KR20240074555A - 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따른 배지조성물을 이용하면, 분화된 세포의 분화 능력 및 효능의 향상과 안정성에 기여할 수 있을 뿐 아니라 세포의 성장 및 생존력을 증대시킬 수 있다. 이를 통해 배양된 세포는 더욱 안정화되어 계대할수록 유효성분을 높게 발현할 수 있다. 또한, 본 발명의 안정적인 배양 유지 방법은 배양기간을 늘려 활용 가능한 세포를 연장할 수 있으며 추가적인 코팅이 필요하지 않아 오염없이 저비용으로 효율적인 대량 생산이 가능하다. 상기에서 분화 유지된 분화된 모유두 유사세포 및 배양액은 탈모 방지 또는 모발 재생의 향상된 촉진 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있으며, 더 나아가 모낭 형성을 목적으로 한 세포치료제 등 다양한 산업에 활용할 수 있다.

Description

분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물 {COMPOSITION FOR MAINTAING DIFFERENTIATION POTENCY OF DIFFERENTIATED DERMAL PAPILA CELLS}
본 발명은 인간 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포를 모유두 유사세포로 분화시킨 후, 분화 상태를 유지시키는 방법과 그 배지 조성물에 관한 것이다.
줄기세포 (Stem cell)는 특정 환경 하에서 생물 조직을 구성하는 다양한 종류의 세포들로 분화 (differentiation)할 수 있는 미분화 세포를 말한다. 이런 줄기세포의 고유의 특성으로 인해 세포치료제, 신약개발, 코슈메슈티컬 등의 분야에서 주목받고 있으며 최근, 줄기세포를 활용한 신기술과 세포 치료제, 화장품 소재들이 다수 출시되고 있는 상황이다.
특히, 여러 세포로 분화될 수 있는 유연성 (plasticity)은 줄기세포 가장 큰 장점으로 작용하지만, 분화 과정은 다양한 요인에 의해 시일이 오래 소요되거나, 분화된 세포가 충분한 효과를 갖지 못하는 경우가 많다. 또한, 이런 분화능으로 인해 줄기세포의 안정성 문제가 대두되어 암 형성의 위험성이 높은 상황이다. 따라서, 줄기세포로부터 특정 계열의 세포로 분화 유도된 세포들을 활용하기 위해서는 선결해야 하는 과제들이 있다.
줄기세포의 상업화 발전 가능성을 현실화하기 위해서는 세포 배양을 통해 많은 양의 세포를 획득하는 것이 중요하다. 하지만, 배양 과정에서 배양 기간이 길어질수록 필연적으로 줄기세포의 노화가 발생되고 변형된다. 이는 증식능 또는 분화능과 같은 줄기세포능의 감소로 이어지며, 세포 활용에 있어서 효과의 지속성이 낮아진다는 문제점이 발생한다. 또한, 배양 기간이 길어짐에 따라 재료비, 인건비 등의 생산원가가 높아지는 단점이 있기 때문에 이러한 문제점을 해결하는 필요성이 증대되고 있다.
종래기술로서 특허문헌 1 및 2는 지방 유래 줄기세포로부터 모유두 유사 세포를 분화시키는 방법 및 배지 조성물을 개시하고 있으나, 분화능을 유지하기 위한 조성물에 대한 인식이나 개시가 없는 실정이다.
한국 특허공개번호 제10-2020-0067818호 한국등록특허 제10-2020-0011970호
본 발명에서는 줄기세포의 분화 기능을 강화시키고 분화 정확성을 높여 세포 안정성을 확보하고자 하였으며 줄기세포의 분화를 유지한 채, 효과적으로 증식시킬 수 있는 세포 배지조성물 및 그 분화 유지 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 분화 모유두유사세포 및 그의 배양액 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 분화 모유두유사세포 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물은 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 우태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포는 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포는, 젤라틴이 코팅된 플레이트에서, 1차 분화용 배지와 2차 분화용 배지를 이용하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것이 바람직하다.
상기 1차 분화용 배지는, 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지인 것이 바람직하다.
상기 2차 분화용 배지는, 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 분화능 유지 조성물을 이용하여 분화 모유두 유사세포를 배양시키는 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 방법에 따라 배양된 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액을 제공하는 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 모유두 세포의 유효성분인 WNT5a, 모낭주기 조절관련 유전자인 WNT10b 및 모낭형성 관련 조절 인자인 LRP6 중 1종 이상의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 탈모 방지 또는 모발 재생의 촉진 효과를 갖는 것이 바람직하다.
