KR20240069453A - 리소좀 표적화 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

리소좀 표적화 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20240069453A
KR20240069453A KR1020220150968A KR20220150968A KR20240069453A KR 20240069453 A KR20240069453 A KR 20240069453A KR 1020220150968 A KR1020220150968 A KR 1020220150968A KR 20220150968 A KR20220150968 A KR 20220150968A KR 20240069453 A KR20240069453 A KR 20240069453A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ndi
group
lyso
conjugate
cells
Prior art date
Application number
KR1020220150968A
Other languages
English (en)
Inventor
유자형
바타크리쉬나 자나
진성언
Original Assignee
울산과학기술원
Filing date
Publication date
Application filed by 울산과학기술원 filed Critical 울산과학기술원
Publication of KR20240069453A publication Critical patent/KR20240069453A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg

Abstract

암 세포 내 리소좀을 표적화하여 자가 조립을 통한 세포사멸을 유도하는 접합체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

리소좀 표적화 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A Lysosomal-Targeting Conjugate and Pharmaceutical Composition For Preventing or Treating Cancer Comprising Thereof}
암 세포 내 리소좀을 표적화하고 리소좀 내 자가조립을 통해 세포 자멸을 유도하는 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이며, 지금까지 암 치료는 의학의 주요 과제 중 하나이다. 다양한 치료법 중 화학 요법(chemotherapy)은 전 세계적으로 1차 치료 요법으로 사용되어 왔으며 암 환자에 대해 치료율이 높다. 그러나 기존의 화학요법 치료제는 낮은 치료 지표, 비특이적 표적화, 상당한 표적-외 독성, 체내에서의 빠른 약물 청소(drug clearance), 낮은 암 선택성, 및 종양 조직 내 불충분한 약물 축적 등 심각한 한계를 가지고 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 암세포에 선택적으로 축적될 수 있고, 표적-외 독성을 최소화시키며, 치료 지표를 증가시킬 수 있는 표적화된 화학요법 약물이 유망한 대안으로 개발되고 있다. 그러나, 그들은 약물 또는 약물 칵테일에 대한 강력한 내성이 나타나는 경우 여전히 한계를 나타낸다.
분자 자가조립 (Self-assembly)은 약물 전달, 조직공학, 유전자 치료 등의 다양한 생의학 분야에 적용될 수 있는 기능성 나노재료를 생성하는데 있어서 주목 받는 분야이다. 대부분 분자의 나노 구조로의 자가조립은 용매에서 연구되어 왔지만, 합성 양친매성 펩타이드의 세포 내부에서의 조립은 많은 연구가 되어 있지 않아서 세포 기능을 조절하기 위한 생체 모방의 조립 분야에 촉망받는 연구 주제가 되고 있다(한국등록특허 10-1743399).
최근 미토콘드리아, 소포체, 핵, 및 리소좀 등의 세포소기관을 표적화하는 암 치료의 다양한 전략이 개발되고 있다. 그러나, 대부분의 세포 소기관-표적화 화학요법은 여전히 낮은 치료 지표 및 낮은 생체 내 효능을 갖는다. 또한, 다양한 세포소기관 중, 리소좀-표적화 암 치료는 매우 적게 연구되어 왔으며, 이는 아마도 치료제의 엔도좀과 리소좀 내에서의 분해로 인한 것일 수 있다. 리소좀은 진핵세포의 중요한 세포소기관이며, 소화 및 노폐물 제거를 담당한다. 이의 악성 형질 전환(Malignant transformation)은 분해 경로의 조절이상(deregulation)으로 인해 리소좀 막의 구조와 기능을 변화시키고, 이는 정상 세포에 비해 암 세포막을 더 약하게 만들며, 리소좀 막 투과(lysosomal membrane permeabilization, LMP)가 더 용이하게 하여, 암세포가 리소좀-표적화 항암 약물에 더욱 민감하게 만든다. 따라서, 리소좀 표적화를 통한 세포 사멸은 전형적인 카스파제-의존적 세포사멸 경로를 우회하며, 이에 따라 약물-내성 암 치료에 대해 새로운 치료 전략이 될 수 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 양친매성 리소좀-표적화 접합체를 개발하였고, 이는 두개의 효과적인 전략, 즉 효소-지시 자가 조립(Enzyme-instructed self-assembly, EISA) 및 세포소기관 국소화-유도 자가 조립(organelle localization-induced self-assembly, OLISA)을 결합한 거대분자적 접근을 통해 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 리소좀 표적화 모이어티 및 (Xaa)n로 표시되는 펩타이드를 포함하는 접합체 (conjugate)로서, 상기 리소좀 표적화 모이어티는 상기 (Xaa)n의 C-말단에 아마이드 결합으로 연결되어 있으며 카텝신 B의 기질인 것이며, 상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 Xaa의 개수로서, 2 내지 200의 정수이고, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 아미노산은 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것이고, 상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것인 접합체 (conjugate)를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 리소좀 표적화 모이어티 및 (Xaa)n로 표시되는 펩타이드를 포함하는 접합체 (conjugate)로서, 상기 리소좀 표적화 모이어티는 상기 (Xaa)n의 C-말단에 아마이드 결합으로 연결되어 있으며 카텝신 B의 기질인 것이며, 상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 Xaa의 개수로서, 2 내지 200의 정수이고, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 아미노산은 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것이고, 상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것인 접합체 (conjugate)를 제공한다.
상기 펩타이드(Peptide)는 3 내지 200개의 아미노산이 펩타이드 결합을 통해 연결된 것을 의미하며, (Xaa)n-Lyso로 표시될 수 있다. 상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 개수로서, 2 내지 200, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 또는 2 내지 3의 정수일 수 있고, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 n은 2이고 상기 Xaa는 동일한 페닐알라닌, 알라닌, 사이클로헥실 알라닌, 또는 발린이 펩타이드 결합을 이루는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드는 아미노산의 N-말단에서 C-말단 순으로 각각의 아미노산 또는 아미노산의 R 그룹에 C3-C10 사이클로알킬기가 결합한 변이체 (C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체)가 펩타이드 결합으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 리소좀 표적화 모이어티의 말단 아미노산의 C-말단의 카르복실기의 하이드록시기는 아민기, 알코올기, 에테르기, 및 아세틸기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것일 수 있으며, 특정한 화학적 그룹이 결합되지 않을 수도 있으며, 이외에 다른 화학적 그룹이 화학적 결합을 이룬 것 일 수도 있으며, 예컨대 아민기가 결합한 것일 수 있다.
상기 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체는 탄소의 숫자가 3 내지 10인 사이클로알킬이 상기 아미노산의 R 그룹에 결합한 것일 수 있으며, 예컨대 알라닌의 R 그룹인 메틸기의 탄소에 사이클로헥실이 결합한 사이클로헥실 알라닌 (Cyclo헥실 alanine; CHA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 펩타이드는 펩타이드에 내부에 존재하거나 다른 펩타이드에 존재하는 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조는 단백질을 구성하는 아미노산 서열간의 상호작용으로 형성되는 2차 구조의 하나로서 수평적으로 연결되는 인정 분자간의 수소결합을 통해 형성된다. 상기 베타 쉬트 2차 구조는 많은 인간의 질병에서 단백질 엉김 (aggregates) 또는 섬유 형성과 관계 있는 것으로 알려져 있다.
상기 리소좀 표적화 모이어티(moiety)는 세포 내부의 리소좀으로 해당 물질을 표적화시키는 기능을 하는 것을 의미하며, 예컨대 RRRRK(Arg-Arg-Arg-Arg-Lys)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 리소좀 표적화 모이어티의 말단 아미노산의 C-말단의 카르복실기의 하이드록시기는 아민, 알킬기, 알코올기, 케톤기, 아실기, 에스터기, 에테르기, 아세틸기, 아실 할라이드기, 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 접합체는 상기 리소좀 표적화 모이어티로 인하여 세포 내 리소좀으로 들어갈 수 있으며, 상기 리소좀 내부로 들어간 접합체는 암세포 특이적이게 암세포의 리소좀 내부에서 자가조립(self-assembly)체를 형성하여 세포 자멸을 유도할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 접합체가 암 세포 특이적으로 리소좀을 표적화하며 리소좀의 손상을 유발함을 확인하였다.
상기 암 세포 내 리소좀에서 자가조립체의 형성에 관하여, 상기 리소좀 내부로 들어간 접합체는 리소좀 내 카텝신 효소와 반응하는 것일 수 있으며, 카텝신 효소에 의해 펩타이드의 절단(cleavage)이 일어나며, 그로 인해 자가조립 경향이 더욱 강화된 형태로 변환하는 것일 수 있다. 암 세포의 경우, 특히 리소좀에서 카텝신 B가 과발현되어 있으며, 이는 종양 발생의 모든 단계에 과발현되어 있다. 따라서, 상기 펩타이드가 상기 리소좀 표적화 모이어티를 통해 카텝신 B와 반응하여 리소좀 표적화 모이어티의 일부가 절단되고, 이에 따라 임계 응집 농도(aggregation concentration, CAC) 값이 감소함에 따라 양친매성 펩타이드의 국소적 농도가 증가하고, 이를 통해 자가조립 과정이 가속되어 일어나는 것일 수 있다. 반면, 정상세포의 경우에는 카텝신 B가 과발현되어 있지 않기 때문에, 카텝신 B로 인한 리소좀 표적화 모이어티의 절단 과정이 나타나지 않으며 따라서 펩타이드의 CAC가 충분히 감소하지 않아 자가조립체가 형성되지 않는다. 일 실시예에 따르면, 카텝신 B의 존재 하, 암 세포 리소좀 내에서 본 발명의 접합체의 리소좀 표적화 모이어티 펩타이드가 절단되며, 이로 인해 임계 응집 농도(CAC)가 감소하고, 리소좀 내 섬유 구조가 형성됨을 확인하였다.
상기 리소좀 표적화 모이어티는 RRRRK일 수 있으며, 이는 상기 리소좀 내 카텝신 B와 반응하여 절단되어 자가 조립 경향이 더욱 강해지는 것일 수 있다.
