KR20240072313A - 황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240072313A
KR20240072313A KR1020220149167A KR20220149167A KR20240072313A KR 20240072313 A KR20240072313 A KR 20240072313A KR 1020220149167 A KR1020220149167 A KR 1020220149167A KR 20220149167 A KR20220149167 A KR 20220149167A KR 20240072313 A KR20240072313 A KR 20240072313A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
staphylococcus aureus
primer
lamp
diagnosing
detecting
Prior art date
Application number
KR1020220149167A
Other languages
English (en)
Inventor
임세라
최상행
윤태호
남호철
이성운
Original Assignee
(주)레보스케치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)레보스케치 filed Critical (주)레보스케치
Priority to KR1020220149167A priority Critical patent/KR20240072313A/ko
Publication of KR20240072313A publication Critical patent/KR20240072313A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 황색포도상구균 검출을 위한 신규한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 아토피 진단용 조성물에 관한 것으로서, 고리매개 등온 증폭반응을 이용하여 특수한 장비없이 간편하고 높은 정확도로 아토피를 진단하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

황색포도상구균 감염 진단을 위한 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도{Composition for RT-LAMP for diagnosing Staphylococcus aureus infection and use thereof}
본 발명은 황색포도상구균 감염 진단을 위한 RT_LAMP용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
아토피 피부염(Atopic Dermatitis)은 주로 유아기나 소아기에 시작되고 심한 가려움증을 동반하는 만성적인 염증성 피부질환이다. 아토피 피부염의 원인은 현재까지 명확하게 밝혀지지 않았지만, 유전적 요인, 환경적 요인, 면역학적 반응, 피부 장벽기능의 이상, 세균·바이러스·곰팡이에 의한 감염 등 여러 원인이 복합적으로 작용하여 발병하는 것으로 알려져 있다.
아토피 환자의 70~80%는 가족력이 있어서 부모 중 한쪽이 아토피성 피부염이 있으면 자녀의 50%에게, 부모 두 명에게 모두 아토피성 피부염이 있으면 자녀의 75%에게 아토피성 피부염이 나타난다.　최근 들어 환경적 요인의 중요성이 강조되고 있는데, 농촌의 도시화, 산업화, 핵가족화로 인한 인스턴트식품 섭취의 증가, 실내외 공해에 의한 알레르기 물질의 증가 등이 아토피성 피부염 발병과 밀접한 관련이 있다. 또한 환자의 80% 이상은 면역학적 이상을 보여, 혈액 속에서 면역글로불린E(IgE)이 증가한다. 아토피성 피부염 환자는 대부분 음식물이나 공기 중의 항원에 대한 특이 IgE 항체가 존재하여 항원에 노출되면 양성 반응을 보여 아토피 증상이 나타난다.
환경오염의 증가 및 공기 매개성 알러지 원인물질 증가 등의 요인에 의하여 아토피 피부염 환자수는 과거부터 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 국내 아토피 환자는 2021년 기준으로 약 99만명에 달하며 세계 인구의 10% 이상이 아토피 피부염 환자라는 통계는 아토피 피부염이 국내를 넘어 전 세계적으로 심각한 사회문제임을 말해준다.
아토피 피부염 환자는 세균이나 바이러스, 진균 등의 피부감염이 정상인보다 잘 생기는데, 이것은 피부의 장벽 기능이 약화된 결과로, 특히, 세균감염으로는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 감염이 가장 흔하다. 이 세균은 정상적인 피부에서 2~25%의 비율로 검출되는 상재균이지만, 피부 건강 상태에 따라 염증이 유발될 수 있고, 아토피 피부염이 있는 소아와 어른에 있어서는 78~100%의 높은 비율로 검출된다. 일단 감염이 생기면 작은 고름물집이 생기고, 진물이 나며 나중에 딱지를 형성하게 된다.
황색포도상구균의 집락 농도는 아토피 피부염의 중증도와 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있어, 아토피 피부염 진단 및 치료와 관련하여 피부 균총의 균형이 무너진 아토피 피부염 환자의 피부에서 황색포도상구균을 높은 정확도와 민감도로 검출하는 것이 매우 중요하다.
