KR20240058792A - Cell line-based thyroid cancer organoids, method for preparing the same and method for evaluating drug using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갑상선암 오가노이드, 암 오가노이드를 형성하도록 갑상선암 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및 상기 암오가노이드 및 성장 배지를 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함하는 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법 및 이에 따른 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법 또는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다. The present invention includes the steps of first culturing thyroid cancer organoids by mixing a medium containing a thyroid cancer cell line and human extracellular matrix (ECM) to form a cancer organoid; and a second culture step of mixing the cancer organoids and the growth medium; It relates to a method for manufacturing thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, and a method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using the thyroid cancer organoid for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, or a method for screening an anticancer drug.
Description
본 발명은 세포주 유래 갑상선암 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 활용한 약물의 효능 또는 독성 평가기술에 관한 것이다. The present invention relates to cell line-derived thyroid cancer organoids, methods for producing the same, and techniques for evaluating the efficacy or toxicity of drugs using the same.
신약 개발의 초기 단계에서는 정확한 독성 및 유효성 예측을 평가하는 모델이 필요하다. 현 기술로는 동물 모델이 신약의 독성 및 유효성에 대하여 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나, 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적 및 대사과정의 차이로 인하여 인간의 생체 내 환경을 완전히 반영하기 어렵다. 또한, 기술적으로도 동물 체내에서 일어나는 반응을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적 문제도 뒤따른다. In the early stages of new drug development, models that evaluate accurate toxicity and efficacy predictions are needed. With current technology, animal models can most closely simulate the toxicity and effectiveness of new drugs. However, animal experiments are burdensome in terms of time and money, and it is difficult to completely reflect the human in vivo environment due to differences in genetic, biochemical, and metabolic processes between species. Additionally, it is technically difficult to monitor reactions occurring in an animal's body, and ethical issues arise as well.
이에, 암 조직에서 직접 분리하여 체외 배양된 일차 배양 암세포가 표준 모델로 사용되고 있지만, 조직을 얻기에도 어렵고, 조직 세포가 체외에서 증식하지 못하는 실험적 한계가 있다. 또한, 암 조직에서 암 세포가 구축되기가 어려워 그 성공률이 저조하며, 환자 유래 암 세포를 장기간 2차원 계대 배양한 결과, 환자의 암에서 나타나는 이질성이나 돌연변이와 같은 조직학적 구조에서 발생할 수 있는 특성이 사라지므로, 이질성을 잃은 세포주를 쥐에 주입하여 암 모델을 만들더라도 원래 암 환자에서 나타나는 특성이 사라진다는 문제점이 있다.Accordingly, primary cultured cancer cells directly isolated from cancer tissue and cultured in vitro are used as a standard model, but it is difficult to obtain tissue and there are experimental limitations in that tissue cells cannot proliferate in vitro. In addition, it is difficult to construct cancer cells from cancer tissue, so the success rate is low, and as a result of long-term two-dimensional subculture of patient-derived cancer cells, characteristics that may arise from the histological structure, such as heterogeneity or mutations, that appear in the patient's cancer. Therefore, even if a cancer model is created by injecting a cell line that has lost its heterogeneity into mice, there is a problem that the characteristics originally seen in cancer patients are lost.
한편, 새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되므로 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다.Meanwhile, organoids are attracting attention as a new human body simulation model. Organoids are formed by growing stem cells into specific cells to form three-dimensional structures such as organs. Unlike two-dimensional cell-based models, organoids are cultured in a three-dimensional environment, so they can be cultured for a longer period of time. Additionally, organoids are similar to actual organs in their constituent cells and structure. Accordingly, organoids are evaluated as the optimal test object for examining the efficacy and stability of drugs in the process of developing new drugs. Furthermore, the organoid-related field is a field with high potential that can be used not only for drug toxicity and efficacy evaluation in new drug development, but also for disease models, cancer research, personalized medicine, and regenerative treatments.
이에 최근에는 암 환자로부터 분리한 암 조직을 이용하여 암 오가노이드를 제작하려는 시도가 있지만, 일반적으로 암 세포, 특히 갑상선암 세포는 배아줄기세포나 유도만능줄기세포 혹은 성체줄기세포보다 기관(organ)의 크기와 구조를 개발하는데 어려움이 있었다. 또한, 기존에 갑상선암 세포주를 이용한 오가노이드 개발 방법은 암 조직만을 포함한 조직으로서, 실제 생체 내(in vivo) 상황을 모사하는데 한계가 있었고, 조직 분화성이 낮아서 갑상선암 오가노이드의 제작 수율이 낮고 크기가 불량한 단점이 있었다.Accordingly, there have been recent attempts to create cancer organoids using cancer tissues isolated from cancer patients, but cancer cells in general, and thyroid cancer cells in particular, are more likely to be used as organoids than embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, or adult stem cells. There were difficulties developing the size and structure. In addition, the existing organoid development method using thyroid cancer cell lines was a tissue containing only cancer tissue, and had limitations in simulating the actual in vivo situation. Due to low tissue differentiation, the production yield of thyroid cancer organoids was low and the size was small. It had some bad flaws.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. The technology behind the invention has been written to facilitate easier understanding of the invention. It should not be understood as an admission that matters described in the technology underlying the invention exist as prior art.
종래에는 줄기세포 유래 또는 iPSC 유래의 세포들에 의하여 형성된 갑상선암 오가노이드들이 제공되어 왔다. 그러나, 줄기세포는 윤리적으로 이슈가 되고 있음에 따라, 이를 활용하기 위해서는 연구윤리위원회(IRB)의 승인을 받은 후 활용이 가능하여 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 나아가, 줄기세포는 줄기세포 각각의 차이(variation)이 있음에 따라, 결과에 대한 유사성 보장이 어려웠다. Conventionally, thyroid cancer organoids formed by stem cell-derived or iPSC-derived cells have been provided. However, as stem cells have become an ethical issue, their use can only be done after obtaining approval from the Research Ethics Committee (IRB), which has the disadvantage of requiring a lot of time. Furthermore, as stem cells each have variations, it was difficult to guarantee similarity in results.
더 나아가, 줄기세포(iPSC 유래의 세포)를 통한 오가노이드 제작은 세포 생산의 시간이 많이 소요되며, 실험자의 숙련도에 따라 생산되는 세포의 질(quality)가 매우 다를 수 있다. 또한, 줄기세포를 특정 계통으로 분화시키기 위해서는 일반적인 세포 배양보다 많은 시간 및 물질이 요구됨에 따라, 이에 따른 비용이 많이 요구된다. 예를 들어, 줄기세포를 통한 오가노이즈 제작에는 마트리겔(Matrigel)이나 하이드로겔(hydrogel)과 같은 물질이 이용되는데, 마트리겔 및 하이드로겔이 이용될 경우, 세포 배양 및 스페로이드(오가노이드) 형성에 많은 시간이 소요된다. Furthermore, organoid production using stem cells (iPSC-derived cells) takes a lot of time to produce cells, and the quality of the cells produced can be very different depending on the skill of the experimenter. In addition, differentiating stem cells into specific lineages requires more time and materials than general cell culture, resulting in high costs. For example, materials such as Matrigel or hydrogel are used to produce organoids using stem cells. When Matrigel and hydrogel are used, cell culture and spheroid (organoid) formation are carried out. It takes a lot of time.
나아가, 오가노이드의 형성은 배양의 환경 및 조성에 매우 예민하여, 종래에는 제작 및 실험자의 숙련도 및 환경에 따라, 모양 및 성숙도가 매우 상이한 오가노이드가 제공되어 왔다. Furthermore, the formation of organoids is very sensitive to the environment and composition of the culture, and organoids with very different shapes and levels of maturity have conventionally been provided depending on the skill level and environment of the fabricator and experimenter.
즉, 종래에는 오가노이드의 기초가 되는 재료(줄기세포)의 민감성 및 이에 따른 배양 기간에 의하여 동질성의 균일한 오가노이드 제공이 어려움에 따라, 줄기세포 유래 갑상선암 오가노이드를 통한 약물 효능 및 독성 시험 또한, 동일한 실험 결과를 도출하기 어려웠다. In other words, in the past, it was difficult to provide homogeneous and uniform organoids due to the sensitivity of the material (stem cells) that forms the basis of organoids and the resulting culture period, so drug efficacy and toxicity tests using stem cell-derived thyroid cancer organoids were also conducted. , it was difficult to derive the same experimental results.
이에, 줄기세포 유래 갑상선암 오가노이드를 통한 다양한 실험은 매우 낮은 신뢰도를 가지며, 실제 약물 및 독성 테스트 등의 물질 유효성 평가에는 이용되지 못하였다. 나아가, 종래의 줄기세포 유래 갑상선암 오가노이드는 균일한 동질성의 오가노이드 확보가 어려움에 따라, 이의 배양 및 제공 기간이 매우 길어 원활한 유통이 어려웠다. Accordingly, various experiments using stem cell-derived thyroid cancer organoids have very low reliability and have not been used to evaluate the effectiveness of substances such as actual drugs and toxicity tests. Furthermore, the conventional stem cell-derived thyroid cancer organoids were difficult to distribute smoothly due to the difficulty in securing organoids of uniform homogeneity, and the culture and provision period was very long.
한편, 본 발명의 발명자들은 줄기세포가 아닌 일반적인 암세포주를 특정 3차원 배양 환경에서 배양할 경우, 단시간 내에 균일한 오가노이드를 형성할 수 있다는 것을 발견하였으며, 그 결과, 본 발명의 발명자들은 전술한 배양 조건을 통하여, 암의 구조 및 암 특성을 잘 모사하는 갑상선암 오가노이드를 개발하였다. Meanwhile, the inventors of the present invention discovered that when general cancer cell lines, rather than stem cells, are cultured in a specific three-dimensional culture environment, uniform organoids can be formed within a short period of time. As a result, the inventors of the present invention discovered that the above-mentioned Through culture conditions, we developed a thyroid cancer organoid that well mimics the structure and characteristics of cancer.
이에, 본 발명의 발명자들은, 모든 세포주, 줄기세포, 장기 등 종류 (species)에 상관없이 적용 가능한 3차원 세포배양용 ECM을 포함하는 배지 (Org 3D culture solution)을 개발하였다. 상술한 ECM (세포외기질)은 인체 피부의 섬유아세포로부터 나노 섬유를 포함하는 형태로 개발되어 생체 내 세포외기질과 동일한 형태를 가짐에 생체 내 모사가 뛰어난 스페로이드 또는 오가노이드 배양 환경을 제공함으로써, 이를 활용한 오가노이드 제조 방법을 제공하고, 이를 통하여 생체 갑상선암의 모사도가 높은 갑상선암 오가노이드 및 약물의 효능 또는 독성 평가 방법의 제공이 가능함을 확인하였다.Accordingly, the inventors of the present invention developed a medium (Org 3D culture solution) containing ECM for 3D cell culture that can be applied regardless of species, such as all cell lines, stem cells, and organs. The above-mentioned ECM (extracellular matrix) was developed in a form containing nanofibers from fibroblasts of human skin and has the same form as the extracellular matrix in vivo, providing a spheroid or organoid culture environment with excellent in vivo mimicry. , provided an organoid manufacturing method using this, and confirmed that it was possible to provide a thyroid cancer organoid with a high degree of simulation of living thyroid cancer and a method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug.
이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 갑상선암 세포주 기반의 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 제공하는 것이다.Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to provide thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of drugs based on thyroid cancer cell lines.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 전술한 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 제조하기 위한 조성물 및 제조 방법을 제공하는 것이다.Another problem to be solved by the present invention is to provide a composition and method for producing thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the above-mentioned drugs.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 전술한 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 활용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법을 제공하는 것이다. Another problem to be solved by the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the drug described above.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. The problems of the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 갑상선암 세포주 유래 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 제공한다.In order to solve the problems described above, the present invention provides thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of drugs derived from thyroid cancer cell lines.
본 발명의 특징에 따르면, 갑상선암 오가노이드는 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 발현할 수 있다.According to a feature of the present invention, the thyroid cancer organoid may express at least one selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin.
본 발명의 특징에 따르면, 갑상선암 오가노이드는 암 활성제 처리에 의해 암 미세환경을 모사할 수 있다.According to features of the present invention, thyroid cancer organoids can simulate a cancer microenvironment by treatment with a cancer activator.
본 발명의 특징에 따르면, 암 미세환경은 상피중간엽전이(EMT; epithelial to mesenchymal transition) 또는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality)이 증가한 것일 수 있다.According to the features of the present invention, the cancer microenvironment may have increased epithelial to mesenchymal transition (EMT) or F-actin abnormality.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드에 약물을 처리하는 단계; 상기 약물이 처리된 오가노이드에 대해 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention includes the steps of treating thyroid cancer organoids with a drug for evaluating drug efficacy or toxicity; For organoids treated with the above drug, selected from the group consisting of F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. A method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids is provided, including measuring the level of at least one biomarker.
