KR20240058788A - Renal proximal tubule organoid, method for preparing the same and method for evaluating drug using the same - Google Patents

Renal proximal tubule organoid, method for preparing the same and method for evaluating drug using the same Download PDF

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Abstract

본 발명은 내강(lumen) 및 상피세포층을 포함하는 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법에 있어서, 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 형성되도록 신장 근위 세뇨관 상피세포주를 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 제 1 배양 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및 형성된 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 성장하도록 오가노이드를 제 2 배양 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 전술한 방법에 의하여 배양된 신장 근위 세뇨관 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법에 대한 것이다.The present invention relates to a manufacturing method for forming renal proximal tubular organoids containing a lumen and an epithelial cell layer, in which a renal proximal tubular epithelial cell line is formed containing human extracellular matrix (ECM) to form renal proximal tubular organoids. A method for producing kidney proximal tubule organoids is provided, comprising first culturing the organoids in a first culture medium, and secondly culturing the organoids in a second culture medium to allow the formed kidney proximal tubule organoids to grow. Additionally, the present invention relates to renal proximal tubules cultured by the above-described method and a method for evaluating drug toxicity using the same.

Description

신장 근위 세뇨관 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법 {RENAL PROXIMAL TUBULE ORGANOID, METHOD FOR PREPARING THE SAME AND METHOD FOR EVALUATING DRUG USING THE SAME}Kidney proximal tubule organoid, method for producing the same, and method for drug evaluation using the same {RENAL PROXIMAL TUBULE ORGANOID, METHOD FOR PREPARING THE SAME AND METHOD FOR EVALUATING DRUG USING THE SAME}

본 발명은 생체 신장 근위 세뇨관과 유사한 구조 및 기능을 가지는 오가노이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 내강 및 내강을 감싸고 있는 상피세포층을 포함하고 둥근 구상의 입체적 형태를 가지고, 신장 근위 세뇨관 상피세포주 및 인체 세포외기질 기반의 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an organoid having a structure and function similar to that of a living kidney proximal tubule, and more specifically, to an organoid that includes a lumen and an epithelial cell layer surrounding the lumen, has a round spherical three-dimensional shape, and is used in renal proximal tubule epithelial cell lines and human bodies. It relates to extracellular matrix-based renal proximal tubule organoids, methods for producing them, and drug evaluation methods using them.

신약개발의 초기 단계에서는 정확한 독성 및 유효성 예측을 평가하는 모델이 필요하다. 현 기술로는 동물 모델이 신약의 독성 및 유효성에 대하여 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나, 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적 및 대사과정의 차이로 인하여 인간의 생체 내 환경을 완전히 반영하기 어렵다. 또한, 기술적으로도 동물 내부에서 일어나는 일을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적으로도 문제가 될 수 있다. In the early stages of new drug development, a model is needed to accurately predict toxicity and efficacy. With current technology, animal models can most closely simulate the toxicity and effectiveness of new drugs. However, animal experiments are burdensome in terms of time and money, and it is difficult to completely reflect the human in vivo environment due to differences in genetic, biochemical, and metabolic processes between species. Additionally, it can be technically difficult and ethically problematic to monitor what is happening inside the animal.

이에, 인간의 조직에서 직접 분리하여 체외 배양된 일차 배양 세포가 표준 모델로 사용되고 있지만, 조직을 얻기에도 어렵고, 조직 세포가 체외에서 증식하지 못하는 실험적 한계가 있다. 나아가, 2차원 세포 기반 모델(cell based in vitro model)은 비용 및 노동력 측면에서 인간의 조직으로부터 유래된 일차 배양 세포보다 효율적이기 때문에 약물 독성 및 유효성 평가에 많이 사용되고 있다. 그러나, 2차원 세포 기반 모델은 세포-세포 및 세포-세포외 기질의 상호 작용으로 발생하는 생리 기능과 조직 복합성을 구현하기엔 불충분하다.Accordingly, primary cultured cells directly isolated from human tissues and cultured in vitro are used as a standard model, but there are experimental limitations in that it is difficult to obtain tissues and tissue cells cannot proliferate in vitro. Furthermore, two-dimensional cell-based in vitro models are widely used to evaluate drug toxicity and effectiveness because they are more efficient than primary cultured cells derived from human tissues in terms of cost and labor. However, two-dimensional cell-based models are insufficient to embody the physiological functions and tissue complexity that arise from cell-cell and cell-extracellular matrix interactions.

한편, 새로운 인체 모사 모델로 오가노이드가 주목을 받고 있다. 오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되어, 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다. 이에, 오가노이드는 신약 개발 과정에서 약물의 효능과 안정성을 알아보기에 최적인 실험체로 평가되고 있다. 나아가, 오가노이드 관련 분야는 신약 개발의 약물 독성 및 유효성 평가뿐만 아니라, 질병모델, 암 연구, 맞춤의학 및 재생 치료제 등에도 이용될 수 있는 잠재력이 높은 분야이다. Meanwhile, organoids are attracting attention as a new human body simulation model. Organoids are formed by growing stem cells into specific cells to form three-dimensional structures such as organs. Organoids, unlike two-dimensional cell-based models, are cultured in a three-dimensional environment and can be cultured for a longer period of time. In addition, organoids are only small in size, but their constituent cells and structure are similar to actual organs. Accordingly, organoids are evaluated as the optimal test object for examining the efficacy and stability of drugs in the process of developing new drugs. Furthermore, the organoid-related field is a field with high potential that can be used not only for drug toxicity and efficacy evaluation in new drug development, but also for disease models, cancer research, personalized medicine, and regenerative treatments.