대한민국 등록특허공보 제10-612551호 (2002.08.10.)
Notomi, T.et al. 2000.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63
본 발명은 상술한 요구에 따라 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 황색포도상구균을 간편한 방법으로 신속하고 특이적으로 검출하기 위한 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 신규 프라이머/프로브 세트 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제 해결을 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 고리매개 등온증폭(LAMP) 반응에 이용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 검출 가능한 표지 물질로 표지된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트를 포함하는 아토피 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 아토피 진단용 조성물은 황색포도상구균의 표적 핵산과 상보적인 염기 서열을 포함하는 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 7로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 아토피 진단용 조성물을 포함하는 아토피 진단용 키트를 제공할 수 있다.
아울러 본 발명은 생물학적 시료 및 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(고리 매개 등온 증폭) 반응을 수행하는 단계; 및 상기 LAMP 반응 수행에 따른 증폭 산물을 검출하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우 이를 황색포도상구균의 감염으로 판단하는 단계;를 포함하는 아토피 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계 이후, 전기영동하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 색 변화를 관찰하여 황색포도상구균의 유무를 파악하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명은 LAMP를 이용한 방식에 따라 황색포도상구균을 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 아토피 진단용 조성물을 제공하며, 내부 대조군을 통해 위음성을 배제함으로써, 진단 결과에 대한 신뢰도를 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1은 isoQuark mini 장비에서의 LAMP 실험결과를 나타낸 것이다.
도 2는 CFX96 장비에서의 LAMP 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 F3 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 4는 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 B3 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 5는 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 FIP 프라이머 (F1c)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 6은 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 FIP 프라이머 (F2)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 7은 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 BIP 프라이머(B1c)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 8은 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 BIP 프라이머(B2)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 9는 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 LF 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 10은 BLAST를 이용한 S. aureus 검출용 LB 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 11은 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 F3 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 12는 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 B3 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 13은 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 FIP 프라이머 (F1c)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 14는 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 FIP 프라이머 (F2)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 15는 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 BIP 프라이머(B1c)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 16은 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 BIP 프라이머(B2)의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 17은 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 LF 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
도 18은 BLAST를 이용한 β-액틴 검출용 LB 프라이머의 특이성 분석 결과(in silico)를 나타낸 것이다.
이하, 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 황색포도상구균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 아토피 진단용 조성물, 아토피 진단용 키트 및 아토피 진단을 위한 정보제공방법에 대하여 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수 있으며, 이러한 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미하고, 중량%는 달리 정의되지 않는 한 전체 조성물 중 어느 하나의 성분이 조성물 내에서 차지하는 중량%를 의미할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함될 수 있다.
또한, 본 명세서의 용어, "포함한다"는 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
또한, 본 명세서의 용어, "실질적으로~ 포함하지 않는다"는 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양 또는 정도로 존재할 수 있는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA, DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 의미할 수 있다.
본 명세서의 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 중합효소를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 3' 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 의미한다. 또한 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 핵산 분자가 표적 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로(substantially) 상보적 및 완전히(perfectly) 상보적인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어"실질적으로 상보적인 서열"은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 서열 특이적인 혼성화가 일어날 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
본 명세서에서 용어"프로브"는 특정 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어 "검출"은 황색포도상구균의 오염 또는 감염 여부를 핵산의 존재 여부 또는 존재할 경우 정량분석 하는 것으로, 구체적으로 LAMP 분석에 기반을 둔 것일 수 있다.
본 명세서에서 "샘플" 또는 "생물학적 시료"는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명은 황색포도상구균을 높은 특이도 및 민감도로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다. 프라이머 세트는 유전자 증폭법에서 사용되는 것으로서, 종래 PCR을 이용한 유전자 증폭법이 있지만, PCR은 증폭을 위한 특수 장비를 필요로 하고, 조작 공정이 많으며, 최종적인 판정을 위해서는 전기영동법 등의 특수한 기법이나 기기, 또는 자외선 조사 장치 등을 필요로 할 수 있으므로, 본 발명의 경우 조작이 용이하고 간편한 등온 증폭법을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에 따른 프라이머 세트는 고리매개 등온증폭반응(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)에 이용되는 것일 수 있다.
