KR20240058787A - Cell line-based thyroid organoids, methods of preparation thereof, and uses thereof - Google Patents

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KR20240058787A
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조재연
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한국화학연구원
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Abstract

본 발명은 오가노이드를 형성하도록 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및 상기 오가노이드를 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone) 및 요오드화 칼륨(Potassium Iodide)을 포함하는 갑상선 오가노이드 배양액과 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함하는 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법 및 이에 따른 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드, 이를 이용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가 방법에 대한 것이다. The present invention includes a first culture step of mixing a medium containing a thyroid cell line and human extracellular matrix (ECM) to form an organoid; and secondly culturing the organoids by mixing them with a thyroid organoid culture medium containing Thyroid-Stimulating Hormone and Potassium Iodide; It relates to a method for manufacturing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances, including thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances, and a method for evaluating the efficacy or toxicity of test substances using the same.

Description

세포주 기반 갑상선 오가노이드, 이의 제조방법 및 이의 용도{CELL LINE-BASED THYROID ORGANOIDS, METHODS OF PREPARATION THEREOF, AND USES THEREOF} Cell line-based thyroid organoids, manufacturing method thereof, and use thereof {CELL LINE-BASED THYROID ORGANOIDS, METHODS OF PREPARATION THEREOF, AND USES THEREOF}

본 발명은 세포주 기반 갑상선 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 활용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가기술에 관한 것이다. The present invention relates to cell line-based thyroid organoids, methods for producing the same, and techniques for evaluating the efficacy or toxicity of test substances using the same.

신약개발의 초기 단계에서는 정확한 독성 및 유효성 예측을 평가하는 모델이 필요하다. 현 기술로는 동물 모델이 신약의 독성 및 유효성에 대하여 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나, 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적 및 대사과정의 차이로 인하여 인간의 생체 내 환경을 완전히 반영하기 어렵다. 또한, 기술적으로도 동물 내부에서 일어나는 일을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적으로도 문제가 될 수 있다. In the early stages of new drug development, a model is needed to accurately predict toxicity and efficacy. With current technology, animal models can most closely simulate the toxicity and effectiveness of new drugs. However, animal experiments are burdensome in terms of time and money, and it is difficult to completely reflect the human in vivo environment due to differences in genetic, biochemical, and metabolic processes between species. Additionally, it can be technically difficult and ethically problematic to monitor what is happening inside the animal.

이에, 인간의 조직에서 직접 분리하여 체외 배양된 일차 배양 세포가 표준 모델로 사용되고 있지만, 조직을 얻기에도 어렵고, 조직 세포가 체외에서 증식하지 못하는 실험적 한계가 있다. 나아가, 2차원 세포 기반 모델(cell based in vitro model)은 비용 및 노동력 측면에서 인간의 조직으로부터 유래된 일차 배양 세포보다 효율적이기 때문에 약물 독성 및 유효성 평가에 많이 사용되고 있다. 그러나, 2차원 세포 기반 모델은 세포-세포 및 세포-세포외 기질의 상호 작용으로 발생하는 생리 기능과 조직 복합성을 구현하기엔 불충분하다.Accordingly, primary cultured cells directly isolated from human tissues and cultured in vitro are used as a standard model, but there are experimental limitations in that it is difficult to obtain tissues and tissue cells cannot proliferate in vitro. Furthermore, two-dimensional cell-based in vitro models are widely used to evaluate drug toxicity and effectiveness because they are more efficient than primary cultured cells derived from human tissues in terms of cost and labor. However, two-dimensional cell-based models are insufficient to embody the physiological functions and tissue complexity that arise from cell-cell and cell-extracellular matrix interactions.

한편, 새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되어, 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다. Meanwhile, organoids are attracting attention as a new human body simulation model. Organoids are formed by growing stem cells into specific cells to form three-dimensional structures such as organs. Organoids, unlike two-dimensional cell-based models, are cultured in a three-dimensional environment and can be cultured for a longer period of time. In addition, organoids are only small in size, but their constituent cells and structure are similar to actual organs. Accordingly, organoids are evaluated as the optimal test object for examining the efficacy and stability of drugs in the process of developing new drugs. Furthermore, the organoid-related field is a field with high potential that can be used not only for drug toxicity and efficacy evaluation in new drug development, but also for disease models, cancer research, personalized medicine, and regenerative treatments.

현재까지 위, 장, 초기 간, 갑상선, 폐, 뇌 등의 다양한 오가노이드가 성공적으로 개발되었다. 그러나, 현재까지 개발된 갑상선 오가노이드는 이를 구성하는 세포의 성숙도 및 특성이 신체 내 갑상선 세포와 비교하여 미성숙한 상태이다. 보다 구체적으로, 종래의 갑상선 오가노이드를 구성하는 세포들은, 신체 내 갑상선 세포와 상이한 바이오 마커 발현을 가지며 이에 따라, 신체 내 갑상선과 다른 특성을 가질 수 있다. 즉, 종래의 갑상선 오가노이드는 전술한 바와 같이 신체 내 기관과 상이한 특성을 가짐에 따라, 오가노이드로써 약물 및 독성 평가 등에 생체 갑상선을 대변하지 못하는 한계를 가진다. To date, various organoids have been successfully developed, including stomach, intestine, early liver, thyroid, lung, and brain. However, the maturity and characteristics of the cells constituting the thyroid organoids developed to date are immature compared to thyroid cells in the body. More specifically, the cells that make up a conventional thyroid organoid may have different biomarker expression than thyroid cells in the body and thus have different characteristics than thyroid cells in the body. In other words, as described above, conventional thyroid organoids have different characteristics from organs in the body, and thus have limitations in that they cannot represent the living thyroid gland in drug and toxicity evaluations as organoids.

결국, 생체 갑상선과 유사 또는 동일한 바이오마커의 발현을 가지고, 구조 및 형태학적으로도 유사하게 모사할 수 있는 갑상선 오가노이드의 개발이 필요한 실정이다. Ultimately, there is a need for the development of thyroid organoids that have similar or identical expression of biomarkers to living thyroid glands and can mimic structurally and morphologically.

발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. The technology behind the invention has been written to facilitate easier understanding of the invention. It should not be understood as an admission that matters described in the technology underlying the invention exist as prior art.

종래에는 줄기세포 유래 또는 iPSC 유래의 세포들에 의하여 형성된 갑상선 오가노이드들이 제공되어 왔다. 그러나, 줄기세포는 윤리적으로 이슈가 되고 있음에 따라, 이를 활용하기 위해서는 연구윤리위원회(IRB)의 승인을 받은 후 활용이 가능하여 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 나아가, 줄기세포는 줄기세포 각각의 차이(variation)이 있음에 따라, 결과에 대한 유사성 보장이 어려웠다. Conventionally, thyroid organoids formed by stem cell-derived or iPSC-derived cells have been provided. However, as stem cells have become an ethical issue, their use can only be done after obtaining approval from the Research Ethics Committee (IRB), which has the disadvantage of requiring a lot of time. Furthermore, as stem cells each have variations, it was difficult to guarantee similarity in results.

더 나아가, 줄기세포(iPSC 유래의 세포)를 통한 오가노이드 제작은 세포 생산의 시간이 많이 소요되며, 실험자의 숙련도에 따라 생산되는 세포의 질(quality)가 매우 다를 수 있다. 또한, 줄기세포를 특정 계통으로 분화시키기 위해서는 일반적인 세포 배양보다 많은 시간 및 물질이 요구됨에 따라, 이에 따른 비용이 많이 요구된다. 예를 들어, 줄기세포를 통한 오가노이즈 제작에는 마트리겔(Matrigel)이나 하이드로겔(hydrogel)과 같은 물질이 이용되는데, 마트리겔 및 하이드로겔이 이용될 경우, 세포 배양 및 스페로이드(오가노이드) 형성에 많은 시간이 소요된다. Furthermore, organoid production using stem cells (iPSC-derived cells) takes a lot of time to produce cells, and the quality of the cells produced can be very different depending on the skill of the experimenter. In addition, differentiating stem cells into specific lineages requires more time and materials than general cell culture, resulting in high costs. For example, materials such as Matrigel or hydrogel are used to produce organoids using stem cells. When Matrigel and hydrogel are used, cell culture and spheroid (organoid) formation are carried out. It takes a lot of time.

나아가, 오가노이드의 형성은 배양의 환경 및 조성에 매우 예민하여, 종래에는 제작 및 실험자의 숙련도 및 환경에 따라, 모양 및 성숙도가 매우 상이한 오가노이드가 제공되어 왔다. Furthermore, the formation of organoids is very sensitive to the environment and composition of the culture, and organoids with very different shapes and levels of maturity have conventionally been provided depending on the skill level and environment of the fabricator and experimenter.

즉, 종래에는 오가노이드의 기초가 되는 재료(줄기세포)의 민감성 및 이에 따른 배양 기간에 의하여 동질성의 균일한 오가노이드 제공이 어려움에 따라, 갑상선 오가노이드를 통한 약물 효능 및 독성 시험 또한, 동일한 실험 결과를 도출하기 어려웠다. That is, in the past, it was difficult to provide homogeneous and uniform organoids due to the sensitivity of the material (stem cells) that forms the basis of organoids and the resulting culture period, so drug efficacy and toxicity tests using thyroid organoids were also conducted in the same experiment. It was difficult to derive results.

이에, 갑상선 오가노이드를 통한 다양한 실험은 매우 낮은 신뢰도를 가지며, 실제 약물 및 독성 테스트 등의 물질 유효성 평가에는 이용되지 못하였다. 나아가, 종래의 갑상선 오가노이드는 균일한 동질성의 오가노이드 확보가 어려움에 따라, 이의 배양 및 제공 기간이 매우 길어 원활한 유통이 어려웠다. Accordingly, various experiments using thyroid organoids have very low reliability and have not been used to evaluate the effectiveness of substances such as actual drugs and toxicity tests. Furthermore, the conventional thyroid organoids were difficult to distribute smoothly due to the difficulty in securing organoids of uniform homogeneity, and the culture and provision period was very long.

한편, 본 발명의 발명자들은 줄기세포가 아닌 시중의 일반적인 상피세포주를 특정 3차원 배양 환경에서 배양할 경우, 단시간 내에 균일한 오가노이드를 형성할 수 있다는 것을 발견하였으며, 그 결과, 본 발명의 발명자들은 전술한 배양 조건을 통하여, 구조 및 특성(바이오마커)적으로 생체 갑상선과 유사한 갑상선 오가노이드를 개발하였다. Meanwhile, the inventors of the present invention discovered that when culturing commercially available epithelial cell lines, rather than stem cells, in a specific three-dimensional culture environment, uniform organoids can be formed within a short period of time. As a result, the inventors of the present invention discovered that Through the above-described culture conditions, thyroid organoids similar to living thyroid glands were developed in terms of structure and characteristics (biomarkers).

이에, 본 발명의 발명자들은, 모든 세포주, 줄기세포, 장기 등 종류(species)에 상관없이 적용 가능한 3차원 세포배양용 ECM을 포함하는 배지 (Org 3D culture solution)을 개발하고, 상술한 ECM(세포외기질)은 인체 피부의 섬유아세포로부터 나노 섬유를 포함하는 형태로 개발되어 생체 내 세포외기질과 동일한 형태를 가짐에 생체 내 모사가 뛰어난 스페로이드 또는 오가노이드 배양 환경을 제공함으로써, 이를 활용한 오가노이드 제조 방법을 제공할 수 있다.Accordingly, the inventors of the present invention developed a medium (Org 3D culture solution) containing ECM for 3D cell culture applicable to all cell lines, stem cells, organs, etc. regardless of species, and developed the above-mentioned ECM (cell extracellular matrix) was developed in a form containing nanofibers from fibroblasts of human skin and has the same form as the in vivo extracellular matrix, providing a spheroid or organoid culture environment with excellent in vivo mimicry, A method for manufacturing a noid can be provided.

이를 통해 제조된 갑상선 오가노이드는 내분비계 교란물질에 노출시킨 결과 갑상선 호르몬의 증가를 나타냈으며, 항산화제로 널리 사용되고 있는 BHA에 노출시킨 결과 갑상선 호르몬의 감소를 나타냄에 따라, 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드를 활용하면 다양한 화합물 또는 신규약물이 인간 갑상선에 미치는 영향을 미리 예측할 수 있고 시험물질의 효능 또는 독성 평가가 가능함을 확인하였다.The thyroid organoids prepared through this process showed an increase in thyroid hormones when exposed to endocrine disruptors, and a decrease in thyroid hormones when exposed to BHA, which is widely used as an antioxidant. The thyroid organoids according to the present invention It was confirmed that it is possible to predict in advance the effects of various compounds or new drugs on the human thyroid gland and to evaluate the efficacy or toxicity of test substances.

