KR20240073656A - 피부 미세 주름 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부 미세 주름 개선용 조성물 및 피부 미세 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는 미세 주름 개선을 위한 맞춤용 물질을 선택하는 정보제공방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피부 미세 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로어레이, 및 상기 유전자 다형성 마커 또는 마커들의 조합을 이용한 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부에 대한 정보제공방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 피부 미세 주름 개선용 조성물 및 피부 미세 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는 미세 주름 개선을 위한 맞춤용 물질을 선택하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피부 미세 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로어레이, 및 상기 유전자 다형성 마커 또는 마커들의 조합을 이용한 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부에 대한 정보제공방법에 관한 것이다.
피부는 여러 가지 생리 기능을 가진 보호막이면서 동시에 타인으로부터 미용적 호감을 얻는데 중요한 기관이기도 하다. 피부노화는 크게 두 가지 과정으로 일어난다. 특별한 환경적 요인 없이 누구에게나 세월과 함께 일어나는 변화를 내인성 노화 (intrinsic aging)라 하며, 여기에 햇볕과 같은 환경요인에 장기간 노출되어 얼굴, 목, 손등에 나타나는 변화를 광노화(photoaging), 즉 외인성 노화 (extrinsic aging)라고 한다. 두 노화 과정에서 진피층의 콜라겐 감소는 주름 발생과 가장 밀접하게 연관이 있는데, 내인성 노화에서는 피부 섬유아세포의 노화에 의한 새로운 콜라겐 섬유 생성능력의 저하가 큰 원인 중 하나이며, 외인성 노화에서는 자외선, 활성산소 등에 의한 피부 섬유아세포의 데미지로 인한 새로운 콜라겐 섬유 생성능력의 감소 또는, 콜라겐 분해효소 증가에 의한 진피 콜라겐 총량의 감소가 주름 발생의 원인 중 하나이다.
나이가 들어감에 따라 피부노화, 탄력저하, 색소 침착 등의 피부 노화가 자연스럽게 발생한다. 이전까지는 이런 노화 징후가 발생한 후에 이미 발생한 징후를 없애는 케어 방법이 트렌드였으나, 최근 들어서는 유전자에 대한 연구가 활발히 진행됨에 따라 피부에 대한 유전자 체질을 파악하면 보다 적극적인 관리를 통하여 아름다운 피부를 좀 더 오랫동안 유지할 수 있다(Kemp et al., Molecules. 2017 Feb 26;22(3), 2017). 특히 DTC 검사 (Direct To Consumer, 소비자가 유전자검사기관에 직접 의뢰하여 받는 유전자 검사 서비스) 등을 통해 개인이 가지고 있는 DNA 중 연관된 SNP를 분석하여 각 특성을 파악하는 유전자검사 서비스가 다양한 기업체를 통해 제공되고 있다. 피부 유전자 검사는 개인 고유의 DNA 중에서 피부의 색소침착, 탄력, 노화, 비타민 C 농도와 연관된 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)를 분석하여 피부 특성을 파악하여, 피부 노화의 예방과 효율적인 피부 관리를 할 수 있게 도와주는 유전자 검사이다.
현재 매우 다양한 유전자 다형성 마커가 밝혀지고 있으나, 피부색이나 미백, 수분, 자외선 등과 관련이 있는 마커가 대부분이며 기작 연구가 동반된 경우는 흔하지 않은 실정이다. 특히 주름 관련 다형성 마커는 기작이 연구된 경우나 이에 대한 맞춤형 소재가 개발된 경우가 거의 없다고 볼 수 있다.
본 발명자들은 유전정보와 피부타입 정보의 빅데이터 구축을 통한 한국인 피부 특성 분류체계를 구축하고자 하였으며, 개체의 피부 특성을 결정하는 유전적 특징을 파악하여 과학적 피부 분류 기준을 구축하고, 이를 근거로 한 개인 맞춤형 유효성분을 개발하여, 다양한 제품 세분화를 통해 피부 특성별 맞춤형 화장품 개발에 기여하고자 예의 노력한 결과, 피부 미세 주름과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성 (SNP) 마커를 선별하고 유전정보를 바탕으로 미세 주름 개선에 도움을 줄 수 있는 개인 맞춤형 물질을 제공할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 피부 미세 주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물, 또는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 피부 미세 주름 정도 연관 유의성 단일염기다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는 미세 주름 개선을 위한 맞춤용 물질을 선택하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 키트 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 확인하는 단계를 포함하는 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부에 대한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 미세 주름 개선용 조성물을 제공한다. 일 예로 상기 조성물은 플로레틴(phloretin), 오리자놀(oryzanol), 루페올(lupeol), 및 수크랄페이트(sucralfate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 유효성분으로 포함한다. 다른 일 예로, 상기 조성물은 (i) 플로레틴 및 오리자놀; (ⅱ) 루페올 및 수크랄페이트; 또는 (ⅲ) 플로레틴, 오리자놀, 루페올 및 수크랄페이트을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 '플로레틴(phloretin)'은 C6-C3-C6 골격을 가진 디하이드로칼콘(dihydrochalcone) 식물 유래 페놀로서, 사과(주로 껍질) 및 사과 잎에 풍부하고, 유리형 또는 글루코시드형(glucosidic form)의 플로리진(phloridzin, (phloretin 2'-O-glucose))으로 존재한다. 플로레틴은 항산화, 항암 활성을 포함한 많은 생물학적 기능을 가지며, 심장질환의 예방과 연관되어 있다. 플로레틴의 분자식은 C15H14O5이고, 분자량은 274.272로, 아래 화학식 1로 나타낼 수 있다. 상기 플로레틴은 그 획득 방법에 제한되지 않고, 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다.
[화학식 1]
상기 용어 '오리자놀(oryzanol)'은 쌀겨, 옥수수, 보리 등으로부터 추출된 물질로서, 페룰릭산(ferulic acid)을 모핵으로 하고 캄페스테롤(campesterol), β-시토스테롤(sitosterol) 등의 스테롤류와 트리테르펜 알콜(triterpene alcohol)류가 에스터(ester)결합을 하고 있는 화합물이다. 이러한 오리자놀은 갱년기 장애와 자율 신경 기능 이상을 치료하는 약의 주요성분으로 알려져 있다. 상기 오리자놀은 그 획득 방법에 제한되지 않고, 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 오리자놀은 감마-오리자놀(HMARU PHAROUS CO.)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 '루페올(lupeol)'은 식물 유래, 구체적으로 콩과 식물 유래의 지용성 성분으로 직접적으로 피지를 녹여줄 수 있고, 모공 안으로 들어가 여드름 균을 살균할 수 있으며, 여드름 발생 원인이 되는 피지 생성, 염증, 각질화 등 여드름의 여러 원인을 억제시켜 주는 기능을 한다. 루페올의 분자식은 C30H50O이고, 분자량은 426.729로 아래 화학식 2로 나타낼 수 있다. 상기 루페올은 그 획득 방법에 제한되지 않고, 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다.
[화학식 2]
상기 용어 '수크랄페이트(sucralfate)'는 위궤양, 위식도 역류 질환, 위 염증 등을 치료하고 스트레스성 궤양을 예방하는데 사용하는 약물이다. 수크랄페이트의 염 부분이 위벽에 있는 피브로인(fibroin)과 결합하여 하나의 막을 형성하고, 상기 막이 위벽을 코팅하여 위산, 담즙 등으로부터 위를 보호함으로써 위의 통증을 완화시킴으로써 수크랄페이트가 제산제로 기능할 수 있다. 상기 수크랄페이트는 그 획득 방법에 제한되지 않고, 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나, 시판되는 물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 물질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.0001 내지 10 중량 %로 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 피부 미세 주름 개선 소재는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.0001 내지 10 중량 %, 약 0.0005 내지 5 중량 %, 약 0.001 내지 5 중량 %, 약 0.01 내지 5 중량 %, 약 0.0001 내지 3 중량 %, 약 0.0005 내지 3 중량 %, 약 0.001 내지 3 중량 %, 약 0.01 내지 3 중량 %, 약 0.0001 내지 1 중량 %, 약 0.0005 내지 1 중량 %, 약 0.001 내지 1 중량 %, 또는 약 0.01 내지 1 중량 %일 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 물질은 피부 미세 주름 개선을 촉진할 수 있는 효과를 부여한다.
