KR20240087508A - Clade 2.3.2.1d/2.3.4.4b에 속하는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 재조합 다가 백신 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
Clade 2.3.2.1d/2.3.4.4b에 속하는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 재조합 다가 백신 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 재조합 다가 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 예방하기 위한 재조합 다가 백신 조성물을 제공함으로써, 각각의 단일 백신의 생산과 비교하여, 백신 생산 비용의 절감이라는 경제적 이점을 가질 뿐 아니라, 상기 다가 백신 조성물의 높은 백신 효능으로 인해 고병원성 조류 인플루엔자 발생에 대비한 효과적 방어 수단으로 질병 방제에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 재조합 다가 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
조류 인플루엔자(Avian Influenza, AI)는 조류 인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 발생하는 닭과 기타 가금류에 대한 급성 전염병으로, 일반적으로 전파가 빠르고, 임상 증상이 전혀 나타나지 않는 경우부터 치사율이 100%인 경우까지 그 병원성이 매우 다양하다.
상기 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV)는 모두 오르쏘믹소 계통(Family orthomyxoviridae)에 속하는 A형의 RNA 바이러스로, 바이러스 외막에 있는 HA(hemagglutinin)(18종류)와 NA(neuraminidase)(11종류)의 조합에 따라, 총 198종류의 혈청형(HxNx)으로 분류할 수 있다. 또한, AIV는 감염된 가금에서 나타나는 병원성에 따라 고병원성(High Pathogenicity, HPAIV)과 저병원성(Low pathogenicity, LPAIV)으로 나뉘며, 그 중에서 현재까지 발생한 HPAIV는 모두 H5 또는 H7 혈청형에 의한 것으로 확인된다.
특히, H5 혈청형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스(HPAIV)는 주로 두 개의 clade(2.3.2.1 및 2.3.4.4)에 속하는 것으로 알려져 있으며, 전 세계적으로 가금류와 야생 조류에서의 발생이 보고되고 있다. 1996년 중국의 거위농장에서 A/Gs/Gd/1/1996(H5N6)의 HPAIV가 처음으로 분리되었고, 이후 H5 바이러스는 감염된 야생조류 및 가금류의 AIV와 다양한 유전적 재조합에 의해 새로운 형태로 지속해서 진화해왔다.
특히, H5N1, H5N2, H5N6, H5N8 등 다양한 아형의 H5형 고병원성 인플루엔자 A 바이러스는 중국, 대만, 베트남 및 인도의 가금류에서 동시에 확인되었고, 2003년 이후, 한국에서도 상기 혈청형의 HPAI와 다양한 하위 clade의 HPAI의 발병이 보고되었다. 더욱이, 2016-2017년 HPAI의 발생은 가금류 산업에 막대한 피해를 입혔고, AIV 예방 접종에 대한 수요를 증가시킨 계기가 되었다.
현재까지 H5형 인플루엔자 A 바이러스의 백신주는 역유전학(reverse genetics, RG) 시스템을 사용하여 확립되었으며, 특히, 중국은 광범위한 백신 생산 시스템을 갖추고 있다. 최근 중국에서는 RE-13(H5N6 2.3.4.4h 바이러스), RE-14(H5N8 2.3.4.4b 바이러스) 및 RE4(H7N9 바이러스)를 포함하도록 3가 백신이 업데이트되었다. 또한, H9N2, H5N1 및 H7N3 및 clade 2.1.3 및 2.3.2.1 종자 바이러스주를 기반으로 한 다가 백신이 파키스탄과 인도네시아에서 각각 개발되었다.
따라서, 주로 발생하는 H5형 고병원성 인플루엔자 A 바이러스의 두 개의 clade(2.3.2.1 및 2.3.4.4)에 대해 높은 방어능을 보이며, 백신 생산 비용의 절감 효과를 기대할 수 있는, 보다 효과적인 국내 다가 백신의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 신규한 다가 백신을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 PB2(polymerase B2) 유전자를 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자로 치환하고 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 혼합하여, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신주 및 이를 포함하는 다가 백신 조성물을 제조함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 신규한 다가 백신을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 PB2 유전자를 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자로 치환하고 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스와 혼합하여, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신주 및 이를 포함하는 다가 백신 조성물을 제조하였고, 이렇게 제조된 백신의 경우 각각의 단가 백신의 생산과 비교하여, 생산 비용이 낮으면서도, 높은 백신 효능을 가짐을 규명하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제작하는 단계;
(b) 상기 H5N1형 재조합 인플루엔자 A 바이러스 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 혼합하는 단계; 및
(c) 상기 H5N1형 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스 및 어쥬번트(adjuvant)를 혼합하는 단계.
본 명세서에서 용어 '조류 인플루엔자(Avian influenza)'는 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생하는 조류의 급성 전염병을 의미하는 것으로, 상기 조류 인플루엔자의 원인체는 인플루엔자 A 바이러스이다.
본 명세서에서 용어 '인플루엔자 A 바이러스'는 조류를 포함한 동물 및 인간에서 모두 발생할 수 있는 통상 '독감(flu)'으로 불리는 고전염성 호흡기 질환의 원인 바이러스를 의미한다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 외피가 있는 RNA 바이러스로서, 8개의 분절된 단일 가닥 음성 RNA 절편으로 이루어진 지놈(genome)을 갖는 것을 특징으로 하며, 구체적으로, 다음의 단백질을 포함한다: 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA), 뉴라미다제(neuraminidase, NA), 중합효소 염기 단백질 1(polymerase basic protein 1, PB1), 중합효소 염기 단백질 2(polymerase B2, PB2), 중합효소 산성 단백질(polymerase A, PA), 뉴클레오프로테인(nucleoprotein, NP), 기질단백질(matrix protein, M) 및 비구조 단백질(non-structural protein, NS).
상기 인플루엔자 A 바이러스에서 HA 단백질 및 NA단백질은 바이러스 표면 상에 존재하는 외막 당단백질로서, 두 단백질 모두 예방적 인플루엔자 백신을 위한 가장 중요한 성분으로 알려져 있다.
구체적으로, 상기 HA 단백질은 적혈구의 응집을 불러 일으키는 물질로서, 바이러스가 숙주를 감염시킬 때 초기 숙주 수용체 (sialic acid (SA) receptor)에 바이러스를 부착함으로써 바이러스 입자의 숙주 세포로의 침투하는데 중요한 역할을 담당하고, 바이러스 중화 및 보호 면역성을 위한 주요 면역 우세 에피토프를 함유한다. NA 단백질은 가수분해하는 효소로서, 인플루엔자 바이러스에 감염된 숙주 세포로부터 증식된 바이러스가 빠져나와 새로운 체세포를 감염시킬 수 있도록, 기존의 감염된 세포의 SA와 표면당단백질의 결합을 끊어 증식한 바이러스가 세포 밖으로 배출하는데 중요한 역할을 한다.
최근까지 공지된 인플루엔자 A 바이러스의 혈청형은 총 198종으로 분류할 수 있으며, 이는 18종의 HA 아형과 11종의 NA 아형의 상이한 조합에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들면, 'H5Nx'로서 언급되는 총 9종류의 H5(혈청)형 바이러스가 공지되어 있으며, 이는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, 및 H5N9로 분류될 수 있다.
