KR20240067078A - 보체 조절용 항c3b 항체를 포함하는 융합 단백질 - Google Patents
보체 조절용 항c3b 항체를 포함하는 융합 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 C3b에 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 여기서 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하고; 융합 단백질의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b와의 결합에 대해 융합 단백질의 폴리펩티드와 경쟁하지 않는다. 본원은 또한 폴리펩티드, 핵산, 벡터 및 이들을 제조하는 방법뿐만 아니라 치료 방법 및 약제학적 조성물도 제공한다.
Description
본 발명은 항 C3b 항체(예를 들어 단일 도메인 항체)를 포함하는 융합 단백질 및 보체 조절 단백질(CCP) 도메인을 포함하는 재조합 단백질에 관한 것이다.
보체 시스템은 선천성 면역 시스템의 중요한 부분을 구성한다. 보체 시스템은 침입하는 병원체와 죽어가는 숙주 세포를 제거하기 위해 표지시키거나 옵소닌화한다. 보체 시스템이 과도하게 활성화되면 여러 가지 질병이 발병할 수 있다. 따라서 보체 시스템은 이러한 질병을 치료하거나 개선하기 위한 억제제의 매력적인 표적으로 부상하고 있다.
보체 시스템은 고전 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로(AP)의 3개의 경로로 구성된다. 보체 시스템의 시작 단계에서, 고전 경로와 렉틴 경로의 패턴 인식 분자(PRM)가 활성화제에 결합한다. 이는 보체 성분 C4를 절단하는 PRM 관련 세린 프로테아제의 활성화로 이어진다. C4의 절단 생성물 중 하나인 C4b는 활성화제에 공유 결합되어 C2와 회합한다. C2의 단백질 분해 활성화 시, 이 복합체는 C3를 절단하는 C4b2a C3 전환효소를 형성한다. 절단 생성물 중 하나인 C3b는 활성화제에 공유적으로 부착되어 인자 B와 회합한다. C3b-결합된 인자 B는 인자 D에 의해 활성화될 수 있으며, 이는 C3b-결합된 Bb 모이어티에서 Ba 모이어티를 유리시키고 대체 경로 C3 전환효소, C3bBb의 형성시킨다. AP C3 전환효소는 C3를 절단하여 다른 두 경로의 결과를 증폭시킨다(Merle et al., 2015). 이 과정에서, C3(기질)은 C3bBb 복합체(AP C3 전환효소)의 C3b와 결합하고 프로테아제(Bb)는 C3를 C3b와 C3a로 절단한다.
AP는 C3의 내부 티오에스테르의 자발적인 가수분해를 통해 고전 경로와 렉틴 경로로 독립적으로 시작될 수도 있다. 생성된 C3(H2O)는 인자 B와 회합하고, 이는 이후 인자 D에 의해 절단된다. 생성된 복합체 C3(H2O)Bb는 C3를 C3a 및 C3b로 절단하는 유체상 C3 전환효소이다. 초기 C3b는 표면의 친핵체와 반응할 수 있으며, 이에 따라 유체상 C3 전환효소는 원칙적으로 모든 표면의 옵소닌화를 유발할 수 있다.
과도한 보체 활성화를 방지하기 위해 시스템은 또한 다수의 조절인자를 포함한다. 이러한 조절인자 중 하나인 인자 H는 숙주 세포와 상호작용하고 두 가지 방식으로 보체 진행을 억제하는 유체상 조절인자이다. 첫째, 인자 H는 중심 보체 C3b의 활성화 생성물을 분해하고 비가역적으로 불활성화시키는 세린 프로테아제 인자 I의 보조인자이다. 둘째, 인자 H는 대체 경로 C3 전환효소(C3bBb)의 붕괴를 가속화한다. 인자 H는 20개의 CCP 도메인을 포함한다.
폴리펩티드 링커에 의해 결합된 CCP1-4 및 CCP19-20을 포함하는 미니-FH를 포함하여, 인자 H의 다양한 최소화 버전이 이전에 설명되었다(도 1)(WO 2013/142362 A1). CCP1-3은 인자 I에 의한 C3b 단백질분해에 대한 보조인자 활성을 갖는 최소 단위인 것으로 여겨진다(Hocking et al. 2008).
C3 및 C3b에 결합할 수 있는 hC3Nb1으로 명명된 단일 도메인 항체는 문헌: Jensen et al. 2018에 개시되어 있다. EWE-hC3Nb1로 명명된 상기 단일 도메인 항체의 C3b 특이적 재조합 버전이 WO 2019/238674 A1에 설명되어 있다. 상기 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1은 인자 B(FB)가 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로(AP)를 억제한다. hC3Nb1은 C3b와 C3의 MG6과 MG7 도메인 사이의 경계면에 결합한다(도 2). C3과의 복합체에서, N-말단은 MG6 도메인에 매우 근접해 있다(도 2D). 본 발명자들은 hC3Nb1의 N-말단의 확장이 이를 C3b에 대해 특이적이게 만들 수 있음을 합리화하였다. 따라서 본 발명자들은 Glu-Trp-Glu 모티프에 의해 hC3Nb1의 N-말단을 확장시켰고, 이는 생성된 EWE-hC3Nb1의 C3b에 대한 특이성을 부여하였다(도 3). EWE-hC3Nb1은 인자 H의 CCP2에 가깝게 결합하지만 중첩되지는 않는다.
보체 시스템의 과잉 활성화는 조직 손상을 유도하고 만성 염증을 지속시키기 때문에 보체 시스템의 조절인자는 오랫동안 모색되어 왔다.
본 발명의 발명자들은 인자 H의 CCP2-4 및 CCP19-20 도메인을 포함하는 인자 H의 신규한 최소화된 버전에 C3b(EWE-hC3Nb1)를 결합할 수 있는 단일 도메인 항체의 재조합 연결이 인자 I에 의해 C3b의 절단을 매개하는 대체 경로(AP) 억제제를 생성한다는 놀라운 발견을 하였다. 실시예에서 볼 수 있듯이, 상기 새로운 융합 단백질은 단일 도메인 항체 모이어티와 놀랍게도 재조합 인자 H 모이어티의 능력을 모두 유지하므로, 본 발명자들은 실제로 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지하고 인자 I에 의해 C3b의 절단을 중재하는 AP 억제제를 발견하였음을 보여준다. 상기 융합 단백질의 놀라운 효과를 확인한 본 발명의 발명자들은 계속해서 EWE-hC3Nb1 및 CCP2-4로만 이루어진 더욱 최소화된 버전을 개발하였다. 이 더 작은 단백질은 C3b 절단을 촉진하는 데 훨씬 더 높은 효율, C3b에 대한 결합 친화도는 약간 낮고 고농도로 농축되는 높은 능력을 보여주었다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 양태에서, 융합 단백질로서,
a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
b) C3b에 결합하는 폴리펩티드로서, (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며; 선택적으로 상기 폴리펩티드는 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 추가로 포함하는 폴리펩티드
를 포함하고; 여기서 상기 융합 단백질의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 융합 단백질의 폴리펩티드와 C3b와의 결합에 대해 경쟁하지 않는 융합 단백질이 제공된다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3가 아닌 C3b에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 I과 경쟁하지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b와 인자 B 또는 활성 Bb 사이의 상호작용을 억제할 수 있고 이에 의해 C3bBb 전환효소 복합체의 조립 및/또는 C3bBb 전환효소의 활성을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B와 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B와 경쟁하고, C3b에 대한 결합에 대해 인자 I과 경쟁하지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b의 MG7 도메인(서열번호: 20) 및 C3b 알파 사슬의 N-말단 영역(예를 들어, 서열번호: 19의 잔기 1 내지 30, 1 내지 20 또는 4 내지 12)에 포함된 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 아미노산으로 이루어진 에피토프에 결합한다:
a) C3b의 Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당);
b) C3b의 Glu758, Glu759, Asn760, Arg855, Val916, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu10, Glu11, Asn12, Arg107, Val168, His170, His171, Phe172에 해당); 또는
c) C3b의 Asp752, Asp754, Ile755, Ile756, Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Asp4, Asp6, Ile7, Ile8, Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당).
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP1 도메인(서열번호: 21)과 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 단일 도메인 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 단일 도메인 항체는 C3b에 특이적으로 결합하고 (a) 서열번호: 23에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (b) N-말단 모티프를 포함하거나 이로 이루어지며, 선택적으로 상기 단일 도메인 항체는 서열번호: 23의 아미노산 서열 및 N-말단 모티프를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, N-말단 모티프는 C3에 대한 결합을 입체적으로 방해함으로써 C3b에 대한 특이성을 생성하며, 선택적으로 N-말단 모티프는 아미노산 EWE를 포함하거나 이로 이루어진 3개 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, 상기 단일 도메인 항체는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제1 링커에 의해 폴리펩티드에 연결된다.
일부 실시양태에서, 제1 링커는 글리신-세린(GS) 링커, 예컨대 서열번호: 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 GS 링커이다.
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예컨대 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이고, 선택적으로 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예컨대 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이고, 선택적으로 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및/또는 (ii) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및 (v) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예컨대 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이고, 선택적으로 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 CCP1 도메인, 예컨대 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것과 같이 인자 I을 동원할 수 있다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하며 인자 I을 동원하고/하거나 여기서 융합 단백질은 대체 경로 C3 전환효소, C3bBb의 형성을 방해하고 인자 I을 동원하는데, 예컨대 융합 단백질은 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화시킨다.
인자 I에 의한 C3b 단백질분해에 대한 인자 H 매개된 보조인자 활성이 CCP2-4만을 포함하는 신규 최소화 버전과 CCP2-4 및 CCP19-20을 포함하는 버전에서 유지된다는 것을 알게 된 본 발명은 두 가지 추가 양태에 관한 것이다:
220개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드; 및
350개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
추가 양태에서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 본 개시내용의 벡터를 세포에 도입하는 단계;
b) 세포를 배양하는 단계; 및
c) 세포로부터 벡터를 수집하고 정제하는 단계;
d) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계
를 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 본 개시내용의 핵산 또는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계;
b) 세포를 배양하는 단계; 및
c) 상등액으로부터 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 얻고 선택적으로 정제하는 단계;
d) 선택적으로, 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 정제하기 전에 세포를 용해시키는 단계
를 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화와 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 치료 유효량의 본 개시내용의 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 장애는 안과 질환, 신경계 질환, 자가면역 및 염증성 장애, 암 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 보체 시스템의 활성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 치료 유효량의 본 개시내용의 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계, 이로써 이를 필요로 하는 개인의 보체 시스템의 활성을 조절하는 단계를 포함한다.
도 1은 최소화된 인자 H 단편의 도식적 표현이다. (A) 인자 H의 CCP 도메인 1-4 및 19-20을 포함하는 이전에 기술된 미니-FH. (B) 단일 도메인 항체인 EWE-hC3Nb1(서열번호: 1), 뿐만 아니라 인자 H의 CCP 도메인 2-4 및 19-20(서열번호: 9)를 포함하는, 본 개시내용에 기술된 EWEμH 단편(서열번호: 5). (C) 본 개시내용에 기술된 EWEnH(서열번호: 7). EWEnH는 단일 도메인 항체인 EWE-hC3Nb1(서열번호: 1) 및 인자 H의 CCP 도메인 2-4(서열번호: 10)를 포함한다.
도 2는 C3b 및 천연 C3과의 복합체 중 hC3Nb1의 구조적 비교이다. (A) C3b(회색) [PDB 항목 6EHG] 및 (B) 천연 C3(회색) [PDB 항목 6RU5]와의 복합체 중 부모 hC3Nb1(검정색)의 구조. 패널 A와 B의 C3 분자는 마크로글로불린(MG) 고리에 정렬되어 있다. hC3Nb1과 (C) C3b [PDB 항목 6EHG] 및 (D) 천연 C3 [PDB 항목 6RU5] 간의 결합 인터페이스. 패널 C와 D의 구조는 hC3Nb1 분자에 정렬되어 있다.
(C)와 (D)를 비교할 때 상기 도면은 (D)에서 MG6 도메인이 hC3Nb1 단일 도메인 항체에 매우 근접한 반면 (C)에서는 MG6 도메인이 더 멀리 떨어져 있음을 보여준다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 추가적인 N-말단 모티프가 C3b(C)에 대한 특이성을 부여할 수 있다는 가설을 세웠다.
도 3은 EWE-hC3Nb1의 검증을 보여준다. (A) C3b:EWE-hC3Nb1 상호작용에 대한 SEC 기반 분석. EWE-hC3Nb1의 존재 또는 부재 하에 C3b를 SEC에 적용하였다. (B) 패널 A와 동일하지만 C3:EWE-hC3Nb1 상호 작용을 분석. (C) 패널 A-B의 피크 분획에 대한 비환원 SDS-PAGE 분석. 데이터는 이전에 WO 2019/238674 A1에 제시되어 있다.
상기 도면은 EWE-hC3Nb1이 C3b(A)와 혼합되었을 때 용출량에 명확한 변화를 부여했지만, 천연 C3(B)와 혼합되었을 때는 그렇지 않았음을 보여주며, 이는 EWE-hC3Nb1이 C3b에 대해 특이적임을 보여준다. 피크 분획의 후속 SDS PAGE를 통해 EWE-hC3Nb1:C3b 복합체(C)의 형성이 확인되었다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 N-말단 모티프의 첨가가 실제로 C3b에 대한 특이성을 생성하였다고 결론을 내렸다.
도 4는 EWEμH 및 EWEnH의 설계를 보여준다. (A) 왼쪽: hC3Nb1의 구조[PDB 항목 6EHG](Jensen et al., 2018)는 CCP1 도메인 없이 C3b:미니-FH[PDB 항목 5O35](Xue et al., 2017)의 구조에 중첩되었다. 점선은 EWE-hC3Nb1의 C 말단과 CCP2 도메인의 N 말단을 연결하는 유연한 링커를 보여준다. 오른쪽: hC3Nb1의 구조[PDB 항목 6EHG](Jensen et al., 2018)는 CCP1 및 CCP19-20 도메인이 없는 C3b:미니-FH[PDB 항목 5O35](Xue et al., 2017)의 구조에 중첩되었다. 점선은 EWE-hC3Nb1의 C 말단과 CCP2 도메인의 N 말단을 연결하는 유연한 링커를 보여준다. (B) 발자국으로 표시된 C3b에서 hC3Nb1의 상호작용 부위[PDB 항목 6EHG]. (C) 발자국으로 표시된 C3b의 미니-FH CCP1 상호작용 부위[PDB 항목 5O35]. hC3Nb1 및 CPP1의 4.5Å 내의 아미노산 잔기는 각각 패널 B 및 C에 표시된다.
상기 도면은 본 개시내용의 융합 단백질이 어떻게 C3b에 결합하는지(A), 그리고 EWE-hC3Nb1 및 FH CCP1이 동일한 영역에서 C3b와 접촉하고 어느 정도 C3b(B) 및 (C) 상의 동일한 잔기와 상호작용한다는 것을 보여준다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 EWE-hC3Nb1과 FH CCP1 도메인이 C3b에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다는 결론을 내렸다.
도 5는 EWEμH의 초기 검증을 보여준다. (A-B) 인자 I에 의한 인자 H 매개된 C3b 절단. C3b는 0.2% 인자 H, 1% 인자 I 및 (A) EWE-hC3Nb1 또는 (B) hC3Nb1의 1.2배 몰 과량과 함께 배양되었다. 패널 A의 데이터는 이전에 WO 2019/238674 A1에 제시되어 있다. C3b의 절단을 SDS PAGE로 모니터링하였다. (C) EWEμH 절단 분석. C3b는 인자 I 및 2배 몰 과량의 미니-FH, EWEμH 또는 미니-FH 뿐만 아니라 EWE-hC3Nb1의 존재 하에 배양되었다. C3b의 절단은 37℃에서 표시된 배양 시 SDS-PAGE 분석에 의해 모니터링되었다.
상기 도면은 EWE-hC3Nb1(A) 및 hC3Nb1(B)이 인자 I에 의해 C3b의 절단을 지연시키는 것을 보여준다. 또한, 미니 FH(CCP1-4, 19-20) 및 EWE-hC3Nb1과 미니-FH(CCP1-4, 19-20) 둘의 혼합물과 비교하여 EWEμH(C)는 EWEμH가 C3b의 절단을 지속시키지만, EWE-hC3Nb1과 미니-FH의 혼합물은 그렇지 않음을 보여준다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 EWEμH가 인자 I에 의해 C3b의 절단을 매개한다는 결론을 내렸다.
도 6은 EWEμH와 EWEnH의 비교를 보여준다. (A-B) EWEμH와 EWEnH의 비교. C3b는 0.5% 인자 I 및 (A) 0.5배 몰비 또는 (B) 2배 몰 과량의 EWEμH 또는 EWEnH와 함께 배양되었다. 인자 I에 의한 C3b의 절단은 37℃에서 지정된 배양시 SDS-PAGE 분석으로 모니터링되었다. (C) 절단의 정량화. 패널 a-b에서 C3b의 α'-사슬 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 강도는 8시간 동안 인자 I과 함께 배양된 C3b의 α'-사슬 강도로 정규화되었다. 평균 및 S.D. (오차 막대)는 1:2 비율의 경우 n=3 실험과 1:0.5 비율의 경우 n=2 실험에 대해 표시된다.