현재까지 위, 장, 초기 간, 갑상선, 폐, 뇌 등의 다양한 오가노이드가 성공적으로 개발되었다. 그러나, 현재까지 개발된 신장 오가노이드는 이를 구성하는 세포의 성숙도 및 특성이 신체 내 신장 세포와 비교하여 미성숙한 상태이다. 보다 구체적으로, 종래의 신장 오가노이드를 구성하는 세포들은, 신체 내 신장 세포와 상이한 바이오 마커 발현을 가지며 이에 따라, 신체 내 신장과 다른 특성을 가질 수 있다. 즉, 종래의 신장 오가노이드는 전술한 바와 같이 신체 내 기관과 상이한 특성을 가짐에 따라, 오가노이드로써 약물 및 독성 평가 등에 생체 신장을 대변하지 못하는 한계를 가진다. To date, various organoids have been successfully developed, including stomach, intestine, early liver, thyroid, lung, and brain. However, the maturity and characteristics of the kidney organoids developed to date are immature compared to kidney cells in the body. More specifically, the cells that make up a conventional kidney organoid may have different biomarker expression than kidney cells in the body and thus have different properties than the kidney in the body. In other words, since conventional kidney organoids have different characteristics from organs in the body as described above, they have limitations in that they cannot represent living kidneys in drug and toxicity evaluations as organoids.

결국, 생체 신장과 유사 또는 동일한 바이오마커의 발현을 가지고, 구조 및 형태학적으로도 유사하게 모사할 수 있는 신장 오가노이드의 개발이 필요한 실정이다. Ultimately, there is a need to develop kidney organoids that have similar or identical expression of biomarkers to living kidneys and can mimic structurally and morphologically.

발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. The technology behind the invention has been written to facilitate easier understanding of the invention. It should not be understood as an admission that matters described in the technology underlying the invention exist as prior art.

종래에는 줄기세포 유래 또는 iPSC 유래의 세포들에 의하여 형성된 신장 오가노이드들이 제공되어 왔다. 그러나, 줄기세포는 윤리적으로 이슈가 되고 있음에 따라, 이를 활용하기 위해서는 연구윤리위원회(IRB)의 승인을 받은 후 활용이 가능하여 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 나아가, 줄기세포는 줄기세포 각각의 차이(variation)이 있음에 따라, 결과에 대한 유사성 보장이 어려웠다. Conventionally, kidney organoids formed by stem cell-derived or iPSC-derived cells have been provided. However, as stem cells have become an ethical issue, their use can only be done after obtaining approval from the Research Ethics Committee (IRB), which has the disadvantage of requiring a lot of time. Furthermore, as stem cells each have variations, it was difficult to guarantee similarity in results.

더 나아가, 줄기세포(iPSC 유래의 세포)를 통한 오가노이드 제작은 세포 생산의 시간이 많이 소요되며, 실험자의 숙련도에 따라 생산되는 세포의 질(quality)가 매우 다를 수 있다. 또한, 줄기세포를 특정 계통으로 분화시키기 위해서는 일반적인 세포 배양보다 많은 시간 및 물질이 요구됨에 따라, 이에 따른 비용이 많이 요구된다. 예를 들어, 줄기세포를 통한 오가노이즈 제작에는 마트리겔(Matrigel)이나 하이드로겔(hydrogel)과 같은 물질이 이용되는데, 마트리겔 및 하이드로겔이 이용될 경우, 세포 배양 및 스페로이드(오가노이드) 형성에 많은 시간이 소요된다. Furthermore, organoid production using stem cells (iPSC-derived cells) takes a lot of time to produce cells, and the quality of the cells produced can be very different depending on the skill of the experimenter. In addition, differentiating stem cells into specific lineages requires more time and materials than general cell culture, resulting in high costs. For example, materials such as Matrigel or hydrogel are used to produce organoids using stem cells. When Matrigel and hydrogel are used, cell culture and spheroid (organoid) formation are carried out. It takes a lot of time.

나아가, 오가노이드의 형성은 배양의 환경 및 조성에 매우 예민하여, 종래에는 제작 및 실험자의 숙련도 및 환경에 따라, 모양 및 성숙도가 매우 상이한 오가노이드가 제공되어 왔다. Furthermore, the formation of organoids is very sensitive to the environment and composition of the culture, and organoids with very different shapes and levels of maturity have conventionally been provided depending on the skill level and environment of the fabricator and experimenter.

즉, 종래에는 오가노이드의 기초가 되는 재료(줄기세포)의 민감성 및 이에 따른 배양 기간에 의하여 동질성의 균일한 오가노이드 제공이 어려움에 따라, 신장 오가노이드를 통한 약물 효능 및 독성 시험 또한, 동일한 실험 결과를 도출하기 어려웠다. That is, in the past, it was difficult to provide homogeneous and uniform organoids due to the sensitivity of the basic material (stem cells) of organoids and the resulting culture period, so drug efficacy and toxicity tests using kidney organoids were also conducted in the same experiment. It was difficult to derive results.

이에, 신장 오가노이드를 통한 다양한 실험은 매우 낮은 신뢰도를 가지며, 실제 약물 및 독성 테스트 등의 물질 유효성 평가에는 이용되지 못하였다. 나아가, 종래의 신장 오가노이드는 균일한 동질성의 오가노이드 확보가 어려움에 따라, 이의 배양 및 제공 기간이 매우 길어 원활한 유통이 어려웠다. Accordingly, various experiments using kidney organoids have very low reliability and have not been used to evaluate the effectiveness of substances such as actual drugs and toxicity tests. Furthermore, with conventional kidney organoids, it was difficult to secure organoids of uniform homogeneity, and the cultivation and provision period was very long, making smooth distribution difficult.

한편, 본 발명의 발명자들은 줄기세포가 아닌 시중의 일반적인 상피세포주를 특정 3차원 배양 환경에서 배양할 경우, 단시간 내에 균일한 오가노이드를 형성할 수 있다는 것을 발견하였으며, 그 결과, 본 발명의 발명자들은 전술한 배양 조건을 통하여, 구조 및 특성(바이오마커)적으로 생체 신장과 유사한 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 개발하였다. Meanwhile, the inventors of the present invention discovered that when culturing commercially available epithelial cell lines, rather than stem cells, in a specific three-dimensional culture environment, uniform organoids can be formed within a short period of time. As a result, the inventors of the present invention discovered that Through the above-described culture conditions, kidney proximal tubule organoids similar to living kidneys were developed in structure and characteristics (biomarkers).