상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물 중 어느 하나에 포함되는 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함되는 것이 바람직하다.
상기 팩은 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나인 것이 보다 바람직하다.
상기 팩은 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 보다 바람직하다.
상기 상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 되는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 분화 모유두 유사세포를 포함하여 모낭을 형성하기 위한 세포치료제를 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 배지조성물을 이용하면, 분화된 세포의 분화 능력 및 효능의 향상과 안정성에 기여할 수 있을 뿐 아니라 세포의 성장 및 생존력을 증대시킬 수 있다. 이를 통해 배양된 세포는 더욱 안정화되어 계대할수록 유효성분을 높게 발현할 수 있다. 또한, 본 발명의 안정적인 배양 유지 방법은 배양기간을 늘려 활용 가능한 세포를 연장할 수 있으며, 분화 시와 달리 분화 유지시에는 젤라틴 코팅 플레이트가 필요 없으므로 간편한 계대 배양이 가능하므로 오염없이 저비용으로 효율적인 대량 생산이 가능하다. 상기에서 분화 유지된 분화된 모유두 유사세포 및 배양액은 탈모 방지 또는 모발 재생의 향상된 촉진 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있으며, 더 나아가 모낭 형성을 목적으로 한 세포치료제 등 다양한 산업에 활용할 수 있다.
도 1은 실시예 1로부터 얻어진 초기 모유두 유사 세포의 분화 마커를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 2에 따라 측정된 계대별 분화 마커 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 3에 따라 측정된 계대별 WNT5a 발현능 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 3에 따라 측정된 계대별 WNT10b 발현능 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 3에 따라 측정된 계대별 LRP6 발현능 확인 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명의 분화 모유두 유사세포는, 내부에 젤라틴이 코팅된 플레이트에 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 로딩하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계 (a); 상기 단계 (a)의 동물세포배양용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 1차 분화용 배지로 옮겨 배양하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 2차 분화용 배지로 옮겨 배양하는 단계 (c);를 포함하여 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화 모유두 유사세포로 분화시킨다.
상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것이며, 상기 단계 (c)의 2차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된다.
본 발명의 분화 유도 방법에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (c)는 바람직하게 3 ~ 7 % CO2 및 35~39℃의 온도로 배양하는 것이 좋으며, 본 발명에서는 5% CO2 및 37℃의 온도로 배양하였다. 이때, 세포 배양을 위한 최적 온도는 주로 세포가 분리된 숙주의 체온에 의존한 조건이고, 5% CO2는 세포 대사와 생장을 모니터링하기 위하여 양분이 한정된 배지에서 양분의 소모시기를 파악하기 위해 첨가한 pH 지시약인 페놀 레드(Phenol red)의 정상적인 작용을 위해 세포 대사 과정에서 발생한 배지 중 CO2가 인큐베이터(Incubator) 내부로 기화되지 않게 하기 위한 조건이다.
본 발명의 분화 유도 방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 세포부착을 안정화시키는 단계로, 바람직하게 1 ~ 2일 동안 배양하는 것이 좋으며 본 발명에서는 1일 배양하였다. 또한, 상기 단계 (b)는 세포분화촉진인자를 처리하는 단계로, 바람직하게 1 ~ 7일 동안 배양하는 것이 좋으며 본 발명에서는 3일간 배양하였다. 또한, 상기 단계 (c)는 모유두세포 특성 유발 인자를 처리하는 단계로, 바람직하게 1 ~ 14일 동안 배양하는 것이 좋으며 본 발명에서는 4일간 배양하였다.
본 발명의 분화 유도 방법에 있어서, 상기 단계 (b) 및 (c)에서 사용하는 배지는 매일 한번씩 교체하였다. 이는 배지의 신선함(fresh)을 유지하기 위한 목적이며, 분화배지에 같이 처리하는 인자의 경우 높은 온도에서 오래 유지될 시, 활성이 떨어지기 때문에 배지를 교체하여 사용하는 것이 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 인간지방 유래 줄기세포는, 바람직하게 인간지방 유래 중간엽 줄기세포인 것이 좋다. 이때, 상기 중간엽 줄기세포는, 바람직하게 골수, 지방조직 또는 탯줄에서 유래된 것일 수 있다.