이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 갑상선 세포주를 기반으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 제공하는 것이다.Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to provide thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances prepared based on thyroid cell lines.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 전술한 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 제조하기 위한 조성물 및 제조 방법을 제공하는 것이다.Another problem to be solved by the present invention is to provide a composition and production method for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the above-mentioned test substances.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 전술한 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 활용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가 방법을 제공하는 것이다. Another problem to be solved by the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance using thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance described above.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. The problems of the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 갑상선 세포주를 기반으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 제공한다.In order to solve the problems described above, the present invention provides thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances prepared based on thyroid cell lines.

본 발명의 특징에 따르면, 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드는 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 발현할 수 있다.According to the features of the present invention, the thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance is one selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. More than one species may appear.

본 발명의 특징에 따르면, 본 발명의 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드는 갑상선 호르몬을 분비할 수 있다. 특히, 시험물질 처리에 의한 갑상선 호르몬의 수치 변화를 모사할 수 있다.According to the features of the present invention, the thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance of the present invention can secrete thyroid hormones. In particular, changes in thyroid hormone levels due to test substance treatment can be simulated.

본 발명의 발명자들은 신약 개발 과정에서 생체 모사도가 뛰어난 본 발명에 따른 인간 갑상선 오가노이드를 이용하여 시험관내(in vitro)에서, 시험물질의 효능 또는 독성 평가가 가능함을 제시한다. 이에 임상시험에 적용하기 위한 약물의 선정 단계를 단축시키므로 신약 개발 기간을 단축시킬 수 있다.The inventors of the present invention suggest that it is possible to evaluate the efficacy or toxicity of test substances in vitro using the human thyroid organoid according to the present invention, which has excellent biomimeticity, during the process of developing a new drug. As a result, the selection stage for drugs to be applied to clinical trials is shortened, thereby shortening the development period for new drugs.

또한, 본 발명의 발명자들은 생체 모사도가 뛰어난 본 발명에 따른 인간 갑상선 오가노이드를 이용하여 호르몬 교란물질 등 다양한 환경 노출 화학물질에 대해 시험관내(in vitro)에서, 독성 평가 및 갑상선에 미치는 영향의 분석이 가능함을 제시한다. In addition, the inventors of the present invention used the human thyroid organoid according to the present invention, which has excellent biomimeticity, to evaluate the toxicity and analyze the effect on the thyroid gland in vitro for various environmentally exposed chemicals such as hormone disruptors. We suggest that this is possible.

나아가, 약물 또는 화학물질의 독성 평가 시 수행되는 동물에서의 갑상선 호르몬 분석을 시험관내 환경에서 가능하기에, 추후 동물 실험 대체가 가능함을 확인하였다. Furthermore, since thyroid hormone analysis in animals, which is performed when evaluating the toxicity of drugs or chemicals, is possible in an in vitro environment, it was confirmed that animal testing can be replaced in the future.

전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 오가노이드를 형성하도록 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및 상기 오가노이드를 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone) 및 요오드화 칼륨(Potassium Iodide)을 포함하는 갑상선 오가노이드 배양액과 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention includes the steps of first culturing a medium containing a thyroid cell line and human extracellular matrix (ECM) to form an organoid; and secondly culturing the organoids by mixing them with a thyroid organoid culture medium containing Thyroid-Stimulating Hormone and Potassium Iodide; Provides a method for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances, including.

본 발명의 특징에 따르면, 제1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있다.According to features of the present invention, the first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days.

본 발명의 특징에 따르면, 제2 배양하는 단계는 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간동안 수행될 수 있다.According to features of the present invention, the second culturing step may be performed for at least one period of about 3 to 50 days.

본 발명의 특징에 따르면, 제2 배양하는 단계에서 시험물질을 처리하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.According to a feature of the present invention, treating the test substance in the second culturing step; It may further include.

본 발명의 특징에 따르면, 시험물질을 처리하는 단계는 배양 7일 이내 처음 수행될 수 있다.According to the features of the present invention, the step of treating the test substance can be performed for the first time within 7 days of culture.

본 발명의 특징에 따르면, 제1 배양하는 단계에서, 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지는 1:1 비율로 포함될 수 있다.According to a feature of the present invention, in the first culturing step, a medium containing a thyroid cell line and human extracellular matrix (ECM) may be included in a 1:1 ratio.

본 발명의 특징에 따르면, 인체 세포외기질은 3차원 세포배양용 ECM일 수 있다.According to the features of the present invention, the human extracellular matrix may be an ECM for 3D cell culture.

본 발명의 3차원 세포배양용 ECM을 포함하는 배지 (Org 3D culture solution)는 오가노이드 성장에 필요한 마트리겔, 하이드로겔, 성장인자 등을 첨가하지 않고도 줄기세포, 세포주, 장기 등과 혼합 배양하는 것만으로 일관적인 퀄리티를 갖는 충분한 양의 오가노이드를 수득할 수 있는 배양 환경을 제공한다. 이에 저비용의 화학적 요소만으로 생산 가능하며 시험관내에서 섬유아세포의 배양으로부터 지속적으로 공급될 수 있는 장점이 있다.The medium containing the ECM for 3D cell culture of the present invention (Org 3D culture solution) can be cultured simply by mixing with stem cells, cell lines, organs, etc. without adding Matrigel, hydrogel, growth factors, etc. required for organoid growth. Provides a culture environment in which a sufficient amount of organoids with consistent quality can be obtained. Accordingly, it can be produced using only low-cost chemical elements and has the advantage of being continuously supplied from fibroblast culture in vitro.

본 발명자들은 상술한 인체 유래 3차원 세포배양용 ECM (hECM)를 이용하여 누구나 손쉽게 배양할 수 있는 인간 갑상선 세포주에 적용한 결과 갑상선 호르몬을 분비 및 갑상선 기능 관련 바이오마커를 발현하는 인간 갑상선 오가노이드를 제작하는데 성공하였다.The present inventors used the above-described human-derived ECM (hECM) for 3D cell culture and applied it to a human thyroid cell line that anyone can easily culture, producing a human thyroid organoid that secretes thyroid hormones and expresses biomarkers related to thyroid function. succeeded in doing so.

아울러 종래 기술 대비 짧은 기간인 3일 이내 오가노이드가 형성됨에 따라 배양 7일 이내 시험물질에 노출시켜 오가노이드를 배양하는 것이 가능하였다. 이에 목적하는 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 오가노이드를 제작하는 기간을 현저히 단축시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 종래 줄기세포 기반의 오가노이드 기술에서처럼 줄기세포의 변형이나 실험자의 숙련도에 따라 오가노이드의 퀄리티가 다르지 않고 균질한 오가노이드를 제작할 수 있다.In addition, as organoids were formed within 3 days, which is a shorter period of time compared to the prior art, it was possible to culture organoids by exposing them to test substances within 7 days of culture. Accordingly, it was confirmed that the period for producing organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the target test substance can be significantly shortened. In addition, as in conventional stem cell-based organoid technology, the quality of the organoid does not vary depending on the deformation of the stem cells or the skill of the experimenter, and homogeneous organoids can be produced.

본 발명의 특징에 따르면, 3차원 세포배양용 ECM은 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고 탈세포화한 후 수득된 세포외기질일 수 있다.According to the features of the present invention, the ECM for 3D cell culture may be an extracellular matrix obtained after treating a human-derived fibroblast patch with proteolytic enzymes and decellularizing it.

본 발명의 특징에 따르면, 제2 배양하는 단계에서, 갑상선 자극 호르몬은 상기 갑상선 오가노이드 배양액 총 부피에 대하여 0.01 내지 1 mU/mL 농도로 포함될 수 있다.According to a feature of the present invention, in the second culturing step, thyroid-stimulating hormone may be included at a concentration of 0.01 to 1 mU/mL based on the total volume of the thyroid organoid culture medium.

본 발명의 특징에 따르면, 제2 배양하는 단계에서, 요오드화 칼륨은 상기 갑상선 오가노이드 배양액 총 부피에 대하여 1 내지 20nM 농도로 포함될 수 있다.According to a feature of the present invention, in the second culturing step, potassium iodide may be included at a concentration of 1 to 20 nM based on the total volume of the thyroid organoid culture medium.

전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 갑상선 세포주, 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지, 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone) 및 요오드화 칼륨(Potassium Iodide)을 포함하는, 시험물질의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention provides a test comprising a thyroid cell line, a medium containing human extracellular matrix (ECM), Thyroid-Stimulating Hormone, and Potassium Iodide. A culture composition for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a substance is provided.

본 발명의 특징에 따르면, 시험물질의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물은 시험관내에서 갑상선 호르몬을 분비하는 갑상선 오가노이드 제조용일 수 있다.According to the features of the present invention, the culture composition for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance may be used for producing thyroid organoids that secrete thyroid hormones in vitro.

본 발명의 특징에 따르면, 시험물질의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물은 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 발현하는 갑상선 오가노이드 제조용일 수 있다.According to the features of the present invention, the culture composition for preparing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances is composed of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. It may be used for producing thyroid organoids expressing one or more species selected from the group.

전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드에 목적하는 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험물질이 처리된 군이 시험물질 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 트리오요오드티로닌(T3), 테트라요오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커의 증감에 따라 상기 시험물질의 효능을 판단하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 효능 평가 방법을 제공한다.In order to solve other problems as described above, the present invention includes the steps of processing a test substance of interest into a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance; And the group treated with the test substance was compared with the untreated group or positive control group to show higher levels of triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), and thyroglobulin. Determining the efficacy of the test substance according to the increase or decrease of one or more biomarkers selected from the group consisting of peroxidase (TPO) and E-cadherin; Provides a method for evaluating the efficacy of test substances, including.

전술한 바와 같은 다른 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드에 목적하는 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험물질이 처리된 군이 시험물질 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 트리오요오드티로닌(T3), 테트라요오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커 증감에 따라 상기 시험물질의 독성을 판단하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 독성 평가 방법을 제공한다. In order to solve other problems as described above, the present invention includes the steps of processing a test substance of interest into a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance; And the group treated with the test substance was compared with the untreated group or positive control group to show higher levels of triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), and thyroglobulin. Determining the toxicity of the test substance according to the increase or decrease of one or more biomarkers selected from the group consisting of peroxidase (TPO) and E-cadherin; Provides a method for evaluating the toxicity of test substances, including.

본 발명은 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 인간 갑상선 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다. 또한 환경에서 노출되는 다양한 화학물질에 대한 갑상선 기능의 상호관계 기전을 밝힐 수 있는 효과가 있다.The present invention provides a human thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance, a method for producing the same, and a method for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance using the same, to verify the drug in the development of new drugs, that is, effectiveness, side effects, and toxicity. There is an effect that can be evaluated. It also has the effect of revealing the interrelationship mechanism of thyroid function in response to various chemicals exposed in the environment.

또한 시험물질의 독성 평가 시 수행되는 동물에서의 갑상선 호르몬 분석을 시험관내 환경에서 가능하기에, 추후 동물 실험 대체가 가능한 효과가 있다.In addition, since thyroid hormone analysis in animals, which is performed when evaluating the toxicity of test substances, is possible in an in vitro environment, it has the effect of being able to replace animal testing in the future.