본 발명의 목적상 상기 용어 '피부 주름'은 개인 피부 중 일부 부위의 탄력이 떨어져 피부가 접히는 모양이 관찰되는 것을 의미한다. 피부의 접힘으로 인해 주름 부위는 주변부 피부에 비해 음영이 지므로, 주변부 피부에 비해 상대적으로 어둡게 관찰된다. 또한 주름은 대부분 선형의 모양을 가지므로, 음영진 부위가 연결되어 일정 길이 이상으로 관찰될 때 주름으로 정의될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 피부 주름은 인체 노화와 관련하여 눈가나 입가 주변에 얇은 미세 주름을 형성할 수 있다. 피부 미세 주름을 칭하는 용어는 'relief', 'furrow', 'wrinkle', 'fine wrinkle', 'line'등의 용어와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 피부 미세 주름은 눈밑 미세 주름, 또는 입가 미세 주름일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 물질은 콜라겐 합성 촉진을 특징으로 하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 물질 중 플로레틴 및/또는 오리자놀을 처리하는 경우에는 콜라겐 타입 I 또는 콜라겐 타입 Ⅳ의 합성을 촉진시킬 수 있으며, 루페올 및/또는 수크랄페이트를 처리하는 경우에는 콜라겐 타입 Ⅲ 또는 콜라겐 타입 Ⅳ의 합성을 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 콜라겐 합성 촉진에 효과가 있는 본 발명의 물질을 혼합한 크림을 눈가에 도포한 결과, 대조군인 레티놀 도포와 비교하여 우수한 주름 개선율을 보임을 확인하였다.
콜라겐을 타겟으로 하는 많은 주름 개선 원료들이 시장에 출시되어 있는 실정이나, 소비자들의 실제 주름 개선에 대한 체감율은 상당히 낮은 것으로 파악된다. 또한 현존하는 원료 중 주름 개선 효능이 가장 우수하다고 알려진 원료인 레티놀을 뛰어 넘는 비레티놀 원료는 흔치 않은 실정이다. 그러나, 본 발명에서는 비레티놀 물질을 이용하여 콜라겐 합성 촉진이 효과가 우수함을 확인하였다는 점에서 의의가 크다고 할 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 물질은 EDAR의 발현을 촉진하거나, BNC2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 물질 중 플로레틴 및/또는 오리자놀을 처리하는 경우에는 BNC2의 발현을 억제시킬 수 있으며, 루페올 및/또는 수크랄페이트를 처리하는 경우에는 EDAR의 발현을 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 물질에 대한 반응성이 특정 유전자 다형성 타입에 따라 달라짐을 알 수 있으며, 미세 주름 발생 위험도 수준이 높은 고위험군 그룹에 대해 맞춤형 처방을 제공함으로써 미세 주름 개선 효율을 상승시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 개인 맞춤형인 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 특정 피부 미세 주름 정도 연관 유의성 단일염기다형성(SNP) 마커를 갖는 개체를 대상으로, 개인 맞춤용 물질을 제공할 수 있다.
일 예로, 피부 미세 주름 정도 연관 유의성 단일염기다형성(SNP) 마커는 표 1에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 구체적으로 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다. '유전자 다형성 마커'는 일반적으로 동일한 유전자 위치(염기)에서 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 관찰되는 경우를 말하며, 일반적으로 개인에 따라서 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자(major allele), 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele)의 경우가 존재한다. 본 발명에서는 "다형성 마커"와 혼용될 수 있으며, 하위 대립 유전자의 염기와 염기 부위를 의미하거나, 염색체의 number와 base position과 함께 정의될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다. 또한, 염색체의 number와 base position이 동일한 둘 이상의 염기의 조합을 의미하며, 상기 염기는 특정한 집단의 개체들에서 발생 빈도가 높은 상위 대립유전자(major allele)와 상기 상위 대립유전자 보다 발생 빈도가 낮은 하위 대립유전자(minor allele)를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 유전자 다형성 마커들은 피부 미세 주름과 연관유의성이 있는 것으로, 두 가지 대립유전자(allele)를 보유할 수 있으며, 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele), 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자 (major allele)를 보유하는 경우로 나눌 수 있다.
피부 미세 주름 연관 유의성 다형성 마커의 대립 유전자를 가지고 있는 경우, 개체가 가지고 있는 대립 유전자에 따라 본 발명의 물질에 의한 반응성에 의해 피부 미세 주름 개선 효과가 달라질 수 있으며, 일 예로 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자 (major allele), 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), 또는 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele)를 보유하고 있는 경우에 본 발명의 물질에 의한 반응성, 즉, 미세 주름 개선 정도가 높거나 혹은 낮은 피부 특성을 가짐을 측정할 수 있으며, 이에 따라 하위 대립 유전자를 4개 이상 포함하는 개체에 미세 주름 개선을 증대시키기 위한 맞춤용 물질을 선택하는데 있어 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어, "rs_id"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다.
상기 단일염기다형성 마커는 표 1 내지 표 2에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다. 상기 표 1 내지 표 2에 표시된 단일염기다형성 마커는 피부 미세 주름 정도와 연관성이 있는지 정도를 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 단일염기다형성 마커의 피부의 주름 정도는 각 마커들의 빈도 수를 측정하여 판단하였다. 이와 같은 유의성은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만, 또는 0.000000001 미만의 p-value와 같은 p-값을 특징으로 하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로 p-value가 0.01 미만일 수 있으며, 더 구체적으로 p-value가 0.001 미만일 수 있고, 보다 더 구체적으로 0.0001 미만일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단일염기다형성(SNP) 마커는 표 1 또는 표 2에 표시된 마커 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단일염기다형성 (SNP) 마커는 1개 이상일 수 있으며, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 등 주름을 판단할 수 있는 개수의 조합으로 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 마커는 SNP 그 자체, 또는 상기 SNP 위치를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 미세 주름 정도 연관 유의성 단일염기다형성 마커는 EDAR 또는 BNC2의 단백질을 코딩하는 유전자 내에 존재하는 하나 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있으며, 구체적으로, rs10865025, rs10756807, rs1952688, rs10116469, 및 rs12338608로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, SNP 아이디가 rs10865025의 경우, Chr.Position (GRCh ver. 37)이 "2:109511765"로 기재되어 있고, Allele이 G>A 로 개시되어 있다면, 이는 인간의 2번 염색체의 109511765번째 염기가 G 또는 A임을 나타내는 것이며, allele의 ">" 왼쪽에 위치하는 염기가 상위 대립유전자(major allele)를 오른쪽에 위치하는 염기가 하위 대립유전자(minor allele)를 의미하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 표 1에서 선택되는 마커는 인간의 2번 염색체의 109511765번째 염기가 G 또는 A인(rs10865025), 상기 109511765째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 16756041번째 염기가 G 또는 A인(rs10756807), 상기 16756041번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 16782156번째 염기가 A 또는 G인(rs1952688), 상기 16782156번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 16783095번째 염기가 A 또는 T인(rs10116469), 상기 16783095번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 16800470번째 염기가 C 또는 T인(rs12338608), 상기 16800470번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구현예로 표 1과 마찬가지로 표 2에 표시된 단일염기다형성(SNP) 마커 중 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 사용될 수 있으며, 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유지, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 상기 조성물은 피부 미세 주름의 완화 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람, 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
일 구현예로, 본 발명의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 샴푸, 컨디셔너, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료로부터 rs10865025, rs10756807, rs1952688, rs10116469, 및 rs12338608로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 미세 주름 개선을 위한 맞춤용 물질을 선택하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 선택된 맞춤용 물질을 특정 다형성 부위를 갖는 개체에 처리하여 피부 미세 주름을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"란 피부 미세 주름 정도에 대한 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다. 상기 검체에서 머리카락, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계의 게놈 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다.