본 발명의 특징에 따르면, 상술한 약물 평가 방법은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 또는 E-cadherin 발현 위치를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.According to a feature of the present invention, the above-described drug evaluation method may further include the step of confirming the expression location of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) or E-cadherin.
본 발명의 특징에 따르면, 약물이 처리된 오가노이드에 대해 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 및 티로페록시다제(TPO)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 수준이 감소하거나 티로글로불린(Tg) 또는 E-cadherin의 수준이 증가한 경우 약물이 효능을 보이는 것으로 판단할 수 있다. 이 때 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 수준이 세포내소포(intracellular vesicle)에서 감소 또는 E-cadherin의 수준이 세포막(membrane)에서 증가한 것일 수 있다.According to a feature of the present invention, F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), and thyroperoxidase (TPO) were detected in organoids treated with the drug compared to the untreated group or the positive control group. ), the drug can be judged to be effective when the level of at least one selected from the group is reduced or the level of thyroglobulin (Tg) or E-cadherin is increased. At this time, the level of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) may be decreased in intracellular vesicles or the level of E-cadherin may be increased in the cell membrane.
본 발명의 특징에 따르면, 약물이 처리된 오가노이드에 대해 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 및 티로페록시다제(TPO)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 수준이 증가하거나 티로글로불린(Tg) 또는 E-cadherin의 수준이 감소한 경우 약물이 독성을 보이는 것으로 판단할 수 있다. 이 때 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 수준이 세포내소포(intracellular vesicle)에서 증가 또는 E-cadherin의 수준이 세포막(membrane)에서 감소한 것일 수 있다.According to a feature of the present invention, F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), and thyroperoxidase (TPO) were detected in organoids treated with the drug compared to the untreated group or the positive control group. ), the drug can be judged to be toxic if the level of at least one selected from the group is increased or the level of thyroglobulin (Tg) or E-cadherin is decreased. At this time, the level of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) may be increased in intracellular vesicles or the level of E-cadherin may be decreased in the cell membrane.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드에 항암 후보물질을 처리하는 단계; 상기 항암 후보물질이 처리된 오가노이드 및 항암 후보물질 미처리군에서 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커 수준(level)을 비교하는 단계; 를 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention includes the steps of treating thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity with an anticancer candidate material; F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO) and E Comparing the level of at least one biomarker selected from the group consisting of -cadherin; Provides an anticancer drug screening method using thyroid cancer organoids, including.
본 발명의 특징에 따르면, 상술한 스크리닝 방법은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 또는 E-cadherin 발현 위치를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.According to a feature of the present invention, the above-described screening method may further include the step of confirming the expression location of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) or E-cadherin.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 암오가노이드가 형성되도록 갑상선암 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및 상기 암오가노이드 및 성장 배지를 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention includes the steps of first culturing a medium containing a thyroid cancer cell line and human extracellular matrix (ECM) to form cancer organoids; and a second culture step of mixing the cancer organoids and the growth medium; It provides a method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, including.
본 발명의 특징에 따르면, 인체 세포외기질은 인체 유래 섬유아세포로부터 수득된 것일 수 있다.According to the features of the present invention, the human extracellular matrix may be obtained from human-derived fibroblasts.
본 발명의 특징에 따르면, 인체 세포외기질은 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고 탈세포화한 후 수득된 3차원 세포배양용 ECM일 수 있다.According to the features of the present invention, the human extracellular matrix may be an ECM for three-dimensional cell culture obtained after treating a patch of human-derived fibroblasts with proteolytic enzymes and decellularizing them.
본 발명의 3차원 세포배양용 배지(Org 3D culture solution)는 ECM (extracellular matrix)를 포함하며 상기 배지는 오가노이드 성장에 필요한 마트리겔, 하이드로겔, 성장인자 등을 첨가하지 않고도 줄기세포, 세포주, 장기 등과 혼합 배양하는 것만으로 일관적인 퀄리티를 갖는 충분한 양의 오가노이드를 수득할 수 있는 배양 환경을 제공한다. 이에 저비용의 화학적 요소만으로 생산 가능하며 시험관내에서 섬유아세포의 배양으로부터 지속적으로 공급될 수 있는 장점이 있다.The medium for 3D cell culture (Org 3D culture solution) of the present invention contains ECM (extracellular matrix), and the medium can be used to grow stem cells, cell lines, etc. without adding matrigel, hydrogel, growth factors, etc. required for organoid growth. It provides a culture environment in which a sufficient amount of organoids with consistent quality can be obtained simply by mixing culture with organs, etc. Accordingly, it can be produced using only low-cost chemical elements and has the advantage of being continuously supplied from fibroblast culture in vitro.
본 발명의 특징에 따르면, 제1 배양하는 단계에서, 갑상선암 세포주 및 인체 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 포함하는 배지는 1:1 비율로 포함될 수 있다.According to a feature of the present invention, in the first culturing step, a medium containing a thyroid cancer cell line and human extracellular matrix (ECM) may be included in a 1:1 ratio.
본 발명의 특징에 따르면, 제1 배양하는 단계에서 50um 내지 200um 크기를 갖는 오가노이드가 형성될 수 있다.According to a feature of the present invention, organoids having a size of 50um to 200um can be formed in the first culturing step.
본 발명의 특징에 따르면, 제1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있다.According to features of the present invention, the first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days.
본 발명의 특징에 따르면, 제2 배양하는 단계는 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간동안 수행될 수 있다.According to features of the present invention, the second culturing step may be performed for at least one period of about 3 to 50 days.
본 발명의 특징에 따르면, 제2 배양하는 단계에서 약물을 처리하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.According to a feature of the present invention, treating the drug in the second culturing step; It may further include.
본 발명의 특징에 따르면, 약물을 처리하는 단계는 배양 7일 이내 처음 수행될 수 있다.According to the features of the present invention, the step of treating the drug can be performed for the first time within 7 days of culture.
본 발명자들은 상술한 인체 유래 3차원 세포배양용 ECM (hECM)을 포함하는 ORG 3D culture solution을 이용하여 누구나 손쉽게 배양할 수 있는 인간 갑상선암 세포주에 적용한 결과 갑상선 기능 관련 바이오마커를 발현하는 인간 갑상선암 오가노이드를 종래의 기술 대비 짧은 시간내에 제작하는데 성공하였다. 구체적으로 배양 3일 이내 오가노이드가 형성됨에 따라 배양 7일 이내 목적하는 약물에 노출시켜 오가노이드를 배양하는 것이 가능하였다. 이에 목적하는 약물의 효능 또는 독성 평가용 오가노이드를 제작하는 기간을 현저히 단축시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 종래 줄기세포 기반의 오가노이드 기술에서처럼 줄기세포의 변형이나 실험자의 숙련도에 따라 오가노이드의 퀄리티가 다르지 않고 균질한 오가노이드를 제작할 수 있다.The present inventors applied the
본 발명의 발명자들은 신약 개발 과정에서 암 특성의 모사도가 뛰어난 본 발명에 따른 인간 갑상선암 오가노이드를 이용하여 시험관내(in vitro)에서, 약물 평가 또는 화학물질의 암 증식 영향 평가가 가능함을 제시한다. 이에 임상시험에 적용하기 위한 약물의 선정 단계를 단축시키므로 신약 개발 기간을 단축시킬 수 있다.The inventors of the present invention suggest that in the process of developing a new drug, it is possible to evaluate drugs or evaluate the effect of chemical substances on cancer growth in vitro using human thyroid cancer organoids according to the present invention, which have excellent mimicry of cancer characteristics. As a result, the selection stage for drugs to be applied to clinical trials is shortened, thereby shortening the development period for new drugs.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 갑상선암 세포주, 인체 세포외기질(ECM) 및 암 활성제 함유 성장 배지를 포함하는, 암 미세환경 모사 갑상선암 오가노이드 배양용 조성물을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention provides a composition for culturing thyroid cancer organoids simulating a cancer microenvironment, comprising a thyroid cancer cell line, human extracellular matrix (ECM), and a growth medium containing a cancer activator.
본 발명의 특징에 따르면, 인체 세포외기질은 인체 유래 섬유아세포로부터 수득된 것 일 수 있다.According to the features of the present invention, the human extracellular matrix may be obtained from human-derived fibroblasts.
본 발명의 특징에 따르면, 인체 세포외기질 및 성장 배지의 부피비는 1 : 4 내지 1 : 6일 수 있다.According to the features of the present invention, the volume ratio of human extracellular matrix and growth medium may be 1:4 to 1:6.
본 발명의 특징에 따르면, 암 미세환경은 상피중간엽전이(EMT; epithelial to mesenchymal transition) 또는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality)이 증가된 것일 수 있다.According to the features of the present invention, the cancer microenvironment may have increased epithelial to mesenchymal transition (EMT) or F-actin abnormality.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 상술한 조성물로 제조된 암 미세환경 모사 갑상선암 오가노이드를 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention provides a thyroid cancer organoid simulating a cancer microenvironment prepared with the composition described above.
본 발명의 일 실시예에 따르면 암 활성제를 처리한 갑상선암 오가노이드는 상피중간엽전이(EMT)가 활성화되어 E-cadherin 등의 EMT 관련 단백질의 변화가 발생하고 F-액틴의 동적 재구성이 발현되는 등의 암 특성을 획득하였다. 이에 본 발명에 따르면 상피중간엽전이(EMT) 또는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality)이 증가된 암 미세환경을 모사하는 갑상선암 오가노이드를 제공함에 따라 약물 평가 및 화학물질의 암 증식 영향 평가의 도구로 활용할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, in thyroid cancer organoids treated with a cancer activator, epithelial-mesenchymal transition (EMT) is activated, changes in EMT-related proteins such as E-cadherin occur, and dynamic reorganization of F-actin is expressed. cancer characteristics were obtained. Accordingly, according to the present invention, by providing a thyroid cancer organoid that simulates a cancer microenvironment with increased epithelial-mesenchymal transition (EMT) or F-actin abnormality, it can be used for drug evaluation and evaluation of the cancer proliferation effect of chemicals. It can be used as a tool.
전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 암 미세환경 모사 갑상선암 오가노이드가 이종 이식된 동물 모델을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention provides an animal model in which thyroid cancer organoids simulating a cancer microenvironment are xenografted.
본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드는 동물모델에 이종 이식되어 이용될 수 있다. 상기 "동물 모델"은 질환 동물 모델을 의미한다. 구체적으로, 동물 모델은 인간의 질병과 유사한 상태의 질병에 걸리거나 선천적으로 그 질병에 걸리도록 만들어낸 동물 모델일 수 있다. 동물 모델로 이용될 수 있는 동물은 인간을 제외한 포유 동물로, 예를 들면, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.The thyroid cancer organoid according to the present invention can be used as a xenograft in an animal model. The “animal model” refers to a disease animal model. Specifically, the animal model may be an animal model created to suffer from a disease similar to a human disease or to be born with the disease. Animals that can be used as animal models are mammals other than humans, for example, selected from the group consisting of rats, mice, guinea pigs, hamsters, rabbits, monkeys, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep and goats. It can be at least one thing.
본 발명은 약물의 효능 또는 독성 평가용 인간 갑상선암 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다. The present invention provides a human thyroid cancer organoid for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, a method for producing the same, and a method for evaluating the efficacy or toxicity of the drug using the same, making it possible to verify the drug in the development of new drugs, that is, evaluate the effectiveness, side effects, and toxicity. There is an effect.
또한 약물의 독성 평가 시 수행되는 동물에서의 바이오마커 분석을 시험관내 환경에서 가능하기에, 추후 동물 실험 대체가 가능한 효과가 있다.In addition, since biomarker analysis in animals, which is performed when evaluating drug toxicity, is possible in an in vitro environment, it has the effect of being able to replace animal testing in the future.
또한 목적하는 오가노이드를 제작하는 비용 및 기간을 현저히 단축시킬 수 있는 효과가 있다. 이에 본 발명의 오가노이드는 신약 개발에 있어 약물 후보 물질 스크리닝에 활용되어 소요되는 비용 및 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 갑상선암 기능이상 관련 질환의 생리학적 연구 및 임상시험에 활용될 수 있다. In addition, it has the effect of significantly shortening the cost and period of producing the desired organoid. Accordingly, the organoid of the present invention can be used for screening drug candidates in the development of new drugs, dramatically reducing the cost and time required, and can be used for physiological research and clinical trials of diseases related to thyroid cancer dysfunction.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다. The effects according to the present invention are not limited to the contents exemplified above, and further various effects are included in the present specification.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 제조하기 위한 방법을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 갑상선암 오가노이드의 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 제조하기 위해 약물 처리를 더 포함하여 제조하는 방법을 예시적으로 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드의 H&E 염색 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드의 Hoechst33342 염색 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드에 대해 팔로이딘(phalloidin) 염색 프로토콜을 이용한 F-액틴 염색 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 발현 변화를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드의 티로글로불린(Tg) 발현 변화를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드의 티로페록시다제(TPO) 발현 변화를 도시한 것이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드의 E-cadherin 발현 변화를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 평가 방법에 대한 흐름도이다.Figure 1 exemplarily illustrates a method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows a microscopic image of a thyroid cancer organoid prepared by a manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 exemplarily illustrates a method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity according to an embodiment of the present invention, further including drug treatment.