또한 목적하는 오가노이드를 제작하는 비용 및 기간을 현저히 단축시킬 수 있는 효과가 있다. 이에 본 발명의 오가노이드는 신약 개발에 있어 약물 후보 물질 스크리닝에 활용되어 소요되는 비용 및 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 갑상선 기능이상 관련 질환의 생리학적 연구 및 임상시험에 활용될 수 있다. In addition, it has the effect of significantly shortening the cost and period of producing the desired organoid. Accordingly, the organoid of the present invention can be used to screen drug candidates in the development of new drugs, dramatically reducing the cost and time required, and can be used for physiological research and clinical trials of diseases related to thyroid dysfunction.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다. The effects according to the present invention are not limited to the contents exemplified above, and further various effects are included in the present specification.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 제조하기 위한 방법을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 갑상선 오가노이드의 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 제조하기 위해 시험물질 처리를 더 포함하여 제조하는 방법을 예시적으로 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 및 시험물질 처리를 더 포함하여 제조된 갑상선 오가노이드의 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 5는 BHA 또는 BPA에 노출되지 않고 제조된 갑상선 오가노이드 및 BHA 또는 BPA에 저농도-장기간 노출되어 제조된 갑상선 오가노이드의 갑상선 호르몬 변화를 비교하여 도시한 것이다. 도 5a는 Nthy-ori3-1 세포 유래 갑상선 오가노이드, 도 5b는 H6040 세포 유래 갑상선 오가노이드에 대한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드의 갑상선자극호르몬수용체(TSHR) 발현을 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드의 티로글로불린(Tg) 발현을 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드의 티로페록시다제(TPO) 발현을 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드의 E-cadherin 발현을 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 이용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가 방법에 대한 흐름도이다.Figure 1 exemplarily shows a method for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows a microscope image of a thyroid organoid produced by a production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 illustrates an exemplary method for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance according to an embodiment of the present invention, further including treatment of the test substance.
Figure 4 shows a microscopic image of a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance prepared by a production method according to an embodiment of the present invention and a thyroid organoid prepared further including treatment of the test substance.
Figure 5 shows a comparison of thyroid hormone changes in thyroid organoids prepared without exposure to BHA or BPA and thyroid organoids prepared with low-concentration-long-term exposure to BHA or BPA. Figure 5a shows the results for thyroid organoids derived from Nthy-ori3-1 cells, and Figure 5b shows the results for thyroid organoids derived from H6040 cells.
Figure 6 shows the expression of thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) in thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances prepared by the production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows thyroglobulin (Tg) expression in thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances prepared by the production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows the expression of thyroperoxidase (TPO) in thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances prepared by the production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 9 shows E-cadherin expression in thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of test substances prepared by the production method according to an embodiment of the present invention.
Figure 10 is a flowchart of a method for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance using thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms. The present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and are within the scope of common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.

본 문서에서, "가진다," "가질 수 있다," "포함한다," 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 기능, 동작, 또는 부품 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다.In this document, expressions such as “have,” “may have,” “includes,” or “may include” refer to the existence of the corresponding feature (e.g., a numerical value, function, operation, or component such as a part). , and does not rule out the existence of additional features.

본 문서에서, "또는"은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "A 또는 B," "A 또는/및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는/및 B 중 하나 또는 그 이상" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, "A 또는 B," "A 및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는 B 중 적어도 하나"는, (1) 적어도 하나의 A를 포함, (2) 적어도 하나의 B를 포함, 또는(3) 적어도 하나의 A 및 적어도 하나의 B 모두를 포함하는 경우를 모두 지칭할 수 있다.In this document, “or” means “and/or” unless otherwise stated. Expressions such as “A or B,” “at least one of A or/and B,” or “one or more of A or/and B” may include all possible combinations of the items listed together. For example, “A or B,” “at least one of A and B,” or “at least one of A or B” (1) includes at least one A, (2) includes at least one B, Or (3) it may refer to all cases including both at least one A and at least one B.

본 문서에서 사용된 표현 "~하도록 구성된(또는 설정된)(configured to)"은 상황에 따라, 예를 들면, "~에 적합한(suitable for)," "~하는 능력을 가지는(having the capacity to)," "~하도록 설계된(designed to)," "~하도록 변경된(adapted to)," "~하도록 만들어진(made to)," 또는 "~ 를 할 수 있는(capable of)"과 바꾸어 사용될 수 있다. As used in this document, the expression “configured to” depends on the situation, for example, “suitable for,” “having the capacity to.” ," can be used interchangeably with "designed to," "adapted to," "made to," or "capable of."

본 문서에서 사용된 용어들은 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 다른 실시예의 범위를 한정하려는 의도가 아닐 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 용어들은 본 문서에 기재된 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다. 본 문서에 사용된 용어들 중 일반적인 사전에 정의된 용어들은, 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 동일 또는 유사한 의미로 해석될 수 있으며, 본 문서에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 경우에 따라서, 본 문서에서 정의된 용어일지라도 본 문서의 실시예들을 배제하도록 해석될 수 없다.Terms used in this document are merely used to describe specific embodiments and may not be intended to limit the scope of other embodiments. Singular expressions may include plural expressions, unless the context clearly indicates otherwise. Terms used herein, including technical or scientific terms, may have the same meaning as generally understood by a person of ordinary skill in the technical field described in this document. Among the terms used in this document, terms defined in general dictionaries may be interpreted to have the same or similar meaning as the meaning they have in the context of related technology, and unless clearly defined in this document, have an ideal or excessively formal meaning. It is not interpreted as In some cases, even terms defined in this document cannot be interpreted to exclude embodiments of this document.

본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.Each of the features of the various embodiments of the present invention can be combined or combined with each other, partially or entirely, and as can be fully understood by those skilled in the art, various technical interconnections and operations are possible, and each embodiment may be implemented independently of each other. It may be possible to conduct them together due to a related relationship.

본 명세서 내에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 이러한, 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다.As used herein, the term “organoid” refers to a small culture that recapitulates both the form and function of a tissue or organ. More specifically, organoids must contain one or more cell types among the various types of cells that make up an organ or tissue, must be able to reproduce the special functions of each organ, and must be able to reproduce the special functions of each organ, and the cells must cluster together to form an organ spatially. It should be organized in a similar form. Organoids differ from spheroids in that they form a system rather than a simple collection of cells, and can be used as a patient-specific model for new drug development, artificial organs, disease treatments, and disease treatment.

본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 다양한 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.The term "medium" used within this specification refers to the growth of various cells in vitro, containing essential elements for cell growth and proliferation, such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. and mixtures for propagation.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM) "은 세포의 증식, 분화 및 사멸 등의 여러가지 세포 대사경로에서 영향을 미치는 신호를 제공하는데 중요한 역할을 하는 3차원 구조의 조직의 발달에 지지체를 의미한다. 세포외 기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자(biochemical factors)들을 저장하고, 공급해줌과 동시에 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있다. 세포외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물로서, 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)과 같은 구조체 단백질(structural protein), GAG(glycosaminoglycan)과 같은 다당류, 세포의 부착을 돕는 부착 단백질(adhesive proteins) 및 성장인자들을 포함하고 있다. 이러한, 세포외 기질은 유래되는 조직 및 세포에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다. The term “extracellular matrix (ECM)” used herein refers to the development of three-dimensional tissue that plays an important role in providing signals that influence various cellular metabolic pathways such as cell proliferation, differentiation, and death. means support. The extracellular matrix stores and supplies the biochemical factors necessary for cell growth and differentiation, while also providing a physical environment that cells can recognize. The extracellular matrix is a product produced by the cells that make up each tissue as needed, including structural proteins such as collagen and elastin, polysaccharides such as GAG (glycosaminoglycan), and other substances that help cells adhere. Contains adhesive proteins and growth factors. This extracellular matrix is composed of different components depending on the tissue and cells from which it is derived, and has special physical properties.

오가노이드 배양에 대표적으로 이용되는 세포외기질은 마트리겔(Matrigel), 하이드로겔(Hidrogel) 등이 있으나 다른 성장인자의 첨가가 필요하고 시간이 많이 소요되는 문제점이 있다. 본 발명의 발명자들은 이를 극복한 오가노이드 배양용 세포외기질을 개발하였으며 KR10-2021-0145017, KR10-2022-0152904의 특허출원을 참고하여 이해될 수 있다.Extracellular matrices typically used for organoid culture include Matrigel and Hydrogel, but they have the problem of requiring the addition of other growth factors and taking a lot of time. The inventors of the present invention have developed an extracellular matrix for organoid culture that overcomes this, and can be understood by referring to the patent applications of KR10-2021-0145017 and KR10-2022-0152904.

본 발명의 일 실시예에 따른 '인체 세포외기질'은 본 발명의 발명자들이 개발한 오가노이드 배양용 세포외기질(ECM)로서 3차원 세포배양용 ECM일 수 있다. 3차원 세포배양용 ECM에 관한 설명은 상술한 특허출원에 기재된 모든 내용을 공유할 수 있다. The 'human extracellular matrix' according to an embodiment of the present invention is an extracellular matrix (ECM) for organoid culture developed by the inventors of the present invention, and may be an ECM for three-dimensional cell culture. The description of the ECM for 3D cell culture can be shared with all the contents described in the above-mentioned patent application.

구체적으로 3차원 세포배양용 ECM은 인체 피부 진피의 섬유아세포를 배양하여 패치를 획득하고, 획득된 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리한 다음 탈세포화한 후 수득된 세포외기질(ECM)일 수 있다. 수득된 세포외기질은 콜라겐(collagne), 액티닌(actinin) 및 액틴-결합 유사 단백질(filamin-C)을 포함하고, 나노 섬유(nano fiber)가 뒤엉킨 형태일 수 있다. 즉, 종래의 파우더 형태의 세포외기질이 배양 플레이트 표면에 코팅된 상태에서 세포를 배양하는 방식에서 나아가, 본 발명에 따른 섬유 형태의 세포외기질은 부유성을 갖는 세포의 모든 표면적을 감싸 배양됨에 따라 안정적으로 생체 내 환경을 가장 유사하게 모사하고, 단시간 내에 충분한 양으로 획득될 수 있다. Specifically, ECM for 3D cell culture is an extracellular matrix (ECM) obtained by culturing fibroblasts from the dermis of human skin to obtain a patch, treating the obtained human-derived fibroblast patch with proteolytic enzymes, and then decellularizing it. It can be. The obtained extracellular matrix contains collagen, actinin, and actin-binding-like protein (filamin-C), and may be in the form of tangled nanofibers. That is, going beyond the conventional method of culturing cells with a powder-type extracellular matrix coated on the surface of a culture plate, the fiber-type extracellular matrix according to the present invention covers the entire surface area of floating cells and is cultured. Accordingly, it can stably simulate the in vivo environment as closely as possible and be obtained in sufficient quantity within a short period of time.

더욱 구체적으로, 본원발명의 3차원 세포배양용 ECM은 섬유아세포(fibroblast) 및 세포외기질을 포함하는 섬유아세포 패치(patch)가 형성되도록, 섬유아세포를 자극 배지(stimulation medium)에서 배양하는 단계, 형성된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계, 단백질 분해효소가 처리된 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계, 섬유아세포 패치에서 섬유아세포가 탈세포화(decellularization)되도록, 냉동된 섬유아세포 패치를 해동하는 단계 및 탈세포화된 섬유아세포 패치로부터 세포외 기질을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, 자극 배지에서 배양하는 단계에서, 자극 배지는 0.01 내지 2 mM의 아스코르빅 산(ascorvic acid)을 포함하고 있을 수 있다.More specifically, the ECM for 3D cell culture of the present invention includes the steps of culturing fibroblasts in a stimulation medium so that a fibroblast patch containing fibroblasts and extracellular matrix is formed; Processing the formed fibroblast patch with a proteolytic enzyme, freezing the protease-treated fibroblast patch, and thawing the frozen fibroblast patch so that the fibroblasts in the fibroblast patch are decellularized. and obtaining extracellular matrix from the decellularized fibroblast patch. At this time, in the step of culturing in the stimulation medium, the stimulation medium may contain 0.01 to 2 mM ascorbic acid.

보다 구체적으로, 아스코르빅산(Ascorbic acid)은 산화방지제로 procollagen 합성에 관여하며, type 1 콜라겐생산의 증가와 관련된 보조인자(Cofactor)이다. 아스코르빅산은 in vitro에서 지방세포, 조골세포, 연골세포와 같은 다양한 세포 증식을 자극 및 조절할 수 있다. 나아가, 특정 농도의 아스코르빅산을 첨가할 경우, 세포 성장 촉진제로 작용하여 세포의 증식력이 증가되고, DNA의 합성까지 촉진시킬 수 있다. 그러나, 아스코르빅산의 농도가 적절하지 못할 경우, 오히려 세포의 증식력을 억제시키고, 세포 독성(Cytotoxic)을 가짐으로 세포 자살(Apoptosis)를 일으킬 수 있다. 이에, 세포의 증식력 즉, 세포외 기질의 합성 및 배출을 향상시킬 수 있는 적정 아스코르빅산의 농도는 0.01 내지 1 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 보다 바람직한 아스코르빅산의 농도는 0.1 내지 1 mM일 수 있다.More specifically, ascorbic acid is an antioxidant that is involved in procollagen synthesis and is a cofactor associated with increased type 1 collagen production. Ascorbic acid can stimulate and regulate the proliferation of various cells such as adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes in vitro. Furthermore, when ascorbic acid is added at a certain concentration, it acts as a cell growth promoter, increases cell proliferation, and even promotes DNA synthesis. However, if the concentration of ascorbic acid is not appropriate, it may inhibit the proliferation of cells and be cytotoxic, causing apoptosis. Accordingly, the appropriate concentration of ascorbic acid that can improve the proliferation of cells, that is, the synthesis and excretion of extracellular matrix, may be 0.01 to 1 mM, but is not limited thereto, and a more preferable concentration of ascorbic acid is 0.1 to 1 mM. It may be 1mM.