상기 리소좀 표적화 모이어티의 아미노산 개수는 1 내지 상기 (Xaa)n-Lyso로 표시되는 펩타이드에 존재하는 아민기 개수 범위에서 선택된 정수일 수 있다. 상기 펩타이드의 C 말단에 아민기가 존재하는 경우, 상기 펩타이드에 연결된 미토콘드리아 표적화 모이어티의 개수는 1 내지 상기 리신 아미노산의 개수 (m)에 1을 더한 숫자인 m+1개 이내의 정수일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드에 연결된 미토콘드리아 표적화 모이어티의 개수는 1 개 또는 2개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 펩타이드 N-말단은 자가조립 강화 모이어티와 아마이드 결합으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자가조립 강화 모이어티는 상기 접합체의 자가조립 경향을 향상시켜주는 구조를 의미한다. 본 발명에서 상기 자가조립 강화 모이어티는 상기 펩타이드의 N-말단에 아마이드 결합으로 연결된 것일 수 있으고, NDI(naphthalene diimide), pyrene, NBD (4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole), perylene, naphtalene, coronene, 및 방향족으로 이루어진 화합물로 평평한 구조를 가지고 있어 파이결합으로 서로 쌓이기 쉬운 자가조립 강화 모이어티로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이 될 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 접합체는 종양 선택성 펩타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 종양 선택성 펩타이드는 상기 리소좀 표적화 모이어티에 결합된 것일 수 있으며, 상기 RGD는 상기 리소좀 표적화 모이어티의의 Lys-말단에 결합된 것일 수 있다. 상기 종양 선택성 펩타이드는 RGD (Arg-Gly-Asp)를 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 종양 표적화 펩타이드의 C-말단 카르복실기의 하이드록시기는 아민, 알킬기, 알코올기, 케톤기, 아실기, 에스터기, 에테르기, 아세틸기, 아실 할라이드기, 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 자가조립 강화 모이어티, (Xaa)n으로 표시되는 펩타이드, 리소좀 표적화 모이어티, 및 종양 선택성 펩타이드는 이들 모두는 직접연결 된 것이거나, 링커를 통하여 연결된 것 일 수 있다. 상기 링커는 탄소수 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4, 또는 2 내지 3인 알킬기 (alkyl), 알켄기 (alkene), 알카인기 (alkyne)가 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 링커는 한 말단에 펩타이드와 아마이드 결합 등의 적절한 결합을 형성할 수 있는 관능기 (functional group)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표현될 수 있다:
[화학식 1]
[화학식 2]
본 발명에서 상기 접합체는 양친매성을 나타낼 수 있으며, 상기 양친매성은 극성 및 비극성 물질 모두에 대해 모두　친화성을 갖는 상태를 의미하며, 본 발명의 접합체에서는 펩타이드에 포함된 비극성 아미노산과 형광단이 소수성을, 극성 아미노산이 친수성을 띄어서 접합체 전체적으로 양친매성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 접합체는 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 이성질체는 분자식은 같으나 공간배열이 동일하지 않은 화합물을 의미하며, 바람직하게는 입체 이성질체 (Stereoisomer)를 의미한다. 입체 이성질체에는 거울상 이성질체(Enantiomer)와 부분입체 이성질체 (Diastereomer)가 존재한다.　거울상 이성질체는 오른손과 왼손의 관계처럼 그 거울상과 서로 겹쳐지지 않는 이성질체를 말하며, 이를 광학 이성질체 (Optical　isomer)라고도 한다. 또한 구조에 따라 D-거울상 이성질체 또는 L-거울상 이성질체로 구분될 수 있다. 부분입체 이성질체는 거울상　관계가 아닌 입체 이성질체를 말하며, 구성 원자들의 공간적 배열이 다른 부분이성질체와 사이클로알케인과 알켄 화합물에서 탄소-탄소 결합의 자유롭지 못한 회전 때문에 원자의 공간 배열이 달라 생긴　cis-trans　이성질체로 나눌 수　있다.
다른 양상은 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 접합체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 산 또는 염기의 부가염 및 그의 입체화학적 이성체 형태를 모두 포함하며, 예컨대, 유기산 또는 무기산의 부가염일 수 있다. 상기 염에는 투여 대상에서 모화합물 (parent compound)의 활성을 유지하며 바람직하지 못한 효과를 유발하지 않는 염이라면 어느 것이든 포함되는 것으로, 특별히 제한되는 것이 아니다.
이러한 염에는 무기염과 유기염이 포함되며, 예를 들어, 아세트산, 질산, 아스파트산, 술폰산, 설퓨릭산, 말레산, 글루탐산, 포름산, 숙신산, 인산, 프탈산, 탄닌산, 타르타르산, 히드로브롬산, 프로피온산, 벤젠술폰산, 벤조산, 스테아르산, 락트산(lactic acid), 비카르본산, 비설퓨릭산, 비타르타르산, 옥살산, 부틸산, 칼슘 이데트, 카르보닉산, 클로로벤조산, 시트르산, 이데트산, 톨루엔술폰산, 푸마르산, 글루셉트산, 에실린산, 파모익산, 글루코닉산, 메틸니트릭산, 말론산, 히드로클로린산, 히드로요도익산, 히드록시나프톨산, 이세티온산, 락토비오닉산, 만델산, 점액산, 나프실릭산, 뮤코닉산, p-니트로메탄설포닉산, 헥사믹산, 판토테닉산, 모노히드로겐인산, 디히드로겐인산, 살리실산, 술파민산, 술파닐린산, 메탄술폰산일 수 있다.
또한, 상기 염의 형태로는, 암모늄염, 리튬염, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염 및 칼슘염과 같은 알칼리 및 알칼리 토금속의 염, 예를 들어, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염과 같은 유기 염기를 갖는 염, 및 아르기닌, 리신과 같은 아미노산을 갖는 염을 포함한다. 또한, 상기 염 형태는 적당한 염기 또는 산으로 처리함으로써 유리 형태로 전환될 수도 있다.
상기 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 암 세포 내 리소좀에서 자가조립체를 형성하여 세포 자멸을 유도하는 것 일수 있다.
상기 세포 자멸 (apoptosis)은 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로, 세포의 괴사나 병적인 죽음으로서 화상과 타박, 독극물 등의 자극에 의해 일어나는 세포의 죽음인 네크로시스와는 구별되는 것으로서, 세포가 축소되면서 시작되어, 이후 인접하는 세포 사이에 틈새가 생기고, 세포 내에서는　DNA가 규칙적으로 절단되어 단편화되는 방법으로 세포가 사망하는 것을 말한다.
상기 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 카스파제-비의존성 경로를 통해 세포 자멸을 유도하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 접합체가 카스파제 억제제를 처리한 경우에도 암 세포 사멸 정도에 변화가 없음을 확인하였으며, 또한 본 발명의 접합체 존재 유무에 관계없이 세포 자멸 마커인 카스파제의 발현 정도에 변화가 없었음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 접합체가 카스파제-비의존성 경로를 통해 세포 자멸을 유도함을 확인하였다.
상기 약학적 조성물의 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 원발성암 또는 전이암일 수 있다. 상기 암은 자궁경부암, 유방암, 편평상피암, 대장암, 위암, 간암, 피부암, 전립선암, 유선암, 비인두 선암, 폐암, 또는 뇌종양으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 접합체가 여러 종류의 암 세포에 대해 사멸 효과를 나타냄을 확인하였다.
상기 약학적 조성물의 조성물의 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은 약물에 대해 내성을 갖는 암을 포함할 수 있으며, 상기 약물에 대해 내성을 갖는 암은 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 원발성암 또는 전이암일 수 있다. 상기 암은 자궁경부암, 유방암, 편평상피암, 대장암, 위암, 간암, 피부암, 전립선암, 유선암, 비인두 선암, 폐암, 또는 뇌종양으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 접합체가 약물 내성 암세포에 대해 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 의도한 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 있어서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학적 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
일 구현예는 경구 투여용 제형 또는 비경구 투여 제형으로 제형화된 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화 된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분 (즉, 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염) 이외에 제형화에 사용 가능한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제형화에 사용될 수 있는 부형제는 담체, 비히클, 희석제, 용매, 예를 들어 1가 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리세롤 및 식용 오일, 예를 들어 대두유, 코코넛유, 올리브유, 잇꽃유, 면실유, 유성 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트; 결합제, 애주번트, 가용화제, 증점제, 안정화제, 붕해제, 활택제, 윤활제, 완충제, 유화제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 착색제, 풍미제, 코팅제, 방부제, 항산화제, 가공제, 약물 전달 개질제 및 향상제(enhancer), 예를 들어 인산칼슘, 마그네슘 스테이트, 활석, 단당류, 이당류, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트로스, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스, 이온 교환 수지 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 다양한 경구 투여 제형의 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신 등의 희석제나, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제나, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.
그리고, 상기 약학적 조성물은 비경구투여 제형의 형태로 제형화 될 수도 있는데, 이러한 경우 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구투여 방법에 의해 투여된다. 이때, 상기 비경구투여 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학적 조성물은 유효 성분이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
상기 약학적 조성물 내의 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 약학 조성물의 사용 목적, 제형의 형태 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 약학 조성물의 전체 중량 기준으로 0.001 내지 99중량%, 0.001 내지 90중량%, 0.001 내지 50중량%, 0.01 내지 50중량%, 0.1 내지 50중량%, 또는 1 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 투여되는 유효성분의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 약물의 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 사람을 포함하는 포유류에 대하여, 하루에 0.01 내지 500 ㎎/㎏(체중)의 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 유효량은 원하는 효과, 예를 들어 암의 치료 및/또는 예방 효과를 얻을 수 있는 양에 따를 수 있다. 상기 약학적 유효량은 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로(예를 들어, 정맥 주사, 근육 주사 등)를 통해 투여될 수 있다.
일 양상에 따른 암 세포 내 리소좀 표적화 접합체는, 암 세포 내 리소좀에서 자가조립하여 암 세포 특이적으로 세포 사멸을 유도하며, 약물 내성 암에 대해서도 암 세포 사멸 효과를 나타내는 바, 암 예방 또는 치료 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 NDI-Lyso의 작용기전을 나타낸 도이다.
도 2는 카텝신 B에 의해 유도되는 NDI-Lyso의 자가조립을 확인한 결과로서, 도 2a는 카텝신 처리 전후의 TEM 이미지, 도 2b는 섬유의 길이 분포, 및 도 2c는 임계응집농도(CAC)를 나타낸 도이다.
도 3은 HeLa 세포에 NDI-Lyso를 처리한 뒤 시간 경과에 따른 변화 양상을 분석한 결과로서, 도 3a는 분석적 HPLC 결과 그래프이며, 도 3b는 MALDI-TOF 질량 분석 결과 그래프이다.