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 모든 세포주, 줄기세포, 장기 등 종류(species)에 상관없이 적용 가능한 3차원 세포배양용 ECM을 포함하는 배지 (Org 3D culture solution)을 개발하고, 상술한 ECM(세포외기질)은 인체 피부의 섬유아세포로부터 나노 섬유를 포함하는 형태로 개발되어 생체 내 세포외기질과 동일한 형태를 가짐에 따라 생체 내 모사가 뛰어난 스페로이드 또는 오가노이드 배양 환경을 제공함으로써, 이를 활용한 오가노이드 제조 방법을 제공하고, 이를 통하여 생체 신장의 모사도가 높은 신장 근위 세뇨관 오가노이드 및 이에 따른 약물 평가 방법을 제공하는 것이다. Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to develop a medium (Org 3D culture solution) containing ECM for 3D cell culture that can be applied regardless of species such as all cell lines, stem cells, and organs, and to ECM (extracellular matrix) was developed in a form containing nanofibers from fibroblasts of human skin and has the same form as the in vivo extracellular matrix, providing a spheroid or organoid culture environment with excellent in vivo mimicry. The aim is to provide a method for manufacturing organoids using this, and through this, to provide kidney proximal tubule organoids with high mimicry of living kidneys and a drug evaluation method accordingly.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. The problems of the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 신장 근위 세뇨관 상피세포주 및 인체 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 기반의 신장 근위 세뇨관 오가노이드(renal proximal tubule organoid)로써, 내강(lumen), 및 내강을 감싸고 있는 상피세포층을 포함하고, 둥근 구상의 입체적 형태인, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 제공한다.In order to solve the problems described above, the present invention is a renal proximal tubule organoid based on a renal proximal tubule epithelial cell line and human extracellular matrix (ECM), which contains a lumen, and Provided are kidney proximal tubular organoids, which contain a layer of epithelial cells lining the lumen and have a round, spherical three-dimensional shape.

본 발명의 특징에 따르면, 상피세포층은, Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 바이오마커를 더 포함할 수 있다. According to the features of the present invention, the epithelial cell layer may include at least one of Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin, and F-actin, but is not limited thereto, and may contain various biomarkers. More may be included.

본 발명의 다른 특징에 따르면, OAT는, OAT1, OAT2, OAT3, OAT4, OAT5 및 URAT1 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to another feature of the present invention, OAT may include at least one of OAT1, OAT2, OAT3, OAT4, OAT5, and URAT1, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, Na+/K+ ATPase 및 E-cadherin은 약물 처리에 의하여 상피세포의 세포막 또는 세포기질(cytosol)로 이동(translocation) 가능할 수 있다.According to another feature of the present invention, Na+/K+ ATPase and E-cadherin may be translocated to the cell membrane or cytosol of epithelial cells by drug treatment.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, ECM은, 3차원 세포 배양용일 수 있다.According to another feature of the present invention, the ECM may be used for three-dimensional cell culture.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, ECM은, 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고, 탈세포화한 후 수득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to another feature of the present invention, ECM can be obtained after treating a fibroblast patch with a proteolytic enzyme and decellularizing it, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 오가노이드는, 약물의 효능 또는 독성 평가용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 재생 의학 등 다양한 약물로도 이용될 수 있다. According to another feature of the present invention, organoids may be used to evaluate the efficacy or toxicity of drugs, but are not limited thereto, and may also be used for various drugs such as regenerative medicine.

나아가, 전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 신장 근위 세뇨관 오가노이드에 약물을 처리하는 단계, 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나의 바이오마커에 대한 발현 수준에 기초하여 약물의 효능 또는 독성 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물의 평가 방법을 제공한다.Furthermore, in order to solve the problems described above, the present invention includes the steps of treating a drug in a kidney proximal tubule organoid, Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, and Vimentin of the drug-treated organoid. and determining whether the drug is effective or toxic based on the expression level for at least one biomarker of F-actin.

본 발명의 특징에 따르면, 결정하는 단계는, 바이오마커 발현 수준을 약물 미처리군 또는 대조군(control)에서의 바이오마커 발현 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to a feature of the present invention, the determining step may include comparing the biomarker expression level with the biomarker expression level in a drug-untreated group or control group, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 결정하는 단계는, 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase 또는 E-cadherin의 발현 위치에 기초하여, 약물의 효능 또는 독성 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the determining step may further include determining whether the drug is effective or toxic based on the expression location of Na+/K+ ATPase or E-cadherin in the organoid treated with the drug. However, it is not limited to this.

더 나아가, 전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발며응ㄴ 신장 근위 세뇨관 오가노이드에 적어도 하나 이상의 약물을 처리하는 단계, 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나의 바이오마커에 대한 발현 수준에 기초하여 약물 후보군을 결정하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공한다. Furthermore, in order to solve the above-described problem, the present invention includes treating the kidney proximal tubule organoid with at least one drug, Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, Provided is a drug screening method using kidney proximal tubule organoids, comprising the step of determining drug candidates based on the expression level for at least one biomarker among 8-OHdG, Vimentin, and F-actin.

본 발명의 특징에 따르면, 결정하는 단계는, 바이오마커 발현 수준을 약물 미처리군 또는 대조군(control)에서의 바이오마커 발현 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to a feature of the present invention, the determining step may include comparing the biomarker expression level with the biomarker expression level in a drug-untreated group or control group, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 결정하는 단계는, 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase 또는 E-cadherin의 발현 위치에 기초하여, 약물의 후보군을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the determining step may further include determining drug candidates based on the expression location of Na+/K+ ATPase or E-cadherin in the organoid treated with the drug. It is not limited.

더 나아가, 전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 내강(lumen) 및 상피세포층을 포함하는 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법에 있어서, 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 형성되도록 신장 근위 세뇨관 상피세포주를 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 제 1 배양 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및 형성된 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 성장하도록 오가노이드를 제 2 배양 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법을 제공한다. Furthermore, in order to solve the problems described above, the present invention relates to a manufacturing method for forming a kidney proximal tubule organoid including a lumen and an epithelial cell layer, wherein the kidney proximal tubule organoid is formed. First culturing the tubular epithelial cell line in a first culture medium comprising human extracellular matrix (ECM), and second culturing the organoids in a second culture medium to grow the formed renal proximal tubule organoids. Provided is a method for producing kidney proximal tubule organoids.