또한, 인플루엔자 A 바이러스는 이의 병원성에 따라, 고병원성과 저병원성 바이러스로 나눌 수 있다. 상기 H5(혈청)형 바이러스의 경우, 전세계적으로 야생 조류 및 가금류에서 동정된 대부분이 낮은 병원성, 즉, 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 속하는 것이나, 일부 H5형 바이러스는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 속하는 것으로 알려져 있다. 하지만, H5Nx 바이러스는 신속하게 진화하여 상이한 H5 계통 중에 진화적 관계를 나타내는 상이한 계통군 중에서 상당히 다양한 항원 변이를 유도함으로써 감염 위험성이 증가될 수 있을 뿐 아니라, 기존의 알려진 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스(HPAIV)는 감염의 대상에게 높은 치사율을 갖는 중증 질환을 유발시킬 수 있다.
상기 인플루엔자 A 바이러스의 병원성을 결정함에 있어서 다양한 요인들이 관여하지만, HA 분절부위(HA cleavage site, HACS)가 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, HA 분절부위(HACS)의 분자적 특성, 즉, 분절부위의 특정한 병원성 관련 유전자 배열에 따라 고병원성 또는 저병원성으로 분류될 수 있다.
구체적으로, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 분절부위 모티프는 1개 또는 2개의 비연속 염기성 아미노산 잔기를 포함하고, 일반적으로 단일염기 특이성(monobasic specificity)을 갖는 트립신 및 트립신 유사 세린 프로테아제에 의해 절단되는 것을 특징으로 한다. 대조적으로, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 분절부위 모티프는 다수의 염기성 아미노산 잔기, 즉 최소 4개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하고, 다염기성 특이성(polybasic specificity)을 갖는 유비쿼터스 발현 단백질 가수분해효소, 특히 퓨린에 의해 분열이 촉진되는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 본 명세서에서 용어 '고병원성 인플루엔자 A 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza A virus, HPAIV)'는 (i) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 6수 이상(75%) 폐사할 경우; (ii) 정맥내 병원성지수(intravenous pathogenicity, IVPI, 10수의 4-8주령 감수성 닭의 정맥내로 바이러스를 접종하고 10일 동안 24시간 간격으로 닭의 임상증상 및 폐사정도를 확인하고 호흡기 증상, 침울, 설사, 외피나 벼슬의 청색증, 두부의 부종, 신경증상의 경중을 점수로 기록하여 각 증상의 합에 증상 수치를 곱한 총합을 100으로 나눈 지수)가 1.2 이상인 경우; (iii) HA 단백질의 분절 부위의 아미노산 서열이 고병원성으로 알려진 바이러스의 분절 부위의 서열정보와 같거나 유사하다고 판정되는 경우를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 용어 '저병원성 인플루엔자 A 바이러스(Low Pathogenic Avian Influenza A Virus, LPAIV)'는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스보다, (i) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 2수 이하(25%) 폐사할 경우; (ii) 정맥내 병원성 지수가 1.2 미만인 경우; (iii) HA 단백질의 분절 부위의 아미노산 서열이 고병원성으로 알려진 바이러스의 분절 부위의 서열정보와 상이하다고 판정되는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 용어 '백신(또는 백신 조성물)'은 대상(subject)으로부터 면역 반응을 유발하는 적어도 하나 이상의 항원 물질을 포함하는 제제로서, 대상(subject)에 항원을 투여함으로써 이의 면역 반응을 야기, 자극 또는 증폭시킬 수 있는 제제를 의미한다. 상기 백신(또는 백신 조성물)은 포함하는 항원(물질)의 수에 따라, 하나의 항원만을 포함하는 단가 백신과 둘 이상의 항원을 포함하는 다가 백신으로 분류될 수 있다.
그러므로, 본 명세서에서 용어 '다가 백신(또는 다가 백신 조성물)'은 적어도 2종 이상의 단가 백신 조성물, 또는 적어도 2종 이상의 단가 백신을 함유하는 제제를 의미하는 것으로, 다가 백신은 2종, 3종, 4종 또는 그 이상의 단가 백신 조성물 또는 단가 백신을 함유할 수 있다. 또한, 다가 백신 또는 다가 백신 조성물은 재조합 바이러스 벡터, 활성 또는 약독화 또는 사멸화 형태의 야생형 바이러스, 또는 활성 또는 약독화 또는 사멸화 형태의 야생형 바이러스 및 재조합 바이러스 벡터의 혼합물을 포함할 수 있다.
일반적으로, 1 종의 항원을 포함하는 유전자 재조합 바이러스 입자를 함유한 단가 백신만을 투여하여 백신 효능을 나타낼 수 있음이 알려져 있으나, 다가 백신(또는 다가 백신 조성물)의 경우, 적어도 2종 이상의 항원 또는 단가 백신을 단일 제제 형태로 함유하고 있으므로, 각각의 단가 백신 바이러스의 개별적 생산 및 투여, 또는 이의 다중 투여가 필요치 않아, 시간 및 비용에서 큰 경제적 이점을 가질 수 있다. 뿐만 아니라, 단일 제제의 형태로 1회 접종만으로 투여될 수 있고, 다양한 타입의 인플루엔자 바이러스에 대해 보다 빠르고 효과적으로 방어할 수 있음을 장점으로 한다.
본 명세서에서 용어 '유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스'는 유전자 재조합 기술을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 RNA 단편이 재조합된 바이러스를 의미한다. 예를 들어, 1개 또는 2개의 공여자 바이러스(고병원성 인플루엔자 A 바이러스, 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 또는 이들의 조합)의 RNA 단편의 조합에 의해 생성되는 유전물질을 함유하는 바이러스이다.
상술한 바와 같이, 본 명세서에서 용어 'H5N1형'은 인플루엔자 A 바이러스의 표면 단백질인 HA 단백질의 항원 특성이 H5형이고, NA 단백질의 항원 특성이 N1형인 인플루엔자 A 바이러스를 의미하고, 구체적으로, 상기 단계 (a)의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H5N1형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 RNA 단편이 재조합된 바이러스를 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 단계 (a)의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H5N1형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 유전자, 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.2.1d에 속하는 H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 재조합된 바이러스일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)일 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 'H5N6형'은 인플루엔자 A 바이러스의 표면 단백질인 HA 단백질의 항원 특성이 H5형이고, NA 단백질의 항원 특성이 N6형인 인플루엔자 A 바이러스를 의미하고, 구체적으로, 상기 단계 (b)의 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H5N6형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 RNA 단편이 재조합된 바이러스를 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 단계 (b)의 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H5N6형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 유전자, 및 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.4.4d에 속하는 H5N6형 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 재조합된 바이러스일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 H5N6형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/duck/Korea/H35/2017(H5N6)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 'clade(계통군)'는 하나의 통상의 선조의 모든 후손들을 포함하는 생물학적 분류(예를 들어, 종)의 그룹을 의미한다. 구체적으로, 본 명세서에서 상기 'clade'는 H5형 인플루엔자 바이러스의 HA 유전자의 계통수적 특징(phylogenetic characterization) 및 서열 상동성에 기초하여 H5형 인플루엔자 바이러스의 그룹을 분류하는 기준이 되는 것으로, 각 clade는 WHO/WOAH/FAO의 전문가 그룹에 의하여 정의된다.
또한, 조류 인플루엔자 바이러스는 다음과 같은 바이러스 명명법에 따라 표기되고: [아형/기원숙주/분리지역/분리순번/분리년도(HxNx)], 예를 들면, 상기 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)는 닭을 숙주로 하는, 베트남에서 2013년에 분리된 조류 인플루엔자 A 바이러스를 의미하고, 상기 A/duck/Korea/H35/2017(H5N6)는 오리를 숙주로 하는, 대한민국에서 2017년에 분리된 조류 인플루엔자 A 바이러스를 의미한다.