상기 도면은 EWEnH 및 EWEμH가 1:0.5(A) 및 1:2(B)의 C3b:융합 단백질 몰비에서 인자 I에 의해 C3b의 절단을 매개한다는 것을 보여준다. (C)의 정량적 비교는 EWEnH가 테스트된 두 몰비 모두에서 C3b 절단을 지속시키는 데 더 효율적임을 나타낸다. 이들 데이터는 두 융합 단백질 모두 C3b의 절단을 매개할 수 있고 EWEnH가 더 효율적일 수 있다는 결론이다.
도 7은 EWE-hC3Nb1의 바이오층 간섭계 기반 분석을 보여준다. (A) 항-펜타 his 바이오센서를 EWE-hC3Nb1로 코팅하였고 센서를 1.56-50 nM C3b의 희석 시리즈로 옮겼다. (B) 항-펜타 his 바이오센서를 EWE-hC3Nb1로 코팅하고 3.125-50 nM iC3b의 희석 시리즈로 옮겼다.
상기 도면은 EWE-hC3Nb1이 C3b(A)와 iC3b(B)에 대해 유사한 친화도를 나타냄을 보여준다.
도 8은 EWEμH의 바이오층 간섭계 기반 분석을 보여준다. (A) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEμH로 코팅하였고 센서를 1.5625-50 nM C3b의 희석 시리즈로 옮겼다. (B) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEμH로 코팅하고 3.125-50 nM 범위의 iC3b 희석 시리즈로 옮겼다.
상기 도면은 EWEμH가 iC3b(B)보다 C3b(A)에 대해 더 높은 친화도를 나타냄을 보여준다.
도 9는 EWEnH의 바이오층 간섭계 기반 분석을 보여준다. (A) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEnH로 코팅하였다. 센서를 3.125-100 nM C3b의 희석 시리즈로 옮겼다. (B) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEnH로 코팅하였다. 테스트된 iC3b 농도 범위는 6.25-100nM이다.
상기 도면은 EWEnH가 C3b(A)와 iC3b(B)에 대해 유사한 친화도를 나타냄을 보여준다.
도 10은 친화도를 요약한 것이다. (A) 표에는 C3b 동역학에 대한 n=3 실험과 iC3b 동역학에 대한 n=2 실험의 ka, kd 및 KD ± 표준 편차의 평균이 요약되어 있다.
상기 도면은 융합 EWEμH가 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1보다 C3b에 대해 대략 10배 더 강하게 결합하는 반면, iC3b에 대해서는 유사한 친화도로 결합함을 보여준다. 융합 단백질 EWEnH는 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1보다 C3b 및 iC3b에 대한 결합 친화도가 약간 더 낮다. 전반적으로, 이들 데이터는 단일 도메인 항체가 융합 단백질에 포함될 때 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1의 C3b 및 iC3b에 대한 강한 결합 친화도가 유지된다는 결론이다.
도 11은 EWEμH와 EWEnH의 기능 비교를 보여준다. (A) 토끼 적혈구의 AP 매개된 용혈 억제. EWE-hC3Nb1, EWEμH, 및 EWEnH의 효과는 11% 혈청에서 분석되었다. 세포용해는 나노바디가 없는 NHS에서 100%, NHS가 없는 경우 0%로 정규화되었다. 상기 효과는 부모 AP 억제제 hC3Nb1(Jensen et al., 2018), 광범위한 억제제 hC3Nb2(Pedersen et al., 2020), 및 불활성 hC3Nb1(W102A) 돌연변이체(Jensen et al., 2018)와 비교되었다. 점선은 희석되지 않은 혈청 내 C3 농도가 5.4μM이라고 가정할 때 추정되는 C3 농도를 나타낸다(Engstrom et al., 2007). 평균 및 S.D. (오차 막대)는 n=3 실험에 대해 표시된다.
상기 도면은 EWEμH, EWEnH, EWE-hC3Nb1, 및 hC3Nb1이 AP 매개된 C3 단편 침착을 억제한다는 것을 보여준다. 데이터는 단일 도메인 항체가 융합 단백질에 포함될 때 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1의 기능적 특성이 유지된다는 것을 확인시켜 준다.
도 12는 EWEμH 및 EWEnH의 농도 분석을 보여준다. (A) EWEμH 및 EWEnH를 농축하여 SEC를 실시하였다. (B) 패널 C의 피크 분획에 대한 SDS-PAGE 분석.
상기 도면은 융합 단백질 EWEnH가 EWEμH보다 더 높은 농도의 한외여과를 견딜 수 있음을 보여준다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 더 작은 단백질 EWEnH가 놀라울 정도로 높은 농도로 한외여과되는 것을 용인하고 따라서 EWEμH보다 더 높은 임상적, 상업적 가치를 가질 수 있다고 결론을 내렸다.
도 13은 래트 C3b의 EWEnH 및 EWEμH 매개된 분해를 보여준다. 래트 C3b는 1% w/w 인자 I 및 2배 몰 과량의 EWEμH 또는 EWEnH와 함께 배양되었다. 인자 I에 의한 래트 C3b의 절단은 37℃에서 지시된 배양시 SDS-PAGE 분석에 의해 모니터링되었다. 상기 도면은 EWEμH와 EWEnH가 모두 인자 I에 의해 래트 C3b의 절단을 매개할 수 있음을 보여준다.
도 2는 C3b 및 천연 C3과의 복합체 중 hC3Nb1의 구조적 비교이다. (A) C3b(회색) [PDB 항목 6EHG] 및 (B) 천연 C3(회색) [PDB 항목 6RU5]와의 복합체 중 부모 hC3Nb1(검정색)의 구조. 패널 A와 B의 C3 분자는 마크로글로불린(MG) 고리에 정렬되어 있다. hC3Nb1과 (C) C3b [PDB 항목 6EHG] 및 (D) 천연 C3 [PDB 항목 6RU5] 간의 결합 인터페이스. 패널 C와 D의 구조는 hC3Nb1 분자에 정렬되어 있다.
(C)와 (D)를 비교할 때 상기 도면은 (D)에서 MG6 도메인이 hC3Nb1 단일 도메인 항체에 매우 근접한 반면 (C)에서는 MG6 도메인이 더 멀리 떨어져 있음을 보여준다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 추가적인 N-말단 모티프가 C3b(C)에 대한 특이성을 부여할 수 있다는 가설을 세웠다.
도 3은 EWE-hC3Nb1의 검증을 보여준다. (A) C3b:EWE-hC3Nb1 상호작용에 대한 SEC 기반 분석. EWE-hC3Nb1의 존재 또는 부재 하에 C3b를 SEC에 적용하였다. (B) 패널 A와 동일하지만 C3:EWE-hC3Nb1 상호 작용을 분석. (C) 패널 A-B의 피크 분획에 대한 비환원 SDS-PAGE 분석. 데이터는 이전에 WO 2019/238674 A1에 제시되어 있다.
상기 도면은 EWE-hC3Nb1이 C3b(A)와 혼합되었을 때 용출량에 명확한 변화를 부여했지만, 천연 C3(B)와 혼합되었을 때는 그렇지 않았음을 보여주며, 이는 EWE-hC3Nb1이 C3b에 대해 특이적임을 보여준다. 피크 분획의 후속 SDS PAGE를 통해 EWE-hC3Nb1:C3b 복합체(C)의 형성이 확인되었다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 N-말단 모티프의 첨가가 실제로 C3b에 대한 특이성을 생성하였다고 결론을 내렸다.
도 4는 EWEμH 및 EWEnH의 설계를 보여준다. (A) 왼쪽: hC3Nb1의 구조[PDB 항목 6EHG](Jensen et al., 2018)는 CCP1 도메인 없이 C3b:미니-FH[PDB 항목 5O35](Xue et al., 2017)의 구조에 중첩되었다. 점선은 EWE-hC3Nb1의 C 말단과 CCP2 도메인의 N 말단을 연결하는 유연한 링커를 보여준다. 오른쪽: hC3Nb1의 구조[PDB 항목 6EHG](Jensen et al., 2018)는 CCP1 및 CCP19-20 도메인이 없는 C3b:미니-FH[PDB 항목 5O35](Xue et al., 2017)의 구조에 중첩되었다. 점선은 EWE-hC3Nb1의 C 말단과 CCP2 도메인의 N 말단을 연결하는 유연한 링커를 보여준다. (B) 발자국으로 표시된 C3b에서 hC3Nb1의 상호작용 부위[PDB 항목 6EHG]. (C) 발자국으로 표시된 C3b의 미니-FH CCP1 상호작용 부위[PDB 항목 5O35]. hC3Nb1 및 CPP1의 4.5Å 내의 아미노산 잔기는 각각 패널 B 및 C에 표시된다.
상기 도면은 본 개시내용의 융합 단백질이 어떻게 C3b에 결합하는지(A), 그리고 EWE-hC3Nb1 및 FH CCP1이 동일한 영역에서 C3b와 접촉하고 어느 정도 C3b(B) 및 (C) 상의 동일한 잔기와 상호작용한다는 것을 보여준다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 EWE-hC3Nb1과 FH CCP1 도메인이 C3b에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다는 결론을 내렸다.
도 5는 EWEμH의 초기 검증을 보여준다. (A-B) 인자 I에 의한 인자 H 매개된 C3b 절단. C3b는 0.2% 인자 H, 1% 인자 I 및 (A) EWE-hC3Nb1 또는 (B) hC3Nb1의 1.2배 몰 과량과 함께 배양되었다. 패널 A의 데이터는 이전에 WO 2019/238674 A1에 제시되어 있다. C3b의 절단을 SDS PAGE로 모니터링하였다. (C) EWEμH 절단 분석. C3b는 인자 I 및 2배 몰 과량의 미니-FH, EWEμH 또는 미니-FH 뿐만 아니라 EWE-hC3Nb1의 존재 하에 배양되었다. C3b의 절단은 37℃에서 표시된 배양 시 SDS-PAGE 분석에 의해 모니터링되었다.
상기 도면은 EWE-hC3Nb1(A) 및 hC3Nb1(B)이 인자 I에 의해 C3b의 절단을 지연시키는 것을 보여준다. 또한, 미니 FH(CCP1-4, 19-20) 및 EWE-hC3Nb1과 미니-FH(CCP1-4, 19-20) 둘의 혼합물과 비교하여 EWEμH(C)는 EWEμH가 C3b의 절단을 지속시키지만, EWE-hC3Nb1과 미니-FH의 혼합물은 그렇지 않음을 보여준다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 EWEμH가 인자 I에 의해 C3b의 절단을 매개한다는 결론을 내렸다.
도 6은 EWEμH와 EWEnH의 비교를 보여준다. (A-B) EWEμH와 EWEnH의 비교. C3b는 0.5% 인자 I 및 (A) 0.5배 몰비 또는 (B) 2배 몰 과량의 EWEμH 또는 EWEnH와 함께 배양되었다. 인자 I에 의한 C3b의 절단은 37℃에서 지정된 배양시 SDS-PAGE 분석으로 모니터링되었다. (C) 절단의 정량화. 패널 a-b에서 C3b의 α'-사슬 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 강도는 8시간 동안 인자 I과 함께 배양된 C3b의 α'-사슬 강도로 정규화되었다. 평균 및 S.D. (오차 막대)는 1:2 비율의 경우 n=3 실험과 1:0.5 비율의 경우 n=2 실험에 대해 표시된다.
상기 도면은 EWEnH 및 EWEμH가 1:0.5(A) 및 1:2(B)의 C3b:융합 단백질 몰비에서 인자 I에 의해 C3b의 절단을 매개한다는 것을 보여준다. (C)의 정량적 비교는 EWEnH가 테스트된 두 몰비 모두에서 C3b 절단을 지속시키는 데 더 효율적임을 나타낸다. 이들 데이터는 두 융합 단백질 모두 C3b의 절단을 매개할 수 있고 EWEnH가 더 효율적일 수 있다는 결론이다.
도 7은 EWE-hC3Nb1의 바이오층 간섭계 기반 분석을 보여준다. (A) 항-펜타 his 바이오센서를 EWE-hC3Nb1로 코팅하였고 센서를 1.56-50 nM C3b의 희석 시리즈로 옮겼다. (B) 항-펜타 his 바이오센서를 EWE-hC3Nb1로 코팅하고 3.125-50 nM iC3b의 희석 시리즈로 옮겼다.
상기 도면은 EWE-hC3Nb1이 C3b(A)와 iC3b(B)에 대해 유사한 친화도를 나타냄을 보여준다.
도 8은 EWEμH의 바이오층 간섭계 기반 분석을 보여준다. (A) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEμH로 코팅하였고 센서를 1.5625-50 nM C3b의 희석 시리즈로 옮겼다. (B) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEμH로 코팅하고 3.125-50 nM 범위의 iC3b 희석 시리즈로 옮겼다.
상기 도면은 EWEμH가 iC3b(B)보다 C3b(A)에 대해 더 높은 친화도를 나타냄을 보여준다.
도 9는 EWEnH의 바이오층 간섭계 기반 분석을 보여준다. (A) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEnH로 코팅하였다. 센서를 3.125-100 nM C3b의 희석 시리즈로 옮겼다. (B) 항-펜타 his 바이오센서를 EWEnH로 코팅하였다. 테스트된 iC3b 농도 범위는 6.25-100nM이다.
상기 도면은 EWEnH가 C3b(A)와 iC3b(B)에 대해 유사한 친화도를 나타냄을 보여준다.
도 10은 친화도를 요약한 것이다. (A) 표에는 C3b 동역학에 대한 n=3 실험과 iC3b 동역학에 대한 n=2 실험의 ka, kd 및 KD ± 표준 편차의 평균이 요약되어 있다.
상기 도면은 융합 EWEμH가 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1보다 C3b에 대해 대략 10배 더 강하게 결합하는 반면, iC3b에 대해서는 유사한 친화도로 결합함을 보여준다. 융합 단백질 EWEnH는 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1보다 C3b 및 iC3b에 대한 결합 친화도가 약간 더 낮다. 전반적으로, 이들 데이터는 단일 도메인 항체가 융합 단백질에 포함될 때 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1의 C3b 및 iC3b에 대한 강한 결합 친화도가 유지된다는 결론이다.
도 11은 EWEμH와 EWEnH의 기능 비교를 보여준다. (A) 토끼 적혈구의 AP 매개된 용혈 억제. EWE-hC3Nb1, EWEμH, 및 EWEnH의 효과는 11% 혈청에서 분석되었다. 세포용해는 나노바디가 없는 NHS에서 100%, NHS가 없는 경우 0%로 정규화되었다. 상기 효과는 부모 AP 억제제 hC3Nb1(Jensen et al., 2018), 광범위한 억제제 hC3Nb2(Pedersen et al., 2020), 및 불활성 hC3Nb1(W102A) 돌연변이체(Jensen et al., 2018)와 비교되었다. 점선은 희석되지 않은 혈청 내 C3 농도가 5.4μM이라고 가정할 때 추정되는 C3 농도를 나타낸다(Engstrom et al., 2007). 평균 및 S.D. (오차 막대)는 n=3 실험에 대해 표시된다.
상기 도면은 EWEμH, EWEnH, EWE-hC3Nb1, 및 hC3Nb1이 AP 매개된 C3 단편 침착을 억제한다는 것을 보여준다. 데이터는 단일 도메인 항체가 융합 단백질에 포함될 때 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1의 기능적 특성이 유지된다는 것을 확인시켜 준다.
도 12는 EWEμH 및 EWEnH의 농도 분석을 보여준다. (A) EWEμH 및 EWEnH를 농축하여 SEC를 실시하였다. (B) 패널 C의 피크 분획에 대한 SDS-PAGE 분석.
상기 도면은 융합 단백질 EWEnH가 EWEμH보다 더 높은 농도의 한외여과를 견딜 수 있음을 보여준다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 더 작은 단백질 EWEnH가 놀라울 정도로 높은 농도로 한외여과되는 것을 용인하고 따라서 EWEμH보다 더 높은 임상적, 상업적 가치를 가질 수 있다고 결론을 내렸다.
도 13은 래트 C3b의 EWEnH 및 EWEμH 매개된 분해를 보여준다. 래트 C3b는 1% w/w 인자 I 및 2배 몰 과량의 EWEμH 또는 EWEnH와 함께 배양되었다. 인자 I에 의한 래트 C3b의 절단은 37℃에서 지시된 배양시 SDS-PAGE 분석에 의해 모니터링되었다. 상기 도면은 EWEμH와 EWEnH가 모두 인자 I에 의해 래트 C3b의 절단을 매개할 수 있음을 보여준다.
제어되지 않은 적절한 보체 조절의 활성화 또는 결여는 다양한 질병에 관여하며, 따라서 본 개시내용은 질병 결과를 개선하기 위해 보체 캐스케이드의 약리학적 조절 수단을 제공한다.
본 발명은 보체 C3b 단백질을 표적화하고 이의 분해를 촉진할 수 있는 융합 단백질에 관한 것이다. 일반적으로, 본 개시내용의 융합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)을 포함하므로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)이 아래에 추가로 기술되는 경우, 이는 융합단백질에 포함된 것으로 이해된다.