본 발명의 특징에 따르면, 제 1 배양하는 단계는, 약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to the characteristics of the present invention, the first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 특징에 따르면, ECM은, 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고, 탈세포화한 후 수득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, ECM can be obtained after treating a fibroblast patch with a proteolytic enzyme and decellularizing it, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 신장 근위 세뇨관 상피세포주 및 제 1 배양 배지는, 1:1 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to another feature of the present invention, the renal proximal tubule epithelial cell line and the first culture medium may be included in a 1:1 ratio, but are not limited thereto.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 배양하는 단계는, 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to another feature of the present invention, the second culturing step may be performed for at least one period of about 3 to 50 days, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 배양하는 단계는, 약물을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to another feature of the present invention, the second culturing step may further include, but is not limited to, the step of treating a drug.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 약물을 처리하는 단계는, 배양 7일 이내 처음 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to another feature of the present invention, the step of treating the drug may be performed for the first time within 7 days of culture, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since these examples are only for illustrative purposes of the present invention, the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.

본 발명은 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법을 제공하여, 신약 개발에 있어 약물에 대한 검증 즉, 유효성, 부작용 및 독성을 평가할 수 있는 효과가 있다. The present invention provides a kidney proximal tubule organoid, a method for producing the same, and a method for assessing drug toxicity using the same, which has the effect of evaluating drugs in the development of new drugs, that is, evaluating effectiveness, side effects, and toxicity.

보다 구체적으로, 본 발명은 생체 신장과 상이한 구조 및 바이오마커의 발현을 가졌던 종래의 오가노이드들과는 달리, 생체 신장과 구조적으로 유사한 내강 및 내강을 감싸고 있는 상피세포층을 포함하며, 둥근 구상의 입체적인 형태의 신장 근위 세뇨관 오가노이드로써, 생체 신장과 동일한 바이오마커의 발현 양상을 나타내고 있다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 다양한 물질에 대한 신장의 구조적 및/또는 생리학적 이상을 확인할 수 있다.More specifically, the present invention, unlike conventional organoids that have a structure and expression of biomarkers different from that of a living kidney, includes a lumen that is structurally similar to a living kidney and an epithelial cell layer surrounding the lumen, and has a round, three-dimensional shape. As a kidney proximal tubule organoid, it shows the same biomarker expression pattern as a living kidney. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can identify structural and/or physiological abnormalities in the kidney in response to various substances.

즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는, 생체 신장과 기능적 및 구조적으로 유사한 인체 모사 모델로서 약물의 부작용, 독성 및 유효성 평가에 이용될 수 있다.In other words, the kidney proximal tubule organoid of the present invention is a human model that is functionally and structurally similar to a living kidney and can be used to evaluate the side effects, toxicity, and effectiveness of drugs.

나아가, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 신약 개발에 있어 약물 후보 물질 스크리닝에 활용되어 소요되는 비용 및 시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 신장 질관의 생리학적 연구 및 임상시험에 활용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 발명의 다양한 원인에 대한 실험이 가능하여 불필요한 약의 복용을 막아 치료에 대한 비용을 줄일 수 있는 개인별 맞춤 진단에 활용될 수 있다. Furthermore, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can be used to screen drug candidates in the development of new drugs, dramatically reducing the cost and time required, and can be used for physiological research and clinical trials of the kidney vaginal tract. Furthermore, the present invention can be used for personalized diagnosis that can reduce the cost of treatment by preventing the use of unnecessary drugs by enabling experiments on various causes of the invention.

또한, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제작 방법은, 균일한 동질성의 오가노이드를 단시간 내에 빠르게 제공할 수 있음에 따라, 다양한 연구 영역의 실험 재료로써 원활하게 유통 및 제공될 수 있다. In addition, the method for producing kidney proximal tubule organoids of the present invention can quickly provide organoids of uniform homogeneity within a short period of time, so they can be smoothly distributed and provided as experimental materials in various research areas.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다. The effects according to the present invention are not limited to the contents exemplified above, and further various effects are included in the present specification.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 제조 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 바이오마커에 대한 형광 이미지이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 구조에 대한 형광 이미지이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법에 대한 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 OAT1 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 F-actine 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 Na+/K+ ATPase 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 E-cadherin 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 8-OHdG 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 vimentin 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다.Figure 1 exemplarily shows the procedure of a method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 2a is a fluorescence image for biomarkers of kidney proximal tubule organoids according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 2b is a fluorescence image of the structure of kidney proximal tubule organoids according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 3a exemplarily illustrates the procedure of a drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 3b is a flowchart of a drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a microscopic image of drug evaluation based on OAT1 expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 is a microscopic image of drug evaluation based on F-actine expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 is a microscopic image of drug evaluation based on Na+/K+ ATPase expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 is a microscopic image of drug evaluation based on E-cadherin expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 is a microscopic image of drug evaluation based on 8-OHdG expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.
Figure 9 is a microscopic image of drug evaluation based on vimentin expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms. The present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and are within the scope of common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.

본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다As used herein, the term “or” means “and/or” unless otherwise stated.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은, 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 보통의 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터 지칭은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시예를 포함한다. 나아가, 용어 "약" 은 문맥으로부터 달리 언급되거나 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 10 % 내에 해당하는 값의 범위를 나타낸다.As used herein, the term “about” refers to the normal error range for each value, which is readily known to those skilled in the art. Reference herein to “about” a value or parameter includes instances of the value or parameter itself. Furthermore, the term “about” refers to a range of values that falls within 10% in either direction (above or below) of the stated reference value, unless otherwise stated or apparent from the context.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환자 또는 개체"는, 상호교환적으로 사용되고 치료가 요구되는 임의의 단일 동물, 더 바람직하게는 포유동물 (그와 같은 비-인간 동물, 예를 들어, 고양이, 개, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양, 및 비-인간 영장류 포함)을 지칭한다. 본 명세서의 다양한 실시예에서 지칭하는 환자는 인간일 수 있다.As used herein, the term “patient or subject” is used interchangeably and refers to any single animal in need of treatment, more preferably a mammal (such as a non-human animal, e.g., cat, dog, (including horses, rabbits, zoo animals, cattle, pigs, sheep, and non-human primates). Patients referred to in various embodiments herein may be human.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분화(Differentiation)"는 세포가 특별한 기능을 갖는 특정한 세포나 조직의 복합체 또는 개체의 수준으로 발달하는 것을 의미한다.As used herein, the term “differentiation” refers to the development of cells to the level of a specific cell or tissue complex or entity with a special function.