나아가, 자극 배지는 아스코르빅산을 포함하는 배지임에 따라, 기초가 되는 기본 배지를 포함하고 있다. 예를들어, 기본 배지는 세포가 살아가기 위해 필요한, 당, 아미노산 및 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 제조된 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 및 FBS (Fetal bovine serum) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 DMEM/F-12일 수 있다.Furthermore, since the stimulation medium is a medium containing ascorbic acid, it contains the basic medium as a basis. For example, basic medium is a mixture containing sugars, amino acids, and water necessary for cells to live, excluding serum, nutrients, and various growth factors. The basic medium of the present invention can be artificially synthesized and used, or a commercially produced medium can be used. For example, commercially prepared media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), DMEM/F-12, Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α -May include, but are not limited to, MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, and FBS (Fetal bovine serum), and are preferably DMEM/F. It could be -12.

나아가, 자극 배지는, 0.0001 내지 0.001 %의 아세틱산(acetic acid)을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Furthermore, the stimulation medium may further include 0.0001 to 0.001% of acetic acid, but is not limited thereto.

또한, 자극 배지에서 배양하는 단계에서, 배양 기간은 3 내지 20주(weeks) 중 적어도 하나의 기간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 6 내지 12주 중 적어도 하나의 기간일 수 있다.Additionally, in the step of culturing in a stimulation medium, the culture period may be at least one period of 3 to 20 weeks, but is not limited thereto, and preferably may be at least one period of 6 to 12 weeks. .

이에, 전술한 배양하는 단계를 통하여, 섬유아세포는 아스코르빅산에 의하여 자극(stimulation)되어 세포외 기질을 생산 및 방출할 수 있으며, 섬유아세포 및 세포외 기질을 포함하는 섬유아세포 패치가 형성될 수 있다.Accordingly, through the above-described culturing step, fibroblasts can be stimulated by ascorbic acid to produce and release extracellular matrix, and a fibroblast patch containing fibroblasts and extracellular matrix can be formed. there is.

이때, 세포외 기질을 생산 및 방출하는 섬유아세포는 세포외 기질과 콜라겐을 합성하는 생물학적 세포의 한 종류로서, 동물조직에서 구조적 틀을 만드는 가장 흔합 결합조직이며, 심장 조직과 같은 다양한 조직으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 섬유아세포는 힘줄(tendon), 인대(ligament), 근육, 피부, 치주, 각막, 연골(cartilage), 뼈, 간, 혈관, 심장, 소장, 대장 및 추간판(intervertebral disc) 중 적어도 하나로부터 유래될수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, fibroblasts, which produce and release extracellular matrix, are a type of biological cell that synthesizes extracellular matrix and collagen, and are the most common connective tissue that creates the structural framework in animal tissue, and can be obtained from various tissues such as heart tissue. You can. For example, fibroblasts can be found in at least one of tendon, ligament, muscle, skin, periodontium, cornea, cartilage, bone, liver, blood vessel, heart, small intestine, large intestine, and intervertebral disc. It may be derived from, but is not limited to.

다시, 배양하는 단계 이후, 섬유아세포 패치로부터 세포외 기질만을 추출하기 위한, 탈세포화(decellularization) 과정이 수행될 수 있으며, 탈세포화를 위한 과정으론 단백질 분해효소를 처리하는 단계, 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계 및 섬유아세포 패치를 해동하는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 세포 배양 즉 생체소재로 사용될 세포외 기질은 특정 세포가 생리학적 특성을 유지하기 위하여, 세포외 기질의 3차원적 구조와 생리활성 물질들을 최대한 많이 보유하여야 한다. 이에, 면역 거부반응을 일으킬 수 있는 항원성이 제거되어야 함에 따라, 구조체 역할을 세포를 제외한 나머지는 모두 제거하는 탈세포화 과정이 필수적일 수 있다.Again, after the culturing step, a decellularization process may be performed to extract only the extracellular matrix from the fibroblast patch, and the decellularization process includes treatment with proteolytic enzymes and freezing the fibroblast patch. It may include the step of thawing the fibroblast patch and the step of thawing the fibroblast patch. Furthermore, the extracellular matrix to be used for cell culture, that is, as a biomaterial, must have as many three-dimensional structures and bioactive substances as possible in order for specific cells to maintain their physiological characteristics. Accordingly, as antigens that can cause immune rejection must be removed, a decellularization process that removes everything except cells that serve as structures may be essential.

이에, 형성된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 단백질 분해효소는 0.01 내지 1 %의 트립신(trypsin)일 수 있으나, 바람직하게는, 0.25 %의 트립신일 수 있다. 그러나, 단백질 분해효소는 이에 제한되는 것은 아니며, 섬유아세포 및 세포외 기질간의 결합 단백질을 분해할 수 있는 단백질 분해효소를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해효소는 콜라제네이즈(Collagenase), 엘라스테이즈(Elastase), 디스페이즈(Dispase), 프로테아제(Protease), 펩신(Pepsin), 레닌(Rennin), 키모트립신(Chymotrypsin), 에렙신(Erepsin), 엔테로키네이즈(Enterokinase), 펩티데이스(Peptidase) 및 프로티네이즈(Proteinase) 등을 포함할 수 있다.Accordingly, a step of treating the formed fibroblast patch with a proteolytic enzyme may be performed. At this time, the proteolytic enzyme may be 0.01 to 1% trypsin, but is preferably 0.25% trypsin. However, proteolytic enzymes are not limited to this and may include all proteolytic enzymes capable of decomposing binding proteins between fibroblasts and extracellular matrix. For example, proteolytic enzymes include Collagenase, Elastase, Dispase, Protease, Pepsin, Rennin, Chymotrypsin, and Erepsin. (Erepsin), Enterokinase, Peptidase, Proteinase, etc.

그 다음, 단백질 분해효소가 처리된 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 냉동시키는 단계는 -10 ℃이하의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Next, a step of freezing the proteolytic enzyme-treated fibroblast patch may be performed. At this time, the freezing step may be performed at a temperature of -10°C or lower, but is not limited thereto.

그 다음, 섬유아세포 패치에서 섬유아세포가 탈세포화되도록, 냉동된 섬유아세포 패치를 해동하는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 해동하는 단계는, 2시간 이상 동안 실온(room temperature)에서 수행될 수 있다.A step may then be performed to thaw the frozen fibroblast patch, such that the fibroblasts in the fibroblast patch are decellularized. At this time, the thawing step may be performed at room temperature for 2 hours or more.

이에, 전술한 탈세포화(decellularization) 과정을 통하여, 섬유아세포 패치로부터 섬유아세포가 유출되어, 섬유아세포 및 기타 세포들을 포함하지 않는 세포외 기질만이 수득할 수 있다.Accordingly, through the above-described decellularization process, fibroblasts are exuded from the fibroblast patch, and only extracellular matrix that does not contain fibroblasts and other cells can be obtained.

한편, 탈세포화(decellularization) 과정은 전술한 냉동 및 해동을 포함하지 않더라도, 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은 탈세포화를 위한 과정으로 단백질 분해효소를 처리하는 단계 이후, 탈세포화 버퍼(decellularization buffer)를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이때, 탈세포화 버퍼는 Triton-X 또는 EDTA를 포함할 수 있다. 그러나, 탈세포화 버퍼의 구성은 전술한 Triton-X 또는 EDTA에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 분야에서 상업적으로 이용되는 비이온성 계면 활성 성분이 모두 포함될 수 있다.Meanwhile, the decellularization process can be performed even if it does not include the above-described freezing and thawing. More specifically, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include the step of treating a decellularization buffer after treating a proteolytic enzyme as a decellularization process. In this case, the decellularization buffer may include Triton-X or EDTA. However, the composition of the decellularization buffer is not limited to the above-described Triton-X or EDTA, and may include all nonionic surfactant ingredients commercially used in the field of the present invention.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 해동하는 단계(S140) 이후, 탈세포화가 완전히 이루어지지 않을 경우, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.Furthermore, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention further includes the step of treating the thawed fibroblast patch with a protease if decellularization is not completely achieved after the thawing step (S140). It can be included.

이때, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계에서 단백질 분해효소는 전술한 단백질 분해효소와 동일한 조건일 수 있으며, 이후 전술한 과정과 동일한 과정을 통하여 탈세포화가 이루어질 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계는 냉동 및 해동하는 단계가 수행되지 않고, 37 ℃의 항온수조에서 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소 및 PBS를 첨가하여 교반과 함께 수행될 수 있다. 나아가, 이때, PBS에는 3 %의 triton-X 및 0.05 %의 EDTA가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, in the step of treating the thawed fibroblast patch with a proteolytic enzyme, the proteolytic enzyme may be under the same conditions as the proteolytic enzyme described above, and then decellularization may be achieved through the same process as the above-mentioned process. However, it is not limited to this, and for example, the step of treating the thawed fibroblast patch with a proteolytic enzyme does not involve freezing and thawing, but rather involves treating the fibroblast patch with a proteolytic enzyme and a protease in a constant temperature water bath at 37°C. This can be done with agitation by adding PBS. Furthermore, at this time, the PBS may contain 3% triton-X and 0.05% EDTA, but is not limited thereto.

더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 수득하는 단계(S150) 이후, 수득된 세포외기질을 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 동결건조하는 단계를 통하여, 수득된 세포외 기질의 유통 및 공급이 용이할 수 있다.Furthermore, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include, but is not limited to, the step of freeze-drying the obtained extracellular matrix after the obtaining step (S150). Through the freeze-drying step, distribution and supply of the obtained extracellular matrix can be facilitated.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 아스코르빅산 단 한종류의 화학 물질 첨가와 냉동 및 해동이라는 간단한 과정만으로 세포외 기질을 생산할 수 있음에 따라, 종래의 세포외 기질의 생산 방법보다 경제적일 수 있다.Accordingly, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention can produce an extracellular matrix with only a simple process of adding ascorbic acid and freezing and thawing, compared to the conventional extracellular matrix. It can be more economical than the substrate production method.

본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드 제조방법은 전술한 인체 세포외기질 및 손쉽게 구할 수 있는 갑상선 세포주를 기반으로 세포주 유래 갑상선 오가노이드의 생산을 저비용 및 고효율로 달성시킬 수 있다. The method for producing thyroid organoids according to an embodiment of the present invention can achieve the production of cell line-derived thyroid organoids at low cost and high efficiency based on the above-described human extracellular matrix and easily available thyroid cell lines.

본 명세서에서 사용되는 용어 “시험물질”은 활성 또는 독성 시험에 사용하기 위한 약물 또는 화학물질을 의미할 수 있다. 바람직하게는 항산화제로써 식품, 화장품 등에 다수 사용되는 butylhydroxyanisole (BHA) 등과 같은 약물화합물, 약물 유사 화합물, 히트 화합물, 선도 물질, 신약 후보물질 또는 갑상선 호르몬에 영향을 주는 내분비계 교란물질인 bisphenol A와 과불화화합물 등과 같은 환경 노출 화학물질일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term “test substance” may refer to a drug or chemical substance for use in activity or toxicity testing. Preferably, drug compounds such as butylhydroxyanisole (BHA), which is widely used in foods and cosmetics as an antioxidant, drug-like compounds, hit compounds, lead substances, new drug candidates, or bisphenol A, which is an endocrine disruptor that affects thyroid hormones, These may be environmentally exposed chemicals such as perfluorinated compounds, but are not limited thereto.

위에서도 언급했듯이 환경 노출 화학물질은 생활 환경, 산업체 등에서 광범위하게 사용되는 화학물질로서 환경과 동식물에 영향을 주는 물질을 의미할 수 있다. 바람직하게는 내분비계 교란 화학물질(endocrine disrupting chemical, EDC) 또는 과불화 알킬 물질(PFAS)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 내분비계 교란 화학물질은 폴리염화비페닐(PCBs), 폴리브롬화비페닐(PBB), 다이옥신, 푸란, 살충제, 과불화화합물, 프탈레이트, 비스페놀-A(BPA), UV필터, 트리클로산, 과염소산염, 파라벤 또는 부틸하이드록시톨루엔(BHT)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. As mentioned above, environmentally exposed chemicals are chemicals that are widely used in living environments, industries, etc. and can refer to substances that affect the environment and animals and plants. Preferably, it may be an endocrine disrupting chemical (EDC) or a perfluoroalkyl substance (PFAS), but is not limited thereto. For example, endocrine disrupting chemicals include polychlorinated biphenyls (PCBs), polybrominated biphenyls (PBB), dioxins, furans, pesticides, perfluorinated compounds, phthalates, bisphenol-A (BPA), UV filters, triclosan, It may be, but is not limited to, perchlorate, paraben, or butylhydroxytoluene (BHT).