본 발명의 실시예에서 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물을 제조하기 위해 사용된 H5N1형 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 항원뱅크 구축용 백신 후보주로부터 선발되었다.
구체적으로, 상기 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 KA435/2.3.2.1d에 속하는 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용하여 제작되었고, 상기 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H35/2.3.4.4b에 속하는 H5N6형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용하여 제작되었다.
본 발명의 다가 백신 조성물 내 H5N1형 또는 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 보다 구체적으로, 다음의 단계를 포함하는 제조 방법으로 수득될 수 있다.
단계 (i): 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조(상기 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H5N1형 또는 H5N6형임)
먼저, H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 유전자, 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.
또는, H5N6형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 유전자, 및 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.
본 명세서에서 용어 '뉴클레오타이드 서열'은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '벡터(vector)'는 벡터의 전사에 제공되는 추가 단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 이와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료 암호 서열을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커 등을 또한 포함한다. 벡터는 일반적으로 플라스미스 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
상기 단계 (i)에서 제조된 H5N1형 유전자 재조합 플라스미드는 H5N1형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 유전자, 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA 유전자를 포함한다.
또한, 상기 단계 (i)에서 제조된 H5N6형 유전자 재조합 플라스미드는 H5N6형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 유전자, 및 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA 유전자를 포함한다.
따라서, 상기 단계 (i)의 재조합 플라스미드는 H5N1형 또는 H5N6형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA 유전자를 포함하는 제1재조합 플라스미드, 및 NA 유전자를 포함하는 제2재조합 플라스미드로 구성된다.
단계 (ii): H1N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스(A/Peurto Rico/8/1934(H1N1), 이하 PR8로 나타냄.)로부터 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 유전자를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
다음, PR8 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.
상기 단계 (ii)에서 제조된 재조합 플라스미드는 PR8 바이러스 유래의 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB2 유전자, 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB1 유전자, 서열번호 7로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PA 유전자, 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NP 유전자, 서열번호 9로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 M 유전자 및 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NS 유전자를 포함한다.
따라서, 상기 단계 (ii)의 재조합 플라스미드는 PR8 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 제3재조합 플라스미드, PB1 유전자를 포함하는 제4재조합 플라스미드, PA 유전자를 포함하는 제5재조합 플라스미드, NP 유전자를 포함하는 제6재조합 플라스미드, M 유전자를 포함하는 제7재조합 플라스미드, 및 NS 유전자를 포함하는 제8재조합 플라스미드로 구성된다.
단계 (iii): 상기 단계 (i) 및 단계 (ii)에서 수득한 플라스미드의 패키징 세포에 트랜스펙션(transfection)
다음, 상기 단계 (i) 및 (ii)의 제 1 내지 제8 재조합 플라스미드를 패키징(packaging cell)에 트랜스펙션한다.
본 명세서에서 용어 '패키징 세포(packaging cell)'는 비-바이러스성 트랜스펙션 방법을 통해 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 패키징 세포는 트랜스펙션된 제1 내지 제8재조합 플라스미드로부터 발현된 HA, NA, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS 단백질이 어셈블리(assembly)된 유전자 재조합의 H5N1형 또는 H5N6형 조류 인플루엔자 A 바이러스를 생산할 수 있다.
단계 (iv): 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 수득(상기 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H5N1형 또는 H5N6형임)
마지막으로, 상기 패키징 세포의 배양 상층액을 원심분리하여 특정병원체부재(SPF, specific pathogenic free) 부화란에 접종함으로써, H5N1형 또는 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 수득한다.본 명세서에서 용어 'rgKA435/2.3.2.1d'는 상기 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조 방법 수득된 바이러스를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 용어 'rgH35/2.3.4.4b'는 상기 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조 방법으로 수득된 바이러스를 의미한다.
그러나, 본 발명의 다가 백신 조성물은 이의 제조 방법에 있어서, 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스 제작하는 단계 (a)를 포함하는 것으로, 상기 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조 방법의 단계 (ii)에서 PR8 바이러스주의 PB2 유전자를 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자로 치환하는 단계를 추가로 필요로 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H9N2형 조류 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H9N2형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/Chicken/Korea/01310/2001(H9N2)일 수 있다.
따라서, 본 발명의 다가 백신 조성물 내 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H9N2형의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 11로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB2 유전자를 포함한다.
본 발명의 다가 백신 조성물 내 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d로 나타낼 수 있다.
즉, 본 명세서에서 용어 'rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d'는 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조 방법으로 수득된 바이러스를 의미한다.
상기 PR8 바이러스주는 H1N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스로, 계절성 및 H5N1형의 특이적 백신주를 생성하는데 주로 사용되며, 특히, 이의 잘 밝혀진 생물학적 특성과 부화란(embryonated chicken-eggs, ECEs)에서의 높은 수율로 인해, 백신주로 사용되는 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조에서 유전자 구성 요소(예를 들면, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS)를 제공하는 백본(backbone) 바이러스로 사용되는 것을 특징으로 한다. 그러나, 상기 바이러스가 높은 역가로 투여되는 경우, 높은 병원성으로 인해 투여 대상의 사망률을 증가시킬 수 있으므로, 추후 백신주로 사용될 재조합 바이러스의 생산성에는 영향을 주지 않으면서도 독성이 낮은 내부 유전자를 갖도록 하는 것이 중요하다. 또한, 상기 구성 요소 중 PB2 유전자는 바이러스의 증식에 관여하여 백신주의 생산 수율에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있으므로, PR8 유전자를 사용하여 백신주를 제조하는 경우, 이에 따른 백신주의 생산 수율도 고려할 필요가 있다.
본 발명의 실시예에서 PB2 유전자에 따른 백신주의 생산 수율을 비교하였으며, 구체적으로, 기존의 PR8 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 rgKA435/2.3.2.1d 백신주의 생산 수율과 비교하여, 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 PB2 유전자를 포함하는 H1N5형의 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스인 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d 백신주에서 보다 높은 생산 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 다가 백신 조성물의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 사용함으로써, 투여 대상에서의 사망 위험성을 감소시킬 뿐 아니라, 바이러스의 증식력에 관여하여 부화란(embryonated chicken egg, ECE)에서의 효율적인 증식을 가능케 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 다가 백신 조성물의 제조 방법에서 사용되는 H5N1형 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것이다.
상기 불활화하는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스에 포르말린, 자외선, 열, BEI(Binary Ethyleneimine), 베타-프로피오락톤(Beta-Propiolactone) 등의 처리로 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스; 및 (ii) H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (i)의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2를 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 예방용 다가 백신 조성물은 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스와 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 혼합함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스와 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 1 내지 2:1의 조성비로 혼합함으로써, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대해 효과적인 면역 반응을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 다가 백신 조성물은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 감염 예방을 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 다가 백신 조성물은 H5형의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 감염에 대해 우수한 백신 효과를 나타내는 것으로, 특히, H5N1형, H5N6형, 또는 이들의 조합의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 감염 예방을 위해 사용될 수 있다.
상기 H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 clade 2.3.2.1d에 속하며, H5N6형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 clade 2.3.4.4b에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 다가 백신 조성물은 clade 2.3.2.1d, clade 2.3.4.4b, 또는 이들의 조합에 의해 유발되는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 감염 예방을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 '예방'은 백신 조성물의 투여에 의해 대상 바이러스의 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 상기 대상 바이러스로 인해 야기되는 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다.