LAMP는 등온 조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T.et al. 2000.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로서, 가닥교체 (strand displacement) 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4 개의 프라이머 세트 (한국 특허 제612551호 등 참고)를 표준 방법으로 하여, 6개의 프라이머 세트를 이용한 방법 (Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고)을 모두 포함할 수 있다.
상기 최소 4 개의 프라이머는 다음과 같다:
FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer)
또한 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있고, 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머의 특징 및 기능에 대하여는 공지된 문헌을 참고할 수 있다(Notomi et al., 2000; 및 Nagamine et al.,2002).
본 발명에 따른 프라이머 세트는 황색포도상구균의 특정 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 프라이머로 구성되며, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는, 황색포도상구균에 높은 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공할 수 있다.
기존의 PCR을 대신하는 유전자 증폭법으로서 LAMP는 PCR이나 realtime PCR과 유사한 원리로 정확도 및 민감도가 높고 대형 장비를 이용하지 않고도 짧은 반응 시간으로 유전자를 증폭시킬 수 있으며, 결과를 색깔에 의해 직관적으로 바로 확인이 가능하여 신속하고 간편한 이점이 있다.
또한 6개의 프라이머는 표적의 다른 부위를 인식함으로써 민감도 및 특이도가 뛰어나다. 따라서 본 발명은 LAMP 반응을 이용하여 황색포도상구균의 감염 여부를 높은 정확도 및 민감도로 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 프라이머는 검출 가능한 표지 물질로 표지된 것일 수 있다. 상기 표지 물질은 형광물질, 화학발광물질 또는 발색효소일 수 있다. 형광물질은 구체적으로 예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRIC), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate), 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate, RITC), 시아닌 색소(Cy3, Cy5 등), 플루오레세인 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레세인-5-일, 2',7'-디클로로플루오레세인-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, 피코에리트린(Phycoerythrin, PE), 로다민 또는 아세틸아미노플루오렌일 수 있다.
또한 화학발광물질은 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 또는 루시게닌일 수 있고, 발색효소는 알칼리 포스파타제, 산성 포스파타제, 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 또는 β-글루코시다제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 표지 물질은 신속하고 간편한 검출을 위해 육안으로 식별가능한 화학발광물질일 수 있다.
등온증폭법(isothermal amplification)은 기존의 PCR 방법과 유사하나, PCR 방법이 변성(denauration), 어닐링(annealing), 신장(elongation)의 세 단계를 반복 수행하며 유전자를 증폭시키기 위하여 조성물의 온도를 변화시켜야 하는 것과 달리, 고정된 일정 온도에서 어닐링 및 신장이 가능하다는 장점을 갖는다. 등온증폭법은 핵산말단가수분해효소(exonuclease)의 활성을 갖는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로써, 열에 의존하지 않고 주형 DNA의 이중나선 구조를 변성시킬 수 있다. 즉, 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도 변화를 필요로 하지 않기 때문에 고가의 장비 없이 유전자를 증폭시킬 수 있다.
일반적으로 등온증폭법은 특정 온도 범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 109개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 유지 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한, 등온증폭법은 수행 시간이 짧고 육안으로 관찰할 수 있다는 점에서 간편하게 DNA를 증폭 및 확인할 수 있다.
이 중에서도 고리매개 등온증폭법 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 내부 프라이머(inner primer, FIB/BIF) 및 외부 프라이머(outer primer, F3/B3) 사용하여 수행되는 증폭 방법의 하나이다. 상기 LAMP는 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥 변위가 발생하고, 이에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성된다. 이를 매개로 증폭 반응이 일어나는 것이다.
도 1을 참조하면, isoQuark mini장비를 이용하여, LAMP를 수행함으로써 S. aureus 균주를 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 2를 참조하면, CFX96장비를 이용하여, LAMP를 수행함으로써 S. aureus 균주를 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
구체적으로, ① 내지 ③ 곡선 S. aureus genomic DNA(FAM)의 copy number 및 ④ 내지 ⑥ 곡선 β-액틴(HEX)의 copy number는 하기와 같다(⑦: NTC(No template control; distilled water)).
