KR20240088845A - 건조된 나노입자 조성물 - Google Patents

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KR20240088845A
KR20240088845A KR1020247012267A KR20247012267A KR20240088845A KR 20240088845 A KR20240088845 A KR 20240088845A KR 1020247012267 A KR1020247012267 A KR 1020247012267A KR 20247012267 A KR20247012267 A KR 20247012267A KR 20240088845 A KR20240088845 A KR 20240088845A
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스티븐 그레고리 리드
대릭 알버트 카터
아미트 프라풀 칸드할
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에이치디티 바이오 코포레이션
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Abstract

건조된 조성물 및 핵산을 대상체에게 전달하는 데 사용하기 위한 상기 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 건조된 조성물은 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체, 하나 이상의 핵산, 및 적어도 하나의 동결보호제를 포함할 수 있다. 또한, 치료를 위해 이러한 건조된 조성물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

건조된 나노입자 조성물
교차 참조
본 출원은 2021년 9월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/247,172 및 2022년 1월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/297,449에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2022년 1월 18일에 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 201953-712601_SL.txt이고, 크기가 3,396 바이트이다.
백신을 포함하여, 다양한 치료 및 예방 제품이 질환에 이용 가능하다. 이러한 제품에 대한 업계의 과제는 안정성이다. 이러한 제품 중 상당수는 저온에서 유지되어야 하여, 안정성을 유지하기 위해 값비싼 냉각 장치 또는 액체 질소를 필요로 한다. 따라서, 최소한의 냉각 요구로 안정적이거나 실온에서 안정적인 치료 및 예방 제품에 있어서, 제조 용액, 조성물 및 이들의 용도에 대한 필요성이 있다.
조성물이 본원에 제공되고, 여기서 조성물은 건조된 조성물이다. 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 조성물은 소수성 코어, 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체; 하나 이상의 핵산; 및 적어도 하나의 동결보호제를 포함한다.
약학 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 약학 조성물은 적합한 희석제에서 재구성된 건조된 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 본원에 제공된 건조된 조성물을 포함하는 약학 조성물; 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함한다.
백신 전달 시스템이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 백신 전달 시스템은 약학 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 백신 보조제를 포함한다.
대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 하나 이상의 핵산 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
동결건조된 조성물을 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 및 (d) 제형을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
분무 건조된 조성물을 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 및 (d) 제형을 분무 건조하여 분무 건조된 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
동결건조된 조성물을 재구성하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 상기 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 제형을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성하는 단계; 및 (d) 적합한 희석제에서 동결건조된 조성물을 재구성하는 단계를 포함한다.
분무 건조된 조성물을 재구성하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 상기 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; (d) 제형을 분무 건조하여 분무 건조된 조성물을 형성하는 단계; 및 (e) 적합한 희석제에서 분무 건조된 조성물을 재구성하는 단계를 포함한다.
건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 소르비탄 지방산 에스테르, 에톡시화 소르비탄 에스테르, 양이온성 지질, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다.
건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트, DOTAP, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다.
건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 (a) 소수성 코어 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체; (b) 선택적으로 하나 이상의 핵산; 및 (c) (i) 건조된 조성물 중 적어도 약 50 중량%의 양으로 존재하거나, (ii) 적어도 50 mg의 양으로 존재하는 적어도 하나의 당을 포함한다.
약학 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 약학 조성물은 적합한 희석제에서 재구성된 본원에 제공된 건조된 조성물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 본원에 제공된 약학 조성물 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함한다.
대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 방법은 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 방법은 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 하나 이상의 핵산 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 방법은 본원에 기재된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
도 1a-1c는 나노입자(NP) 담체의 개략도를 보여준다. 도 1a는 수중유 에멀션을 보여준다. 도 1b는 나노구조화된 지질 담체(NLC)를 보여준다. 도 1c는 액체 오일 중에 무기 나노입자를 갖는 나노입자를 보여준다.
도 2는 동결건조 사이클 #1 후 시간 = 0시간(hour)에서, 표시된 당 조성에서 지질 담체 제형 및 나노구조화된 지질 담체(NLC)에 대한 케이크의 모습을 예시한다.
도 3은 동결건조 사이클 #1 후 25℃ 및 42℃에서 24시간 후에, 표시된 당 조성에서 지질 담체 제형 및 나노구조화된 지질 담체(NLC)에 대한 케이크의 모습을 예시한다.
도 4는 동결건조 사이클 #1 후 25℃ 및 42℃에서 24시간에, 표시된 당 조성에서 지질 담체 제형 및 나노구조화된 지질 담체(NLC)의 모습을 예시한다.
도 5a-5b는 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서, 25℃ 및 42℃에서 보관 1일 후 재구성된 케이크의 입자 크기를 예시한다. 도 5a는 표시된 당 조성에서, 시간 = 0시간에서 액체 제형에 대한 배수-변화를 보여준다. 도 5b는 표시된 당 조성에서, PDI의, 시간 = 0시간에서 액체 제형에 대한 점 변화를 보여준다.
도 6a-6b는 지질 담체 + RNA 및 NLC + RNA 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성(integrity)을 예시한다. 도 6a는 지질 담체 + RNA 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성을 보여준다. 도 6b는 지질 담체 + RNA 및 NLC + RNA 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성을 보여준다.
도 7a-7g는 지질 담체 + repRNA 및 NLC + repRNA-SEAP 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 BHK21 세포에서의 SEAP 발현을 예시한다. 도 7a는 10% 트레할로스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7b는 5% 만니톨 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7c는 10% 수크로스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7d는 20% 수크로스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7e는 5% 글루코스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7f는 10% 말토스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7g는 10% 수크로스 중 NLC + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다.
도 8은 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 다양한 시점(시간 = 0시간, 25℃에서 6일 후 및 25℃에서 1개월 후)에서 지질 담체 + RNA-SEAP 케이크의 모습을 예시한다.
도 9는 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 다양한 시점(시간 = 0시간, 42℃에서 24시간 후, 42℃에서 3일 후 및 42℃에서 1개월 후)에서 지질 담체 + RNA-SEAP 케이크의 모습을 예시한다.
도 10a-10b는 동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서 보관 1일 후 재구성된 케이크의 입자 크기를 예시한다. 도 10a는 표시된 당 조성에서 재구성된 제형의 PDI의 점 변화를 보여준다. 도 10b는 지질 담체 + RNA 새로운 복합체에 대한 입자 크기의 log10 배수 변화를 보여준다.
도 11은 동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성을 예시한다.
도 12는 동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서 BHK21 세포에서의 SEAP 발현을 예시한다.
도 13a-13b는 미글리올-지질 담체 제형이 대식세포에서 향상된 repRNA 단백질 생산을 유도하는 것을 보여준다. 도 13a는 첫 번째 실험에서 나노 루시페라아제 인코딩 레플리콘 RNA를 갖는 다양한 제형의 흡수 스펙트럼을 보여준다. 도 13b는 두 번째 실험에서 나노 루시페라아제 인코딩 레플리콘 RNA를 갖는 다양한 제형의 흡수 스펙트럼을 보여준다.
도 14a-14b는 미글리올 제형을 사용한 대식세포에서의 감소된 TNF-알파(α) 생산을 보여준다. 도 14a는 첫 번째 실험에서 다양한 제형에 대한 TNF-알파의 생산을 보여준다. 도 14b는 두 번째 실험에서 다양한 제형에 대한 TNF-알파의 생산을 보여준다.
도 15a-15b는 미글리올 제형을 사용한 대식세포에서의 향상된 단백질 생산과 낮은 TNF-알파 생산 사이의 상관관계를 보여준다. 도 15a는 첫 번째 실험에서 다양한 제형에 대한 sec-나노 루시페라아제(NanoLuc)와 TNF-알파 사이의 상관관계를 보여준다. 도 15b는 두 번째 실험에서 다양한 제형에 대한 sec-나노 루시페라아제와 TNF-알파 사이의 상관관계를 보여준다.
도 16a-16f는 지질 담체-제형화된 DNA SEAP의 다양한 반복으로 근육내 주사한 BALB/c 마우스에서의 SEAP 수준을 예시한다. 도 16a는 4일차의 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 16b는 6일차의 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 16c는 8일차의 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 16d는 4일차의 상대 발광 단위(RLU)의 사본이다. 도 16e는 6일차의 상대 발광 단위(RLU)의 사본이다. 16f는 8일차의 상대 발광 단위(RLU)의 사본이다.
도 17은 조건 1 내지 14에 대해 Y-축에 다분산도 지수(PDI) 및 Z-평균 측정의 측정치 및 X-축에 그룹 번호가 있는 막대 차트이다.
도 18a-18b는 조건 1 내지 14에 대한 항-D614G IgG 수준을 보여주는 도트 차트를 보여준다. 도 18a는 조건 1 내지 14에 대해 Y축에 IgG(μg/ml), X축에 그룹 번호가 있는 도트 차트를 보여준다. 측정은 항-D614G(1:40 희석) IgG 반응에 대해 14일차에 기록되었다. 도 18b는 조건 1 내지 14에 대해 Y축에 IgG(μg/ml), X축에 그룹 번호가 있는 도트 차트를 보여준다. 측정은 항-D614G(1:200 희석) IgG 반응에 대해 28일차에 기록되었다.
도 19는 Y축에 항-D614G(1:200 희석) IgG(μg/ml) 측정치 및 X축에 보관 조건의 표시가 있는 28일차의 도트 차트를 보여준다.
이제 다양한 양태들이 이하에서 보다 충분히 설명될 것이다. 그러나, 이러한 양태들은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본원에 제시된 실시양태들로 제한되어서는 안되고; 오히려, 이러한 실시양태들이 제공되어, 본 개시내용은 철저하고 완전해질 것이며, 그 범위를 당업자에게 충분히 전달할 것이다.
향상된 안정성 프로파일을 갖는 치료적으로 관련된 조성물의 생성 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은, 선택적으로 핵산과 복합체화된 지질 나노입자 담체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 동결 건조된다.
정의
본원에 정의되고 사용되는 모든 정의는, 사전적 정의, 참조로 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 통상의 의미를 지배하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참조 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 청구 객체(subject matter)와 관련하여 참조로 포함되며, 이는 일부 경우에 문서의 전체를 포괄할 수 있다. 특허 참조 문헌 및 비-특허 참조 문헌을 포함하여, 본원에 개시된 모든 참조 문헌은 마치 각각이 개별적으로 포함된 것처럼 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 그러나, 명시적인 정의를 포함하는 특허, 특허 출원 또는 간행물이 참조로 포함된 경우, 이러한 명시적인 정의는, 이들이 확인되는, 포함된 특허, 특허 출원 또는 간행물에는 적용되면서도 본 출원의 본문, 특히 본 출원의 청구범위에는 반드시 적용되는 것은 아니어서, 이 경우에 본원에 제공된 정의가 대신하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
본 명세서 및 청구범위 내에서 본원에 사용된 바와 같은 부정관사 "a" 및 "an"은, 달리 명확하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위 내에서 본원에 사용된 바와 같은 어구 "및/또는"은 그렇게 등위 접속된(conjoined) 요소 중 "둘 중 하나 또는 둘 모두", 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다수의 요소들은 동일한 방식, 즉 그렇게 등위 접속된 요소들 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 외에, 구체적으로 식별된 그러한 요소와 관련이 있든 관련이 없든, 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, "A 및/또는 B"에 대한 기재는, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형(open-ended) 언어와 함께 사용되는 경우, 하나의 실시양태에서 A 단독(선택적으로 B 이외의 요소 포함); 다른 실시양태에서 B 단독(선택적으로 A 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서 A와 B 모두(선택적으로 다른 요소 포함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위 내에서 본원에 사용된 바와 같이, "또는"은 위에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석되어야 하고, 즉 요소의 개수 또는 목록 중 하나 초과도 포함해서 적어도 하나, 및 선택적으로 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~의 단 하나" 또는 "~의 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "~로 구성된"과 같이 달리 명확하게 나타낸 용어만이 요소의 개수 또는 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "~의 하나", "~의 단 하나" 또는 "~의 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 앞에 올 경우 배타적인 대안(즉, "둘 중 하나 또는 둘 다 아님")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에 사용될 때 "본질적으로 구성되는"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같이 이의 통상의 의미를 가질 것이다.
본 개시내용의 조성물은 개시된 구성성분을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적" 또는 "선택적으로"는 그 뒤에 기재되는 상황이 발생할 수도 있거나, 발생하지 않을 수 있음을 의미하는 바, 상기 기재는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값의 최대 ± 20% 범위를 의미한다. 본 출원 및 청구범위에 특정 값이 기재된 경우, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며 이러한 맥락에서 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "N/P 비율(또는 N:P)"은 양전하를 띠는 중합체 아민(N = 질소) 기 대 음전하를 띠는 핵산 포스페이트(P) 기의 비율을 지칭한다. 중합체/핵산 복합체의 N/P 특성은 순 표면 전하, 크기 및 안정성과 같은 다른 많은 특성에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 질소 염기(예를 들어, 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U), 아데닌(A) 또는 구아닌(G)) 내 또는 그 위에 하나 이상의 화학적 변형(예를 들어, 치환)을 함유하는 뉴클레오티드를 지칭한다.
값의 범위가 본원에 제공되는 경우, 해당 범위의 상한과 하한 사이에서, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 하한의 단위의 10분의 1까지, 사이에 있는 각각의 값, 및 해당 명시된 범위 내에서 임의의 다른 명시된 값 또는 사이에 있는 값이 본 개시내용 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은, 명시된 범위에서 구체적으로 배제된 임의의 한계에 따라 본 개시내용 내에 포괄되는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외하는 범위도 개시내용에 포함된다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우, 그 분수(예컨대 정수의 1/10 및 100분의 1)를, 달리 나타내지 않는 한, 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 언급된 임의의 숫자 범위는 달리 나타내지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
나노입자 담체 시스템
나노입자 또는 복수의 나노입자를 포함하는 다양한 조성물이 본원에 제공된다. 나노입자는 또한 본원에서 담체로 지칭되었거나 NP로 약칭되었다. 본원에 제공된 나노입자는 직경이 약 1 마이크로미터(μm) 미만인 유기 물질, 무기 물질, 또는 무기 물질과 유기 물질의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 본원에 제공된 생물활성제용 전달 시스템으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 소수성 코어, 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체; 하나 이상의 핵산; 및 적어도 하나의 동결보호제를 포함하는 건조된 조성물이 제공된다. 조성물은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 분무 건조되거나 동결건조될 수 있다. 조성물은 열적으로 안정하다. 예를 들어, 조성물은 약 25℃, 약 45℃, 약 -20℃, 및 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정하다. 조성물은 적어도 1주, 적어도 2주, 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정하다.
본원에 기재된 조성물을 동결 건조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 승화 또는 1차 건조가 이 시점에서 실시되어 결합되지 않은 물을 제거하고; 그 후에 2차 건조가 수행되어, 결합수를 승화시키고, 물질을 원하는 잔류 수분 수준으로 낮춘다. 이 단계에서 물은 결합되지 않은 것이 아니라 표적에 결합되어 있다는 점을 고려하면, 전형적으로 이 과정을 추진하는 데 더 많은 에너지가 필요하다. 분무 건조가 사용될 수 있으며, 이는 종종 더 빠른 과정이고, 단일 단계에서 건조 분말로의 액체 제형의 변환을 수반한다. 용액은 미세한 액적으로 원자화되고, 이는 따뜻한 기체를 사용하여 대형 챔버에서 곧바로 빠르게 건조된다. 생성된 건조 입자는 이후 사이클론으로 수집될 수 있다. 추가적인 건조 기술은, 예를 들어 분무 동결 건조 및 초임계 유체 건조를 포함한다.
본 개시내용은 RNA와 같은 하나 이상의 핵산의 담체로서 지질 담체의 용도를 제공한다. 특히, 완충액에 하전된 코팅이 있는 지질 매트릭스의 고체 무기 코어가 개시된다. 이러한 나노입자의 사용은 수많은 장점을 갖는다: RNA는 입자와 무관하게 복합체화될 수 있으며, 입자는, 예컨대 MRI 또는 기타 영상화 기술에 사용할 수 있는 자기 신호를 갖도록 디자인될 수 있다. RNA는 입자에 의해 보호되며, 이들은 세포나 생명체에 제공되는 경우, 보호된 RNA 중 항원을 포함한 다양한 유형의 단백질의 발현을 막아낸다.
다양한 나노입자 및 나노입자의 제형(즉, 나노에멀션)이 사용된다. 예시적인 나노입자는 도 1a-도 1c에 예시된다. 본원에 제공된 나노입자는, 비제한적으로, 수중유 에멀션, 나노구조화된 지질 담체(NLC), 양이온성 나노에멀션(CNE), 소포성 인지질 겔(VPG), 중합체성 나노입자, 양이온성 지질 나노입자, 리포솜, 금 나노입자, 고체 지질 나노입자(LNP 또는 SLN), 혼합상 코어 NLC, 이온화 가능한 지질 담체, 자성 담체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-기능화 담체, 콜레스테롤-기능화 담체, 폴리락트산(PLA)-기능화 담체 및 폴리락트산-코-글리콜산(PLGA)-기능화 지질 담체를 포함할 수 있다.
도 1a(크기 조정되지 않음)에 예시된 바와 같이, 수중유 에멀션은 물 또는 수성 상에 분산된 오일 액적을 함유하는 안정적이고, 혼합되지 않는 유체이다. 도 1b(크기 조정되지 않음)는 고체 유기 지질(예를 들어, 트리미리스틴)과 액체 오일(예를 들어, 스쿠알렌)의 블렌드를 포함할 수 있는 나노구조화된 지질 담체(NLC)를 예시한다. NLC에서, 고체 지질은 액체 오일에 분산된다. 전체 나노액적은 수성(물) 상에 분산된다. 일부 실시양태에서, 나노입자는, 액체 오일에 분산된 고체 무기 나노입자(예를 들어, 철 옥사이드 나노입자)로서, 도 1c(크기 조정되지 않음)에 예시된 바와 같이, 무기 나노입자를 포함한다. 그 후, 전체 나노액적은 수성(물) 상에 콜로이드로서 분산된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 수용액에 분산된다. 수용액의 비제한적인 예는 물(예를 들어, 멸균, 증류, 탈이온화, 초순수, RNAse-미함유 등), 식염수 용액(예를 들어, 크레브(Kreb's), 아스카리스(Ascaris), 덴트(Dent's), 테트(Tet's) 식염수) 또는 1%(w/v)의 물 중 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함한다.