상기 (a) 단계의 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 방법 중 (b) 단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 구체적으로 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.
상기 물질은 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 미세 주름 정도 연관 유의성 유전자는 각 개체의 특이적 물질을 선택할 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 일 예로, EDAR 또는 BNC2 단백질을 코딩하는 유전자 내에 존재하는 하나 이상의 단일염기다형성 마커를 가진 개체의 경우, 루페올, 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 처리할 경우에 미세 주름 개선을 증대시킬 수 있으나, 각 개체의 유전자 특성에 따라 최적의 물질 조합을 제공할 수 있다.
이는, 피부 미세 주름과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성 (SNP) 마커를 선별하고 유전정보를 바탕으로 미세 주름 개선에 의한 효과를 극대화할 수 있는 개인 맞춤형 물질을 선택할 수 있도록 정보를 제공할 수 있음을 시사하는 것이다.
일 예로, rs10865025, rs10756807, rs1952688, rs10116469, 및 rs12338608의 염기 중 4개 이상의 하위 대립유전자(minor allele)를 포함하는 경우 플로레틴 및 오리자놀을 선택하거나; 루페올 및 수크랄페이트를 선택하거나; 또는 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트를 선택하도록 하는 정보제공방법을 제공하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "SNP 칩"은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.
TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 dTTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 미세 주름 정도 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 미세 주름 정도 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 미세 주름 정도 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적상 상기 용어'피부 미세 주름 정도'는 피부 주름으로 인해 일정 길이 이상의 선형의 부위가 주변부 피부에 비해 상대적으로 어둡게 관찰될 때 모든 대상 영역을 합산하여 전체 측정 부위 대비 비율을 측정한 결과를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 표 1 또는 표 2에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하여 미세 주름 생성이 쉬운지 여부를 판단하는 것을 의미한다. 더욱 구체적으로, 미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입은 노화 진행이 빨라서 피부 면적 당 주름이 많이 생성되는 비율이 높은 피부 타입을 의미한다.
본 발명의 상기 대립유전자는 각각의 개체에서 염색체의
number가 동일하고, 그 중에서 SNP의 상위 대립유전자(major allele) 및 하위 대립유전자(minor allele)가 존재하고, 다형성 마커의 다형성 부위의 염기가 하위 대립유전자로 하나씩 늘어감에 따라 상위 대립유전자는 하나씩 줄어갈 수 있으며, 상위 대립유전자로 하나씩 늘어감에 따라 하위 대립유전자는 하나씩 줄어갈 수 있다. 다만, 하위대립유전자 및 상위대립유전자가 늘어나고 줄어들 수 있는 범위는 i) 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자(major allele), ii) 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), iii) 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele)의 3가지 타입 안에서 일 수 있으며, 상기 3가지 타입의 범위 내에서 대립 유전자가 줄어들거나, 늘어날 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "피부의 미세 주름 정도 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브"는 상기와 같은 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 피부 미세 주름 정도를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다. 또한, 상기 용어는 '미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용'의 용어와 혼용되어 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "피부의 미세 주름 정도 진단용 마커를 증폭할 수 있는 제제"란 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 피부 미세 주름 정도를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 구체적으로 상기 피부의 미세 주름 정도 진단용 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다. 또한, 상기 용어는 '미세 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용'의 용어와 혼용되어 사용할 수 있다.
상기 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 정도를 통해 피부 타입을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 미세 주름 정도 진단용 조성물을 포함하는 피부의 미세 주름 정도 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 피부 미세 주름 정도 진단용 마커인 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 피부 미세 주름 정도를 진단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 피부 미세 주름 정도 진단용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 피부 미세 주름 정도 진단용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 구체적으로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 피부 미세 주름 정도 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 미세 주름 정도 진단용 조성물을 포함하는 피부의 미세 주름 정도 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 피부 타입 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25~30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명의 피부 미세 주름 정도 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 수득한 DNA에서 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 미세 주름 정도에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 용어, '개체', (a) 단계, (b)단계'는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 추가적으로 (c) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 상기 단일염기다형성 마커에 따른 하위 대립유전자(minor allele)인 염기를 4개 이상 포함하는 경우, 미세 주름이 많은 고위험군으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 피부 미세 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커들을 통하여 개인의 피부 미세 주름 발생 정도에 대한 예측 정보를 제공해 줄 수 있으며, 더 나아가서는 개인에게서 관찰되는 유전자 다형성 마커들의 정보에 따라 피부 미세 주름 정도를 완화시켜줄 수 있는 맞춤형 성분 또는 제품을 개발할 수 있을 것이다.
도 1은 플로레틴 및/또는 오리자놀의 처리에 따른 콜라겐의 발현 촉진을 나타낸 것이다.
도 2는 루페올 및/또는 수크랄페이트의 처리에 따른 콜라겐의 발현 촉진을 나타낸 것이다.
도 3은 안테라 3D와 눈밑 미세주름 분석 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 전문가의 육안 평가를 위해 사용된 기준 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트가 함유된 크림을 도포한 경우에 레티놀 대비 미세 주름 개선율을 나타낸 것이다.
도 6은 플로레틴 및/또는 오리자놀의 처리에 따른 BNC2 발현 억제를 나타낸 것이다.
도 7은 루페올 및/또는 수크랄페이트의 처리에 따른 EDAR 발현 촉진을 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트가 함유된 크림을 고위험군에 도포한 경우, 레티놀 대비 미세 주름 개선율을 나타낸 것이다.
도 2는 루페올 및/또는 수크랄페이트의 처리에 따른 콜라겐의 발현 촉진을 나타낸 것이다.
도 3은 안테라 3D와 눈밑 미세주름 분석 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 전문가의 육안 평가를 위해 사용된 기준 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트가 함유된 크림을 도포한 경우에 레티놀 대비 미세 주름 개선율을 나타낸 것이다.
도 6은 플로레틴 및/또는 오리자놀의 처리에 따른 BNC2 발현 억제를 나타낸 것이다.
도 7은 루페올 및/또는 수크랄페이트의 처리에 따른 EDAR 발현 촉진을 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트가 함유된 크림을 고위험군에 도포한 경우, 레티놀 대비 미세 주름 개선율을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 피부 미세 주름 연관유의성 유전자 다형성 마커 도출
한국인(여성)에서 유전정보에 따라 얼굴 피부 미세 주름 유무 및 정도(수치)에 차이가 나타나는 유전체 부위(유전자 변이)를 발굴하고자 하였다. 본 발명은 미세 주름에 연관되어 있는 유전체 부위(유전자 변이)를 발굴하기 위한 것으로, 후보 유전자를 미리 선별하지 않고 유전체전장수준을 스크리닝 할 수 있는 microarray genotyping chip (Illumina社 제품)을 활용하였다.
본 발명에서 미세 주름 유무 및 정도를 평가하기 위하여 이미지 기반의 피부진단 전문기기(PIE社 Janus3)를 활용하였으며, 피부 미세 주름 유무 및 정도(수치)에 영향을 줄 수 있는 외부효과를 최소화하기 위하여 나이와 BMI, 군집 주성분 수치로 보정 후 활용하였다.