본 발명에 따른 갑상선 오가노이드 제조방법은 갑상선 바이오마커를 발현하여 생체 모사가 뛰어난 갑상선 오가노이드를 짧은 기간에 다량 제공함에 따라 시험물질의 효능 또는 독성 평가를 시험관내에서 진행할 수 있는 갑상선 오가노이드를 제공할 수 있다. The thyroid organoid manufacturing method according to the present invention expresses thyroid biomarkers and provides a large amount of thyroid organoids with excellent biomimetic properties in a short period of time, thereby providing a thyroid organoid that can evaluate the efficacy or toxicity of test substances in vitro. can do.

본 명세서에서 사용되는 용어 “갑상선 자극 호르몬 수용체(THSR)”는 갑상선 세포의 세포막 표면에 위치한 G 단백질 결합 수용체로서, 이는 뇌하수체(pituitary)에서 분비하는 갑상선 자극 호르몬의 수용체이다. 갑상선 자극 호르몬이 갑상선 자극 호르몬 수용체와 결합이 되면 갑상선 성장, 갑상선 세포의 분화, 갑상선 호르몬의 합성 등이 일어난다. 약물에 포함되는 화학물질 또는 환경에서 노출되는 화학물질 등의 다양한 화학물질에 생체가 노출되었을 때 뇌하수체가 자극되어 갑상선 자극 호르몬이 증가 또는 감소하고, 이는 갑상선 자극 호르몬의 수용체에 영향을 주게 된다. 따라서 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드를 활용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가에서 중요한 바이오마커가 될 수 있다.As used herein, the term “thyroid-stimulating hormone receptor (THSR)” is a G protein-coupled receptor located on the cell membrane surface of thyroid cells, which is a receptor for thyroid-stimulating hormone secreted by the pituitary. When thyroid-stimulating hormone combines with the thyroid-stimulating hormone receptor, thyroid growth, differentiation of thyroid cells, and synthesis of thyroid hormones occur. When the body is exposed to various chemicals, such as chemicals contained in drugs or chemicals exposed in the environment, the pituitary gland is stimulated to increase or decrease thyroid-stimulating hormone, which affects the receptor for thyroid-stimulating hormone. Therefore, it can be an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of test substances using the thyroid organoid according to the present invention.

본 명세서에서 사용되는 용어 “티로글로불린(Thyroglobulin; Tg)”은 갑상선 호르몬 합성에 관여하는 주요 단백질이다. 티로글로불린은 정상 갑상선 조직 및 갑상선암 조직에서만 분비되므로 갑상선 특이 바이오마커로서 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드의 생체 유사도를 평가하는 지표가 될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드를 활용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가에서 중요한 바이오마커로 이용될 수 있다.The term “Thyroglobulin (Tg)” used herein is a major protein involved in thyroid hormone synthesis. Since thyroglobulin is secreted only in normal thyroid tissue and thyroid cancer tissue, it can be a thyroid-specific biomarker and an indicator for evaluating the biosimilarity of the thyroid organoid according to the present invention. Additionally, it can be used as an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of test substances using the thyroid organoid according to the present invention.

본 명세서에서 사용되는 용어 “티로페록시다제(Thyroperoxidase; TPO)”는 갑상선 호르몬 합성에 관여하는 효소로 티로글로불린의 티로신 잔기에서 요오드화물(iodide)의 산화를 촉매하여 T3(Triiodothyronine)와 T4(Tetraiodothyronine; Thyroxine)을 합성에 필요한 단계를 촉진하는 역할을 한다. 갑상선에서 TPO의 발현 증가는 갑상선에 이상이 생겼음을 간접적으로 예측하는 지표임이 알려져 있다. 따라서 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드를 활용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가에서 중요한 바이오마커로 이용될 수 있다.The term “thyroperoxidase (TPO)” used herein is an enzyme involved in thyroid hormone synthesis that catalyzes the oxidation of iodide from the tyrosine residue of thyroglobulin to produce T3 (Triiodothyronine) and T4 (Tetraiodothyronine). It plays a role in promoting the steps necessary for synthesizing Thyroxine. It is known that increased expression of TPO in the thyroid gland is an indirect indicator of abnormalities in the thyroid gland. Therefore, it can be used as an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of test substances using the thyroid organoid according to the present invention.

본 명세서에서 사용되는 용어 “E-cadherin”은 세포 간의 접착을 유지하는 cadherin 계열의 분자로 대부분의 상피세포에서 발현이 되며 상피세포간 연결을 안정적으로 유지시키는 중요한 단백질이다. 특히, 갑상선 여포에서 발현되며, 갑상선의 세포 접착(adhesion) 및 갑상선 조직 구조(tissue structure)에 중요한 역할을 하는, 정상 갑상선 조직에서 견고히 발현되는 단백질 중 하나이다. 갑상선 상피세포의 특성이 변하게 되면 상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)가 활성화되어 병리적 현상이 관찰된다. 따라서 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드를 활용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가에서 E-cadherin 발현 변화는 중요한 바이오마커로 이용될 수 있다.The term “E-cadherin” used herein is a cadherin-family molecule that maintains adhesion between cells. It is expressed in most epithelial cells and is an important protein that stably maintains connections between epithelial cells. In particular, it is expressed in thyroid follicles and is one of the proteins robustly expressed in normal thyroid tissue, playing an important role in thyroid cell adhesion and thyroid tissue structure. When the characteristics of thyroid epithelial cells change, epithelial-mesenchymal transition (EMT) is activated and pathological phenomena are observed. Therefore, changes in E-cadherin expression can be used as an important biomarker in evaluating the efficacy or toxicity of test substances using thyroid organoids according to the present invention.

본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드는 트리이오드티로닌(T3), 테트라이오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 것을 확인하였다.The thyroid organoid according to an embodiment of the present invention contains triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and Expression of at least one biomarker selected from the group consisting of E-cadherin was confirmed.

따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드를 활용하면 상술한 바이오마커를 지표로 목적하는 시험물질의 효능 및 독성을 예측할 수 있다. Therefore, by using the thyroid organoid according to an embodiment of the present invention, the efficacy and toxicity of the target test substance can be predicted using the above-described biomarker as an indicator.

구체적으로 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드에 목적하는 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험물질이 처리된 군을 시험물질 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 트리이오드티로닌(T3), 테트라이오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커 증감에 따라 시험물질의 효능을 판단하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 효능 평가 방법을 제공할 수 있다(도 10).Specifically, processing the test substance of interest into a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance; And by comparing the group treated with the test substance with the untreated group or positive control group, the levels of triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), and thyroglobulin (Tg) were increased. Determining the efficacy of the test substance according to the increase or decrease of one or more biomarkers selected from the group consisting of peroxidase (TPO) and E-cadherin; A method for evaluating the efficacy of a test substance can be provided, including (FIG. 10).

구체적으로 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드에 목적하는 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험물질이 처리된 군을 약물 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 트리이요오드티로닌(T3), 테트라이오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커 증감에 따라 시험물질의 독성을 판단하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 독성 평가 방법을 제공할 수 있다(도 10).Specifically, processing the test substance of interest into a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance; And the group treated with the test substance was compared with the drug-untreated group or the positive control group to produce triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), and thyrophe. Determining the toxicity of the test substance according to the increase or decrease of one or more biomarkers selected from the group consisting of roxidase (TPO) and E-cadherin; A method for evaluating the toxicity of test substances can be provided, including (FIG. 10).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since these examples are only for illustrative purposes of the present invention, the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.

실시예 1. 갑상선 세포주 기반 인간 갑상선 오가노이드 제조Example 1. Preparation of human thyroid organoids based on thyroid cell lines

이하에서는 도 1 내지 도4를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드 제조방법 및 이에 따른 갑상선 오가노이드를 구체적으로 설명한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 1 to 4, a method for manufacturing a thyroid organoid according to an embodiment of the present invention and a thyroid organoid resulting therefrom will be described in detail.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법을 예시적으로 도시한 것이다.Figure 1 exemplarily illustrates a method for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a test substance according to an embodiment of the present invention.

도 1을 참조하면, 제조방법은 오가노이드를 형성하도록 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함한느 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및 상기 오가노이드를 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone) 및 요오드화 칼륨(Potassium Iodide)을 포함하는 갑상선 오가노이드 배양액과 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함할 수 있다.Referring to Figure 1, the manufacturing method includes first culturing a mixture of a medium containing a thyroid cell line and human extracellular matrix (ECM) to form an organoid; and secondly culturing the organoids by mixing them with a thyroid organoid culture medium containing Thyroid-Stimulating Hormone and Potassium Iodide; may include.

다양한 실시예에서, 갑상선 세포들은 본 발명의 발명자들이 개발한 3차원 세포배양용 ECM(Org 3D culture solution)인 인체 세포외기질과 함께 서로 융합되어 세포들 사이의 구분이 사라지면서 밀착 연접(tight junction)이 일어나고, 자가 조직화(self-organization)가 일어나면서 오가노이드가 형성된다. 본 발명에 따른 세포외기질은 세포의 모든 표면적을 감싸 배양됨에 따라 안정적으로 생체 내 환경을 가장 유사하게 모사하는 오가노이드를 배양할 수 있다.In various embodiments, thyroid cells fuse with each other and the human extracellular matrix, which is an ECM (Org 3D culture solution) for three-dimensional cell culture developed by the inventors of the present invention, forming tight junctions while the distinction between cells disappears. ) occurs, and self-organization occurs, forming organoids. As the extracellular matrix according to the present invention surrounds the entire surface area of cells and is cultured, organoids that most closely mimic the in vivo environment can be stably cultured.

다양한 실시예에서, 제1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있고, 제2 배양하는 단계는 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있다. 제1 배양하는 단계 및 제2 배양하는 단계는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.In various embodiments, the first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days, and the second culturing step may be performed for at least one of about 3 days to 50 days. . The first culturing step and the second culturing step may be performed sequentially or simultaneously.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인체 세포외기질을 포함하여 갑상선 세포를 배양한 결과 3일 이내에 50-200 um 정도의 사이즈로 갑상선 오가노이드가 형성되었다. 이에 갑상선 오가노이드를 이용한 시험물질의 효능 또는 독성 평가를 위해 시험물질의 처리는 실질적으로 오가노이드 배양 7일 이내 처음 수행될 수 있다. 시험물질이 처리된 갑상선 오가노이드의 배양은 도 3을 참조하여 후술하기로 한다.According to one embodiment of the present invention, as a result of culturing thyroid cells including human extracellular matrix according to the present invention, thyroid organoids were formed with a size of about 50-200 um within 3 days. Therefore, to evaluate the efficacy or toxicity of a test substance using thyroid organoids, treatment of the test substance can be performed for the first time within 7 days of organoid culture. Cultivation of thyroid organoids treated with test substances will be described later with reference to FIG. 3.

다양한 실시예에서, 갑상선 세포주는 갑상선 조직으로부터 분리하여 수득하거나 상업용 세포주를 구입하는 등의 경로에 있어 제한이 없다. 갑상선 세포주는 갑상선 정상세포 또는 갑상선 정상 상피세포일 수 있다. In various embodiments, there are no restrictions on the route, such as obtaining the thyroid cell line by isolating it from thyroid tissue or purchasing a commercial cell line. Thyroid cell lines may be normal thyroid cells or normal thyroid epithelial cells.

다양한 실시예에서, 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질을 포함하는 배지는 1:1 비율로 포함될 수 있다. 바람직하게는 인체 세포외기질을 포함하는 배지 1mL 기준으로 갑상선 세포주는 1~5 x 105 내지 1~5 x 107 세포수로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In various embodiments, medium containing a thyroid cell line and human extracellular matrix may be included in a 1:1 ratio. Preferably, based on 1 mL of medium containing human extracellular matrix, the thyroid cell line may be included in the number of 1 to 5 x 10 5 to 1 to 5 x 10 7 cells, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 갑상선 오가노이드 형성을 위해 인체 세포외기질을 포함하는 배지 1mL에 갑상선 세포 H6040 또는 Nthy-ori3-1를 1 x 106 세포수로 혼합하였다. 본 발명의 발명자들이 개발한 3차원 세포배양용 ECM과의 융합으로 갑상선 세포는 3일 이내 짧은 기간동안 자가조직화되어 오가노이드를 형성하였다.According to one embodiment of the present invention, to form thyroid organoids, thyroid cells H6040 or Nthy-ori3-1 were mixed with 1 mL of medium containing human extracellular matrix at a cell number of 1 x 10 6 . By fusion with the ECM for 3D cell culture developed by the inventors of the present invention, thyroid cells self-organized for a short period of time within 3 days to form organoids.