기존 연구들에서는 다른 기원의 세포를 IPS 세포(IPS cell)로 유도한 뒤, 분화시키는 방법을 사용하였다. 하지만 본 발명은 상기 인간지방 유래 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화된다.
상기에서 얻어진 분화 모유두 유사세포(p1)는 도 1에 개시한 바와 같이, 모낭세포의 분화 마커인 CORIN, WNTSa 및 LEF-1를 발현시키고 있다.
상기에서 얻어진 분화 모유두 유사세포는 본 발명에 따른 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물을 포함하는 배지에서 ~p7까지 계대 배양시킨다.
본 발명에 따른 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물은 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 우태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 따라 배양된 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 모유두 세포의 유효성분인 WNT5a, 모낭주기 조절관련 유전자인 WNT10b 및 모낭형성 관련 조절 인자인 LRP6 중 1종 이상의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 배양액은 배양액을 수거하고 원심 분리하여 수득한 상등액을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 탈모 방지 또는 모발 재생의 촉진 효과를 갖는 것이 바람직하다.
상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물 중 어느 하나에 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 약학 조성물은 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 제제시에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여, 국소투여 등의 방식으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 섭취 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 추가될 수 있는 적합한 성분의 선택은, 당업자에게 자명한 범위에서, 본 발명의 피부 외용제 조성물이 용액, 로션, 림, 연고, 겔, 폼 또는 경피 패치로 제형화 되는지 여부에 어느 정도 의존할 것이다.
예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다. 화장료 조성물에 통상적으로 부가되는 성분이나 함량 등은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 로션은 용액과 유사하지만 용액보다 더 진하고 본질적으로 더 완화시키는 경향이 있다. 로션에는 일반적으로 물과 오일이 혼합되어 있으며 용액보다 알코올이 적은 경우가 많다.
예를 들어, 크림은 거의 같은 비율의 오일과 물의 에멀젼을 가지고 있다. 피부의 각질층 외층까지 잘 침투한다. 크림은 로션보다 두껍고 용기에서 꺼낼 때 모양이 유지된다.
또한, 본 발명의 조성물은 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 팩은 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
상기 팩은 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 분화 모유두 유사세포를 포함하여 모낭을 형성하기 위한 세포치료제를 제공하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 또는 실험예를 통해 예시적으로 보다 상세히 설명하고자 한다.
(실시예 1) 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도
모유두 유사세포로 분화를 유도시키기 위해, 지방 유래 중간엽 줄기세포를 젤라틴이 코팅된 플레이트 6 well plate (10 X 104 cells per well)에 배양하였다. 이때, 0.01 mM 레티노익산, 10% 우태아혈청(FBS) 및 1×페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지를 사용하였고, 5% CO2 및 37℃의 온도에서 6 well plate 기준 2 ml 취하여 매일 한번씩 교체해주었으며 3일간 배양하였다. 그 후, 20 ng/ml 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 200 ng/ml 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 1 μM 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 10% 우태아혈청 및 1Х페니실린/스트렙토마이신 등이 첨가된 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지를 5% CO2 및 37℃의 온도에서 6 well plate 기준 2 ml 취하여 매일 한번씩 교체하여 4일간 배양하였다.
(실험예 1) 모유두 유사세포의 분화 유지를 위한 배지 조성물의 제조 및 배양 방법
본 실시예에서는 분화 유지를 위해 DMEM/HIGH GLUCOSE 기본배지에 5 ng/ml 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 100 ng/ml 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 1 μM 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 분화 유지용 배지 조성물을 제작하였다.
다음으로, 분화 완료된 초기 세포 (p1)를 0.05% 트립신/0.02% EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후, 상기에 제조된 배지에 적용하여 6 well plate (3 X 104 cells per well)에 5% CO2 및 37℃의 온도 조건에서 배양하였다. 세포는 3 ~ 5일간 배양하면서 컨플루언스가 90% 이상에 도달하게 되면 이와 같은 방식으로 계대 배양을 진행하였다. (p1 ~ p7)
(실험예 2) 분화 모유두 유사세포의 계대별 분화능 유지 평가
본 실시예에서는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두 유사 세포가 지속적으로 배양(계대)됨에 따라 그 특성을 잘 유지하는지 확인하기 위해 모유두세포 특이적 유전자인 CORIN, WNT5a, LEF-1를 통해 분화능을 확인하였다.