본 발명의 다가 백신 조성물의 대상(subject)은 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 다가 백신 조성물은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 동물, 예컨대, 가금류에서의 감염 예방을 위한 백신일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 백신 조성물의 대상은 닭, 오리, 메추라기, 칠면조, 거위 등을 포함하는 가금류일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
상술한 바와 같이, 조류 인플루엔자 A 바이러스의 감염 예방을 위한 백신의 대상(subject)이 제한되는 것은 아니나, 축종별, 예컨대, 닭, 오리, 실용계(예를 들면, 산란계, 종계 또는 육계), 종오리 등에 따라 효능이 상이하게 나타날 수 있다.
본 발명의 다가 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 어쥬번트(보조제), 면역 자극제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체는 당업계에 공지되어있으며, 단백질, 설탕 등을 포함한다. 상기 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유. 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 수용액 담체는 식용수 및 완충배지를 포함하는 물, 알코올/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제로서 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 방부제로는 포르말린 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 다가 백신 조성물은 어쥬번트(보조제)를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 백신 조성물 내 항원의 면역원성을 강화시키고 대상체에서 면역 반응을 증진시키는 데 적합한 임의의 약제를 의미한다. 또한, 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 다가 백신 조성물의 제조 방법은 상기 다가 백신 조성물을 구성하는 각각의 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스 혼합시킨 후, 어쥬번트를 혼합하는 단계 (c)를 포함한다.
예를 들어, 상기 어쥬번트(보조제)는 alum, 완전 프로인트 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬번트, LPS, poly IC, poly AU, 리포펙틴(Lipofectin), 피로탁시(lipotaxi), CaPO4, DEAE 덱스트란, 폴리브렌(Polybrene), 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 무기질, 젤, 리소레시틴, 플루로릭 폴리올스(pluronic polyols), 플리음이온(polyanions), 펩티드(peptides), 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 디니트로페놀이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 보조제 이외에, 본 발명의 다가 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N', N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 제2 보조제를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 다가 백신 조성물은 면역 자극제로서, 인공적으로 합성된 레바미솔, 이소프레노신 및 사이토카인을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 사이토카인으로는 인터페론-α, 인터류킨-2, GM-CSF, G-CSF 등이 있다.
본 발명의 다가 백신 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 약제학적 유효량으로 투여될 수 있으며, 보호 면역 반응을 도출하기에 충분히 적합한 투여량을 의미한다.
상기 '약제학적 유효량'은 바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 다가 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상(subject)의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있다. 한편, 본 발명의 백신 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 다가 백신 조성물의 투여 횟수는 수행 요건에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 이는 단일 투여 또는 반복 투여(또는 다중 투여)로서 투여될 수 있다. 일반적으로, 백신의 1회 접종은 피하 또는 근육내 경로를 통해서 1일령에 또는 알에서 17일령-19일령 배아에게 수행될 수 있다. 다중 투여의 경우, 2차 투여는 1차 투여 이후 5 내지 30일 이내에 수행될 수 있다.
본 발명의 다가 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종 용도일 수 있다.
본 발명의 다가 백신 조성물은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 다가 백신 조성물은 비경구 투여될 수도 있으며, 상기 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여방식을 의미한다. 본 발명의 백신의 비경구 투여는 바람직한 순도 하에 약제학적으로 허용가능한 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하여야 한다.
본 발명의 다가 백신 조성물의 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용할 수 있다. 상기 제형은 주사용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 다가 백신 조성물 내 H5N1형 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것이다.
상기 불활화하는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스에 포르말린, 자외선, 열, BEI(Binary Ethyleneimine), 베타-프로피오락톤(Beta-Propiolactone) 등의 처리로 달성될 수 있다.
본 발명의 다가 백신 조성물은 상기 불활화 된 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스에 추가로 오일 어쥬번트를 첨가해 혼합하여 불활화 오일 백신 또는 사독백신으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 H5N1 형 및 H5N6형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 사독백신이다.
본 발명의 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 다가 백신 조성물은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 다가 백신 조성물을 포함하므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 예방하기 위한 재조합 다가 백신 조성물을 제공함으로써, 각각의 단일 백신의 생산과 비교하여, 백신 생산 비용의 절감이라는 경제적 이점을 가질 뿐 아니라, 상기 다가 백신 조성물의 높은 백신 효능으로 인해 고병원성 조류 인플루엔자 발생에 대비한 효과적 방어 수단으로 질병 방제에 기여할 수 있다.
도 1은 바이러스 간의 항원 거리 결정을 위한 제작된 항원 지도를 나타낸다.
도 2는 바이러스 백신주에서의 항원 단백질 농도를 나타낸다.
도 3은 SPF 닭에서 공격 접종에 따른 생존률을 나타낸다.
도 4는 SPF 닭에서 공격 접종에 따른 바이러스 배출 수준의 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 바이러스 백신주에서의 항원 단백질 농도를 나타낸다.
도 3은 SPF 닭에서 공격 접종에 따른 생존률을 나타낸다.
도 4는 SPF 닭에서 공격 접종에 따른 바이러스 배출 수준의 분석 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
모든 실험은 한국 농림축산검역본부(Animal and Plant Quarantine Agency, APQA) 동물윤리위원회에서 승인한 가이드라인(승인번호: 2022-653)에 따라 생물안정등급(BSL) 3등급 시설에서 수행되었다.
제조예 1. 다가 백신 제조를 위한 바이러스주 선정 및 세포 배양
제조예 1.1. 후보 바이러스주 선정
먼저, 본 실시예에서 다음 4 종의 조류 인플루엔자 바이러스주를 다가 백신 제조를 위해 사용하였다:
(a) A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013 (H5N1)(이하, KA435/2.3.2.1d);
(b) A/duck/Korea/H35/2017 (H5N6) (이하, H35/2.3.4.4b);
(c) A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) (이하, PR8) 및;
(d) A/Chicken/Korea/01310/2001 (H9N2).
또한, 백본 바이러스(backbone virus)로서, 상기 PR8 유래 PB1, PB2, PA, NP, M, 및 NS와 A/Chicken/Korea/01310/2001 유래 PB2가 사용되었다.
제조예 1.2. 세포 배양
인간 배아 신장 세포주인 HEK 293T, 인간 폐 상피 세포주인 A549, 및 닭 배아 섬유아세포(DF-1)를 10% FBS(Biowest, USA)와 1% 항생제-항진균제 혼합물(Gibco, USA)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다.
실시예 1. 다가 백신 제조를 위한 최적 항원 혼합물의 조성 확인
고병원성 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신을 제조하고자, 본 발명자들의 제조한 H5N1형 및 H5N6형 재조합 바이러스를 사용하여 항원 혼합물의 조성에 따른 백신 효능을 평가하였다.
실시예 1.1. 재조합 백신주 준비
먼저, 각각 H5N1형(KA435/2.3.2.1d) 및 H5N6형(H35/2.3.4.4b)의 후보 바이러스주로부터 다염기성(polybasic) 아미노산 영역이 결여된 HA 유전자와 NA 유전자, 및 PR8 백본 유전자(PB1, PB2, PA, NP, M, NS)를 RT-PCR로 증폭시키고 v2pHW2000 플라스미드 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음, Lipofectamine LTX & plusTM(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 상기 플라스미드를 HEK-293T 세포에 형질감염시켰다. 이후, 세포 상등액을 10일된 SPF 부화란에 접종하고 37℃에서 72시간 동안 배양하였고, 요막강액(Allantoic fluid)은 10 번째까지 계대배양하였다.