도 4는 접합체의 MALDI-TOF/TOF 분석을 통한 질량 분석 결과를 나타낸 도로서, 도 4a는 NDI-Lyso, 도 4b는 NBD-Lyso, 도 4c는 FF-Lyso, 도 4d는 C16-Lyso, 및 도 4e는 Py-Lyso의 결과이다.
도 5는 Lysotracker Red를 사용하여 공동-국소화를 분석한 결과로서, 도 5a는 HeLa 세포에 NDI-Lyso, NBD-Lyso, NDI-Lyso+NBD-Lyso를 각각 처리한 후의 공초점 이미지이며, 도5b는 HEK293 세포에 NDI-Lyso를 처리한 후의 공초점 이미지이다.
도 6은 NDI-Lyso 처리 전 후의 HeLa 세포에 대한 TEM 이미지이다.
도 7은 각각 항-Lamp1 항체, Acridine orange, 및 lyso sensor을 사용하여 NDI-Lyso 처리 전 후의 리소좀 막의 완전성을 형광 이미지를 통해 확인한 결과이다.
도 8은 유세포 분석을 통해 NDI-Lyso 처리 전 후의 리소좀 수를 분석한 결과이다.
도 9는 DHE(dihydroethidium)을 통해 NDI-Lyso 처리 전 후의 세포에서의 ROS 생성을 분석한 결과이다.
도 10은 여러 암 세포, 약물 내성 암 세포 및 정상 세포에서의 NDI-Lyso IC50(the half inhibitory maximum concentration) 값을 나타낸 그래프이다.
도 11은 HeLa 세포에서 NDI-Lyso 농도에 따른 LDH 방출을 측정한 그래프이다. 3회 반복 측정(n = 3)으로 얻은 데이터이며 평균 ± SEM의 값으로 나타냈다.
도 12a는 NDI-Lyso 처리 후 HeLa 세포에서 다양한 카스파제-의존성 세포 사멸 마커에 대해 웨스턴 블로팅 한 결과이며, 도 12b는 NDI-Lyso 및 NDI-Lyso+카스파제 억제제 처리 후 유세포 분석을 통한 Annexin V/PI 분석 결과이다.
도 13은 NDI-Lyso 농도에 따른 세포 생존률을 분석한 결과로서, 도 13a는 HeLa 세포, 도 13b는 HEK293세포, 및 도 13c는 HeLa 세포에 카텝신 B 억제제를 처리한 결과이다.
도 14a 및 도 14b는 다양한 암 세포, 약물 내성 암세포 및 정상세포에 대해 NDI-Lyso 농도에 따른 세포 생존률을 분석한 결과이다. 여기서, SK-BR-3, MDA-MB-468, SCC7, MCF7, HT-29, MDA-MB-231, 및 4T-1은 암 세포주이며, IMR90은 정상세포, MCF7-ADR 및 SNU620-ADR300은 약물 내성 암 세포주이다.
도 15는 형광 현미경을 통한 Annexin V/PI 분석 결과이다. 도 15a는 NDI-Lyso 처리 전의 결과이며, 도 15b는 24시간동안 NDI-Lyso 20μM를 처리한 결과이다.
도 16은 NDI-R3, NDI-K5, FF-Lyso, C16-Lyso, 및 Py-Lyso를 각각 처리한 뒤 농도에 따른 세포 생존률을 분석한 결과이다.
도 17은 NDI-R3, NDI-K5, FF-Lyso, C16-Lyso, 및 Py-Lyso 용액에 카텝신 B를 처리하기 전 후의 TEM 이미지이다.
도 18은 NDI-Lyso 및 Py-Lyso를 HeLa 세포에 각각 처리한 뒤 농도에 따른 세포 생존률을 분석한 결과이다.
도 19a는NDI-Lyso 및 NDI-R3의 섬유 구조의 Coarse-grained (CG) 모델을 나타낸 도이며, 도 19b는 NDI-Lyso 및 NDI-R3의 섬유 구조 내 구아니딘-페닐, 구아니딘-NDI, 구아니딘-구아니딘의 RDF 그래프이며, 도 19c는 NDI-Lyso 및 NDI-R3의 섬유 구조에서 페닐과 펩타이드 사이의 결합 부위의 수를 나타낸 그래프이며, 도 19d는 NDI-Lyso 및 NDI-R3의 섬유 표면 상 각 성분의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 20a는 리소좀 막에서 NDI-Lyso의 초기 및 최종(2.25μs) 배열 및 결함 영역의 xy 평면을 나타낸 것이며, 도 20b는 NDI-R3의 초기 및 최종(2.25μs) 배열 및 결함 영역의 xy 평면을 나타낸 것이며, 도 20c는 시간에 따른 NDI 분자에 의해 유도된 기공의 면적을 나타낸 그래프이며, 도 20d는 리소좀 막의 위치 에너지를 나타낸 그래프이며, 및 도 20e는 리소좀 막과 NDI 분자의 페닐 그룹 사이의 상호작용 에너지를 나타낸 도이다.
도 21a는 HeLa 및 HEK293 세포주에서 NDI-Lyso 및 NDI-Lyso-RGD의 IC50 값을 나타낸 그래프이며, 도 21b는 IR-780-로딩된 NDI-Lyso-RGD, IR-780 및 PBS의 정맥내 주사 후 24시간 후 4T-1 이종이식 종양이 있는 누드 마우스의 in vivo 이미지이며, 도 21c는 IR-780-로딩된 NDI-Lyso-RGD, IR-780 및 PBS의 정맥내 주사 후 24시간 후 생체분포 이미지이다.
도 22a는 대조군, NDI-K5 처리군, NDI-Lyso-RGD 처리군의 평균 종양 중량을 나타낸 그래프이며, 도 22b는 체중 변화를 나타낸 그래프이며, 도 22c는 종양 성장 비율의 변화 그래프이다.
도 23은 HeLa, HT-29, MDA-MB-231, 4T-1 및 HEK293 세포주에서 NDI-Lyso-RGD를 처리한 후 세포 생존률을 분석한 그래프이다. HeLa, HT-29, MDA-MB-231, 및 4T-1은 암 세포주이며, HEK293은 정상 세포주이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험재료 및 기구
펩타이드 합성에 필요한 모든 아미노산은 Apex Bio, Houston 및 Chem-Impex, Chicago에서 구입하였다. 인간 간에서 추출한 카텝신 B, 재조합 항-LAMP1 항체 [EPR21026](ab208943), 염소 항-토끼 IgG H&L (Alexa Fluor® 488) (ab150077), Acridine Orange 염색 용액 (ab270791), Z-Phe-Phe-FMK (Cathepsin B 및 L 억제제 (ab141386)), 항-시토크롬 C 항체 [EPR1327] (ab133504), 항-카스파제-3 항체 [EPR18297] (ab184787), 항-카스파제-9 항체 [EPR18107] (ab202068) 및 항-베타 액틴 항체 [AC-15] (ab6276)는 abcam으로부터 구입하였다. Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor?? 488 &Propidium Iodide (PI), Alexa Fluor?? 488 Dextran; 10,000 MW, Lyso TrackerTM Red DND-99 및 LysoSensor?? Green DND-189은 ThermoFisher Scientific에서 구입하였다. Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide은 Merck-Sigma Aldrich에서 구입하였다. Diglycidyl ether of poly(propylene glycol), 736 epoxy resin, 3,4-epoxycyclohexanemethyl 3,4-epoxycyclohexanecarboxylate 4221, nonenyl succinic anhydride, 및 2-dimethylethanolamine은 Electron Microscopy Sciences, Philadelphia에서 TEM 준비를 위해 구입하였다. 기타 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich, Alfa Aesar, 및 Thermo Fisher, Korea에서 구입하였다. UV 및 형광 스펙트럼은 각각 UV-vis spectrometer (JASCO V-670) 및 Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer로부터 수득하였다. 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF/TOF)를 사용하여 분석되었다. NMR 용매는 받은 대로 사용되었고, 스펙트럼은 Agilent 400 MHz spectrometer에서 기록되었다. 스펙트럽은 SiMe4 관하여 잔류 용매 (CD3OD-d4의 경우 1H δ=3.34) 공명을 사용하여 내부적으로 참조되었다. 투과 전자 현미경 이미지는 BioTEM (JEM-1400)을 사용하여 얻었다. 형광 현미경 이미지는 LSM 780 공초점 현미경을 사용하여 얻었다.
실시예 1. NDI-Lyso의 고안 및 합성
(1.1) NDI-Lyso의 고안
NDI-Lyso는 3개의 중요한 모이어티로 구성된다: (1) Phe-Phe (FF): 자가조립 모이어티, (2) 헥실-나프탈렌 다이이미드-알라닌 (C6-NDI-Ala): 방향족성-방향족성 상호작용을 통한 자가조립 강화 모이어티, 및 (3) Arg-Arg-Arg-Arg-Lys (RRRRK): 카텝신 B 기질 서열(RR)을 포함하는 세포 투과성 펩타이드 서열로서, 양친매성 펩타이드를 암세포 리소좀에 위치시키기 위한 리소좀 표적화 모이어티로 구성된다.
(1.2) NDI-Lyso의 합성
헥실-NDI-Ala-COOH의 합성: 1M KOH 수용액(17.5mL)을 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물(1.0g, 7.46mmol)의 175mL 수용액에 첨가하고 혼합물을 강하게 교반하면서 가열하여 화합물을 완전히 용해시키고 투명한 용액을 생성하였다. 1M H3PO4을 적가하여 용액의 pH를 6.4로 조정하였다. 다음으로, 0.49mL n-헥실 아민(7.46mmol)을 용액에 첨가하고, 1M H3PO4를 사용하여 pH를 다시 6.4로 조정하고, 용액을 밤새 환류시켰다. 용액을 냉각하고 여과하였다. 여과액에 아세트산(2.5mL)을 첨가한 후 고체 침전물을 얻었다. 잔류물을 여과하고, 다량의 물로 세척하고, 실리카겔 상에서 진공하에 건조시켜 하기 반응식 1의 화합물 b의 백색 고체를 얻었다(반응식 1). 다음으로, 60℃에서 가열하여 1a(1g, 2.85mmol)를 디메틸포름아미드(DMF, 15mL)에 먼저 용해시켰다. 이어서, β-알라닌(0.44g, 5.87mmol) 및 DIPEA(0.98ml, 5.87mmol)를 순차적으로 첨가하고 용액을 90℃로 가열하며 밤새 교반하였다. 반응 완료 후, 용매를 증발시키고 잔류물을 2:1 물/메탄올(100mL)에 현탁시키고 염산(6N)을 첨가하여 용액의 pH를 3으로 조정하였다. 고체를 원심분리에 의해 물로 세척한 다음 진공 하에 실리카겔 상에서 건조시켜 헥실-NDI-Ala-COOH (반응식 1의 화합물 c)를 수득하였다.