지질 담체를 포함하는 다양한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 지질 담체는 소수성 코어, 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션이다. 지질 담체의 소수성 코어는 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 액체 상이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 친수성 표면을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친수성 표면은 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친수성 표면은 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 막을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막은 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 양이온성 지질을 포함한다. 친수성 표면 내 포함을 위한 예시적인 양이온성 지질은, 비제한적으로 다음을 포함한다: l,2-디올레오일옥시-3 (트리메틸암모늄)프로판(DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄) 카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤), 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); l,2-디미리스토일 3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP),디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP), 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP), N-[l-(2,3- 디올레일옥시)프로필]N,N,N트리메틸암모늄, 클로라이드(DOTMA), N,N-디올레오일-N,N- 디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC), l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP), 및 1,2- 디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLinDMA),1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 306Oi10, 테트라키스(8-메틸노닐) -(((메틸아잔디일) 비스(프로판-3,1 디일))비스(아잔트리일))테트라프로피오네이트, 9A1P9, 데실(2-(디옥틸암모니오)에틸) 포스페이트; A2-Iso5-2DC18, 에틸 5,5-디((Z)-헵타데크-8-엔-1-일)-1-(3-(피롤리딘-1-일)프로필)-2,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-카복실레이트; ALC-0315, ((4-하이드록시부틸)아잔디일)비스(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트); ALC-0159, 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드; β-시토스테롤, (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((2R,5R)-5-에틸-6-메틸헵탄-2-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-올; BAME-O16B, 비스(2-(도데실디설파닐)에틸) 3,3′-메틸-9-옥소-10-옥사-13,14-디티아-3,6-디아자헥사코실)아잔디일)디프로피오네이트; BHEM-콜레스테롤, 2-(((((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일)옥시)카보닐)아미노)-N,N-비스(2-하이드록시에틸)-N-메틸에탄-1-아미늄 브로마이드; cKK-E12, 3,6-비스(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진-2,5-디온; DC-콜레스테롤, 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤; DLin-MC3-DMA, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트; DOPE, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; DOSPA, 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트; DSPC, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린; ePC, 에틸포스파티딜콜린; FTT5, 헥사(옥탄-3-일) -((((벤젠-1,3,5-트리카보닐)이리스(아잔디일)) 트리스 (프로판-3,1-디일)) 트리스(아잔트리일))헥사노나노에이트; 지질 H(SM-102), 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(6-옥소-6-(운데실옥시)헥실)아미노) 옥타노에이트; OF-Deg-Lin, (((3,6-디옥소피페라진-2,5-디일)비스(부탄-4,1-디일))비스(아잔아잔))테트라키스(에탄-2,1-디일)()-테트라키스 (옥타데카-9,12-디에노에이트); PEG2000-DMG, (R)-2,3-비스(미리스토일옥시)프로필-1-(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카바메이트; TT3, 또는 N1,N3,N5-트리스(3-(디도데실아미노)프로필)벤젠-1,3,5-트리카복사미드. 지질의 적합한 부류의 다른 예는, 비제한적으로, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG); 및 상기 지질 중 임의의 것의 페길화(PEGylated) 버전을 포함하는 페길화 지질(예를 들어, DSPE-PEG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 DOTAP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 액체 상이다. 사용될 수 있는 오일의 비제한적인 예는 α-토코페롤, 코코넛유, 포도씨유, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 광유, 모노아실글리세롤, 팜핵유(palm kernel oil), 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 프로폴리스, 스쿠알렌, 스쿠알란, 솔라네솔(solanesol), 대두 레시틴, 대두유, 해바라기유, 트리글리세리드 또는 비타민 E를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 트리글리세리드를 포함한다. 예시적인 트리글리세리드는, 비제한적으로, 카프릭 트리글리세리드, 카프릴릭 트리글리세리드, 카프릴릭 및 카프릭 트리글리세리드, 트리글리세리드 에스테르 및 미리스트산 트리글리세린을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 액체 유기 물질 및 고체 무기 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 무기 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 무기 입자는 고체 무기 입자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 소수성 코어 내에 무기 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 고체 상이다. 일부 실시양태에서, 오일은 솔라네솔을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 소수성 코어 내에 금속을 포함한다. 금속은 비제한적으로 금속염, 금속 옥사이드, 금속 하이드록사이드 또는 금속 포스페이트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드(Fe3O4, Fe2O3, FeO 또는 이들의 조합), 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 무기 입자는 하나 이상의 동일하거나 상이한 금속(전이 금속을 포함한 임의의 금속)으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무기 입자는 전이 금속 옥사이드이다. 일부 실시양태에서, 전이 금속은 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트()(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3)이다. 일부 실시양태에서, 금속은 알루미늄하이드록사이드 또는 알루미늄 옥시하이드록사이드이고, 포스페이트-말단 지질 또는 계면활성제, 예컨대 올레산, 올레일아민, SDS, TOPO 또는 DSPA는, 소수성 코어를 형성하기 위해 무기 고체 나노입자가 액체 오일과 혼합되기 전에, 무기 고체 나노입자를 코팅하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 금속은 상자성, 초상자성, 페리자성 또는 강자성 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 금속은 초상자성 철 옥사이드(Fe3O4)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 양이온성 지질, 오일 및 무기 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 DOTAP; 스쿠알렌 및/또는 글리세릴 트리미리스테이트-다이나산(dynasan); 및 철 옥사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 계면활성제를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 양이온성 지질, 오일, 무기 입자 및 계면활성제를 포함한다.
계면활성제는 본원에 제공된 나노입자의 두 액체 사이 또는 액체와 고체 구성성분 사이의 표면 장력을 낮추는 화합물이다. 계면활성제는 소수성, 친수성 또는 양친매성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 소수성 계면활성제를 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 소수성 계면활성제는, 비제한적으로 소르비탄 모노라우레이트(SPAN® 20), 소르비탄 모노팔미테이트(SPAN® 40), 소르비탄 모노스테아레이트(SPAN® 60), 소르비탄 트리스테아레이트(SPAN® 65), 소르비탄 모노올리에이트(SPAN® 80) 및 소르비탄 트리올리에이트(SPAN® 85)를 포함한다. 적합한 소수성 계면활성제는 10 이하, 예를 들어, 5 이하, 1 내지 5, 또는 4 내지 5의 친수성-친유성 평형(HLB) 값을 갖는 것들을 포함한다. 예를 들어, 소수성 계면활성제는 1 내지 5, 또는 4 내지 5의 HLB 값을 갖는 소르비탄 에스테르일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 유화제로도 지칭되는 친수성 계면활성제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 폴리소르베이트를 포함한다. 폴리소르베이트는 지방산으로 에스테르화된 에톡시화 소르비탄(소르비톨의 유도체)로부터 유래된 오일 함유 액체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자 또는 지질 담체는 친수성 계면활성제를 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 친수성 계면활성제는, 비제한적으로 폴리소르베이트, 예컨대 TWEEN®, Kolliphor, Scattics, Alkest 또는 Canarcel; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(폴리소르베이트); 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 또는 TWEEN® 80); 폴리소르베이트 60(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트 또는 TWEEN® 60); 폴리소르베이트 40(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 또는 TWEEN® 40); 및 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 또는 TWEEN® 20)을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 친수성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
본원에 제공된 나노입자는 지질막(예를 들어, DOTAP와 같은 양이온성 지질)으로 둘러싸인 소수성 코어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 코어는 하나 이상의 무기 입자; 포스페이트-말단 지질; 및 계면활성제를 포함한다.
본원에 기재된 무기 고체 나노입자는 액체 오일과 혼합되기 전에 표면 개질될 수 있다. 예를 들어, 무기 고체 나노입자의 표면이 친수성인 경우, 무기 고체 나노입자는, 나노에멀션 입자의 "오일" 상으로 액체 오일과 무기 고체 나노입자의 혼화를 용이하게 하기 위해 소수성 분자(또는 계면활성제)로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무기 입자는 캡핑 리간드, 포스페이트-말단 지질 및/또는 계면활성제로 코팅된다. 일부 실시양태에서 소수성 코어는 포스페이트-말단 지질을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 포스페이트-말단 지질은, 비제한적으로, 트리옥틸포스핀 옥사이드(TOPO) 또는 디스테아릴 포스파티드산(DSPA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 코어는 계면활성제를 포함하고, 이는 인-말단 계면활성제, 카복실레이트-말단 계면활성제, 설페이트-말단 계면활성제 또는 아민-말단 계면활성제이다. 전형적인 카복실레이트-말단 계면활성제는 올레산을 포함한다. 전형적인 아민 말단 계면활성제는 올레일아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 디스테아릴 포스파티드산(DSPA), 올레산, 올레일아민 또는 소듐 도데실 설페이트(SDS)이다. 일부 실시양태에서, 무기 고체 나노입자는 금속 옥사이드, 예컨대 철 옥사이드이고, 계면 활성제, 예컨대, 올레산, 올레일아민, SDS, DSPA 또는 TOPO는, 소수성 코어를 형성하기 위해 무기 고체 나노입자가 액체 오일과 혼합되기 전에, 무기 고체 나노입자를 코팅하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 소수성 코어는, 포스페이트-말단 지질, 인-말단 계면활성제, 카복실레이트-말단 계면활성제, 설페이트-말단 계면활성제 또는 아민-말단 계면활성제로 선택적으로 코팅된 적어도 하나의 금속 하이드록사이드 또는 옥시하이드록사이드 입자를 함유하는 하나 이상의 무기 입자; 및 자연 발생 또는 합성 스쿠알렌을 함유하는 액체 오일; DOTAP를 포함하는 양이온성 지질; 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하는 소수성 계면활성제; 및 폴리소르베이트를 포함하는 친수성 계면활성제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 소수성 코어는 TOPO로 선택적으로 코팅된 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 옥시하이드록사이드 나노입자를 함유하는 하나 이상의 무기 나노입자, 및 자연 발생 또는 합성 스쿠알렌을 함유하는 액체 오일; 양이온성 지질 DOTAP; 소르비탄 모노스테아레이트를 포함하는 소수성 계면활성제; 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 친수성 계면활성제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 소수성 코어는, 포스페이트-말단 지질, 인-말단 계면활성제, 카복실레이트-말단 계면활성제, 설페이트-말단 계면활성제, 또는 아민-말단 계면활성제로 선택적으로 코팅된 적어도 하나의 금속 하이드록사이드 또는 옥시하이드록사이드 입자를 함유하는 하나 이상의 무기 입자; 및 자연 발생 또는 합성 스쿠알렌을 함유하는 액체 오일; DOTAP를 포함하는 양이온성 지질; 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하는 소수성 계면활성제; 및 폴리소르베이트를 포함하는 친수성 계면활성제로 구성된다. 일부 실시양태에서, 소수성 코어는 TOPO로 선택적으로 코팅된 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 옥시하이드록사이드 나노입자를 함유하는 하나 이상의 무기 나노입자, 및 자연 발생 또는 합성 스쿠알렌을 함유하는 액체 오일; 양이온성 지질인 DOTAP; 소르비탄 모노스테아레이트를 포함하는 소수성 계면활성제; 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 친수성 계면활성제로 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 0.2% 내지 약 40% w/v 스쿠알렌, 약 0.001% 내지 약 10% w/v 철 옥사이드 나노입자, 약 0.2% 내지 약 10 % w/v DOTAP, 약 0.25% 내지 약 5% w/v 소르비탄 모노스테아레이트, 및 약 0.5% 내지 약 10% w/v 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 2% 내지 약 6% w/v 스쿠알렌, 약 0.01% 내지 약 1% w/v 철 옥사이드 나노입자, 약 0.2% 내지 약 1 % w/v DOTAP, 약 0.25% 내지 약 1% w/v 소르비탄 모노스테아레이트, 및 약 0.5% 내지 약 5% w/v 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 0.2% 내지 약 40% w/v 스쿠알렌, 약 0.001% 내지 약 10% w/v 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 옥시하이드록사이드 나노입자, 약 0.2% 내지 약 10 % w/v DOTAP, 약 0.25% 내지 약 5% w/v 소르비탄 모노스테아레이트, 및 약 0.5% 내지 약 10% w/v 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 2% 내지 약 6% w/v 스쿠알렌, 약 0.01% 내지 약 1% w/v 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 옥시하이드록사이드 나노입자, 약 0.2% 내지 약 1 % w/v DOTAP, 약 0.25% 내지 약 1% w/v 소르비탄 모노스테아레이트, 및 약 0.5% 내지 약 5% w/v 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 표 1에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 나노입자 제형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 NP-1 내지 NP-30 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 NP-1 내지 NP-31 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 본원에 제공된 핵산과 혼합된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 균질화 및 초음파 처리 기술에 의해 제조된다.
표 1: 나노입자 제형
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 소르비탄 모노스테아레이트(예를 들어, SPAN® 60), 폴리소르베이트 80(예를 들어, TWEEN® 80), DOTAP, 스쿠알렌을 포함하고, 고체 입자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 소르비탄 모노스테아레이트(예를 들어, SPAN® 60), 폴리소르베이트 80(예를 들어, TWEEN® 80), DOTAP, 스쿠알렌 및 철 옥사이드 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 면역 자극제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 자극제는 스쿠알렌이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극제는 중간 사슬(medium chain) 트리글리세리드이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극제는 Miglyol 810 또는 Miglyol 812이다. Miglyol 810은 포화된 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르이다. Miglyol 812는 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르이다. 일부 실시양태에서, 면역 자극제는 생성된 단백질의 총량을 감소시킬 수 있지만, 본원에 제공된 조성물에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 백신으로 전달되는 경우). 일부 실시양태에서, 면역 자극제는 생성된 단백질의 총량을 증가시킬 수 있지만, 본원에 제공된 조성물에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
본원에 제공된 나노입자는 크기가 다양한 평균 직경의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 20 나노미터(nm) 내지 약 200 nm 범위의 평균 직경(z-평균 유체역학적 직경, 동적 광 산란에 의해 측정됨)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 z-평균 직경은 약 20 nm 내지 약 150 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm, 약 20 nm 내지 약 80 nm, 약 20 nm 내지 약 60 nm의 범위이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 z-평균 직경은 약 40 nm 내지 약 200 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 40 nm 내지 약 90 nm, 약 40 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 40 nm 내지 약 60 nm의 범위이다. 하나의 실시양태에서, 나노입자의 z-평균 직경은 약 40 nm 내지 약 80 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 z-평균 직경은 약 40 nm 내지 약 60 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 직경이 최대 100 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 직경이 50 내지 70 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 직경이 40 내지 80 nm이다. 일부 실시양태에서, 나노 입자의 소수성 코어 내에 있는 무기 입자(예를 들어, 철 옥사이드)는 약 3 nm 내지 약 50 nm 범위의 평균 직경(수 가중(number weighted) 평균 직경)일 수 있다. 예를 들어, 무기 입자는 약 5 nm, 약 10 nm, 약 15 nm, 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm 또는 약 50 nm의 평균 직경을 가질 수 있다.
본원에 제공된 나노입자는 크기 분포에 대한 품질의 지표인 다분산도 지수(PDI)를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자의 평균 다분산도 지수(PDI)는 약 0.1 내지 약 0.5의 범위이다. 일부 실시양태에서, 나노입자의 평균 PDI는 약 0.2 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.4, 약 0.2 내지 약 0.4, 약 0.2 내지 약 0.3, 또는 약 0.1 내지 약 0.3의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 0.1:1 내지 약 20:1, 약 0.5:1 내지 약 12:1, 약 0.5:1 내지 약 9:1, 약 0.5:1 내지 약 5:1, 약 0.5:1 내지 약 3:1, 또는 약 0.5:1 내지 약 1:1 범위의 오일-대-계면활성제 몰비를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 0.1:1 내지 약 2:1, 약 0.2:1 내지 약 1.5:1, 약 0.3:1 내지 약 1:1, 약 0.5:1 내지 약 1:1, 또는 약 0.6:1 내지 약 1:1 범위의 친수성 계면활성제-대-지질 비율을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 0.1:1 내지 약 5:1, 약 0.2:1 내지 약 3:1, 약 0.3:1 내지 약 2:1, 약 0.5:1 내지 약 2:1, 또는 약 1:1 내지 약 2:1 범위의 소수성 계면활성제-대-지질 비율을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 약 0.2% 내지 약 40% w/v 액체 오일, 약 0.001% 내지 약 10% w/v 무기 고체 나노입자, 약 0.2% 내지 약 10% w/v 지질, 약 0.25% 내지 약 5% w/v 소수성 계면활성제, 및 약 0.5% 내지 약 10% w/v 친수성 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질은 양이온성 지질을 포함하고, 오일은 스쿠알렌을 포함하고/하거나, 소수성 계면활성제는 소르비탄 에스테르를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 나노입자는 8 내지 11의 친수성-친유성 평형을 초래하는 에스테르의 비율을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 본원에 제공된 지질 담체와 통합되거나, 이와 연합되거나, 이와 복합체화되어, 지질 담체-핵산 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체-핵산 복합체는 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성된다.
핵산
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다. 선천성 면역 반응을 조절하는 RNA, 단백질 또는 항원을 인코딩하는 RNA, 침묵 RNA, 마이크로RNA, tRNA, 자가 복제 RNA 등을 포함하여, 다양한 RNA가 전달을 위한 지질 담체 입자와 연합될 수 있다. 본 개시내용의 특정 양태에서, RNA는 자가 복제 RNA이다.
나노입자 및 핵산을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 나노입자와 복합체를 이룬다. 일부 실시양태에서, 핵산은 나노입자의 막과 복합체를 이룬다. 일부 실시양태에서, 핵산은 나노입자의 친수성 표면과 복합체를 이룬다. 일부 실시양태에서, 핵산은 나노입자 내에 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 소수성 코어 내에 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 RNA 또는 DNA 폴리머라제를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 RNA 폴리머라제(예를 들어, VEEV 폴리머라제)와 같은 자가 복제를 위한 요소를 인코딩한다.
자가 복제 뉴클레오티드는 일반적으로 바이러스 레플리카아제, 바이러스 프로테아제, 바이러스 헬리카제 및 다른 비구조적 바이러스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 유전자를 함유하고, 또한 5'- 및 3'-말단 cis-활성 복제 서열 및 암 관련 단백질을 인코딩하는 항원 서열을 포함한다. 이종 서열(들)의 발현을 지시하는 서브게놈 프로모터가 자가 복제 뉴클레오티드 서열에 포함될 수 있다. 원하는 경우, 이종 서열은 자가 복제 RNA의 다른 코딩 영역으로 프레임 내에서 융합될 수 있고/있거나 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 제어 하에 있을 수 있다.