또한, 재조합 바이러스 백신주에서 PB2에 의한 증식 조절을 비교하고자, rgKA435/2.3.2.1dA/Chicken/Korea/01310/2001(H9N2) 유래 PB2 지놈 세그먼트를 포함하는 재조합 바이러스주 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d는 리버스 엔지니어링 기술을 사용하여 제조하였고, 기존의(native) H5N1형 유전자 재조합 바이러스주와 상기 PB2 유전자를 치환하여 제조된 재조합 바이러스주(rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d)의 비교하여 각각의 생산 수율을 비교 분석 하였다.
실시예 1.2. 최적의 항원 혼합물의 조성 확인
상기 실시예 1.1에서 준비한 재조합 백신주(rgKA435/2.3.2.1d, rgKA435 및 rgH35/2.3.4.4b)를 사용하여, 우수한 백신 효과를 나타낼 수 있는 최적의 항원 혼합물의 조성을 비교 분석하였다.
먼저, 5주령의 SPF 닭 20마리를 4개의 그룹(n=5, 그룹당)으로 나누고 BSL-2 시설에서 각 재조합 백신을 단일 또는 혼합하여 접종하였다.
구체적으로, 그룹 1 및 2의 SPF 닭에 각각 rgKA435/2.3.2.1d(512 HAU) 및 rgH35/2.3.4.4b(512 HAU)의 1가 백신을 0.5 ml씩 접종하였고, 그룹 3에는 상기 1가 백신의 1:1 혼합물(rgKA435/2.3.2.1d(512 HAU) 및 rgH35/2.3.4.4b(512 HAU))을, 그룹 4에는 상기 1가 백신의 2:1 혼합물(rgKA435/2.3.2.1d(1024 HAU) 및 rgH35/2.3.4.4b(512 HAU)을 접종하였다. 상기 2가 백신의 항원 조성비는 H5N1형 조류 인플루엔자 바이러스인 KA435/2.3.2.1d의 병원성이 H5N6형 조류 인플루엔자 바이러스인 H35/2.3.4.4b보다 높다는 이전 연구결과를 기반으로, 1:1 및 2:1로 설정되었다. SPF 닭에 백신을 접종하기 전, 상기 모든 백신(1가 백신 및 2가 백신)은 Montanide ISA VG70 오일 보조제(Seppic, La Garenne-Colombes, France)와 0.5 ml의 백신 투여량 당 30:70(w/w)으로 혼합되었다.
백신 접종 3주 후, 상기 2가 백신(rgKA435/2.3.2.1d 및 rgH35/2.3.4.4b)에서 최적의 항원 조성을 확인하고자, 혈구응집억제반응(hemagglutination inhibition(HI)) 분석을 수행하여 HI 역가를 측정하였다. 각 계대에서 요막강액의 혈구응집 단위(haemagglutination units, HAU) 수를 측정하기 위하여 상동 항원 및 항혈청을 5 log2의 HI 역가로 조정한 후 혈구응집억제반응(HI) 분석을 수행하였고, 50% 계란 감염 용량(50% egg infectious dose, EID50)은 1 번째, 5 번째 및 10 번째 계대에서 결정되었다.
그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
| Group | 다가 백신주 | HAU | HI 역가 / 3 wpv (log2) | |
| 2.3.2.1d | 2.3.4.4b | |||
| 1 | rgKA435/2.3.2.1d | 512 | 7.5 ± 0.7 | 3.2 ± 1.9 |
| 2 | rgH35/2.3.4.4b | 512 | 4.6 ± 0.9 | 7.6 ± 0.5 |
| 3 | rgKA435/2.3.2.1d + rgH35/2.3.4.4b | 512+512 | 7.4 ± 0.5 | 8.2 ± 1.6 |
| 4 | rgKA435/2.3.2.1d + rgH35/2.3.4.4b | 1024+512 | 7.4 ± 0.5 | 8.6 ± 0.5 |
| *HAU, hemagglutination unit; HI, hemagglutination inhibition; wpv, weeks post-vaccination | ||||
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 1가 백신 접종 그룹의 경우, 동종 바이러스에 대한 평균 HI 역가는 7.5 ± 0.7 내지 7.6 ± 0.5(log2)인 반면, 이종 바이러스에 대한 평균 HI 역가는 3.2 ± 1.9 내지 4.6 ± 0.9(log2)였다. 반면, 항원 조성에는 차이가 있었지만 두 2가 혼합물 모두 KA435/2.3.2.1d에 대해 7.4 ± 0.5(log2)의 HI 역가를 나타내었다. 그러나 1:1 혼합물은 H35/2.3.4.4b에 대해 HI 역가가 8.2 ± 1.6(log2)인 반면, 2:1 혼합물은 8.6 ± 0.5(log2) 역가를 나타내는 것을 확인하였다.
그러나, 본 실시예에서 사용된 rgKA435/2.3.2.1d의 경우, 기존 단독 백신실험에서 WOAH 최소 항원 요구량 50 PD50 (50% Protective dose)이 충족되지 않는 것으로 나타난 바 있어, 이의 항원 함량을 2배(1024 HAU)로 높여 2:1 비율로 혼합하였을 경우와 1:1(512 HAU:512 HAU) 비율로 혼합하였을 경우, 2.3.2.1d에 대한 rgKA435/2.3.2.1d의 항원 함량에 따른 면역원성에 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1.3. 항원 분석
항원 단위(antigen units, AU)[1 AU는 HI 교차 반응성의 2배 손실에 해당함]로 측정된 바이러스 간의 항원 거리를 결정하고자, https://amaccs-web.antigenic-cartography.org에서 제공되는 2D 지도 제작법의 오픈 액세스 소프트웨어를 사용하여 항원 지도 제작을 수행하였다.
그 결과는 하기 도 1에 나타내었다.
하기 도 1에서 나타낸 바와 같이, 2가(2.3.2.1d 및 2.3.4.4b) 백신에서 H35/17과 KA435/13 사이의 거리는 각각 1.5 AU와 2.5 AU였다.
실시예 1.4. 항원 단백질 농도 측정
항원 단백질의 농도를 측정하기 위하여, 먼저, 백신 항원은 실험실 규모의 접선 흐름 여과 시스템(lab scale tangential flow filtration system)(Merk Millipore, Burlington, USA)을 사용하여 농축하였고, 이후 농축된 백신 항원을 25-70%(w/w) 자당 밀도 구배에 로드한 다음 4℃에서 1시간 동안 27,000 rpm에서 초원심분리하였다. 그 다음, 펠렛을 수확하고 ultra-15 원심 필터 장치(Amicon, Merck Millipore, Burlington, USA)를 사용하여 4℃, 3,500 rpm에서 30분 동안 인산염 완충 식염수(PBS)로 투석 여과하였다. 농축 및 정제된 백신 항원을 250 ㎍/ml에서 0.1 ㎎/ml로 연속 희석하고 Qubit Fluorometer 4(ThermoFisher, Waltham, USA)를 사용하여 바이러스 단백질 농도를 분석하였다. 각 희석에서 HAU의 수는 혈구 응집 분석에서 측정되었고, 투여량 당 HA 단백질의 양은 보조제에 의한 희석 인자(dilution factor)를 사용하여 계산하였다. 비교를 위한 양성 대조군으로 PR8 바이러스로부터 유래된 바이러스 항원을 사용하였다.
그 결과는 하기 도 2에 나타내었다.