[반응식 1]
펩타이드 및 접합체 합성: 0.25mmol 규모의 표준 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 고체상 펩타이드 합성(solid-phase peptide synthesis, SPPS)을 사용하여 합성하였다. Rink amide MBHA 수지를 고분자 지지체로 사용하였다. 수지 상의 Fmoc를 DMF/피페리딘(80/20) 혼합물로 제거하였다. 합성의 각 단계에서 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 디이소프로필 에틸 아민(DIPEA)을 커플링제로 사용하여 Fmoc-보호된 아미노산을 첨가하였다.
합성된 펩타이드 백본은 HBTU 및 DIPEA의 존재 하에 헥실-NDI-Ala-COOH(NDI-Lyso), 1-피렌 부티르산(Py-lyso), Nitrobenzofurazan-β alanine(NBD-lyso)과 접합되었다. 마지막으로 절단 칵테일(TFA/물/트리 이소프로필 아민 혼합물(9.5:0.5:0.5))을 사용하여 수지로부터 펩타이드를 절단하고 생성물을 차가운 에테르에 침전시키고 ACN/물 혼합물 내에서 C18 역 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent Technologies, USA)를 통해 정제하였다. 펩타이드 합성은 MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization) (Ultraflex III)로 확인하였다.
실시예 2. NDI-Lyso의 리소좀 내 카텝신 B에 의해 유도되는 절단에 의한 자가조립 현상 확인
(2.1) 카텝신 B에 의해 유도되는 접합체의 자가조립 현상 확인
NDI-Lyso의 자가조립을 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 확인하였으며, 인 비트로에서 NDI-Lyso는 카텝신 B 처리 전에는 ~100nm 길이의 짧은 섬유를 형성하는 반면, 카텝신 B 처리 24시간 후 뻣뻣하고 긴 섬유를 형성하는 것으로 관찰되었다 (도 2a). 피렌 방출 방법(pyrene emission method)을 통해, NDI-Lyso의 임계 응집 농도(CAC)는 카텝신 B의 부재 하 65 μM이며, 이는 카텝신 B 처리 후에 34 μM로 감소하였음을 확인하였다(도 2c). 이를 통해, 카텝신 B의 존재 하, 이에 의해 NDI-Lyso의 절단으로 인해 분자의 소수성 증가 및 CAC 감소에 따라 자가조립 경향이 증가됨을 확인하였다.
(2.2) 카텝신 B에 의해 유도되는 접합체의 절단 확인
이후, 카텝신 B가 과발현된 HeLa 세포에 NDI-Lyso를 처리하여 이의 효소적 절단을 관찰하였다. HeLa 세포를 NDI-Lyso와 함께 상이한 시간으로 처리한 뒤, HPLC 및 MALDI-TOF 질량 분석을 수행하였다. HPLC 분석 도중, NDI-Lyso 단편의 피크가 관찰되었으며, 새로운 피크는 HeLa 세포 처리 후 4시간 이후에 나타났다. 새로운 피크의 강도는 시간이 지남에 따라 증가하였고, 12시간 이후에는 100% 절단되었으며(도 3a), 이를 통해 NDI-Lyso의 효소적 절단을 확인하였다. 효소적 절단은 이후 MALDI-TOF/TOF 질량 분석을 통해 추가로 확인되었다(도 3b). 이는 NDI-Lyso의 절단이 R-R 서열 사이, 주로 펩타이드의 P2-P3 위치에서 일어남을 나타냈으며, 단편화된 생성물의 거의 100% 가 NDI-R3 임을 확인하였다, 이를 통해, 카텝신 B에 의해 NDI-Lyso가 NDI-R3로 절단됨을 확인하였다 (도 2 및 도 3).
실시예 3. NDI-Lyso의 암세포 리소좀 표적화 및 리소좀 내 자가조립 확인
(3.1) NDI-Lyso의 암세포 특이적 리소좀 표적화 기능 확인
Lysotracker red 및 NDI-Lyso의 HeLa 세포에서의 공동-국소화(co-localization) 조사를 수행하였으며, 분자의 파란색 형광이 Lysotracker의 빨간색 형광과 일치하여 공동-국소화되었음을 확인하였다(도 5a). 이를 통해 NDI-Lyso의 리소좀 표적화 기능을 확인하였다. 반면, 카텝신 B의 발현이 낮은 정상 세포인 인간 배아 신장 293(HEK 293) 세포의 경우, Lysotracker의 빨간색 형광과 NDI-Lyso의 파란색 형광이 일치하지 않음을 확인하였다 (도 5b). 이를 통해, NDI-Lyso의 리소좀 표적화는 암 세포 내에서만 이루어짐을 확인하였으며, NDI-Lyso의 리소좀 표적화 기능은 카텝신 B의 과발현으로 인한 것임이 예측되었다.
따라서, NDI-Lyso의 리소좀 내 국소화 이후, NDI-Lyso가 카텝신 B에 의해 절단되어 자가조립을 할 것이라고 예측했으며, NDI-Lyso의 리소좀 내 자가조립을 확인하기 위해 NDI-Lyso의 헥실-NDI가 환경적으로 예민한 형광단인 4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole (NBD)로 치환된 분자 NBD-Lyso를 상기 실시예 1에 기술한 NDI-Lyso 합성 방법과 같이 합성하였다. 합성된 NBD-Lyso의 구조를 하기 화학식 3에 나타내었으며, 이에 대한 질량 분석 결과를 도 4에 나타내었다. NBD는 소수성 환경에서 매우 형광을 나타내는 환경적으로 예민한 형광단이기 때문에, 세포 환경에서의 분자 조립을 확인하기 위해 자주 사용된다. NBD-Lyso와 NDI-Lyso를 HeLa 세포에서 공동-배양하고, Lysotracker red로 공동-국소화 분석을 한 결과, NBD의 강한 초록색 방출이 HeLa 세포에서 나왔고, 이는 Lysotracker red와 우수한 공동-국소화를 나타내었다(도 5a, NDI-Lyso+NBD-Lyso). 그러나, 같은 농도의 NBD-Lyso를 단독으로 사용한 경우, 초록색 형광이 관찰되지 않았으며(도 5a, NBD-Lyso), 이는 NBD-Lyso의 높은 CAC값으로 인한 것임을 예측할 수 있다. 이를 통해 NDI-Lyso의 자가조립이 리소좀 내에서 일어남을 확인하였다. 반면, HEK293 정상 세포에서 두 분자의 공동-조립을 확인한 결과, 공통되는 방출을 관찰하지 못했으며(도 5b), 이를 통해 NDI-Lyso의 조립의 리소좀 표적화가 카텝신 B의 과발현으로 인해 암 세포에서만 일어남을 확인하였다.
[화학식 3]
(2.2) NDI-Lyso의 암세포 내 리소좀에서의 자가조립 확인
이후, 리소좀 내 조립을 확인하기 추가적으로 확인하기 위해 리소좀 내 섬유를 직접적으로 관찰하기 위한 세포-TEM을 수행하였다. NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포의 리소좀 내 및 근처에서 많은 섬유가 관찰되었다 (도 6). 그러나, 처리되지 않은 HeLa 세포의 리소좀에서는 그러한 섬유가 발견되지 않았다. 이러한 결과를 통해 NDI-Lyso는 암세포 내 리소좀에서 선택적으로 자가조립됨을 확인하였다.
실시예 4. NDI-Lyso 처리를 통한 리소좀 팽창, 리소좀 막 완전성 상실, 리소좀 막 손상 및 활성산소종(ROS) 생성의 확인
HeLa 세포에 NDI-Lyso로 처리한 경우, 리소좀 막의 파괴가 관찰되었다(도 6). 이에 대해, 암세포 리소좀 내 NDI-Lyso의 자가조립이 리소좀에 스트레스를 유발할 것이라고 예측하였으며, 이를 확인하기 위해 LAMP1(lysosomal-associated membrane protein-1) 염색을 수행하였다. LAMP-1은 리소좀의 완전성, pH 및 이화작용을 유지시키는 역할을 한다. 대조군에 비해, 많은 커다란 초록색 구가 NDI-Lyso 처리된 HeLA세포에서 발견되었으며, 이를 통해 리소좀의 막 완전성 상실 및 리소좀의 팽창을 확인하였다 (도 7). 또한, 리소좀 아크리딘 오렌지(AO)가 세포질로 누출되는 것을 측정함으로써 리소좀 막의 완전성을 추가로 분석하였다. 대조군과 비교하여 NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포의 녹색 형광 강도의 증가를 통해 NDI-Lyso 처리된 암세포의 리소좀 막의 불안전성을 확인하였다 (도 7). 이를 통해, 암세포에 대한 NDI-Lyso가 리소좀 막의 손상을 유발함을 확인하였다. 추가적으로. Lysosensor를 사용한 형광 현미경 및 유세포분석을 통해 리소좀 손상을 확인하였다. NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포에서 세포 내 lysosensor의 형광 강도 감소가 관찰되었으며 (도 7), 이를 통해 리소좀에 손상을 확인하였다. 또한, 세포내 lysosensor의 형광 강도의 감소가 유세포분석에 의해 관찰되었다(도 8).
리소좀 내 펩타이드 조립이 암 세포 리소좀에 스트레스를 유발하는 바, 디하이드로에티듐(dihydroethidium, DHE)을 사용하여 NDI-Lyso의 ROS 생성 능력을 측정하였다. 대조군과 비교하여, NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포에서 강한 적색 형광이 관찰되었는 바, 이를 통해 많은 양의 ROS가 생성됨을 확인하였다(도 9).
상기와 같은 결과를 통해, 암세포 리소좀 내 NDI-Lyso의 조립은 암 세포 리소좀의 팽창, 막 완전성 상실, LMP, 리소좀 막 불안정화, 리소좀 손상 및 ROS 생성을 유발함을 확인하였다.