다양한 실시양태에서, 자가 복제 뉴클레오티드 서열은 자가 복제 RNA 분자이다. 본 개시내용의 자가 복제 RNA 분자는 자가 복제 RNA 분자가 감염성 바이러스 입자의 생성을 유도할 수 없도록 설계될 수 있다. 이는, 예를 들어 자가 복제 RNA에서 바이러스 입자의 생성에 필요한 구조 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 바이러스 유전자를 생략함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 자가 복제 RNA 분자가 알파 바이러스, 예컨대 신드비스 바이러스(SIN), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE)를 기반으로 하는 경우, 외피 당단백질 및/또는 캡시드와 같은 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 생략될 수 있다. 원하는 경우, 본 개시내용의 자가 복제 RNA 분자는 약독화되거나 악성인 감염성 바이러스 입자의 생성을 유도하거나, 단일 라운드의 후속 감염이 가능한 바이러스 입자를 생성하도록 설계될 수 있다.
자가 복제 RNA 분자는 어떠한 단백질 없이도 척추동물 세포에 전달될 때 그 자체로부터(또는 그 자체의 안티센스 카피로부터) 전사에 의해 다중 딸 RNA의 생성을 초래할 수 있다. 자가 복제 RNA는 세포에 전달된 후 직접 번역될 수 있으며, 이러한 번역은 전달된 RNA로부터 전사물을 그 후에 생성하는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 제공한다. 따라서, 전달된 RNA는 다중 딸 RNA의 생산으로 이어진다. 이러한 전사물은 전달된 RNA에 대한 안티센스이며, 인코딩된 암-관련 단백질의 현장(in situ) 발현을 제공하도록 그들 자신이 번역될 수 있거나, 인코딩된 암-관련 단백질(들)의 현장 발현을 제공하도록 번역되는, 전달된 RNA와 동일한 센스를 갖는 추가 전사물을 제공하도록 전사될 수 있다.
원하는 경우, 자가 복제 RNA는, 포스페이트, 또는 뉴클레오시드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6-원 당 유사체 또는 열린-사슬 당 유사체) 내부 또는 위에 화학적 변형을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 자가 복제 RNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있으므로, 개선된 안정성을 가질 수 있고, 생체내 분해 및 제거에 대한 내성이 있을 수 있으면서 다른 장점이 있을 수 있다. 특정 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 자가 복제 RNA 분자는 자가 복제 RNA가 세포 내로 전달될 때 엔도솜 및 세포질 면역 수용체의 자극을 피하거나 감소시키는 것으로 여겨진다. 이는 단백질의 자가 복제, 증폭 및 발현이 일어나는 것을 가능하게 한다. 이는 또한, 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 자가 복제 RNA가 선천성 면역 체계의 활성화와 그 후의 바람직하지 않은 결과(예를 들어, 주사 부위의 염증, 주사 부위의 자극, 통증 등)를 감소시키기 때문에, 변형된 뉴클레오티드를 함유하지 않는 자가 복제 RNA와 관련된 안전성 우려를 감소시킨다. 또한, 자가 복제의 결과로서 생성된 RNA 분자는 세포질 면역 수용체에 의해 외래 핵산으로 인식되는 것으로 여겨진다. 따라서, 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 자가 복제 RNA 분자는 숙주 세포에서 RNA의 효율적인 증폭과 암-관련 단백질의 발현뿐만 아니라 보조 효과를 제공한다.
RNA 서열은, 예를 들어 RNA의 반감기 및 번역 효능을 증가시키기 위해 이의 코돈 사용법과 관련하여 변형될 수 있다. (예를 들어, 약 30개 이상의 아데노신 잔기의) 다중 A 꼬리(poly A tail)는 RNA의 3' 말단에 부착되어 이의 반감기를 증가시킬 수 있다. RNA의 5' 말단은 구조 m7G(5') ppp(5') N(캡(cap) 0 구조)을 갖는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 이의 유도체로 캡핑될 수 있으며, 이는 (예를 들어, N7-모노메틸화 캡 0 구조의 구성에 촉매 작용을 미치는, mRNA 트리포스파타제, 구아닐릴-트랜스퍼라제 및 구아닌-7-메틸트랜스퍼라제로 구성된 백시니아 바이러스 캡핑 효소(Vaccinia Virus Capping Enzyme, VCE)를 사용함으로써) RNA 전사 후, 효소적으로 조작될 수 있거나, RNA 합성 중 통합될 수 있다. 캡 구조는 RNA 분자에 안정성과 번역 효능을 제공할 수 있다. RNA 분자의 5' 캡은 캡 1 구조(m7Gppp [m2'-O]N)의 생성을 초래하는 2'-O-메틸트랜스퍼라제에 의해 추가로 변형될 수 있고, 이는 번역 효능을 추가로 증가시킬 수 있다. 캡 1 구조는 또한 생체내 효력을 증가시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 질소 염기(예를 들어, 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U), 아데닌(A) 또는 구아닌(G)) 내 또는 그 위에 하나 이상의 화학적 변형(예를 들어, 치환)을 함유하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 원하는 경우, 자가 복제 RNA 분자는 포스페이트, 또는 뉴클레오시드의 당 모이어티(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6-원 당 유사체 또는 열린 사슬 당 유사체) 내부 또는 그 위에 화학적 변형을 함유할 수 있다.
자가 복제 RNA 분자는, 바람직하게는 5' 캡의 일부가 아닌(예를 들어, 5″ 캡의 일부인 변형 이외의) 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 따라서, 자가 복제 RNA 분자는 단일 위치에 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있거나, 두 개 이상의 위치에 특정 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 슈도우리딘, N6-메틸아데노신, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘)를 함유할 수 있거나, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 각각 하나 이상의 위치에 있음)를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 자가 복제 RNA 분자는 질소 염기 상에 또는 그것 내에 변형을 함유하지만, 변형된 당 또는 포스페이트 모이어티를 함유하지 않는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 예에서, 자가 복제 RNA 분자 내 뉴클레오티드의 0.001% 내지 99% 또는 100%가 변형된 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 자가 복제 RNA 분자 내 뉴클레오티드의 0.001%-25%, 0.01%-25%, 0.1%-25% 또는 1%-25%가 변형된 뉴클레오티드이다.
다른 예에서, 자가 복제 RNA 분자 내 변형되지 않은 특정 뉴클레오티드의 0.001% 내지 99% 또는 100%가 변형된 뉴클레오티드로 대체된다. 예를 들어, 우리딘을 함유하는 자가 복제 RNA 분자 내 뉴클레오티드의 약 1%는, 예컨대 우리딘을 슈도우리딘으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 다른 예에서, 자가 복제 RNA 분자 내 원하는 양(백분율)의 2개, 3개 또는 4개의 특정 뉴클레오티드(우리딘, 시티딘, 구아노신 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드)는 변형된 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 자가 복제 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드의 0.001%-25%, 0.01%-25%, 0.1%-25%, 또는 1%-25%가 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, 자가 복제 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드의 0.001%-20%, 0.001%-15%, 0.001%-10%, 0.01%-20%, 0.01%-15%, 0.1%-25, 0.01%-10%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 또는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%가 변형된 뉴클레오티드이다.
자가 복제 RNA 분자 내 뉴클레오티드의 100% 미만이 변형된 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 자가 복제 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드의 100% 미만이 변형된 뉴클레오티드인 것이 또한 바람직하다. 따라서, 바람직한 자가 복제 RNA 분자는 적어도 일부 변형되지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.
변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 통합될 수 있고 RNA 분자에 존재할 수 있는 변형된 핵염기는 다음을 포함한다: m5C(5-메틸시티딘), m5U(5-메틸우리딘), m6A(N6-메틸아데노신), s2U(2-티오우리딘), Um(2′-O-메틸우리딘), m1A(1-메틸아데노신); m2A(2-메틸아데노신); Am(2-1-O-메틸아데노신); ms2m6A(2-메틸티오-N6-메틸아데노신); i6A(N6-이소펜테닐아데노신); ms2i6A(2-메틸티오-N6이소펜테닐아데노신); io6A(N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신); ms2io6A(2-메틸티오-N6-(cis-하이드록시이소펜테닐) 아데노신); g6A(N6-글리시닐카바모일아데노신); t6A(N6-트레오닐 카바모일아데노신); ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신); m6t6A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신); hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일 아데노신); ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신); Ar(p)(2′-O-리보실아데노신(포스페이트)); I(이노신); m1I(1-메틸이노신); m′Im(1,2′-O-디메틸이노신); m3C(3-메틸시티딘); Cm(2T-O-메틸시티딘); s2C(2-티오시티딘); ac4C(N4-아세틸시티딘); f5C(5-폰닐시티딘); m5Cm(5,2-O-디메틸시티딘); ac4Cm(N4아세틸2TO메틸시티딘); k2C(리시딘); m1G(1-메틸구아노신); m2G(N2-메틸구아노신); m7G(7-메틸구아노신); Gm(2′-O-메틸구아노신); m22G(N2,N2-디메틸구아노신); m2Gm(N2,2′-O-디메틸구아노신); m22Gm(N2,N2,2′-O-트리메틸구아노신); Gr(p)(2′-O-리보실구아노신(포스페이트)); yW(위부토신); o2yW(퍼옥시위부토신); OHyW(하이드록시위부토신); OHyW*(저변형(undermodified) 하이드록시위부토신); imG(위오신(wyosine)); mimG(메틸구아노신); Q(케오신); oQ(에폭시케오신); galQ(갈탁토실(galtactosyl)-케오신); manQ(만노실-케오신); preQo(7-시아노-7-데아자구아노신); preQi(7-아미노메틸-7-데아자구아노신); G*(아케오신); D(디하이드로우리딘); m5Um(5,2′-O-디메틸우리딘); s4U(4-티오우리딘); m5s2U(5-메틸-2-티오우리딘); s2Um(2-티오-2′-O-메틸우리딘); acp3U(3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘); hoSU(5-하이드록시우리딘); moSU(5-메톡시우리딘); cmo5U(우리딘 5-옥시아세트산); mcmo5U(우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르); chm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘)); mchm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르); mcm5U(5-메톡시카보닐 메틸우리딘); mcm5Um(S-메톡시카보닐메틸-2-O-메틸우리딘); mcm5s2U(5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘); nm5s2U(5-아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5U(5-메틸아미노메틸우리딘); mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5se2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘); ncm5U(5-카바모일메틸 우리딘); ncm5Um(5-카바모일메틸-2′-O-메틸우리딘); cmnm5U(5-카복시메틸아미노메틸우리딘); cnmm5Um(5-카복시메틸아미노메틸-2-L-O메틸우리딘); cmnm5s2U(5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘); m62A(N6,N6-디메틸아데노신); Tm(2′-O-메틸이노신); m4C(N4-메틸시티딘); m4Cm(N4,2-O-디메틸시티딘); hm5C(5-하이드록시메틸시티딘); m3U(3-메틸우리딘); cm5U(5-카복시메틸우리딘); m6Am(N6,T-O-디메틸아데노신); rn62Am(N6,N6,O-2-트리메틸아데노신); m2′7G(N2,7-디메틸구아노신); m2′2′7G(N2,N2,7-트리메틸구아노신); m3Um(3,2T-O-디메틸우리딘); m5D(5-메틸디하이드로우리딘); f5Cm(5-포르밀-2′-O-메틸시티딘); m1Gm(1,2′-O-디메틸구아노신); m′Am(1,2-O-디메틸 아데노신) 이리노메틸우리딘); tm5s2U(S-타우리노메틸-2-티오우리딘)); imG-14(4-데메틸 구아노신); imG2(이소구아노신); ac6A(N6-아세틸아데노신), 하이포크산틴, 이노신, 8-옥소-아데닌, 이의 7-치환 유도체, 디하이드로우라실, 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-아미노우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-메틸우라실, 5-(C2-C6)-알케닐우라실, 5-(C2-C6)-알키닐우라실, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-하이드록시시토신, 5-(C1-C6)-알킬시토신, 5-메틸시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-(C2-C6)-알키닐시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N2-디메틸구아닌, 7-데아자구아닌, 8-아자구아닌, 7-데아자-7-치환 구아닌, 7-데아자-7-(C2-C6)알키닐구아닌, 7-데아자-8-치환 구아닌, 8-하이드록시구아닌, 6-티오구아닌, 8-옥소구아닌, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,4-디아미노푸린, 2,6-디아미노푸린, 8-아자푸린, 치환된 7-데아자푸린, 7-데아자-7-치환 푸린, 7-데아자-8-치환된 푸린, 수소(무염기 잔기), m5C, m5U, m6A, s2U, W, 또는 2′-O-메틸-U. 이들 변형된 핵염기 중 어느 하나 또는 임의의 조합이 본 개시내용의 자가 복제 RNA에 포함될 수 있다. 이러한 변형된 핵염기 및 이들의 상응하는 리보뉴클레오시드 중 다수는 상업적 공급업체로부터 입수 가능하다.
일부 실시양태에서, RNA 분자, 선택적으로 자가 복제 RNA 분자는 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 메틸포스포네이트 연결을 포함한다.
적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 자가 복제 RNA 분자는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 분자를 생산하기 위한 몇 가지 적합한 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 자가 복제 RNA 분자는, 적합한 DNA 의존성 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7 파지 RNA 폴리머라제, SP6 파지 RNA 폴리머라제, T3 파지 RNA 폴리머라제 등, 또는 RNA 분자 내로의 변형된 뉴클레오티드의 효율적인 혼입을 가능하게 하는 이들 폴리머라제의 돌연변이체를 사용하여, 자가 복제 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 전사(예를 들어, 시험관내 전사)시킴으로써 제조될 수 있다. 전사 반응은 뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드, 및 적합한 완충액 및 적합한 염과 같이, 선택된 폴리머라제의 활성을 지원하는 기타 구성성분을 함유할 것이다. 자가 복제 RNA 내로의 뉴클레오티드 유사체의 혼입은, 예를 들어 이러한 RNA 분자의 안정성을 변경하고/하거나, RNase에 대한 저항성을 증가시키고/시키거나, 적절한 숙주 세포 내로 도입 후 복제(RNA의 "전염력")를 확립하고/하거나, 선천성 및 적응성 면역 반응을 유도 또는 감소시키기 위해 조작될 수 있다.
자가 복제 RNA 분자에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드의 존재 및/또는 양은 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 자가 복제 RNA는 모노포스페이트로 소화(예를 들어, 뉴클레아제 P1 사용)되고 탈인산화(예를 들어, CIAP와 같은 적합한 포스파타제 사용)될 수 있으며, 생성된 뉴클레오시드는 역상 HPLC에 의해 분석될 수 있다(예를 들어, YMC 팩 ODS-AQ 컬럼(5 미크론, 4.6 Х 250 mm) 사용, 및 구배를 이용해 용리함, 구배: 30% B(0-5분)에서 100% B(5-13분) 및 100% B(13-40) 분, 유속(0.7 ml/분), UV 검출(파장: 260 nm), 컬럼 온도(30℃), 완충액 A(20 mM 아세트산-암모늄 아세테이트 pH 3.5), 완충액 B(20 mM 아세트산-암모늄 아세테이트 pH 3.5/메탄올 [90/10])).
자가 복제 RNA는 전달 시스템과 연합될 수 있다. 자가 복제 RNA는 보조제와 함께 또는 보조제 없이 투여될 수 있다.
하나 이상의 핵산은 지질 담체와 통합/연합/복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성할 수 있다. 지질 담체-핵산 복합체는 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 둘 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 적어도 하나의 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 적어도 하나의 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 적어도 하나의 DNA 및 적어도 하나의 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 5 ng 초과에서 약 1 mg까지의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 최대 약 25, 50, 75, 100, 150, 175 ng의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 최대 약 1 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 약 0.05 μg, 0.1 μg, 0.2 μg, 0.5, μg 1 μg, 5 μg, 10 μg, 12.5 μg, 15 μg, 25 μg, 40 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 0.05 μg, 0.1 μg, 0.2 μg, 0.5, μg 1 μg, 5 μg, 10 μg, 12.5 μg, 15 μg, 25 μg, 40 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 약 5 μg, 약 10 μg, 약 25 μg, 약 50 μg 또는 약 100 μg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 최대 약 5 μg, 약 10 μg, 약 25 μg, 약 50 μg 또는 100 μg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 길이가 적어도 약 200, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000 또는 20,000 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 길이가 최대 약 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000 또는 20,000 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 길이가 약 7500, 10,000, 15,000 또는 20,000 뉴클레오티드이다.
동결보호제
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 적어도 하나의 동결보호제를 포함한다. 포함을 위한 예시적인 동결보호제는, 비제한적으로, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨 또는 글루코스, 및 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 포함을 위한 추가 또는 대안적인 동결보호제는 소르비톨, 리비톨, 에리트리톨, 트레이톨, 에틸렌 글리콜 또는 프럭토스이다. 일부 실시양태에서, 포함을 위한 추가 또는 대안적인 동결보호제는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 3-O-메틸-D-글루코피라노스(3-OMG), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 1,2-프로판디올, 아세트아미드, 트레할로스, 포름아미드, 당, 단백질 및 탄수화물이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 1% w/v 내지 약 20% w/v, 바람직하게는 약 10% w/v 내지 약 20% w/v, 보다 바람직하게는 약 10% w/v으로 존재한다. 본 개시내용의 특정 양태에서, 동결보호제는 수크로스이다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 동결보호제는 말토스이다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 동결보호제는 트레할로스이다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 동결보호제는 만니톨이다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 동결보호제는 글루코스이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500 mg 또는 500 mg 초과의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 50 내지 약 500 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 200 내지 약 300 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 250 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 동결건조된 조성물 중량의 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 95% 초과의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 동결건조된 조성물 중량의 약 95%의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 동결건조된 조성물 중량의 80 내지 98%, 85 내지 98%, 90 내지 98%, 또는 94 내지 96%의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 당이다. 일부 실시양태에서, 당은 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨 또는 글루코스이다. 일부 실시양태에서, 당은 수크로스이다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500 mg 또는 500 mg 초과의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 약 50 내지 약 500 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 약 200 내지 약 300 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 약 250 mg의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 동결건조된 조성물 중량의 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 95% 초과의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 동결건조된 조성물 중량의 약 95%의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 수크로스는 동결건조된 조성물 중량의 80 내지 98%, 85 내지 98%, 90 내지 98%, 또는 94 내지 96%의 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 열적으로 안정하다. 조성물은 열이나 추위의 작용에 저항하고 주어진 온도에서 핵산 분자를 분해로부터 보호하는 능력과 같은 이의 특성을 유지할 때 열적으로 안정한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 약 25℃ 또는 표준 실온에서 열적으로 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 약 45℃에서 열적으로 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 약 -20℃에서 열적으로 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 적어도 약 -80℃, 적어도 약 -20℃, 적어도 약 0℃, 적어도 약 2℃, 적어도 약 4℃, 적어도 약 6℃, 적어도 약 8℃, 적어도 약 10℃, 적어도 약 20℃, 적어도 약 25℃, 적어도 약 30℃, 적어도 약 37℃, 최대 45℃의 온도에서 열적으로 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 적어도 약 5일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 1개월, 최대 3개월 동안 열적으로 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 적어도 약 4℃에서 최대 37℃의 온도로 적어도 약 5일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 1개월, 최대 3개월 동안 보관된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 백신은 적어도 약 20℃에서 최대 25℃의 온도로 적어도 약 5일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 1개월, 최대 3개월 동안 보관된다.