다양한 실시예에서, 제1 배양을 통해 형성된 오가노이드는 내분비 기관인 갑상선의 모사도를 높이기 위해 갑상선 자극 호르몬 및 요오드화 칼륨을 포함하는 갑상선 오가노이드 배양액과 혼합하여 제2 배양될 수 있다. 이 때 갑상선 오가노이드 배양액은 배양 기간동안 3일에 한 번씩 교체해줄 수 있다.In various embodiments, the organoids formed through the first culture may be cultured a second time by mixing them with a thyroid organoid culture medium containing thyroid-stimulating hormone and potassium iodide to increase the degree of mimicry of the thyroid gland, which is an endocrine organ. At this time, the thyroid organoid culture medium can be replaced every three days during the culture period.

다양한 실시예에서, 제1 배양하는 단계 및 제2 배양하는 단계에서 사용되는 배지 또는 배양액은 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인슐린을 포함하지 않는 이글 기본 배지(Basal medium Eagle's, BME), 최소 필수 배지(Minimal essential medium, MEM), 이글 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Ham's F12, SF 12 및 RPMI 1640 등과 같은 다양한 무혈청 배지 및 이들의 변이형 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 또한 FBS (Fetal bovine serum) 등을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 FBS-RPMI, FBS-DMEM, 상피세포배지(EpiCM)를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In various embodiments, the medium or culture solution used in the first and second culturing steps may be artificially synthesized or commercially produced. For example, basal medium Eagle's (BME) without insulin, Minimal essential medium (MEM), Eagle's MEM, Dulbecco's modified Eagle's medium. , DMEM), Ham's F12, SF 12, and RPMI 1640, and may include at least one of various serum-free media and their variants. It may also further include FBS (Fetal bovine serum). Preferably, it may include FBS-RPMI, FBS-DMEM, and epithelial cell medium (EpiCM), but is not limited thereto.

다양한 실시예에서, 갑상선 세포주 배양액은 추가적으로 아미노산, 아세트산, 글루타맥스 및 아스코르빅산 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 세포의 성장에 필요한 아미노산으로서 L-글라이신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파틱산, L-글루탐산, L-프롤린, L-세린 또는 L-글루타민을 더 포함할 수 있다.In various embodiments, the thyroid cell line culture medium may additionally include, but is not limited to, at least one of amino acids, acetic acid, glutamax, and ascorbic acid. Amino acids necessary for cell growth may further include L-glycine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-proline, L-serine, or L-glutamine.

다양한 실시예에서, 갑상선 오가노이드 배양액에 포함되는 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone, 이하 TSH)은 갑상선 오가노이드 배양액 총량에 대에 0.01 내지 1 mU/mL로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mU/mL 포함될 수 있다. 본 발명에서 제시한 농도보다 낮은 농도로 갑상선 오가노이드가 노출되었을때는 약물에 대한 반응이 낮게 나타내며, 보다 높은 농도로 노출되었을때는 약물처리를 안한 vehicle control 자체에서 갑상선호르몬 분비가 증가되는 작용으로 인하여 약물에 대한 반응을 쉽게 판별하기 어려울 가능성이 높다. In various embodiments, Thyroid-Stimulating Hormone (TSH) contained in the thyroid organoid culture medium may be included in an amount of 0.01 to 1 mU/mL, preferably 0.05 to 0.5 mU/mL, based on the total amount of the thyroid organoid culture medium. mU/mL may be included. When thyroid organoids are exposed to a lower concentration than that suggested in the present invention, the response to the drug is low, and when exposed to a higher concentration, the drug increases due to the action of increasing thyroid hormone secretion in the untreated vehicle control itself. It is highly likely that it will be difficult to easily determine the reaction to .

다양한 실시예에서, 갑상선 오가노이드 배양액에 포함되는 요오드화 칼륨 (Potassium Iodide, 이하 PI) 은 갑상선 오가노이드 배양액 총량에 1 내지 20nM 로 포함될 수 있고 바람직하게는 5 내지 15nM 로 포함될 수 있다. 본 발명에서 제시하는 농도보다 낮은 PI의 농도가 배양액에 갑상선 오가노이드가 노출되었을때는 약물 노출에 의하여 만들어지는 갑상선 호르몬 자체의 양이 적기 때문에 배지에 분비된 호르몬 분석에 어려움이 있을 수 있으며, 높은 농도의 PI에 노출시 갑상선 오가노이드 자체에 미미하지만 독성을 유발시킬 수 있기에 본 발명에서 제시하는 농도 사용을 권장한다.In various embodiments, potassium iodide (PI) contained in the thyroid organoid culture medium may be included in an amount of 1 to 20 nM, preferably 5 to 15 nM, in the total amount of the thyroid organoid culture medium. When thyroid organoids are exposed to a culture medium with a concentration of PI lower than that suggested in the present invention, there may be difficulties in analyzing the hormones secreted in the medium because the amount of thyroid hormone itself produced by drug exposure is small, and high concentrations Exposure to PI may cause slight but toxic effects on the thyroid organoid itself, so it is recommended to use the concentration suggested in the present invention.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1 배양하는 단계에서 형성된, H6040 세포 유래 오가노이드를 0.1 mU/mL TSH 및 10 nM 농도의 PI가 첨가된 상피세포 배지에서 30일 동안 제2 배양하였다. 또한 Nthy-ori3-1 세포 유래 오가노이드를 0.1 mU/mL TSH 및 10 nM 농도의 PI가 첨가된 10% FBS-RPM 배지에서 30일 동안 제2 배양하였다.According to one embodiment of the present invention, the H6040 cell-derived organoids formed in the first culturing step were cultured a second time for 30 days in epithelial cell medium supplemented with 0.1 mU/mL TSH and 10 nM concentration of PI. In addition, Nthy-ori3-1 cell-derived organoids were cultured a second time for 30 days in 10% FBS-RPM medium supplemented with 0.1 mU/mL TSH and 10 nM concentration of PI.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 갑상선 오가노이드 제작 후, paraffin block에 인간 갑상선 오가노이드를 심어 4um의 두께로 절편을 만든 후, Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 하였다. H&E 염색은 여러장기의 조직학적 분석에 활용되는 가장 보편적인 방법 중에 하나이다. According to one embodiment of the present invention, after producing a human thyroid organoid, the human thyroid organoid was planted in a paraffin block and a section was made with a thickness of 4 μm, followed by Hematoxylin & Eosin (H&E) staining. H&E staining is one of the most common methods used for histological analysis of various organs.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 갑상선 오가노이드의 현미경 이미지를 도시한 것이다. 도 2를 참조하면, 본 발명인 갑상선 오가노이드는 colloid 및 colloid를 감싸고 있는 상피세포층을 포함하는 여포와 같은 둥근 구상의 입체적 형태인 것으로 나타난다. 이는 인간 갑상선 조직에서와 비슷한 구조를 가지고 있기에 형태학적으로 생체유사도가 있음이 검증되었다.Figure 2 shows a microscope image of a thyroid organoid produced by a production method according to an embodiment of the present invention. Referring to Figure 2, the thyroid organoid of the present invention appears to have a round spherical three-dimensional form like a follicle containing a colloid and an epithelial cell layer surrounding the colloid. Since it has a structure similar to that of human thyroid tissue, it has been verified to be morphologically similar to living organisms.

다양한 실시예에서, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법은 제2 배양하는 단계에서 약물을 처리하는 단계; 를 더 포함할 수 있다. 또한 약물을 처리하는 단계는 오가노이드 배양 7일 이내 처음 수행될 수 있다. In various embodiments, a method of producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug includes processing the drug in a second culturing step; It may further include. Additionally, the drug treatment step can be performed for the first time within 7 days of organoid culture.

도 3을 참조하면, 제1 배양하는 단계에서 형성된 오가노이드를 갑상선 오가노이드 배양액과 혼합하는 제2 배양하는 단계에서 목적하는 약물을 처리할 수 있다. 이 때 갑상선 오가노이드 배양액 및 약물의 혼합물은 배양 기간동안 3일에 한 번씩 교체해주고, 오가노이드에 노출되었던 old medium은 약물에 따른 갑상선 호르몬의 변화를 분석하기 위해 모두 수집한 후 -70℃ 이하에서 보관한다.Referring to FIG. 3, the organoid formed in the first culturing step can be treated with the desired drug in the second culturing step where the organoids are mixed with the thyroid organoid culture medium. At this time, the mixture of thyroid organoid culture medium and drug was replaced every three days during the culture period, and the old medium exposed to the organoid was collected to analyze changes in thyroid hormones according to the drug and stored at -70°C or below. keep it.

본 발명의 일 실시예에 따르면, Nthy-ori3-1 세포 유래 오가노이드 및 H6040 세포 유래 오가노이드의 제2 배양 과정에서 BHA(부틸하이드록시아니솔) 또는 BPA(비스페놀-A)를 1uM씩 처리한 배양액을 3일에 한 번씩 교체하며 30일 동안 배양하여 내분비계 교란 화학물질(EDC)에 저농도로 장기간 노출된 갑상선 오가노이드를 제조하였다. 구체적으로, EDC를 저농도 장기간 노출시 3일에 한번씩 fresh media에 EDC를 새로 추가한 후, old media를 모두 빼낸 다음 fresh media를 추가시킴으로써 장기간 노출을 시켰다.According to one embodiment of the present invention, during the second culture of Nthy-ori3-1 cell-derived organoids and H6040 cell-derived organoids, 1uM each of BHA (butylhydroxyanisole) or BPA (bisphenol-A) was treated. Thyroid organoids exposed to low concentrations of endocrine disrupting chemicals (EDC) for a long period of time were prepared by culturing for 30 days, changing the culture medium once every three days. Specifically, during long-term exposure to low concentrations of EDC, new EDC was added to fresh media once every three days, and then all old media was removed and fresh media was added, resulting in long-term exposure.

도 4를 참조하면 본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 갑상선 오가노이드를 vehicle control 처리한 오가노이드(CTL), 부틸하이드록시아니솔을 처리하여 제조된 갑상선 오가노이드(EDC-1) 및 비스페놀-A를 처리하여 제조된 갑상선 오가노이드(EDC-2)의 형태를 관찰할 수 있다. Referring to Figure 4, an organoid (CTL) prepared by vehicle control treatment of a thyroid organoid prepared by a production method according to an embodiment of the present invention, and a thyroid organoid (EDC-1) prepared by treatment with butylhydroxyanisole. And the shape of the thyroid organoid (EDC-2) prepared by treatment with bisphenol-A can be observed.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드를 이용하여 약물 처리에 의한 갑상선 호르몬 및 다양한 갑상선 바이오마커의 변화를 다음 실시예에서 기술하였다Hereinafter, changes in thyroid hormones and various thyroid biomarkers due to drug treatment using thyroid organoids according to an embodiment of the present invention are described in the following examples.

실시예 2: 갑상선 오가노이드의 갑상선 호르몬(T3, T4) 분석Example 2: Analysis of thyroid hormones (T3, T4) in thyroid organoids

도 1 및 도 3에 도시된 방법으로, BHA 또는 BPA을 처리한 갑상선 오가노이드 배양액을 3일에 한 번씩 교체하며 수집하고 -70℃ 이하에서 보관해 두었다가 4℃에서 서서히 해동하였다. 이후 섞여 있을 가능성이 있는 세포 잔해를 제거하기 위해 1000 rpm으로 1분간 spin-down한 후 상층액만 새로운 튜브로 옮기고 ELISA를 이용해 갑상선 호르몬 분석을 진행하였다. By the method shown in Figures 1 and 3, thyroid organoid culture medium treated with BHA or BPA was collected and replaced every three days, stored at -70°C or lower, and then slowly thawed at 4°C. Afterwards, to remove possible cell debris, the tube was spun down at 1000 rpm for 1 minute, and only the supernatant was transferred to a new tube, and thyroid hormone analysis was performed using ELISA.

도 5는 약물에 노출되지 않고 제조된 갑상선 오가노이드 및 BHA 또는 BPA에 저농도-장기간 노출되어 제조된 갑상선 오가노이드의 갑상선 호르몬 변화를 비교하여 도시한 것이다. 도 5a는 Nthy-ori3-1 세포 유래 갑상선 오가노이드, 도 5b는 H6040 세포 유래 갑상선 오가노이드에 대한 결과이다.Figure 5 shows a comparison of thyroid hormone changes in thyroid organoids prepared without exposure to drugs and thyroid organoids prepared with low concentration and long-term exposure to BHA or BPA. Figure 5a shows the results for thyroid organoids derived from Nthy-ori3-1 cells, and Figure 5b shows the results for thyroid organoids derived from H6040 cells.