실시예 5. NDI-Lyso의 암세포 특이적 사멸 효과 및 약물 내성 암세포에 대한 사멸 효과 확인
(5.1) 암세포 특이적 사멸 효과 확인
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT 분석)를 사용하여 HeLa 세포에 대한 NDI-Lyso의 암 세포 사멸 효과 연구를 수행하였다. NDI-Lyso는 암 세포에 대해 낮은 IC50 값(11.13 ± 1.07 μM)을 가지며 (도 10), 암세포에 대해 상당한 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인하였다(도 13a). 반면, 정상세포인 HEK293 세포에 대해서는 세포 사멸 효과를 나타내지 않았는바(도 13b), 이를 통해 암 세포 특이적 사멸 효과를 확인하였다.
(5.2) 다양한 암세포에 대한 세포 사멸 효과 확인
양친매성 펩타이드-유도 세포 사멸의 카텝신 B-매개 선택적 암 세포 리소좀 내 조립을 추가로 확인하기 위해 SK-BR-3, MDA-MB-468, SCC7, MCF7, HT-29, MDA-MB-231, 및 4T-1의 암세포에서의 NDI-Lyso의 세포 사멸 효과를 조사하였으며, 이를 HEK293, IMR90 등의 정상세포와 비교했다. NDI-Lyso는 낮은 IC50 값(~10μM)을 나타내며, 모든 암세포에 대해 상당한 항암 활성을 나타냄을 확인한 반면; 동일한 농도에서 정상 세포에서 사멸 효과를 나타내지 않았으며 IC50 값은 높았다(~60μM)(도 10, 도 13b, 도 14).
NDI-Lyso은 기존의 화학 치료제에 비해 높은 선택성 지수(selectivity index, SI = ~6; 정상 세포의 IC50 값/암 세포의 IC50 값)를 갖는다.
(5.3) 카텝신 B에 의해 유도되는 암 세포 사멸 효과 확인
또한, 카텝신 B 억제제 존재 하 NDI-Lyso의 항암 효과를 조사하였다. 카텝신 B 억제제의 존재 하에서는 카텝신 B의 효소 활성이 감소되며, 카텝신 B 억제제로 사전 처리된 HeLa 세포에서 NDI-Lyso의 감소된 세포 사멸 효과가 나타났으며(도 13c), 이를 통해 리소좀 내 펩타이드 조립의 억제로 인한 세포 사멸 효과 감소를 확인하였다. 이를 통해, 카텝신 B가 리소좀 내 펩타이드 조립으로 인한 세포 사멸에 중요한 역할을 담당함을 확인하였다.
또한, 정상 세포에 대한 NDI-Lyso의 낮은 세포 사멸은 암세포에 비해 카텝신 B의 낮은 발현 및 정상 세포 리소좀의 낮은 취약성으로 인한 것임을 예측할 수 있다. NDI-Lyso의 가장 낮은 IC50 값은 카텝신 B를 매우 과발현하는 HT-29 및 MDA-MB-231 세포에서 나타났으며 (도 10), 이는 세포 사멸 유도에서 카텝신 B의 중요성을 나타낸다.
(5.4) 약물 내성 암세포주에 대한 세포 사멸 효과 확인
약물 내성 암 세포주 MCF7-ADR 및 SNU620-ADR300에서 NDI-Lyso의 세포 사멸효과를 추가로 조사했다. 증가된 카텝신 B 발현은 약물 내성 세포에서도 관찰되었다(도 14). NDI-Lyso은 MCF7-ADR 및 SNU620-ADR300에서 다른 암 세포주와 유사한 낮은 IC50 값을 나타냈으며, 상당한 세포 사멸 효과를 나타냈다 (도 10 및 도 14).
실시예 6: 카스파제-비의존적 세포자멸 경로를 통한 암 세포 사멸 메커니즘의 확인
(6.1) 세포자멸적 세포 사멸 경로 확인
LMP(Lysosomal Membrane Permeability)는 내재적 카스파제-의존적 또는 카스파제-비의존적 세포자멸사 경로를 활성화할 수 있다. LMP-유도 세포자멸사는 원형질막 붕괴를 야기하고 세포질 LDH(Lactate Dehydrogenase) 효소를 배양 배지로 방출하도록 유도한다. LDH 방출 분석을 통해 NDI-Lyso가 용량-의존적 방식으로 HeLa 세포에서 LDH 방출을 유발함을 확인하였으며 (도 11), 이를 통해 양친매성 펩타이드의 리소좀 내 조립을 통한 세포자멸적 세포 사멸을 확인하였다.
또한, 펩타이드 양친매성체의 리소좀 내 조립에 의해 유도된 세포 자멸적 세포 사멸을 추가로 조사하기 위해, NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포에서 FITC-annexin V/PI staining assay을 수행하고 유세포 분석을 사용하여 세포 사멸을 측정했다. 처리된 세포 및 비처리 세포에서 괴저성(necrotic) (FITC-/PI+) 및 세포자멸 세포 ((조기 세포자멸 (FITC+/PI-) 또는 후기 세포자멸 (FITC+/PI+)) 집단의 백분율을 온전한 세포(FITC-/PI-)와 비교하여 계산하였다. 펩타이드 양친매성 물질의 리소좀 내 조립으로 인해 76%의 세포 사멸이 관찰된 반면, 대조군에서는 100%의 세포가 온전하였다 (도 12b).
(6.2) 카스파제-비의존적 세포자멸 경로 확인
NDI-Lyso의 카스파제-의존적 또는 카스파제-비의존적 세포자멸 경로를 확인하기 위해 카스파제 억제제를 전처리한 HeLa 세포에서 FITC-annexin V/PI staining assay 를 수행하였다. 카스파제 억제제 존재하에서 NDI-Lyso 처리된 세포의 세포자멸사 백분율에는 변화가 없었다 (도 12b). 이를 통해 리소좀 내 조립에 의한 세포 사멸이 전형적인 카스파제-의존적 경로를 따르지 않음을 확인하였다.
전형적인 카스파제-의존적 세포자멸사 경로를 우회하는 리소좀 손상에 따른 세포자멸 유도 효과를 통해, 카스파제-의존적 세포자멸사를 유도하기 위한 많은 화학 약물에 대해 내성을 갖는 암에 대해서도 세포 사멸 효과를 나타낼 수 있다. NDI-Lyso-유도된 세포자멸적 세포사를 형광 현미경을 사용한 Annexin V/PI assay를 통해 확인하였다(도 15). 도 15a는 HeLa 세포에 NDI-Lyso를 처리하기 전의 결과이며, 도 15b는 NDI-Lyso 20 μM을 처리한 24시간 후의 결과이다. FITC conjugated annexin V가 phosphatidyl serine (PS) 잔기에 결합하여 강한 초록색 형광이 나타났으며, 이는 조기 세포자멸을 나타내고, 약한 빨간색 형광은 원형질막 손상으로 인해 나타나며, 이는 후기 세포자멸 또는 괴사를 나타낸다.
카스파제-비의존적 세포자멸사 경로를 추가로 확인하기 위해, 세포자멸 마커인 카스파제 3, 카스파제 9 및 시토크롬 c의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 분석하였다. 대조군과 비교하여 NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포에서 세포자멸 마커의 발현에 유의한 변화가 없었으며(도 12a), 이는 펩타이드 양친매체의 리소좀 내 조립을 통한 세포사멸이 전형적인 카스파제-의존적 경로를 따르지 않는다는 것을 추가로 뒷받침한다.
실시예 7: NDI-Lyso의 구조-활성 관계(Structure-Activity Relationship) 분석
(7.1) 비교 분자 합성
구조-활성 관계를 조사하기 위해 3개의 분자를 합성했으며, 이 중 두 분자는 NDI-Lyso와 구조적 유사성을 갖는 N-말단이 변형된 분자이며, 한 분자는 N-말단에 자가조립 강화 모이어티가 없는 분자이다. NDI-Lyso의 헥실-NDI-ala-카르복시산을 각각 팔미트산(palmitic acid) 및 피렌 부티르산(pyrene butyric acid)으로 대체하여 C16-Lyso 및 Py-Lyso를 합성하였다. 팔미트산 및 피렌 부티르산 또한 소수성 및 π-π 상호 작용을 향상시켜 자가조립 경향을 증가시키는 것으로 알려져 있다. N-말단 캡핑의 중요성을 평가하기 위해 자가조립 강화 모이어티가 없는 FF-Lyso를 합성했다. 합성된 C16-Lyso, Py-Lyso 및 FF-Lyso의 구조를 각각 하기 화학식 4a, 4b 및 4c에 나타내었으며, 이에 대한 질량 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
[화학식 4a]
[화학식 4b]
[화학식 4c]
(7.2) FF-Lyso와, C16-Lyso 및 Py-Lyso와 세포 사멸 효과 비교
카텝신 B 처리 전 FF-Lyso는 미셀과 같은 형태를 나타내었고, 카텝신 B 처리 후 응집체를 형성하였으나 (도 18), HeLa 세포에 대한 세포 사멸 효과는 나타나지 않았다(도 16). 이를 통해, N-말단의 자가 조립 강화 모이어티가 접합체의 암 세포 리소좀 내 자가조립에 중요한 역할을 하며, 이를 통한 섬유 형성이 암 세포 사멸을 유도에 중요한 역할을 담당함을 확인하였다.
또한, 카텝신 처리 전 C16-Lyso 및 Py-Lyso은 미셀과 같은 형태를 나타낸 반면, 카텝신 B 처리 후 각각 긴 섬유질 응집체와 긴 섬유를 형성함을 확인하였으며(도 18), C16-Lyso 및 Py-Lyso 모두 HeLa 세포에서 세포 사멸 효과를 나타내었다(도 16). 이와 비교하여, 본 발명의 NDI-Lyso는 그 중 HeLa 세포에 대해 가장 높은 세포 사멸 효과를 나타냄을 세포 생존률 분석 실험을 통해 확인하였다 (도 13a, 도 16 및 도 18). 또한, NDI-Lyso의 IC50 값은 11.3 μM인 반면, Py-Lyso의 IC50 값은 18.9 μM로 계산되었다.