조합 조성물
본원에 기재된 핵산 및 본원에 기재된 지질 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-5를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-6을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-8을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-10을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-11을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-12를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-13을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-16을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-17을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-18을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-18을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-19를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-20을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-22를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-23을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-24를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-25를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-26을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-27을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-28을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-29를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-30을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-31을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 담체는 NP-1 내지 NP-31 중 임의의 것 및 동결보호제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 본원에 기재된 당이다. 본원에 제공된 조성물은 질소:포스페이트(N:P) 몰비를 특징으로 할 수 있다. N:P 비율은 질소를 함유하는 나노입자 내 양이온성 지질의 양, 및 음전하를 띠는 포스페이트를 함유하는 조성물에 사용된 핵산의 양에 의해 결정된다. 핵산에 대한 지질 담체의 몰비는 핵산의 전달 효율을 증가시키고, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 핵산-운반 나노에멀션 조성물의 능력을 증가시키고, 대상체에서 항원에 대한 항체 역가의 생성을 유도하는 핵산-운반 나노에멀션 조성물의 능력을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 질소-대-포스페이트 몰비를 특징으로 할 수 있는 지질 담체 대 핵산의 몰비를 갖고, 이는 약 0.01:1 내지 약 1000:1, 예를 들어, 약 0.2:1 내지 약 500:1, 약 0.5:1 내지 약 150:1, 약 1:1 내지 약 150:1, 약 1:1 내지 약 125:1, 약 1:1 내지 약 100:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 5:1 내지 약 50:1, 약 5:1 내지 약 25:1, 또는 약 10:1 내지 약 20:1의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질소-대-포스페이트(N:P) 몰비를 특징으로 하는 지질 담체 대 핵산의 몰비는, 약 1:1 내지 약 150:1, 약 5:1 내지 약 25:1, 또는 약 10:1 내지 약 20:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 나노에멀션 조성물의 N:P 몰비는 약 15:1이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 막에 공유적으로 부착된 본원에 제공된 핵산을 포함한다.
본원에 제공된 조성물은 오일-대-계면활성제 몰비를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 오일-대-계면활성제 비율은 스쿠알렌 : 양이온성 지질, 소수성 계면활성제 및 친수성 계면활성제의 몰비이다. 일부 실시양태에서, 오일-대-계면활성제 비율은 스쿠알렌 : DOTAP, 소수성 계면활성제 및 친수성 계면활성제의 몰비이다. 일부 실시양태에서, 오일-대-계면활성제 비율은 스쿠알렌 : DOTAP, 소르비탄 모노스테아레이트 및 폴리소르베이트 80의 몰비이다. 일부 실시양태에서, 오일-대-계면활성제 몰비는 약 0.1:1 내지 약 20:1, 약 0.5:1 내지 약 12:1, 약 0.5:1 내지 약 9:1, 약 0.5:1 내지 약 5:1, 약 0.5:1 내지 약 3:1, 또는 약 0.5:1 내지 약 1:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 오일-대-계면활성제 몰비는 적어도 약 0.1:1, 적어도 약 0.2:1, 적어도 약 0.3:1, 적어도 약 0.4:1, 적어도 약 0.5:1, 적어도 약 0.6:1, 적어도 약 0.7:1이다. 일부 실시양태에서, 오일-대-계면활성제 몰비는 적어도 약 0.4:1에서 최대 1:1이다.
본원에 제공된 조성물은 친수성 계면활성제-대-양이온성 지질 비율을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친수성 계면활성제-대-양이온성 지질 비율은 약 0.1:1 내지 약 2:1, 약 0.2:1 내지 약 1.5:1, 약 0.3:1 내지 약 1:1, 약 0.5:1 내지 약 1:1, 또는 약 0.6:1 내지 약 1:1의 범위이다. 본원에 제공된 조성물은 소수성 계면활성제-대-지질(예를 들어, 양이온성 지질) 비율을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 계면활성제-대-지질 비율은 약 0.1:1 내지 약 5:1, 약 0.2:1 내지 약 3:1, 약 0.3:1 내지 약 2:1, 약 0.5:1 내지 약 2:1, 또는 약 1:1 내지 약 2:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 DOTAP이다.
소르비탄 지방산 에스테르, 에톡시화 소르비탄 에스테르, 양이온성 지질, 면역 자극제 및 RNA를 포함하는 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 소르비탄 모노스테아레이트(예를 들어, SPAN® 60), 폴리소르베이트 80(예를 들어, TWEEN® 80), DOTAP, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다.
약학 조성물
하나의 양태에서, 본 개시내용은 지질 담체 및 선택적으로 본원에 기재된 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 선택적으로, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제"는 약학적 투여에 호환 가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
약학 조성물은 적합한 희석제에서 재구성된 건조된 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 희석제는 수성이다. 바람직한 양태에서, 희석제는 물이다.
본 개시내용은 또한 약학 조성물 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함하는 키트를 제공한다. 대상체는 포유동물일 수 있다. 바람직한 양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 백신 보조제를 포함하는 백신 전달 시스템을 제공한다.
지질 담체와 핵산의 복합체화에 의해, 조성물은 세포에 전달될 수 있다. 세포는 도움이 필요한 대상체에 있을 수 있다. 예를 들어, 핵산이 단백질 항원이거나 단백질 항원을 인코딩하는 경우, 핵산을 운반하는 조성물은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 조성물은 대상체에서 항원에 대한 항체 역가를 유도함으로써, 예를 들어 대상체에서 중화 항체 역가를 유도함으로써 그렇게 할 수 있다.
본 개시내용은 또한 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 지질 담체를 함유하는 조성물은, 대상체에게 유효량으로 투여될 경우, 핵산이 지질 담체 없이 대상체에게 투여될 때 유발되는 면역 반응과 동일하거나 더 큰 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 나노에멀션 조성물 중 소수성 계면활성제는 세포에 핵산을 전달하는 나노에멀션 조성물의 능력을 증가시키거나, (핵산이 단백질 항원이거나 단백질 항원을 인코딩하는 경우) 항원에 대한 대상체 내의 면역 반응을 유도하는 핵산을 운반하는 나노에멀션 조성물의 능력을 증가시키는 데 기여할 수 있다. 예를 들어, 나노에멀션 조성물 중 소수성 계면활성제는 핵산을 운반하는 나노에멀션 조성물의 능력을 증가시키는 데 기여할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
앞서 논의된 바와 같이, 무기 고체 나노입자가, 영상화 방법을 통해 검출 가능한 리포터 요소를 함유하는 경우, 생성된 나노에멀션 입자는, 나노에멀션 입자가 체내 투여된 후 영상화되고 추적될 수 있다. 예를 들어, 무기 고체 나노입자는, 상자성, 초상자성, 페리자성 또는 강자성 화합물과 같이, 자기공명영상(MRI)을 통해 검출 가능한 리포터 요소를 함유할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 하나의 양태는 또한 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 핵산 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 동결건조된 조성물 및 분무 건조된 조성물을 제조하고 재구성하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 조성물 및 방법은 다양한 질환 및 개시된 것들을 치료하는 데 유용하다.
감염의 비제한적인 예는 바이러스성 및 비-바이러스성 감염을 포함할 수 있다. 바이러스 감염의 예는, 비제한적으로, 인유두종 바이러스(HPV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스의 유형 및 하위 유형, 황열병 바이러스(YFV), 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya Virus), 뎅기열, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 및 이의 변종을 포함한다.
질환의 예는 흑색종 관련 항원 A 유전자, 예컨대 MAGE-A1, MAGE-A3 및 티로시나제 관련 단백질(TYRP) 유전자, 예컨대 TYRP-1와 관련된 암을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 조성물 및 방법은 항원을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 여기서 항원은 박테리아 감염, 박테리아 질환, 바이러스 감염, 바이러스 질환, 원생동물 감염, 원생동물 질환, 비-전염성 질환, 하나 이상의 암 또는 자가면역 질환으로부터 유래된다.
일부 양태에서, 항원은 바이러스로부터 유래된다. 상기 바이러스는 인유두종 바이러스(HPV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스의 유형 및 하위 유형, 황열병 바이러스(YFV), 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 뎅기열, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 및 이의 변종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
투여 및 투약
하나의 양태에서, 본 개시내용의 건조된 조성물은 핵산(예를 들어, RNA, 선택적으로 자가 복제 RNA)을 세포 또는 대상체, 예를 들어 비제한적으로 인간, 개, 고양이, 가축(예를 들어, 소, 양, 염소, 돼지), 말 등을 포함하는 포유동물에 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물에 통합하기 위한 예시적인 총 핵산 양은 약 1, 2, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 마이크로그램(μg) 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제형은 투여를 위한 단일 용기로 제조된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제형은 나노입자 담체로부터 제형을 분리하는, 투여를 위한 2개의 용기로 제조된다.
본원에 사용된 바와 같이, "용기"는 그릇, 바이알, 앰플, 튜브, 컵, 상자, 병, 플라스크, 단지, 접시, 단일 웰 또는 다중 웰 장치의 웰, 저장소, 탱크 등, 또는 본원에 개시된 조성물이 배치, 보관 및/또는 이송되고, 엑세스되어 내용물을 제거할 수 있는 기타 장치를 포함한다. 이러한 용기의 예는 유리 및/또는 플라스틱 밀봉되거나 재-밀봉 가능한 튜브 및 앰플을 포함하며, 이는 바늘과 주사기를 사용하여 내용물을 빼내는 것에 호환 가능한 고무 격막 또는 기타 밀봉 수단을 갖는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기에는 RNase가 없다.
바람직한 실시양태에서, 건조된 조성물은 동결건조된다. 일부 실시양태에서, 건조된 조성물은 분무 건조된다.
일부 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 재구성된다. 다른 실시양태에서, 분무 건조된 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 재구성된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 조성물이 대상체에게 투여될 수 있게 하는 형태이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체(에어로졸)의 형태이다.
핵산을 세포 또는 대상체에 전달하기 위해, 임의의 적합한 투여 경로가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 종양내, 피하, 피내, 근육내, 흡입/비강내, 정맥내, 복강내, 두개내 또는 경막내(intrathecal) 경로를 통한 투여용으로 제형화되고/되거나 이들을 통한 투여에 사용하기 위해 제형화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 비경구로 투여된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 경피적으로(percutaneously) 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 근육내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 피내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 경피로 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 피하로 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은, 예를 들어 비강 분무기를 통해, 비강내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물은, 예를 들어 점적을 통해, 경구로 투여된다.
하나의 양태에서, 임의의 적합한 투여 형태는 본원에 기재된 약학 조성물의 전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 용액 또는 현탁액과 같은 주사 가능한 투여 형태로 제공된다.
다른 실시양태에서, 조성물은 용액, 현탁액 또는 분말과 같은 흡입기를 통해 전달될 수 있는 투여 형태로 제공되며, 여기서 투여 형태는 계량 흡입기, 연무 흡입기(soft-mist inhaler), 분무기 또는 건조 분말 흡입기와 같은 흡입기를 통한 전달을 위해 제형화된다.
다른 실시양태에서, 조성물은 용액, 현탁액 또는 분말과 같이 비강으로 전달될 수 있는 투여 형태로 제공되며, 여기서 투여 형태는 아토마이저 또는 비강 펌프 병, 또는 비강으로 투여되는 약학 조성물의 전달에 적합한 기타 장치를 통한 비강 전달을 위해 제형화된다.
하나의 양태에서, 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 보존제 및/또는 기타 부형제는 본 개시내용의 조성물의 전달을 위해 본원에 기재된 투여 형태로 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 하나 이상의 무기 나노입자를 함유하지 않는 건조된 조성물을 제공한다. 상기 건조된 조성물은 소르비탄 지방산 에스테르, 에톡시화 소르비탄 에스테르, 양이온성 지질, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다. 특정 양태에서, 건조된 조성물은 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트, DOTAP, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다.
일부 양태에서, 면역 자극제는 생산된 단백질의 총량을 감소시킬 수 있지만, 백신에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 면역 자극제는 생성된 단백질의 총량을 증가시킬 수 있지만, 백신에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 면역 자극제는 스쿠알렌이다. 일부 양태에서, 면역 자극제는 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드(MIGLYOL® 810) 또는 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르(MIGLYOL® 812N)이다.
예시적인 실시양태
건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 (a) 소수성 코어, 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체; (b) 하나 이상의 핵산; 및 (c) 적어도 하나의 동결보호제를 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 동결건조된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 분무 건조된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 열적으로 안정하다. 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 약 25℃에서 열적으로 안정하다. 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 약 45℃에서 열적으로 안정하다. 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 약 -20℃에서 열적으로 안정하다. 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정하다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 적어도 1주, 적어도 2주 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정하다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물의 소수성 코어는 오일을 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 오일은 α-토코페롤, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 모노아실글리세롤, 프로폴리스, 스쿠알렌, 광유, 포도씨유, 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 대두유, 해바라기유, 대두 레시틴, 트리글리세리드, 비타민 E, 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드, 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르, 디하이드로이소스쿠알렌(DHIS), 파네센 및 스쿠알란 중 적어도 하나를 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 금속염, 금속 옥사이드, 금속 하이드록사이드, 금속 포스페이트 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 지질은 앙이온성 지질, 음이온성 지질, 중성 지질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 지질은 양이온성 지질이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 양이온성 지질은 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤); 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP); 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디올레오일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 및 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); N-데실-N,N-디메틸데칸-1-아미늄 브로마이드(DDAB); 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA); 에틸포스파티딜콜린(ePC); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체는 적어도 하나의 계면활성제를 선택적으로 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 계면활성제는 소수성 계면활성제, 친수성 계면활성제 및 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소수성 계면활성제는 소르비탄 에스테르를 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소르비탄 에스테르는 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 친수성 계면활성제는 폴리소르베이트를 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체는 약 40 nm 내지 약 150 nm 범위의 z-평균 유체역학적 직경을 갖고, 이때 평균 다분산도 지수가 약 0.1 내지 약 0.4 범위이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 RNA이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 RNA는 자가 복제 RNA이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 지질 담체와 통합되거나 이와 복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체-핵산 복합체는 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 질소-대-포스페이트(N:P) 몰비를 특징으로 하는 지질 담체 대 하나 이상의 핵산의 몰비는 약 1:1 내지 약 150:1 범위이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 수크로스이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 1% w/v 내지 약 20% w/v이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 1% w/v 내지 약 40% w/v이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 10% w/v 내지 약 20% w/v이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 10% w/v이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3) 또는 이들의 조합을 포함한다.
약학 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 약학 조성물은 적합한 희석제에서 재구성된 본원에 제공된 건조된 조성물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약학 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적합한 희석제는 수성이다. 약학 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적합한 희석제는 물이다.
키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 본원에 제공된 약학 조성물 또는 본원에 제공된 건조된 조성물; 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함한다.
백신 전달 시스템이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 백신 전달 시스템은 본원에 제공된 약학 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 백신 보조제를 포함한다.
대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 하나 이상의 핵산 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
동결건조된 조성물을 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 및 (d) 제형을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
분무 건조된 조성물을 제조하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 및 (d) 제형을 분무 건조하여 분무 건조된 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
동결건조된 조성물을 재구성하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 상기 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 제형을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성하는 단계; 및 (d) 적합한 희석제에서 동결건조된 조성물을 재구성하는 단계를 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적합한 희석제는 수성이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적합한 희석제는 물이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 적어도 1주, 적어도 2주 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물이 약 25℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 45℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 -20℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정하다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3) 또는 이들의 조합을 포함한다.
분무 건조된 조성물을 재구성하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 상기 방법은 (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계; (b) 하나 이상의 핵산을 상기 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계; (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; (d) 제형을 분무 건조하여 분무 건조된 조성물을 형성하는 단계; 및 (e) 적합한 희석제에서 분무 건조된 조성물을 재구성하는 단계를 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 희석제는 수성이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 희석제는 물이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 25℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 45℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 -20℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 동결건조된 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정하다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소수성 코어는 오일을 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 오일은 α-토코페롤, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 모노아실글리세롤, 프로폴리스, 스쿠알렌, 광유, 포도씨유, 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 대두유, 해바라기유, 대두 레시틴, 트리글리세리드, 비타민 E, 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드, 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르, 디하이드로이소스쿠알렌(DHIS), 파네센 및 스쿠알란 중 적어도 하나를 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 지질은 앙이온성 지질, 음이온성 지질, 중성 지질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 지질은 양이온성 지질을 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 양이온성 지질은 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤); 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP); 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디올레오일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 및 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); N-데실-N,N-디메틸데칸-1-아미늄 브로마이드(DDAB); 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA); 에틸포스파티딜콜린(ePC); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체는 하나 이상의 계면활성제를 선택적으로 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 계면활성제는 소수성 계면활성제, 친수성 계면활성제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소수성 계면활성제가 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하고; 친수성 계면활성제가 폴리소르베이트를 포함한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체는 약 40 nm 내지 약 150 nm 범위의 z-평균 유체역학적 직경을 갖고, 이때 평균 다분산도 지수가 약 0.1 내지 약 0.4 범위이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 RNA이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 RNA는 자가 복제 RNA이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 지질 담체와 통합되거나 이와 복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성한다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체-핵산 복합체는 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성된다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 수크로스이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 1% w/v 내지 약 20% w/v이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 10% w/v 내지 약 20% w/v이다. 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 동결보호제는 약 10% w/v이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3), 또는 이들의 조합을 포함한다.