본 명세서 내에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 이러한, 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(speroid)와 차이를 가지며, 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자 별 모델로 이용될 수 있다. As used herein, the term “organoid” refers to a small culture that recapitulates both the form and function of a tissue or organ. More specifically, organoids must contain one or more cell types among the various types of cells that make up an organ or tissue, must be able to reproduce the special functions of each organ, and must be able to reproduce the special functions of each organ, and the cells must cluster together to form an organ spatially. It should be organized in a similar form. Organoids differ from spheroids in that they form a system rather than a simple collection of cells, and can be used as a patient-specific model for new drug development, artificial organs, disease treatments, and disease treatment.

본 명세서 내에서 사용되는 용어 "배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 다양한 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.The term "medium" used within this specification refers to the growth of various cells in vitro, containing essential elements for cell growth and proliferation, such as sugars, amino acids, various nutrients, serum, growth factors, and minerals. and mixtures for propagation.

이때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM) "은 세포의 증식, 분화 및 사멸 등의 여러가지 세포 대사경로에서 영향을 미치는 신호를 제공하는데 중요한 역할을 하는 3차원 구조의 조직의 발달에 지지체를 의미한다. 세포외 기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자(biochemical factors)들을 저장하고, 공급해줌과 동시에 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있다. 세포외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물로서, 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)과 같은 구조체 단백질(structural protein), GAG(glycosaminoglycan)과 같은 다당류, 세포의 부착을 돕는 부착 단백질(adhesive proteins) 및 성장인자들을 포함하고 있다. 이러한, 세포외 기질은 유래되는 조직 및 세포에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다. At this time, the term “extracellular matrix (ECM)” used in this specification refers to a three-dimensional tissue that plays an important role in providing signals that affect various cellular metabolic pathways such as cell proliferation, differentiation, and death. stands for support in the development of The extracellular matrix stores and supplies the biochemical factors necessary for cell growth and differentiation, while also providing a physical environment that cells can recognize. The extracellular matrix is a product produced by the cells that make up each tissue according to their needs, including structural proteins such as collagen and elastin, polysaccharides such as GAG (glycosaminoglycan), and other substances that help cells adhere. Contains adhesive proteins and growth factors. This extracellular matrix is composed of different components depending on the tissue and cells from which it is derived, and has special physical properties.

오가노이드 배양에 대표적으로 이용되는 세포외기질은 마트리겔(Matrigel), 하이드로겔(Hidrogel) 등이 있으나 다른 성장인자의 첨가가 필요하고 시간이 많이 소요되는 문제점이 있다. 본 발명의 발명자들은 이를 극복한 오가노이드 배양용 세포외기질을 개발하였으며 KR10-2021-0145017, KR10-2022-0152904 의 특허출원을 참고하여 이해될 수 있다.Extracellular matrices typically used for organoid culture include Matrigel and Hydrogel, but they have the problem of requiring the addition of other growth factors and taking a lot of time. The inventors of the present invention have developed an extracellular matrix for organoid culture that overcomes this, and can be understood by referring to the patent applications of KR10-2021-0145017 and KR10-2022-0152904.

본 발명의 일 실시예에 따른 '인체 세포외기질'은 본 발명의 발명자들이 개발한 오가노이드 배양용 세포외기질(ECM)로서 3차원 세포배양용 ECM일 수 있다. 3차원 세포배양용 ECM에 관한 설명은 상술한 특허출원에 기재된 모든 내용을 공유할 수 있다. The 'human extracellular matrix' according to an embodiment of the present invention is an extracellular matrix (ECM) for organoid culture developed by the inventors of the present invention, and may be an ECM for 3D cell culture. The description of the ECM for 3D cell culture can be shared with all the contents described in the above-mentioned patent application.

구체적으로 3차원 세포배양용 ECM은 인체 피부 진피의 섬유아세포를 배양하여 패치를 획득하고, 획득된 인체 유래 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리한 다음 탈세포화한 후 수득된 세포외기질(ECM)일 수 있다. 수득된 세포외기질은 콜라겐(collagne), 액티닌(actinin) 및 액틴-결합 유사 단백질(filamin-C)을 포함하고, 나노 섬유(nano fiber)가 뒤엉킨 형태일 수 있다. 즉, 종래의 파우더 형태의 세포외기질이 배양 플레이트 표면에 코팅된 상태에서 세포를 배양하는 방식에서 나아가, 본 발명에 따른 섬유 형태의 세포외기질은 부유성을 갖는 세포의 모든 표면적을 감싸 배양됨에 따라 안정적으로 생체 내 환경을 가장 유사하게 모사하고, 단시간 내에 충분한 양으로 획득될 수 있다. Specifically, ECM for 3D cell culture is an extracellular matrix (ECM) obtained by culturing fibroblasts from the dermis of human skin to obtain a patch, treating the obtained human-derived fibroblast patch with proteolytic enzymes, and then decellularizing it. It can be. The obtained extracellular matrix contains collagen, actinin, and actin-binding-like protein (filamin-C), and may be in the form of tangled nanofibers. That is, in addition to the conventional method of culturing cells with a powder-type extracellular matrix coated on the surface of a culture plate, the fiber-type extracellular matrix according to the present invention covers the entire surface area of floating cells and is cultured. Accordingly, it can stably simulate the in vivo environment as closely as possible and be obtained in sufficient quantities within a short period of time.