Figure 4 shows H&E staining of thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention. It shows a microscope image.
Figure 5 shows a Hoechst33342 staining microscopic image of a thyroid cancer organoid according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 shows a microscopic image of F-actin staining using a phalloidin staining protocol for thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention.
Figures 7a and 7b show changes in thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) expression in thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug prepared by a manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows changes in thyroglobulin (Tg) expression in thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug prepared by the production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 9 shows changes in the expression of thyroperoxidase (TPO) in thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug prepared by the production method according to an embodiment of the present invention.
Figures 10a and 10b show changes in E-cadherin expression in thyroid cancer organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug prepared by a production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 11 is a flowchart of a drug evaluation method using thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity according to an embodiment of the present invention.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms. The present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and are within the scope of common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
본 문서에서, "가진다," "가질 수 있다," "포함한다," 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 기능, 동작, 또는 부품 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다.In this document, expressions such as “have,” “may have,” “includes,” or “may include” refer to the existence of the corresponding feature (e.g., a numerical value, function, operation, or component such as a part). , and does not rule out the existence of additional features.
본 문서에서, "또는"은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "A 또는 B," "A 또는/및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는/및 B 중 하나 또는 그 이상" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, "A 또는 B," "A 및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는 B 중 적어도 하나"는, (1) 적어도 하나의 A를 포함, (2) 적어도 하나의 B를 포함, 또는(3) 적어도 하나의 A 및 적어도 하나의 B 모두를 포함하는 경우를 모두 지칭할 수 있다.In this document, “or” means “and/or” unless otherwise stated. Expressions such as “A or B,” “at least one of A or/and B,” or “one or more of A or/and B” may include all possible combinations of the items listed together. For example, “A or B,” “at least one of A and B,” or “at least one of A or B” (1) includes at least one A, (2) includes at least one B, Or (3) it may refer to all cases including both at least one A and at least one B.
본 문서에서 사용된 표현 "~하도록 구성된(또는 설정된)(configured to)"은 상황에 따라, 예를 들면, "~에 적합한(suitable for)," "~하는 능력을 가지는(having the capacity to)," "~하도록 설계된(designed to)," "~하도록 변경된(adapted to)," "~하도록 만들어진(made to)," 또는 "~ 를 할 수 있는(capable of)"과 바꾸어 사용될 수 있다. As used in this document, the expression “configured to” depends on the situation, for example, “suitable for,” “having the capacity to.” ," can be used interchangeably with "designed to," "adapted to," "made to," or "capable of."
본 문서에서 사용된 용어들은 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 다른 실시예의 범위를 한정하려는 의도가 아닐 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 용어들은 본 문서에 기재된 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다. 본 문서에 사용된 용어들 중 일반적인 사전에 정의된 용어들은, 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 동일 또는 유사한 의미로 해석될 수 있으며, 본 문서에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 경우에 따라서, 본 문서에서 정의된 용어일지라도 본 문서의 실시예들을 배제하도록 해석될 수 없다.Terms used in this document are merely used to describe specific embodiments and may not be intended to limit the scope of other embodiments. Singular expressions may include plural expressions, unless the context clearly indicates otherwise. Terms used herein, including technical or scientific terms, may have the same meaning as generally understood by a person of ordinary skill in the technical field described in this document. Among the terms used in this document, terms defined in general dictionaries may be interpreted to have the same or similar meaning as the meaning they have in the context of related technology, and unless clearly defined in this document, have an ideal or excessively formal meaning. It is not interpreted as In some cases, even terms defined in this document cannot be interpreted to exclude embodiments of this document.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.Each of the features of the various embodiments of the present invention can be combined or combined with each other, partially or entirely, and as can be fully understood by those skilled in the art, various technical interconnections and operations are possible, and each embodiment may be implemented independently of each other. It may be possible to conduct them together due to a related relationship.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 이러한, 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다.As used herein, the term “organoid” refers to a small culture that recapitulates both the form and function of a tissue or organ. More specifically, organoids must contain one or more cell types among the various types of cells that make up an organ or tissue, must be able to reproduce the special functions of each organ, and must be able to reproduce the special functions of each organ, and the cells must cluster together to form an organ spatially. It should be organized in a similar form. Organoids differ from spheroids in that they form a system rather than a simple collection of cells, and can be used as a patient-specific model for new drug development, artificial organs, disease treatments, and disease treatment.
본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 다양한 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.The term "medium" used within this specification refers to the growth of various cells in vitro, containing essential elements for cell growth and proliferation, such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. and mixtures for propagation.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM) "은 세포의 증식, 분화 및 사멸 등의 여러가지 세포 대사경로에서 영향을 미치는 신호를 제공하는데 중요한 역할을 하는 3차원 구조의 조직의 발달에 지지체를 의미한다. 세포외 기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자(biochemical factors)들을 저장하고, 공급해줌과 동시에 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있다. 세포외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물로서, 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)과 같은 구조체 단백질(structural protein), GAG(glycosaminoglycan)과 같은 다당류, 세포의 부착을 돕는 부착 단백질(adhesive proteins) 및 성장인자들을 포함하고 있다. 이러한, 세포외 기질은 유래되는 조직 및 세포에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다. The term “extracellular matrix (ECM)” used herein refers to the development of three-dimensional tissue that plays an important role in providing signals that influence various cellular metabolic pathways such as cell proliferation, differentiation, and death. means support. The extracellular matrix stores and supplies the biochemical factors necessary for cell growth and differentiation, while also providing a physical environment that cells can recognize. The extracellular matrix is a product produced by the cells that make up each tissue as needed, including structural proteins such as collagen and elastin, polysaccharides such as GAG (glycosaminoglycan), and other substances that help cells adhere. Contains adhesive proteins and growth factors. This extracellular matrix is composed of different components depending on the tissue and cells from which it is derived, and has special physical properties.
오가노이드 배양에 대표적으로 이용되는 세포외기질은 마트리겔(Matrigel), 하이드로겔(Hidrogel) 등이 있으나 다른 성장인자의 첨가가 필요하고 시간이 많이 소요되는 문제점이 있다. 본 발명의 발명자들은 이를 극복한 오가노이드 배양용 세포외기질을 개발하였으며 KR10-2021-0145017, KR10-2022-0152904의 특허출원을 참고하여 이해될 수 있다.Extracellular matrices typically used for organoid culture include Matrigel and Hydrogel, but they have the problem of requiring the addition of other growth factors and taking a lot of time. The inventors of the present invention have developed an extracellular matrix for organoid culture that overcomes this, and can be understood by referring to the patent applications of KR10-2021-0145017 and KR10-2022-0152904.
본 발명의 일 실시예에 따른 '인체 세포외기질'은 본 발명의 발명자들이 개발한 오가노이드 배양용 세포외기질(ECM)로서 3차원 세포배양용 ECM일 수 있다. 3차원 세포배양용 ECM에 관한 설명은 상술한 특허출원에 기재된 모든 내용을 공유할 수 있다. The 'human extracellular matrix' according to an embodiment of the present invention is an extracellular matrix (ECM) for organoid culture developed by the inventors of the present invention, and may be an ECM for three-dimensional cell culture. The description of the ECM for 3D cell culture can be shared with all the contents described in the above-mentioned patent application.
구체적으로 3차원 세포배양용 ECM은 인체 피부 진피의 섬유아세포를 배양하여 패치를 획득하고, 획득된 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리한 다음 탈세포화한 후 수득된 세포외기질(ECM)일 수 있다. 수득된 세포외기질은 콜라겐(collagne), 액티닌(actinin) 및 액틴-결합 유사 단백질(filamin-C)을 포함하고, 나노 섬유(nano fiber)가 뒤엉킨 형태일 수 있다. 즉, 종래의 파우더 형태의 세포외기질이 배양 플레이트 표면에 코팅된 상태에서 세포를 배양하는 방식에서 나아가, 본 발명에 따른 섬유 형태의 세포외기질은 세포의 응집(aggregation)을 촉진하고, 플레이트에 세포가 부착되는 것을 막아주는 기능을 포함하고 있다. 따라서 부유성을 갖는 세포의 모든 표면적을 감싸 배양됨에 따라 안정적으로 생체 내 환경을 가장 유사하게 모사하는 오가노이드를 형성하고, 단시간 내에 충분한 양으로 획득될 수 있다. Specifically, ECM for 3D cell culture is an extracellular matrix (ECM) obtained by culturing fibroblasts from the dermis of human skin to obtain a patch, treating the obtained human-derived fibroblast patch with proteolytic enzymes, and then decellularizing it. It can be. The obtained extracellular matrix contains collagen, actinin, and actin-binding-like protein (filamin-C), and may be in the form of tangled nanofibers. In other words, going beyond the conventional method of culturing cells with a powder-type extracellular matrix coated on the surface of a culture plate, the fiber-type extracellular matrix according to the present invention promotes aggregation of cells and promotes cell aggregation on the plate. It contains a function that prevents cells from adhering. Therefore, by covering the entire surface area of floating cells and culturing them, organoids that most closely mimic the in vivo environment are stably formed and can be obtained in sufficient quantity within a short period of time.
더욱 구체적으로, 본원발명의 3차원 세포배양용 ECM은 섬유아세포(fibroblast) 및 세포외기질을 포함하는 섬유아세포 패치(patch)가 형성되도록, 섬유아세포를 자극 배지(stimulation medium)에서 배양하는 단계, 형성된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계, 단백질 분해효소가 처리된 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계, 섬유아세포 패치에서 섬유아세포가 탈세포화(decellularization)되도록, 냉동된 섬유아세포 패치를 해동하는 단계 및 탈세포화된 섬유아세포 패치로부터 세포외 기질을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, 자극 배지에서 배양하는 단계에서, 자극 배지는 0.01 내지 2 mM의 아스코르빅 산(ascorvic acid)을 포함하고 있을 수 있다.More specifically, the ECM for 3D cell culture of the present invention includes the steps of culturing fibroblasts in a stimulation medium so that a fibroblast patch containing fibroblasts and extracellular matrix is formed; Processing the formed fibroblast patch with a proteolytic enzyme, freezing the protease-treated fibroblast patch, and thawing the frozen fibroblast patch so that the fibroblasts in the fibroblast patch are decellularized. and obtaining extracellular matrix from the decellularized fibroblast patch. At this time, in the step of culturing in the stimulation medium, the stimulation medium may contain 0.01 to 2 mM ascorbic acid.
보다 구체적으로, 아스코르빅산(Ascorbic acid)은 산화방지제로 procollagen 합성에 관여하며, type 1 콜라겐생산의 증가와 관련된 보조인자(Cofactor)이다. 아스코르빅산은 in vitro에서 지방세포, 조골세포, 연골세포와 같은 다양한 세포 증식을 자극 및 조절할 수 있다. 나아가, 특정 농도의 아스코르빅산을 첨가할 경우, 세포 성장 촉진제로 작용하여 세포의 증식력이 증가되고, DNA의 합성까지 촉진시킬 수 있다. 그러나, 아스코르빅산의 농도가 적절하지 못할 경우, 오히려 세포의 증식력을 억제시키고, 세포 독성(Cytotoxic)을 가짐으로 세포 자살(Apoptosis)를 일으킬 수 있다. 이에, 세포의 증식력 즉, 세포외 기질의 합성 및 배출을 향상시킬 수 있는 적정 아스코르빅산의 농도는 0.01 내지 1 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 보다 바람직한 아스코르빅산의 농도는 0.1 내지 1 mM일 수 있다.More specifically, ascorbic acid is an antioxidant that is involved in procollagen synthesis and is a cofactor associated with increased type 1 collagen production. Ascorbic acid can stimulate and regulate the proliferation of various cells such as adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes in vitro. Furthermore, when ascorbic acid is added at a certain concentration, it acts as a cell growth promoter, increases cell proliferation, and even promotes DNA synthesis. However, if the concentration of ascorbic acid is not appropriate, it may inhibit the proliferation of cells and be cytotoxic, causing apoptosis. Accordingly, the appropriate concentration of ascorbic acid that can improve the proliferation of cells, that is, the synthesis and excretion of extracellular matrix, may be 0.01 to 1 mM, but is not limited thereto, and a more preferable concentration of ascorbic acid is 0.1 to 1 mM. It may be 1mM.
나아가, 자극 배지는 아스코르빅산을 포함하는 배지임에 따라, 기초가 되는 기본 배지를 포함하고 있다. 예를들어, 기본 배지는 세포가 살아가기 위해 필요한, 당, 아미노산 및 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 제조된 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 및 FBS (Fetal bovine serum) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 DMEM/F-12일 수 있다.Furthermore, since the stimulation medium is a medium containing ascorbic acid, it contains the basic medium as a basis. For example, basic medium is a mixture containing sugars, amino acids, and water necessary for cells to live, excluding serum, nutrients, and various growth factors. The basic medium of the present invention can be artificially synthesized and used, or a commercially produced medium can be used. For example, commercially prepared media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), DMEM/F-12, Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α -May include, but are not limited to, MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, and FBS (Fetal bovine serum), and are preferably DMEM/F. It could be -12.