건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물이 소르비탄 지방산 에스테르, 에톡시화 소르비탄 에스테르, 양이온성 지질, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소르비탄 지방산 에스테르가 소르비탄 모노스테아레이트이다. 또한, 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 에톡시화 소르비탄 에스테르는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트이다. 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 양이온성 지질은 DOTAP이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 면역 자극제는 스쿠알렌이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 에스테르의 비율이 8 내지 11의 친수성-친유성 평형을 초래하는 건조된 조성물이 추가로 본원에 제공된다. 건조된 조성물이 본원에 제공되고, 여기서 에스테르 및 지질의 비율이 30 nm 내지 200 nm의 입자 크기를 초래한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 에스테르 및 지질의 비율이 40 nm 내지 70 nm의 입자 크기를 초래한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서, 하나 이상의 무기 나노입자가 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3), 또는 이들의 조합을 포함한다.
건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트, DOTAP, 면역 자극제 및 RNA를 포함한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 면역 자극제는 생산되는 단백질의 총량을 감소시키지만 백신에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트, DOTAP 및 스쿠알렌을 포함하고, 고체 입자를 포함하지 않는다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 에스테르의 비율은 8 내지 11의 친수성-친유성 평형을 초래한다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 입자 크기는 30 nm 내지 200 nm이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 N:P 비율은 5 내지 35이다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 면역 자극제는 생산되는 단백질의 총량을 증가시키지만, 백신에 대한 면역 반응을 감소시킨다. 건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 면역 자극제는 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드 또는 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르 중 적어도 하나이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3), 또는 이들의 조합을 포함한다.
건조된 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 건조된 조성물은 (a) 소수성 코어 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체; (b) 선택적으로 하나 이상의 핵산; 및 (c) (i) 건조된 조성물 중 적어도 약 50 중량%의 양으로 존재하거나, (ii) 적어도 50 mg의 양으로 존재하는 적어도 하나의 당을 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 동결건조된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 약 25℃에서 열적으로 안정하다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 약 45℃에서 열적으로 안정하다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 약 -20℃에서 열적으로 안정하다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정하다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 조성물은 적어도 1주, 적어도 2주 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정하다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소수성 코어는 오일을 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 오일은 α-토코페롤, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 모노아실글리세롤, 프로폴리스, 스쿠알렌, 광유, 포도씨유, 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 대두유, 해바라기유, 대두 레시틴, 트리글리세리드, 비타민 E, 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드, 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르, 디하이드로이소스쿠알렌(DHIS), 파네센 및 스쿠알란 중 적어도 하나를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 지질은 앙이온성 지질, 음이온성 지질, 중성 지질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 지질은 양이온성 지질을 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 양이온성 지질은 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤); 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP); 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디올레오일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 및 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); N-데실-N,N-디메틸데칸-1-아미늄 브로마이드(DDAB); 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA); 에틸포스파티딜콜린(ePC); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체는 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 계면활성제는 소수성 계면활성제, 친수성 계면활성제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소수성 계면활성제는 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하고; 친수성 계면활성제는 폴리소르베이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체는 약 40 nm 내지 약 150 nm 범위의 z-평균 유체역학적 직경을 갖고, 이때 평균 다분산도 지수가 약 0.1 내지 약 0.4 범위이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 DNA이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 RNA이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 RNA는 자가 복제 RNA이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 소수성 코어는 하나 이상의 무기 나노입자를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 금속염, 금속 옥사이드, 금속 하이드록사이드, 금속 포스페이트 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 핵산은 지질 담체와 통합되거나 이와 복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 지질 담체-핵산 복합체는 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 질소-대-포스페이트(N:P) 몰비를 특징으로 하는 지질 담체 대 하나 이상의 핵산의 몰비는 약 1:1 내지 약 150:1의 범위이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 당은 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 당은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 mg 또는 300 mg 초과의 양으로 존재한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 당은 50 mg 내지 250 mg의 양으로 존재한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 적어도 하나의 당은 적어도 약 250 mg의 양으로 존재한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 당은 조성물 중량의 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 95% 초과의 양으로 존재한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 당은 조성물 중량의 80 내지 98%, 선택적으로 94 내지 96%의 양으로 존재한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 당은 조성물 중량의 약 95%의 양으로 존재한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 적어도 하나의 당은 수크로스를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함한다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 하나 이상의 무기 나노입자는 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)- Fe2O3), 또는 이들의 조합을 포함한다.
최대 약 200 마이크로그램(μg)의 양으로 존재하는 핵산; 최대 약 1.5 mg/ml의 농도로 존재하는 양이온성 지질; 최대 약 0.01 mg/ml의 농도로 존재하는 철 옥사이드; 최대 약 1.88 mg/ml의 농도로 존재하는 스쿠알렌; 최대 약 1.86 mg/ml의 농도로 존재하는 소르비탄 모노스테아레이트; 최대 약 1.86 mg/ml의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80; 최대 약 50 mg/ml의 농도로 존재하는 수쿠로스; 및 선택적으로, 최대 약 2.1 mg/ml의 농도로 존재하는 시트르산 모노하이드레이트를 포함하는 조성물이 본원에 추가로 제공된다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 핵산은 RNA 또는 DNA이다. 조성물이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 핵산은 RNA이고 최대 약 50 μg의 양으로 존재한다.
키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 본원에 제공된 약학 조성물 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함한다. 키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 지질 담체 및 핵산을 각각 포함하는 2개 이상의 별도의 유닛을 포함한다. 키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 지질 담체 및 핵산을 포함하는 유닛을 포함한다. 키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 키트는 건조된 조성물의 수화를 위한 시약을 포함하는 유닛을 추가로 포함한다. 키트가 본원에 추가로 제공되고, 여기서 수화를 위한 시약은 물을 포함한다.
대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 방법은 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 방법은 본원에 제공된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체에서 하나 이상의 핵산 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법이 본원에 추가로 제공되고, 여기서 방법은 본원에 기재된 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
이하의 실시예는 당업자에게 본원에 개시된 실시양태의 원리와 실시를 보다 명확하게 설명하기 위해 제시된 것이며, 임의의 청구된 실시양태의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 부분 및 백분율은 중량 기준이다.
실시예
실시예 1. 사용된 일반적인 생산 기술 및 물질
다음과 같은 물질을 지질 담체의 제조에 사용하였으며, 여기서 지질 담체는 소수성 코어, 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션이다.
작용제는 스쿠알렌, 소르비탄 모노스테아레이트, (SPAN® 60), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(TWEEN® 80), DOTAP 클로라이드, 철 옥사이드 나노입자 및 소듐 시트레이트 디하이드레이트를 포함한다. 일반적으로, 수 가중 평균 직경이 5 nm인 철 옥사이드 나노입자에, 클로로포름을 첨가하였다. 클로로포름을 흄 후드에서 증발되게 하여 철 옥사이드 나노입자의 건조 코팅을 남겼다. 철 옥사이드 나노입자에, SPAN® 60, 스쿠알렌 및 DOTAP 클로라이드를 첨가하여 "오일" 상을 제조하였다. 오일 상을 60℃로 예열된 수조에서 30분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 1리터 유리병에서, Milli-Q 물로 제조된 소듐 시트레이트 디하이드레이트 용액에 TWEEN® 80을 첨가함으로써 "수성" 상을 제조하였다. 수성 상을 30분 동안 교반하여 TWEEN® 80이 완전히 용해되게 하였다. TWEEN® 80이 완전히 용해된 후, 수성 상을 비이커로 옮기고, 60℃로 예열된 수조에서 항온처리하였다. 가열된 오일 상에, 예열된 수성 상을 첨가하였다. 우유-유사 외관을 갖는 균질한 콜로이드가 생성될 때까지 혼합물을 VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 즉시 유화시켰다. 그 후, 20,000 psi에서 LM10 미세유동화기의 Y-형 상호작용 챔버를 통해 유체를 통과시켜 콜로이드를 처리하였다. 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)으로 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 다분산도 지수 0.2로 59 nm가 될 때까지 유체를 통과시켰다. 미세유동화된 지질 담체 샘플을 200 nm 기공 크기의 폴리에테르설폰(PES) 주사기 필터로 최종 여과하였다.
실시예 2. 지질 담체 + RNA 분비 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 복합체의 제조
지질 담체 + RNA-SEAP 복합체를 제조하고, 동결건조를 위해 3 부분으로 분취하였다. 본원의 다른 곳에 기재된 Fe-지질 담체는 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 염화물(LIPOID), 0.2 mg Fe/ml 12 nm 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems, San Diego, CA, USA) 및 10 mM 소듐 시트레이트 디하이드레이트(Fisher Chemical)를 포함한다. 액체 샘플을 비교를 위해 모아 두었다. 재구성을 위해 샘플을 수집하고 선택하였다. 이어서, 동결건조된 케이크의 모습을 기록하였다. 모든 동결건조된 케이크를 0.7 ml의 milliQ 물에서 재구성하였다. 그 후, (i) 입자 크기, (ii) 크기 분포, (iii) RNA 무결성, (iv) DOTAP 및 스쿠알렌 함량 및 (v) 시험관내 단백질 발현의 측정을 포함하여 재구성된 물질의 물리화학적 특성을 측정하였다. 그 결과는 아래에 제시되어 있다. 표 2는 지질 담체 + RNA-SEAP 복합체의 제조에 사용된 물질을 개시한다.
표 2: 지질 담체 + RNA-SEAP 복합체의 제조용 물질
동결건조 조건은 아래와 같이 표 3 내지 표 5에 제시되어 있다.
표 3: 동결건조 사이클 # 1
표 4: 동결건조 사이클 # 2
표 5: 동결건조 사이클 # 3
희석제의 제조: 당 및 시트레이트를 포함하는 희석제를 표 6에 개략된 바와 같이 제조하였다. 각각의 당을 50 ml의 Rnase 미함유 원뿔형 튜브에서 칭량하였다. 약 35-40 ml의 뉴클레아제 미함유 물을 첨가하여 당을 용해시키고, 필요에 따라 약간의 열과 초음파 처리를 사용하였다. 0.5 ml의 1M Na-시트레이트, pH = 6 용액을 피펫으로 계량하였다. 모든 당이 모두 용해되고 용액이 투명해진 후, 원뿔형 튜브에서 뉴클레아제 미함유 물로 50 ml 표시까지 적량(Q.S.)을 만든다. 0.22 μm STERIFLIP®으로 희석제를 여과하고 무균적으로(aseptically) 캡을 조여 무균성을 유지한다.
표6: 희석제의 제조
예비-복합체 제형의 제조: 지질 담체 "DS"는 30 mg DOTAP/ml의 벌크 용액이고, Fe-지질 담체 제형을 지칭하며, 그 제조는 실시예 8에 기재되어 있다.
단, 50% 수크로스 조성 지질 담체를 5배 희석하여 2 X 6 mg DOTAP/ml 지질 담체 "DP"를 제조한 것을 제외하면, 지질 담체 "DS"(30 mg DOTAP/ml)를 각각의 희석제에 10배 희석하여 3 mg DOTAP/ml 지질 담체 "DP"를 제조하였다. 액체 제형 중 표적 RNA 농도는 50 ng/ul이었으며, 15의 N:P에서 지질 담체와 복합체화하였다. 이는 바이알당 25 μg RNA 용량을 시뮬레이션한다. 표 7은 예비-복합체 지질 담체 복합체의 제조를 개시한다. 사용하지 않은 지질 담체는 2-8℃에 보관하였다.
표 7: 예비-복합체 지질 담체 제조
표 8은 예비-복합체 나노구조화된 지질 담체(NLC) 복합체의 제조를 개시한다. NLC를 대조군으로 사용하였다. 사용하지 않은 NLC는 새로운 복합체 대조군을 위해 2-8℃에 보관하였다.
표 8: 예비-복합체 NLC 제조
RNA 예비-복합체의 제조는 표 9에 개시되어 있다. RNA 스톡을 제조하였다. 분취당 50% 수크로스의 경우 약 7.5 ml 또는 0.63 ml를 나누어서 -80℃에서 보관하였다.
표 9: RNA 예비-복합체의 제조
지질 담체-RNA 복합체의 제조는 표 9에 개시되어 있다. RNA 스톡을 제조하였다. 동결건조(lyo) 사이클당 복합체화당 희석된 RNA의 부피는 (+5%)였고, 희석된 지질 담체의 부피는 (+5%)였다.
상기 기재된 표 8 및 표 9에 나열된 각각의 희석 제형을, 표 10에 개시된 해당하는 "조성 ID"의 희석 RNA와 함께, 부피로 1:1로 혼합함으로써, 지질 담체 + RNA 또는 NLC + RNA의 복합체를 제조하였다. 동결건조 사이클 또는 장기 보관 조건을 적용하기 전에 복합체를 실온에서 30분 동안 평형화하였다.
표 10: 지질 담체-RNA 예비-복합체의 제조
실시예 3: 입자 크기 측정
일회용 사이징 큐벳 DTS0012 내의 10 μl GLB51-F04-20-02에 900 μl의 milliQ 물을 첨가함으로써 제형을 100배 희석하였다. 큐벳을 가볍게 두드려 소용돌이와 기포를 제거하였다. 입자 크기를 zetasizer ULTRA에서 MALDS 방법에 의해 측정하였다. 최소 5개의 측정치를 수집하였다. 평균 z-평균 직경과 평균 PDI를 후방 산란(173°) 측정으로부터 기록하였다.
실시예 4: 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성
뉴클레아제 미함유 물: 12 μl의 복합체 + 48 μl의 물에서 50 ng/μl 복합체를 10 ng/μl까지 5배로 희석하여 샘플을 제조하였다. 60 μl의 페놀:클로로포름을 첨가하고 10-15회 뒤집어서 RNA를 추출하였다. 15분 동안 원심분리하여 10 μl의 상청액을 제거하고, 10 μl의 글리옥살 로드 염료와 합한 후, 50℃에서 30분 동안 가열하여 RNA를 변성시켰다. 레인당 10 μl를 로딩하였다.
실시예 5: BHK21 세포에서의 SEAP 발현
세포 형질감염: 형질감염 하루 전에 96-웰 플레이트에 1.5 x 105 세포/mL를 사전-시딩하였다. 형질감염 당일, 피펫팅에 의해 성장 배지를 플레이트로부터 제거하였다. 50 μL의 RNA:지질 담체 혼합물과 50 μL의 Opti-MEMTM(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA)을 BHK21(새끼 햄스터 신장 섬유아세포) 세포에 첨가하였다. 세포를 4시간 동안 항온처리하였다. RNA:지질 담체와 Opti-MEMTM 배지를 피펫팅에 의해 제거하고 DMEM 성장 배지로 교체하였다. 세포를 밤새 항온처리하였다.
상청액에서의 SEAP 발현 평가: SEAP Reporter Assay KitTM(Novus Biologicals NPB2-25285) 키트를 사용하여 상청액에서의 SEAP 수준을 측정하였다. 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라 희석되지 않은 상청액을 분석하였다.
실시예 6: 사이클 #1 후 특성화 데이터
모든 동결건조된 케이크는 사이클 #1 후 시간 = 0시간에 양호한 무결성을 나타냈다. 5% 글루코스 중 지질 담체 + RNA-SEAP의 무결성은 25℃에서 24시간 후에 부분적으로 손상되었다. 다른 모든 제형의 무결성은 보존되었다. 본원의 다른 곳에 기재된 Fe-지질 담체는 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 0.2 mg Fe/ml 12 nm 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems) 및 10 mM 소듐 시트레이트 디하이드레이트(Fisher Chemical)를 포함한다. 10% 수크로스 중 NLC + RNA-SEAP 및 5% 글루코스 제형 중 지질 담체 + RNA-SEAP 유래의 케이크는 42℃에서 24시간 후에 눈에 띄게 수축하였다. 다른 모든 제형의 무결성은 보존되었다. 도 2-4는 동결건조 사이클 #1 후, 표시된 당 조성에서 동결건조된 케이크의 모습을 예시한다. 도 2는 시간 = 0시간에, 표시된 당 조성에서 NLC 및 지질 담체 케이크의 모습을 예시한다. 도 3은 t = 25℃ 및 42℃에서 24시간 후, 표시된 당 조성에서 NLC 및 지질 담체 케이크의 모습을 예시한다. 도 4는 t = 25℃ 및 42℃에서 24시간에, 표시된 당 조성에서 NLC 및 지질 담체 케이크의 모습을 예시한다.
동결건조 사이클 #1 후 25℃ 또는 42℃에서, 표시된 당 조성에서 보관 1일 후 재구성된 케이크의 입자 크기를 도 4a-4b에서와 같이 측정하였다. 도 5a는 표시된 당 조성에서, 시간 = 0시간에서 액체 제형에 대한 입자 크기의 배수 변화를 보여준다. 도 5b는 표시된 당 조성에서, 해당하는 액체 제형에 대한 재구성된 동결건조 제형의 PDI의 점 변화를 보여준다. 평균 크기 및 크기 분포 값은 표 11에 나타나 있다. 재구성된 모든 동결건조 제형은 재구성 후 지질 담체 + RNA 복합체 크기의 증가를 초래하였다. 동결 보호제로서 수크로스를 함유하는 모든 재구성된 제형은 25℃에서 시간 = 0시간 및 24시간에서 최소의 PDI 변화를 초래하였다.
표 11에 기재된 동결건조(t=0)는 동결건조 사이클의 완료와 같은 날에 재구성된 동결건조된 제형을 지칭한다. 표 11에 기재된 액체는 동결건조 제형의 동등한 액체(비-동결건조) 제형을 지칭한다.
표 11: 평균 z-평균 직경 및 평균 PDI 동결건조 사이클 #1.
동결건조 사이클 #1 후 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성:
동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성은 지질 담체 + RNA 및 NLC + RNA 제형에 대해 6a-6b에 예시된다. 도 6a는 지질 담체 + RNA 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성을 보여준다. 도 6b는 지질 담체 + RNA 및 NLC + RNA 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성을 보여준다.
25℃ 및 42℃에서 동결건조된 케이크를 재구성하기 전에 24시간 동안 보관하였다. 지질 담체 + RNA-SEAP로부터 RNA-SEAP의 재구성 및 페놀:클로로포름 추출 후 모든 동결건조된 샘플은 6a-6b에 도시된 바와 같이 네이키드 RNA-SEAP 양성 대조군과 일치하는 정의된 RNA 밴드를 보여주었다. 도 6a는 42℃에서 24시간 동안 보관된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP 복합체의 액체 제형이 RNA 밴드 강도의 유의미한 감소를 초래하였음을 보여주며, 이는 액체로 보관되는 경우에는 분해를 가속화시켰지만, 건조된 동결건조 형태로 보관된 경우에는 그렇지 않았음을 시사한다.