더욱 구체적으로, 본원발명의 3차원 세포배양용 ECM은 섬유아세포(fibroblast) 및 세포외기질을 포함하는 섬유아세포 패치(patch)가 형성되도록, 섬유아세포를 자극 배지(stimulation medium)에서 배양하는 단계, 형성된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계, 단백질 분해효소가 처리된 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계, 섬유아세포 패치에서 섬유아세포가 탈세포화(decellularization)되도록, 냉동된 섬유아세포 패치를 해동하는 단계 및 탈세포화된 섬유아세포 패치로부터 세포외 기질을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, 자극 배지에서 배양하는 단계에서, 자극 배지는 0.01 내지 2 mM의 아스코르빅 산(ascorvic acid)을 포함하고 있을 수 있다.More specifically, the ECM for 3D cell culture of the present invention includes the steps of culturing fibroblasts in a stimulation medium so that a fibroblast patch containing fibroblasts and extracellular matrix is formed; Processing the formed fibroblast patch with a proteolytic enzyme, freezing the protease-treated fibroblast patch, and thawing the frozen fibroblast patch so that the fibroblasts in the fibroblast patch are decellularized. and obtaining extracellular matrix from the decellularized fibroblast patch. At this time, in the step of culturing in the stimulation medium, the stimulation medium may contain 0.01 to 2 mM ascorvic acid.

보다 구체적으로, 아스코르빅산(Ascorbic acid)은 산화방지제로 procollagen 합성에 관여하며, type 1 콜라겐생산의 증가와 관련된 보조인자(Cofactor)이다. 아스코르빅산은 in vitro에서 지방세포, 조골세포, 연골세포와 같은 다양한 세포 증식을 자극 및 조절할 수 있다. 나아가, 특정 농도의 아스코르빅산을 첨가할 경우, 세포 성장 촉진제로 작용하여 세포의 증식력이 증가되고, DNA의 합성까지 촉진시킬 수 있다. 그러나, 아스코르빅산의 농도가 적절하지 못할 경우, 오히려 세포의 증식력을 억제시키고, 세포 독성(Cytotoxic)을 가짐으로 세포 자살(Apoptosis)를 일으킬 수 있다. 이에, 세포의 증식력 즉, 세포외 기질의 합성 및 배출을 향상시킬 수 있는 적정 아스코르빅산의 농도는 0.01 내지 1 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 보다 바람직한 아스코르빅산의 농도는 0.1 내지 1 mM일 수 있다.More specifically, ascorbic acid is an antioxidant that is involved in procollagen synthesis and is a cofactor associated with increased type 1 collagen production. Ascorbic acid can stimulate and regulate the proliferation of various cells such as adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes in vitro. Furthermore, when ascorbic acid is added at a certain concentration, it acts as a cell growth promoter, increases cell proliferation, and even promotes DNA synthesis. However, if the concentration of ascorbic acid is not appropriate, it may inhibit cell proliferation and be cytotoxic, causing apoptosis. Accordingly, the appropriate concentration of ascorbic acid that can improve the proliferation of cells, that is, the synthesis and excretion of extracellular matrix, may be 0.01 to 1 mM, but is not limited thereto, and a more preferable concentration of ascorbic acid is 0.1 to 1 mM. It may be 1mM.

나아가, 자극 배지는 아스코르빅산을 포함하는 배지임에 따라, 기초가 되는 기본 배지를 포함하고 있다. 예를들어, 기본 배지는 세포가 살아가기 위해 필요한, 당, 아미노산 및 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 제조된 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12, MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 및 FBS (Fetal bovine serum) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 DMEM/F-12일 수 있다.Furthermore, since the stimulation medium is a medium containing ascorbic acid, it contains the basic medium as a basis. For example, basic medium is a mixture containing sugars, amino acids, and water necessary for cells to live, excluding serum, nutrients, and various growth factors. The basic medium of the present invention can be artificially synthesized and used, or a commercially produced medium can be used. For example, commercially prepared media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), DMEM/F-12, Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α -May include, but are not limited to, MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, and FBS (Fetal bovine serum), and are preferably DMEM/F. It could be -12.

나아가, 자극 배지는, 0.0001 내지 0.001 %의 아세틱산(acetic acid)을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Furthermore, the stimulation medium may further include 0.0001 to 0.001% of acetic acid, but is not limited thereto.

또한, 자극 배지에서 배양하는 단계에서, 배양 기간은 3 내지 20주(weeks) 중 적어도 하나의 기간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 6 내지 12주 중 적어도 하나의 기간일 수 있다.Additionally, in the step of culturing in a stimulation medium, the culture period may be at least one period of 3 to 20 weeks, but is not limited thereto, and preferably may be at least one period of 6 to 12 weeks. .

이에, 전술한 배양하는 단계를 통하여, 섬유아세포는 아스코르빅산에 의하여 자극(stimulation)되어 세포외 기질을 생산 및 방출할 수 있으며, 섬유아세포 및 세포외 기질을 포함하는 섬유아세포 패치가 형성될 수 있다.Accordingly, through the above-described culturing step, fibroblasts can be stimulated by ascorbic acid to produce and release extracellular matrix, and a fibroblast patch containing fibroblasts and extracellular matrix can be formed. there is.

이때, 세포외 기질을 생산 및 방출하는 섬유아세포는 세포외 기질과 콜라겐을 합성하는 생물학적 세포의 한 종류로서, 동물조직에서 구조적 틀을 만드는 가장 흔합 결합조직이며, 심장 조직과 같은 다양한 조직으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 섬유아세포는 힘줄(tendon), 인대(ligament), 근육, 피부, 치주, 각막, 연골(cartilage), 뼈, 간, 혈관, 심장, 소장, 대장 및 추간판(intervertebral disc) 중 적어도 하나로부터 유래될수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, fibroblasts, which produce and release extracellular matrix, are a type of biological cell that synthesizes extracellular matrix and collagen, and are the most common connective tissue that creates the structural framework in animal tissue, and can be obtained from various tissues such as heart tissue. You can. For example, fibroblasts can be found in at least one of tendon, ligament, muscle, skin, periodontium, cornea, cartilage, bone, liver, blood vessel, heart, small intestine, large intestine, and intervertebral disc. It may be derived from, but is not limited to.