나아가, 자극 배지는, 0.0001 내지 0.001 %의 아세틱산(acetic acid)을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Furthermore, the stimulation medium may further include 0.0001 to 0.001% of acetic acid, but is not limited thereto.
또한, 자극 배지에서 배양하는 단계에서, 배양 기간은 3 내지 20주(weeks) 중 적어도 하나의 기간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 6 내지 12주 중 적어도 하나의 기간일 수 있다.Additionally, in the step of culturing in a stimulation medium, the culture period may be at least one period of 3 to 20 weeks, but is not limited thereto, and preferably may be at least one period of 6 to 12 weeks. .
이에, 전술한 배양하는 단계를 통하여, 섬유아세포는 아스코르빅산에 의하여 자극(stimulation)되어 세포외 기질을 생산 및 방출할 수 있으며, 섬유아세포 및 세포외 기질을 포함하는 섬유아세포 패치가 형성될 수 있다.Accordingly, through the above-described culturing step, fibroblasts can be stimulated by ascorbic acid to produce and release extracellular matrix, and a fibroblast patch containing fibroblasts and extracellular matrix can be formed. there is.
이때, 세포외 기질을 생산 및 방출하는 섬유아세포는 세포외 기질과 콜라겐을 합성하는 생물학적 세포의 한 종류로서, 동물조직에서 구조적 틀을 만드는 가장 흔합 결합조직이며, 심장 조직과 같은 다양한 조직으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 섬유아세포는 힘줄(tendon), 인대(ligament), 근육, 피부, 치주, 각막, 연골(cartilage), 뼈, 간, 혈관, 심장, 소장, 대장 및 추간판(intervertebral disc) 중 적어도 하나로부터 유래될수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, fibroblasts, which produce and release extracellular matrix, are a type of biological cell that synthesizes extracellular matrix and collagen, and are the most common connective tissue that creates the structural framework in animal tissue, and can be obtained from various tissues such as heart tissue. You can. For example, fibroblasts can be found in at least one of tendon, ligament, muscle, skin, periodontium, cornea, cartilage, bone, liver, blood vessel, heart, small intestine, large intestine, and intervertebral disc. It may be derived from, but is not limited to.
다시, 배양하는 단계 이후, 섬유아세포 패치로부터 세포외 기질만을 추출하기 위한, 탈세포화(decellularization) 과정이 수행될 수 있으며, 탈세포화를 위한 과정으론 단백질 분해효소를 처리하는 단계, 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계 및 섬유아세포 패치를 해동하는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 세포 배양 즉 생체소재로 사용될 세포외 기질은 특정 세포가 생리학적 특성을 유지하기 위하여, 세포외 기질의 3차원적 구조와 생리활성 물질들을 최대한 많이 보유하여야 한다. 이에, 면역 거부반응을 일으킬 수 있는 항원성이 제거되어야 함에 따라, 구조체 역할을 세포를 제외한 나머지는 모두 제거하는 탈세포화 과정이 필수적일 수 있다.Again, after the culturing step, a decellularization process may be performed to extract only the extracellular matrix from the fibroblast patch, and the decellularization process includes treatment with proteolytic enzymes and freezing the fibroblast patch. It may include the step of thawing the fibroblast patch and the step of thawing the fibroblast patch. Furthermore, the extracellular matrix to be used for cell culture, that is, as a biomaterial, must have as many three-dimensional structures and bioactive substances as possible in order for specific cells to maintain their physiological characteristics. Accordingly, as antigens that can cause immune rejection must be removed, a decellularization process that removes everything except cells that serve as structures may be essential.
이에, 형성된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 단백질 분해효소는 0.01 내지 1 %의 트립신(trypsin)일 수 있으나, 바람직하게는, 0.25 %의 트립신일 수 있다. 그러나, 단백질 분해효소는 이에 제한되는 것은 아니며, 섬유아세포 및 세포외 기질간의 결합 단백질을 분해할 수 있는 단백질 분해효소를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해효소는 콜라제네이즈(Collagenase), 엘라스테이즈(Elastase), 디스페이즈(Dispase), 프로테아제(Protease), 펩신(Pepsin), 레닌(Rennin), 키모트립신(Chymotrypsin), 에렙신(Erepsin), 엔테로키네이즈(Enterokinase), 펩티데이스(Peptidase) 및 프로티네이즈(Proteinase) 등을 포함할 수 있다.Accordingly, a step of treating the formed fibroblast patch with a proteolytic enzyme may be performed. At this time, the proteolytic enzyme may be 0.01 to 1% trypsin, but is preferably 0.25% trypsin. However, proteolytic enzymes are not limited to this and may include all proteolytic enzymes capable of decomposing binding proteins between fibroblasts and extracellular matrix. For example, proteolytic enzymes include Collagenase, Elastase, Dispase, Protease, Pepsin, Rennin, Chymotrypsin, and Erepsin. (Erepsin), Enterokinase, Peptidase, Proteinase, etc.
그 다음, 단백질 분해효소가 처리된 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 냉동시키는 단계는 -10 ℃이하의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Next, a step of freezing the proteolytic enzyme-treated fibroblast patch may be performed. At this time, the freezing step may be performed at a temperature of -10°C or lower, but is not limited thereto.
그 다음, 섬유아세포 패치에서 섬유아세포가 탈세포화되도록, 냉동된 섬유아세포 패치를 해동하는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 해동하는 단계는, 2시간 이상 동안 실온(room temperature)에서 수행될 수 있다.A step may then be performed to thaw the frozen fibroblast patch, such that the fibroblasts in the fibroblast patch are decellularized. At this time, the thawing step may be performed at room temperature for 2 hours or more.
이에, 전술한 탈세포화(decellularization) 과정을 통하여, 섬유아세포 패치로부터 섬유아세포가 유출되어, 섬유아세포 및 기타 세포들을 포함하지 않는 세포외 기질만이 수득할 수 있다.Accordingly, through the above-described decellularization process, fibroblasts are exuded from the fibroblast patch, and only extracellular matrix that does not contain fibroblasts and other cells can be obtained.
한편, 탈세포화(decellularization) 과정은 전술한 냉동 및 해동을 포함하지 않더라도, 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은 탈세포화를 위한 과정으로 단백질 분해효소를 처리하는 단계 이후, 탈세포화 버퍼(decellularization buffer)를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이때, 탈세포화 버퍼는 Triton-X 또는 EDTA를 포함할 수 있다. 그러나, 탈세포화 버퍼의 구성은 전술한 Triton-X 또는 EDTA에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 분야에서 상업적으로 이용되는 비이온성 계면 활성 성분이 모두 포함될 수 있다.Meanwhile, the decellularization process can be performed even if it does not include the above-described freezing and thawing. More specifically, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include the step of treating a decellularization buffer after treating a proteolytic enzyme as a decellularization process. In this case, the decellularization buffer may include Triton-X or EDTA. However, the composition of the decellularization buffer is not limited to the above-described Triton-X or EDTA, and may include all nonionic surfactant ingredients commercially used in the field of the present invention.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 해동하는 단계 이후, 탈세포화가 완전히 이루어지지 않을 경우, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.Furthermore, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include the step of treating the thawed fibroblast patch with a protease if decellularization is not completely achieved after the thawing step. there is.
이때, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계에서 단백질 분해효소는 전술한 단백질 분해효소와 동일한 조건일 수 있으며, 이후 전술한 과정과 동일한 과정을 통하여 탈세포화가 이루어질 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계는 냉동 및 해동하는 단계가 수행되지 않고, 37 ℃의 항온수조에서 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소 및 PBS를 첨가하여 교반과 함께 수행될 수 있다. 나아가, 이때, PBS에는 3 %의 triton-X 및 0.05 %의 EDTA가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, in the step of treating the thawed fibroblast patch with a proteolytic enzyme, the proteolytic enzyme may be under the same conditions as the proteolytic enzyme described above, and then decellularization may be achieved through the same process as the above-mentioned process. However, it is not limited to this, and for example, the step of treating the thawed fibroblast patch with a proteolytic enzyme does not involve freezing and thawing, but rather involves treating the fibroblast patch with a proteolytic enzyme and a protease in a constant temperature water bath at 37°C. This can be done with agitation by adding PBS. Furthermore, at this time, the PBS may contain 3% triton-X and 0.05% EDTA, but is not limited thereto.
더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 수득하는 단계 이후, 수득된 세포외기질을 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 동결건조하는 단계를 통하여, 수득된 세포외 기질의 유통 및 공급이 용이할 수 있다.Furthermore, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include, but is not limited to, the step of freeze-drying the obtained extracellular matrix after the obtaining step. Through these steps, distribution and supply of the obtained extracellular matrix can be facilitated.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 아스코르빅산 단 한종류의 화학 물질 첨가와 냉동 및 해동이라는 간단한 과정만으로 세포외 기질을 생산할 수 있음에 따라, 종래의 세포외 기질의 생산 방법보다 경제적일 수 있다.Accordingly, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention can produce an extracellular matrix with only a simple process of adding ascorbic acid and freezing and thawing, compared to the conventional extracellular matrix. It can be more economical than the substrate production method.
본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드 제조방법은 전술한 인체 세포외기질 및 손쉽게 구할 수 있는 갑상선암 세포주를 기반으로 세포주 유래 갑상선암 오가노이드의 생산을 저비용 및 고효율로 달성시킬 수 있다. The method for producing thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention can achieve the production of cell line-derived thyroid cancer organoids at low cost and high efficiency based on the above-described human extracellular matrix and easily available thyroid cancer cell lines.
본 명세서에서 사용되는 용어 “약물”은 생물의 이익을 위해 생리적 시스템 또는 질병 상태를 변화시키거나 검토하기 위해서 사용되는 모든 물질을 포함할 수 있다. 또한 신체 구조 또는 기능에 영향을 미치기 위해 사용하는 모든 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민제, 호르몬제, 금속염류, 백신, 항혈청제, 항생제, 항암제, 화학요법제제, 강심제, 혈압조절제, 항히스타민제, 스테로이드제, 해독제 및 조영제로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term “drug” may include any substance used to change or modify a physiological system or disease state for the benefit of an organism. It can also include any substance used to affect body structure or function. For example, it may include at least one of the group consisting of vitamins, hormones, metal salts, vaccines, antiserum agents, antibiotics, anticancer agents, chemotherapy agents, cardiotonic agents, blood pressure regulators, antihistamines, steroids, antidotes, and contrast agents. , but is not limited to this.
본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드는 암 미세환경을 모사하는 특성을 나타낼 수 있다. 구체적으로 상피중간엽전이(EMT; epithelial to mesenchymal transition) 또는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality)이 증가한 암 특성을 모사할 수 있다.Thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention may exhibit characteristics that mimic the cancer microenvironment. Specifically, it can simulate cancer characteristics with increased epithelial to mesenchymal transition (EMT) or F-actin abnormality.
본 명세서에서 사용되는 용어 “상피중간엽전이(EMT; epithelial- mesenchymal transition)”은 상피세포가 전이능력과 침윤능력을 가지는 세포로 변환하는 과정으로 암의 진행, 전이, 항암치료에 대한 내성 및 암줄기세포 특성을 획득하는 과정에서 중요한 역할을 한다. 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드는 상피중간엽전이(EMT) 증가에 따른 갑상선 상피세포의 병리적 특성 변화에 의한 현상이 발생된 것으로 확인되어 암 미세환경 특성을 모사하고 있음을 확인하였다.The term “epithelial-mesenchymal transition (EMT)” used in this specification is a process in which epithelial cells are transformed into cells with metastatic and invasive abilities, which can affect cancer progression, metastasis, resistance to anti-cancer treatment, and cancerous lines. It plays an important role in the process of acquiring air cell characteristics. It was confirmed that the thyroid cancer organoid according to the present invention mimics the characteristics of the cancer microenvironment as it was confirmed that the phenomenon was caused by a change in the pathological characteristics of thyroid epithelial cells due to an increase in epithelial-mesenchymal transition (EMT).