동결건조는 42℃ 보관에서 액체 지질 담체 + RNA 제형에서 RNA 무결성을 보존하였다.
동결건조 사이클 #1 후 BHK21 세포에서 SEAP 발현:
지질 담체 + repRNA 및 NLC + repRNA-SEAP 제형에 대한 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 BHK21 세포에서의 SEAP 발현이 도 7a-7g에 예시된다. 도 7a는 10% 트레할로스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7b는 5% 만니톨 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7c는 10% 수크로스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7d는 20% 수크로스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7e는 5% 글루코스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7f는 10% 말토스 중 지질 담체 + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 7g는 10% 수크로스 중 NLC + repRNA-SEAP에 대한 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다.
비교를 위해, 표시된 당 조성에서 새로 제조된 지질 담체 + RNA-SEAP로 세포를 형질감염시켰다. 추가적인 안정성 비교로서, 25℃에서 24시간 동안 또는 42℃에서 24시간 동안 보관된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP의 액체 제형으로 세포를 형질감염시켰다. 후자의 조건은 시험관내 단백질 발현에 대한 분해된 RNA의 효과를 측정하기 위한 비교 역할을 하였다. 도 7a-7g는 25℃에서 24시간 후 또는 시간 = 0시간에 재구성된 모든 동결건조된 제형이 상응하는 새로 제조된 지질 담체 + RNA-SEAP 복합체에 비해 RNA 용량 의존적 발현 프로파일에 변화를 초래하지 않았음을 예시한다. 액체 제형에서 42℃에서 24시간 동안 보관된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP(도 7c)는 동결건조된 제형과 비교하여 유의미하게 감소된 SEAP 발현을 초래하였다. 10% 트레할로스(도 7a), 20% 수크로스(도 7d) 및 10% 말토스(도 7f)는 또한 42℃에서 24시간 보관 후 SEAP 발현에 의해 측정된 바와 같이 RNA-SEAP의 효력을 보존하였다. 마지막으로, 42℃에서, 5% 만니톨(도 7b) 또는 5% 글루코스(도 7e)를 함유하는 동결건조된 지질 담체 + RNA-SEAP는 이의 상응하는 새로 제조된 액체 제형에 비해 SEAP의 용량 의존적 발현 프로파일의 눈에 띄는 감소를 초래하였다. 비교를 위해, 10% 수크로스 중 RNA-SEAP로 NLC를 제조하였다(도 7g).
동결건조 사이클 #1 후 지질 담체 + RNA-SEAP 케이크의 모습:
도 8 및 도 9는 사이클 #1 후 다양한 시점에서, 표시된 당 조성에서 지질 담체 + RNA-SEAP 케이크의 모습을 보여준다. 모든 동결건조된 케이크는 사이클 #1 후 시간 = 0시간에 양호한 무결성을 보여주었다. 도 8은 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서 다양한 시점(시간 = 0시간, 25℃에서 6일 후 및 25℃에서 1개월 후)에서 지질 담체 + RNA-SEAP 케이크의 모습을 예시한다. 도 8은 5% 글루코스 중 지질 담체 + RNA-SEAP의 무결성이 25℃에서 6일 후 및 25℃에서 1개월 후에 상당히 손상되었음을 보여준다. 10% 수크로스 중 NLC + RNA-SEAP의 무결성은 25℃에서 6일 후에 부분적으로 손상되었고, 25℃에서 1개월 후에는 상당히 손상되었다. 다른 모든 제형의 무결성은 25℃에서 1개월 후 보존되었다.
도 9는 동결건조 사이클 #1 후 표시된 당 조성에서, 다양한 시점(시간 = 0시간, 42℃에서 24일 후, 42℃에서 3일 후 및 42℃에서 1개월 후)에서 지질 담체 + RNA-SEAP 케이크의 모습을 예시한다. 도 8은 모든 수크로스 및 글루코스 함유 제형이 42℃에서 24시간, 3일 및 1개월 보관 후 점진적으로 수축되었음을 보여준다. 다른 모든 제형의 무결성은 42℃에서 1개월 후 보존되었다.
실시예 7: 사이클 #3 후 특성화 데이터
동결건조 사이클 #3 후 입자 크기:
동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서, 25℃ 또는 42℃에서 보관 1일 후 재구성된 케이크의 입자 크기를 도 10a-10b에서와 같이 측정하였다. 도 10a-10b는 동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서 보관 1일 후 재구성된 케이크의 입자 크기를 예시한다. 도 10a는 표시된 당 조성에서, 재구성된 제형의 PDI의 점 변화를 보여준다. 도 10b는 지질 담체 + RNA 새로운 복합체에 대한 입자 크기의 log10 배수 변화를 보여준다.
평균 크기 및 크기 분포 값은 표 12에 나타나 있다. 1개월 동안 25℃ 또는 42℃에서 보관된 모든 동결건조된 제형은 재구성 후 복합체 크기의 증가를 초래하였다. 도 10a-10b에 도시된 바와 같이 1개월 동안 5℃에서 보관된 액체 제형에 대하여, 20% 수크로스에서 제조된 지질 담체 + RNA-SEAP는 가장 작은 입자 크기의 배수 변화 및 PDI의 최소 변화를 초래하였다.
표 12: 동결건조 사이클 #3 후 평균 Z-평균 직경 및 평균 PDI
동결건조 사이클 #3 후 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성:
동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 RNA 무결성은 도 11에 예시된다. 액체 및 동결건조된 제형 모두 25℃과 42℃에서 1개월 동안 보관하였다. 도 11은 새로 제조된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP로부터 추출된 RNA-SEAP로 정규화된 밴드의 % 광학 밀도(OD)를 보여준다. 42℃에서 1개월 동안 보관된, 액체 또는 동결건조된 모든 샘플은 RNA-SEAP의 완전한 분해를 나타내는 검출 가능한 RNA 밴드를 나타내지 않았다. 10% 수크로스 중 NLC + RNA-SEAP 및 5% 만니톨 중 지질 담체 + RNA-SEAP를 제외하고, 모든 동결건조된 지질 담체 + RNA-SEAP 제형은, 1개월 동안 5℃에서 액체 형태로 보관된 지질 담체 + RNA-SEAP보다 1개월 동안 25℃에서 RNA-SEAP를 더 잘 보호하였다. 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP를 25℃에서 1개월 동안 액체로 전적으로 보관하였다. 이에 비해, 동결건조된 형태로 25℃로 보관했을 때, RNA-SEAP는 새로운 복합체에 대해 OD가 50%였고, 액체 형태로 5℃로 보관했을 때는 OD가 23%였다. 20% 수크로스 또는 10% 말토스에서 제형화된 지질 담체 + RNA-SEAP는 25℃에서 1개월 보관 후 RNA-SEAP를 유의미하게 보존하였다.
동결건조 사이클 #3 후 BHK21 세포에서 SEAP 발현:
동결건조 사이클 #3 후 표시된 당 조성에서, BHK21 세포에서의 SEAP 발현이 도 12에 예시된다. 평균 SEAP 발현 수준은 12.5 ng/웰의 단일 RNA 형질감염 용량에 대해 도시되었다. 비교를 위해, 도 12에 도시된 바와 같이, 세포를 새로 제조된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP로 형질감염시켰다(상부 점선). 42℃에서 1개월 동안 보관된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP의 액체 제형으로 형질감염된 세포는 시험관내 단백질 발현에 대한 분해된 RNA의 효과를 측정하기 위한 비교 역할을 하였다(하단 점선). 1개월 동안 42℃에서 보관된 모든 동결건조된 샘플로부터의 발현은 42℃에서 1개월 동안 액체 형태로 보관된 10% 수크로스 중 지질 담체 + RNA-SEAP의 발현 수준 이하였다. 25℃에서 1개월 동안 보관된, 10% 수크로스, 20% 수크로스, 10% 트레할로스 및 10% 말토스 중 동결건조된 지질 담체 + RNA-SEAP 복합체는 5℃에서 액체 형태로 1개월 동안 보관된 동일한 조성물보다 더 높은 SEAP 발현을 초래하였다.
실시예 8: 대식세포에서 면역 반응
지질 담체 및 repRNA의 다양한 제형을 제조하고 분석하여 대식세포에서 지질 담체의 선천성 면역 반응을 검정하였다. THP-1 대식세포에서 단백질 발현 및 TNF 생산 자극을 연구하였다.
초기에, THP-1 단핵구를 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 사용하여 대식세포로 분화시켰다. 그 후, 세포를 나노 루시페라아제 인코딩 레플리콘 RNA(서열번호: 2)를 갖는 다양한 제형으로 형질감염시켰다. 이어서, 세포 배양 배지를 나노 루시페라아제 및 TNF 발현에 대해 평가하였다.
본 검정에 사용된 제형 및 이의 특성, 예컨대 입자 크기 및 PDI는 표 13에 기재되어 있다. 나노 루시페라아제를 인코딩하는 repRNA의 농도는 909 ng/ul이었으며 -80℃에서 유지되었다. 포화 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르인 MIGLYOL® 812 N을 본 검정에 사용하였다.
표 13: 제형
Fe-지질 담체 제형(100 ml 규모로 제조됨): Fe-지질 담체 제형은 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 0.2 mg Fe/ml 12 nm 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems) 및 10 mM 소듐 시트레이트 디하이드레이트(Fisher Chemical)를 포함한다. 클로로포름(Imagion Biosystems, lot# 95-127) 중 20 mg Fe/ml 12 nm 직경 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자의 1 ml를 4:1 아세톤:클로로포름(v/v) 용매 혼합물에서 자기적으로(magnetically) 분리함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, 휘발성 용매(아세톤 및 클로로포름)를 흄 후드에서 완전히 증발되게 하여 건조된 올레산 철 옥사이드 나노입자의 코팅을 남겼다. 이 철 옥사이드 코팅에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.25 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. 철 농도를 ICP-OES에 의해 결정하였다. DOTAP 및 스쿠알렌 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
고 Fe-지질 담체 제형(100 ml 규모로 제조됨): 고 Fe-지질 담체 제형은 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 1 mg Fe/ml 15 nm 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems) 및 10 mM 소듐 시트레이트 디하이드레이트(Fisher Chemical)를 포함한다. 클로로포름(Imagion Biosystems, lot# 95-133) 중 20 mg Fe/ml 15 nm 직경 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자의 5 ml를 4:1 아세톤:클로로포름(v/v) 용매 혼합물에서 자기적으로 분리함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, 휘발성 용매(아세톤 및 클로로포름)를 흄 후드에서 완전히 증발되게 하여 건조된 올레산 철 옥사이드 나노입자의 코팅을 남겼다. 이 철 옥사이드 코팅에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.3 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. 철 농도를 ICP-OES에 의해 결정하였다. DOTAP 및 스쿠알렌 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
Fe-지질 담체 미글리올 제형(100 ml 규모로 제조됨): Fe-지질 담체 미글리올 제형은 37.5 mg/ml 미글리올® 812 N(IOI Oleo GmbH, Hamburg, Germany), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 0.2 mg Fe/ml 15 nm 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems) 및 10 mM 소듐 시트레이트 디하이드레이트(Fisher Chemical)를 포함한다. 클로로포름(Imagion Biosystems, lot# 95-127) 중 20 mg Fe/ml 15 nm 직경 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자의 1 ml를 4:1 아세톤:클로로포름(v/v) 용매 혼합물에서 자기적으로 분리함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, 휘발성 용매(아세톤 및 클로로포름)를 흄 후드에서 완전히 증발되게 하여 건조된 올레산 철 옥사이드 나노입자의 코팅을 남겼다. 이 철 옥사이드 코팅에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.3 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. 철 농도를 ICP-OES에 의해 결정하였다. DOTAP 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
고 Fe-지질 담체 미글리올 제형(100 ml 규모로 제조됨): 고 Fe-지질 담체 미글리올 제형은 37.5 mg/ml 미글리올® 812 N(IOI Oleo GmbH), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 1 mg/ml 15 nm 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems) 및 10 mM 소듐 시트레이트 디하이드레이트(Fisher Chemical)를 포함한다. 클로로포름(Imagion Biosystems, lot# 95-127) 중 20 mg Fe/ml 15 nm 직경 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자의 5 ml를 4:1 아세톤:클로로포름(v/v) 용매 혼합물에서 자기적으로 분리함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, 휘발성 용매(아세톤 및 클로로포름)를 흄 후드에서 완전히 증발되게 하여 건조된 올레산 철 옥사이드 나노입자의 코팅을 남겼다. 이 철 옥사이드 코팅에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.3 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. 철 농도를 ICP-OES에 의해 결정하였다. DOTAP 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
알루미늄-지질 담체 제형(100 ml 규모로 제조됨): 알루미늄-지질 담체 제형은 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 1 mg Al/ml TOPO-코팅 Alhydrogel®(알루미늄 옥시하이드록사이드) 입자(Croda) 및 10 mM 소듐 시트레이트를 포함한다. 10 ml의 Alhydrogel을 20분 동안 1000 rpm으로 원심분리에 의해 메탄올에서 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, Alhydrogel을 10 ml의 메탄올에 분산시키고, 이 분산액에 250 mg/ml 트리옥틸포스핀 옥사이드(TOPO)의 1 ml를 첨가하고, 37℃의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 밤새 항온처리하였다. 과량의 TOPO를 추가적인 메탄올 세척에 의해 제거한 후, 11 ml의 메탄올에 분산시켰다. 메탄올을 흄 후드에서 밤새 증발되게 하여 TOPO-Alhydrogel의 건조층을 남겼다. 이 건조 TOPO-Alhydrogel 층에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3 그램의 DOTAP을 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.3 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. 알루미늄 농도를 ICP-OES에 의해 결정하였다. DOTAP 및 스쿠알렌 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
Fe-지질 담체 솔라네솔 제형(100 ml 규모로 제조됨): Fe-지질 담체 솔라네솔 제형은 37.5 mg/ml 솔라네솔(Cayman chemicals), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 0.2 mg Fe/ml 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자(Imagion Biosystems) 및 10 mM 소듐 시트레이트를 포함한다. 클로로포름(Imagion Biosystems, lot# 95-133) 중 20 mg Fe/ml 15 nm 직경 올레산-코팅 철 옥사이드 나노입자의 1 ml를 4:1 아세톤:클로로포름(v/v) 용매 혼합물에서 자기적으로 분리함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, 휘발성 용매(아세톤 및 클로로포름)를 흄 후드에서 완전히 증발되게 하여 건조된 올레산 철 옥사이드 나노입자의 코팅을 남겼다. 이 철 옥사이드 코팅에 3.75 그램의 솔라네솔, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을 F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. 철 농도를 ICP-OES에 의해 결정하였다. DOTAP 및 솔라네솔 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
NLC 제형(100 ml 규모로 제조됨): NLC 제형은 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID), 2.4 mg/ml Dynasan 114(IOI Oleo GmbH) 및 10 mM 소듐 시트레이트를 포함한다. 200 ml의 비이커에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60, 0.24의 그램의 Dynasan 114 및 3 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 92 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 92 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.3 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. DOTAP 및 스쿠알렌 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
CNE 제형(100 ml 규모로 제조됨): CNE 제형은 43 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 5 mg/ml SPAN® 85(Millipore Sigma), 5 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 4 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID) 및 10 mM 소듐 시트레이트를 포함한다. 200 ml의 비이커에 4.3 그램의 스쿠알렌, 0.5 그램의 SPAN® 85 및 0.4 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 2.6 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 95 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 95 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.05-0.1 다분산도 지수(PDI)로 100±10 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. DOTAP 및 스쿠알렌 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
처리 그룹을 준비하였다. 이들 그룹 중 8개는 나노 루시페라아제 repRNA 그룹이었으며, 웰당 600 ng 용량으로, Fe-지질 담체, 고 Fe-지질 담체, Fe-지질 담체 미글리올, 고 Fe-지질 담체 미글리올, 알루미늄-지질 담체, Fe-지질 담체 솔라네솔(SLN), NLC 및 CNE 제형을 사용하여 제조하였다. 미처리 그룹은 나노 루시페라아제가 없었다.
나노 루시페라아제 repRNA를 2.2 mL의 RNAse 미함유 물에 8 ng/μL로 희석함으로써 다양한 제형을 제조하였다. 지질 담체 제형과 RNA 마스터 믹스에, 희석된 RNA의 250 μL와 함께 각각의 희석된 제형을 250 μL씩 첨가함으로써 복합체화하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다.
24웰 플레이트에 웰당 7 x 105개의 THP-1을 시딩함으로써 세포 형질감염을 수행하였다. 웰당 80 μM의 PMA를 첨가하고 37℃에서 항온처리하였다. 다음날, PMA 함유 배지를 제거하고, 형질감염 전 한 시간 동안 cRPMI로 교체하였다. 그 후, 샘플을 Opti-MEMTM에서 연속 희석하여 0.45 ng/μL에서 시작하는 10-점 1.5-배 희석 시리즈를 제조하였다. 이어서, 피펫팅에 의해 배양 배지를 플레이트로부터 제거하였다. 450 μL의 Opti-MEMTM 및 150 μL의 복합체화된 제형을 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 빈 웰에 450 μL의 Opti-MEMTM만 제공하였다. 4시간 후, 샘플을 피펫팅에 의해 플레이트로부터 제거하고, 500 μL의 성장 배지로 교체하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 성장 배지를 다음날 수확하고, -80℃로 보관하였다. 다운스트림 검정을 수행하였다.
먼저 완충액에 Nano-Glo 루시페라아제 검정 시약을 1:50으로 희석함으로써 루시페라아제 검정을 수행하였다. 25 μL의 상청액을 제거하고 96-웰 플레이트에서 25 μL의 Nano-Glo 시약과 혼합하였다. 이를 실온에서 3분 동안 항온처리하였다. 발광을 판독하였다.