①105 copies/㎕, ②104 copies/㎕, ③103 copies/㎕, ④105 copies/㎕, ⑤104 copies/㎕, ⑥103 copies/㎕
본 발명은 상술한 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 포함하는 아토피 진단용 조성물을 제공할 수 있다. 이 경우에도 상기 프라이머 세트는 LAMP 수행에 이용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부염 유발 원인균의 특정 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 프로브를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 황색포도상구균의 유전자의 특정 염기서열에 완전히(perfectly) 상보적인 서열 또는 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열을 이용할 수 있다.
일반적으로 혼성화에 의해 형성되는 이중가닥(duplex)의 안정성은 말단의 서열이 일치됨에 따라 결정되는 경향이 있기 때문에, 표적 서열의 3′-말단 또는 5′-말단에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 이때 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 황색포도상구균의 표적 핵산과 상보적인 염기 서열을 포함하는 프로브는 서열번호 7로 표시될 수 있다.
또한 본 발명은 황색포도상구균의 특정 핵산 서열에 상보적으로 결합하는 프라이머 및 molecular beacon 프로브를 이용하여, LAMP를 통해 황색포도상구균을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 표적 핵산의 검출 및 정량용 진단 키트를 제공할 수 있다. 이를 통해 아토피 피부염을 신속하게 진단할 수 있어 아토피 피부염의 증상 개선 및 치료에 도움을 줄 수 있다.
또한 본 발명의 일 구현예에 있어서, 아토피 진단용 조성물은 프라이머 등의 구조를 안정하게 유지시키는 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 아토피 진단용 조성물을 포함하는 키트는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합된 것일 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
키트는 당업자에게 알려진 제조방법에 의해 제조될 수 있고, 정량 분석을 위해 표지 물질로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 표지 물질로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 표지 물질의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
아울러 본 발명은 본 명세서에 개시된 프라이머 세트를 이용한 황색포도상구균 검출 방법(아토피 진단을 위한 정보제공방법)을 제공할 수 있다.
상기 검출 방법은 황색포도상구균의 감염이 의심되는 대상체의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 제공하는 단계; 상기 생물학적 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 상기 LAMP 반응 수행에 따른 증폭 산물을 검출하는 단계; 상기 증폭 산물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우 이를 황색포도상구균의 감염으로 판단하는 단계;를 포함할 수 있다.
LAMP 반응은 이 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수도 있다.
본 발명에 따른 LAMP 반응은 55 내지 70 ℃, 57 내지 70 ℃, 59 내지 70 ℃, 61 내지 70 ℃, 55 내지 68 ℃, 57 내지 68 ℃, 59 내지 68 ℃, 61 내지 68 ℃, 또는 61 내지 66 ℃에서 수행될 수 있다. 또한, LAMP 반응은 10 내지 90분, 20 내지 90분, 25 내지 90분, 10 내지 80분, 20 내지 80분, 25 내지 80분, 10 내지 70분, 20 내지 70분, 25 내지 70분, 10 내지 65분, 20 내지 65분 또는 25 내지 65분 동안 수행될 수 있다.
LAMP 반응은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응물은 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 LAMP 반응 결과의 분석은 실시간 또는 반응 종료 후에 가능하고, 증폭 여부는 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 측정 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다. 음성 대조군과 비교하여 색이 변화하거나 탁도가 증가한 경우 증폭이 된 것으로, 이 경우 황색포도상구균 양성으로 판단함으로써, 아토피 피부염으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 색 변화를 관찰하여 황색포도상구균의 유무를 파악하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계 이후, 전기영동하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
제조예 1. 황색포도상구균의 genomic DNA 시료 준비
S. aureus 표준 균주 (ATCC no. 29213) 를 LB BROTH (엘피에스솔루션, 한국) 에서 37 ℃, 18시간동안 150rpm으로 진탕 배양하고, DNeasy Blood & Tissue Kit (퀴아젠, 미국) 를 사용하여 표준 균주 배양액에서 S. aureus의 genomic DNA 추출하였다.