하기 도 2에 나타낸 바와 같이, rgKA435/2.3.2.1d 및 rgH35/2.3.4.4b의 512 HAU에 해당하는 바이러스 단백질의 양은 각각 40 ㎍/ml(6.8 ㎍/dose) 및 60-100 ㎍/ml(10.2-17 ㎍/dose)임을 확인하였다. 반면, PR8(양성 대조군으로 사용됨)의 512 HAU에 해당하는 바이러스 단백질의 양은 20-60 ㎍/ml(3.4-10.2 ㎍/dose)였다.
따라서, 512 HAU는 WOAH 기준(즉, 3 ㎍/투여량)에 규정된 백신 효능에 대한 최소 항원 요건을 충족함을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 다가 백신 제조
실시예 2.1. 개선된 증식력을 갖는 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d 백신주의 제조
본 발명의 다가 백신의 제조에 앞서, 상기 실시예 1.2의 최적 항원 혼합물의 조성비를 확인한 결과로부터, 기존 rgKA435/2.3.2.1d 백신주를 이용한 단독 백신 실험에서 WOAH 최소 항원요구량 50 PD50(50% Protective dose)가 충족되지 않음을 나타낸 바, 상기 백신주와 rgH35/2.3.4.4b를 2:1 또는 1:1의 조성비로 혼합하여 사용할지라도, 상기 rgKA435/2.3.2.1d의 항원 함량 증가 비율에 따른 면역원성에 차이를 나타내지 않음을 확인하였으므로, 기존 rgKA435/2.3.2.1d 백신주에 비해 개선된 증식력을 갖는 백신주를 확보하고자 하였다.
따라서, 기존의 PR8 바이러스주를 백본(backbone)으로 사용하여 제작된 H5N1형 유전자 재조합 바이러스인 rgKA435/2.3.2.1d와, 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스(H9N2형) 유래 PB2 유전자로 치환된 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d를 각각 접종하여 SPF 부화란 및 세포 배양에서의 성장 수율을 비교 분석하였다.
구체적으로, 바이러스 역가는 log10EID50/0.1 ml 및 log10TCID50/0.1 ml로 나타내었으며, EID50/0.1 ml은 10-11 주령의 SPF 부화란에서 1번째, 5번째 및 10번째 계대후 수확된 바이러스에서 측정되었다. 또한, 세포 배양에서의 성장 수율은, 96-웰 플레이트에서 1x105 cell/웰로 접종된 DF-1 세포와 1x105 cell/웰로 접종된 A549 세포에서 10번째 계대배양에서 측정 되었다.
각 배양에서의 성장 수율 측정 결과는 하기 표 2 및 표3으로 나타내었다.
| 배양 | *HAU (log2) | **EID50 | ||
| rgKA435/2.3.2.1d | rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d | rgKA435/2.3.2.1d | rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d | |
| CE1 | 8.0 | 8.5 | 7.5 | 9.0 |
| CE2 | 6.5 | 8.5 | - | - |
| CE3 | 7.5 | 9.0 | - | - |
| CE4 | 8.0 | 9.0 | - | - |
| CE5 | 8.0 | 9.0 | 7.8 | 8.5 |
| CE6 | 8.0 | 8.5 | - | - |
| CE7 | 7.5 | 8.0 | - | - |
| CE8 | 8.0 | 8.5 | - | - |
| CE9 | 7.5 | 8.0 | - | - |
| CE10 | 8.0 | 9.5 | 8.4 | 9.2 |
| *HAU, hemagglutination unit; **EID50, egg infective dose at 50% | ||||
| 배양 | *TCID50 (DF-1) | *TCID50 (A549) | ||
| rgKA435/2.3.2.1d | rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d | rgKA435/2.3.2.1d | rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d | |
| CE1 | 3.5 | 4.5 | 2.5 | 4.5 |
| CE2 | - | - | - | - |
| CE3 | - | - | - | - |
| CE4 | - | - | - | - |
| CE5 | 3.5 | 4.5 | 2.8 | 3.5 |
| CE6 | - | - | - | - |
| CE7 | - | - | - | - |
| CE8 | - | - | - | - |
| CE9 | - | - | - | - |
| CE10 | 3.8 | 5.5 | 3.8 | 4.5 |
| *TCID50, tissue culture infective dose at 50%. | ||||
상기 표 2 및 3에서 나타낸 바와 같이, 10 번째 계대배양에서 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d의 HA 역가는 9.5 log2였으나, 대조적으로, rgKA435/2.3.2.1d의 종점(end point) HA 역가는 8.0 log2에서 증가하지 않았다. rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d의 EID는 1 번째 계대에서 9.0 log10EID50/0.1 ml, 10 번째 계대에서 9.2 log10EID50/0.1 ml였다. 초기 계대에서 rgKA435/2.3.2의 EID 역가는 7.5 log10EID50/0.1 ml였으나, 10 번째 계대에 의해 8.4 log10EID50/0.1 ml로 증가하였다. rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d의 높은 역가는 10 번째 계대에서 DF-1 세포와 A549 세포 모두에서 확인되었다(각각 5.5 log10TCID50/0.1 ml 및 4.5 log10TCID50/0.1 ml).
따라서, 본 발명의 다가 백신 조성물의 제조함에 있어서, 개선된 증식력을 가짐으로써, 기존 rgKA435/2.3.2.1d에 비해 높은 성장 수율을 나타내는 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2 유전자를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 A 바이러스인 'rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d'를 사용하여 수행되었으며, 이후 모든 실시예 및 실험예에서 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d를 사용하였다.
실시예 2.2. 다가 백신 준비
상기 실시예 2.1에서 개선된 증식력이 확인된 rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d 및 rgH35/2.3.4.4b 백신주를 함유하는 무균 부화란(free embryonated chicken eggs)에서 10 계대 후, 요막강액을 수확하고 2,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 정제하였다. 그런 다음, 각 재조합 백신주를 20℃에서 18시간 동안 0.1% 포르말린(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 노출시켜 불활화하였다.
바이러스 성장은 혈구응집 활성(HA) 검정을 통해 측정하였고, HA 역가는 512 HAU로 조정되었다. 본 발명의 다가 백신주를 제조하고자, 512 HAU로 조정된 각 후보 백신주(rgKA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d 및 rgH35/2.3.4.4.b)를 유화시킨 후, 투여량 당 50:50(w/w)으로 혼합하였다. 상기 혼합 시, Montanide ISA VG70 오일 보조제를 함께 사용하였으며, 백신에 대한 상기 보조제는 30:70(w/w)으로 혼합되었다. 제조된 다가 백신은 PBS로 연속 희석하여 1 dose, 1/10 dose, 및 1/100 dose로 추후 실험에 사용하였다.
실험예
상기 실시예 2에서 준비한 다가 백신에 의한 가금류에서의 고병원성 인플루엔자 A 바이러스(HPAIV)에 대한 면역성을 실제로 확인하고자, SPF 닭을 사용하여 공격접종 실험을 수행하였다.