(7.3) NDI-R3 및 NDI-K5의 암 세포 사멸 효과 확인
NDI-R3에 카텝신 B를 처리하기 전과 후 모두 긴 섬유가 형성됨을 확인하였고(도 18), 카텝신 B 처리 후의 섬유 구조는 NDI-Lyso의 것과 유사한 형태를 가짐을 알 수 있었다. 그러나 NDI-R3 그자체로는 HeLa 세포에 대해 암 세포 사멸 효과를 나타내지 않은 반면(도 16), NDI-Lyso에 의해 생성된 동일한 화합물은 암 세포 사멸 효과가 있는 것으로 나타났다. 이를 통해, 아르기닌-풍부 양이온성 세포-투과성 펩타이드 서열을 갖는 NDI-Lyso에서 Arg-Lys 부분이 제거된 NDI-R3의 경우, 세포 내로의 투과량이 NDI-Lyso에 비해 상대적으로 적기 때문에, 20 μM 이하의 농도에서 자가조립에 의한 세포 사멸 효과가 나타나지 않음을 예측하였으며, 이를 통해 리소좀 내에서의 효소적 절단 및 조립이 암세포 사멸을 유도하는데 중요한 역할을 함을 확인하였다.
펩타이드 양친매성 물질의 리소좀 내 조립에서 카텝신 B 기질로서의 역할을 추가로 확인하기 위해 또 다른 대조군 분자인 NDI-K5를 합성했으며, 여기서 RRRRK 서열은 유사한 전하를 갖는 KKKKK로 대체하였다. 카텝신 B 처리 전 후 모두 NDI-K5는 긴 섬유를 형성했으며, 카텝신 B 처리 후에도 형태에는 변화는 관찰되지 않았다 없었다 (도 18). 그러나 NDI-K5는 HeLa 세포에 대해 암 세포 사멸 효과를 나타내지 않았으며(도 16), 이를 통해 카텝신 B 기질이 되는 모이어티가 카텝신 B-매개 리소좀 내 조립에서 중요한 역할을 함을 확인하였다.
실시예 8. NDI-Lyso 및 NDI-R3
NDI-분자 섬유의 형성 메커니즘 및 이들의 세포막에서의 행동을 조사하기 위해 NDI-Lyso 및 NDI-R3 분자의 CG 모델을 구성하여 CGMD(Coarse-Grained Molecular Dynamics) 시뮬레이션을 수행했다(도 19a).
구아니딘 그룹은 거리 및 각도 측면에서 페닐 및 NDI기 모두에 대해 NDI-Lyso에 유리하게 꼬이고 배향되었으며, 구체적으로, 구아니딘-페닐 및 구아니딘-NDI 그룹의 상호작용은 NDI-R3보다 NDI-Lyso에서 더 강했다. 따라서 NDI-Lyso는 NDI-R3보다 더 응축된(condensed) 형태를 보임을 확인하였다 (도 19a). NDI-Lyso 및 NDI-R3의 안정화된 이합체 구조를 조사하였으며, 구아니딘-NDI가 NDI-Lyso 이합체의 주요 상호작용인 반면 구아니딘-페닐이 NDI-R3 이합체의 주요 상호작용임을 관찰했다.
CGMD 시뮬레이션에서 섬유 구조를 조사하였다(도 19a). NDI-Lyso 섬유 구조에서는 구아니딘과 NDI가 밀접하게 상호 작용한 반면, NDI-R3의 섬유 구조에서는 구아니딘-페닐과 구아니딘-구아니딘이 호의적인 상호작용을 보였다(도 19b). 또한, NDI-R3 섬유 구조에서 페닐 그룹과 펩타이드 간의 상호 작용 수가 더 많았다(도 19c). 결과적으로, NDI-R3 분자는 NDI-Lyso 분자보다 더 긴 섬유를 형성하였다(19nm 대 15.3nm)(도 19a).
NDI-분자와 리소좀 막 사이의 상호작용을 예측하기 위해 섬유 구조의 표면 성분을 비교하였다(도 19d). NDI-Lyso 및 NDI-R3 섬유 표면 모두 구아니딘 그룹의 비율이 가장 높게 나타났으며, 섬유 구조의 구아니딘 기는 지질의 친수성 그룹(즉, 외막)과 상호 작용할 것으로 예측되었다.
한편, NDI-R3 섬유 구조의 표면의 페닐기 함량은 NDI-Lyso의 표면보다 7% 더 높게 나타났으며, 섬유 구조의 페닐 그룹은 비극성 상호작용을 통해 지질의 소수성 그룹(즉, 내막)과 상호작용할 것으로 예측되었다.
리소좀 막에서 NDI 분자의 자가조립 시뮬레이션을 수행했으며, 시뮬레이션을 위해 NDI-분자를 막 환경에 무작위적으로 위치시켰다(도 20a). NDI-분자는 이후 섬유로 조립되어 리소좀 막에 결함을 유발함을 확인하였으며 (도 20a 및 도 20b), NDI-R3의 섬유 구조는 NDI-Lyso의 섬유 구조보다 리소좀 막에 더 깊고 큰 기공을 형성함을 확인하였다. 기공 크기의 차이는 2.25μs에서 약 0.4Х103 nm2로 나타났다(도 20c). 또한, NDI-R3 섬유에 의해 유도된 결함 있는 막의 불안정성은 지질 이중층에 있는 성분의 위치 에너지 분석에 의해서도 확인되었다(도 20d).
상기 기술한 바와 같이, NDI-R3 섬유는 표면에 더 많은 페닐 그룹을 가지고 있으므로, 리소좀 내막과의 비극성 상호 작용을 통해 리소좀 내부 막을 침투할 수 있다(도 20e). 따라서, NDI-R3가 리소좀 막과의 상호 작용에 더 유리한 섬유 구조를 형성함에 따라, NDI-Lyso 보다 더욱 큰 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, NDI-Lyso가 카텝신 B로 인해 NDI-R3로 절단되면서 암 세포에 대한 우수한 사멸 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 선택적 종양 표적화 및 종양 성장 억제 효과 분석
종양 표적화 펩타이드 RGD가 암 세포막에서 과발현되는 αvβ3 인테그린을 표적으로 하는 것으로 알려져 있는 바, NDI-Lyso의 종양 표적화 능력을 더욱 증가시키기 위해 RGD가 부착된 NDI-Lyso(NDI-Lyso-RGD)를 합성하였다. NDI-Lyso-RGD는 HeLa, HT-29, MDA-MB-231 및 4T1 세포에서 유의한 항암 효과가 있는 반면 HEK293 정상 세포에는 세포 사멸 효과를 나타내지 않았다(도 23). 또한 암세포에서 NDI-Lyso보다 IC50 값이 낮았고, 선택성 지수는 높았다 (도 21a). NDI-Lyso 및 NDI-Lyso-RGD의 선택성 지수는 각각 5.3 및 14.1로 NDI-Lyso에 비해 NDI-Lyso-RGD의 더 나은(2.7배) 선택적 치료 효능을 나타낸다.
다음으로 NDI-Lyso-RGD의 종양 표적화 능력을 조사했다. 펩타이드 양친매성의 RGD 변형이 생체내에서 높은 표적화 능력을 제공할 것이라고 예상했다. NDI-Lyso-RGD 분자가 미셀 구조를 형성함을 TEM 이미지를 통해 확인하였는 바, 형광 염료를 미셀에 로딩하여 영상화 실험에 사용할 수 있다. In vivo 표적화 능력을 조사하기 위해 NDI-Lyso-RGD 미셀에 IR-780 염료를 캡슐화하고 IR-780이 로딩된 NDI-Lyso-RGD를 4T1 종양 이종이식 모델의 누드 마우스에 정맥 주사했다. 정맥내 주사 24시간 후 종양 부위에서 IR-780 로딩된 NDI-Lyso-RGD의 상당히 높은 축적이 나타났으며, 축적은 다른 기관과 비교하여 종양에 선택적이었고 (도 21b 및 도 21c). 이는 NDI-Lyso-RGD의 높은 종양 표적화 능력을 나타낸다.
또한, 4T1 종양 이종이식 모델을 사용하여 종양 성장에 대한 NDI-Lyso-RGD의 효과를 조사했다. NDI-Lyso-RGD는 종양 성장의 상당한 억제를 나타내는 반면 NDI-K5는 종양 효과가 없는 것으로 나타났다 (도 22c). 평균 종양 중량이 현저히 감소했다(도 22a). 또한 NDI-Lyso-RGD의 in vivo 독성을 분석했다. 누드 마우스의 체중에는 유의한 변화가 없었으며(도 22b), 대조군과 비교하여 NDI-Lyso-RGD 처리군에서 비정상적인 행동이 관찰되지 않았다. 또한, NDI-Lyso-RGD 처리 후 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장 및 신장)에서 병리학적 변화가 관찰되지 않았는 바, NDI-Lyso-RGD가 in vivo 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
참고예
임계 응집 농도(CAC) 측정: 카텝신 B 처리(24시간 동안 2U/mL) 전후의 NDI-Lyso의 CAC를 steady-state 형광 피렌 방출 방법으로 측정했다. 300μM 펩타이드 용액은 DMSO 스톡 용액 내 10mM 펩타이드의 투석을 통해 제조되었다. 2μM의 피렌을 함유하는 상이한 농도의 펩티드 용액의 형광 방출 스펙트럼을 기록하였다. 여기 파장은 343 nm로 설정하였다. 373nm 부근의 I1 밴드와 384nm 부근의 I3 밴드의 비율, I1/I3는 응집이 일어날 때 감소하였다. Log[펩티드]는 I1/I3에 대해 플롯팅되었다. 특정 농도, CAC를 지나면 비율 값이 급격히 감소한다.
세포 TEM 제조: NDI-Lyso 처리된 HeLa 세포 및 대조군 HeLa 세포를 4% 파라포름알데히드에 30분 동안 고정하고 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 3.75% 수크로스로 30분에 걸쳐 3회 세척했다. 세포를 0.1% 사산화 오스뮴, 5% 수크로스 및 0.05M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)의 혼합물 내에서 1시간 동안 후-고정하고 milliQ 물로 3회 세척하였다. 이후, 단계별 아세톤(각 단계 20%)에서 탈수하고 에폭시 수지에 파묻었다. 수지를 80℃에서 밤새 중합하였다. RMC 584 CR-X 울트라마이크로톰으로 초박형 섹션(100 nm)을 얻었고, 이후 JEOL JEM-1400 전자 현미경으로 이미지를 얻었다.
세포 배양: 인간 자궁경부암 세포(HeLa), 인간 유방암 세포(MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-468), 마우스 편평상피암 세포(SSC7), HT-29, MDA-MB-231, 4T-1, 약물 내성 인간 유방암 세포(MCF7-ADR) 및 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)를 5% CO2의 습한 대기 및 37°C에서 10% 소태아혈청(FBS, Life Technologies) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다. 1차 인간 폐 섬유아세포(IMR90) 세포를 5% CO2의 습한 대기 및 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS; Life Technologies), 1% 비필수 아미노산(NEAA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 DMEM 배지에서 배양했다. 약물 내성 위 암세포(SNU-620-ADR/300)를 10%의 열 불활성화 소태아혈청(FBS)과 함께 L-글루타민(300mg/L), 25mM HEPES 및 25mM NaHCO3가 포함된 RPMI1640에서 배양하였다.