ELISA 검정을 수행하여 제조업체의 프로토콜에 따라 R&D Systems의 Human TNF-alpha DuoSet ELISA를 사용해 배지 내 TNF-알파 단백질 수준을 평가하였다. 96웰 마이크로플레이트를 항-TNF 포획 항체로 코팅하였다. 플레이트를 차단한 후, 희석 없이 배지 샘플을 직접 첨가하였다. 비오틴화된 검출 항체, SA-HRP 및 기질을 첨가한 후, SPECTRAMAX® i3(Molecular Devices, LLC, San Jose CA, USA) 플레이트 판독기에서, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
본 실시예의 모든 연구를 이중으로 수행하였다. 이중 수행 결과는 첫 번째 실험과 두 번째 실험으로 각각 표시된다.
본 검정은 도 13a의 첫 번째 검정 및 도 13b의 두 번째 검정에 나타난 바와 같이, 지질 담체와 미글리올로 구성된 액체 제형이 레플리콘에서 더 높은 단백질 생산을 유도하였음을 입증한다. TNF-알파 분비에 의해 측정된 바와 같이 감소된 선천성 면역 반응이 검출되었으며, 이는 도 14a의 첫 번째 검정 및 도 14b의 두 번째 검정에 나타나 있다.
향상된 단백질 생산과 낮은 TNF-알파 자극 사이의 상관관계를 도 15a의 첫 번째 검정 및 도 15b의 두 번째 검정에 나타난 바와 같이, 미글리올 지질 담체 제형을 사용하여 관찰하였다. 솔라네솔은 도 15a의 첫 번째 검정 및 도 15b의 두 번째 검정에 나타난 바와 같이, 약간 낮은 단백질 생산을 유도하였지만, 잠재적으로는 더 높은 TNF 생산을 유도하였다.
도 16a-16f는 지질 담체-제형화된 DNA SEAP의 다양한 반복으로 근육내 주사한 BALB/c 마우스에서의 SEAP 수준을 예시한다. 도 16a는 4일차의 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 16b는 6일차의 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 16c는 8일차의 상대 발광 단위(RLU)를 보여준다. 도 16d는 4일차의 상대 발광 단위(RLU)의 사본이다. 도 16e는 6일차의 상대 발광 단위(RLU)의 사본이다. 16f는 8일차의 상대 발광 단위(RLU)의 사본이다.
도 17은 조건 1 내지 14에 대해 Y-축에 다분산도 지수(PDI) 및 Z-평균 측정의 측정치 및 X-축에 그룹 번호가 있는 막대 차트이다.
도 18a-18b는 조건 1 내지 14에 대해 Y축에 IgG(μg/ml), X축에 그룹 번호가 있는 도트 차트이고, 이는 14일차 항-D614G(1:40 희석) 및 28일차 항-D614G(1:200 희석)에서의 측정에 대해 각각 나타낸 기록이다.
도 19는 Y축에 항-D614G(1:200 희석) IgG(μg/ml) 측정치 및 X축에 보관 조건의 표시가 있는 28일차의 도트 차트를 보여준다.
제형 간의 다른 주요한 차이점은 관찰되지 않았다. 이는 지질 담체와 미글리올(Fe-지질 담체 미글리올)로 구성된 제형이 비제한적으로 항-바이러스 요법 및 암 치료법과 같은 치료 적용례에서 잠재적인 제형일 수 있음을 시사한다. 이러한 치료 적용례에서, 비제한적으로 치료 단백질 또는 항체의 생체내 생산과 같이, 높은 단백질 생산 및 낮은 면역자극이 요구된다.
실시예 9: 마우스 내에서의 DNA(SEAP) 생체 활성
본 실시예는 BALB/c 마우스에서 지질 담체 및 DNA(SEAP)의 생체 활성에 대한 주사된 용량의 영향을 연구한다. 동역학, 지속 기간 및 규모를 연구하였다. 물질: SEAP를 인코딩하는 DNA(공급업체: Aldevron; 카탈로그 번호: gWiz-SEAP, 로트 번호: 38611), -20℃에서 5 mg/mL, SEAP를 인코딩하는 repRNA(서열번호: 1), -80℃에서 2217 μg/mL 및 4℃에서 지질 담체 제형(30 mg DOTAP/ml)을 본 실시예에 사용하였다. C57BL/6 마우스에 표 14에 나열된 처리 그룹에 기재된 바와 같이 접종하고, 그 후에 SEAP 수준을 혈청에서 측정하였다.
표 14: 처리 그룹
7개의 상이한 제형을 제조하고, 7개의 처리 그룹(그룹 1-7)에 걸쳐 근육내 투여하였다. DNA-SEAP 또는 RNA-SEAP를 표 15에 제시된 부피에 따라 희석하여 그룹 1-7에 대한 제형을 제조하였다.
표 15: 제형의 제조: RNA/DNA의 희석
지질 담체와의 복합체화 전 희석된 DNA 또는 RNA의 농도는 다음과 같았다(NanoDrop 사양으로 측정): 그룹 1, 4 및 5는 약 820 μg/ml의 DNA를 함유하고; 그룹 2와 3은 약 480 μg/ml DNA를 함유하였고; 그룹 6과 7은 약 43 μg/ml RNA를 함유하였다. 그룹 1-6에 대한 제형을 아래 표 16에 제시된 바와 같이 100 mM 시트레이트로 희석하였다.
표 16: 지질 담체 제형의 희석
250 μl의 희석된 지질 담체를 250 μl의 희석된 DNA 또는 RNA에 첨가함으로써, 상기 제형을 복합체화하였다. 생성된 복합 제형을 얼음 위에서 적어도 30분 동안 항온처리하였다. 표 17은 이 검정에 대한 일정을 제시한다.
표 17: 일정
마우스를 정기적으로 채혈하고, 혈청을 즉시 준비하고, SEAP 활성에 대한 분석까지 -80℃에서 보관하였다.
혈청 내 SEAP 수준을 평가하기 위해, 모든 혈청 샘플을 동시에 해동하고, SEAP 검출을 수행하였다. 도 16a-16f는 지질 담체-제형 DNA SEAP의 다양한 반복으로 근육내 주사된 BALB/c 마우스에서의 SEAP 수준을 예시한다. 마우스를 정기적으로 채혈하고, 혈청을 준비하고, SEAP 검정에 의한 분석까지 보관하였다. 데이터를 평균 및 SE(그룹당 n = 5)로 표시하였다.
도 16a-16f에서 볼 수 있는 바와 같이, 지질 담체 제형은 특히 주사 6일 후에 DNA 단독 전달에 비해 표적 단백질 생산을 돕는다. 추가로, 본 실시예는 미글리올의 포함이 미글리올이 결여된 지질 담체 제형에 비해 RNA 레플리콘으로부터 단백질 생산을 향상시킨다는 것을 보여준다.
실시예 10: 무기 코어 제형이 없는 지질 담체
무기 코어 제형이 없는 지질 담체를 100 ml 규모로 제조하였다. 무기 코어가 없는 지질 담체는 37.5 mg/ml 스쿠알렌(SEPPIC), 37 mg/ml SPAN® 60(Millipore Sigma), 37 mg/ml TWEEN® 80(Fisher Chemical), 30 mg/ml DOTAP 클로라이드(LIPOID) 및 10 mM 소듐 시트레이트를 포함한다. 200 ml의 비이커에 3.75 그램의 스쿠알렌, 3.7 그램의 SPAN® 60 및 3.0 그램의 DOTAP를 첨가하여 오일 상을 제조하였다. 오일 상을 65℃ 수조에서 45분 동안 초음파 처리하였다. 별도로, 뉴클레아제 미함유 물에서 제조된 10 mM 소듐 시트레이트 완충액의 500 ml에 19.5 그램의 TWEEN® 80을 용해시킴으로써 수성 상을 제조하였다. 수성 상 96 ml를 별도의 유리병에 옮기고 65℃로 30분 동안 가열하였다. 따뜻한 오일 상을 따뜻한 수성 상에 첨가함으로써 오일 상을 96 ml의 수성 상과 혼합하였다. VWR 200 균질화기(VWR International)를 사용하여 혼합물을 유화시키고, 생성된 미가공 에멀션을, 동적 광 산란(Malvern Zetasizer Nano S)에 의해 측정한 z-평균 유체역학적 직경이 0.1-0.3 다분산도 지수(PDI)로 40-80 nm에 도달할 때까지, F12Y 75 μm 다이아몬드 상호작용 챔버 및 보조 H30Z-200 μm 세라믹 상호작용 챔버가 장착된 30,000 psi의 M110P 미세유동화기(Microfluidics)를 통해 통과시켜 처리하였다. 무기 코어 제형이 없는 미세유동화된 제형을 200 nm 기공-크기의 폴리에테르설폰(PES) 필터로 최종적으로 여과하고, 2-8℃에서 보관하였다. DOTAP 및 스쿠알렌 농도를 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 11: 추가적인 나노입자 제형
추가적인 나노입자 제형을 다음과 같은 표(표 18 및 표 19)에 따라 제조한다.
표 18: mRNA 백신 제형
표 19: 동결건조된 mRNA 백신 제형
실시예 16: 마우스에서 동결건조된 COVID 백신의 평가
다음을 수행하여, 레플리콘 RNA 인코딩된 SARS-CoV-2 스파이크 항원 서열을 갖는 동결건조된 NP-1의 활성, 재구성된 백신의 물리화학적 특성, 효력 및 면역원성을 검정하였다. 간략하게는, 표 20의 물질을 사용하였다.
표 20: 물질
제형 복합체의 제조. 지질 나노입자/RNA 복합체의 조성물을 아래 표 21에 나타낸 바와 같이 본 검정에서 제조하였다. NP-1 또는 NP-7과 repRNA를 15의 N-대-P 비율로 복합체화하였고, 복합체화하여 각각 10% 또는 20% w/v 수크로스 함량 및 50 mg/ml 또는 100 mg/ml("2X" 물질)의 최종 repRNA 농도를 얻었다. 10% 수크로스를 갖는 복합 물질(50 mg/ml의 repRNA)은 5 mM 소듐 시트레이트를 함유한 한편, 20% 수크로스를 함유한 복합 물질(100 mg/ml의 repRNA)은 10 Mm의 소듐 시트레이트를 함유하였다. 복합체를, 멸균되고 발열원 제거되고 베이킹된 2 ml의 바이알에 채웠다. 10% 수크로스를 갖는 복합체를 바이알당 0.7 ml로 채우고, 20% 수크로스의 경우 바이알당 0.35 ml로 채웠다. 그 후, 바이알을 동결건조하여 보관하거나 액체 형태로 보관하였다. 보관 온도는 1주 동안 25℃ 또는 42℃였다. 조성물당 동결건조된 바이알 및 액체 바이알의 양은 표 21에 요약되어 있다.
표 21: 동결건조된 조성물 및 액체 조성물
동결건조 사이클. 불활성 가스 충전 및 스토퍼링 능력(stoppering capability)을 갖춘 SP VirTis Advantage Pro 트레이 및 배치 동결건조기를 사용하였다. 동결건조 사이클의 요약은 아래 표 22에 나타나 있다. 사이클 종료 후, 실온으로 평형화하기 전 바이알을 48 torr의 질소로 다시 채우고 마개를 닫았다.
표 22. 동결건조 사이클
조건 그룹. 본 검정에서 분석된 14개 그룹의 요약은 아래 표 23에 제공된다. 백신 제조를 위한 표준 프로토콜과 비교하기 위한 양성 대조군으로 쓰기 위해, 보관 컬럼에 표시된 바와 같이, 그룹 1과 4를 새로 제조하였다.
표 23. 조건 그룹
면역원성 검정. 항-스파이크 IgG 반응의 유도를 6 내지 8주령 암컷 C57Bl/6 마우스에서 평가하였다. 5마리의 마우스 그룹 크기를 사용하였다. 일정은 표 24에 나타나 있다.
표 24. 면역원성 일정
25℃ 또는 42℃의 안정성 챔버에서 1주 보관 후, 동결건조된 나노입자/RNA 복합체를 0.7 ml 멸균 milliQ 물에서 재구성하고, 입자가 육안으로 보이지 않을 때까지 부드럽게 소용돌이치게 하였다. 복합체의 입자 크기(z-평균) 및 크기 분포(PDI)를 측정하고 이를 도 17에 요약하였고, 이때 그룹 지정이 표 25에 나타나 있다. 새로 제조된 NP-1/WT-S 복합체(그룹 1)의 입자 크기 및 PDI는 각각 76.8 nm 및 0.223이었다. 재구성 후, 동결건조된 샘플(그룹 7-14)은 평균 45%(+/-11%) 증가하였다. 그룹 1에 대한 z-평균의 % 변화 요약이 표 25에 포함되어 있다.
표 25: z-평균의 퍼센트 % 변화
페놀-클로로포름 추출된 repRNA의 아가로스 겔 전기영동. NP-1/repRNA 및 NP-7 + repRNA에서 1주 동안 보관된, 10% 수크로스 또는 20% 수크로스 중 NP-1/repRNA 및 NP-7 + repRNA의 액체 제형은, 각각 repRNA 산물의 부분 또는 전체 분해를 초래하였다(데이터는 표시되지 않음). 10% 수크로스 또는 20% 수크로스 중 NP-1/repRNA 및 NP-7 + repRNA의 동결건조는 NP-1/repRNA 및 NP-7 + repRNA에서 1주 보관 후 repRNA 무결성을 보존하였다(데이터는 표시되지 않음).
효력 검정. 25℃에서 1주 동안 보관된 10% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/WT-S는 형질감염된 BHK 세포에서 스파이크 단백질의 용량 의존적 발현을 생성하였다. 발현 프로파일은 새로 복합체화된 NP-1/WT-S와 유사하였다. 10% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/WT-S의 42℃ 1주 보관은 시험관내 단백질 발현을 유의미하게 감소시켰다. 25℃ 또는 42℃에서 1주 동안 보관된 10% 수크로스 중 액체 NP-1/WT-S는 BHK 세포에서 스파이크 단백질을 생성하지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
ELISA에 의한 항-D614G 스파이크 IgG 반응. 혈청 항-D614G 스파이크 IgG 수준을 프라임-후(post-prime) 14일차 및 28일차에 평가하였으며, 각각 아래의 도 18a와 18b에 도시되어 있다. 마우스 혈청을 1:40(14일차) 또는 1:200(28일차) 희석으로 항-D614G 스파이크 ELISA에서 검정하였다. 혈청 IgG 수준(μg/ml)을 알려진 농도의 마우스 IgG 표준에 의해 생성된 4PL 표준 곡선으로부터 보간하였다.
28일차 프라임-후 항-D614G IgG 반응. 25℃에서 1주 후, 10% 수크로스 중 액체 NP-1/WT-S는 새로 제조된 NP-1/WT-S 양성 대조군과 비교하여 항-스파이크 IgG의 통계적으로 유의미한 감소를 초래하였다. 새로 제조된 NP-1/WT-S 및 25℃에서 1주 동안 보관된 10% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/WT-S 사이의 평균 IgG 수준에는 유의미한 차이가 없었다.
42℃에서 1주 후, 10% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/WT-S는 100% 혈청전환을 유도했지만, 평균 IgG 수준은 새로 제조된 NP-1/WT-S과 비교하여 유의미하게 감소하였다. 새로 제조된 NP-1/WT-S 양성 대조군에 대해 비교하면 통상의 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 결정된 p-값을 포함하는, 면역화 후 28일차로부터 얻은 요약 평균 +/- 표준 편차 IgG 농도 데이터를 표 26에 나타내었다. P < 0.05는 통계적으로 유의미한 차이로 간주된다.
표 26: 1:200 혈청 희석에서의 평균 IgG
새로 제조된 제형 대 동결건조된 제형의 비교. 28일차 프라임-후 혈청 내 항-D614G 스파이크 IgG 농도가 도 19에 도시되어 있다. 평균 IgG 값 사이의 통계적 차이를 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용한 통상의 일원 분산 분석에 의해 결정하였다. 모든 그룹을 10% 수크로스 중 새로 제조된 NP-1/RNA와 비교하였다. 새로 제조된 NP-1/RNA와 25℃에서 7일 동안 보관된 10% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/RNA 사이에는 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 42℃에서는, 10% 또는 20% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/RNA는 새로 제조된 NP-1/RNA와 비교하여 유의미하게 낮은 항-스파이크 IgG를 유도하였다. 20% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/RNA(25℃ 또는 42℃에 보관됨)는 새로 준비된 NP-1/WT-S보다 유의미하게 낮은 IgG를 유도하였다. 10% 또는 20% 수크로스 중 동결건조된 NP-1/델타-S(25℃에서 보관됨)는 새로 제조된 NP-1/WT-S와 유사한 평균 IgG(통계적으로 유의미하지 않음)를 유도하였다.
특허 참조 문헌 및 비-특허 참조 문헌을 포함하여, 본원에 개시된 모든 참조 문헌은 마치 각각이 개별적으로 포함된 것처럼 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본원에 사용된 전문 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐이며 제한하도록 의도되지 않았음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 용어에는 관련 기술 분야에 알려진 전통적인 의미가 부여되어야 함을 이해해야 한다.