특히, 본 개시내용은 (a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및 (b) μH(마이크로-H) 또는 nH(나노-H)와 같은 보체 조절 단백질(CCP) 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인자 B(FB)(서열번호: 30)가 C3b에 결합하는 것을 방지할 수 있고, 재조합 단백질은 인자 I(서열번호: 22)을 동원할 수 있다. 결과적으로, 융합 단백질은 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지하고 인자 I에 의한 C3b의 절단을 매개함으로써 AP를 억제할 수 있다.
보체 시스템
보체 시스템은 선천성 면역 시스템의 일부이며 침입하는 미생물로부터 보호하고 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 선천성 면역 체계는 적응력이 없으며 개인의 일생 동안 변하지 않는다. 혈청 단백질, 장막 단백질, 세포막 결합 수용체 및 조절 단백질을 포함하여 50개 이상의 단백질과 단백질 단편이 보체 시스템을 구성한다. 보체 단백질의 하위세트는 불활성 전구체(전단백질)로 순환한다. 여러 가지 유발 요인 중 하나에 의해 자극을 받으면 상기 시스템의 프로테아제는 특정 단백질을 절단하여 추가 절단의 증폭 캐스케이드를 시작한다. 이러한 활성화 캐스케이드의 최종 결과에는 반응의 대규모 증폭, 식균작용 및 병원체 용해 강화, 면역 복합체 및 세포사멸 세포 제거, 염증, 적응 면역 반응 자극 및 세포 살해 막 공격 복합체의 조립이 포함된다.
보다 구체적으로, 보체 시스템은 세 가지 다른 단백질 분해 경로, 즉 고전 경로(CP), 렉틴 경로(LP) 및 대체 경로(AP)에 의해 활성화된다. 보체 시스템의 활성화로 인해 보체 단백질 C3(모든 경로)이 C3a 및 C3b로 절단된다. 보체 활성화 표면에서 C3b 밀도의 특정 역치에 도달한 후, 말단 경로(TP)가 활성화되어 보체 C5가 절단된다.
CP는 패턴 인식 분자 C1q와 세린 프로테아제 C1r 및 C1s에 의해 형성된 C1 복합체에 의해 활성화된다. C1 인식은 C1 복합체의 활성화로 이어진다. C1은 C4를 C4a와 C4b로 절단하고, C2는 이제 C4b에 결합할 수 있으며, C2는 C1 복합체에 의해 C2a와 C2b로 절단된다. C4bC2a는 C3를 C3a와 C3b로 절단하는 CP C3 전환효소이다.
LP는 각각 만노스 결합 렉틴(MBL), 콜렉틴 CL-LK 및 3개의 피콜린에 의한 탄수화물 또는 아세틸화된 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)의 인식에 의해 개시된다. MBL, CL-LK 및 피콜린은 MBL, CL-LK 및 피콜린이 DAMP 및 PAMP에 결합할 때 활성화되는 MBL 관련 세린 프로테아제(MASP) -1 및 -2와 연관되어 있다. MASP-1 및 MASP-2 활성화는 고전적 경로와 동일한 단백질 분해 캐스케이드를 유발하고 또한 CP C3 전환효소의 조립을 유도한다.
AP는 C3의 내부 티오에스테르의 자발적 가수분해에 의해 활성화되어 C3(H2O)가 형성될 수 있다. C3(H2O)는 프로테아제 인자 B(FB)와 회합하고, 이는 인자 D에 의해 Bb와 Ba로 절단된다. C3(H2O)와 Bb 사이의 복합체는 C3를 C3a와 C3b로 절단하는 유체상 AP C3 전환효소이다. C3b는 표면의 근처 친핵체와 반응하여 이들에 공유 결합되어 활성화제 결합된 C3b를 생성한다. 이러한 C3b는 절단된 FB와 회합하여 AP C3 전환효소인 C3bBb가 형성된다. AP C3 전환효소는 C3를 C3b와 C3a로 절단하고 증폭 루프에서 더 많은 AP 전환효소가 형성된다. 활성화제 결합된 C3b는 또한 CP C3 전환효소에 의해 수행된 C3 절단에서 유래할 수 있으며, 실제로 AP C3 전환효소는 CP 및 LP에서 발생하는 초기 C3 절단을 강력하게 증폭시킨다.
C3 및 C3b
보체 성분 3(C3)은 선천성 면역성 및 보체 시스템에서 중심 역할을 하는 면역 시스템 단백질이다. 인간 C3(서열번호: 33)은 1,663개의 아미노산 서열(N-말단, 22개의 아미노산 신호 펩티드 포함)을 포함한다. C3은 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결된 알파 사슬과 베타 사슬을 포함한다. C3b는 알파 사슬의 작은 아나필라톡신 도메인(아미노산 668 내지 748)의 단백질 분해 제거에 의해 C3으로부터 형성된다. 따라서, 아미노산 23 내지 667은 C3b 베타 사슬(서열번호: 24)을 코딩하고, 아미노산 749 내지 1,663은 C3b 알파 사슬(서열번호: 19)을 코딩한다.
C3b는 강력한 옵소닌으로, 병원균, 항체-항원 면역 복합체 및 식세포와 NK 세포에 의한 식세포작용을 위한 세포사멸 세포를 표적으로 한다. C3b는 또한 보체 반응을 활성화하고 증폭시키기 위한 전환효소 복합체의 형성에도 관여한다. C3b는 인자 B와 회합하여 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb를 형성한다.
C3b는 iC3b로 지정된 전환효소 조립에 참여할 수 없는 불활성 형태로 처리될 수 있다. 절단은 보체 인자 I에 의해 수행되며 보체 인자 I에 대한 보조 인자에 의해 촉진된다. 보체 인자 I에 대한 보조 인자는 일반적으로 C3b 및/또는 보체 인자 I에 결합하고, 보체 인자 I에 의해 C3b에서 iC3b로의 처리를 강화한다. 보체 인자 I에 대한 보조 인자로 작용할 수 있는 분자에는 보체 인자 H가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "C3"은 임의의 종으로부터의 C3을 지칭한다. 일부 실시양태에서, C3은 포유동물 C3(예를 들어 시노몰구스, 인간 및/또는 설치류(예를 들어 래트 및/또는 쥐과) C3), 바람직하게는 인간 C3이다. 일부 실시양태에서, C3은 서열번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "C3b"는 임의의 종으로부터의 C3b를 지칭한다. 일부 실시양태에서, C3b는 포유동물 C3b(예를 들어 시노몰구스, 인간 및/또는 설치류(예를 들어 래트 및/또는 쥐과) C3b), 바람직하게는 인간 C3b이다. 일부 실시양태에서, C3b는
(a) 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 C3b 알파 사슬; 및
(b) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 C3b 베타 사슬
을 포함함을 특징으로 한다.
본 개시내용의 맥락에서 개별 보체 단백질은 추가로 하기 서열 목록에 제시된 특정 단백질로서 식별될 수 있지만, 관련 기술분야의 기술자는 본 개시내용이 본원에 개시된 특정 종 또는 단백질에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
단일 도메인 항체를 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편
본 발명의 융합 단백질은 C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 특이적으로 결합한다. "C3b에 특이적으로 결합하는"이라는 용어는 다른 항원(예컨대 C3)에 결합하지 않거나, 생리학적 효과를 생성하기에 충분한 친화도로 다른 항원에 결합하지 않는 항체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, C3b를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b와 인자 B(FB) 또는 활성 Bb 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 이는 C3bBb 전환효소 복합체의 조립 및/또는 C3bBb 전환효소의 활성을 억제한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 보체 시스템의 활성화를 억제할 수 있다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제할 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인자 B의 Asn122에 부착된 글리칸과 C3b의 상호작용을 차단함으로써 C3b와 인자 B(FB) 또는 C3b에 대한 이의 단편 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 결합하고 기질 C3(예를 들어, 서열번호: 33에 따르는 아미노산 서열)의 C3b, 예를 들어 C3b 단독 또는 AP C3 전환효소(C3bBb)의 C3b로의 결합을 방지할 수 있다. C3b의 C3으로의 결합을 차단함으로써, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 대체 경로를 억제할 수 있다.
"항체"라는 용어는 특정 항원에 결합하거나 면역학적으로 반응성인 면역글로불린(Ig) 분자를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 인간 항체는 이종사량체이다. 항체는 일반적으로 2개의 "경쇄"(LC)와 2개의 "중쇄"(HC)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 불변 영역(CH) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고; 각각의 경쇄는 경쇄 불변 도메인(CL) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3(항체 클래스 IgA, IgD 및 IgG) 및 선택적으로 중쇄 불변 도메인 CH4(항체 클래스 IgE 및 IgM)를 포함한다.
가변 영역 VH 및 VL은 초가변 영역으로도 알려져 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역을 추가로 포함한다. 항체와 이의 표적 항원 또는 에피토프 사이의 결합은 CDR에 의해 매개된다. CDR은 보다 보존된 프레임워크 영역(FR)과 함께 산재되어 있다. 일반적으로, 항체의 각 VH 및 VL에는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(아미노 말단에서 카르복시 말단까지)의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR이 있다.
중쇄와 경쇄의 불변 영역은 항체가 표적에 결합하는 방식에 직접 관여하기보다는 이펙터 역할을 한다. 면역글로불린은 항체의 불변 영역을 통해 숙주 조직이나 인자에 부착되어 면역 반응을 촉진할 수 있다. IgA, IgG, IgD, IgE, 및 IgM은 중쇄 불변 영역의 5가지 주요 클래스이며, 각각은 이소형으로 지정된 고유한 이펙터 역할을 갖는다. 특정 실시양태에서, C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG 이소형이다. 항체 또는 항원 결합 단편은 임의의 IgG 하위클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. "단일클론 항체"(mAb)는 단일 항원 결정자 또는 에피토프를 인식하고 결합하는 동종 항체 집단을 지칭한다. 이는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 형질전환 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 통해 얻을 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간, 래트, 마우스, 말, 토끼, 염소, 돼지, 소, 닭, 낙타과, 당나귀, 또는 이의 키메라 버전과 같은 재조합 수단에 의해 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
인간 또는 인간화된 항체, 특히 재조합 인간 또는 인간화된 항체가 특히 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR, 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 항원 결합 폴리펩티드의 임의의 자연 발생 또는 인공적으로 작제된 구성을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 항원(예: C3b)에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따르는 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체, 미니바디, Fab', V NAR 도메인, IgNAR, Fv, scFv, Fd, Fcab, scFv-Fc, F(ab')2, di-scFv, 인트라바디, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, IgG CH2, 이중특이적 T 세포 인게이저(BiTE®), F(ab')3, DVD-Ig, (scFv)2, mAb2, DARPin, 또는 고리형 펩티드일 수 있다.
수용체와 이의 리간드 사이, 예를 들어 항체와 항원 사이의 결합 강도는 항원에 대한 친화도로 정의될 수 있다. 항체의 친화도는 복합체를 형성하는 분자로 가역적으로 분리(해리)하려는 분자 복합체의 성향을 측정하는 평형 상수인 해리 상수, KD로 정의될 수 있다. 항체의 KD 값이 작을수록 항체가 표적 항원에 결합하는 친화도가 높아진다. 하나의 양태에서, KD는 koff/kon 비율로 정의되며, 여기서 koff 및 kon은 분자 복합체의 결합 및 해리에 대한 속도 상수이다. 바람직하게는 친화도는 IC50 값을 기준으로 해리 상수 KD를 계산하여 결정된다. 따라서, 친화도는 겉보기 친화도로 측정된다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 ELISA 분석에서 EC50 값(최대 결합의 50%를 달성하는 유효 농도)을 기준으로 한 겉보기 친화도를 기반으로 측정 시, 약 10-4 M 이하, 예컨대 약 10-5 M 이하, 예컨대 약 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 이하의 KD에 해당하는 친화도로 결합하는 것이 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 항체는 약 10-6 M 이하, 예컨대 10-6 내지 10-18 M의 KD에 해당하는 친화도로 결합한다. 항체에 대한 KD 값은 본 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD는 바이오센서 시스템, 예를 들어 Biacore® 시스템을 사용하거나, Octet RED96 시스템과 같은 바이오층 간섭계 기술을 사용하여 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정된 바와 같이 10-4 M 내지 10-11 M, 10-4 M 내지 10-10 M, 10-4 M 내지 10-9 M, 10-4 M 내지 10-8 M, 10-4 M 내지 10-7 M, 10-4 M 내지 10-6 M, 10-4 M 내지 10-5 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-5 M 내지 10-6 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-7 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 또는 10-9 M 내지 10-10 M의 KD에 해당하는 친화도로 결합한다. 하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정된 바와 같이 10-8 M 내지 10-10 M의 KD에 해당하는 친화도로 결합한다.
항체는 또한 또는 대안적으로 비특이적 항원(예: BSA 또는 카세인)에 대한 결합 친화도보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1000배 더 낮은 KD에 해당하는 친화도로 이들의 표적 보체 인자에 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질에 포함된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 폴리펩티드에 항원 결합 부위를 포함한다. 따라서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에서 "단일 도메인 항체"로 지칭된다. 단일 도메인 항체는 나노바디라고도 알려져 있다.
단일 도메인 항체는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 자연적으로 발생하는 인간 항체와 마찬가지로, 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 단일 도메인 항체는 일반적으로 12 내지 15 kDa 범위의 분자량을 갖는데, 즉, 일반적으로 150 내지 160 kDa 범위의 일반 항체보다 훨씬 낮다. 단일 도메인 항체는 또한 하나의 경쇄와 절반의 중쇄로 이루어진 이종사량체 항체의 Fab 단편(~50 kDa)보다 작다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 VH/VHH 또는 VL 도메인에 의해 형성된다. 따라서, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 항원 결합 부위는 3개 이하의 CDR로 형성된다.
그와 같이, 단일 도메인 항체의 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있고; 단일 항원 결합 단위를 형성할 수 있는 한(즉, 본질적으로 단일 가변 도메인으로 이루어진 기능성 항원 결합 단위), 단일 항원 결합 도메인은 기능성 항원 결합 단위를 형성하기 위해 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없다.
본 개시내용의 단일 도메인 항체는 바람직하게는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 특히, CDR은 항체의 특이성을 확인할 수 있으며 따라서 항원 결합 부위는 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 적어도 1개, 더욱 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 더 바람직하게는 3개의 CDR을 포함하는 것이 바람직하다. 하나의 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 3개의 CDR을 포함한다.
표적 결합에서 CDR 영역의 중요성이 높기 때문에, 일반적으로 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: 단일 도메인 항체)의 서열 변경이 CDR 외부에서 이루어지는 것으로 간주된다. 따라서, 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 임의의 서열 변이는 상보성 결정 영역 외부에 있다. 일단 서열이 획득되면, CDR 영역의 서열은 다양한 방법으로 주석을 달 수 있다. 본 발명의 CDR 및 프레임워크 영역의 정확한 경계는 Kabat 방법을 사용하여 결정되었다.
단일 도메인 항체는 자연에서 발견되는 항체, 예를 들어 낙타과(VHH) 및 연골 어류(VNAR)에서 유래할 수 있다. 신규 또는 수염상어 항원 수용체(NAR) 단백질은 연관된 경쇄가 없는 2개의 중쇄의 이량체로 존재한다. 각 사슬은 1개의 가변(V)과 5개의 불변 도메인으로 이루어진다. 따라서 NAR 단백질은 단일 면역글로불린 가변형 도메인을 구성한다. 단일 중쇄 항체는 또한 단봉낙타, 낙타, 라마, 알파카와 같은 낙타과에서도 발견되는데, 여기서 중쇄는 불변 영역 중 하나를 잃어 가변 영역에서 변형을 겪는데, 이 두 가지 모두 경쇄의 결합에 필요한 구조적 요소이다.
그러나, 단일 도메인 항체는 재조합 방법으로 조작될 수도 있다. 한 가지 접근법은 인간이나 마우스로부터의 공통 IgG에서 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 경쇄에서 유래된 단일 도메인도 표적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 따라서, 단일 도메인 항체는 임의의 적합한 유기체로부터 유래될 수 있다.
단일 도메인 낙타과 항체는 특이성 측면에서 일반 항체와 대등하다. 단일 도메인 항체는 예를 들어 파지 패닝 절차를 사용하여 쉽게 단리된다. 더 작은 크기와 단일 도메인 구조는 이러한 항체가 대규모 생산을 위해 박테리아 세포에서 단백질로 발현되기 쉽게 만들며, 이들이 상업적 이용에 이상적이 되도록 한다. 따라서 본 개시내용의 단일 도메인 항체는 바람직하게는 낙타과 항체, 바람직하게는 라마 항체로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 특이성을 얻기 위해 추가로 조작된다. 특히, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3이 아닌 C3b에 특이적으로 결합하도록 추가로 조작된다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 N-말단 모티프를 포함한다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, N-말단 모티프는 C3에 대한 결합을 입체적으로 방해함으로써 C3b에 대한 특이성을 생성한다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, N-말단 모티프는 IgG와 같은 단백질이다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, N-말단 모티프는 인간 IgG의 Fc 영역이다. 다른 실시양태에서, N-말단 모티프는 부피가 큰 N-말단 모티프일 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 부피가 큰 N-말단 모티프는 최대 10개의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 부피가 큰 N-말단 모티프는 부피가 큰 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 티로신, 글루탐산 및 글루타민으로 이루어진다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 부피가 큰 N-말단 모티프는 아미노산 EWE로 이루어진 3개의 아미노산 서열이다.