유전체 부위(유전자 변이)와 피부 미세 주름 유무 및 정도(수치)와의 연관성을 확인하기 위하여 선형회귀분석을 활용하여 상관유의성 및 유전적 효과를 수치화하였다.
1-1: 피부 미세 주름 정도 평가 방법
눈밑 미세 주름 정도를 설명할 수 있는 유전자 다형성 마커를 도출해내기 위하여, 20~70대의 건강한 한국인 여성을 모집하였다. 또한, 피부 측정을 위하여 모든 분석 대상은 클렌징 또는 비누를 얼굴 세안을 하고 피부가 측정 환경에 적응할 수 있도록 어떠한 제품도 바르지 않고 30분간 대기한 후에 피부 주름 정도를 평가하였으며, 평가에는 이미지 기반의 피부진단 전문기기(PIE社 Janus3)를 활용하였다 (측정 및 분석은 기기 제조사의 매뉴얼에 따라 수행함). 구체적으로, 분석 대상자는 머리띠 착용 및 검은 천을 옷 위에 두른 후 얼굴을 기기에 내장된 이마 받침대와 턱 받침대에 고정하고 눈을 감은 상태로 측정을 위한 자세 유지하고, Janus 3 기기에 내장된 카메라를 통해 분석 대상자의 안면부에 대한 고해상도 이미지를 촬영하였다. 촬영된 고해상도 이미지로부터 평가 대상 부위인 양쪽 눈 밑 부분만을 추출하여 비식별화한 후 훈련된 피부 전문가 1인 이상이 눈 밑 미세주름 유무를 판단하거나 눈 밑 미세주름 등급 기준에 따라 등급을 평가하여 수치화하였다.
육안평가는 Janus 3 기기에 내장된 카메라를 통해 분석 대상자의 안면부에 대한 고해상도 이미지를 촬영하여 안면 이미지를 획득한 뒤, facial landmark 정보를 이용하여 지정된 눈 밑 부위의 이미지를 추출 (비식별화)하여, 평가 대상 부위를 추출하였다. 1인 이상의 훈련된 피부 전문가가 눈 밑 미세 주름 유무와 등급을 평가하였으며, 등급을 평가하는데 사용한 기준 이미지는 도 4와 같으며, 도 4의 좌상단부터 0~4등급을 나타낸다.
유전자 채집은 타액 수집을 통하여 이루어졌으며, 효과적인 유전자 채집을 위해 모든 분석 대상은 채집 전 30분부터는 물을 포함한 어떠한 음식물 섭취를 금하였다.
상기 피험자 중 ① 임신, 수유 중 또는 6 개월 이내에 임신을 계획하고 있는 경우, ② 피부질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부외형제를 1 개월 이상 사용한 경우, ③ 동일한 시험에 참가한 뒤 6 개월이 경과되지 않는 경우, ④ 민감성, 과민성 피부를 가진 경우, ⑤ 시험 부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 경우, ⑥ 시험 시작 3 개월 이내에 시험 부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 경우, ⑦ 시험 부위에 시술(피부 박피술, 보톡스, 기타 피부관리)을 받거나 6 개월 이내 계획한 경우, ⑧ 만성 소모성 질환이 있는 경우 (천식, 당뇨, 고혈압 등), ⑨ 아토피 피부염을 가지는 경우, ⑩ 그 외 주 시험자의 판단으로 시험이 곤란하다고 판단되는 경우는 피험자에서 제외하였다.
1-2: 유전자 채집 및 분석 방법
유전자 분석을 위한 타액으로부터의 유전자 추출은 QIAamp mini prep kit (QIAGEN)을 이용하여 human genomic DNA를 추출하였으며, 그 품질은 흡광도 (OD 260/280) 또는 1.7, 농도 50ng/ul, 1x TAE 1% agarose gel을 통한 band 검사를 통해 확인하였으며 품질을 통과한 건에 한하여 유전자 분석을 수행하였다.
Illumina社 microarray genotyping chip을 이용하여 유전자 분석이 진행되었으며, 구체적으로는 동일 회사의 global screening array 제품을 이용하여 분석 대상자들의 유전자를 분석하였다.
Illumina社 microarray genotyping chip 유전자 분석 실험은 제공되는 매뉴얼에 따라 진행되었으며, 제공되는 시약을 사용하여 genomic DNA 증폭 (amplification), DNA 조각화 (fragmentation), 침전 (precipitation), 혼성화 (hybridization), 염색 (staining), 세척 (washing), 코팅 (coating), 스캐닝 (scanning)의 과정을 수행하였다.
실험이 완료된 microarray genotyping chip은 iScan Control Software (Illumina)를 이용하여 스캔하였으며, 스캔이 완료되면 idat 파일이 자동으로 생성되어 GenomeStudio (Illumina) 프로그램을 이용하여 데이터 품질관리 (sample call rate 98%, marker call rate 98%) 및 유전자정보 확인을 수행하였다.
본 실험에서는 유전자 분석 이후 데이터 품질관리를 통과한 데이터만 활용하였다.
1-3: 피부 미세 주름 유무 연관 유전자 다형성 마커 도출
피부 미세 주름 유무와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커들을 도출하기 위하여 눈 밑 미세주름 유무와 유전자 다형성 마커 간 연관성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 표현형은 한국인 여성 1,000여명을 대상으로 눈 밑 미세 주름 유무를 판단한 전문가 육안 평가 데이터를 사용하였다.
유전형은 기능적으로 주름 발생에 영향을 줄 가능성이 높은 유전자를 선정하고, 해당 유전자 상에 위치하는 유전자 다형성 마커 데이터를 사용하였다.
단, 분석 대상 유전자 다형성 마커들의 품질관리를 위하여 각 유전자 다형성 마커들의 하위 대립유전자 빈도 (minor allele frequency) > 0.01 및 하디-웨인버그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium) > 0.000001 기준을 넘는 것에 한하여 분석에 사용하였다. 또한, 눈 밑 미세 주름 유무와 유전자 다형성 마커 간 연관성의 유의성은 로지스틱회귀분석 F-statistics를 통해 평가하였으며, 그 기준은 P-value < 0.05로 설정하였다. 분석은 PLINK v 1.90 및 SNP & Variation suite(Golden Helix, Inc., Bozeman, Montana, USA) 프로그램을 사용하였다.
피부 미세 주름 정도에 영향을 줄 수 있는 외부효과를 최소화하고 유전자정보에 따른 효과를 도출하기 위하여 나이, 폐경여부 또는 BMI(body mass index) 정보 또는 생활습관 (음주, 흡연, 식습관, 수면습관 등)의 정보로 눈 밑 미세 주름 유무를 보정하여 분석에 활용할 수 있다.
피부 미세 주름, 특히 눈밑 미세 주름의 유무와 유의하게 관련된 SNP 마커 대표적인 예들을 하기 표 1에 나타냈다.