리소좀과의 공동-국소화 연구: 처리 24시간 전에 HeLa 세포를 20000개 세포/웰의 시딩 밀도로 8웰 유리 커버글라스 (Lab Tek II, Thermo Scientific) 에 시딩하였다. 세포를 4시간 동안 20μM의 NDI-Lyso로 처리하거나 20μM의 NDI-Lyso 및 20μM의 NBD-lyso와 4시간 동안 공동-배양 후 Lyso Tracker™ Red를 제조사 프로토콜에 따라 배양하였다. 세포를 새로운 배지로 세척하고 공동-국소화를 Carl Zeiss LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 주기적으로 모니터링했다.
면역 형광: 처리 전에 HeLa 세포는 8웰 유리 커버글라스 (Lab Tek II, Thermo Scientific) 에 20000개 세포/웰의 시딩 밀도로 밤새 시딩되었고 상이한 농도의 NDI-Lyso로 20시간 동안 처리되었다. 4℃에서 1차 항체(Recombinant Anti-LAMP1 항체)와 밤새 배양하기 전에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.1% Triton X-100으로 처리하였으며, 2% BSA(bovine serum albumin)로 차단하였다. 이후, PBS(phosphate-buffered saline)로 세포를 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 약 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 Carl Zeiss LSM 780 공초점 레이저 주사 현미경으로 분석하였다.
LMP의 시각화: 처리 전에 HeLa 세포를 밤새 20000개 세포/웰의 시딩 밀도로 8웰 유리 커버글라스 (Lab Tek II, Thermo Scientific)에 시딩하였다. 그런 다음, 세포를 Alexa Fluor 488-dextran(10,000MW, 100μg·mL-1)과 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포 배양 배지를 20시간 동안 상이한 농도의 NDI-Lyso로 교체하였다. 그 후, 세포를 세척하고 Carl Zeiss LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 분석하였다.
리소좀 손상 연구: 처리 전에 HeLa 세포를 밤새 8웰 유리 커버글라스 (Lab Tek II, Thermo Scientific) (공초점 현미경 검사용) 또는 6웰 플레이트(유세포 분석용)에서 배양하였다. 그런 다음 20시간 동안 상이한 농도의 NDI-Lyso로 처리한 다음 2.5μM lysosensor와 함께 40분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 Carl Zeiss LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 분석하였다. 유세포 분석을 위해 세포를 트립신 처리하여 PBS로 세척하고 BD FACSVerse 유세포 분석기로 분석하였다.
리소좀 막 완전성 연구: 리소좀 막 완전성 상실은 photo-oxidation에 대한 반응으로 리소좀 AO의 세포질 누출의 라이브 세포 이미징에 의해 결정되었다. 처리 전에 HeLa 세포를 8웰 유리 커버클라스 (Lab Tek II, Thermo Scientific)에 20000개 세포/웰의 시딩 밀도로 밤새 시딩하였다. 이후 세포를 20시간 동안 상이한 농도의 NDI-Lyso로 처리한 다음 추가로 37°C에서 15분 동안 AO(2 μg ml-1)와 함께 배양하였다. 세포를 세척하고 Carl Zeiss LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 분석하였으며, 488 nm 레이저로 AO를 여기시켰다.
DHE(dihydroethidium)을 사용한 ROS 생성 연구: 처리 전 HeLa 세포를 밤새 20000개 세포/웰의 시딩 밀도로 8웰 유리 커버클라스(Lab Tek II, Thermo Scientific)에 시딩한 후 20시간 동안 상이한 농도의 NDI-Lyso로 처리하였다. 그 후, 세포를 세척하고 새로 제조된 5μM DHE로 37°C에서 30분 동안 처리하였다. 세포를 세척하고 새로운 DMEM과 함께 배양하고 Carl Zeiss LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 분석하였다.
세포 생존률 연구: MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 분석에 의해 펩타이드 양친매체의 세포 생존률을 측정하였다. 처리 24시간 전에 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 5X103개 세포의 밀도로 시딩하였다. 그런 다음 세포를 24시간 동안 상이한 농도의 펩타이드 양친매체로 처리하였다. 카텝신 B 억제제의 존재 하 세포 생존률 연구를 위해, 화합물 처리 전에 세포를 카텝신 B 억제제 Z-Phe-Phe-FMK(50μM)로 처리하였다. 그 후 세포를 MTT 용액으로 4시간 동안 처리한 다음 디메틸 설폭사이드와 메탄올의 1:1 혼합물에 용해된 결정화된 포르마잔을 ELISA plate reader로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 결과는 생존률 백불율 = [(A595 (treated cells)-background)/(A595 (untreated cells)-background)] x100으로 나타내었다.
유세포 분석에 의한 Annexin V/PI 분석: HeLa 세포는 5% CO2 하 37°C 에서 6웰 플레이트 내 DMEM에서 2Х105 세포/웰의 밀도로 시딩되었다. 세포를 NDI-Lyso(20μM)로 20시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 세척하고, 트립신 처리하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 1X annexin-binding buffer 로 세척하고 5 μL의 PI (Propidium iodide) (스톡 농도는 50 μg/mL) 및 5 μL의 annexin V (스톡 농도는 200 μg/mL)를 함유하는 100 μL 1X annexin-binding buffer 용액과 함께 37 oC에서 15분 동안 배양하였다. 그 후 또 다른 400μL의 1X annexin-binding buffer 를 세포에 첨가하고 530 및 610nm에서 방출 필터를 사용하여 BD FACSVerse 유세포 분석기로 분석하였다.
공초점 현미경을 사용한 Annexin V/PI 분석: HeLa 세포를 Lab TEK II 공초점 8 웰에 시딩하였다. 세포를 상이한 농도의 NDI-Lyso와 함께 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포 배양 배지를 1mL의 annexin binding buffer에서 Alexa Fluor 488-conjugated annexin V 및 PI로 교체하고 37°C에서 15분 동안 배양하였다. 세포를 세척한 후 배지를 free DMEM 배지로 교체하였다. 마지막으로 LSM 780 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 세포를 분석하였다.
LDH 방출 연구: LDH 방출(%)은 Thermo Scientific™에서 구입한 Pierce?? LDH Cytotoxicity Assay Kit를 사용하여 측정하였다. HeLa 세포를 24시간 동안 96웰 플레이트의 3중 웰에 5Х105 개 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 상이한 농도의 NDI-Lyso와 함께 24시간 동안 배양하였다. 10μL Lysis Buffer (10X)를 양성 대조군에 첨가하였다. NDI-Lyso과 함께 배양한 후, 50 μL의 각 샘플 배지를 96-웰 플레이트로 옮기고 50 μL Reaction Mixture를 각 샘플 웰에 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 빛을 차단한 실온에서 30분 동안 배양했다. 그 후 50 μL의 Stop Solution을 각 샘플 웰에 첨가하고 부드럽게 tapping하여 혼합하였다. 490 및 680 nm에서의 흡광도를 microplate reader를 사용하여 측정하였다. LDH 방출을 계산하기 전에, 490 nm 흡광도에서 680 nm 흡광도 값(배경)을 뺀다[(LDH at 490 nm) - (LDH at 680 nm)]. LDH 방출(%)은 최대 LDH 활성 대조군에 대한 백분율로 계산되었다.
웨스턴 블롯팅: 세포를 6-웰 플레이트에서 DMEM 내 5Х105 개 세포/웰의 밀도로 시딩한 다음, 24시간 동안 상이한 농도의 NDI-Lyso로 처리하였다. 세포를 RIPA buffer 로 용해하고 총 단백질 농도를 Bradford assay를 사용하여 결정하였다. 단백질은 SDS-PAGE를 사용하여 분리되었고, PVDF(polyvinylidene difluoride) 막 (Immobilon-P polyvinylidene fluoride membranes; Millipore Corporation, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. PVDF 막은 비특이적 상호 작용을 최소화하기 위해 탈지유 용액을 사용하여 차단되었다. 그 다음 1차 항체로 밤새 처리한 후 2시간 동안 2차 항체를 처리하였다. 단백질 발현은 BCIP®/NBT 용액을 사용하여 시각화되었다.
시뮬레이션 상세 내용: 세포막에 대한 다양한 분자 거동의 카텝신 B 효과를 조사하기 위해 Martini forcefield를 사용하여 CGMD(Coarse-Grained Molecular Dynamics)를 수행하였다. NDI-Lyso 및 NDI-R3는 Martini 규칙에 따라 모델링되었다; 알킬, 리소의 PAA(peptide, alkyl, and amine), R3의 PAA, 페닐, 구아니딘 및 나프탈렌 디이미드 그룹은 각각 2, 15, 10, 3, 1 및 10개의 CG 비드로 구성된다(도 S23). NDI 분자의 단일 분자 구조를 비교하기 위해 각 NDI 분자를 3×3×3 nm3의 박스에 넣었다. 2ns에 대한 NVT(즉, 표준) MD 시뮬레이션을 수행하였고, 최종 500ps의 궤적을 사용하여 분석을 수행하였다. 거리 및 각도 분포는 각 그룹의 질량 중심을 사용하여 생성되었다.
섬유 구조의 자가 조립을 위해, NDI-Lyso의 430 분자 및 NDI-R3의 512 분자가 25Х25Х40 nm3의 각 박스 내에서 사용되었으며, 이는 모델 시스템의 중성을 위해 물과 반대 이온으로서 나트륨 이온으로 채워져있다. NPT(즉, 등온-등압) MD 시뮬레이션은 200ns 동안 수행되었으며 분석은 최종 20ns에서 50ns까지의 궤적으로 수행되었다. NDI-분자의 독성은 무작위로 분포된 NDI 분자 및 세포막을 포함하는 시뮬레이션 시스템을 사용하여 비교되었다. 암세포의 리소좀 막에서 230개의 NDI-Lyso 및 410개의 NDI-R3 분자가 각각 물 및 나트륨 이온과 함께 20.5×20.5×45 nm3 의 박스에 위치하였다. 암세포의 리소좀 막의 성분을 고려할 때, 막은 386개의 POPG, 164개의 POPC, 756개의 DPSM 및 866개의 CHOL(즉, 2.3:1:4.6:5.2)로 구성된다. NPT MD 시뮬레이션은 2.25μs 동안 수행되었다. 결점 면적은 섬유와 막의 접촉 면적으로 구하였다. 막의 위치 에너지와 상호작용 에너지는 최종 50ns의 궤적으로 구하였다. 시뮬레이션 및 분석은 GROMACS/2020.2.에서 5fs의 시간 간격으로 298K에서 수행되었다. 속도 재조정 온도 조절장치로 등온 상태를 유지하고 반데르 발스의 1.2nm 컷오프 반경을 사용했다. Coulomb 상호작용을 위해 입자 PME(Particle mesh Ewald) summation이 사용되었다.