단일 도메인 항체 종
본 발명의 단일 도메인 항체는 C3b에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, C3b를 표적으로 하는 단일 도메인 항체는 C3b와 인자 B(FB)(예를 들어, 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열) 또는 활성 Bb 사이의 상호작용을 억제하여 C3bBb 전환효소 복합체의 조립 및/또는 C3bBb 전환효소의 활성을 억제할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 보체 시스템의 활성화를 억제할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인자 B(예를 들어, 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열) 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인자 B의 Asn122에 부착된 글리칸과 C3b의 상호작용을 차단함으로써 C3b와 인자 B(FB) 또는 이의 단편 사이의 C3b에 대한 상호작용을 억제할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 결합하고 기질 C3(예를 들어, 서열번호: 33에 따르는 아미노산 서열)이 C3b, 예를 들어 C3b 단독 또는 AP C3 전환효소(C3bBb)의 C3b에 결합하는 것을 방지할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 결합하고, 여기서 단일 도메인 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 결합하고 서열번호: 23에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예컨대 적어도 82%, 예컨대 적어도 83%, 예컨대 적어도 84%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 N-말단 모티프를 포함한다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, N-말단 모티프는 C3에 대한 결합을 입체적으로 방해함으로써 C3b에 대한 특이성을 생성한다.
따라서, 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 특이적으로 결합하고 (a) 서열번호: 23에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (b) N-말단 모티프를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 23의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예컨대 적어도 82%, 예컨대 적어도 83%, 예컨대 적어도 84%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, N-말단 모티프는 최대 10개의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열이다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, N-말단 모티프는 아미노산 EWE로 이루어진 3개의 아미노산 서열이다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 특이적으로 결합하고 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예컨대 적어도 82%, 예컨대 적어도 83%, 예컨대 적어도 84%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 특이적으로 결합하고 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 25의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예컨대 적어도 82%, 예컨대 적어도 83%, 예컨대 적어도 84%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 결합하고, 여기서 단일 도메인 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호: 27에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 28에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 29에 따르는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b에 특이적으로 결합하고 서열번호: 26에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예컨대 적어도 82%, 예컨대 적어도 83%, 예컨대 적어도 84%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
표적 결합에서 CDR 영역의 중요성이 높기 때문에, 일반적으로 단일 도메인 항체 서열의 변경이 CDR 외부에서 이루어지는 것으로 간주된다. 따라서, 본 개시내용의 한 실시양태에서, 임의의 서열 변이는 상보성 결정 영역 외부에 있다. 예를 들어, 서열번호: 1 또는 서열번호: 25에서의 서열 변이는 프레임워크 영역, 즉 서열번호: 2, 3 및 4에 따르는 아미노산 서열 외부에 있다. 예를 들어, 서열번호: 26에서의 서열 변이는 프레임워크 영역, 즉 서열번호: 27, 28 및 29에 따르는 아미노산 서열 외부에 있다.
에피토프
항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)의 항원 결합 부위는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)이 결합하는 항원 상의 부위를 에피토프라고 지칭한다. 에피토프를 인식하는 항체 또는 결합 분자의 일부를 파라토프라고 한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 아미노산의 선형 서열 또는 1차 구조에 의해 항체가 인식하는 에피토프이다. 구조적 에피토프 또는 3차원 에피토프는 특정한 3차원 모양을 갖고 있으며 폴리펩티드 사슬의 다른 부위에 위치하거나 심지어 다른 폴리펩티드 사슬에 위치한 아미노산으로 구성될 수 있다. 에피토프는 당류, 유기 및 무기 분자와 같은 폴리펩티드 이외의 분자에도 위치할 수 있다.
단백질이 결합하는 에피토프를 결정하는 한 가지 방법은 단백질의 발자국을 결정하는 것이다.
본 개시내용의 융합 단백질에 포함된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 (예를 들어 특이적으로) 결합할 수 있다. C3b에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 관련 항원, 특히 다른 종의 C3b, 예를 들어 시노몰거스, 인간 및/또는 설치류(예: 래트 및/또는 마우스) C3b와 교차-반응성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인간 C3b 및 래트 C3b에 특이적으로 결합한다.
항체가 결합하는 에피토프는 구조적 또는 선형 에피토프일 수 있다. 항체가 결합하는 에피토프를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 에피토프는 알라닌 돌연변이 유발 또는 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열에 포함된 에피토프에 결합한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 서열번호: 20에 따르는 아미노산 서열에 포함된 에피토프에 결합한다.
예를 들어, 항체가 특정 잔기, 예컨대 서열번호: 20 내의 에피토프에 결합한다고 말하는 경우, 이는 항체가 특정 잔기(즉, 이 실시예에서는 서열번호: 20)로 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다는 의미이다. 이러한 항체가 반드시 서열번호: 20 내의 모든 잔기와 접촉하는 것은 아니다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 C3b의 MG7 도메인 및 C3b 알파 사슬의 N-말단에 포함된 에피토프, 예컨대 서열번호: 20에 따르는 아미노산 서열 및 서열번호: 19의 N-말단에 포함된 에피토프에 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b(서열번호: 20)의 MG7 도메인 및 C3b 알파 사슬의 C3b의 N-말단 영역(예를 들어, 서열번호: 19의 잔기 1-30, 1-20 또는 4-12)에 포함된 에피토프에 결합한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인자 H의 CCP1 도메인(서열번호: 21), CCP4 도메인(서열번호: 16), CCP19 도메인(서열번호: 14) 또는 CCP20 도메인(서열번호: 16)과 동일한 C3b의 결합 부위에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인자 H의 CCP1 도메인(서열번호: 21)과 동일한 C3b의 결합 부위에 결합한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 서열번호: 1(즉, EWE-hC3Nb1), 서열번호: 23(즉, hC3Nb1), 서열번호: 25(즉, IgG-Fc-hC3Nb1) 또는 서열번호: 26(즉, DI62)에 정의된 단일 도메인 항체의 것과 동일한 에피토프에 결합한다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 서열번호: 1(즉, EWE-hC3Nb1) 또는 서열번호: 25(즉, IgG-Fc-hC3Nb1)에 정의된 단일 도메인 항체의 것과 동일한 에피토프에 결합한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 서열번호 1에 정의된 단일 도메인 항체(즉, EWE-hC3Nb1)의 것과 동일한 에피토프에 결합한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 다음 아미노산으로 이루어진 에피토프에 결합한다:
a) C3b의 Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당);
b) C3b의 Glu758, Glu759, Asn760, Arg855, Val916, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu10, Glu11, Asn12, Arg107, Val168, His170, His171, Phe172에 해당); 또는
c) C3b의 Asp752, Asp754, Ile755, Ile756, Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Asp4, Asp6, Ile7, Ile8, Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당).
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에서 인자 B와 동일한 결합 부위에 결합함으로써 인자 B가 C3b에 결합하는 것을 방지한다. 하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b의 다음 잔기 중 적어도 하나를 포함하는 에피토프에 결합한다: Arg94, Gly142 내지 Arg148, Thr161, Gln177 내지 Ser181, Pro190 내지 Glu197, Glu759 내지 Val762, Glu766, Trp771, Trp773 내지 Val775, Phe794 내지 Lys796, Leu867, His868, Arg891, Leu907, Glu909, Glu911, Arg926, Glu977, Asn1293, Ser1302 내지 Ser1305, Thr1308 내지 Arg1310, His1312, Glu1322 내지 Gluy1326, Lys1337, Glu1530, Glu1531, Cys1537, Val1541, Asp1542, Lys1570 내지 Glu1575 및 Val1658 내지 Asn1663(서열번호: 24에 따르는 아미노산 서열의 Arg72, Gly120 내지 Arg126, Thr139, Gln155 내지 Ser159 및 Pro168 내지 Glu175 및 서열번호 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu11 내지 Val14, Glu18, Trp23, Trp25 내지 Val27, Phe46 내지 Lys48, Leu119, His120, Arg143, Leu159, Glu161, Glu163, Arg178, Glu229, Asn545, Ser554 내지 Ser557, Thr560 내지 Arg562, His564, Glu574 내지 Glu578, Lys589, Glu782, Glu783, Cys789, Val793, Asp794, Lys822 내지 Gly827 및 Val910 내지 Asn915에 해당). 위의 잔기는 C3b의 추정 인자 B 결합 부위이다(Forneris et al. Science. 2010 Dec 24;330(6012):1816-20).
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에서 C3과 동일한 결합 부위에 결합하여, 기질 C3가 C3b(예를 들어 C3b 단독 또는 AP C3 전환효소의 C3b(C3bBb))에 결합하는 것을 방지한다. 하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 MG4(C3b의 Thr351 내지 Ser447, 서열번호: 24의 Thr329 내지 Ser425에 해당), MG5(Thr448 내지 Asp557, 서열번호: 24의 Thr426 내지 Asp535에 해당) 및/또는 C3b의 MG7 도메인(서열번호: 20)에 포함된 에피토프에 결합한다.
항원은 다양한 에피토프를 포함할 수 있다. 항체가 아닌 단백질은 다른 단백질과도 결합할 수 있으며, 어떤 경우에는 특이성과 친화도가 낮은 상태로 에피토프에 결합한다. 2개의 에피토프가 근접하게 위치할 때, 단 하나의 분자만이 이의 에피토프에 결합할 수 있고, 따라서 상기 다른 에피토프에 결합할 수 있는 단백질과 결합에 대해 경쟁하는 상황이 발생할 수 있다. 다른 상황에서는 2개의 단백질/항체가 동일한 에피토프에 결합하고 결합에 대해 경쟁해야 한다. 본 개시내용의 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)이 결합하는 에피토프는 다른 단백질과 결합에 대해 경쟁하는 능력에 의해 설명된다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 융합 단백질의 폴리펩티드와 경쟁하지 않는다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 서열번호: 9 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 경쟁하지 않는다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 I, 예컨대 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열과 경쟁하지 않는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP2 및/또는 CCP3 도메인, 예컨대 서열번호: 11 및/또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 경쟁하지 않는다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP2 및 CCP3 도메인, 예컨대 서열번호: 11 및/또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 경쟁하지 않는다.
본 개시내용의 보다 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 I(예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열), 및 인자 H의 CCP2 및 CCP3 도메인(예: 서열번호: 11 및 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열)과 경쟁하지 않는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B(예를 들어, 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열)와 경쟁한다.
바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP1 도메인, 예컨대 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 경쟁한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 다음 아미노산으로 이루어진 에피토프에 결합할 수 있는 단백질과 경쟁한다:
a) C3b의 Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당);
b) C3b의 Glu758, Glu759, Asn760, Arg855, Val916, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu10, Glu11, Asn12, Arg107, Val168, His170, His171, Phe172에 해당); 또는
c) C3b의 Asp752, Asp754, Ile755, Ile756, Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Asp4, Asp6, Ile7, Ile8, Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당).
본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 서열번호: 1 또는 서열번호: 25에 정의된 바와 같은 단일 도메인 항체와 경쟁하는데, 즉, 이는 C3b에 대한 결합에 대해 EWE-hC3Nb1 또는 IgG-Fc-hC3Nb1과 경쟁한다. 본 개시내용의 보다 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 서열번호: 1에 정의된 바와 같은 단일 도메인 항체와 경쟁하는데, 즉, 이는 C3b에 대한 결합에 대해 EWE-hC3Nb1와 경쟁한다.
하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B(예를 들어 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열)와 경쟁하지만, C3b에 대한 결합에 대해서 인자 I(예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열)와 경쟁하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B(예를 들어 서열 번호: 30에 따르는 아미노산 서열)와 경쟁하지만, C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP2 도메인(서열번호: 11) 및 CCP3 도메인(서열번호: 12)과 경쟁하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B(예를 들어 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열)와 경쟁하지만, C3b에 대한 결합에 대해 인자 I(예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열), 및 인자 H의 CCP2 도메인(서열번호: 11) 및 CCP3 도메인(서열번호: 12)과 경쟁하지 않는다.
보다 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP1 도메인(예를 들어 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열) 및 인자 B(예를 들어 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열)와 경쟁하지만, C3b에 대한 결합에 대해 인자 I(예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열), 및 인자 H의 CCP2 도메인(서열번호: 11) 및 CCP3 도메인(서열번호: 12)과 경쟁하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 C3 (예를 들어 서열번호: 33에 따르는 아미노산 서열)과 경쟁하지만, C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP2 도메인(서열번호: 11) 및 CCP3 도메인(서열번호: 12)과 경쟁하지 않는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 C3(예를 들어 서열번호: 33에 따르는 아미노산 서열)과 경쟁하지만, C3b에 대한 결합에 대해 인자 I(예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열), 및 인자 H의 CCP2 도메인(서열번호: 11) 및 CCP3 도메인(서열번호: 12)과 경쟁하지 않는다.
항체 간의 경쟁은 테스트 중인 항체가 공통 항원, 즉, C3b에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석법을 통해 결정된다. 많은 유형의 경쟁 결합 분석이 알려져 있으며, 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사성면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석; 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 고체상 직접 표지된 분석, 고체상 직접 표지된 샌드위치 분석; 직접 표지된 RIA가 있다. 일반적으로 이러한 분석에는 항원을 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원, 비표지된 테스트 항체 및 표지된 기준 항체의 사용이 포함된다. 경쟁적 억제는 테스트 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지물의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로 테스트 항체는 과잉으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)에는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 발생하도록 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과잉으로 존재할 경우, 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50% 또는 75% 억제한다.
항체 변형
상기 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 바람직한 실시양태에서 항체의 기능 및/또는 유용성을 개선하는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 치료를 위해 비인간 항체를 사용하는 것이 항상 바람직한 것은 아니며, 따라서 본원에 제공된 단일 도메인 항체는 인간화된 항체일 수 있다.
본 개시내용에 따르는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인간화된 항체(예를 들어, 인간화된 단일 도메인 항체)일 수 있다. 본원에 사용된 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열을 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 항체이다. 인간 항체는 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자에 대한 유전자전이 또는 전환염색체인 동물(예: 마우스) 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체일 수 있다. 인간 항체는 또한 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질감염종으로부터 단리될 수 있다. 인간 항체는 또한 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있거나 인간 B 세포로부터 직접 클로닝될 수도 있다.
인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이 유발에 적용될 수 있으며 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이에 연관된 서열은 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
인간 항체는 바람직하게는 야생형 인간 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
상기 전환염색체 동물의 전이유전자는 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및/또는 γ) 및 κ경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유할 수 있다. 더욱이, 상기 동물은 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 불활성화시키는 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 키메라 항체, 즉, 상이한 종으로부터 유래된 영역을 포함하는 항체일 수 있다. 키메라 항체는 예를 들어 한 종의 동물로부터의 가변 영역 및 다른 종의 동물로부터의 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 라마 단일클론 항체로부터 유래된 가변 영역과 인간의 불변 영역을 갖는 항체일 수 있다. 이러한 항체는 인간화된 항체로도 지칭될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 항체에 대한 인간 유기체의 면역학적 반응을 방지하기 위해 유리하게 인간화될 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 얻은 서열에 의해 부분적으로 코딩되고 다른 서열로부터 부분적으로 코딩되는 인간화된 항체일 수 있다. 상기 다른 서열은 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)을 생성하는 다른 종, 가장 바람직하게는 낙타과 종, 예를 들어 라마로부터의 생식계열 면역글로불린이다. 특히, 인간화된 항체는 항원 결합 부위가 라마의 면역글로불린에서 유래하는 반면, 분자의 나머지 면역글로불린 유래 부분 중 일부 또는 전부는 인간 면역글로불린에서 유래하는 항체일 수 있다. 상기 라마로부터의 항원 결합 부위는 예를 들어 완전한 VHH 또는 적절한 인간 프레임워크 영역에 이식된 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다. 따라서, 인간화된 항체에서 CDR은 낙타과 또는 연골 어류, 바람직하게는 라마로부터 유래될 수 있고, 항체의 다른 영역은 인간 기원이다.
다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 코돈 최적화 또는 항체의 기능 및/또는 유용성을 향상시키기 위해 도입된 다른 변형에 의해 변형된다.