도 5a를 참조하면, 1νΝ BHA 또는 1νM BPA에 노출되어 제조된 Nthy-ori3-1 세포 유래 갑상선 오가노이드는 약물에 노출되지 않고 제조된 갑상선 오가노이드(Vehicle CTL)와 비교하여 갑상선 호르몬 T3, T4의 증가가 나타났다. 이는 약물에 노출된 인간 갑상선 오가노이드가 갑상선 호르몬 분비를 증가시킨다는 것을 의미하며, 이는 본 발명에서 사용되었던 EDC 약물이 내분비계 교란을 유발시켜 인간 갑상선기능 항진을 유발시킬 가능성이 있음을 인간 갑상선 오가노이드를 활용하여 증명한 사례이다. 따라서, 이러한 반응을 활용하여 새로운 약물 개발이나, 동물에서는 증명되었지만 인간에서는 갑상선 호르몬 교란 등에 대한 증명이 완벽하게 되지 않은 많은 화합물들에 대한 검증 연구가 가능하다.Referring to Figure 5a, thyroid organoids derived from Nthy-ori3-1 cells prepared by exposure to 1νΝ BHA or 1νM BPA had higher levels of thyroid hormones T3 and T4 compared to thyroid organoids (Vehicle CTL) prepared without exposure to the drug. an increase was observed. This means that human thyroid organoids exposed to the drug increase thyroid hormone secretion, which suggests that the EDC drug used in the present invention is likely to cause endocrine disruption and induce human hyperthyroidism. This is a case proven using . Therefore, using these reactions, it is possible to develop new drugs or conduct validation studies on many compounds that have been proven in animals but have not been completely proven to disrupt thyroid hormones in humans.

도 5b를 참조하면, 1M BPA에 노출되어 제조된 H6040 세포 유래 갑상선 오가노이드는 갑상선 호르몬 T3, T4의 증가가 통계적으로 유의하게 나타났다(p=0.035). 1νM BHA에 노출되어 제조된 H6040 세포 유래 갑상선 오가노이드의 경우 갑상선 호르몬 T3, T4의 감소가 통계적으로 유의하게 나타났다(각각 p=0.0001, p=0.0096). BPA는 대표적인 내분비계 교란물질로 잘 알려져 있고, 사람에서도 갑상선 호르몬 증가를 유발시킬 수 있다고 보고되어 있다. 이를 양성대조약물로 사용하여 본 발명품인 인간 갑상선 오가노이드에 저농도 장기간 노출시킨 결과, 인간 갑상선 오가노이드에서 갑상선 호르몬 분비를 증가시키는 결론을 얻었다. Referring to Figure 5b, thyroid organoids derived from H6040 cells prepared by exposure to 1M BPA showed a statistically significant increase in thyroid hormones T3 and T4 ( p=0.035 ). In the case of H6040 cell-derived thyroid organoids prepared by exposure to 1νM BHA, there was a statistically significant decrease in thyroid hormones T3 and T4 ( p=0.0001 and p=0.0096, respectively). BPA is well known as a representative endocrine disruptor, and it has been reported that it can cause an increase in thyroid hormones in humans. As a result of using this as a positive control drug and exposing the human thyroid organoid of the present invention to a low concentration for a long period of time, it was concluded that thyroid hormone secretion was increased in the human thyroid organoid.

본 발명에서 사용된 항산화제로 널리 사용되고 있는 BHA는 설치류에서는 갑상선 호르몬 분비를 억제한다는 보고는 있으나, 사람에서는 아직 명확히 증명되지 않은 물질이다. 이를 본 발명품인 인간 갑상선 오가노이드에 저농도-장기간 노출시킨 결과, 갑상선 호르몬 분비가 통계적으로 유의하게 감소되는 것을 증명하여, 사람에서도 설치류와 마찬가지로 갑상선에 직접적인 영향을 줄 수 있다는 것을 증명한 것이다. 이와 같이 화합물이나 신규약물이 인간 갑상선에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 미리 시험할 수 있는 도구로 제시한다.BHA, which is widely used as an antioxidant used in the present invention, has been reported to inhibit thyroid hormone secretion in rodents, but is a substance that has not yet been clearly proven in humans. As a result of low-concentration and long-term exposure to the human thyroid organoid of the present invention, it was demonstrated that thyroid hormone secretion was statistically significantly reduced, proving that it can directly affect the thyroid gland in humans as in rodents. In this way, it is presented as a tool to test in advance what effect a compound or new drug may have on the human thyroid gland.

실시예 3: 갑상선 오가노이드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 분석Example 3: Thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) analysis of thyroid organoids

도 1 및 도 3에 도시된 방법으로 과불화화합물을 처리하여 제조된 갑상선 오가노이드에 대해 갑상선 자극 호르몬 수용체(THSR) 분석을 면역염색하여 갑상선의 중요한 바이오마커 중 하나인 TSHR 분석을 수행하였다. Thyroid-stimulating hormone receptor (THSR) analysis was performed on thyroid organoids prepared by treating perfluorinated compounds using the method shown in Figures 1 and 3, and TSHR analysis, one of the important biomarkers of the thyroid gland, was performed.

도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 제조방법으로 제조된 갑상선 오가노이드의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 발현을 분석한 것이다. THSR은 갑상선에 존재하는 중요한 receptor 중 하나이며, 이는 pituitary에서 분비하는 Thyroid-stimulating hormone (TSH)의 수용체이다. TSH 가 TSHR과 결합이 되면 thyorid growth, thyrocyte differentiation, thyroid hormone synthesis 등이 일어난다. THSR은 갑상선에 존재하는 중요한 receptor 중 하나이며, 이는 pituitary에서 분비하는 Thyroid-stimulating hormone (TSH)의 수용체이다. TSH 가 TSHR과 결합이 되면 thyorid growth, thyrocyte differentiation, thyroid hormone synthesis 등이 일어난다. 이러한 화학물질들을 인간 갑상선 오가노이드에 노출시, TSHR의 expression변화를 유도하거나. TSHR 발현 변화 없이 T3 및 T4 분비의 증가를 유도할 수 있다. 즉, 화학물질들이 갑상선 호르몬 증감에 어떠한 영향을 미치는지에 평가하기 위하여 본 발명품 활용이 가능하다. Figure 6 is an analysis of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) expression in thyroid organoids prepared by a production method according to another embodiment of the present invention. THSR is one of the important receptors present in the thyroid gland, and is the receptor for Thyroid-stimulating hormone (TSH) secreted by the pituitary. When TSH combines with TSHR, thyorid growth, thyrocyte differentiation, and thyroid hormone synthesis occur. THSR is one of the important receptors present in the thyroid gland, and is the receptor for Thyroid-stimulating hormone (TSH) secreted by the pituitary. When TSH combines with TSHR, thyorid growth, thyrocyte differentiation, and thyroid hormone synthesis occur. When these chemicals are exposed to human thyroid organoids, they induce changes in the expression of TSHR. It can induce an increase in T3 and T4 secretion without changing TSHR expression. In other words, the present invention can be used to evaluate how chemicals affect the increase or decrease of thyroid hormones.

도 6에서는 생활용품의 코팅제로 많이 사용되었던 화학물질인 과불화화합물인 PFOA와 PFDA를 저농도-장기간 동안 본 발명품에 노출시킨 결과, TSHR의 발현이 vehicle control에 비하여 현저히 감소되는 것을 증명하였으며, 이는 과불화화합물이 인체에 노출되면 TSHR 발현을 감소시켜 갑상선 기능 이상을 유발한다는 것을 증명한 것이다. In Figure 6, it was demonstrated that the expression of TSHR was significantly reduced compared to the vehicle control as a result of exposing the perfluorinated compounds PFOA and PFDA, which are chemicals widely used as coating agents for household goods, to the present invention at low concentration for a long period of time, which is It has been proven that when the chemical compound is exposed to the human body, it reduces TSHR expression and causes thyroid dysfunction.

실시예 4: 갑상선 오가노이드의 티로글로불린(Thyroglobulin) 분석Example 4: Thyroglobulin analysis of thyroid organoids

도 1 및 도 3에 도시된 방법으로 과불화화합물을 처리하여 제조된 갑상선 오가노이드에 대해 갑상선 바이오마커 중 하나인 티로글로불린(Thyroglobulin) 면역염색을 수행하여 Tg 발현 분석을 수행하였다. 티로글로불린은 정상 갑상선 조직 및 갑상선암 조직에서만 분비되는 단백질로 갑상선 특이 바이오마커이다. Thyroglobulin, one of the thyroid biomarkers, was immunostained to analyze Tg expression on thyroid organoids prepared by treating perfluorinated compounds using the method shown in Figures 1 and 3. Thyroglobulin is a protein secreted only from normal thyroid tissue and thyroid cancer tissue and is a thyroid-specific biomarker.

도 7을 참조하면 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드는 Tg (티로글로불린)의 발현이 명확하게 나타나 인체 갑상선에 대한 유사도가 있음을 확인하였다. 따라서, 다양한 내분비계 교란물질이나 신규약물을 본 발명품인 인간 갑상선 오가니오드에 노출시킨 후 Tg 발현 변화를 측정함으로써 화학물질이나 신규약물들이 인간 갑상선 기능을 활성 또는 억제시키는지 여부를 예측할 수 있는 tool 로 활용할 수 있다. Referring to Figure 7, the thyroid organoid according to the present invention clearly showed expression of Tg (thyroglobulin), confirming its similarity to the human thyroid gland. Therefore, it is a tool that can predict whether chemicals or new drugs activate or inhibit human thyroid function by measuring changes in Tg expression after exposing various endocrine disruptors or new drugs to the human thyroid organiode of the present invention. You can utilize it.

도 7에서 사용된 화학물질은 도 6에서와 마찬가지로, 생활에서 방수를 위하여 코팅제로 사용되었던 과불화화합물이 인간 갑상선에 어떠한 영향을 미치는 지를 Tg 면역염색 후 분석하였다. 도 7에서와 같이 과불화화합물에 저농도 장기간 노출된 인간 갑상선에서 Tg 발현이 증가되는 것을 확인하였고, 이는 과불화화합물이 인간 갑상선에 직접적으로 영향을 미치는 것을 증명한 것이다. The chemicals used in Figure 7 were analyzed after Tg immunostaining to determine the effect of perfluorinated compounds used as coating agents for waterproofing on the human thyroid gland, as in Figure 6. As shown in Figure 7, it was confirmed that Tg expression was increased in the human thyroid gland exposed to low concentrations of perfluorinated compounds for a long period of time, proving that perfluorinated compounds directly affect the human thyroid gland.

실시예 5: 갑상선 오가노이드의 티로페록시다제(TPO) 분석Example 5: Tyroperoxidase (TPO) analysis of thyroid organoids

도 1 및 도 3에 도시된 방법으로 과불화화합물을 처리하여 제조된 갑상선 오가노이드에 대해 갑상선 바이오마커 중 하나인 티로페록시다제(Thyroperoxidase; TPO) 면역염색을 수행하여 TPO 발현 분석을 수행하였다.Thyroperoxidase (TPO) immunostaining, one of the thyroid biomarkers, was performed on thyroid organoids prepared by treating perfluorinated compounds using the method shown in Figures 1 and 3 to analyze TPO expression.

티로페록시다제는 갑상선 호르몬 합성에 관여하는 효소로 티로글로불린의 티로신 잔기에서 요오드화물(iodide)의 산화를 촉매하여 T3(Triiodothyronine)와 T4(Tetraiodothyronine; Thyroxine)을 합성하는 역할을 한다. 갑상선에서 TPO의 발현 증가는 갑상선 기능에 이상이 생겼음을 확인하는 지표임이 알려져 있다.Thyroperoxidase is an enzyme involved in thyroid hormone synthesis. It catalyzes the oxidation of iodide from the tyrosine residue of thyroglobulin to synthesize T3 (Triiodothyronine) and T4 (Tetraiodothyronine; Thyroxine). It is known that increased expression of TPO in the thyroid gland is an indicator that abnormalities in thyroid function have occurred.

