.76 ± 30.14 | 142.99 ± 21.95 | 134.04 ± 12.11 |
| LTB4 (pg/mL) | 84.26 ± 8.99 | 42.82* ± 10.61 | 42.08* ± 8.21 |
2nd infection (-) = secondary infection-negative patients; 2nd infection (+) = patients with septic shock who developed secondary infection; Bead-anti-mtFPs = bead-anti-mtFP cocktail treated; ND = nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit; pM = picomolar; TNF-α = tumor necrosis factor-α; IL-1β = interleukin-1β; IL-6 = interleukin 6; IL-10 = interleukin 10; GRO-α = growth-regulated oncogene-α; IL-8 = interleukin 8; LTB4 = leukotriene B4.* P < 0.05 versus 2nd infection (-).
건강한 지원자로부터 얻은 PMN과 달리, 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에게서 얻은 PMN에서 비드-항-mtPF 혼합제 처리된 자체 혈장에 노출된 PMN에서는 화학 주성이 회복되는 것으로 나타났으나 미처리 혈장에 노출된 PMN에 비교했을 때 통계적으로 유의성을 나타내지 않았다(도 12D 및 13D). 입원 시 패혈성 쇼크 환자와 이차 감염 음성 환자의 혈장 LTB4 수준은 각각 88pg/mL 및 84pg/mL이었다(표 2 및 표 4). 그러나, 2차 감염 시작 시 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자의 LTB4 수준은 91 pg/mL로 2차 감염 음성 환자의 LTB4 수준보다 유의하게 낮았다(도 13C)(표 4). 이는 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크에서 회복된 환자의 혈장 LTB4 수치가 2차 감염 음성 환자의 혈장 LTB4 수치보다 낮다는 본 발명자들의 이전 연구 결과와 일치한다. 또 다른 실험 연구에서는 LTB4가 PMN 화학 주성 동안 신호 중계 분자로 작용하고 LTB4가 PMN 분극을 향상시키고 fMLF에 대한 반응으로 PMN 이동을 증폭한다고 보고한 바 있다.
따라서 우리는 또한 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크 환자에서 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 노출된 PMN의 화학 주성에 대한 LTB4의 추가 치료 효과를 조사하였다. 동일한 환자로부터 얻은 PMN과 함께 배양 시작 시 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 재조합 LTB4 50pg/mL를 첨가하였다. 90분의 배양 후, PMN 화학주성을 측정하였다. 추가 재조합 LTB4가 있는 비드-항-mtFP 혼합제 처리 혈장에 90분 노출은 미처리 혈장에 노출된 PMN과 비교할 때 PMN 화학주성을 효과적으로 회복하였다(도 13D). 상기 결과는 혈장 LTB4가 순환하는 mtFP 제거 후 FPR 매개 PMN 화학주성의 회복에서 핵심 역할을 할 수 있고, 혈장 LTB4 수준이 패혈성 쇼크에서 회복하는 환자에서 면역 마비의 발병을 예측하는 가능한 바이오마커가 될 수 있음을 나타낸다.
즉, 순환하는 강력한 mtFP의 제거는 2차 감염이 발생한 패혈성 쇼크에서 회복 중인 환자에서 FPR1 매개 PMN 화학 주성을 구제하였다. 특히, protein A/sepharose를 ND6, ND3, ND4 및 ND5에 특이적인 항-mtFP 항체와 결합하여 만든 비드-항-mtFP 혼합제는 순환하는 강력한 mtFP를 성공적으로 제거하고 PMN 화학 주성을 회복하였다. 임상 환경에서 항-mtFP 항체를 부착하는 체외막을 사용하여 혈액 관류를 통해 순환하는 mtFP를 제거하는 것은 PMN 화학주성 아네르기(anergy)를 예방하기 위한 보조 치료 전략으로 고려될 수 있다. 과 염증 단계에서 살아남은 환자에서 이차 병원 감염의 발병을 예방함으로써 패혈성 쇼크 환자의 장기적인 임상 결과를 향상시킬 수 있다.
Claims (8)
- 혈액을 장치 내부로 흐르게 하는 혈액 유입부; 항-mTFP 항체(anti- mitochondrial N-formyl peptides antibody)를 포함하는 흡착 매체; 및 혈액을 장치 외부로 흐르게 하는 혈액 유출부;를 포함하는 혈액관류장치.
- 제 1항에 있어서,
상기 혈액관류장치는 병원 내 2차 감염의 발생을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈액관류장치.
- 제1항에 있어서,
상기 혈액관류장치의 대상 개체는 패혈증 환자, 패혈성 쇼크 환자, 중증외상환자, 장기 이식 환자, 출혈성 쇼크 환자, 심근경색 환자, 심인성 쇼크 환자, 뇌졸중 환자 및 심정지 후 생존 환자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈액관류 장치.
- 제1항에 있어서,
상기 mtFP는 mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6 (MT-ND6), MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 및 mitochondrial cytochrome c oxidase 1 (MT-COX1)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈액 관류 장치.
- 제1항에 있어서,
상기 혈액관류장치는 산소, 혈액-항응고제 및 leukotriene B4 (LTB4)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈액관류장치.
- 제1항에 있어서,
상기 항-mtFP 항체를 0.5 μg/mL ~ 20.0 μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈액 관류 장치.
- 제1항에 있어서,
상기 흡착 매체는 그 표면에 항-mtFP 항체가 부착 또는 코팅된 것을 특징으로 하는, 혈액관류장치.
- 제1항에 있어서,
상기 흡착매체는 섬유 형태(fiber form), 비드 형태(bead form), 필름 형태(film form) 및 유공 섬유형태(hollow-fiber form)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈액관류장치.
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| KR1020220176528A KR20240094339A (ko) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 병원 내 2차 감염을 감소시키기 위한 혈액관류장치 |
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| KR1020220176528A KR20240094339A (ko) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 병원 내 2차 감염을 감소시키기 위한 혈액관류장치 |
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| KR1020220176528A KR20240094339A (ko) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 병원 내 2차 감염을 감소시키기 위한 혈액관류장치 |
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