| 번호 | 분석 대상 표현형 | SNP1) | Gene1) | Chr:Position1) | Allele2) | MAF3) | P-value4) | Effect size (β)5) |
| 1 | 눈밑 미세 주름 | rs10865025 | EDAR | 2:109511765 | G>A | 0.08 | 0.04 | 0.40 |
| 2 | 눈밑 미세 주름 | rs10756807 | BNC2 | 9:16756041 | G>A | 0.25 | 0.02 | 0.33 |
| 3 | 눈밑 미세 주름 | rs1952688 | BNC2 | 9:16782156 | A>G | 0.33 | 0.03 | 0.28 |
| 4 | 눈밑 미세 주름 | rs10116469 | BNC2 | 9:16783095 | A>T | 0.34 | 0.04 | 0.27 |
| 5 | 눈밑 미세 주름 | rs12338608 | BNC2 | 9:16800470 | C>T | 0.20 | 0.01 | 0.39 |
1) 미국국립보건원 (NIH) ID, 해당 홈페이지에서 서열확인가능
2) (major allele) > (minor allele) 의미
3) minor allele frequency = (2mm + Mm)/2(MM + Mm + mm)
4) 3가지의 유전형(M/M, M/m, m/m)에 대한 표현형 차이의 통계적 유의성 (M: major allele, m: minor allele)
5) minor allele 이 하나씩 늘어감에 따라 표현형의 위험도 변화정도 ( - : 눈밑 미세 주름 위험 감소, + : 눈밑 미세 주름 위험 증가)
눈밑 미세 주름 유무 = 눈밑의 미세 주름 관찰 여부 (전문가 육안 평가)
1-4: 피부 미세 주름 정도 연관 유전자 다형성 마커 도출
피부 미세 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커들을 도출하기 위하여 눈 밑 미세주름 정도와 유전자 다형성 마커 간 연관성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 표현형은 한국인 여성 2,000여명을 대상으로 눈 밑 미세 주름 유무를 판단한 전문가 육안 평가 데이터를 사용하였다. 육안평가는 Janus 3 기기에 내장된 카메라를 통해 분석 대상자의 안면부에 대한 고해상도 이미지를 촬영하여 안면 이미지를 획득한 뒤, facial landmark 정보를 이용하여 지정된 눈 밑 부위의 이미지를 추출 (비식별화)하여, 평가 대상 부위를 추출하였다. 1인 이상의 훈련된 피부 전문가가 눈 밑 미세 주름 유무와 등급을 평가하였으며, 등급을 평가하는데 사용한 기준 이미지는 도 4와 같으며, 도 4의 좌상단부터 0~4등급을 나타낸다.
유전형은 microarray chip을 통해 생성된 전장 유전체 수준에서 관찰되 는 모든 유전자 다형성 마커 데이터를 사용하였다. 단, 분석 대상 유전자 다형성 마커들의 품질관리를 위하여 각 유전자 다형성 마커들의 하위 대립유전자 빈도 (minor allele frequency) > 0.01 및 하디-웨인버그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium) > 0.000001 기준을 넘는 것에 한하여 분석에 사용하였다. 또한, 눈 밑 미세 주름 정도와 유전자 다형성 마커 간 연관성의 유의성은 로지스틱회귀분석 F-statistics를 통해 평가하였으며, 그 기준은 P-value < 0.0001로 설정하였다. 분석은 PLINK v 1.90 및 SNP & Variation suite(Golden Helix, Inc., Bozeman, Montana, USA) 프로그램을 사용하였다.
눈밑 미세 주름 정도에 영향을 줄 수 있는 외부효과를 최소화하고 유전자정보에 따른 효과를 도출하기 위하여 나이, 폐경여부 또는 BMI(body mass index) 정보 또는 생활습관 (음주, 흡연, 식습관, 수면습관 등)의 정보로 눈 밑 미세 주름 정도를 보정하여 분석에 활용할 수 있다.
피부 미세 주름, 특히 눈밑 미세 주름 정도와 유의하게 관련된 SNP 마커 대표적인 예들을 하기 표 2에 나타냈다.
| 번호 | SNP1) | Gene1) | Chr:Position1) | Allele2) | MAF3) | P-value4) | Effect size (β)5) |
| 1 | rs11742240 | IL7R | 5:35881376 | G>T | 0.22 | 2.04E-07 | -0.16 |
| 2 | rs6881270 | IL7R | 5:35879095 | C>T | 0.22 | 2.32E-07 | -0.16 |
| 3 | rs6881706 | IL7R | 5:35879156 | G>T | 0.22 | 2.32E-07 | -0.16 |
| 4 | rs11746643 | - | 5:35833717 | A>G | 0.22 | 6.46E-07 | -0.16 |
| 5 | rs12658443 | - | 5:35893423 | C>G | 0.23 | 1.06E-06 | -0.15 |
| 6 | rs143067902 | - | 20:48960227 | C>T | 0.02 | 1.34E-06 | 0.51 |
| 7 | rs4900133 | SLC24A4 | 14:92963513 | A>T | 0.45 | 2.18E-06 | -0.13 |
| 8 | rs11567694 | IL7R | 5:35857704 | A>G | 0.23 | 3.41E-06 | -0.14 |
| 9 | rs10213865 | IL7R | 5:35857850 | A>C | 0.23 | 3.41E-06 | -0.14 |
| 10 | rs11567705 | IL7R | 5:35861152 | C>G | 0.23 | 3.41E-06 | -0.14 |
| 11 | rs10125996 | BNC2 | 9:16792675 | G>C | 0.23 | 3.60E-06 | -0.14 |
| 12 | rs6890853 | IL7R | 5:35852311 | G>A | 0.23 | 3.77E-06 | -0.14 |
| 13 | rs1494564 | - | 5:35851831 | C>T | 0.23 | 3.80E-06 | -0.14 |
| 14 | rs116349073 | FGFRL1 | 4:1010563 | G>T | 0.03 | 3.83E-06 | 0.35 |
| 15 | rs11930231 | FGFRL1 | 4:1012156 | G>A | 0.03 | 3.83E-06 | 0.35 |
| 16 | rs115983866 | FGFRL1 | 4:1013104 | A>T | 0.03 | 3.83E-06 | 0.35 |
| 17 | rs116835475 | FGFRL1 | 4:1013404 | G>A | 0.03 | 3.83E-06 | 0.35 |
| 18 | rs535135673 | FGFRL1 | 4:1014491 | G>A | 0.03 | 3.83E-06 | 0.35 |
| 19 | rs34463936 | - | 5:35850149 | C>T | 0.17 | 3.92E-06 | -0.16 |
| 20 | rs1820367 | COL25A1 | 4:109984529 | C>T | 0.07 | 3.94E-06 | -0.23 |
| 21 | rs115019686 | FGFRL1 | 4:1011107 | C>T | 0.03 | 4.05E-06 | 0.35 |
| 22 | rs876367 | COL25A1 | 4:109990227 | C>T | 0.07 | 4.21E-06 | -0.23 |
| 23 | rs72883487 | COL25A1 | 4:109995979 | G>T | 0.07 | 4.95E-06 | -0.23 |
| 24 | rs112105249 | COL25A1 | 4:109997847 | G>A | 0.07 | 4.95E-06 | -0.23 |
| 25 | rs7679355 | COL25A1 | 4:109999116 | T>C | 0.07 | 4.95E-06 | -0.23 |
| 26 | rs72883496 | COL25A1 | 4:109999445 | C>T | 0.07 | 4.95E-06 | -0.23 |
| 27 | rs6818139 | COL25A1 | 4:110000262 | A>T | 0.07 | 4.95E-06 | -0.23 |
| 28 | rs1952322 | SLC24A4 | 14:92960471 | C>G | 0.46 | 5.13E-06 | -0.12 |
| 29 | rs10735356 | - | 12:98486735 | G>A | 0.03 | 5.16E-06 | -0.34 |
| 30 | rs118040802 | - | 13:104376235 | A>G | 0.05 | 5.23E-06 | -0.28 |
| 31 | rs2242056 | MYO5A | 15:52631871 | C>T | 0.30 | 5.68E-06 | 0.13 |
| 32 | rs12697352 | - | 5:35837234 | G>A | 0.18 | 5.73E-06 | -0.15 |
| 33 | rs12380481 | BNC2 | 9:16791865 | C>T | 0.23 | 5.80E-06 | -0.14 |
| 34 | rs72883483 | COL25A1 | 4:109994351 | G>A | 0.07 | 6.02E-06 | -0.23 |
| 35 | rs11742270 | IL7R | 5:35881443 | G>A | 0.18 | 6.15E-06 | -0.16 |
| 36 | rs79551193 | COL25A1 | 4:109989008 | T>G | 0.07 | 6.17E-06 | -0.23 |
| 37 | rs1364849 | COL25A1 | 4:110001924 | C>A | 0.07 | 6.49E-06 | -0.23 |
| 38 | rs6897932 | IL7R | 5:35874575 | C>T | 0.18 | 6.91E-06 | -0.15 |
| 39 | rs4746452 | - | 10:66362059 | G>A | 0.07 | 6.95E-06 | -0.23 |
| 40 | rs6871748 | - | 5:35885982 | T>C | 0.18 | 7.84E-06 | -0.15 |
| 41 | rs10075764 | - | 5:35841449 | A>G | 0.18 | 7.96E-06 | -0.15 |
| 42 | rs10472984 | - | 5:35843832 | C>G | 0.18 | 7.96E-06 | -0.15 |
| 43 | rs1961220 | - | 5:35844125 | G>A | 0.18 | 7.96E-06 | -0.15 |
| 44 | rs4594881 | - | 5:35846815 | G>T | 0.18 | 7.96E-06 | -0.15 |