본 명세서에서 사용되는 용어 “F-actin 비정상(F-actin abnormality)”은 많은 암에서 비정상적인 액틴 이소형 발현이 보고되는 것에 기초한 암의 초기 바이오마커이다. F-actin은 세포골격에서 미세 필라멘트를 형성하고 근육 원섬유에서 얇은 필라멘트를 형성하는 구형 다기능 단백질 계열로서 모든 진핵세포에 존재한다. 세포골격은 세포질 내 소기관이며 유동적인 구조로 이루어져 있어 세포 형태를 유지하는 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 세포이동을 가능하게 하는데 이러한 세포골격은 정상세포보다 암세포에서 더 역동적으로 변화하는 것으로 알려져 있다. 암세포에서 F-actin의 역동적인 변화는 암세포의 분열과 성장, 이동 능력에 주요 역할을 하므로 암의 발전과 진행, 전이 등에 기여하게 된다. 이와 같이 세포에 존재하는 F-actin이 암조직에 미치는 다양한 영향을 기반으로 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드에서 F-actin 비정상(F-actin abnormality)에 따른 형태 변화를 분석함으로써 약물의 효능 및 독성 평가에 이용할 수 있다.As used herein, the term “F-actin abnormality” is an early biomarker of cancer based on reports of abnormal actin isoform expression in many cancers. F-actin is a family of globular multifunctional proteins that form fine filaments in the cytoskeleton and thin filaments in muscle fibrils and are present in all eukaryotic cells. The cytoskeleton is an organelle within the cytoplasm and is composed of a fluid structure, which not only plays an important role in maintaining cell shape but also enables cell movement. This cytoskeleton is known to change more dynamically in cancer cells than in normal cells. Dynamic changes in F-actin in cancer cells play a major role in the division, growth, and migration ability of cancer cells, contributing to the development, progression, and metastasis of cancer. Based on the various effects of F-actin present in cells on cancer tissue, the efficacy and toxicity of the drug are evaluated by analyzing morphological changes due to F-actin abnormality in the thyroid cancer organoid according to the present invention. It is available for use.
본 명세서에서 사용되는 용어 “갑상선암 자극 호르몬 수용체(THSR)”는 갑상선암 세포의 세포막 표면에 위치한 G 단백질 결합 수용체로서, 이는 뇌하수체(pituitary)에서 분비하는 갑상선암 자극 호르몬의 수용체이다. 갑상선암 자극 호르몬이 갑상선암 자극 호르몬 수용체와 결합이 되면 갑상선암 성장, 갑상선암 세포의 분화, 갑상선암 호르몬의 합성 등이 일어난다. 약물에 포함되는 화학물질 또는 환경에서 노출되는 화학물질 등의 다양한 화학물질에 생체가 노출되었을 때 뇌하수체가 자극되어 갑상선암 자극 호르몬이 증가 또는 감소하고, 이는 갑상선암 자극 호르몬의 수용체에 영향을 주게 된다. 따라서 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드를 활용한 약물의 효능 또는 독성 평가에서 중요한 바이오마커가 될 수 있다.The term “thyroid cancer-stimulating hormone receptor (THSR)” used herein is a G protein-coupled receptor located on the cell membrane surface of thyroid cancer cells, which is a receptor for thyroid cancer-stimulating hormone secreted by the pituitary. When thyroid cancer-stimulating hormone combines with the thyroid cancer-stimulating hormone receptor, thyroid cancer growth, differentiation of thyroid cancer cells, and synthesis of thyroid cancer hormones occur. When the body is exposed to various chemicals, such as chemicals contained in drugs or chemicals exposed in the environment, the pituitary gland is stimulated and thyroid cancer-stimulating hormone increases or decreases, which affects the receptor for thyroid cancer-stimulating hormone. Therefore, it can be an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of drugs using the thyroid cancer organoid according to the present invention.
본 명세서에서 사용되는 용어 “티로글로불린(Thyroglobulin; Tg)”은 갑상선암 호르몬 합성에 관여하는 주요 단백질이다. 티로글로불린은 정상 갑상선암 조직 및 갑상선암 조직에서만 분비되므로 갑상선암 특이 바이오마커로서 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드의 생체 유사도를 평가하는 지표가 될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드를 활용한 약물의 효능 또는 독성 평가에서 중요한 바이오마커로 이용될 수 있다.The term “Thyroglobulin (Tg)” used herein is a major protein involved in thyroid cancer hormone synthesis. Since thyroglobulin is secreted only in normal thyroid cancer tissue and thyroid cancer tissue, it can be a thyroid cancer-specific biomarker and an indicator for evaluating the biosimilarity of the thyroid cancer organoid according to the present invention. Additionally, the thyroid cancer organoid according to the present invention can be used as an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of a drug.
본 명세서에서 사용되는 용어 “티로페록시다제(Thyroperoxidase; TPO)”는 갑상선암 호르몬 합성에 관여하는 효소로 티로글로불린의 티로신 잔기에서 요오드화물(iodide)의 산화를 촉매하여 T3(Triiodothyronine)와 T4(Tetraiodothyronine; Thyroxine)을 합성에 필요한 단계를 촉진하는 역할을 한다. 갑상선암에서 TPO의 발현 증가는 갑상선암에 이상이 생겼음을 간접적으로 예측하는 지표임이 알려져 있다. 따라서 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드를 활용한 약물의 효능 또는 독성 평가에서 중요한 바이오마커로 이용될 수 있다.The term “thyroperoxidase (TPO)” used herein is an enzyme involved in thyroid cancer hormone synthesis that catalyzes the oxidation of iodide from the tyrosine residue of thyroglobulin to produce T3 (Triiodothyronine) and T4 (Tetraiodothyronine). It plays a role in promoting the steps necessary for synthesizing Thyroxine. It is known that increased expression of TPO in thyroid cancer is an indicator that indirectly predicts abnormalities in thyroid cancer. Therefore, it can be used as an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of drugs using the thyroid cancer organoid according to the present invention.
본 명세서에서 사용되는 용어 “E-cadherin”은 세포 간의 접착을 유지하는 cadherin 계열의 분자로 대부분의 상피세포에서 발현이 되며 상피세포간 연결을 안정적으로 유지시키는 중요한 단백질이다. 특히, 갑상선암 여포에서 발현되며, 갑상선암의 세포 접착(adhesion) 및 갑상선암 조직 구조(tissue structure)에 중요한 역할을 하는, 정상 갑상선암 조직에서 견고히 발현되는 단백질 중 하나이다. 갑상선암 상피세포의 특성이 변하게 되면 상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)가 활성화되어 병리적 현상이 관찰된다. 따라서 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드를 활용한 약물의 효능 또는 독성 평가에서 E-cadherin 발현 변화는 중요한 바이오마커로 이용될 수 있다.The term “E-cadherin” used herein is a cadherin-family molecule that maintains adhesion between cells. It is expressed in most epithelial cells and is an important protein that stably maintains connections between epithelial cells. In particular, it is expressed in thyroid cancer follicles and is one of the proteins that is robustly expressed in normal thyroid cancer tissue, playing an important role in thyroid cancer cell adhesion and thyroid cancer tissue structure. When the characteristics of thyroid cancer epithelial cells change, epithelial-mesenchymal transition (EMT) is activated and pathological phenomena are observed. Therefore, changes in E-cadherin expression can be used as an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of drugs using thyroid cancer organoids according to the present invention.
본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드를 활용하면 상술한 바이오마커를 지표로 목적하는 약물의 효능 및 독성을 예측할 수 있다. Thyroid organoid according to an embodiment of the present invention consists of F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. Expression of at least one biomarker selected from the group was confirmed. Therefore, by using the thyroid cancer organoid according to an embodiment of the present invention, the efficacy and toxicity of the target drug can be predicted using the above-described biomarker as an indicator.
따라서 본 발명은 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드에 약물 또는 항암 후보물질을 처리하는 단계; 상기 약물 또는 항암 후보물질이 처리된 오가노이드에 대해 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 평가 방법 또는 항암제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.Therefore, the present invention includes the steps of treating a drug or anticancer candidate material to a thyroid cancer organoid for evaluating drug efficacy or toxicity; For organoids treated with the above drugs or anticancer candidates, F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin were detected. A drug evaluation method or an anticancer drug screening method using thyroid cancer organoids can be provided, including the step of measuring the level of at least one biomarker selected from the group consisting of.
본 발명의 특징에 따르면, 상술한 방법은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 또는 E-cadherin 발현 위치를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.According to a feature of the present invention, the above-described method may further include the step of confirming the expression location of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) or E-cadherin.
구체적으로, 약물 또는 항암 후보물질이 처리된 오가노이드에 대해 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 및 티로페록시다제(TPO)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 수준이 감소하거나 티로글로불린(Tg) 또는 E-cadherin의 수준이 증가한 경우 약물이 효능을 보이거나 항암 활성을 보이는 것으로 판단할 수 있다. 상술한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 수준은 세포내소포(intracellular vesicle)에서 감소 또는 E-cadherin의 수준은 세포막(membrane)에서 증가한 것을 의미할 수 있다.Specifically, organoids treated with drugs or anticancer candidates were compared to the drug-untreated group or the positive control group to determine F-actin abnormality, thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), and thyroperoxidase (TPO). ) If the level of at least one selected from the group consisting of is decreased or the level of thyroglobulin (Tg) or E-cadherin is increased, the drug may be judged to be effective or show anticancer activity. The above-mentioned thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) level may mean a decrease in intracellular vesicles or an increase in the level of E-cadherin in the cell membrane.
구체적으로, 약물 또는 항암 후보물질이 처리된 오가노이드에 대해 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 및 티로페록시다제(TPO)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 수준이 증가하거나 티로글로불린(Tg) 또는 E-cadherin의 수준이 감소한 경우 약물이 독성을 보이거나 항암 활성이 없는 것으로 판단할 수 있다. 상술한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 수준은 세포내소포(intracellular vesicle)에서 증가 또는 E-cadherin의 수준은 세포막(membrane)에서 감소한 것을 의미할 수 있다.Specifically, organoids treated with drugs or anticancer candidates were compared to the drug-untreated group or the positive control group to determine F-actin abnormality, thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), and thyroperoxidase (TPO). If the level of at least one selected from the group consisting of ) increases or the level of thyroglobulin (Tg) or E-cadherin decreases, the drug may be judged to be toxic or have no anticancer activity. The above-mentioned thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) level may mean an increase in intracellular vesicles or a decrease in the level of E-cadherin in the cell membrane.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since these examples are only for illustrative purposes of the present invention, the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.
실시예 1. 갑상선암 세포주 기반 인간 갑상선암 오가노이드 제조Example 1. Preparation of human thyroid cancer organoids based on thyroid cancer cell lines
이하에서는 도 1 내지 도 3을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드 제조방법 및 이에 따른 갑상선암 오가노이드를 구체적으로 설명한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 1 to 3, a method for manufacturing thyroid cancer organoids and the resulting thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention will be described in detail.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법을 예시적으로 도시한 것이다.Figure 1 exemplarily illustrates a method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity according to an embodiment of the present invention.
도 1을 참조하면, 제조방법은 오가노이드를 형성하도록 갑상선암 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및 상기 오가노이드 및 성장 배지를 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함할 수 있다. Referring to Figure 1, the manufacturing method includes first culturing a mixture of a medium containing a thyroid cancer cell line and human extracellular matrix (ECM) to form an organoid; and a second culture step of mixing the organoids and growth medium; may include.
다양한 실시예에서, 갑상선암 세포주 및 인체 세포외기질은 1:1 비율로 포함될 수 있다. 바람직하게는 인체 세포외기질을 포함하는 배지 1mL 기준으로 갑상선암 세포주는 1~5 x 105 내지 1~5 x 107 세포수로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In various embodiments, thyroid cancer cell lines and human extracellular matrix may be included in a 1:1 ratio. Preferably, based on 1 mL of medium containing human extracellular matrix, the thyroid cancer cell line may be included in the number of 1 to 5 x 10 5 to 1 to 5 x 10 7 cells, but is not limited thereto.
다양한 실시예에서, 갑상선암 세포주는 환자 유래 갑상선암 조직 또는 종양으로부터 분리하여 직접 수득하거나 상업용 암세포주를 구입하는 등의 경로에 있어 제한이 없다. 갑상선암 세포주는 예를 들어 TBP-3868, T238, WRO, FTC133, BCPAP, TPC1, K1, 8505C, HTH7, C643, SW1736, MDA-T41 또는 SNU-790 세포주일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 당해 기술분야에서 사용되는 갑상선암 세포주라면 모두 이용될 수 있다.In various embodiments, there are no restrictions on the route, such as obtaining the thyroid cancer cell line directly by separating it from a patient-derived thyroid cancer tissue or tumor or purchasing a commercial cancer cell line. The thyroid cancer cell line may be, for example, but is not limited to TBP-3868, T238, WRO, FTC133, BCPAP, TPC1, K1, 8505C, HTH7, C643, SW1736, MDA-T41 or SNU-790 cell lines. Any thyroid cancer cell line used in the art can be used.