실시예 1. 황색포도상구균 특이적 프라이머 설계
LAMP을 사용하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검출하기 위해 먼저 프라이머를 설계 및 제작하였다. 구체적으로 NCBI를 통해 확보한 S. aureus 및 β-액틴 유전자의 염기서열 데이터베이스로부터 황색포도상구균의 보존적 영역을 탐색하여 황색포도상구균 특이 유전자 (nucA gene)를 표적으로 하는 하기 표 1에 기재된 프라이머 세트 및 대조군으로서 표 2에 기재된 β-액틴 유전자에 특이적 프라이머 세트 및 프로브를 제작하였다.
[표 1] S. aureus의 특이 유전자 프라이머 및 프로브 설계
[표 2] β-액틴 유전자 프라이머 및 프로브 설계
실시예 2. LAMP를 이용한 표적 핵산의 검출
(1)아토피 진단용 조성물 제조
상기 제작된 프라이머 및 프로브를 포함하여 총 볼륨이 20㎕이 되도록 LAMP 2x Master Mix(엘피스바이오텍, 한국) 10㎕, 프라이머/프로브(바이오니아, 한국) 7㎕, S. aureus genomic DNA 시료 2㎕, β-액틴(바이오니아, 한국) 시료 1㎕를 첨가하여 아토피 진단용 조성물(증폭용 조성물)을 제조하였다.
(2)LAMP반응을 통한 표적 핵산의 증폭 및 검출
LAMP 반응은 isoQuark mini(RevoSketch 사, 한국) 및 CFX96™ Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 30분간 반응시킨 후 최종 LAMP 산물을 수득하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, isoQuark mini에서는 S. aureus genomic DNA 3.31×103 기준, Ct값이 8, β-액틴 4.48×103 기준, Ct값이 7인 증폭곡선 양상을 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, CFX96에서는 S. aureus genomic DNA 3.31×103 기준, Ct값이 6~7, 대조군의 Ct값이 6~7인 증폭곡선 양상을 나타내었다.
본 발명 실시예 1을 통해 합성된 프라이머 세트는 LAMP 반응으로 S. aureus 균주의 nucA 유전자를 증폭시킴에 따라, 이를 통해 S. aureus 균주를 검출하는 데 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 본 발명에 따른 프라이머 세트의 특이도 확인
본 발명에서 프라이머 세트의 특이도는 in silico 상으로 NCBI에서 제공하는 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 3 내지 10에 나타난 바와 같이, S. aureus 진단용 프라이머의 특이도는 S. aureus 균주 및 nucA 유전자와 95~100%의 특이성을 나타내었다. S. aureus 진단용 프로브는 LB 프라이머를 변형한 것이므로 도 10의 LB 프라이머의 특이성 결과로 갈음할 수 있다. 하우스키핑 유전자인 β-액틴은 보편적으로 모든 유기체의 세포에서 발현되므로 BLAST의 'Choose Search Set'에서 'Organism'을 'Homo sapiens (taxid: 9606)'로 설정하였으며, 도 11 내지 18에 나타난 바와 같이, β-액틴 진단용 프라이머의 특이도는 Homo sapiens 및 β-액틴과 94~100%의 특이성을 나타내었다. β-액틴 진단용 프로브는 LF 프라이머를 변형한 것이므로 도 17의 LF 프라이머의 특이성 결과로 갈음할 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트는 S. aureus 균주를 선별하여 검출하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상 설명한 것은 본 발명에 의한 본 발명에 따른 황색포도상구균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 아토피 진단용 조성물, 아토피 진단용 키트 및 아토피 진단을 위한 정보제공방법을 실시하기 위한 실시예에 불과하며, 이에 한정되지 않고, 이하의 청구범위에서 청구하는 바와 같이 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변경 실시가 가능한 범위까지 본 발명의 기술적 사상이 있다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머는 고리매개 등온증폭(LAMP) 반응에 이용되는, 프라이머 세트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머는 검출 가능한 표지 물질로 표지된, 프라이머 세트.