폴리펩티드
본 개시내용은 신규 폴리펩티드 및 신규 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 모두 제공한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 하나 이상의 길고 폴딩된 폴리펩티드 사슬을 포함하는 복잡한 3차원 구조이다. 폴리펩티드 사슬은 아미노산이라고 불리는 복수의 작은 화학 단위로 구성되며, 이는 공유 펩티드 결합을 통해 N-말단에서 C-말단 방식으로 연결된다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 L-배열을 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 L- 및 D-아미노산의 다양한 조합을 사용하는 전통적인 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. "펩티드"라는 용어는 2개 이상의 아미노산의 조합을 기술한다. 20개의 아미노산이 자연적으로 존재하며 일반적으로 다음 표를 사용하여 지정된다:
본 개시내용에서 제공되는 폴리펩티드는 천연 보체 단백질로부터 유래된 재조합 단백질이다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체 보조인자 단백질 인자 H로부터 유래된다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체 조절 단백질(CCP)과 같은, 인자 H로부터의 특정 도메인을 포함한다. 인자 H는 20개의 CCP 도메인(CCP1-CCP20)으로 이루어진다. CCP 도메인은 진화적으로 보존된 단백질 도메인이다. 스시 도메인 또는 SCR(짧은 합의 반복체)로도 알려져 있다. 이 이름은 이황화 결합에 의해 생성된 고리를 보여주는 1차 구조를 그릴 때 도메인이 니기리 스시와 시각적으로 유사하기 때문에 유래되었다. 스시 도메인은 다양한 보체 및 접착 단백질에 존재한다. 이 도메인에 대한 구조는 알려져 있다. 이는 베타 샌드위치 배열을 기반으로 한다 - 한 면은 중앙에 삼중 가닥 영역을 형성하기 위해 수소 결합된 3개의 β가닥으로 구성되고, 다른 면은 2개의 별도 β가닥으로 형성된다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 제공된 폴리펩티드는 인자 H의 최소화된 버전이다. CCP 도메인 1-4 및 19-20으로 이루어진 이러한 선행 기술 단백질은 이전에 미니-FH로 지칭되었다. 본 개시내용의 최소화된 버전은 바람직하게는 CCP1(서열번호: 21)을 포함하지 않는 버전으로 제공될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 μH(마이크로-H) 및 nH(나노-H)를 제공하며, 여기서 μH는 CCP 도메인 2-4 및 19-20을 포함하고 nH는 CCP 도메인 2-4를 포함한다.
도메인 CCP2, CCP3 또는 CCP4 중 적어도 하나가 폴리펩티드, 예를 들어 적어도 CCP2-3 또는 CCP3-4에 유지되는 것이 바람직하다. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 도메인 CCP2-3은 보체 단백질 인자 H의 재조합 변이체에 유지된다. 본 개시내용의 더욱 바람직한 실시양태에서, 도메인 CCP2-4는 보체 단백질 인자 H의 재조합 변이체에 유지된다. 하나 이상의 도메인이 제거되면 하나 이상의 링커가 추가되어 폴리펩티드 사슬에 올바른 유연성을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 폴리펩티드는 인자 H의 CCP 도메인 2(서열번호: 11) 및 CCP 도메인 3(서열번호: 12)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 11에 따르는 아미노산과 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (b) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 11에 따르는 아미노산과 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (b) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열번호: 12에 따르는 아미노산과 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (b) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예를 들어 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인자 H의 CCP 도메인 4(서열번호: 13), 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예컨대 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열; 및 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예컨대 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인자 H의 CCP 도메인 19(서열번호: 14), 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인자 H의 CCP 도메인 20(서열번호: 16), 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및 (ii) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iii) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iv) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만, 예컨대 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열; (iii) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및 (iv) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만, 예컨대 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iv) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만, 예컨대 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및 (iv) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만, 예컨대 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 CCP 도메인 또는 이의 변이체의 다음 조합을 포함한다:
상기 실시양태의 상기 변이체는 해당하는 아미노산 서열과 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 보체 단백질 인자 H의 임의의 재조합 변이체이고, 여기서 보체 단백질 인자 H의 재조합 변이체는 CCP1, 예를 들어 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호 21에 따르는 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 CCP1, 예를 들어 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하지 않는다.
인자 H의 인간 병렬상동체(orthologue)의 전장 버전은 1231개 아미노산 폴리펩티드이고 CCP1 도메인은 64개 아미노산 폴리펩티드이다. CCP2 도메인은 인간 인자 H의 위치 83에서 시작하므로, 본 개시내용의 하나의 실시양태에서 폴리펩티드는 1148개 아미노산의 최대 길이를 갖는다. 인간 인자 H의 CCP 도메인의 평균 길이는 59개 아미노산이며, 따라서 하나 이상의 CCP 도메인이 제거된 보체 단백질 인자 H의 다양한 재조합 변이체가 만들어질 수 있다.
본질적으로 임의의 CCP 도메인이 폴리펩티드에 유지될 수 있기 때문에, 폴리펩티드는 1148개 미만의 아미노산, 예를 들어 1140개 미만의 아미노산, 예를 들어 1130개 미만의 아미노산, 예를 들어 1120개 미만의 아미노산, 예를 들어, 1110개 미만의 아미노산, 예를 들어 1100개 미만의 아미노산, 예를 들어 1090개 미만의 아미노산, 예를 들어 1080개 미만의 아미노산, 예를 들어 1070개 미만의 아미노산, 예를 들어 1060개 미만의 아미노산, 예를 들어 1050개 미만의 아미노산, 예를 들어 1040개 미만의 아미노산, 예를 들어 1030개 미만의 아미노산, 예를 들어 1020개 미만의 아미노산, 예를 들어 1010개 미만의 아미노산, 예를 들어 1000개 미만의 아미노산, 예를 들어 990개 미만의 아미노산, 예를 들어 980개 미만의 아미노산, 예를 들어 970개 미만의 아미노산, 예를 들어 960개 미만의 아미노산, 예를 들어 950개 미만의 아미노산, 예를 들어 940개 미만의 아미노산, 예를 들어 930개 미만 아미노산, 예를 들어 920개 미만의 아미노산, 예를 들어 910개 미만의 아미노산, 예를 들어 900개 미만의 아미노산, 예를 들어 890개 미만의 아미노산, 예를 들어 880개 미만의 아미노산, 예를 들어 870개 미만의 아미노산, 예를 들어 860개 미만의 아미노산, 예를 들어 850개 미만의 아미노산, 예를 들어 840개 미만의 아미노산, 예를 들어 830개 미만의 아미노산, 예를 들어 820개 미만의 아미노산, 예를 들어 810개 미만의 아미노산, 예를 들어 800개 미만의 아미노산, 예를 들어 790개 미만의 아미노산, 예를 들어 780개 미만의 아미노산, 예를 들어 770개 미만의 아미노산, 예를 들어 760개 미만의 아미노산, 예를 들어 750개 미만의 아미노산, 예를 들어 740개 미만의 아미노산, 예를 들어 730개 미만의 아미노산, 720개 미만의 아미노산, 예를 들어 710개 미만의 아미노산, 예를 들어 700개 미만의 아미노산, 예를 들어 690개 미만의 아미노산, 예를 들어 680개 미만 아미노산, 예를 들어 670개 미만의 아미노산, 예를 들어 660개 미만의 아미노산, 예를 들어 650개 미만의 아미노산, 예를 들어 640개 미만의 아미노산, 예를 들어 630개 미만의 아미노산, 예를 들어 620개 미만의 아미노산, 예를 들어 610개 미만의 아미노산, 예를 들어 600개 미만의 아미노산, 예를 들어 590개 미만의 아미노산, 예를 들어 580개 미만의 아미노산, 예를 들어 570개 미만의 아미노산, 예를 들어 560개 미만의 아미노산, 예를 들어 550개 미만의 아미노산, 예를 들어 540개 미만의 아미노산, 예를 들어 530개 미만의 아미노산, 예를 들어 520개 미만의 아미노산, 예를 들어 510개 미만의 아미노산, 예를 들어 500개 미만의 아미노산, 예를 들어 490개 미만의 아미노산, 예를 들어 480개 미만의 아미노산, 예를 들어 470개 미만의 아미노산, 예를 들어 460개 미만의 아미노산, 예를 들어 450개 미만의 아미노산, 예를 들어 440개 미만의 아미노산, 예를 들어 430개 미만 아미노산, 예를 들어 420개 미만의 아미노산, 예를 들어 410개 미만의 아미노산, 예를 들어 400개 미만의 아미노산, 예를 들어 390개 미만의 아미노산, 예를 들어 380개 미만의 아미노산, 예를 들어 370개 미만의 아미노산, 예를 들어 360개 미만의 아미노산, 예를 들어 350개 미만의 아미노산, 예를 들어 340개 미만의 아미노산, 예를 들어 330개 미만의 아미노산, 예를 들어 320개 미만의 아미노산, 예를 들어 310개 미만의 아미노산, 예를 들어 300개 미만의 아미노산, 예를 들어 290개 미만의 아미노산, 예를 들어 280개 미만의 아미노산, 예를 들어 270개 미만의 아미노산, 예를 들어 260개 미만의 아미노산, 예를 들어 250개 미만의 아미노산, 예를 들어 240개 미만의 아미노산, 예를 들어 230개 미만의 아미노산, 예를 들어 220개 미만의 아미노산, 예를 들어 210개 미만의 아미노산, 예를 들어 200개 미만의 아미노산, 예를 들어 190개 미만의 아미노산 또는 예를 들어 180개 미만 아미노산의 다양한 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예를 들어 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들어 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들어 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 상이한 CCP 도메인 또는 이의 변이체를 함께 연결하기 위한 적어도 하나의 링커를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 링커는 서열번호: 17에 따르는 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용은 한 양태에서 220개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들어 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190, 185개의 아미노산이다. 하나의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 추가의 양태에서 350개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예컨대 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325, 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는
a) 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체;
b) 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및
c) 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열을 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열에 연결하는 제2 링커를 포함하거나 이로 이루어지며; 여기서 제2 링커는 서열번호: 17에 따르는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 C3b에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, C3b에 결합하는 폴리펩티드는 관련 항원, 특히 다른 종의 C3b, 예를 들어 시노몰거스, 인간 및/또는 설치류(예: 래트 및/또는 쥐) C3b에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 C3b 및 래트 C3b에 결합한다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것과 같이 인자 I을 동원할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 인자 I을 동원함으로써, 예컨대 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 인자 I에 대한 보조인자, 예컨대 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조인자이다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하지 않는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 20에 따르는 아미노산 서열에 포함된 에피토프에 결합하지 않는다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합 단백질의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)과 결합에 대해 경쟁하지 않는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 C3b에의 결합에 대해 서열번호: 1(즉, EWE-hC3Nb1) 또는 서열번호: 25(즉, IgG-Fc-hC3Nb1)에 정의된 단일 도메인 항체와 경쟁하지 않는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 C3b에 대한 결합에 대해 서열번호: 1에 정의된 단일 도메인 항체(즉, EWE-hC3Nb1)와 경쟁하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정된 바와 같이 약 10-4 내지 약 10-9 M, 약 10-4 내지 약 10-8 M, 10-4 내지 약 10-7 M, 10-5 내지 약 10-9 M, 10-5 내지 약 10-8 M, 10-5 내지 약 10-7 M, 10-6 내지 약 10-9 M, 10-6 내지 약 10-8 M, 10-6 내지 약 10-7 M, 10-7 내지 약 10-9 M, 10-7 내지 약 10-8 M 또는 10-8 내지 약 10-9 M의 KD에 해당하는 친화도로 C3b와 결합한다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정된 바와 같이 약 10-8 내지 약 10-6 M의 KD에 해당하는 친화도로 C3b와 결합한다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정된 바와 같이 약 10-7 내지 약 10-6 M의 KD에 해당하는 친화도로 C3b와 결합한다.
융합 단백질
본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체) 및 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 조립될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 시험관 내에서 유전자 서열을 융합함으로써 재조합적으로 설계된다. 본원에 제공된 융합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: 단일 도메인 항체) 및 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 둘을 연결하는 링커를 추가로 포함한다.
각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체) 및 융합 단백질의 폴리펩티드는 C3b에 결합한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 C3b에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하지 않는다.
본 개시내용에 기술된 융합 단백질에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)은 임의의 위치에서 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)의 C-말단은 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)의 C-말단은 폴리펩티드의 CCP 도메인(예를 들어, CCP2)의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체)의 N-말단은 폴리펩티드의 CCP 도메인의 C-말단에 연결된다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및 (b) 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예를 들면 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들면 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (v) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들면 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체); 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체; 및
(b) 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예를 들면 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들면 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (v) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들면 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하며, CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 단일 도메인 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예를 들어 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체;를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들어 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (v) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 선택적으로 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들면 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 180개 미만의 아미노산, 예를 들어 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들어 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (v) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 240개 미만의 아미노산, 예를 들면 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 183개 아미노산이다.
하나의 실시양태에서, 융합 단백질은
(a) C3b에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체로, 여기서 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로 항체는 서열번호: 25에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 항체; 및
(b) C3b에 결합하고 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 380개 미만의 아미노산, 예를 들면 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 폴리펩티드의 길이는 319개 아미노산이다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 7에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 7에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 7에 따르는 아미노산 서열과 적어도 81%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 5에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 5에 따르는 아미노산 서열과 적어도 81%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 재조합 융합 단백질이 C3b 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체) 및 전술한 재조합 폴리펩티드를 포함하는 경우, 생성된 융합 단백질은 대체 경로의 억제를 조합하는 것 뿐만 아니라 표면 결합된 C3b 분자를 제거하는 놀라운 이점을 갖는다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 인자 B(예컨대 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열) 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제할 수 있고 또한 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것과 같이 인자 I를 동원할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해할 수 있고 또한 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것과 같이 인자 I를 동원할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 인자 B(예컨대 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열) 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제할 수 있고 또한 인자 I을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 인자 B(예컨대 서열번호: 30에 따르는 아미노산 서열) 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제할 수 있고 또한 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조인자와 같은, 인자 I에 대한 보조인자이다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해할 수 있고 또한 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것과 같이, 인자 I를 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 융합 단백질은 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해할 수 있고 또한 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조인자와 같은, 인자 I에 대한 보조인자이다.
링커
본 개시내용의 링커는 비면역원성이도록 설계되고 바람직하게는 또한 유연한 링커이다. 유연성 확보를 위해 링커의 길이는 아미노산 15 내지 25개인 것이 바람직하다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 링커의 길이는 8 내지 25개 아미노산, 예컨대 8 내지 20개 아미노산, 예컨대 8 내지 15개 아미노산, 예를 들어 8 내지 12개 아미노산 또는 예컨대 10개 내지 15개 아미노산이다. 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 심지어 25개의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커의 길이는 20개 아미노산이다.
링커는 바람직하게는 세린-글리신(GS) 링커, 예컨대 유연한 GGGGS 링커, 예를 들어 GGGSS, GGGSG, GGGGS, 또는 GGGGSGGGGS 또는 (GGGGS)m, (GGGGSS)m, (GGGSG)m과 같은 이들의 다중 변이체이고, 여기서 m은 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3의 정수이다. 바람직한 실시양태에서 m은 4이다.
바람직한 실시양태에서, 세린-글리신 링커는 적어도 하나의 류신(L), 예컨대 적어도 2개 또는 적어도 3개의 류신을 추가로 포함한다. 세린-글리신 링커는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개의 류신을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세린-글리신 링커는 2개의 류신 또는 4개의 류신을 포함한다.
하나의 실시양태에서 링커는 서열 LGGGS, GLGGS, GGLGS, GGGLS 또는 GGGGL을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGGSG, GLGSG, GGLSG, GGGLG 또는 GGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGGSS, GLGSS, GGLSS, GGGLS 또는 GGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGLGS, GLGLS, GLLGS, LGGLS 또는 GLGGL을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGLSG, GLLSG, GGLSL, GGLLG 또는 GLGSL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGLSS, GLGLS, GGLLS, GLGSL 또는 GLGSL을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 세린-글리신 링커는 20개의 아미노산 길이를 갖고 2개의 류신 또는 4개의 류신을 포함한다.
하나의 실시양태에서 링커는 서열 LGGGSGGGGS, GLGGSGGGGS, GGLGSGGGGS, GGGLSGGGGS 또는 GGGGLGGGGS를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 링커는 서열 LGGSG GGGSG, GLGSGGGGSG, GGLSGGGGSG, GGGLGGGGSG 또는 GGGSLGGGSG를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGGSSGGGSS, GLGSSGGGSS, GGLSSGGGSS, GGGLSGGGSS 또는 GGGSLGGGSS를 포함하거나 이로 이루어진다.
추가 실시양태에서 링커는 서열 LGGGSLGGGS, GLGGSGLGGS, GGLGSGGLGS, GGGLSGGGLS 또는 GGGGLGGGGL을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 링커는 서열 LGGSGLGGSG, GLGSGGLGSG, GGLSGGGLSG, GGGGLGGGGLG 또는 GGGSLGGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서 링커는 서열 LGGSSLGGSS, GLGSSGLGSS, GGLSSGGGLSS, GGGLSGGGLS 또는 GGGSLGGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다.
대안적인 링커는 GSAT 링커 및 SEG 링커, 또는 이들의 다중 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 단일 도메인 항체)은 제1 링커에 의해 폴리펩티드에 연결된다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 내의 CCP 도메인은 하나 이상의 제2 링커에 의해 연결된다. 하나의 실시양태에서, CCP2-CCP4 도메인(예를 들어 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열)은 제2 링커에 의해 CCP19-CCP20 도메인(예를 들어 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열)에 연결된다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 제1 링커는 글리신-세린(GS) 링커이다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 제1 링커는 15 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 제1 링커의 길이는 45 Å 내지 130 Å, 예를 들어 55 Å 내지 120 Å, 60 Å 내지 80 Å 또는 65 내지 70 Å이다. 본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 제1 링커는 서열번호: 6에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 하나의 실시양태에서, 제2 링커는 서열번호: 17에 정의된 바와 같다.