도 8을 참조하면 본 발명에 따른 갑상선 오가노이드에서 TPO 발현을 확인함에 따라 인체 갑상선에 대한 유사도가 있음을 확인하였다. 또한 방수를 위한 코팅제로 사용되었으나 독성이 확인되어 사용이 금지된 과불화화합물을 저농도-장기간 인간 갑상선 오가노이드에 노출시킨 결과, 제조된 갑상선 오가노이드의 TPO 발현이 증감되는 것을 확인함에 따라, 본 발명의 갑상선 오가노이드를 이용하면 갑상선 기능을 활성 또는 억제시키는 시험물질을 예측할 수 있다. Referring to Figure 8, as TPO expression was confirmed in the thyroid organoid according to the present invention, it was confirmed that there was similarity to the human thyroid gland. In addition, it was confirmed that TPO expression in the prepared thyroid organoids was increased or decreased as a result of exposing human thyroid organoids at low concentrations and for a long period of time to perfluorinated compounds, which were used as coating agents for waterproofing but were banned for use due to confirmed toxicity. Accordingly, the present invention Using thyroid organoids, test substances that activate or inhibit thyroid function can be predicted.

실시예 6: 갑상선 오가노이드의 E-cadherin 분석Example 6: E-cadherin analysis of thyroid organoids

도 1 및 도 3에 도시된 방법으로 과불화화합물을 처리하여 제조된 갑상선 오가노이드에 대해 E-cadherin 면역염색을 수행하여 갑상선 바이오마커 중 하나인 E-cadherin 발현 분석하였다.E-cadherin immunostaining was performed on thyroid organoids prepared by treating perfluorinated compounds using the method shown in Figures 1 and 3 to analyze the expression of E-cadherin, one of the thyroid biomarkers.

E-cadherin은 대부분의 상피세포에서 발현이 되는 중요한 바이오마커 중 하나이다. 특히, 갑상선 여포에서 발현되며, 갑상선의 세포 접착(adhesion) 및 조직 구조(tissue structure)에 중요한 역할을 하는, 정상조직에서 견고히 발현되는 단백질 중 하나이다. 갑상선 질환, 특히 암과 같은 병리학적 상태가 되었을 때, E-cadherin의 발현 패턴이 변화하는 것으로 알려져 있다.E-cadherin is one of the important biomarkers expressed in most epithelial cells. In particular, it is expressed in thyroid follicles and is one of the proteins robustly expressed in normal tissues, playing an important role in thyroid cell adhesion and tissue structure. It is known that the expression pattern of E-cadherin changes when pathological conditions such as thyroid disease, especially cancer, occur.

도 9를 참조하면, 인간 갑상선 오가노이드에서 E-cadherin 발현을 확인함에 따라 인체 갑상선에 대한 유사도가 있음을 확인하고, 특히 갑성선 여포를 정상적으로 모사하고 있음을 확인하였다. 특히 여러 제품의 코팅제로 사용되었으나 독성이 검증되어 사용이 금지된 과불화화합물중 PFOA를 10 νM로 21일간 노출시킨 결과, 그림과 같이 E-cadherin의 발현이 세포막에서 세포기질로 전위되는 것이 확인되었고, long chain PFAC로 알려진 PFDA에 같은 농도로 21일간 노출시킨 결과, E-cadherin 발현이 대조군보다 감소되는 것을 확인하였다. E-cadherin의 발현의 감소 및 전위 모두 E-cadherin 기능을 상실하였기에 본 바이오마커 분석을 통하여 갑상선의 기능을 평가하는 도구로 사용가능함을 증명하였다.Referring to Figure 9, as the expression of E-cadherin was confirmed in the human thyroid organoid, it was confirmed that there was similarity to the human thyroid gland, and in particular, it was confirmed that thyroid follicles were normally simulated. In particular, as a result of exposure to PFOA at 10 νM for 21 days, which is a perfluorinated compound used as a coating agent in several products but banned for use due to proven toxicity, it was confirmed that the expression of E-cadherin was translocated from the cell membrane to the cytosol as shown in the figure. , when exposed to PFDA, known as long chain PFAC, at the same concentration for 21 days, it was confirmed that E-cadherin expression was reduced compared to the control group. Since both the decrease and translocation of E-cadherin expression result in loss of E-cadherin function, this biomarker analysis proved that it can be used as a tool to evaluate thyroid function.

상술한 실시예 2~실시예 6의 결과에 따라 본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드를 활용하면 다양한 시험물질 즉, 약물, 약물이 포함하는 화합물, 환경에 노출되는 다양한 화학물질 등과 갑상선의 상호작용에 대한 기전을 시험관내에서 밝힐 수 있다. 이를 바탕으로 갑상선 기능에 관련되는 다양한 시험물질의 효능 또는 독성 평가를 수행할 수 있다.According to the results of Examples 2 to 6 described above, using the thyroid organoid according to an embodiment of the present invention can be used to test the thyroid gland with various test substances, such as drugs, compounds contained in drugs, various chemicals exposed to the environment, etc. The mechanism for interaction can be revealed in vitro. Based on this, the efficacy or toxicity of various test substances related to thyroid function can be evaluated.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and may be modified and implemented in various ways without departing from the technical spirit of the present invention. Accordingly, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention, but rather to explain it, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be interpreted in accordance with the claims below, and all technical ideas within the equivalent scope should be interpreted as being included in the scope of rights of the present invention.

Claims (24)

갑상선 세포주를 기반으로 제조된, 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드.Thyroid organoids manufactured based on thyroid cell lines for evaluating the efficacy or toxicity of test substances. 제1항에 있어서,
상기 갑상선 오가노이드는 갑상선 호르몬을 분비하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드.According to paragraph 1,
The thyroid organoid is a thyroid organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that the thyroid organoid secretes thyroid hormones. 제1항에 있어서,
상기 갑상선 오가노이드는 약물에 의한 갑상선 호르몬의 수치 변화를 모사한 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드.According to paragraph 1,
The thyroid organoid is a thyroid organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that it simulates changes in thyroid hormone levels caused by drugs. 제1항에 있어서,
상기 갑상선 오가노이드는 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 발현하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드.According to paragraph 1,
The thyroid organoid is characterized in that it expresses one or more selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin, the efficacy of the drug or Thyroid organoids for toxicity assessment. 오가노이드를 형성하도록 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 배지를 혼합하여 제1 배양하는 단계; 및
상기 오가노이드를 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone) 및 요오드화 칼륨(Potassium Iodide)을 포함하는 갑상선 오가노이드 배양액과 혼합하여 제2 배양하는 단계; 를 포함하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.A first culture step of mixing a medium containing a thyroid cell line and human extracellular matrix (ECM) to form organoids; and
A second culture step of mixing the organoid with a thyroid organoid culture medium containing Thyroid-Stimulating Hormone and Potassium Iodide; Method for producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, including. 제5항에 있어서,
상기 인체 세포외기질은 3차원 세포배양용 ECM인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 5,
A method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the human extracellular matrix is ECM for three-dimensional cell culture. 제6항에 있어서,
상기 3차원 세포배양용 ECM은 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고 탈세포화한 후 수득된 세포외기질(ECM)인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 6,
The ECM for 3D cell culture is an extracellular matrix (ECM) obtained after treating a patch of human-derived fibroblasts with proteolytic enzymes and decellularizing them. A method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity. . 제5항에 있어서,
상기 제1 배양하는 단계는 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 5,
The first culturing step is characterized in that culturing for at least one period of about 1 hour to 3 days, a method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity. 제5항에 있어서
상기 제2 배양하는 단계는 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.In paragraph 5
The second culturing step is a method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that culturing for at least one period of about 3 to 50 days. 제5항에 있어서
상기 제2 배양하는 단계에서 약물을 처리하는 단계; 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.In paragraph 5
treating a drug in the second culturing step; A method for producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, further comprising: 제10항에 있어서
상기 약물을 처리하는 단계는 배양 7일 이내 처음 수행되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.In paragraph 10
A method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the drug treatment step is performed for the first time within 7 days of culture. 제5항에 있어서,
상기 인체 세포외기질은 3차원 세포배양용 ECM인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 5,
A method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the human extracellular matrix is ECM for three-dimensional cell culture. 제5항에 있어서,
상기 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질을 포함하는 배지는 1:1 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 5,
A method of producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that the medium containing the thyroid cell line and human extracellular matrix is contained in a 1:1 ratio. 제5항에 있어서,
상기 갑상선 자극 호르몬은 상기 갑상선 오가노이드 배양액 총 부피에 대하여 0.01 내지 1 mU/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 5,
A method of producing a thyroid organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the thyroid stimulating hormone is contained at a concentration of 0.01 to 1 mU/mL based on the total volume of the thyroid organoid culture medium. 제5항에 있어서,
상기 요오드화 칼륨은 상기 갑상선 오가노이드 배양액 총 부피에 대하여 1 내지 20nM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드 제조방법.According to clause 5,
A method of producing a thyroid organoid for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the potassium iodide is contained at a concentration of 1 to 20 nM relative to the total volume of the thyroid organoid culture medium. 갑상선 세포주, 인체 세포외기질(ECM)를 포함하는 배지, 갑상선 자극 호르몬(Thyroid-Stimulating Hormone) 및 요오드화 칼륨(Potassium Iodide)을 포함하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.A culture composition for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, comprising a thyroid cell line, a medium containing human extracellular matrix (ECM), Thyroid-Stimulating Hormone, and Potassium Iodide. 제16항에 있어서,
상기 갑상선 세포주 및 인체 세포외기질을 포함하는 배지는 1:1 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.According to clause 16,
A culture composition for producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, characterized in that the medium containing the thyroid cell line and human extracellular matrix is contained in a 1:1 ratio. 제16항에 있어서,
상기 인체 세포외기질(ECM)은 3차원 세포배양용 ECM인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.According to clause 16,
The human extracellular matrix (ECM) is a culture composition for producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the human extracellular matrix (ECM) is ECM for three-dimensional cell culture. 제16항에 있어서
상기 갑상선 자극 호르몬은 상기 조성물 총 부피에 대하여 0.01 내지 1 mU/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.In paragraph 16
A culture composition for producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the thyroid-stimulating hormone is contained at a concentration of 0.01 to 1 mU/mL based on the total volume of the composition. 제16항에 있어서,
상기 요오드화 칼륨은 상기 조성물 총 부피에 대하여 1 내지 20nM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.According to clause 16,
A culture composition for producing thyroid organoids for evaluating drug efficacy or toxicity, wherein the potassium iodide is contained at a concentration of 1 to 20 nM based on the total volume of the composition. 제16항에 있어서,
상기 조성물은 시험관내에서 갑상선 호르몬을 분비하는 갑상선 오가노이드 제조용인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.According to clause 16,
A culture composition for producing thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, characterized in that the composition is used for producing thyroid organoids that secrete thyroid hormones in vitro. 제16항에 있어서,
상기 조성물은 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 발현하는 갑상선 오가노이드 제조용인 것을 특징으로 하는, 약물의 효능 또는 독성 평가를 위한 갑상선 오가노이드 제조용 배양 조성물.According to clause 16,
The composition is a drug for producing thyroid organoids expressing at least one selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), and E-cadherin. Culture composition for producing thyroid organoids for evaluating efficacy or toxicity. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드에 목적하는 시험물질을 처리하는 단계; 및
상기 시험물질이 처리된 군을 시험물질 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 트리이오드티로닌(T3), 테트라이오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커 증감에 따라 시험물질의 효능을 판단하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 이용한 시험물질의 효능 평가 방법.Processing the test substance of interest to a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance prepared with the composition of any one of claims 16 to 22; and
Triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), and thyrophe were compared with the group treated with the test substance or the positive control group. Determining the efficacy of the test substance according to the increase or decrease of one or more biomarkers selected from the group consisting of oxidase (TPO) and E-cadherin; A method for evaluating the efficacy of a test substance using thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance, including. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물로 제조된 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드에 목적하는 시험물질을 처리하는 단계; 및
상기 시험물질이 처리된 군을 시험물질 미처리군 또는 양성 대조군과 비교하여 트리이오드티로닌(T3), 테트라이오드티로닌(T4), 갑상선자극호르몬수용체(TSHR), 티로글로불린(Tg), 티로페록시다제(TPO) 및 E-cadherin으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커 증감에 따라 시험물질의 독성을 판단하는 단계; 를 포함하는, 시험물질의 효능 또는 독성 평가용 갑상선 오가노이드를 이용한 시험물질의 독성 평가 방법.Processing the test substance of interest to a thyroid organoid for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance prepared with the composition of any one of claims 16 to 22; and
Triiodothyronine (T3), tetraiodothyronine (T4), thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR), thyroglobulin (Tg), and thyrophe were compared with the group treated with the test substance or the positive control group. Determining the toxicity of the test substance according to the increase or decrease of one or more biomarkers selected from the group consisting of roxidase (TPO) and E-cadherin; A method for evaluating the toxicity of a test substance using thyroid organoids for evaluating the efficacy or toxicity of the test substance, including.
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