실험예 1. SPF 닭에서의 시험
먼저, 80마리의 SPF 닭(5주령)을 사용하여, 8개의 그룹(6개의 면역 그룹/2개의 가짜(sham) 그룹)으로 나누고, BSL-2 시설에서 500 ㎍씩 백신 접종을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 백신 접종에 대한 실험군에서 면역화 그룹은, 접종에 사용된 백신 투여량(dose)에 따라, i) 1 dose(그룹 1 및 5), ii) 1/10 dose(그룹 2 및 6), 또는 iii) 1/100 dose(그룹 3 및 7)으로 분류되었다. 가짜 그룹의 경우, PBS/Montanide ISA V70(30:70, w/w)을 접종하였다. 3주 후, 모든 그룹의 SPF 닭은 공격접종을 위해 BSL-3 시설로 옮겨주었고, 여과 시스템이 있는 격리된 캐비닛에서 음식과 물을 자유롭게 섭취가능한 상태로 사육되었다. 이후, 공격접종은 백신 접종된 SPF 닭에서 각각 106 EID50/0.1 ml의 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/13(H5N1, clade 2.3.2.1d) 및 A/duck/Korea/H35/17(H5N6, clade 2.3.4.4b)을 공격 접종주로 사용하여 0.1 ml로 비강 접종하였다.
| Group | 다가 백신 | dose | HA | 공격접종주 | 마리수 | 비고 |
| 1 | 2.3.2.1d(01310 PB2)* 1/2 dose + 2.3.4.4b 1/2 dose |
1 | 29 | clade2.3.2.1d | 10 | 효능평가 |
| 2 | 1/10 | 26 | 10 | |||
| 3 | 1/100 | 23 | 10 | |||
| 4 | Sham | - | - | 10 | ||
| 5 | 2.3.2.1d(01310 PB2)* 1/2 dose + 2.3.4.4b 1/2 dose |
1 | 29 | clade2.3.4.4b | 10 | |
| 6 | 1/10 | 26 | 10 | |||
| 7 | 1/100 | 23 | 10 | |||
| 8 | Sham | - | - | 10 | ||
| *2.3.2.1d의 경우 이전 종란 접종 후 역가는 27 28 HA 수준으로, 농축을 통해 29 HA로 만든 후 접종하였으나, 이번 경우는 01310 PB2(H9N2 PB2)로 교체하여 원역가 29 HA를 그대로 사용함. | ||||||
실험예 1.1. 공격 접종에 따른 임상 증상 관찰 및 치사율 확인
공격 접종 수행 후, SPF 닭에서 생존 및 임상증상 여부를 매일 모니터링하였다. 또한, 반수(50%) 방어용량 (50% protective dose, PD50)은 폐사율을 종점(end point)으로 사용하여 계산하였다.
그 결과는 하기 표 5, 6 및 도 3으로 나타내었다.
| 2.3.2.1d(C) | ||||||||
| 1 dose | Cx | 1/10 dose | Cx | 1/100 dose | Cx | Control | Cx | |
| 0 dpi | 10 | 10 | 10 | 10 | ||||
| 1 dpi | 10 | 10 | 10 | 7 | 3수폐사 | |||
| 2 dpi | 10 | 10 | 10 | 0 | 7수폐사 | |||
| 3 dpi | 10 | 10 | 4수설사 | 5 | 5수폐사 | 0 | ||
| 4 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 5 dpi | 10 | 10 | 3수설사 | 5 | 4수설사 | 0 | ||
| 6 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 7 dpi | 10 | 10 | 3수설사 | 5 | 3수설사 | 0 | ||
| 8 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 9 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 10 dpi | 10 | 10 | 1수설사 | 5 | 1수설사 | 0 | ||
| 11 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 12 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 13 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| 14 dpi | 10 | 10 | 5 | 0 | ||||
| Survival rate | 100 | 100 | 50 | 0 | ||||
| PD50 | 100 | |||||||
| 2.3.4.4b(B) | ||||||||
| 1 dose | Cx | 1/10 dose | Cx | 1/100 dose | Cx | Control | Cx | |
| 0 dpi | 10 | 10 | 10 | 10 | ||||
| 1 dpi | 10 | 10 | 10 | 9 | 1수폐사 | |||
| 2 dpi | 10 | 10 | 7 | 0 | 9수폐사 | |||
| 3 dpi | 10 | 10 | 6 | 3수폐사 | 0 | |||
| 4 dpi | 10 | 10 | 6 | 1수폐사 | 0 | |||
| 5 dpi | 10 | 10 | 6 | 1수침울 | 0 | |||
| 6 dpi | 10 | 10 | 6 | 2수녹변 | 0 | |||
| 7 dpi | 10 | 10 | 6 | 0 | ||||
| 8 dpi | 10 | 10 | 6 | 1수침울 | 0 | |||
| 9 dpi | 10 | 10 | 6 | 1수침울 | 0 | |||
| 10 dpi | 10 | 9 | 1수사고사 | 6 | 0 | |||
| 11 dpi | 10 | 9 | 6 | 0 | ||||
| 12 dpi | 10 | 9 | 6 | 0 | ||||
| 13 dpi | 10 | 9 | 6 | 0 | ||||
| 14 dpi | 10 | 9 | 6 | 0 | ||||
| Survival rate | 100 | 90 | 60 | 0 | ||||
| PD50 | 147 | |||||||
상기 표 5 및 6과, 하기 도 3에서 나타낸 바와 같이, 1 dose 또는 1/10 dose로 접종한 모든 실험군은 생존한 것을 확인하였다. 그러나, 1/100 dose 접종 그룹에서는, KA435/2.3.2.1d 또는 H35/2.3.4.4b로 공격 접종 3-4일(dpc)후, 실험군 내 각각 5마리와 4마리가 폐사된 것을 확인하였다. 반면, 가짜 그룹에서는 모든 실험군이 3 dpc에서 폐사된 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 2가 백신을 1 dose 또는 1/10 dose로 접종시킨 SPF 닭 중 어느 것도 H35/2.3.4.4b의 공격 접종 기간 동안 폐사율(morbidity)을 나타내지 않았다. 그러나, 2가 백신 1/10 dose 및 1/100 dose 접종 그룹에서 일부 살아남은 SPF 닭은 KA435/2.3.2.1d에 대해, 3-10일(dpc)에서 가벼운 임상증상이 관찰되었다.
그리고 KA435/2.3.2.1d 및 H35/2.3.4.4b에 대한 반수방어용량(PD50)은 각각 100 및 147로 높은 수준을 나타내었다. 상기 반수방어용량 값의 경우, 치료 효과를 유발하는 치료제의 양과 독성을 유발하는 양을 비교한 '보호 지수'를 나타내는 것으로, 정량적으로 독성 용량을 치료 용량으로 나눈 비율을 의미한다. 즉, 본 실험예에서 대상이 되는 모집단의 50%에 대한 약물의 독성 용량(TD50)을 모집단의 50%에 대한 최소 유효 용량(ED50)으로 나눈 값으로, 높은 보호 지수를 나타내는 것을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 높은 보호 지수를 갖는 다가 백신은 상이한 clade에 속하는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대해 독성 역치에 도달하는 것 없이, 낮은 용량으로도 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다.
실험예 1.2. 혈청학적 분석
본 발명의 다가 백신의 면역원성을 평가하고자, 혈구응집억제(HI, Hemagglutination Inhibition) 반응을 이용하여 백신 접종 후(wpc)와 공격 접종 14 dpc에 수득된 혈청으로부터 항체 역가를 분석하였다.
먼저, 상기 백신 접종 후(1-3 wpv), 및 공격 접종 후 14일차(dpi)에 각각 혈액을 수집하여 바이러스 항혈청의 2배 연속 희석액(25 ㎕)을 PBS에 첨가하고 동일한 부피의 각 백신 바이러스주 항원(3 HA(log2))과 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 25 ㎕의 1% SPF 닭 적혈구를 실온에서 30분 동안 각 웰에 첨가하였다.