제 1배양하는 단계는 구체적으로 도 2를 참조하면, 갑상선암 세포주와 인체 세포외기질을 포함하는 배지를 혼합하여 배양될 수 있다.Referring specifically to FIG. 2, the first culturing step may be performed by mixing a medium containing a thyroid cancer cell line and a human extracellular matrix.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1 배양하는 단계는 1mL의 인체 세포외기질을 포함하는 배지와 갑상선암 세포 SNU-790을 1 x 106 세포수로 혼합하여 10% FBS-RPMI에 세포들이 분포할 수 있도록 섞어준 후 플레이트에 시딩한다. 본 발명에 따른 인체 세포외기질의 특성에 따라 부유하는 세포들과 서로 융합되어 밀착 연접 및 자가 조직화가 일어나면서 배양 3일 이내 오가노이드가 형성된다. 암 오가노이드가 100 um로 균질해지는 시기까지(약 7일) 신선한 배지로 3일에 한번씩 교체해준다. According to one embodiment of the present invention, the first culturing step is to mix medium containing 1 mL of human extracellular matrix and thyroid cancer cells SNU-790 at a cell count of 1 x 10 6 and distribute the cells in 10% FBS-RPMI. After mixing it well, seed it on the plate. According to the characteristics of the human extracellular matrix according to the present invention, it fuses with floating cells, tight junctions and self-organization occur, and organoids are formed within 3 days of culture. Replace the medium with fresh medium once every 3 days until the cancer organoids become homogeneous at 100 um (about 7 days).
다양한 실시예에서, 제1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 종래의 오가노이드 형성은 수주 이상의 기간이 소요되었다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드 제조 방법은 3일 이내의 단 시간 내에 갑상선암 오가노이드의 형성을 제공한다. In various embodiments, the first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days, but is not limited thereto. In this regard, conventional organoid formation takes several weeks or more. However, the method for producing thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention provides the formation of thyroid cancer organoids within a short time of less than 3 days.
한편, 제 1 배양하는 단계에 의하여 형성된 오가노이드들은 50 - 200 μm 크기를 가질 수 있으며 각각의 크기 및 성숙도가 상이할 수 있음에 따라, 실험 또는 임상적인 약물(화합물) 평가에 있어, 오가노이드의 반응을 현미경으로 관찰하기에 충분하도록 균질한 크기 및 갑상선암의 특성을 발현하는 오가노이드 성장을 위하여 50일내의 기간동안 배지를 3일에 한번 교체하며 제2 배양할 수 있다. On the other hand, the organoids formed by the first culturing step may have a size of 50 - 200 μm and each size and maturity may be different, so in experimental or clinical drug (compound) evaluation, the organoids In order to grow organoids with a uniform size sufficient to observe the reaction under a microscope and expressing the characteristics of thyroid cancer, a second culture can be performed by replacing the medium once every 3 days for a period of 50 days.
제2 배양하는 단계는 구체적으로 도 3을 참고하면, 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 제1 배양하는 단계 및 제2 배양하는 단계는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.Referring specifically to FIG. 3, the second culturing step may be performed for at least one period of about 3 to 50 days, but is not limited thereto. The first culturing step and the second culturing step may be performed sequentially or simultaneously.
다양한 실시예에서, 제1 배양하는 단계 또는 제2 배양하는 단계에서 사용되는 배양 배지는 성장 배지일 수 있다. 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 인슐린을 포함하지 않는, 이글 기본 배지(Basal medium Eagle's, BME), 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), DMEM/F12, HAM'S F-10, HAM'S F-12, MEDIUM 199 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. In various embodiments, the culture medium used in the first or second culturing step may be a growth medium. It can be artificially synthesized and used, or a commercially prepared medium can be used. For example, basal medium Eagle's (BME), Minimal essential medium (MEM), Eagle's MEM, Dulbecco's modified Eagle's medium, without insulin. medium, DMEM), DMEM/F12, HAM'S F-10, HAM'S F-12, MEDIUM 199, and RPMI 1640, and may include at least one of various serum-free media and variants thereof.
다양한 실시예에서, 성장 배지는 추가적으로 아미노산, 아스코르빅산, 아세트산, FBS, B27 및 IWR-1 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 세포의 성장에 필요한 아미노산으로서 L-글라이신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파틱산, L-글루탐산, L-프롤린, L-세린 또는 L-글루타민을 더 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. L-글루타민은 글루타맥스(Glutamax)로 대체될 수 있다.In various embodiments, the growth medium may additionally include at least one of the following amino acids: ascorbic acid, acetic acid, FBS, B27, and IWR-1. Amino acids necessary for cell growth may further include, but are not limited to, L-glycine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-proline, L-serine, or L-glutamine. . L-Glutamine can be replaced with Glutamax.
다양한 실시예에서, 성장 배지는 추가적으로 항생제를 포함할 수 있다. In various embodiments, the growth medium may additionally include antibiotics.
다양한 실시예에서, 인체 세포외기질 및 성장 배지의 부피비는 1:4 내지 1:6일 수 있으며, 바람직하게는 1:5의 비율일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In various embodiments, the volume ratio of human extracellular matrix and growth medium may be 1:4 to 1:6, preferably 1:5, but is not limited thereto.
다양한 실시예에서, 제2 배양하는 단계는 약물을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다시 도 3을 참조하면, 오가노이드들을 하나 이상의 다른 용기에 분류하여 제2 배양을 수행함과 동시에, 특정 용기에 약물을 추가하여 배양될 수 있다. 이때, 약물의 처리(treatment group, 처리군)는 배양 7일차에 수행되는 것이 바람직할 수 있다. 이에, 도 3에서의 T0은 제 2 배양에서 7일차의 갑상선암 오가노이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사용자의 실험 목적 및 계획에 따라 다양한 기간의 제2 배양에서의 오가노이드가 이용될 수 있다. 예를 들어, 갑상선암의 발달 과정에서의 약물의 효능 및 독성 평가가 요구되는 경우, 제2 배양의 0일차의 갑상선암 오가노이드가 T0에서 이용될 수 있다.In various embodiments, the second culturing step may further include treating the drug. Referring again to FIG. 3, the organoids can be sorted into one or more different containers to perform a second culture, and at the same time, the organoids can be cultured by adding a drug to a specific container. At this time, it may be desirable to perform drug treatment (treatment group) on the 7th day of culture. Accordingly, T0 in FIG. 3 may be a thyroid cancer organoid on day 7 in the second culture, but is not limited thereto. Organoids in secondary culture can be used for various periods of time depending on the user's experimental purpose and plan. For example, if evaluation of drug efficacy and toxicity during the development of thyroid cancer is required, thyroid cancer organoids from day 0 of the second culture can be used at T0.
다양한 실시예에서, 약물 미처리군(CTL) 및 약물 처리군(PFOA, PFDA)에 대해 형태학적 및 단백질 발현을 비교 분석하는 방법으로 약물의 효능 또는 독성 평가를 수행할 수 있다. 형태학적 분석으로는 현미경적 구조 분석이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 발현 분석으로는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커 수준 즉, 바이오마커의 발현량 및 발현 위치에 기초한 분석일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In various embodiments, the efficacy or toxicity of a drug may be evaluated by comparative analysis of morphological and protein expression for a drug-untreated group (CTL) and a drug-treated group (PFOA, PFDA). Morphological analysis may include, but is not limited to, microscopic structural analysis. Protein expression analysis includes at least one biomarker selected from the group consisting of F-actin abnormality, thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. The analysis may be based on the marker level, that is, the expression level and expression location of the biomarker, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 따르면 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가를 위해 약물의 처리는 실질적으로 제1 배양을 포함하는 오가노이드의 배양 7일 이내 처음 수행될 수 있다. 구체적으로 오가노이드 크기가 균질해지는 시기(7일 전후)부터 방수를 위한 코팅제로 오랫동안 사용되었으나 독성이 검증되어 현재 사용이 금지된 PFOA 또는 PFDA를 10 νM 의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출시켜 갑상선암 오가노이드를 유지시켰다. 여러가지 화합물에 장기간 노출된 갑상선 암 오가노이드의 일부는 형태 및 바이오마커 분석을 위하여 4% 파라포름알데하이드로 고정을 한 후, 파라핀을 이용하여 슬라이드 제작을 하였다. 나머지 일부는 정량적 분석을 위하여 RNAase free tube에 옮긴 후 동결과정을 거쳐 -80 ¼C deepfreezer에 보관해 두었다. According to one embodiment of the present invention, in order to evaluate the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids, drug treatment may be performed for the first time within 7 days of culturing the organoid, including the first culture. Specifically, from the time when the organoid size becomes uniform (around 7 days), PFOA or PFDA, which has been used as a coating for waterproofing for a long time but is currently banned due to its proven toxicity, is mixed with new medium at a concentration of 10 νM and then once every 3 days. Thyroid cancer organoids were maintained by replacing them and exposing them to the compound for 21 days. Some of the thyroid cancer organoids exposed to various compounds for a long period of time were fixed with 4% paraformaldehyde for morphology and biomarker analysis, and slides were made using paraffin. For quantitative analysis, the remaining part was transferred to an RNAase free tube, went through a freezing process, and was stored in a -80 ¼ C deepfreezer.
실시예 2: 갑상선암 오가노이드의 형태 분석Example 2: Morphological analysis of thyroid cancer organoids
2-1. H&E 염색을 통한 갑상선암 오가노이드의 구조 2-1. Structure of thyroid cancer organoids through H&E staining
Hematoxylin & Eosin 염색은 조직이나 세포 샘플을 현미경으로 관찰하기 위한 가장 일반적으로 사용되는 염색 기술 중 하나이다. 이 기법은 병리학에서 널리 사용되며, 오가노이드의 형태와 구조를 시각화를 위하여 사용된다.Hematoxylin & Eosin staining is one of the most commonly used staining techniques for microscopic observation of tissue or cell samples. This technique is widely used in pathology and is used to visualize the morphology and structure of organoids.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드의 H&E 염색 현미경 이미지를 도시한 것이다. 구체적으로, 도 4를 참조하면, 갑상선암 오가노이드의 파라핀 절편 및 H&E 염색을 통해 내강(lumen)을 확인할 수 있다.Figure 4 shows H&E staining of thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention. It shows a microscope image. Specifically, referring to Figure 4, the lumen of the thyroid cancer organoid can be confirmed through paraffin sectioning and H&E staining.
이에 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드에 시험하고자 하는 방수를 위한 코팅제로 오랫동안 사용되었으나 독성이 검증되어 현재 사용이 금지된 PFOA 또는 PFDA를 10 νM을 처리 후, 오가노이드의 형태 변화를 확인함으로써 시험물질의 효능 또는 독성 여부를 평가할 수 있다. 도 4와 같이 과불화화합물에 저농도-장기간 노출된 갑상선암 오가노이드에서 갑상선암 세포수가 증가된 것을 육안으로 확인할 수 있기에, 과불화화합물이 갑상선암의 증식에 영향을 미칠 수 있다는 결론을 낼 수 있다. Accordingly, after treatment with 10 νM of PFOA or PFDA, which has been used for a long time as a coating agent for waterproofing to be tested on the thyroid cancer organoid according to the present invention, but is currently banned due to its toxicity, the test substance was confirmed by confirming the change in the shape of the organoid. Efficacy or toxicity can be evaluated. As shown in Figure 4, an increase in the number of thyroid cancer cells can be visually confirmed in thyroid cancer organoids exposed to perfluorinated compounds at low concentration and for a long period of time, so it can be concluded that perfluorinated compounds can affect the proliferation of thyroid cancer.
2-2. Hoechst33342 염색을 통한 갑상선암 형태 및 핵 형태 분석2-2. Thyroid cancer morphology and nuclear morphology analysis through Hoechst33342 staining
암 오가노이드 연구에서 Hoechst33342를 사용하여 핵을 염색하는 것은 다양한 장점을 가지고 있다. 첫째, Hoechst33342는 형광 염료이므로, 현미경을 통해 세포의 핵을 명확하게 식별하고 시각화할 수 있으며, 이는 세포의 구조와 배치, 핵 분할 등을 평가하는데 유용하다. 둘째, Hoechst33342 염색을 통해 세포 주기의 각 단계에서 핵의 상태를 평가할 수 있으며, 이는 세포 분열과 관련된 연구에서 특히 중요하다. 셋째, Hoechst 33342를 사용하여 암 오가노이드 내의 세포 수를 정량적으로 분석할 수 있다. 이를 통해 특정 약물의 처리나 조건이 암 오가노이드의 성장에 어떻게 영향을 미치는지 평가할 수 있다. 넷째, Hoechst 33342 염색을 통해 비정상적인 핵 형태나 조직을 식별함으로써 세포 사멸을 평가할 수 있다.Staining nuclei using Hoechst33342 in cancer organoid research has various advantages. First, because Hoechst33342 is a fluorescent dye, it can clearly identify and visualize the nucleus of a cell through a microscope, which is useful for evaluating the structure and arrangement of the cell, nuclear division, etc. Second, Hoechst33342 staining allows assessing the state of the nucleus at each stage of the cell cycle, which is especially important in studies related to cell division. Third, the number of cells within cancer organoids can be quantitatively analyzed using Hoechst 33342. This allows us to evaluate how certain drug treatments or conditions affect the growth of cancer organoids. Fourth, cell death can be assessed by identifying abnormal nuclear morphology or organization through Hoechst 33342 staining.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드의 Hoechst33342 염색 현미경 이미지를 도시한 것이다. 구체적으로, 도 5를 참조하면, vehicle control을 처리한 갑상선암 오가노이드(CTL)와 방수를 위한 코팅제로 오랫동안 사용되었으나 독성이 검증되어 현재 사용이 금지된 PFOA 또는 PFDA를 10 νM로 21일간 처리한 갑상선암 오가노이드의 형태 및 염색된 핵의 형태를 비교함에 따라 시험물질이 갑상선암 형태 및 핵에 미치는 영향을 평가할 수 있다. 도 5는 공초점 현미경을 활용하여 Hoechst33342 염색된 갑상선암 오가노이드의 모양을 Z-stack으로 이미지를 확보한 것이므로 이러한 이미지에서 관찰될 수 있는 갑상선암의 모양 변화 및 핵 형태 변화 분석을 통하여 약물이 갑상선암에 미치는 영향을 평가할 수 있다. Figure 5 shows a Hoechst33342 staining microscope image of a thyroid cancer organoid according to an embodiment of the present invention. Specifically, referring to Figure 5, thyroid cancer organoids (CTL) treated with vehicle control and thyroid cancer treated with PFOA or PFDA, which have been used for a long time as a coating agent for waterproofing but are currently banned due to proven toxicity, at 10 νM for 21 days. By comparing the shape of the organoid and the shape of the stained nucleus, the effect of the test substance on the shape and nucleus of thyroid cancer can be evaluated. Figure 5 is a Z-stack image of the shape of a thyroid cancer organoid stained with Hoechst33342 using a confocal microscope. Therefore, the effect of drugs on thyroid cancer can be analyzed through analysis of the shape changes and nuclear shape changes of thyroid cancer that can be observed in these images. Impact can be assessed.