핵산 및 벡터
본 개시내용은 추가로 본 개시내용의 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및 벡터를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 게놈 DNA, cDNA, 및 RNA 서열과 같은 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따르는 폴리펩티드를 발현하는 종에 최적화되는 것이 바람직하며, 즉 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 최적화되는 것이 바람직하다.
따라서 하나의 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 핵산의 용이한 교환을 허용하는 것이 바람직하다.
따라서, 추가 양태에서, 본 개시내용은 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 추가 양태에서, 본 개시내용은 벡터를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음:
a) 벡터를 세포에 도입하는 단계;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 세포로부터 벡터를 수집하고 정제하는 단계; 및
d) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계를 포함한다.
숙주 세포 및 제조 방법
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질을 포함하는 핵산 및 벡터를 포함하는 숙주 세포뿐만 아니라 본 개시내용의 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 벡터를 발현하고, 발현할 수 있는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵생물 세포가 포함된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포(예를 들어 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포), 효모 세포(예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 식물 세포, 또는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜리(E. coli)일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음:
a) 본 개시내용의 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 또는 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 상등액으로부터 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 얻고 선택적으로 정제하는 단계; 및
d) 선택적으로, 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 정제하기 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함한다.
약제학적 조성물 및 치료 방법
약제학적 조성물은 약효 특성을 갖는 하나 이상의 물질과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다. 약제학적 조성물의 세부사항은 아래에 제공된다.
본 발명의 하나의 양태는 본원에 제공된 융합 단백질 또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 약제학적 조성물은 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본원에 제공된 폴리펩티드를 포함한다.
융합 단백질 또는 폴리펩티드는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 선택된 투여 경로에 적합한 다양한 형태로 인간 환자와 같은 포유동물 숙주에게 투여될 수 있다. 또 다른 접근법에서, 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 아데노(adeno) 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 DNA로서 투여된 다음 벡터로부터 발현될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 보체 활성화와 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 의약으로 사용하기 위한 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화와 연관된 장애의 치료에 사용하기 위한 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 양태의 일부 실시양태에서, 보체 활성화와 연관된 장애는 안구 질환, 신경계 질환, 자가면역 및 염증성 질환, 암 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물은 안구 질환의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 또한 안과 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
안과 질환은 안구, 급성 폐쇄각 녹내장, 모든 단계의 연령 관련 황반 변성(습식 및 건식), 베체트 망막병증, 중심 망막 정맥 폐색(CRVO), 맥락막 신생혈관(CNV), 만성 개방성-각 녹내장, 각막신생혈관증, 당뇨병 및 기타 허혈 관련 망막병증, 당뇨병성 황반부종, 당뇨병성 망막병증, 안내염, 지도형 위축, 눈의 히스토플라스마증, 허혈 관련 망막병증, 허혈성 시신경병증, 레베르 유전성 시신경병증, 황반변성 질환, 시신경척수염(NMO), 병리학적 근시, 퍼처 망막병증, 망막 혈관신생, 쇼그렌안구건조증 포도막염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물은 신경 질환의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 또한 신경 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 신경 질환은 알츠하이머병, 정신분열증, 근위축성 측삭 경화증, 길랭-바레 증후군, 헌팅턴병, 다발성 경화증 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물은 자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 또한 자가면역 및 염증성 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 자가면역 및 염증성 장애는 ANCA 혈관염, 항핵 세포질 항원 관련 파우치 면역 혈관염(베게너 증후군), 항인지질 증후군(APS), 천식, 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), 자가면역 용혈성 빈혈, 수포성 유천포창, C3 사구체신염, 복강병, 한랭응집병, 크론병, 한랭글로불혈증, 치밀 침착병, 피부근염, 당뇨병, 제1형 당뇨병, 수포표피박리증, 하시모토 갑상선염, 초급성 거부반응. 저보체성 두드러기 혈관염(HUV), IgA 신장병, 장 및 신장 허혈-재관류(IR) 손상, 루푸스 신염 및 그에 따른 사구체신염 및 혈관염, 중증근육무력증, 근염, 시신경염, 부종양증후군, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 심상성 천포창을 포함한 천포창, 결절성 다발성동맥염, 류마티스성 다발근통, 외상후 쇼크, 급성 신부전, 허혈 및 재관류 후 원격 조직 손상 망막 혈관염, 류마티스 관절염(RA), 유육종증, 패혈증, 뇌졸중, 전신홍반루푸스(SLE), 측두동맥염, 외상성 뇌 및 척수 손상, 제2형 막증식성 사구체신염, 혈관염 질환, 백반증, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 만성 폐쇄성 폐질환 증후군(COPD), 죽상경화증, 심정지 유발 관상동맥 내피 기능 장애, 자발적 및 재발성 임신 손실, 애디슨병으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물은 암 치료에 사용하기 위해 제공된다. 또한 암을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양 또는 모세포종이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 보체 시스템의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 치료 유효량의 본 개시내용의 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계, 이로써 이를 필요로 하는 대상체에서 보체 시스템의 활성을 조절하는 단계를 포함한다. 또한 보체 시스템의 활성을 조절하는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물이 제공되며, 이 방법은 치료가 필요한 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 을 투여하는 단계, 이로써 이를 필요로 하는 대상체에서 보체 시스템의 활성을 조절하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따르는 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 개체에서 고전적 경로, 렉틴 경로 및/또는 대체 경로의 활성을 조절, 즉 억제 또는 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
개체는 보체 시스템의 활성 증가와 연관된 임상적 또는 생리학적 장애 또는 병태로 고통받을 수 있다. 다른 실시양태에서, 개체는 보체 시스템의 활성을 증가 및/또는 동원함으로써 치료될 수 있는 장애 또는 임상적 또는 생리학적 병태를 앓을 수 있다.
투여 형태
상기 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 융합 단백질 또는 폴리펩티드 조성물은 의학적/치료적 처치에 사용될 수 있다. 이러한 양태에서, 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 치료가 필요한 대상체에게 투여되고, 상황에 따라 임의의 적합한 투여 경로가 선택될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 아래에 설명되어 있다.
전신 치료
주요 투여 경로는 본 발명에 따르는 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 혈류에 도입하여 궁극적으로 원하는 작용 부위를 표적화하기 위한 비경구적이다.
이러한 투여를 위한 적절한 투여 형태는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
비경구 투여
비경구 투여는 경구/경장 경로가 아닌 임의의 투여 경로로, 약물이 간에서 1차 통과 분해되는 것을 방지한다. 따라서, 비경구 투여에는 임의의 주사 및 주입, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입, 예컨대 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여가 포함된다. 또한, 비경구 투여에는 흡입 및 국소 투여가 포함된다.
비경구 투여의 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다.
약제학적 조성물
본원에 제공된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 원시 형태로 투여하는 것이 가능하지만, 이를 약제학적 조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 또는 폴리펩티드 및 이에 대한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 문헌: Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2005, Lippincott, Williams & Wilkins에 설명된 바와 같이, 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
투여량 및 투여 요법
투여량 요구사항은 사용된 특정 조성물, 투여 경로 및 치료 대상체에 따라 달라질 수 있다. 또한, 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 개별 투여량의 최적의 양 및 간격은 치료되는 병태의 성질 및 정도, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료를 받는 특정 환자에 따라 결정될 것임을 관련 기술분야에서의 기술자라면 인식할 것이다.
융합 단백질 또는 폴리펩티드는 단위 투여 형태로 제공 및/또는 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 동물 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된, 단독으로 또는 다른 제제와 함께 미리 결정된 양의 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 함유한다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 사양은 사용된 특정 융합 단백질 또는 폴리펩티드 및 달성하려는 효과뿐만 아니라 숙주의 각 항체와 연관된 약력학에 따라 달라진다. 투여되는 용량은 "유효량" 또는 개별 환자에서 "유효 수준"을 달성하는 데 필요한 양이어야 한다.
"유효 수준"이 선호되는 투여 종료점으로 사용되는 경우, 실제 투여량과 일정은 약동학, 약물 분포, 및 대사의 개인간 차이에 따라 달라질 수 있다. "유효 수준"은 예를 들어 본 발명에 따르는 하나 이상의 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 농도에 해당하는 환자에서의 원하는 혈액 또는 조직 수준으로 정의될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 비경구 투여를 위한 매우 다양한 조성물로 제형화될 수 있다.
서열 동일성
서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다: 높은 수준의 서열 동일성은 제1 서열이 제2 서열로부터 유래될 가능성을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성은 2개의 정렬된 서열 사이에 동일한 아미노산 서열을 요구한다. 따라서, 기준 서열과 70% 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은 정렬 후에 후보 서열의 아미노산 중 70%가 기준 서열의 해당하는 아미노산과 동일할 것을 요구한다. 동일성은 ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램, 및 여기에 제안된 기본 매개변수(이에 제한되지 않음)와 같은 컴퓨터 분석의 도움을 받아 결정될 수 있다. 기본 설정으로 이 프로그램을 사용하면 쿼리의 성숙한(생물 활성) 부분과 기준 폴리펩티드가 정렬된다. 완전히 보존된 잔기의 수를 계산하고 기준 폴리펩티드의 길이로 나눈다. 그렇게 함으로써, 쿼리 서열의 일부를 형성하는 임의의 태그 또는 융합 단백질 서열은 정렬 및 서열 동일성의 후속 결정에서 무시된다.
ClustalW 알고리즘을 유사하게 사용하여 뉴클레오티드 서열을 정렬할 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열에 대해 표시된 것과 유사한 방식으로 계산될 수 있다.
서열 비교에 활용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직하고 비제한적인 예는 Myers and Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 FASTA 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다. Align은 전역 정렬을 기반으로 서열 동일성을 계산한다. Align0은 서열 말단의 공백에 대해 페널티를 적용하지 않는다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN og Align0 프로그램을 활용하는 경우, 간격 개방/확장 페널티가 -12/-2인 BLOSUM50 치환 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
항목
A1. 다음을 포함하는 융합 단백질:
a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체;
b) 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드; 및
c) 제1 링커.
A2. 항목 A1에 있어서, 단일 도메인 항체가 C3b의 MG7 도메인 및 C3b 알파 사슬의 N-말단에 포함된 에피토프, 예를 들어 서열번호: 20에 따르는 아미노산 서열 및 서열번호: 19의 N-말단에 포함된 에피토프에 결합하는 융합 단백질.
A3. 항목 A1 또는 항목 A2에 있어서, 단일 도메인 항체가 인자 H의 CCP1 도메인과 결합에 대해 경쟁하는, 예를 들어 단일 도메인 항체가 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 결합에 대해 경쟁하는 융합 단백질.
A4. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열번호: 1에 정의된 단일 도메인 항체와 결합에 대해 경쟁하는 융합 단백질.
A5. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 하기 아미노산으로 이루어진 에피토프에 결합하는, 단백질과 결합에 대해 경쟁하는 융합 단백질:
a) 서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920;
b) 서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu758, Glu759, Asn760, Arg855, Val916, His918, His919, Phe920; 또는
c) 서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Asp752, Asp754, Ile755, Ile756, Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920.
A6. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 인자 I과 C3b에의 결합에 대해 경쟁하지 않는, 예를 들어, 단일 도메인 항체가 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열과 결합에 대해 경쟁하지 않는 융합 단백질.
A7. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 인자 H의 CCP2 또는 CCP3 도메인과 결합에 대해 경쟁하지 않는, 예를 들어 단일 도메인 항체가 서열번호: 11 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 결합에 대해 경쟁하지 않는 융합 단백질.
A8. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 융합 단백질.
A9. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 N-말단 모티프, 예컨대 부피가 큰 N-말단 모티프를 포함하는 융합 단백질.
A10. 항목 A9에 있어서, N-말단 모티프가 C3에 대한 결합을 입체적으로 방해함으로써 C3b에 대한 특이성을 생성하는 융합 단백질.
A11. 항목 A9 또는 A10에 있어서, N-말단 모티프가 IgG와 같은 단백질인 융합 단백질.
A12. 항목 A9 또는 A10에 있어서, 부피가 큰 N-말단 모티프가 최대 10개의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 10개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열인 융합 단백질.
A13. 항목 A9 내지 A10 또는 항목 A12 중 어느 하나에 있어서, 부피가 큰 N-말단 모티프가 1개 이상, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 3개 이상의 큰 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 티로신, 글루탐산 및 글루타민으로부터 선택된 아미노산으로 이루어진 융합 단백질.
A14. 항목 A9 내지 A10 또는 A12 내지 A13 중 어느 하나에 있어서, 부피가 큰 N-말단 모티프가 EWE를 포함하거나 EWE로 이루어진 3개의 아미노산 서열인 융합 단백질.
A15. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열번호: 1에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A16. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 임의의 서열 변이가 CDR 외부에 있는 융합 단백질.
A17. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 단일 도메인 항체의 인간화된 버전인 융합 단백질.
A18. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하는 융합 단백질.
A19. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해하는 융합 단백질.
A20. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 제1 링커가 글리신-세린(GS) 링커인 융합 단백질.
A21. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 제1 링커가 15 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 융합 단백질.
A22. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 제1 링커의 길이가 45 Å 내지 130 Å, 예를 들어 55 Å 내지 120 Å, 60 Å 내지 80 Å 또는 65 내지 70 Å인 융합 단백질.
A23. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 제1 링커가 서열번호: 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A24. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 220개 미만의 아미노산 길이를 갖는 융합 단백질.
A25. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 다음을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질:
a) 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체;
b) 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및
c) 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열을 서열번호: 18에 따르는 아미노산 서열에 연결하는 제2 링커, 예를 들어, 제2 링커는 서열번호: 17에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 링커.
A26. 항목 A25에 있어서, 폴리펩티드의 길이가 350개 미만의 아미노산인 융합 단백질.
A27. 항목 A25에 있어서, 폴리펩티드의 길이가 1148개 미만의 아미노산인 융합 단백질.
A28. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 제2 링커가 서열번호: 17에 따르는 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
A29. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A30. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 인자 I을 동원하는, 예를 들어 폴리펩티드가 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 융합 단백질.
A31. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 인자 I를 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화하는 융합 단백질.
A32. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 인자 I에 대한 보조인자, 예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조 인자인 융합 단백질.
A33. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하지 않는 융합 단백질.
A34. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 서열번호: 7에 따르는 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 7에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A35. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A36. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 서열번호: 5에 따르는 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 5에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A37. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질.
A38. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I을 동원하며, 예를 들어 융합 단백질이 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 융합 단백질.
A39. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해하고 인자 I을 동원하며, 예를 들어 융합 단백질이 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 융합 단백질.
A40. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화시키는 융합 단백질.
A41. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I에 대한 보조인자, 예컨대 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조인자인 융합 단백질.
A42. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해하고 인자 I 동원함으로써, 예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화시키는 융합 단백질.
A43. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해하고 인자 I에 대한 보조인자, 예컨대 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조인자인 융합 단백질.
A44. 220개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
A45. 350개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
A46. 항목 A44 또는 A45에 있어서, 폴리펩티드가 인자 I을 동원하는, 예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 폴리펩티드.
A47. 항목 A44 또는 A45에 있어서, 폴리펩티드가 인자 I을 동원함으로써, 예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화하는 폴리펩티드.
A48. 항목 A44 또는 A45에 있어서, 폴리펩티드가 인자 I에 대한 보조인자, 예를 들어 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열에 따르는 보조인자인 폴리펩티드.
A49. 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 항목 A44 내지 A48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
A50. 항목 A49의 핵산을 포함하는 벡터.
A51. 항목 A50에 따르는 벡터를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 다음:
a) 항목 A50에 따르는 벡터를 세포에 도입하는 단계;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 세포로부터 벡터를 수집하고 정제하는 단계; 및
d) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계를 포함하는 방법.
A52. 항목 A49의 핵산 또는 항목 A50의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
A53. 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 항목 A44 내지 A48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 다음:
a) 항목 A49에 따르는 핵산 또는 항목 A50에 따르는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 상등액으로부터 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 얻고 선택적으로 정제하는 단계; 및
d) 선택적으로, 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 정제하기 전에 세포를 용해시키는 단계를 포함하는 방법.
A54. 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 항목 A44 내지 A48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
A55. 보체 활성화와 연관된 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나의 융합 단백질, 항목 A44 내지 A48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 A54의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
A56. 약제로서 사용하기 위한 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나의 융합 단백질, 항목 A44 내지 A48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 A54에 따르는 약제학적 조성물.
A57. 보체 활성화와 연관된 장애의 치료에 사용하기 위한 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나의 융합 단백질, 항목 A44 내지 A48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 A54에 따르는 약제학적 조성물.
A58. 안구 질환, 신경계 질환, 자가면역 및 염증성 질환, 암 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애에 사용하기 위한, 항목 A55에 따르는 방법 또는 항목 A57의 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물.
A59. 보체 시스템의 활성을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 다음: 항목 A1 내지 A43 중 어느 하나에 정의된 융합 단백질, 항목 A44 내지 A43 중 어느 하나에 정의된 폴리펩티드 또는 항목 A54에 정의된 약제학적 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계; 이에 의해 이를 필요로 하는 개체의 보체 시스템의 활성을 조절하는 단계를 포함하는 방법.