다시, 배양하는 단계 이후, 섬유아세포 패치로부터 세포외 기질만을 추출하기 위한, 탈세포화(decellularization) 과정이 수행될 수 있으며, 탈세포화를 위한 과정으론 단백질 분해효소를 처리하는 단계, 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계 및 섬유아세포 패치를 해동하는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 세포 배양 즉 생체소재로 사용될 세포외 기질은 특정 세포가 생리학적 특성을 유지하기 위하여, 세포외 기질의 3차원적 구조와 생리활성 물질들을 최대한 많이 보유하여야 한다. 이에, 면역 거부반응을 일으킬 수 있는 항원성이 제거되어야 함에 따라, 구조체 역할을 세포를 제외한 나머지는 모두 제거하는 탈세포화 과정이 필수적일 수 있다.Again, after the culturing step, a decellularization process may be performed to extract only the extracellular matrix from the fibroblast patch, and the decellularization process includes treatment with proteolytic enzymes and freezing the fibroblast patch. It may include the step of thawing the fibroblast patch and the step of thawing the fibroblast patch. Furthermore, the extracellular matrix to be used for cell culture, that is, as a biomaterial, must have as many three-dimensional structures and bioactive substances as possible in order for specific cells to maintain their physiological characteristics. Accordingly, as antigens that can cause immune rejection must be removed, a decellularization process that removes everything except cells that serve as structures may be essential.

이에, 형성된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 단백질 분해효소는 0.01 내지 1 %의 트립신(trypsin)일 수 있으나, 바람직하게는, 0.25 %의 트립신일 수 있다. 그러나, 단백질 분해효소는 이에 제한되는 것은 아니며, 섬유아세포 및 세포외 기질간의 결합 단백질을 분해할 수 있는 단백질 분해효소를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해효소는 콜라제네이즈(Collagenase), 엘라스테이즈(Elastase), 디스페이즈(Dispase), 프로테아제(Protease), 펩신(Pepsin), 레닌(Rennin), 키모트립신(Chymotrypsin), 에렙신(Erepsin), 엔테로키네이즈(Enterokinase), 펩티데이스(Peptidase) 및 프로티네이즈(Proteinase) 등을 포함할 수 있다.Accordingly, a step of treating the formed fibroblast patch with a proteolytic enzyme may be performed. At this time, the proteolytic enzyme may be 0.01 to 1% trypsin, but is preferably 0.25% trypsin. However, proteolytic enzymes are not limited to this and may include all proteolytic enzymes capable of decomposing binding proteins between fibroblasts and extracellular matrix. For example, proteolytic enzymes include Collagenase, Elastase, Dispase, Protease, Pepsin, Rennin, Chymotrypsin, and Erepsin. (Erepsin), Enterokinase, Peptidase, Proteinase, etc.

그 다음, 단백질 분해효소가 처리된 섬유아세포 패치를 냉동시키는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 냉동시키는 단계는 -10 ℃이하의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Next, a step of freezing the proteolytic enzyme-treated fibroblast patch may be performed. At this time, the freezing step may be performed at a temperature of -10°C or lower, but is not limited thereto.

그 다음, 섬유아세포 패치에서 섬유아세포가 탈세포화되도록, 냉동된 섬유아세포 패치를 해동하는 단계가 수행될 수 있다. 이때, 해동하는 단계는, 2시간 이상 동안 실온(room temperature)에서 수행될 수 있다.A step may then be performed to thaw the frozen fibroblast patch, such that the fibroblasts in the fibroblast patch are decellularized. At this time, the thawing step may be performed at room temperature for 2 hours or more.

이에, 전술한 탈세포화(decellularization) 과정을 통하여, 섬유아세포 패치로부터 섬유아세포가 유출되어, 섬유아세포 및 기타 세포들을 포함하지 않는 세포외 기질만이 수득할 수 있다.Accordingly, through the above-described decellularization process, fibroblasts are exuded from the fibroblast patch, and only extracellular matrix that does not contain fibroblasts and other cells can be obtained.

한편, 탈세포화(decellularization) 과정은 전술한 냉동 및 해동을 포함하지 않더라도, 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은 탈세포화를 위한 과정으로 단백질 분해효소를 처리하는 단계 이후, 탈세포화 버퍼(decellularization buffer)를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이때, 탈세포화 버퍼는 Triton-X 또는 EDTA를 포함할 수 있다. 그러나, 탈세포화 버퍼의 구성은 전술한 Triton-X 또는 EDTA에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 분야에서 상업적으로 이용되는 비이온성 계면 활성 성분이 모두 포함될 수 있다.Meanwhile, the decellularization process can be performed even if it does not include the above-described freezing and thawing. More specifically, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include the step of treating a decellularization buffer after treating a proteolytic enzyme as a decellularization process. In this case, the decellularization buffer may include Triton-X or EDTA. However, the composition of the decellularization buffer is not limited to the above-described Triton-X or EDTA, and may include all nonionic surfactant ingredients commercially used in the field of the present invention.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 해동하는 단계 이후, 탈세포화가 완전히 이루어지지 않을 경우, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.Furthermore, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include the step of treating the thawed fibroblast patch with a protease if decellularization is not completely achieved after the thawing step. there is.

이때, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계에서 단백질 분해효소는 전술한 단백질 분해효소와 동일한 조건일 수 있으며, 이후 전술한 과정과 동일한 과정을 통하여 탈세포화가 이루어질 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 해동된 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하는 단계는 냉동 및 해동하는 단계가 수행되지 않고, 37 ℃의 항온수조에서 섬유아세포 패치에 단백질 분해효소 및 PBS를 첨가하여 교반과 함께 수행될 수 있다. 나아가, 이때, PBS에는 3 %의 triton-X 및 0.05 %의 EDTA가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.At this time, in the step of treating the thawed fibroblast patch with a proteolytic enzyme, the proteolytic enzyme may be under the same conditions as the proteolytic enzyme described above, and then decellularization may be achieved through the same process as the above-mentioned process. However, it is not limited to this, and for example, the step of treating the thawed fibroblast patch with a proteolytic enzyme does not involve freezing and thawing, but rather involves treating the fibroblast patch with a proteolytic enzyme and a protease in a constant temperature water bath at 37°C. This can be done with agitation by adding PBS. Furthermore, at this time, the PBS may contain 3% triton-X and 0.05% EDTA, but is not limited thereto.