분화시킨 초기 모유두 유사 세포와 배양된 모유두 유사 세포를 0.05% 트립신/0.02% EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후, 2 x 105 세포/ml의 농도로 맞추었으며, 세포용액을 Fc receptors blocking하였다. 그 뒤, Fixation/Permeabilization solution kit (BDCytofix/Cytoperm™ 社)의 고정 용액(Fixation solution)을 이용하여 세포를 고정시켰으며, 삼투성 용액(Permeabilization solution)을 이용하여 염색시켰다. 염색시킨 세포를 착색 용액(Staining solution)으로 세척하여 새로운 용액으로 세포를 현탁시킨 뒤, 유세포 측정기(FACSLyric™, BD science) 및 팩스스위트(FACSuiteTM sofware; BD science)로 세포를 분석하였다. 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 모유두 세포의 특이 마커인 Corin, WNT5a 및 LEF-1의 발현이 ~p7까지 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
(실험예 3) 분화 모유두 유사세포의 계대별 효능 유지 평가
본 실시예에서는 분화시킨 모유두 유사 세포와 배양(계대)된 모유두 유사 세포가 특성이 유사한지 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 통해 모유두 유사세포의 효능 유전자인 WNT5a, WNT10b 등의 유전자 발현양상을 검증하였다.
계대별 확보된 모유두 유사 세포를 클로로포름 (Chloroform) 및 이소프로판올(Isopropanol)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 상기 RNA를 주형으로 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후, PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Thermo Fisher) 시약과 QuantStudio 3 Real-Time PCR 기기를 활용해 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석을 실시하였으며, 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
그 결과, 배양이 진행됨에 따라 모유두 세포의 유효성분인 WNT5a, 모낭주기 조절관련 유전자인 WNT10b, 모낭형성 관련 조절 인자인 LRP6의 발현이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 계대 배양이 진행될수록 세포가 더욱 안정화되어 WNT5a의 발현은 약 4배, Wnt10b 약 2~ 3배 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
유전자 서열
WNT5a Forward : 5'- TAC GAG AGT GCT CGC ATC CTC A -3'
Reverse : 5'- TGT CTT CAG GCT ACA TGA GCC G -3'
WNT10b Forward : 5'-CTG ACA AGG GGA CAG AAC CC-3'
Reverse : 5'-CAG GAC CTC CAG TGG TTT GG-3'
LRP6 Forward : 5'-AAC GCG AGA AGG GAA GAT GG-3'
Reverse : 5'-ATC GCA AGT CCC GTC TGT TT-3'
β-Actin Forward : 5'- AGC AAG CAG GAG TAC GAT GA -3'
Reverse : 5'- GGT GTA AAA CGC AGC TCA GTA A -3'
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (16)

  1. 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3'-oxime), 우태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지를 포함하는 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포가 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포가, 젤라틴이 코팅된 플레이트에서, 1차 분화용 배지와 2차 분화용 배지를 이용하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 1차 분화용 배지는, 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지인 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 2차 분화용 배지는, 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3′-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지인 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포의 분화능 유지 조성물.
  6. 제 1 항의 분화능 유지 조성물을 이용하여 분화 모유두 유사세포를 배양시키는 방법.
  7. 제 6 항의 방법에 따라 배양된 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 모유두 세포의 유효성분인 WNT5a, 모낭주기 조절관련 유전자인 WNT10b 및 모낭형성 관련 조절 인자인 LRP6 중 1종 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 탈모 방지 또는 모발 재생의 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물 중 어느 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 팩이 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 팩이 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  15. 제 7 항에 있어서, 상기 분화 모유두 유사세포 또는 그 배양액은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 되는 것을 특징으로 하는 분화 모유두 유사세포를 포함하는 배양액.
  16. 제 7 항의 상기 분화 모유두 유사세포를 포함하여 모낭을 형성하기 위한 세포치료제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200067818A (ko) 2017-07-19 2020-06-12 서울대학교산학협력단 인간 유래 만능줄기세포에서 모유두전구세포로의 분화방법 및 이의 용도

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