추가 항목
B1. 다음을 포함하는 융합 단백질:
a) C3b에 결합하는 단일 도메인 항체;
b) 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드; 및
c) 제1 링커.
B2. 항목 B1에 있어서, 단일 도메인 항체가 C3b의 MG7 도메인 및 C3b 알파 사슬의 N-말단에 포함된 에피토프, 예를 들어 서열번호: 20에 따르는 아미노산 서열 및 서열번호: 19의 N-말단에 포함된 에피토프에 결합하고/하거나 단일 도메인 항체는 인자 H의 CCP1 도메인과 결합에 대해 경쟁하며, 예를 들어 단일 도메인 항체는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 결합에 대해 경쟁하는 융합 단백질.
B3. 항목 B1 내지 B2 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 융합 단백질.
B4. 항목 B1 내지 B3 중 어느 하나에 있어서, 단일 도메인 항체가 N-말단 모티프, 예컨대 부피가 큰 N-말단 모티프를 포함하고, 부피가 큰 N-말단 모티프는 C3에 대한 결합을 입체적으로 방해함으로써 C3b에 대한 특이성을 생성하며, 예를 들어, 부피가 큰 N-말단 모티프는 EWE 단일 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 3개 아미노산 서열인 융합 단백질.
B5. 항목 B1 내지 B4 중 어느 하나에 있어서, 제1 링커가 글리신-세린(GS) 링커, 예컨대 서열번호: 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 GS 링커인 융합 단백질.
B6. 항목 B1 내지 B5 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질은 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I를 동원하고/하거나 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해하며 인자 I를 동원하는데, 예를 들어 융합 단백질은 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 융합 단백질.
B7. 항목 B1 내지 B6 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I을 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화시키는 융합 단백질.
B8. 220개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
B9. 350개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
B10. 항목 B1 내지 B5 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 항목 B8 내지 B9 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
B11. 항목 B10의 핵산을 포함하는 벡터.
B12. 항목 B10의 핵산 또는 항목 B11의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
B13. 항목 B1 내지 B7 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 항목 B8 내지 B9 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
B14. 의약으로 사용하기 위한 항목 B1 내지 B7 중 어느 하나의 융합 단백질, 항목 B8 내지 B9 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 B13에 따르는 약제학적 조성물.
B15. 보체 활성화와 연관된 장애의 치료에 사용하기 위한 항목 B1 내지 B7 중 어느 하나의 융합 단백질, 항목 B8 내지 B9 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 B13에 따르는 약제학적 조성물로, 여기서 상기 장애는 안과 질환, 신경계 질환, 자가면역 및 염증성 질환, 암 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예
실험 세부사항
천연 C3는 이전에 설명한 바와 같이 혈장에서 정제되었다(Jensen et al., 2018). C3b는 설명된 바와 같이 정제된 C3에서 생성되었다(Pedersen et al., 2020). 글루타메이트-트립토판-글루타메이트(EWE) 모티프를 hC3Nb1 발현 벡터에 삽입하고 생성된 EWE-hC3Nb1 나노바디를 이전에 설명한 바와 같이 정제하였다(Jensen et al., 2018). 간단히 말해서, 단일 도메인 항체는 이. 콜리에서 발현되었다. 밤새 배양물을 펠렛화하여 세포를 20mM Tris pH 8.5, 500mM NaCl, 0.5mM EDTA, 20mM 이미다졸에 재현탁시키고 초음파 처리한 다음 HisTrap Crude FF(GE Healthcare) 컬럼에 인가하였다. 400mM 이미다졸이 보충된 완충액에 재현탁시킴으로써 단백질을 용출시켰다. 단백질을 20mM 아세트산 pH 5.5, 50mM NaCl에 대해 밤새 투석한 후 Source 15S(GE Healthcare) 컬럼에 인가하고 35개 컬럼 용적에 걸쳐 50 내지 350mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 단백질은 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl로 평형화된 Superdex 75(GE Healthcare) 컬럼에서 최종적으로 연마되었다.
미니-FH는 이전에 설명한 바와 같이 정제되었다(Pedersen et al., 2019). EWEμH 및 EWEnH는 유사한 프로토콜을 사용하여 정제되었다. 간단히 말해서, 융합 단백질은 PEI 형질감염을 사용하여 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되었다. 농축된 상등액을 수집하고, pH를 8.5로 조정한 후, 단백질을 HisTrap Excel(GE Healthcare) 컬럼에 인가하였다. 20mM Tris pH 8.5, 500mM NaCl, 400mM 이미다졸을 첨가하여 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질을 20 mM Tris pH 8.5, 50 mM NaCl에 대해 밤새 투석한 후 9 ㎖ Source 15Q(GE Healthcare) 컬럼에 인가하였다. 단백질은 20 내지 500mM NaCl로부터 60 ㎖ 선형 구배로 용출되었다. 이어서 단백질을 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl에서 평형화된 Superdex 200 증가(GE Healthcare) 컬럼에 인가하였다.
크기 배제 크로마토그래피 분석. C3b 200 ㎍를 2배 몰 과량의 EWE-hC3Nb1과 혼합하거나 처리하지 않은 채로 두었다. 혼합물을 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl에서 400 ㎕로 희석하고 희석 완충액으로 평형화된 Superdex 200 증가(GE Healthcare) 컬럼에 인가하였다. 천연 C3에 대한 EWE-hC3Nb1의 결합을 분석하는 SEC가 유사하게 수행되었다. 피크 분획은 SDS PAGE로 분석되었다.
인자 I에 의한 C3b의 인자 H 매개 절단. C3b를 1.2배 몰 과량의 EWE-hC3Nb1 또는 hC3Nb1과 함께 5분 동안 배양하였다. 다음으로, C3b 대비 1% 인자 I(Complement Technologies)와 0.2% 인자 H(Complement Technologies)를 첨가하였다. 혼합물을 표시된 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 반응 완충액은 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl이었다.
EWEμH와 미니-FH의 비교. C3b는 0.5% 인자 I(Complement Technologies) 및 2배 몰 과량의 미니-FH, EWEμH 또는 EWE-hC3Nb1 및 미니-FH와 혼합하였다. 혼합물을 표시된 시간 동안 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl에 37℃에서 배양하였다.
EWEμH와 EWEnH의 비교. C3b를 표시된 몰비로 EWEμH 또는 EWEnH와 함께 4℃에서 5분 동안 배양한 후 1% 인자 I(Complement Technologies)을 첨가하였다. 반응 완충액은 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl이었고 반응 온도는 37℃였다. 테스트된 C3b:융합 단백질 비율은 1:0.5 및 1:2였으며 각각 n=2 및 n=3 반복으로 수행되었다. C3b α'-사슬에서 발생하는 밴드의 강도는 ImageJ(버전 1.52a) 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.
용혈 분석. AP 완충액(20mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM MgCl2, 10mM EGTA, 0.1% 젤라틴) 중 1260, 420, 140, 46.7, 15.6 또는 5.2nM의 표시된 억제제를 11% NHS와 혼합하였다. 20 ㎕의 억제제-NHS 혼합물을 AP 완충액에서 10 ㎕의 6% 토끼 적혈구와 함께 배양하였다. 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 60 ㎕의 차가운 0.9% NaCl, 5mM EDTA를 첨가하고 적혈구를 200xg에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 70 ㎕의 상등액을 96개-웰 플레이트로 옮기고 VICTOR3 다중-표지물 플레이트 계수기(PerkinElmer)를 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
농도 시험. EWEμH 농축기에서 투명한 침전물이 관찰될 때까지 EWEμH 또는 EWEnH를 4℃의 vivaspin 500 원심분리 농축기에서 농축하였다. 단백질의 농도는 Nanodrop ND-1000 분광광도계(Seven Werner)를 사용하여 측정하였다. 단백질을 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl에 400 ㎕로 희석하고 희석 완충액에 평형화된 Superdex 200(GE Healthcare) 컬럼에 인가하였다.
바이오층 간섭계 실험. 모든 실험은 20mM HEPES pH 7.5, 150mm NaCl에서 수행되었다. 모든 실험은 30℃에서 작동하고 1000rpm으로 진탕시키는 Octet RED96(Fortebio Pall Corporation) 장치에서 수행되었다. EWE-hC3Nb1, EWEμH 또는 EWEnH는 항-펜타 바이오센서(Fortebio Pall Corporation)에 고정화되었고 센서는 C3b 또는 iC3b의 희석 시리즈로 이동시켰다. 정규화를 위해 센서그램에서 0nM 분석물질의 측정값을 빼고 GraphPad Prism(버전 6.01) 소프트웨어를 사용하여 센서그램을 1:1 결합 모델에 맞추었다.
래트 C3b의 EWEnH 및 EWEμH 매개된 분해. 래트 C3b를 2배 몰 과량의 EWEμH 또는 EWEnH와 혼합하였다. 4℃에서 5분간 배양한 후, C3b에 비해 1%(w/w) 인자 I(Complement Technology)을 첨가하였다. 반응 완충액은 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl이었다. 샘플을 37℃에서 0, 1, 2, 4, 8 또는 24시간 동안 배양하였다.
실시예 1 - EWE-hC3Nb1 인자 H 융합 단백질
EWE-hC3Nb1은 C3 및 C3b에 결합하는 능력에 대해 테스트되었다(도 3). EWE-hC3Nb1은 C3b와 혼합하였을 때(도 3A) 용출량에 명확한 변화를 주었지만, 천연 C3와 혼합하였을 때는 그렇지 않았는데(도 3B), 이는 EWE-hC3Nb1이 C3b에 대해 특이적임을 보여주는 것이다. 피크 분획의 후속 SDS PAGE를 통해 EWE-hC3Nb1:C3b 복합체의 형성이 확인되었다(도 3C).
EWEμH 및 EWEnH 융합 단백질의 설계(도 4A). C3b와 복합체를 이루는 hC3Nb1의 결정 구조(Jensen et al., 2018)는 미니-FH와 복합체를 이루는 C3b의 결정 구조(Xue et al., 2017)에 도킹되었다. 왼쪽 패널에는 미니-FH의 CCP1이 표시되지 않았다. 오른쪽 패널에는 미니-FH의 CCP1 및 CCP19-20이 표시되지 않았다. 점선은 EWE-hC3Nb1 모이어티의 C-말단을 인자 H 부분의 CCP2의 N-말단에 연결하는 유연한 링커를 나타낸다. 본 발명자들은 C3b에 결합된 hC3Nb1 또는 미니-FH의 결정 구조를 비교함으로써, C3b에서 hC3Nb1과 CCP1의 결합 부위가 광범위하게 중첩된다는 것을 깨달았다(도 4B-C). 결합 부위에서 이러한 중첩을 인식한 본 발명자들은 인자 H의 CCP2-4 및 CCP19-20 도메인에 대한 EWE-hC3Nb1의 재조합 연결이 인자 I에 의한 C3b의 절단을 매개하는 AP 억제제를 생성할 수 있다는 가설을 세웠다.
실시예 2 - C3b 절단의 검증
첫째, EWE-hC3Nb1 및 hC3Nb1은 인자 I에 의한 C3b의 인자 H 매개된 절단을 억제하는 능력에 대해 테스트되었다. 결과는 EWE-hC3Nb1(도 5A) 및 hC3Nb1(도 5B) 모두 인자 I에 의해 C3b의 인자 H 매개된 절단을 지연시키는 것으로 나타났다. 둘째, 인자 I에 의한 C3b의 절단을 유지시키는 능력에 대해 EWEμH를 테스트하였다. EWEμH의 효과는 미니-FH(CCP1-4, 19-20)뿐만 아니라 EWE-hC3Nb1 및 미니-FH(CCP1-4, 19-20)(도 5C) 둘의 혼합물과 비교되었다. 이 분석은 EWEμH가 C3b의 절단을 유지하는 반면, EWE-hC3Nb1과 미니-FH의 혼합물은 그렇지 않음을 보여준다. 따라서 EWEμH는 인자 I에 의한 C3b의 절단을 매개한다.
EWEnH와 EWEμH 융합 단백질을 서로 비교하기 위해 추가 검증이 수행되었다. 도 6은 EWEnH와 EWEμH의 비교를 보여준다. 두 융합 단백질 모두 1:0.5(도 6A) 및 1:2(도 6B)의 C3b:융합 단백질 몰비로 인자 I에 의한 C3b의 절단을 매개한다. 도 6C는 패널 A 내지 B의 각 시점에서 나머지 C3b의 정량화를 보여 주며, 이는 EWEnH가 테스트된 두 몰비 모두에서 C3b 절단을 유지하는 데 더 효율적이라는 것을 나타낸다.
실시예 3 - 융합 단백질의 단일 도메인 항체 모이어티의 결합 친화도 및 기능적 특성의 비교
융합 단백질 형식으로 제시되었을 때 C3b에 대한 EWE-hC3Nb1의 결합 친화도가 유지되는지 조사하기 위해 바이오층 간섭계 기반 분석을 수행하였다. 도 7은 C3b(도 7A) 및 iC3b(도 7B)에 대한 EWE-hC3Nb1의 친화도에 대한 조사를 보여 주며, 이는 EWE-hC3Nb1이 둘에 대해 유사한 친화도를 나타냄을 보여준다. 도 8은 C3b(도 8A) 및 iC3b(도 8B)에 대한 EWEμH의 친화도에 대한 바이오층 간섭계 기반 평가를 보여준다. 이러한 데이터는 EWEμH가 iC3b에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 C3b에 결합한다는 것을 나타낸다. 도 9는 EWEnH와 C3b(도 9A) 및 iC3b(도 9B)의 상호작용에 대한 평가를 보여준다. 이러한 데이터는 EWEnH가 C3b와 iC3b를 유사한 친화도로 결합한다는 것을 보여준다. 도 10의 표에는 도 7 내지 9에 설명된 결합 동역학이 요약되어 있다. 융합 EWEμH는 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1보다 C3b에 대해 대략 10배 더 강하게 결합하는 반면, iC3b에 대해서는 유사한 친화도로 결합한다. 융합 단백질 EWEnH는 단일 도메인 항체 EWE-hC3Nb1보다 C3b 및 iC3b에 대한 결합 친화도가 약간 더 낮다.
단일 도메인 항체의 결합 친화도가 유지됨을 확인한 후, 토끼 적혈구의 AP 매개된 용혈을 억제하는 능력을 확인하기 위한 기능적 연구를 수행하였다. 도 11은 EWEμH, EWEnH, EWE-hC3Nb1, 및 hC3Nb1이 11% NHS에서 AP 매개된 C3 단편 침착을 억제한다는 것을 보여준다. 이 효과는 광범위한 억제제 hC3Nb2(Pedersen et al., 2020) 및 불활성 hC3Nb1 돌연변이체(W102A)(Jensen et al., 2018)와 비교되었다.
전반적으로 이들 데이터는 AP 억제제로서 단일 도메인 항체의 정상적인 기능이 융합 단백질 형식으로 제시될 때 유지된다는 것을 보여준다.
실시예 4 - EWEμH 및 EWEnH의 농도
두 융합 단백질이 고농도로 침전되는 경향을 조사하기 위해 EWEμH와 EWEnH를 농축하였다. EWEμH는 3.75 ㎎/㎖에서 침전되기 시작하였다. EWEnH는 22 ㎎/㎖에서 어떠한 침전도 나타내지 않았다. 농축된 단백질을 SEC에 적용했는데, 여기서 EWEnH는 단분산 피크로 용출되었다(도 12A-B). 융합 단백질 EWEnH가 EWEμH보다 더 높은 농도의 한외여과를 견딜 수 있음을 보여준다.
실시예 5 - 래트 C3b(서열번호: 31 및 32)의 EWEnH 및 EWEμH 매개된 분해
EWEμH와 EWEnH는 인자 I에 의해 래트 C3b의 절단을 매개하는 능력에 대해 추가로 테스트되었다. 결과는 EWEμH와 EWEnH가 모두 인자 I에 의한 래트 C3b의 분해를 매개할 수 있음을 보여 주며 두 융합 단백질 모두 종 간 반응성을 가지고 있음을 보여준다. 실시예 2의 인간 C3b로부터 얻은 결과와 유사하게, EWEnH는 EWEμH보다 C3b 절단을 유지하는 데 더 효율적이다.