서열
서열번호: 1 RNA
서열번호: 2 RNA
SEQUENCE LISTING <110> HDT BIO CORP. <120> DRIED NANOPARTICLE COMPOSITIONS <130> 201953-712601 <140> <141> <150> 63/297,449 <151> 2022-01-07 <150> 63/247,172 <151> 2021-09-22 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1557 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 augcuccucu ugcuccuucu cuugggacuc cgauugcagc ucucuuuggg uauaauuccu 60 gucgaagaag agaaucccga cuucuggaau cgcgaagcgg cagaagcauu gggugcggca 120 aaaaagcucc aaccggcaca gacugcggcc aagaaucuca uaauuuucuu gggugauggc 180 augggcguuu ccacugugac ugcggcacga auccugaagg gucaaaagaa ggauaaacug 240 gguccagaga ucccgcuggc uauggauagg uuuccauacg uugcgcucuc uaagaccuau 300 aacgucgaua agcauguacc agacuccgga gcgacggcca cugcuuaccu uuguggaguu 360 aaagguaauu uccaaacaau aggacugagc gcagcugcaa gauucaacca augcaacacg 420 acaagaggga augaggugau uucagucaug aaucgagcaa agaaagcugg gaaauccguu 480 ggcgugguca ccacuacaag agugcagcau gcaucuccag caggaacuua cgcccacacu 540 guaaacagaa acugguauag ugacgccgau guucccgccu cugcgaggca agaggguugu 600 caagacaucg cuacccagcu cauaagcaac auggacauug auguaauacu gggugggggu 660 cggaaauaca uguuccggau gggcacuccc gauccggagu acccggauga cuauucccaa 720 ggagguacca gauuggacgg gaaaaaucuu guccaagaau ggcucgccaa gcggcagggg 780 gcaagguacg uguggaacag gacagaacug augcaggcaa gcuuggaucc aagcguaacg 840 caucuuaugg gucuuuuuga acccggugau augaaauacg aaauacaucg cgacucaaca 900 cuggacccgu cucucaugga gaugacugaa gcugccuuga gguuguugag ucggaacccu 960 aggggcuuuu ucuuguucgu agagggcggg cgaauugacc acggucauca cgaaucucga 1020 gcguaccggg cgcucacaga aaccaucaug uuugacgaug cuaucgaacg agcgggucag 1080 cuuaccucug aagaagauac gcucucucuu gucaccgcgg accauagcca uguuuuuucc 1140 uucggugguu auccguugcg agguuccagc auauucggcc ucgcgccagg gaaagcccgc 1200 gaccgcaaag cuuauacggu gcugcuuuac ggaaacggcc cugguuacgu ccuuaaagac 1260 ggugcgagac cugacgugac ggaaucugaa uccgguucuc ccgaauauag acaacagagu 1320 gcuguuccgc uggaugaaga gacucaugcg ggagaagaug uagcgguuuu ugcuaggggg 1380 ccgcaagcac accuuguuca uggcguucag gagcaaacuu ucauagccca uguaauggca 1440 uuugcugcgu gucucgagcc guauaccgcu ugcgaucucg cuccgccggc ggguacaacc 1500 gaugcugccc acccggggua cucaagagua ggggcagcag ggcgauuuga acaaacu 1557 <210> 2 <211> 597 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 augaacaguu ucaguaccuc cgcguucggg ccgguugccu uuagccuggg gcuucuucug 60 gugcuccccg ccgcauuccc agcgccgguc uucacacucg aagauuucgu uggggacugg 120 cgacagacag ccggcuacaa ccuggaccaa guccuugaac agggaggugu guccaguuug 180 uuucagaauc ucgggguguc cguaacuccg auccaaagga uuguccugag cggugaaaau 240 gggcugaaga ucgacaucca ugucaucauc ccguaugaag gucugagcgg cgaccaaaug 300 ggccagaucg aaaaaauuuu uaagguggug uacccugugg augaucauca cuuuaaggug 360 auccugcacu auggcacacu gguaaucgac gggguuacgc cgaacaugau cgacuauuuc 420 ggacggccgu augaaggcau cgccguguuc gacggcaaaa agaucacugu aacagggacc 480 cuguggaacg gcaacaaaau uaucgacgag cgccugauca accccgacgg cucccugcug 540 uuccgaguaa ccaucaacgg agugaccggc uggcggcugu gcgaacgcau ucuggcg 597

Claims (128)

  1. (a) 소수성 코어, 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체;
    (b) 하나 이상의 핵산; 및
    (c) 적어도 하나의 동결보호제
    를 포함하는, 건조된 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    동결건조된 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    분무 건조된 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    열적으로 안정한 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    약 25℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    약 45℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    약 -20℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    적어도 1주, 적어도 2주, 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정한 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    소수성 코어가 오일을 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    오일이 α-토코페롤, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 모노아실글리세롤, 프로폴리스, 스쿠알렌, 광유, 포도씨유, 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 대두유, 해바라기유, 대두 레시틴, 트리글리세리드, 비타민 E, 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드, 포화된 코코넛/팜핵유(palmkernel oil) 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르, 디하이드로이소스쿠알렌(DHIS), 파네센 및 스쿠알란 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 무기 나노입자가 금속염, 금속 옥사이드, 금속 하이드록사이드, 금속 포스페이트 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 앙이온성 지질, 음이온성 지질, 중성 지질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 양이온성 지질인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    양이온성 지질이 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤); 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP); 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디올레오일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 및 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); N-데실-N,N-디메틸데칸-1-아미늄 브로마이드(DDAB); 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA); 에틸포스파티딜콜린(ePC); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    지질 담체가 적어도 하나의 계면활성제를 선택적으로 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    적어도 하나의 계면활성제가 소수성 계면활성제, 친수성 계면활성제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    소수성 계면활성제가 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하고; 친수성 계면활성제가 폴리소르베이트를 포함하는, 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    지질 담체가 약 40 nm 내지 약 150 nm 범위의 z-평균 유체역학적 직경을 갖고, 이때 평균 다분산도 지수가 약 0.1 내지 약 0.4 범위인, 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 RNA인, 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    RNA가 자가 복제 RNA인, 조성물.
  22. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 지질 담체와 통합되거나 이와 복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    지질 담체-핵산 복합체가 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성되는, 조성물.
  24. 제1항에 있어서,
    질소 대 포스페이트(N:P) 몰비를 특징으로 하는 지질 담체 대 하나 이상의 핵산의 몰비가 약 1:1 내지 약 150:1 범위인, 조성물.
  25. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 수크로스인, 조성물.
  27. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 약 1% w/v 내지 약 40% w/v인, 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 약 10% w/v 내지 약 20% w/v인, 조성물.
  29. 제27항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 약 10% w/v인, 조성물.
  30. 적합한 희석제에서 재구성된 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    희석제가 수성인, 약학 조성물.
  32. 제30항에 있어서,
    희석제가 물인, 약학 조성물.
  33. 제30항의 약학 조성물 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함하는 키트.
  34. 제30항의 약학 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 백신 보조제(adjuvant)를 포함하는 백신 전달 시스템.
  35. 제30항의 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
  36. 제30항의 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  37. 제30항의 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 하나 이상의 핵산의 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법.
  38. (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계;
    (b) 하나 이상의 핵산을 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 및
    (d) 제형을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 동결건조된 조성물을 제조하는 방법.
  39. (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계;
    (b) 하나 이상의 핵산을 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계; 및
    (d) 제형을 분무 건조하여 분무 건조된 조성물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 분무 건조된 조성물을 제조하는 방법.
  40. (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계;
    (b) 하나 이상의 핵산을 상기 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계;
    (d) 제형을 동결건조시켜 동결건조된 조성물을 형성하는 단계; 및
    (e) 적합한 희석제에서 동결건조된 조성물을 재구성하는 단계
    를 포함하는, 동결건조된 조성물을 재구성하는 방법.
  41. (a) 소수성 코어, 선택적으로 하나 이상의 무기 나노입자 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체를 얻는 단계;
    (b) 하나 이상의 핵산을 상기 지질 담체 내로 통합시켜 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 적어도 하나의 동결보호제를 지질 담체-핵산 복합체에 첨가하여 제형을 형성하는 단계;
    (d) 제형을 분무 건조하여 분무 건조된 조성물을 형성하는 단계; 및
    (e) 적합한 희석제에서 분무 건조된 조성물을 재구성하는 단계
    를 포함하는, 분무 건조된 조성물을 재구성하는 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    희석제가 수성인, 방법.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    희석제가 물인, 방법.
  44. 제38항 또는 제40항에 있어서,
    동결건조된 조성물이 열적으로 안정한, 방법.
  45. 제38항 또는 제40항에 있어서,
    동결건조된 조성물이 약 25℃에서 열적으로 안정한, 방법.
  46. 제38항 또는 제40항에 있어서,
    동결건조된 조성물이 약 45℃에서 열적으로 안정한, 방법.
  47. 제38항 또는 제40항에 있어서,
    동결건조된 조성물이 약 -20℃에서 열적으로 안정한, 방법.
  48. 제38항 또는 제40항에 있어서,
    동결건조된 조성물이 약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정한, 방법.
  49. 제38항 또는 제40항에 있어서,
    동결건조된 조성물이 적어도 1주, 적어도 2주, 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정한, 방법.
  50. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    소수성 코어가 오일을 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    오일이 α-토코페롤, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 모노아실글리세롤, 프로폴리스, 스쿠알렌, 광유, 포도씨유, 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 대두유, 해바라기유, 대두 레시틴, 트리글리세리드, 비타민 E, 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드, 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르, 디하이드로이소스쿠알렌(DHIS), 파네센 및 스쿠알란 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  52. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 무기 나노입자가 금속염, 금속 옥사이드, 금속 하이드록사이드, 금속 포스페이트 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 앙이온성 지질, 음이온성 지질, 중성 지질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 양이온성 지질인, 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    양이온성 지질이 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤); 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP); 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디올레오일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 및 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); N-데실-N,N-디메틸데칸-1-아미늄 브로마이드(DDAB); 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA); 에틸포스파티딜콜린(ePC); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질 담체가 하나 이상의 계면활성제를 선택적으로 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    하나 이상의 계면활성제가 소수성 계면활성제, 친수성 계면활성제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    소수성 계면활성제가 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하고; 친수성 계면활성제가 폴리소르베이트를 포함하는, 방법.
  59. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질 담체가 약 40 nm 내지 약 150 nm 범위의 z-평균 유체역학적 직경을 갖고, 이때 평균 다분산도 지수가 약 0.1 내지 약 0.4 범위인, 방법.
  60. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 RNA인, 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    RNA가 자가 복제 RNA인, 방법.
  62. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 지질 담체와 통합되거나 이와 복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    지질 담체-핵산 복합체가 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성되는, 방법.
  64. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 수크로스인, 방법.
  66. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 약 1% w/v 내지 약 20% w/v인, 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 약 10% w/v 내지 약 20% w/v인, 방법.
  68. 제66항에 있어서,
    적어도 하나의 동결보호제가 약 10% w/v인, 방법.
  69. 소르비탄 지방산 에스테르, 에톡시화 소르비탄 에스테르, 양이온성 지질, 면역 자극제(immune stimulant) 및 RNA를 포함하는 건조된 조성물.
  70. 제69항에 있어서,
    소르비탄 지방산 에스테르가 소르비탄 모노스테아레이트인, 조성물.
  71. 제69항에 있어서,
    에톡시화 소르비탄 에스테르가 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트인, 조성물.
  72. 제69항에 있어서,
    양이온성 지질이 DOTAP인, 조성물.
  73. 제69항에 있어서,
    면역 자극제가 스쿠알렌인, 조성물.
  74. 제69항에 있어서,
    에스테르의 비율이 8 내지 11의 친수성-친유성 평형(hydrophilic-lipophilic balance)을 초래하는, 조성물.
  75. 제69항에 있어서,
    에스테르 및 지질의 비율이 30 nm 내지 200 nm의 입자 크기를 초래하는, 조성물.
  76. 제69항에 있어서,
    에스테르 및 지질의 비율이 40 nm 내지 70 nm의 입자 크기를 초래하는, 조성물.
  77. 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트, DOTAP, 면역 자극제 및 RNA를 포함하는 건조된 조성물.
  78. 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 자극제가 생산되는 단백질의 총량을 감소시키지만, 백신에 대한 면역 반응을 증가시키는, 조성물.
  79. 제77항에 있어서,
    소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트, DOTAP 및 스쿠알렌을 포함하고, 고체 입자를 포함하지 않는 조성물.
  80. 제77항에 있어서,
    에스테르의 비율이 8 내지 11의 친수성-친유성 평형을 초래하는, 조성물.
  81. 제77항에 있어서,
    입자 크기가 30 nm 내지 200 nm인, 조성물.
  82. 제77항에 있어서,
    N:P 비율이 5 내지 35인, 조성물.
  83. 제69항 또는 제77항에 있어서,
    면역 자극제가 생산되는 단백질의 총량을 증가시키지만, 백신에 대한 면역 반응을 감소시키는, 조성물.
  84. 제83항에 있어서,
    면역 자극제가 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드 또는 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르인, 조성물.
  85. a) 소수성 코어 및 하나 이상의 지질을 포함하는 나노에멀션인 지질 담체;
    b) 선택적으로 하나 이상의 핵산; 및
    c) (i) 건조된 조성물 중 적어도 약 50 중량%의 양으로 존재하거나, (ii) 적어도 약 50 mg의 양으로 존재하는 적어도 하나의 당
    을 포함하는, 건조된 조성물.
  86. 제85항에 있어서,
    동결건조된 조성물.
  87. 제85항에 있어서,
    약 25℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  88. 제85항에 있어서,
    약 45℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  89. 제85항에 있어서,
    약 -20℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  90. 제85항에 있어서,
    약 2℃ 내지 약 8℃에서 열적으로 안정한 조성물.
  91. 제85항에 있어서,
    적어도 1주, 적어도 2주, 및/또는 적어도 1개월 동안 열적으로 안정한 조성물.
  92. 제85항에 있어서,
    소수성 코어가 오일을 포함하는, 조성물.
  93. 제92항에 있어서,
    오일이 α-토코페롤, 라우로일 폴리옥실글리세리드, 모노아실글리세롤, 프로폴리스, 스쿠알렌, 광유, 포도씨유, 올리브유, 파라핀유, 땅콩유, 대두유, 해바라기유, 대두 레시틴, 트리글리세리드, 비타민 E, 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드, 포화된 코코넛/팜핵유 유래 카프릴릭 및 카프릭 지방산 및 식물 유래 글리세롤의 트리글리세리드 에스테르, 디하이드로이소스쿠알렌(DHIS), 파네센 및 스쿠알란 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  94. 제85항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 앙이온성 지질, 음이온성 지질, 중성 지질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  95. 제94항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 양이온성 지질을 포함하는, 조성물.
  96. 제94항에 있어서,
    양이온성 지질이 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP); 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC 콜레스테롤); 디메틸디옥타데실암모늄(DDA); 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판(DMTAP), 디팔미토일(C16:0)트리메틸 암모늄 프로판(DPTAP); 디스테아로일트리메틸암모늄 프로판(DSTAP); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디올레오일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 및 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA); 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); N-데실-N,N-디메틸데칸-1-아미늄 브로마이드(DDAB); 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA); 에틸포스파티딜콜린(ePC); 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  97. 제85항에 있어서,
    지질 담체가 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는, 조성물.
  98. 제97항에 있어서,
    적어도 하나의 계면활성제가 소수성 계면활성제, 친수성 계면활성제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  99. 제98항에 있어서,
    소수성 계면활성제가 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올리에이트 및 소르비탄 트리올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 소르비탄 에스테르를 포함하고; 친수성 계면활성제가 폴리소르베이트를 포함하는, 조성물.
  100. 제85항에 있어서,
    지질 담체가 약 40 nm 내지 약 150 nm 범위의 z-평균 유체역학적 직경을 갖고, 이때 평균 다분산도 지수가 약 0.1 내지 약 0.4 범위인, 조성물.
  101. 제85항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 DNA인, 조성물.
  102. 제85항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 RNA인, 조성물.
  103. 제102항에 있어서,
    RNA가 자가 복제 RNA인, 조성물.
  104. 제85항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이 지질 담체와 통합되거나 이와 복합체화되어 지질 담체-핵산 복합체를 형성하는, 조성물.
  105. 제104항에 있어서,
    지질 담체-핵산 복합체가 비공유 상호작용 또는 가역적 공유 상호작용을 통해 형성되는, 조성물.
  106. 제85항에 있어서,
    질소 대 포스페이트(N:P) 몰비를 특징으로 하는, 지질 담체 대 하나 이상의 핵산의 몰비는 약 1:1 내지 약 150:1의 범위인, 조성물.
  107. 제85항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 당이 수크로스, 말토스, 트레할로스, 만니톨, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  108. 제85항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 당이 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 mg 또는 300 mg 초과의 양으로 존재하는, 조성물.
  109. 제85항에 있어서,
    적어도 하나의 당이 50 mg 내지 250 mg의 양으로 존재하는, 조성물.
  110. 제85항에 있어서,
    적어도 하나의 당이 적어도 약 250 mg의 양으로 존재하는, 조성물.
  111. 제85항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    당이 조성물 중량의 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 또는 95% 초과의 양으로 존재하는, 조성물.
  112. 제85항에 있어서,
    당이 조성물 중량의 80 내지 98%, 선택적으로 94 내지 96%의 양으로 존재하는, 조성물.
  113. 제85항에 있어서,
    당이 조성물 중량의 약 95%의 양으로 존재하는, 조성물.
  114. 제85항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 당이 수크로스를 포함하는, 조성물.
  115. 제85항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    소수성 코어가 하나 이상의 무기 나노입자를 포함하는, 조성물.
  116. 제115항에 있어서,
    하나 이상의 무기 나노입자가 금속염, 금속 옥사이드, 금속 하이드록사이드, 금속 포스페이트 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  117. 제115항에 있어서,
    하나 이상의 무기 나노입자가 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 알루미늄 옥시하이드록사이드, 철 옥사이드, 티타늄 디옥사이드, 실리콘 디옥사이드(SiO2), 알루미늄 하이드록시포스페이트(Al(OH)x(PO4)y), 칼슘 포스페이트(Ca3(PO4)2), 칼슘 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 철 글루코네이트 또는 철 설페이트를 포함하는, 조성물.
  118. 제115항에 있어서,
    하나 이상의 무기 나노입자가 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(y-Fe2O3), 뷔스타이트(FeO) 또는 헤마타이트(알파(α)-Fe2O3), 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
  119. 최대 약 200 마이크로그램(μg)의 양으로 존재하는 핵산;
    최대 약 1.5 mg/ml의 농도로 존재하는 양이온성 지질;
    최대 약 0.01 mg/ml의 농도로 존재하는 철 옥사이드;
    최대 약 1.88 mg/ml의 농도로 존재하는 스쿠알렌;
    최대 약 1.86 mg/ml의 농도로 존재하는 소르비탄 모노스테아레이트;
    최대 약 1.86 mg/ml의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80;
    최대 약 50 mg/ml의 농도로 존재하는 수크로스; 및
    선택적으로, 최대 약 2.1 mg/ml의 농도로 존재하는 시트르산 모노하이드레이트
    를 포함하는 조성물.
  120. 제119항에 있어서,
    핵산이 RNA 또는 DNA인, 조성물.
  121. 제119항에 있어서,
    핵산이 RNA이고, 최대 약 50 μg의 양으로 존재하는, 조성물.
  122. 적합한 희석제에서 재구성된 제85항 내지 제118항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체, 또는 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  123. 제122항에 있어서,
    희석제가 수성인, 약학 조성물.
  124. 제123항에 있어서,
    희석제가 물인, 약학 조성물.
  125. 제122항의 약학 조성물 및 대상체로의 투여를 위한 전달 시스템을 포함하는 키트.
  126. 제123항의 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 방법.
  127. 제120항의 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  128. 제122항의 약학 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 하나 이상의 핵산의 전달을 영상화 및/또는 추적하는 방법.
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