| 45 | rs6858316 | COL25A1 | 4:110002520 | T>G | 0.07 | 8.09E-06 | -0.22 |
| 46 | rs10214273 | IL7R | 5:35883986 | T>G | 0.18 | 8.32E-06 | -0.15 |
| 47 | rs72883469 | COL25A1 | 4:109993265 | T>C | 0.07 | 8.98E-06 | -0.22 |
| 48 | rs34429094 | COL25A1 | 4:109993338 | T>C | 0.07 | 8.98E-06 | -0.22 |
| 49 | rs72883476 | COL25A1 | 4:109993636 | T>C | 0.07 | 8.98E-06 | -0.22 |
| 50 | rs7675200 | COL25A1 | 4:109995301 | A>G | 0.07 | 8.98E-06 | -0.22 |
| 51 | rs79306299 | - | 11:15451058 | C>T | 0.10 | 9.60E-06 | -0.19 |
| 52 | rs147393407 | FGFRL1 | 4:1001852 | G>C | 0.03 | 9.62E-06 | 0.35 |
| 53 | rs2881132 | COL25A1 | 4:109990513 | A>G | 0.07 | 9.74E-06 | -0.22 |
| 54 | rs117886264 | - | 18:5664322 | G>A | 0.01 | 1.01E-05 | 0.50 |
| 55 | rs2183406 | BNC2 | 9:16790960 | A>G | 0.25 | 1.09E-05 | -0.13 |
| 56 | rs2183407 | BNC2 | 9:16790968 | G>C | 0.25 | 1.09E-05 | -0.13 |
| 57 | rs62351974 | - | 5:35892037 | C>T | 0.18 | 1.12E-05 | -0.15 |
| 58 | rs62351975 | - | 5:35892290 | T>C | 0.18 | 1.12E-05 | -0.15 |
| 59 | rs12658494 | - | 5:35893499 | G>T | 0.18 | 1.12E-05 | -0.15 |
| 60 | rs6501944 | ABCA9 | 17:67020838 | G>A | 0.41 | 1.14E-05 | 0.12 |
| 61 | rs10995921 | - | 10:66351195 | C>T | 0.07 | 1.14E-05 | -0.22 |
| 62 | rs10214237 | IL7R | 5:35883734 | T>C | 0.18 | 1.16E-05 | -0.15 |
| 63 | rs10962601 | BNC2 | 9:16796252 | T>G | 0.23 | 1.16E-05 | -0.14 |
| 64 | rs72631618 | SLC24A4 | 14:92959606 | C>A | 0.03 | 1.17E-05 | -0.35 |
| 65 | rs60557797 | - | 11:15443444 | T>A | 0.11 | 1.24E-05 | -0.19 |
| 66 | rs12341168 | BNC2 | 9:16793202 | T>C | 0.26 | 1.29E-05 | -0.13 |
| 67 | rs78143042 | COL25A1 | 4:110021483 | T>A | 0.07 | 1.32E-05 | -0.22 |
| 68 | rs113769874 | COL25A1 | 4:110004760 | A>G | 0.07 | 1.36E-05 | -0.22 |
| 69 | rs7674074 | COL25A1 | 4:110035500 | C>T | 0.07 | 1.39E-05 | -0.22 |
| 70 | rs79166066 | COL25A1 | 4:110052842 | A>G | 0.08 | 1.41E-05 | -0.22 |
| 71 | rs12649586 | COL25A1 | 4:110053740 | A>T | 0.08 | 1.41E-05 | -0.22 |
| 72 | rs17039914 | COL25A1 | 4:110057072 | C>T | 0.08 | 1.41E-05 | -0.22 |
| 73 | rs16920057 | - | 10:66363602 | C>T | 0.07 | 1.46E-05 | -0.22 |
| 74 | rs10995919 | - | 10:66344560 | C>T | 0.07 | 1.52E-05 | -0.22 |
| 75 | rs139319078 | - | 10:66344671 | A>G | 0.07 | 1.52E-05 | -0.22 |
| 76 | rs7696508 | COL25A1 | 4:110026585 | G>A | 0.07 | 1.54E-05 | -0.21 |
| 77 | rs4454016 | COL25A1 | 4:110032888 | C>T | 0.07 | 1.54E-05 | -0.21 |
| 78 | rs10120562 | BNC2 | 9:16793104 | A>G | 0.24 | 1.55E-05 | -0.13 |
| 79 | rs112271794 | COL25A1 | 4:109992061 | T>C | 0.07 | 1.56E-05 | -0.22 |
| 80 | rs12420460 | - | 11:15418219 | A>G | 0.11 | 1.67E-05 | -0.18 |
| 81 | rs17039759 | COL25A1 | 4:110006031 | G>A | 0.07 | 1.68E-05 | -0.21 |
| 82 | rs12646527 | COL25A1 | 4:110007821 | C>T | 0.07 | 1.68E-05 | -0.21 |
| 83 | rs77771943 | COL25A1 | 4:110019438 | G>T | 0.07 | 1.68E-05 | -0.21 |
| 84 | rs181345844 | FGFRL1 | 4:1004090 | G>A | 0.03 | 1.76E-05 | 0.34 |
| 85 | rs200599345 | LAIR1 | 19:54864727 | C>T | 0.04 | 1.78E-05 | -0.31 |
| 86 | rs56147432 | - | 11:15416854 | T>C | 0.11 | 1.80E-05 | -0.18 |
| 87 | rs7479972 | - | 11:15393887 | C>T | 0.11 | 1.81E-05 | -0.18 |
| 88 | rs3822032 | FGFRL1 | 4:1015789 | T>C | 0.07 | 1.83E-05 | 0.22 |
| 89 | rs35128275 | COL25A1 | 4:110057711 | G>C | 0.07 | 1.85E-05 | -0.22 |
| 90 | rs56755954 | C1orf109 | 1:38144316 | A>C | 0.19 | 1.89E-05 | -0.14 |
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| 92 | rs78938373 | - | 11:15410172 | A>G | 0.11 | 1.90E-05 | -0.18 |
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| 503 | rs78967482 | TMEM163 | 2:135313708 | A>G | 0.25 | 9.52E-05 | -0.12 |
| 504 | rs9685922 | LOC105377267 | 4:70052684 | G>C | 0.38 | 9.54E-05 | 0.10 |
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| 507 | rs73826622 | LOC105377267 | 4:70053043 | C>G | 0.38 | 9.54E-05 | 0.10 |
| 508 | rs117992229 | EHBP1 | 2:63198854 | G>C | 0.02 | 9.74E-05 | 0.35 |
| 509 | rs141227271 | NUDCD1 | 8:110333373 | G>A | 0.03 | 9.75E-05 | -0.31 |
| 510 | rs11067765 | - | 12:116212862 | T>A | 0.32 | 9.77E-05 | -0.11 |
| 511 | rs10766240 | - | 11:15387297 | T>A | 0.17 | 9.79E-05 | -0.14 |
| 512 | rs1278271 | ADAM12 | 10:127747972 | G>A | 0.42 | 9.79E-05 | -0.10 |
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| 514 | rs1451011 | BBS9 | 7:33679634 | A>G | 0.20 | 9.83E-05 | -0.13 |
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| 516 | rs9403532 | PHACTR2 | 6:144113921 | C>T | 0.34 | 9.85E-05 | -0.10 |
| 517 | rs8066691 | ABCA9 | 17:67061265 | A>G | 0.35 | 9.90E-05 | 0.11 |
| 518 | rs11765833 | - | 7:1830116 | A>C | 0.39 | 9.91E-05 | 0.10 |
| 519 | rs9908205 | PLD6 | 17:17105615 | C>G | 0.32 | 9.94E-05 | -0.11 |
1) 미국국립보건원 (NIH) ID, 해당 홈페이지에서 서열확인가능
2) (major allele) > (minor allele) 의미
3) minor allele frequency = (2mm + Mm)/2(MM + Mm + mm)
4) 3가지의 유전형(M/M, M/m, m/m)에 대한 표현형 차이의 통계적 유의성 (M: major allele, m: minor allele)
5) minor allele 이 하나씩 늘어감에 따라 표현형의 증감 변화정도 ( - : 눈밑 미세 주름 위험 감소, + : 눈밑 미세 주름 위험 증가)
눈밑 미세 주름 유무 = 눈밑의 미세 주름 심각도 등급 (전문가 육안 평가)
실시예 2: 다양한 물질의 콜라겐 합성 촉진 효과 분석 결과
해당 유전자 및 관련 메커니즘 상에서 콜라겐 합성을 촉진할 수 있는 다양한 물질을 처리하여 콜라겐 합성 촉진에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 물질은 플로레틴(phloretin), 오리자놀(oryzanol), 루페올(lupeol), 및 수크랄페이트(sucralfate)를 사용하였다.