2-3. F-actin 염색을 통한 갑상선암 오가노이드 세포골격 형태 분석2-3. Analysis of thyroid cancer organoid cytoskeleton morphology through F-actin staining
모든 세포에 존재하는 F-액틴 염색을 통하여, vehicle control을 처리한 갑상선암 오가노이드와 약물을 처리한 갑상선암 오가노이드의 형태 변화를 분석할 수 있다. 특히 암조직에서의 F-액틴의 역할은 매우 중요하다. 암세포에서 발견되는 F-액틴의 동적 재구성은 암세포의 이동과 침입, 그리고 전이에 중요한 역할을 한다.Through F-actin staining, which is present in all cells, morphological changes in thyroid cancer organoids treated with vehicle control and thyroid cancer organoids treated with drugs can be analyzed. In particular, the role of F-actin in cancer tissue is very important. Dynamic reorganization of F-actin found in cancer cells plays an important role in cancer cell migration, invasion, and metastasis.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드에 대해 팔로이딘(phalloidin) 염색 프로토콜을 이용한 F-액틴 염색 현미경 이미지를 도시한 것이다. Figure 6 shows a microscopic image of F-actin staining using a phalloidin staining protocol for thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention.
구체적으로, 도 6을 참조하면, vehicle control을 처리한 갑상선암 오가노이드(CTL)와 PFOA 또는 PFDA를 10 νM로 21일간 노출된 갑상선암 오가노이드의 F-액틴 비정상에 의한 세포골격의 변화를 비교하여 약물의 갑상선암 오가노이드 세포골격에 미치는 영향을 평가할 수 있다. 세포 골격은 세포를 지지하는 역할을 하기 때문에 암세포에서의 세포 골격은 정상세포의 세포골격과 형태적으로 차이를 나타낸다. 특히 암 전이가 증가되는 경우 세포골격에서 spot의 증가가 관찰되며 전이와 연관있는 대표적인 세포골격의 형태 변화 중 하나이다. 이러한 이유로 항암제의 효능 또는 생활유해물질의 독성을 평가할 때 상술한 F-액틴 비정상(F-actin abnormality) 분석을 통해 세포골격 형태를 확인함으로써 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드 모델을 활용해 신약의 효능 및 독성을 평가할 수 있다.Specifically, referring to Figure 6, changes in the cytoskeleton due to F-actin abnormality in thyroid cancer organoids (CTL) treated with vehicle control and thyroid cancer organoids exposed to PFOA or PFDA at 10 νM for 21 days were compared. The effect on the thyroid cancer organoid cytoskeleton can be evaluated. Because the cytoskeleton plays a role in supporting cells, the cytoskeleton in cancer cells is morphologically different from the cytoskeleton in normal cells. In particular, when cancer metastasis increases, an increase in spots is observed in the cytoskeleton and is one of the representative cytoskeleton morphological changes associated with metastasis. For this reason, when evaluating the efficacy of anticancer drugs or the toxicity of household harmful substances, the cytoskeletal form is confirmed through the above-mentioned F-actin abnormality analysis, and the thyroid cancer organoid model according to the present invention can be used to determine the efficacy of new drugs and Toxicity can be assessed.
실시예 3: 갑상선암 오가노이드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 분석Example 3: Thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) analysis of thyroid cancer organoids
실시예 1에서 제조된 갑상선암 오가노이드에 대해 TSHR 면역염색 프로토콜을 이용하여 갑상선 자극 호르몬 수용체(THSR) 발현 분석을 수행하였다.Thyroid stimulating hormone receptor (THSR) expression analysis was performed on the thyroid cancer organoid prepared in Example 1 using the TSHR immunostaining protocol.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선암 오가노이드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 변화를 도시한 것이다. Figures 7a and 7b show changes in thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) in thyroid cancer organoids according to an embodiment of the present invention.
구체적으로, 도 7a를 참조하면, vehicle control을 처리한 갑상선암 오가노이드(CTL)와 비교하여 PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출시켜 TSHR의 발현의 변화를 확인할 수 있다. TSHR의 발현과 갑상선암 진행과 관련이 있기 때문에, TSHR 발현이 감소되면 암진행이 가속화되고 갑상선암의 전이가 쉽게 되는 특징이 있다. 이를 기반으로 본 발명에서는 갑상선암 오가노이드에 대조약물과 과불화화합물을 저농도-장기간 노출시 TSHR 발현의 차이를 분석한 것이다. 그 결과 과불화화합물에 노출된 갑상선암 오가노이드에서 TSHR 발현이 감소되어 과불화화합물이 갑상선암의 증식 및 전이에 영향을 미친다는 것을 밝혔다. Specifically, referring to Figure 7a, compared to thyroid cancer organoids (CTL) treated with vehicle control, PFOA or PFDA was mixed with new medium at a concentration of 10 νM and then changed once every 3 days and exposed to the compound for 21 days. Changes in the expression of TSHR can be confirmed. Because the expression of TSHR is related to the progression of thyroid cancer, when TSHR expression is reduced, cancer progression accelerates and thyroid cancer metastases easily. Based on this, the present invention analyzed the difference in TSHR expression when thyroid cancer organoids were exposed to a control drug and a perfluorinated compound at low concentration and for a long period of time. As a result, TSHR expression was decreased in thyroid cancer organoids exposed to perfluorinated compounds, revealing that perfluorinated compounds affect the proliferation and metastasis of thyroid cancer.
이에 TSHR가 발현되어 있는 본 발명의 갑상선암 오가노이드를 활용하여 약물 처리에 의한 TSHR의 증감을 확임함으로써, 약물의 암에 대한 영향을 평가할 수 있다. Accordingly, by confirming the increase or decrease in TSHR due to drug treatment using the thyroid cancer organoid of the present invention in which TSHR is expressed, the effect of the drug on cancer can be evaluated.
한편, 갑상선암 자극 호르몬 수용체(TSHR)는 정상적으로 갑상선 여포 상피세포의 기저(basal)부분에서 발현한다. 하지만 도 7b를 참조하면, PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출시킨 후, TSHR 발현 위치가 세포내소포(intracellular vesicle)로 전위되는 것을 확인할 수 있다. 특히 금지 화합물인 PFOA에 노출된 갑상선암 오가노이드에서 그 변화가 뚜렷하게 나타났다. Meanwhile, thyroid tumor-stimulating hormone receptor (TSHR) is normally expressed in the basal portion of thyroid follicular epithelial cells. However, referring to Figure 7b, PFOA or PFDA was mixed with new medium at a concentration of 10 νM, replaced once every 3 days, and exposed to the compound for 21 days. After that, the TSHR expression site was translocated to intracellular vesicles. You can check that. In particular, the changes were evident in thyroid cancer organoids exposed to the banned compound PFOA.
이에 TSHR가 발현되어 있는 본 발명의 갑상선암 오가노이드를 활용하여 약물 처리에 의한 TSHR 발현의 위치를 확인함으로써, 약물의 암에 대한 영향을 평가할 수 있다. Accordingly, the effect of the drug on cancer can be evaluated by confirming the location of TSHR expression by drug treatment using the thyroid cancer organoid of the present invention in which TSHR is expressed.
실시예 4: 갑상선암 오가노이드의 티로글로불린(Thyroglobulin, Tg) 분석Example 4: Thyroglobulin (Tg) analysis of thyroid cancer organoids
실시예 1에서 제조된 갑상선암 오가노이드에 대해 Tg 면역염색 프로토콜을 이용하여 갑상선암 바이오마커 중 하나인 티로글로불린(Tg) 발현 분석을 수행하였다.Thyroglobulin (Tg) expression analysis, one of the thyroid cancer biomarkers, was performed on the thyroid cancer organoid prepared in Example 1 using the Tg immunostaining protocol.
티로글로불린은 정상 갑상선 조직 및 갑상선암 조직에서만 분비되는 단백질로 갑상선 및 갑상선암 특이 바이오마커 중 하나이다. Thyroglobulin is a protein secreted only from normal thyroid tissue and thyroid cancer tissue and is one of the thyroid and thyroid cancer specific biomarkers.
도 8을 참조하면 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드는 Tg(티로글로불린)의 발현이 명확하게 나타나 인체 갑상선암의 특성을 모사함을 확인하였다. 또한 PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출시킴에 따라 갑상선암 오가노이드의 Tg 발현이 증가되는 것을 확인하였고, 이는 갑상선암에서 호르몬 분비 활성화에 따른 2차 세포증식을 유발할 가능성이 있음을 시사한다. Referring to Figure 8, it was confirmed that the thyroid cancer organoid according to the present invention clearly expressed Tg (thyroglobulin), mimicking the characteristics of human thyroid cancer. In addition, it was confirmed that Tg expression in thyroid cancer organoids was increased as PFOA or PFDA was mixed in new medium at a concentration of 10 νM and exposed to the compound for 21 days, replaced once every 3 days, which was found to be involved in activating hormone secretion in thyroid cancer. This suggests that there is a possibility of causing secondary cell proliferation.
따라서, 신규 항암제 및 유해물질에 대한 효능 및 독성평가 시 본 발명인 갑상선암 오가노이드에서 Tg 발현량 증감을 분석함으로써 시험약물에 대한 갑상선암의 활성 또는 억제를 예측할 수 있다.Therefore, when evaluating the efficacy and toxicity of new anticancer drugs and harmful substances, the activity or inhibition of thyroid cancer for the test drug can be predicted by analyzing the increase or decrease in Tg expression level in the thyroid cancer organoid of the present invention.
실시예 5: 갑상선암 오가노이드의 티로페록시다제(TPO) 분석Example 5: Tyroperoxidase (TPO) analysis of thyroid cancer organoids
실시예 1에서 제조된 갑상선암 오가노이드에 대해 TPO 면역염색 프로토콜을 이용하여 갑상선암 바이오마커 중 하나인 티로페록시다제(Thyroperoxidase; TPO) 발현 분석을 수행하였다.Expression analysis of thyroperoxidase (TPO), one of the thyroid cancer biomarkers, was performed on the thyroid cancer organoid prepared in Example 1 using the TPO immunostaining protocol.
티로페록시다제는 갑상선 호르몬 합성에 관여하는 효소로 티로글로불린의 티로신 잔기에서 요오드화물(iodide)의 산화를 촉매하여 T3(Triiodothyronine)와 T4(Tetraiodothyronine; Thyroxine)을 합성하는 역할을 한다. 갑상선에서 TPO의 발현 증가는 갑상선암이 촉진될 가능성이 있음을 간접적으로 예측할 수 있다.Thyroperoxidase is an enzyme involved in thyroid hormone synthesis. It catalyzes the oxidation of iodide from the tyrosine residue of thyroglobulin to synthesize T3 (Triiodothyronine) and T4 (Tetraiodothyronine; Thyroxine). Increased expression of TPO in the thyroid gland can indirectly predict the possibility of promoting thyroid cancer.