  4. 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트를 포함하는 아토피 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    황색포도상구균의 표적 핵산과 상보적인 염기 서열을 포함하는 프로브를 더 포함하는, 아토피 진단용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 프로브는 서열번호 7로 표시되는 염기 서열로 이루어진, 아토피 진단용 조성물.
  7. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 아토피 진단용 조성물을 포함하는 아토피 진단용 키트.
  8. 생물학적 시료 및 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 LAMP(고리 매개 등온 증폭) 반응을 수행하는 단계; 및 상기 LAMP 반응 수행에 따른 증폭 산물을 검출하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우 이를 황색포도상구균의 감염으로 판단하는 단계;를 포함하는 아토피 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계 이후, 전기영동하는 단계를 더 포함하는, 아토피 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 색 변화를 관찰하여 황색포도상구균의 유무를 파악하는 단계;를 포함하는, 아토피 진단을 위한 정보제공방법.
KR1020220149167A 2022-11-10 2022-11-10 황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도 KR20240072313A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220149167A KR20240072313A (ko) 2022-11-10 2022-11-10 황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220149167A KR20240072313A (ko) 2022-11-10 2022-11-10 황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240072313A true KR20240072313A (ko) 2024-05-24

Family

ID=91321300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220149167A KR20240072313A (ko) 2022-11-10 2022-11-10 황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20240072313A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100612551B1 (ko) 1999-11-08 2006-08-11 에이켄 카가꾸 가부시끼가이샤 핵산의 합성방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100612551B1 (ko) 1999-11-08 2006-08-11 에이켄 카가꾸 가부시끼가이샤 핵산의 합성방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Notomi, T.et al. 2000.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2005334466B2 (en) Diagnosis and prognosis of infectious disease clinical phenotypes and other physiologic states using host gene expression biomarkers in blood
JP2010532665A (ja) 細菌性および真菌性敗血症の病原菌の高感度な増幅および検出用の核酸配列およびその組合せ
US8911946B2 (en) Detection of antibiotic-resistant microorganisms
US20100075305A1 (en) Detection of bacterium by utilizing dnaj gene and use thereof
JP2011510630A (ja) 試料中に存在する目的ヌクレオチド配列を検出するための核酸プローブの使用
WO2015023616A2 (en) Method for comprehensive, quantitative, and highly sensitive discrimination of nucleic acid sequences in homogeneous and heterogeneous populations
US8790899B2 (en) Real-time PCR assays for rapid detection and differentiation of the Clostridium botulinum toxin genes A, B, E, and F
KR102323375B1 (ko) 다중 프로브
US9024002B2 (en) Compositions and methods for detection of Salmonella species
CN1724686B (zh) 用于检测肺炎支原体的靶序列和试剂盒
US11459620B2 (en) Compositions and methods for detection of Mycobacterium avium paratuberculosis
Zhao et al. Rapid oligonucleotide suspension array-based multiplex detection of bacterial pathogens
KR20170030190A (ko) Lamp를 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 및 그 용도
KR20240072313A (ko) 황색포도상구균 감염 진단을 위한 rt-lamp용 조성물 및 이의 용도
EP2839025B1 (en) Compositions and methods for detection of microorganisms of the mycobacterium avium complex excluding mycobacterium avium paratuberculosis
Bush et al. Detection of Escherichia coli rRNA using target amplification and time-resolved fluorescence detection
US20100330573A1 (en) Optimized oligonucleotides and methods of using same for the detection, isolation, quantification, monitoring and sequencing of bordetella
US20140272940A1 (en) Methods for detection of multiple target nucleic acids
EP3066210B1 (en) Detection of streptococcus pneumoniae
Anjorin et al. Understanding Nucleic Acid Amplification Techniques in the Detection of Influenza viruses in Developing Countries
CN111100938A (zh) 人类肠道病原菌感染诊断用乙型副伤寒沙门菌特异性基因探针
CN111100937A (zh) 人类肠道病原菌感染诊断用甲型副伤寒沙门菌特异性基因探针
CN111172300A (zh) 人类肠道病原菌感染诊断用丙型副伤寒沙门菌特异性基因探针
CN111100936A (zh) 人类肠道病原菌感染诊断用伤寒沙门菌特异性基因探针