그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
| Group | Vaccine strain | challenge virus |
dose | No. of positive/No. of chickens (Homologous HI titer, log2) |
|||
| 1wpv | 2wpv | 3wpv | 14dpi | ||||
| 1 | rg/KA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d + rgH35/2.3.4.4b |
KA435/ 2.3.2.1d |
1 | 3/10 (0.8±1.2) |
10/10 (6.8±0.6) |
10/10 (8.3±0.8) |
10/10 (9.3±0.5) |
| 2 | 1/10 | 3/10 (0.7±1.2) |
10/10 (5.1±0.9) |
10/10 (6.5±1.0) |
10/10 (8.9±0.7) |
||
| 3 | 1/100 | 0/10(-) | 10/10 (3.2±0.7) |
10/10 (4.6±0.8) |
5/5 (8.0±0.6) |
||
| 4 | - | 0/10 (-) |
0/10 (-) |
0/10 (-) |
0/0 (-) |
||
| 5 | rg/KA435-H9N2 PB2/2.3.2.1d + rgH35/2.3.4.4b |
H35/ 2.3.4.4b |
1 | 0/10 (-) |
10/10 (7.8±0.6) |
10/10 (8.4±0.5) |
10/10 (9.2±0.4) |
| 6 | 1/10 | 0/10 (-) |
10/10 (6.5±0.5) |
10/10 (6.9±0.7) |
10/10 (8.3±0.5) |
||
| 7 | 1/100 | 0/10(-) | 10/10 (1.7±0.9) |
10/10 (2.1±0.9) |
6/6 (7.7±0.5) |
||
| 8 | - | 0/10 (-) |
0/10 (-) |
0/10 (-) |
0/0 (-) |
||
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 3 wpv에서 KA435/2.3.2.1d에 의한 공격 접종은 1 dose 및 1/10 dose 접종 그룹에서 각각 8.3 ± 0.8(log2) 및 6.5 ± 1.0(log2)의 평균 HI 역가를 나타내었다. H35/2.3.4.4b로 공격 접종 후, 1 dose 및 1/10 dose 접종 그룹에서는 각각 8.4 ± 0.5(log2) 및 6.9 ± 0.7(log2)의 역가가 측정되었다. 반면, KA435/2.3.2.1d로 공격 접종된 1/100 dose 접종 그룹에서 3 wpv에서의 평균 HI 역가는 4.6 ± 0.8(log2)이었으나, H35/2.3.4.4b로 공격 접종된 그룹에서 3 wpv에서 상대적으로 낮은 평균 HI 역가(2.1 ± 0.9 log2)가 검출되었다. 14 dpc에는 KA435/2.3.2.1d 또는 H35/2.3.4.4b로 공격 접종된 모든 백신 접종 그룹에서 각각 8.0-9.3(log2) 및 7.7-9.2(log2)의 HI 역가를 나타내었다.
실험예 1.3. 바이러스 배출 수준 분석
상기 공격 접종 후, SPF 닭으로부터 바이러스 배출 수준을 평가하고자, TCID50 분석을 수행하여 바이러스의 양을 측정하였다.
먼저, 공격 접종 후 1, 3, 5, 7, 10 및 14일차(dpc)인 SPF 닭으로부터 인후두(Oropharyngeal, OP) 및 총배설강(cloacal, CL) 스왑(swab) 샘플을 채취하였다. 상기 스왑(swab) 샘플은 10% FBS(Biowest, USA) 및 1% 항생제-항진균제 혼합물(Gibco, USA)로 보충된 고포도당 DMEM을 함유하는 5 ml 튜브에 수집하였고, 1,500 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤, 연속적으로 10배 희석한 후 96-웰 플레이트에서 성장한 DF-1 세포(100 ㎕/웰, 밀도 5x105)에 접종하였다. 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세포 변성 효과(cytopathic effect, CPE)에 대해 관찰하였고, 바이러스 역가를 Reed 및 Muench 방법을 사용하여 log10 TCID50/0.1 ml로 계산하였다.
결과는 하기 도 4에 나타내었다.
하기 도 4에 나타낸 바와 같이, KA435/2.3.2.1d로 공격 접종된 1 dose 그룹에서는 바이러스 배출이 검출되지 않았으나, 3 dpc(p < 0.01)에서 1/10 dose 그룹(1.3 log10TCID50/0.1 ml)의 OP 및 CL 스왑 샘플과 3-7 dpc에서 1/100 dose 그룹(1.0-2.3 log10TCID50/0.1 ml)의 스왑 샘플에서 바이러스 배출이 검출되었다. H35/2.3.4.4b로 공격 접종한 경우, 1 dose 및 1/10 dose 그룹에서는 바이러스 배출이 검출되지 않은 반면, 1/100 dose 그룹에서는 3-5 dpc(1.5-2.7 log10TCID50/0.1 ml)에 바이러스 배출의 검출이 확인되었다. 그러나 1/100 dose 그룹의 OP 스왑 샘플에서의 바이러스 배출은 3 dpc에서 크게 떨어졌다(p < 0.01). 1-3 dpc의 모든 가짜 그룹에서 얻은 OP 및 CL 스왑 샘플에는 셰드(shed) 바이러스(0.5-2.6 log10TCID50/0.1 ml)가 포함되어 있었다.
통계적 분석
모든 데이터는 평균±평균의 표준오차로 표시되며, 통계 분석은 Prism 버전 5(GraphPad Software Inc., San Diego, USA)를 사용하여 수행하였다. 또한, Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 곡선을 나타냈으며, Fisher의 정확성 테스트는 실험 그룹 간의 데이터를 비교하는 데 사용되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (12)
- 다음의 단계를 포함하는, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물의 제조 방법:
(a) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2) 유전자를 포함하는 H5N1형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제작하는 단계;
(b) 상기 H5N1형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스 및 H5N6형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 혼합하는 단계; 및
(c) 상기 H5N1형 및 H5N6형 재조합 조류인플루엔자 A 바이러스 및 어쥬번트(adjuvant)를 혼합하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.2.1d에 속하는 H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 재조합된 바이러스인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 Clade 2.3.2.1d에 속하는 H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/chicken/Vietnam/NCVD-KA435/2013(H5N1)인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 H5N6형은 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5N6형 조류 인플루엔자 A 바이러스로부터 재조합된 바이러스인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5N6형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/duck/Korea/H35/2017(H5N6)인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 H9N2형 조류 인플루엔자 A 바이러스인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 H9N2형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/Chicken/Korea/01310/2001(H9N2)인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 H5N1형 및 H5N6형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화된 것인, 다가 백신 조성물의 제조 방법.
- (i) H5N1형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스; 및 (ii) H5N6형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는, 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용 다가 백신 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 H5N1형 재조합 조류 인플루엔자 바이러스는 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다가 백신 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 다가 백신 조성물은 Clade 2.3.2.1d, Clade 2.3.4.4b, 또는 이들의 조합에 의해 유발되는 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 예방용인, 다가 백신 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 다가 백신 조성물 내 H5N1형 및 H5N6형 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것인, 다가 백신 조성물.
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|---|---|
| KR (1) | KR20240087508A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190073460A (ko) | 2016-10-21 | 2019-06-26 | 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 | 조류 인플루엔자 바이러스의 항원을 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도 |
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2023
- 2023-05-11 KR KR1020230061365A patent/KR20240087508A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190073460A (ko) | 2016-10-21 | 2019-06-26 | 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 | 조류 인플루엔자 바이러스의 항원을 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도 |
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