사람 피부섬유아세포 (NHDF-Neo - Human Dermal Fibroblasts, Neonatal, Lonza, CC-2509)는 Lonza로부터 구매하여 사용하였다. 구입한 세포는 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium - Thermo Fisher Scientific)에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 1% Antibiotics (Penicillin streptomycin)을 섞어 만든 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
콜라겐 mRNA 합성 촉진 효능을 분석하기 위해 사람 피부섬유아세포를 6 well plate에 1.5X10^5 cells / well 씩 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 24시간 동안 배양하였다. 물질들을 적절한 농도/조합으로 serum free media에 첨가한 후 다시 동일 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후 RNA-spin total RNA extraction kit (인트론바이오테크놀로지, 17211)를 이용하여 mRNA를 수득하고 cDNA synthesis kit (필코리아테크놀로지, ET21100)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 및 taqman probe (assay ID: COL1A1 - Hs00164004_m1, COL3A1 - Hs00943809_m1, COL4A1 - Hs00266237_m1, BNC2 - Hs00417700_m1, EDAR - Hs00223468_m1)을 이용하여 qPCR을 진행함으로써 각 유전자의 발현량을 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 플로레틴 또는 오리자놀 단독 처리 시에는 Type I collagen (COL1A1), Tyep III collagen (COL3A1), Type IV collagen (COL4A1)의 발현이 촉진됨을 확인하였으며, 플로레틴 및 오리자놀 복합 처리 시에는 Type I collagen (COL1A1), Type IV collagen (COL4A1) 유전자 발현에 대한 시너지 효과가 나타남을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 루페올 또는 수크랄페이트 단독 처리시에는 Tyep III collagen (COL3A1)의 발현이 촉진됨을 확인하였으며, 루페올 및 수크랄페이트 복합 처리시에는 Tyep III collagen (COL3A1), Type IV collagen (COL4A1) 유전자 발현에 대한 시너지 효과가 나타남을 확인하였다.
실시예 3: 레티놀 대비 피부 미세 주름 개선 정도를 확인하기 위한 인체 적용 시험 시험
실시예 1을 통해 얻어진 피부 미세 주름 유무 및 정도와 연관성을 보이는 다형성 마커를 기반으로 피부 미세 주름 개선의 효과를 극대화할 수 있는 물질을 발굴하여 맞춤형 물질을 처방하고자 하였다.
3-1: 피험자 선정
생명윤리위원회 (Institutional Review Board, IRB, Korea)의 승인(LG- Wr_Fine-2021-1013) 후 ㈜LG생활건강 기관생명윤리위원회의 표준 운영지침 및 임상시험 기준에 따라 실시하였으며, 눈가, 눈밑에 주름이 많은 20~50대 성인으로 피부에 외관상 큰 이상이 없으며, 시험 시작 전 3달 이내 피부과 시술 경험이 없는 건강한 피시험자 11인을 선정하였다.
3-2: 피험자 제외 기준
상기 피험자 중 1) 습진성/감염성 피부 질환을 보유한 자, 2) 알레르기성 특이 체질이거나 과민증이 있는 자, 3) 임신 중이거나 수유 중인 자, 4) 현저한 영양 장애자, 5) 약물이나 알코올 중독자, 6) 시험 부위에 점, 여드름, 문신, 홍반, 화상 자국 등을 보유한 자, 7) 동일한 시험에 참여한 뒤 1개월이 경과되지 않은 자, 8) 고혈압, 당뇨 질환자의 경우에는 피험자에서 제외하였다.
3-3: 시험 정보
대조군 크림은 레티놀 0.1% (3300IU) 크림을 0주 내지 2주에는 피부 적응기로 격일 저녁 좌측 눈가에 도포하였으며, 2주부터 실험 종료시까지는 매일 저녁 좌측 눈가에 도포하였다.
실험군 크림은 Phloretin 0.05%, oryzanol 0.1%, lupeol (원료명: collageneer) 2%, sucralfate (원료명: Sucralfatesome) 2%를 매일 아침/저녁 2회, 우측 눈가에 도포하였다.
총 4주간 사용하며, 안테라 3D를 이용하여 사용 전/후 주름을 측정한 후, 눈밑의 미세주름 texture overall size (Ra 값)를 구하였다.
미세주름 overall size - Ra값이란, 안테라 측정 시 표면적과 비교하여 높이가 높거나 낮은 곳의 전체 부피를 전체 면적으로 나누어준 값을 의미한다.
3-4: 눈밑 미세 주름 측정 기기 및 측정/분석 방법
안테라 3D를 이용하여 눈 주변 사진 (좌우 각각)을 찍어 3D image를 얻었다(3번 반복 촬영)(도 3).
1) 분석 항목: texture
2) 영역 지정 도구 중 stripe 선택 → 속눈썹 바로 아래 눈밑 피부 지정 (under eye patch 모양으로 지정, 폭 9mm), 자동으로 0주, 4주 이미지의 동일한 영역 선택함
3) Texture 분석 시 score, Ra, Rq, Rmax 파라미터 중 Ra 값을 이용하여 분석 진행, 3번 반복 촬영한 값의 평균을 구하여 비교함
3-5: 레티놀 대비 피부 미세 주름 개선 정도 확인
실시예 2를 통해 콜라겐 합성 촉진에 효과가 있는 본 발명의 물질 4가지(플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트)를 혼합하여 우측 눈가에 도포하고, 대조군 크림(레티놀)은 좌측 눈가에 도포하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 4주 도포 후 미세주름 개선율이 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트가 함유된 크림을 도포한 경우에 레티놀 대비 2.1배 우수한 주름 개선율을 보임을 확인하였다.
실시예 4: 피부 미세 주름 정도 연관 유의성 다형성 마커와 미세 주름 개선 물질 처리의 상관관계 확인
실시예 1을 통해 얻어진 피부 미세 주름 정도와 연관성을 보이는 다형성 마커를 기반으로 본 발명의 물질에 의한 미세 주름 개선 정도를 확인하고자 하였다.