도 9를 참조하면 본 발명에 따른 갑상선암 오가노이드에서 TPO 발현이 명확하게 나타나 인체 갑상선암의 특성을 모사하고 있음을 확인하였다. 또한 생활유해물질인 PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출시킴에 따라 갑상선암 오가노이드의 TPO 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 특히 본 발명을 활용하여 갑상선암 오가노이드에 과불화화합물을 저농도-장기간 노출이 TPO 발현을 증가시켜 갑상선암을 촉진시킨다는 결론을 지을 수 있게 하였다. 이에 본 발명의 갑상선암 오가노이드를 이용하면 이와 같이 갑상선암을 활성 또는 억제시키는 약물을 예측할 수 있다.Referring to Figure 9, it was confirmed that TPO expression was clearly observed in the thyroid cancer organoid according to the present invention, mimicking the characteristics of human thyroid cancer. In addition, it was confirmed that TPO expression in thyroid cancer organoids increased as PFOA or PFDA, which are hazardous substances in daily life, were mixed into new medium at a concentration of 10 νM, replaced every three days, and exposed to the compounds for 21 days. In particular, using the present invention, it was possible to conclude that low-concentration and long-term exposure to perfluorinated compounds in thyroid cancer organoids increases TPO expression and promotes thyroid cancer. Accordingly, using the thyroid cancer organoid of the present invention, drugs that activate or inhibit thyroid cancer can be predicted.
실시예 6: 갑상선암 오가노이드의 E-cadherin 분석Example 6: E-cadherin analysis of thyroid cancer organoids
실시예 1에서 제조된 갑상선암 오가노이드에 대해 E-cadherin 면역염색을 수행하여 갑상선암 바이오마커 중 하나인 E-cadherin 발현 분석을 수행하였다.E-cadherin immunostaining was performed on the thyroid cancer organoid prepared in Example 1 to analyze the expression of E-cadherin, one of the thyroid cancer biomarkers.
E-cadherin은 대부분의 상피세포에서 발현이 되는 중요한 바이오마커 중 하나이다. 갑상선 상피세포의 특성이 변하게 되면, 상피중간엽전이(EMT)가 활성화되어 병리적 현상이 관찰된다. 이러한 변화는 주로 섬유화나 암의 침윤과 전이 시 발견되며, E-cadherin의 감소는 이러한 병리적 현상이 발생되고, 갑상선 상피세포의 기능 및 구조 변화가 생겼다는 것을 예상할 수 있다. E-cadherin is one of the important biomarkers expressed in most epithelial cells. When the characteristics of thyroid epithelial cells change, epithelial-mesenchymal transition (EMT) is activated and pathological phenomena are observed. These changes are mainly found during fibrosis or cancer invasion and metastasis, and a decrease in E-cadherin can be expected to indicate that these pathological phenomena occur and changes in the function and structure of thyroid epithelial cells occur.
도 10a를 참조하면, 본 발명인 갑상선암 오가노이드를 생활유해물질인 PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출시켰다. 그후 E-cadherin 발현이 정도를 면역염색을 통하여 분석한 결과, 유해물질로써 사용이 금지된 PFOA에 저농도-장기간 노출된 갑상선암 오가노이드에서 E-cadherin 발현 감소를 확인하였다. Referring to Figure 10a, the thyroid cancer organoid of the present invention was exposed to the compound for 21 days, after mixing PFOA or PFDA, a household hazardous substance, in a new medium at a concentration of 10 νM and replacing it once every 3 days. Afterwards, the level of E-cadherin expression was analyzed through immunostaining, and a decrease in E-cadherin expression was confirmed in thyroid cancer organoids exposed to low concentration and long-term exposure to PFOA, which is banned as a harmful substance.
이에 E-cadherin가 발현되어 있는 본 발명의 갑상선암 오가노이드를 활용하여 약물 처리에 의한 E-cadherin의 증감을 확임함으로써, 약물의 암에 대한 영향을 평가할 수 있다. Accordingly, by confirming the increase or decrease of E-cadherin due to drug treatment using the thyroid cancer organoid of the present invention in which E-cadherin is expressed, the effect of the drug on cancer can be evaluated.
한편, E-cadherin는 정상적으로 세포막에 존재하여 그 기능을 수행하지만, 암 전이 등의 신호가 강화되면 E-cadherin 발현은 세포막(membrane)에서 세포질(cytosol)로 전위된다. 도 10b를 참조하면, 생활유해물질인 PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도 처리 시, E-cadherin 발현 위치가 세포질 또는 세포막으로 전위되는 것을 확인할 수 있다. 보다 자세히 설명하면, 본 발명의 갑상선암 오가노이드를 활용하여 생활유해물질인 PFOA 또는 PFDA를 10 νM의 농도로 새로운 배지에 섞은 후 3일에 한번씩 교체하며 21일동안 화합물에 노출에 의한 E-cadherin 발현의 위치를 확인함으로써, 약물의 암에 대한 영향을 평가할 수 있다. 특히 유해물질로 인정되어 사용이 금지된 PFOA에 저농도-장기간 노출된 갑상선암 오가노이드에서 E-cadherin 발현이 세포질로 이동한 것이 명확히 검증되었다. Meanwhile, E-cadherin normally exists in the cell membrane and performs its function, but when signals such as cancer metastasis are strengthened, E-cadherin expression is transferred from the cell membrane to the cytosol. Referring to Figure 10b, it can be seen that when treated with PFOA or PFDA, which are hazardous substances in life, at a concentration of 10 νM, the E-cadherin expression location is translocated to the cytoplasm or cell membrane. In more detail, using the thyroid cancer organoid of the present invention, PFOA or PFDA, a household hazardous substance, is mixed into new medium at a concentration of 10 νM, replaced once every 3 days, and E-cadherin expression by exposure to the compound for 21 days. By confirming the location of , the effect of the drug on cancer can be evaluated. In particular, it was clearly verified that E-cadherin expression moved to the cytoplasm in thyroid cancer organoids exposed to low concentration and long-term exposure to PFOA, which is recognized as a hazardous substance and is banned from use.
따라서, 본 발명의 갑상선암 오가노이드를 활용하여 약물 처리에 의한 E-cadherin의 발현 위치의 변화를 확임함으로써, 약물의 암에 대한 영향을 평가할 수 있다. Therefore, the effect of the drug on cancer can be evaluated by confirming the change in the expression location of E-cadherin due to drug treatment using the thyroid cancer organoid of the present invention.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and may be modified and implemented in various ways without departing from the technical spirit of the present invention. Accordingly, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention, but rather to explain it, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be interpreted in accordance with the claims below, and all technical ideas within the equivalent scope should be construed as being included in the scope of rights of the present invention.
Claims (27)
상기 갑상선암 오가노이드는 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 발현하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드.According to paragraph 1,
The thyroid cancer organoid is a thyroid cancer organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, expressing at least one selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. Noid.
상기 갑상선암 오가노이드는 암 활성제 처리에 의해 암 미세환경을 모사하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드.According to paragraph 1,
The thyroid cancer organoid is a thyroid cancer organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that it simulates a cancer microenvironment by treatment with a cancer activator.
상기 암 미세환경은 상피중간엽전이(EMT; epithelial to mesenchymal transition) 또는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality)이 증가된 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드.According to paragraph 3,
A thyroid cancer organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the cancer microenvironment is characterized by increased epithelial to mesenchymal transition (EMT) or F-actin abnormality.
상기 약물이 처리된 오가노이드에 대해 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커 수준(level)을 측정하는 단계를 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법.Treating a drug to a thyroid cancer organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the drug according to any one of claims 1 to 4;
For organoids treated with the above drug, selected from the group consisting of F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. A method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids, comprising measuring the level of at least one biomarker.
상기 방법은, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 또는 E-cadherin 발현 위치를 확인하는 단계를 더 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법.According to clause 5,
The method further includes the step of confirming the expression location of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) or E-cadherin. A method of evaluating drug efficacy or toxicity using thyroid cancer organoids.
상기 약물이 처리된 오가노이드에 대해 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 및 티로페록시다제(TPO)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 수준이 감소하거나 티로글로불린(Tg) 또는 E-cadherin의 수준이 증가한 경우 약물이 효능을 보이는 것으로 판단하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법.According to clause 5,
Organoids treated with the above drugs were selected from the group consisting of F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), and thyroperoxidase (TPO) compared to the untreated group or the positive control group. A method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids, where the drug is judged to be effective when the level of at least one decreases or the level of thyroglobulin (Tg) or E-cadherin increases.
상기 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 수준이 세포내소포(intracellular vesicle)에서 감소 또는 E-cadherin의 수준이 세포막(membrane)에서 증가한 것인, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법.In clause 7,
A method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids, wherein the level of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) is decreased in intracellular vesicles or the level of E-cadherin is increased in the cell membrane.
상기 약물이 처리된 오가노이드에 대해 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 및 티로페록시다제(TPO)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 수준이 증가하거나 티로글로불린(Tg) 또는 E-cadherin의 수준이 감소한 경우 약물이 독성을 보이는 것으로 판단하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법.According to clause 5,
Organoids treated with the above drugs were selected from the group consisting of F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), and thyroperoxidase (TPO) compared to the untreated group or the positive control group. A method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids, where the drug is judged to be toxic when the level of at least one is increased or the level of thyroglobulin (Tg) or E-cadherin is decreased.
상기 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 수준이 세포내소포(intracellular vesicle)에서 증가 또는 E-cadherin의 수준이 세포막(membrane)에서 감소한 것인, 갑상선암 오가노이드를 이용한 약물의 효능 또는 독성 평가 방법.According to clause 9,
A method for evaluating the efficacy or toxicity of a drug using thyroid cancer organoids, wherein the level of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) is increased in intracellular vesicles or the level of E-cadherin is decreased in the cell membrane.
상기 항암 후보물질이 처리된 오가노이드 및 항암 후보물질 미처리군에 서 F-액틴 비정상(F-actin abnormality), 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커 수준(level)을 비교하는 단계; 를 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 항암제 스크리닝 방법.Processing a thyroid cancer organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the drug according to any one of claims 1 to 6 with an anticancer candidate material;
In the organoids treated with the above anticancer candidate substances and the anticancer candidate untreated group, F-actin abnormality, thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO) and Comparing the level of at least one biomarker selected from the group consisting of E-cadherin; Including, anticancer drug screening method using thyroid cancer organoids.
상기 방법은, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 또는 E-cadherin 발현 위치를 확인하는 단계를 더 포함하는, 갑상선암 오가노이드를 이용한 항암제 스크리닝 방법.According to clause 11,
The method further includes the step of confirming the expression location of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) or E-cadherin.
상기 암오가노이드 및 성장 배지를 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.A first culture step of mixing a medium containing a thyroid cancer cell line and human extracellular matrix (ECM) to form cancer organoids; and
A second culture step of mixing the cancer organoids and growth medium; Method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, including.
상기 인체 세포외기질은 인체 유래 섬유아세포로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
A method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the human extracellular matrix is obtained from human-derived fibroblasts.
상기 인체 세포외기질은 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고 탈세포화한 후 수득된 3차원 세포배양용 ECM인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 신장암 오가노이드.According to clause 13,
The human extracellular matrix is a kidney cancer organoid for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, characterized in that the human extracellular matrix is an ECM for three-dimensional cell culture obtained after treating a patch of human-derived fibroblasts with proteolytic enzymes and decellularizing them.
상기 갑상선암 세포주 및 인체 세포외기질을 포함하는 배지는 1:1 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
A method of producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that the medium containing the thyroid cancer cell line and human extracellular matrix is contained in a 1:1 ratio.
상기 제1 배양하는 단계에서 50um 내지 200um 크기를 갖는 오가노이드가 형성되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
A method of producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that organoids having a size of 50um to 200um are formed in the first culturing step.
상기 제1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
A method of producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the first culturing step is performed for at least one of about 1 hour to 3 days.
상기 제2 배양하는 단계는 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
A method of producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the second culturing step is performed for at least one period of about 3 to 50 days.
상기 제2 배양하는 단계는 약물을 처리하는 단계; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
The second culturing step includes treating a drug; A method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, further comprising:
상기 약물을 처리하는 단계는 배양 7일 이내 처음 수행되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선암 오가노이드 제조방법.According to clause 13,
A method for producing thyroid cancer organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the drug treatment step is performed for the first time within 7 days of culture.
상기 인체 세포외기질은 인체 유래 섬유아세포로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 암 미세환경 모사 갑상선암 오가노이드 배양용 조성물.In paragraph 22
A composition for culturing thyroid cancer organoids simulating a cancer microenvironment, wherein the human extracellular matrix is obtained from human-derived fibroblasts.
상기 인체 세포외기질 및 성장 배지의 부피비는 1 : 4 내지 1 : 6인 것을 특징으로 하는, 암 미세환경 모사 갑상선암 오가노이드 배양용 조성물.According to clause 22,
A composition for culturing thyroid cancer organoids simulating a cancer microenvironment, characterized in that the volume ratio of the human extracellular matrix and the growth medium is 1:4 to 1:6.
상기 암 미세환경은 상피중간엽전이(EMT; epithelial to mesenchymal transition) 또는 F-액틴 비정상(F-actin abnormality)이 증가한 것을 특징으로 하는, 암 미세환경 모사 갑상선암 오가노이드 배양용 조성물.According to clause 22,
The cancer microenvironment is characterized by increased epithelial to mesenchymal transition (EMT) or F-actin abnormality. A composition for thyroid cancer organoid culture simulating a cancer microenvironment.
An animal model in which the cancer microenvironment-mimicking thyroid cancer organoid of item 26 is xenografted.
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