서열 개요
서열번호: 1
EWE-hC3Nb1
MEWEQVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS
서열번호: 2
hC3Nb1, EWE-hC3Nb1 및 IgG-Fc-hC3Nb1의 CDR1
SGSIFSINAMG
서열번호: 3
hC3Nb1, EWE-hC3Nb1 및 IgG-Fc-hC3Nb1의 CDR2
TINRSGGRTY
서열번호: 4
hC3Nb1, EWE-hC3Nb1 및 IgG-Fc-hC3Nb1의 CDR3
GTGWSPQTDNEYNY
서열번호: 5
EWEμH
EWEQVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDGGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEAGGGGGGGGGGGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKRENLYFQG
서열번호: 6
EWE-hC3Nb1과 인자 H 모이어티의 CCP2 도메인을 연결하는 폴리펩티드 링커
GGGGGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 7
EWEnH
EWEQVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEA
서열번호: 8
미니 FH
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEAGGGGGGGGGGGGGKCGPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
서열번호: 9
CCP2-CCP4 및 CCP19-CCP20을 포함하는 μH
RPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDGGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEAGGGGGGGGGGGGGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
서열번호: 10
CCP2-CCP4를 포함하는 nH
RPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEA
서열번호: 11
인자 H CCP2 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 83-143
RPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEV
서열번호: 12
인자 H CCP3 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 144-207
VKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVE
서열번호: 13
인자 H CCP4 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 208-264
ISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEE
서열번호: 14
인자 H CCP19 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 1107-1165
GKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLH
서열번호: 15
인자 H CCP19와 CCP20 UniProtKB - P08603(CFAH_HUMAN) 1166-1165 사이의 링커
PCVI
서열번호: 16
인자 H CCP20 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 1170-1230
SREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
서열번호: 17
CCP4-CCP19를 연결하는 링커
AGGGGGGGGGGG
서열번호: 18
인자 H CCP19-CCP20 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 1107-1230
KCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
서열번호: 19
rcsb.com의 인간 C3b 알파 사슬 서열 [pdb id: 5O35] 749-1663
SNLDEDIIAEENIVSRSEFPESWLWNVEDLKEPPKNGISTKLMNIFLKDSITTWEILAVSMSDKKGICVADPFEVTVMQDFFIDLRLPYSVVRNEQVEIRAVLYNYRQNQELKVRVELLHNPAFCSLATTKRRHQQTVTIPPKSSLSVPYVIVPLKTGLQEVEVKAAVYHHFISDGVRKSLKVVPEGIRMNKTVAVRTLDPERLGREGVQKEDIPPADLSDQVPDTESETRILLQGTPVAQMTEDAVDAERLKHLIVTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKGGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLQLKDFDFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAPDHQELNLDVSLQLPSRSSKITHRIHWESASLLRSEETKENEGFTVTAEGKGQGTLSVVTMYHAKAKDQLTCNKFDLKVTIKPAPETEKRPQDAKNTMILEICTRYRGDQDATMSILDISMMTGFAPDTDDLKQLANGVDRYISKYELDKAFSDRNTLIIYLDKVSHSEDDCLAFKVHQYFNVELIQPGAVKVYAYYNLEESCTRFYHPEKEDGKLNKLCRDELCRCAEENCFIQKSDDKVTLEERLDKACEPGVDYVYKTRLVKVQLSNDFDEYIMAIEQTIKSGSDEVQVGQQRTFISPIKCREALKLEEKKHYLMWGLSSDFWGEKPNLSYIIGKDTWVEHWPEEDECQDEENQKQCQDLGAFTESMVVFGCPN
서열번호: 20
C3b UniProtKB - P01024(CO3_HUMAN) 829-933의 MG7 도메인
FFIDLRLPYSVVRNEQVEIRAVLYNYRQNQELKVRVELLHNPAFCSLATTKRRHQQTVTIPPKSSLSVPYVIVPLKTGLQEVEVKAAVYHHFISDGVRKSLKVVP
서열번호: 21
인자 H CCP1 UniProtKB - P08603 (CFAH_HUMAN) 19-82
EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQK
서열번호: 22
인자 I UniProtKB - P05156(CFAI_HUMAN) 19-583
KVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFPTYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADVVCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVTQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTVVDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGVVSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV
서열번호: 23
hC3Nb1
MQVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS
서열번호: 24
rcsb.com의 인간 C3b 베타 사슬 서열 [pdb id: 5O35] 23-667
SPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGYLFIQTDKTIYTPGSTVLYRIFTVNHKLLPVGRTVMVNIENPEGIPVKQDSLSSQNQLGVLPLSWDIPELVNMGQWKIRAYYENSPQQVFSTEFEVKEYVLPSFEVIVEPTEKFYYIYNEKGLEVTITARFLYGKKVEGTAFVIFGIQDGEQRISLPESLKRIPIEDGSGEVVLSRKVLLDGVQNPRAEDLVGKSLYVSATVILHSGSDMVQAERSGIPIVTSPYQIHFTKTPKYFKPGMPFDLMVFVTNPDGSPAYRVPVAVQGEDTVQSLTQGDGVAKLSINTHPSQKPLSITVRTKKQELSEAEQATRTMQALPYSTVGNSNNYLHLSVLRTELRPGETLNVNFLLRMDRAHEAKIRYYTYLIMNKGRLLKAGRQVREPGQDLVVLPLSITTDFIPSFRLVAYYTLIGASGQREVVADSVWVDVKDSCVGSLVVKSGQSEDRQPVPGQQMTLKIEGDHGARVVLVAVDKGVFVLNKKNKLTQSKIWDVVEKADIGCTPGSGKDYAGVFSDAGLTFTSSSGQQTAQRAELQCPQPAA
서열번호: 25
IgG-Fc-hC3Nb1
APLEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAQVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS
서열번호: 26
DI62
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSDYTMGWFRQAPGKEREFVAGLSTGGSFTRYAASVEGRFTISRDNAKTTVYLQMNNLQPEDTAVYYCAADFTPYGTNWSRFREARDHYWGQGTQVTVSS
서열번호: 27
DI62의 CDR1
SGRTFSDYTMG
서열번호: 28
DI62의 CDR2
GLSTGGSFTR
서열번호: 29
DI62의 CDR3
DFTPYGTNWSRFREARDHY
서열번호: 30
인간 인자 B UniProtKB - P00751 (CFAB_HUMAN) 26-764
TPWSLARPQGSCSLEGVEIKGGSFRLLQEGQALEYVCPSGFYPYPVQTRTCRSTGSWSTLKTQDQKTVRKAECRAIHCPRPHDFENGEYWPRSPYYNVSDEISFHCYDGYTLRGSANRTCQVNGRWSGQTAICDNGAGYCSNPGIPIGTRKVGSQYRLEDSVTYHCSRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPQEVAEAFLSSLTETIEGVDAEDGHGPGEQQKRKIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHVIILMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL
서열번호: 31
래트 C3b 베타 사슬 서열 25-666
SPMYSIITPNVLRLESEETFILEAHDAQGDVPVTVTVQDFLKKQVLTSEKTVLTGATGHLNRVFIKIPASKEFNADKGHKYVTVVANFGATVVEKAVLVSFQSGYLFIQTDKTIYTPGSTVFYRIFTVDNNLLPVGKTVVIVIETPDGVPIKRDILSSHNQYGILPLSWNIPELVNMGQWKIRAFYEHAPKQTFSAEFEVKEYVLPSFEVLVEPTEKFYYIHGPKGLEVSITARFLYGKNVDGTAFVIFGVQDEDKKISLALSLTRVLIEDGSGEAVLSRKVLMDGVRPSSPEALVGKSLYVSVTVILHSGSDMVEAERSGIPIVTSPYQIHFTKTPKFFKPAMPFDLMVFVTNPDGSPARRVPVVTQGSDAQALTQDDGVAKLSVNTPNNRQPLTITVSTKKEGIPDARQATRTMQAQPYSTMHNSNNYLHLSVSRVELKPGDNLNVNFHLRTDAGQEAKIRYYTYLVMNKGKLLKAGRQVREPGQDLVVLSLPITPEFIPSFRLVAYYTLIGANGQREVVADSVWVDVKDSCVGTLVVKGDPRDNRQPAPGHQTTLRIEGNQGARVGLVAVDKGVFVLNKKNKLTQSKIWDVVEKADIGCTPGSGKNYAGVFMDAGLTFKTNQGLQTDQREDPECAKPAA
서열번호: 32
래트 C3b 알파 사슬 서열 749-1663
SDVDEDIIPEEDIISRSHFPESWLWTIEELKEPEKNGISTKVMNIFLKDSITTWEILAVSLSDKKGICVADPYEITVMQDFFIDLRLPYSVVRNEQVEIRAVLFNYREQEKLKVRVELLHNPAFCSMATAKKRYYQTIEIPPKSSVAVPYVIVPLKIGLQEVEVKAAVFNHFISDGVKKILKVVPEGMRVNKTVAVRTLDPEHLNQGGVQREDVNAADLSDQVPDTDSETRILLQGTPVAQMAEDAVDGERLKHLIVTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDQTEQWEKFGLEKRQEALELIKKGYTQQLAFKQPISAYAAFNNRPPSTWLTAMWSRSFSLAANLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDGPVIHQEMIGGFRNTKEADVSLTAFVLIALQEARDICEGQVNSLPGSINKAGEYLEASYLNLQRPYTVAIAGYALALMNKLEEPYLTKFLNTAKDRNRWEEPGQQLYNVEATSYALLALLLLKDFDSVPPVVRWLNDERYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYRADVPDHKDLNMDVSLHLPSRSSPTVFRLLWESGSLLRSEETKQNEGFSLTAKGKGQGTLSVVTVYHAKVKGKTTCKKFDLRVTIKPAPETAKKPQDAKSSMILDICTRYLGDVDATMSILDISMMTGFIPDTNDLELLSSGVDRYISKYEMDKAFSNKNTLIIYLEKISHSEEDCLSFKVHQFFNVGLIQPGSVKVYSYYNLEESCTRFYHPEKDDGMLSKLCHNEMCRCAEENCFMHQSQDQVSLNERLDKACEPGVDYVYKTKLTTIELSDDFDEYIMTIEQVIKSGSDEVQAGQERRFISHVKCRNALKLQKGKQYLMWGLSSDLWGEKPNTSYIIGKDTWVEHWPEAEERQDQKNQKQCEDLGAFTETMVVFGCPN
서열번호: 33
신호 펩티드를 포함하는 인간 C3 서열 UniProtKB - P01024(CO3_HUMAN) 1-1663
MGPTSGPSLLLLLLTHLPLALGSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGYLFIQTDKTIYTPGSTVLYRIFTVNHKLLPVGRTVMVNIENPEGIPVKQDSLSSQNQLGVLPLSWDIPELVNMGQWKIRAYYENSPQQVFSTEFEVKEYVLPSFEVIVEPTEKFYYIYNEKGLEVTITARFLYGKKVEGTAFVIFGIQDGEQRISLPESLKRIPIEDGSGEVVLSRKVLLDGVQNPRAEDLVGKSLYVSATVILHSGSDMVQAERSGIPIVTSPYQIHFTKTPKYFKPGMPFDLMVFVTNPDGSPAYRVPVAVQGEDTVQSLTQGDGVAKLSINTHPSQKPLSITVRTKKQELSEAEQATRTMQALPYSTVGNSNNYLHLSVLRTELRPGETLNVNFLLRMDRAHEAKIRYYTYLIMNKGRLLKAGRQVREPGQDLVVLPLSITTDFIPSFRLVAYYTLIGASGQREVVADSVWVDVKDSCVGSLVVKSGQSEDRQPVPGQQMTLKIEGDHGARVVLVAVDKGVFVLNKKNKLTQSKIWDVVEKADIGCTPGSGKDYAGVFSDAGLTFTSSSGQQTAQRAELQCPQPAARRRRSVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARASHLGLARSNLDEDIIAEENIVSRSEFPESWLWNVEDLKEPPKNGISTKLMNIFLKDSITTWEILAVSMSDKKGICVADPFEVTVMQDFFIDLRLPYSVVRNEQVEIRAVLYNYRQNQELKVRVELLHNPAFCSLATTKRRHQQTVTIPPKSSLSVPYVIVPLKTGLQEVEVKAAVYHHFISDGVRKSLKVVPEGIRMNKTVAVRTLDPERLGREGVQKEDIPPADLSDQVPDTESETRILLQGTPVAQMTEDAVDAERLKHLIVTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLALLQLKDFDFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAPDHQELNLDVSLQLPSRSSKITHRIHWESASLLRSEETKENEGFTVTAEGKGQGTLSVVTMYHAKAKDQLTCNKFDLKVTIKPAPETEKRPQDAKNTMILEICTRYRGDQDATMSILDISMMTGFAPDTDDLKQLANGVDRYISKYELDKAFSDRNTLIIYLDKVSHSEDDCLAFKVHQYFNVELIQPGAVKVYAYYNLEESCTRFYHPEKEDGKLNKLCRDELCRCAEENCFIQKSDDKVTLEERLDKACEPGVDYVYKTRLVKVQLSNDFDEYIMAIEQTIKSGSDEVQVGQQRTFISPIKCREALKLEEKKHYLMWGLSSDFWGEKPNLSYIIGKDTWVEHWPEEDECQDEENQKQCQDLGAFTESMVVFGCPN
참고자료
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Claims (35)
- 융합 단백질로서,
a) C3b에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
b) C3b에 결합하는 폴리펩티드로서, (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며; 선택적으로 상기 폴리펩티드는 (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 추가로 포함하는 폴리펩티드
를 포함하고; 여기서 상기 융합 단백질의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 융합 단백질의 폴리펩티드와 C3b와의 결합에 대해 경쟁하지 않는 것인 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3가 아닌 C3b에 특이적으로 결합하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3b에 대한 결합에 대해 인자 I과 경쟁하지 않는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3b와 인자 B 또는 활성 Bb 사이의 상호작용을 억제할 수 있고 이에 의해 C3bBb 전환효소 복합체의 조립 및/또는 C3bBb 전환효소의 활성을 억제할 수 있는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B와 경쟁하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3b에 대한 결합에 대해 인자 B와 경쟁하고, C3b에 대한 결합에 대해 인자 I과 경쟁하지 않는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3b의 MG7 도메인(서열번호: 20) 및 C3b 알파 사슬의 N-말단 영역(예를 들어, 서열번호: 19의 잔기 1 내지 30, 1 내지 20 또는 4 내지 12)에 포함된 에피토프에 결합하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 아미노산:
a) C3b의 Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당);
b) C3b의 Glu758, Glu759, Asn760, Arg855, Val916, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Glu10, Glu11, Asn12, Arg107, Val168, His170, His171, Phe172에 해당); 또는
c) C3b의 Asp752, Asp754, Ile755, Ile756, Glu759, Asn760, His918, His919, Phe920(서열번호: 19에 따르는 아미노산 서열의 Asp4, Asp6, Ile7, Ile8, Glu11, Asn12, His170, His171, Phe172에 해당)
으로 이루어진 에피토프에 결합하는 것인 융합 단백질. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C3b에 대한 결합에 대해 인자 H의 CCP1 도메인(서열번호: 21)과 경쟁하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 단일 도메인 항체인 융합 단백질.
- 제10항에 있어서, 단일 도메인 항체가 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서 CDR1은 서열번호: 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하며, CDR2는 서열번호: 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열번호: 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 단일 도메인 항체가 C3b에 특이적으로 결합하고 (a) 서열번호: 23에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 (b) N-말단 모티프를 포함하거나 이로 이루어지며, 선택적으로 단일 도메인 항체가 서열번호: 23의 아미노산 서열 및 N-말단 모티프를 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
- 제12항에 있어서, N-말단 모티프가 C3에 대한 결합을 입체적으로 방해함으로써 C3b에 대한 특이성을 생성하고, 선택적으로 N-말단 모티프가 아미노산 EWE를 포함하거나 이로 이루어진 3개 아미노산 서열인 융합 단백질.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제1 링커에 의해 폴리펩티드에 연결되는 것인 융합 단백질.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 링커가 글리신-세린(GS) 링커, 예컨대, 서열번호: 6에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 GS 링커인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 180개 미만의 아미노산, 예컨대, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135 또는 130개 미만의 아미노산이고, 선택적으로 상기 폴리펩티드의 길이는 125개 아미노산인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 240개 미만의 아미노산, 예컨대, 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190 또는 185개 미만의 아미노산이고, 선택적으로 폴리펩티드의 길이는 183개의 아미노산인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (i) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및/또는 (ii) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항, 제18항 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (i) 서열번호: 11에 따르는 아미노산 서열; (ii) 서열번호: 12에 따르는 아미노산 서열; (iii) 서열번호: 13에 따르는 아미노산 서열; (iv) 서열번호: 14에 따르는 아미노산 서열; 및 (v) 서열번호: 16에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항, 제18항 또는 제20항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제16항, 제18항 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 380개 미만의 아미노산, 예컨대, 375, 370, 365, 360, 355, 350, 345, 340, 335, 330, 325 또는 320개 미만의 아미노산이고, 선택적으로 폴리펩티드의 길이는 319개의 아미노산인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 CCP1 도메인, 예컨대, 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열, 또는 서열번호: 21에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하지 않는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것과 같이, 인자 I를 동원할 수 있는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I를 동원하고/하거나 융합 단백질이 대체 경로 C3 전환효소인 C3bBb의 형성을 방해하고 인자 I를 동원하며, 예컨대 융합 단백질은 서열번호: 22에 따르는 아미노산 서열을 동원하는 것인 융합 단백질.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 인자 B 또는 이의 단편이 C3b에 결합하는 것을 방지함으로써 대체 경로를 억제하고 인자 I를 동원함으로써 C3b의 분해를 활성화시키는 것인 융합 단백질.
- 220개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 10에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
- 350개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드로서, 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열 또는 서열번호: 9에 따르는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 제28항 또는 제29항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
- 제30항의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제30항의 핵산 또는 제31항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 제28항 또는 제29항의 폴리펩티드를 포함하고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제29항 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제29항 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 보체 활성화와 연관된 장애, 예컨대 안질환, 신경계 질환, 자가면역 및 염증성 질환, 암 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애의 치료에 사용하기 위한, 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물.
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