일 예로, 피부세포(특히 각질세포) 전사인자 중 하나인 BNC2의 발현량은 많을수록 어두운 피부색을 가지며, BNC2 유전자에 발생하는 돌연변이는 피부의 pigmented spot과 관련이 있음이 보고되어 있는바, BNC2의 발현량을 감소시키는 것이 활성 산소에 대한 반응성을 낮추면서 세포 노화나 사멸이 진행되지 않도록 하는 것이다. 즉, 본 발명의 물질을 처리하여 BNC2의 발현량을 감소시키는 경우, 주름 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 플로레틴 및 오리자놀을 단독으로 처리한 경우에 BNC2의 발현이 억제됨을 확인하였으며, 플로레틴 및 오리자놀 복합 처리시에는 시너지 효과에 의하여 단독 처리한 것에 비하여 BNC2의 발현이 더 효과적으로 억제됨을 확인하였다.
다른 일 예로, 생물의 발생과정에서 외배엽 발달에 중요한 EDA 수용체로 알려진 EDAR는 발현량이 감소할수록 NF-kB 신호가 억제되며, 피부가 얇아지고 건조해지며, 특히 눈 주변 피부가 주름지고 색소 침착이 발생하는 외배엽 이형성증(HED; Hyphohidrotic ectodermal dysplasia)을 유발한다고 보고되어 있는바, EDAR의 발현량을 증가시키는 것이 NF-Kb 활성을 통해 chemokine을 증가시키고, 광노화 등의 자극을 복구할 능력을 증가시키는 것이다. 즉, 본 발명의 물질을 처리하여 EDAR의 발현량을 증가시키는 경우, 주름 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 루페올 및 수크랄페이트를 단독으로 처리한 경우에 EDAR의 발현이 증가됨을 확인하였으며, 루페올 및 수크랄페이트 복합 처리시에는 시너지 효과에 의하여 단독 처리한 것에 비하여 EDAR의 발현이 더 효과적으로 촉진됨을 확인하였다.
이를 통해, 레티놀 대비 미세 주름 개선에 대한 반응성이 높은 본 발명의 물질을 처리하여 미세 주름 유무 연관 다형성 마커의 종류에 따른 맞춤 처방을 할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: 미세 주름 고위험군 맞춤형 주름 개선 처방 개발을 위한 인체적용시험
실시예 3을 통해 얻어진 피부 미세 주름 정도 연관 유의성 다형성 마커와 본 발명의 물질 처리의 상관관계를 통해 미세 주름 발생 위험도 수준에 따른 미세 주름 개선 효율을 상승시켜줄 수 있는 물질을 제공하고자 하였다.
5-1: 피험자 선정
생명윤리위원회 (Institutional Review Board, IRB, Korea)의 승인(LG- Wr_Fine-2021-1013) 후 ㈜LG생활건강 기관생명윤리위원회의 표준 운영지침 및 임상시험 기준에 따라 실시하였으며, 눈가, 눈밑에 주름이 많은 20~50대 성인으로 피부에 외관상 큰 이상이 없으며, 시험 시작 전 3달 이내 피부과 시술 경험이 없는 건강한 피시험자 10인을 선정하였다.
표 1의 눈밑 미세주름 유무 연관 유전자 다형성 마커를 토대로 미세 주름 발생 위험도 수준에 따라 피험자를 저위험군과 고위험군으로 하기와 같이 분류하였다.
마커 5개 중 minor allele을 3개 이하로 포함 → 저위험군 (n=5)
마커 5개 중 minor allele을 4개 이상으로 포함 → 고위험군 (n=5)
5-2: 피험자 제외 기준
실시예 3-2와 동일
5-3: 시험 정보
실시예 3-3과 동일
5-4: 눈밑 미세 주름 측정 기기 및 측정/분석 방법
실시예 3-4와 동일
5-5: 본 발명의 물질 처리에 따른 주름 개선율 확인
본 발명의 물질 4가지(플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트)가 함유된 크림을 도포한 경우, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 저위험군 그룹에서는 레티놀 단독 대비 맞춤처방 도포 시 눈밑 미세주름 길이가 유사한 수준으로 개선되었으나, 고위험군 그룹에서는 레티놀 단독 대비 맞춤처방 도포 시 눈밑 미세주름 길이 개선율이 약 3.6배 증가함을 확인하였다.
이를 통해, 물질에 대한 반응성이 특정 유전자 SNP의 대립유전자 보유 여부에 따라 달라짐을 알 수 있으며, 미세 주름 발생 위험도 수준이 높은 고위험군 그룹에 대해 맞춤형 처방을 제공함으로써 미세 주름 개선 효율을 상승시킬 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (16)
- 플로레틴(phloretin), 오리자놀(oryzanol), 루페올(lupeol), 및 수크랄페이트(sucralfate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 미세 주름 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은
(ⅰ)플로레틴 및 오리자놀;
(ⅱ) 루페올 및 수크랄페이트; 또는
(ⅲ) 플로레틴, 오리자놀, 루페올 및 수크랄페이트을 유효성분으로 포함하는, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 물질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.0001 내지 10 중량 %로 함유하는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 미세 주름은 눈밑 미세 주름, 또는 입가 미세 주름인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 콜라겐 합성 촉진을 특징으로 하는 것인, 조성물.
- 제5항에 있어서,
콜라겐 타입 I 또는 콜라겐 타입 Ⅳ의 합성 촉진을 위한 물질은 플로레틴 및 오리자놀인 것인, 조성물.
- 제5항에 있어서,
콜라겐 타입 Ⅲ 또는 콜라겐 타입 Ⅳ의 합성 촉진을 위한 물질은 루페올 및 수크랄페이트인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 물질은 EDAR의 발현을 촉진하거나, BNC2의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
- 제8항에 있어서,
BNC2의 발현 억제를 위한 물질은 플로레틴 또는 오리자놀인 것인, 조성물.
- 제8항에 있어서,
EDAR의 발현 촉진을 위한 물질은 루페올 또는 수크랄페이트인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 주름 개선은 EDAR 또는 BNC2의 단백질을 코딩하는 유전자 내에 존재하는 하나 이상의 단일염기다형성 마커를 가진 개체를 대상으로 하는 맞춤형인 것인, 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커는 rs10865025, rs10756807, rs1952688, rs10116469, 및 rs12338608로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커는 인간의 2번 염색체의 109511765번째 염기가 G 또는 A인(rs10865025), 상기 109511765째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
인간의 9번 염색체의 16756041번째 염기가 G 또는 A인(rs10756807), 상기 16756041번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
인간의 9번 염색체의 16782156번째 염기가 A 또는 G인(rs1952688), 상기 16782156번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
인간의 9번 염색체의 16783095번째 염기가 A 또는 T인(rs10116469), 상기 16783095번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
인간의 9번 염색체의 16800470번째 염기가 C 또는 T인(rs12338608), 상기 16800470번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조성물.
- (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료로부터 rs10865025, rs10756807, rs1952688, rs10116469, 및 rs12338608로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 미세 주름 개선을 위한 맞춤용 물질을 선택하기 위한 정보제공방법.
- 제14항에 있어서,
상기 물질은 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 정보제공방법.
- 제14항에 있어서,
rs10865025, rs10756807, rs1952688, rs10116469, 및 rs12338608의 염기 중 4개 이상의 하위 대립유전자(minor allele)를 포함하는 경우 미세 주름 개선을 위한 맞춤용 물질은 플로레틴 및 오리자놀; 루페올 및 수크랄페이트; 또는 플로레틴, 오리자놀, 루페올, 및 수크랄페이트를 선택하는 것인, 정보제공방법.
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