4T-1 종양 이종이식 모델의 확립, in vivo 이미징 및 생체 분포 연구: 모든 동물 실험은 IACUC-UNIST(Institutional Animal Care and Use Committee of Ulsan National Institute of Science and Technology)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. Balb/c 누드 암컷 마우스는 Orient bio, Korea에서 구입했으며, 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에서 4T-1(0.1 mL/mice, 2 Х106 cells/100 μL) 종양 이종이식 모델이 확립되었다. 종양 부피가 ~100 mm3에 도달하면 각 마우스에 IR-780이 로딩된 NDI-Lyso-RGD, IR-780 및 PBS를 별도로 정맥 주사하였다. 각 마우스는 표준 X-선 background로, 760 nm 및 830 nm에서 여기를 방출로 설정하여 in vivo 광학 이미징 시스템(Bruker Xtreme 모델)을 사용하여 상이한 시간 간격에서 이미지화되었다. 24시간에 이미지화한 후, 마우스를 안락사시키고 생체분포 연구를 수행하였다.
종양 성장 억제 연구: 모든 동물 실험은 IACUC-UNIST에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. Balb/c 누드 암컷 마우스를 Orient Bio, Korea에서 구입하였으며 모든 동물 실험을 수행했다. 종양 이종이식 모델을 생성하기 위해 4T-1 세포(0.1 mL/mice, 2 Х106 cells/100 μL)를 각 누드 마우스의 오른쪽 옆구리 영역에 피하 주사하였다. digital caliper를 사용하여 종양 성장을 주기적으로 모니터링하였다. [부피 = (종양 길이) × (종양 너비)2/2] 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 종양 부피가 100 mm3에 도달하면, n=5에서 3개의 대표적인 마우스 그룹 (i) PBS, (ii) NDI-K5 및 (iii) 인 NDI-Lyso-RGD가 선택되었다. 비정상적인 크기의 종양이 있는 마우스는 사용하지 않았다. 마우스를 PBS, NDI-K5(10mg/kg) 및 (iii) NDI-Lyso-RGD(10mg/kg)로 24일까지 격일로 정맥 주사하여 처리하였다. 종양 크기와 체중을 모든 그룹에서 나타난 대로 주기적으로 측정하고 비교하였다.
면역조직화학적 분석: 각 그룹의 한 마리의 마우스를 24일째에 희생시키고 종양을 분리하고 PBS 중 4% 포름알데히드 용액에서 고정시켰다. 고정된 종양은 gradient 에탄올 세척에 의해 탈수되었고, 파라핀 블록에 파묻히고, 절편되고, 및 H&E 염색으로 염색되었다. 마지막으로 H&E 염색된 슬라이드를 Virtual Microscopy로 관찰하였다.
Tunnel 분석: 각 그룹에서 한 마리의 마우스를 24일째에 희생시키고 종양을 분리하였다. 고정을 위해 4% 포름알데히드 용액을 사용하였다. 고정된 종양은 gradient 에탄올 세척에 의해 탈수되고, 파라핀 블록에 파묻히고, 절편되고, 및 TUNEL assay kit (Promega Corp. USA)로 면역염색되고 형광 현미경으로 관찰되었다.
In vivo 독성 연구: 모든 동물 실험은 IACUC-UNIST에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. 각 마우스(n=10)에 PBS 중 NDI-Lyso-RGD(10 mgkg-1day-1)를 7일 동안 매일 정맥 주사를 통해 투여하였다. 대조군에서는, 동일한 부피의 PBS를 주입하였다. 단기(ST) 독성(급성 독성 연구)를 확인하기 위한 생화학적 독성 연구, 혈액학적 독성 연구 및 조직학적 연구를 위해 모든 마우스를 8일째에 안락사시켰다. 마우스는 실험 내내 autoclaved standard pellet food 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었다. 동물의 체중을 측정하고 임상 징후에 대해 정기적으로 관찰하고 이환율 및 사망률에 대해 매일 모니터링하였다. 혈액학적 분석을 위해, 마취 후 심장 내 천자에 의해 혈액을 수집하였다. 혈액학적 독성 분석을 위해 전혈을 즉시 헤파린 처리하였다. 혈액학적 분석에는 WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW, HDW, PLT 및 MPV가 포함된다. 혈청 생화학적 분석을 위해, 전혈을 clotted vial에 넣고 원심분리하고, 수집된 혈청을 생화학적 분석을 위해 제출하였다. GOT, GPT, ALP, TP, ALB, T-BIL, BUN, CREA, GLU, PHOS 및 CA의 혈청 수준을 결정하기 위해 혈청 생화학적 분석을 수행하였다.
통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 리소좀 표적화 모이어티 및 (Xaa)n로 표시되는 펩타이드를 포함하는 접합체 (conjugate)로서,
    상기 리소좀 표적화 모이어티는 상기 (Xaa)n의 C-말단에 아마이드 결합으로 연결되어 있으며 카텝신 B의 기질인 것이며,
    상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 Xaa의 개수로서, 2 내지 200의 정수이고,
    상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택되며,
    상기 아미노산은 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것이고,
    상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것인 접합체 (conjugate).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 n은 2이고, 상기 아미노산은 페닐알라닌, 알라닌, 사이클로헥실 알라닌, 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 것으로서, 서로 동일한 것인 접합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 리소좀 표적화 모이어티는 RRRRK(Arg-Arg-Arg-Arg-Lys)인 것인 접합체.
  4. 청구항 3에 있어서. 상기 리소좀 표적화 모이어티의 Lys의 C-말단 카르복실기의 하이드록시기는 아민, 알킬기, 알코올기, 케톤기, 아실기, 에스터기, 에테르기, 아세틸기, 아실 할라이드기, 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것인, 접합체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 자가조립 강화 모이어티를 추가로 포함하고, 상기 자가조립 강화 모이어티는 상기 펩타이드에 연결된 것인, 접합체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 자가조립 강화 모이어티는 상기 펩타이드의 N-말단에 아마이드 결합으로 연결된 것인, 접합체.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 자가조립 강화 모이어티는 NDI(naphthalene diimide), pyrene, NBD (4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole), perylene, naphtalene, 및 coronene으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것인, 접합체.
  8. 청구항 1에 있어서, Arg-Gly-Asp(RGD)를 추가로 포함하는 것인, 접합체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 RGD는 상기 펩타이드의 C-말단에 아마이드 결합을 통해 연결된 것인, 접합체.
  10. 청구항 8에 있어서. 상기 Asp의 C-말단 카르복실기의 하이드록시기는 아민, 알킬기, 알코올기, 케톤기, 아실기, 에스터기, 에테르기, 아세틸기, 아실 할라이드기, 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것인, 접합체.
  11. 청구항 6에 있어서, 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 구조를 갖는 접합체:
    [화학식 1]


    [화학식 2]
    .
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 접합체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 청구항 12항에 있어서, 상기 약학적 조성물의 상기 접합체는 암 세포 내 리소좀 내에서 세포 자멸 (Apoptosis)을 유도하는 것인, 약학적 조성물.

KR1020220150968A 2022-11-11 리소좀 표적화 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR20240069453A (ko)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240069453A true KR20240069453A (ko) 2024-05-20

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101968732B1 (ko) 세포소기관에서 자가조립 가능한 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
US8674070B2 (en) Cancer-targeting peptides and uses thereof in cancer therapy
Qin et al. Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for enhancing the brain delivery
Sancini et al. Functionalization with TAT-peptide enhances blood-brain barrier crossing in vitro of nanoliposomes carrying a curcumin-derivative to bind amyloid-β peptide
US20170056506A1 (en) Amphiphilic drug-drug conjugates for cancer therapy, compositions and methods of preparation and uses thereof
US20190240282A1 (en) Nanocage
Lee et al. A HA2-Fusion tag limits the endosomal release of its protein cargo despite causing endosomal lysis
Medina et al. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug
Kang et al. Cell-penetrating peptide-conjugated lipid/polymer hybrid nanovesicles for endoplasmic reticulum-targeting intracellular delivery
JP2021504371A (ja) Ｙｅａｔｓ阻害剤およびその使用方法
Accardo et al. Amphiphilic CCK peptides assembled in supramolecular aggregates: structural investigations and in vitro studies
KR20240069453A (ko) 리소좀 표적화 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
Biswas et al. Novel Guanidine‐Containing Molecular Transporters Based on Lactose Scaffolds: Lipophilicity Effect on the Intracellular Organellar Selectivity
Zhao et al. Improved targeting delivery of WED-load immunoliposomes modified with SP-A mAb for the treatment of pulmonary fibrosis
JP2013545795A (ja) 造影剤
KR102329285B1 (ko) 세포소기관에서 자기조립 가능한 펩타이드 분자를 포함하는 접합체의 d-거울상이성질체 및 l-거울상이성질체가 공동으로 조립되어 형성된 자기조립체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20240069480A (ko) 자가조립 가능한 펩타이드 분자를 포함하는 양친매성 접합체 및 이의 용도
KR102467024B1 (ko) 자가조립 및 역자가조립 가능한 pH 감응성 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 이의 용도
CN111939147A (zh) Nn-酰基氨酸酯在用于制备抗肿瘤药物中的应用
JP2001502897A (ja) 細胞毒性ペプチド
KR102316571B1 (ko) 간세포성 암종 특이적 항암 치료진단제
KR20190132144A (ko) 자가조립 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 그의 용도
Sancini et al. Functionalization with TAT-Peptide Enhances Blood-Brain Barrier Crossing
BR112020006150A2 (pt) peptídeos anticâncer e usos dos mesmos
Allen Understanding How Endosomal Membrane Permeabilizing Agents Can Be Improved for Efficient Intracellular Delivery