더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 수득하는 단계 이후, 수득된 세포외기질을 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 동결건조하는 단계를 통하여, 수득된 세포외 기질의 유통 및 공급이 용이할 수 있다.Furthermore, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may further include, but is not limited to, the step of freeze-drying the obtained extracellular matrix after the obtaining step. Through these steps, distribution and supply of the obtained extracellular matrix can be facilitated.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외 기질의 제조 방법은, 아스코르빅산 단 한종류의 화학 물질 첨가와 냉동 및 해동이라는 간단한 과정만으로 세포외 기질을 생산할 수 있음에 따라, 종래의 세포외 기질의 생산 방법보다 경제적일 수 있다.Accordingly, the method for producing an extracellular matrix according to an embodiment of the present invention can produce an extracellular matrix with only a simple process of adding ascorbic acid and freezing and thawing, compared to the conventional extracellular matrix. It can be more economical than the substrate production method.

본 발명의 일 실시예에 따른 갑상선 오가노이드 제조방법은 전술한 인체 세포외기질 및 손쉽게 구할 수 있는 갑상선 세포주를 기반으로 세포주 유래 갑상선 오가노이드의 생산을 저비용 및 고효율로 달성시킬 수 있다. The method for producing thyroid organoids according to an embodiment of the present invention can achieve the production of cell line-derived thyroid organoids at low cost and high efficiency based on the above-described human extracellular matrix and easily available thyroid cell lines.

신장 height 근위proximal 세뇨관 tubules 오가노이드organoid , 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법, its preparation method and drug evaluation method using it

이하에서는 도 1 내지 3b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 1 to 3B, a kidney proximal tubule organoid according to an embodiment of the present invention, a method for producing the same, and a drug evaluation method using the same will be described in detail.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 제조 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다. 이때, 설명의 편의를 위하여, 도 2a 내지 3b를 참조하여 설명하도록 한다. Figure 1 exemplarily shows the procedure of a method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, for convenience of explanation, description will be made with reference to FIGS. 2A to 3B.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 제조 방법은 3차원 세포 배양 방법에 기초하여 입체적인 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법으로써, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 형성하기 위한 제 1 배양하는 단계 및 형성된 오가노이드를 성장시키기 위한 제 2 배양하는 단계를 포함할 수 있다.Referring to Figure 1, the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention is a manufacturing method for forming three-dimensional kidney proximal tubule organoids based on a three-dimensional cell culture method. It may include a first culturing step to form and a second culturing step to grow the formed organoid.

제 1 배양하는 단계는 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 형성되도록 신장 근위 세뇨관 상피세포주를 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 제 1 배양 배지에서 배양하는 단계이다. 보다 구체적으로, 제 1 배양하는 단계는 근위 세뇨관 상피세포(주)들과 인체 세포외기질이 함께 서로 융합되어 세포들 사이에 구분이 사라지면서 밀착 연접(tight junction)이 일어나고, 자가 조직화(self-organization)가 일어나면서 오가노이드가 형성되는 단계일 수 있다. The first culturing step is a step of culturing the renal proximal tubular epithelial cell line in a first culture medium containing human extracellular matrix (ECM) to form renal proximal tubular organoids. More specifically, in the first culture step, the proximal tubular epithelial cells (main) and the human extracellular matrix fuse together, the distinction between cells disappears, tight junctions occur, and self-organization (self-organization) occurs. This may be the stage in which organoids are formed as organization occurs.

이때, 신장 근위 세뇨관 상피세포주는 상업적으로 이용되는 RPTEC/TERT1 세포주(cell line)로, 인간 신장 근위 세뇨관 상피세포주를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상업적으로 이용가능한 모든 신장 근위 세뇨관 상피세포주가 이용될 수 있다. 또한, 신장 근위 세뇨관 상피세포주는 상업적으로 이용되는 세포주 뿐만 아니라, 생체 신장으로부터 직접 수득된 신장 근위 세뇨관 상피세포주가 이용될 수 있다.At this time, the renal proximal tubular epithelial cell line is the commercially available RPTEC/TERT1 cell line, which may mean, but is not limited to, a human renal proximal tubular epithelial cell line, and is not limited to all commercially available renal proximal tubular epithelial cell lines. can be used. Additionally, renal proximal tubular epithelial cell lines, as well as commercially available cell lines, can be used as renal proximal tubular epithelial cell lines obtained directly from living kidneys.

제 1 배양 배지는 인체 세포외기질(ECM)을 필수적으로 포함하는 배지를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 제 1 배양 배지는 세포외기질, 아미노산, 아세트산, 글루타맥스, 아스코르빅산, B27 및 IWR-1 중 적어도 하나를 포함하는 기본 배양 배지일 수 있으며, 전술한 구성을 포함하며 상업적으로 이용되는 ORG 3D solution을 포함하는 배지를 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The first culture medium may refer to a medium that essentially contains human extracellular matrix (ECM). More specifically, the first culture medium may be a basic culture medium containing at least one of extracellular matrix, amino acids, acetic acid, glutamax, ascorbic acid, B27, and IWR-1, and may include the above-mentioned composition and a commercially available culture medium. It may be a medium containing ORG 3D solution used, but is not limited thereto.

이때, 제 1 배양 배지의 세포외기질은 인체 피부 진피에서 유래한 섬유아세포로부터 생산된 세포외기질로써, 인체 피부 진피에서 유래한 섬유아세포를 배양하여 패치를 획득하고, 획득된 패치에 단백질 분해효소를 처리하여 탈세포화한 후 수득될 수 있다. 나아가, 수득된 세포외기질은 콜라겐(collagne), 액티닌(actinin) 및 액틴-결합 유사 단백질(filamin-C)을 포함하고, 나노 섬유(nano fiber)가 뒤엉킨 형태일 수 있다. 즉, 나노 섬유 형태의 세포외기질은 신장 근위 세뇨관 상피세포(주)와 빠르게 혼합되고, 세포의 모든 표면적을 감싸 배양됨에 따라 안정적으로 생체 내 환경을 가장 유사하게 모사하여 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 단기간 내에 형성할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법은 전술한 세포외기질을 포함함에 따라, 저비용 및 고효율로 단시간 내에 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 형성 및 생산할 수 있다.At this time, the extracellular matrix of the first culture medium is an extracellular matrix produced from fibroblasts derived from human skin dermis. A patch is obtained by culturing fibroblasts derived from human skin dermis, and a proteolytic enzyme is added to the obtained patch. It can be obtained after treatment and decellularization. Furthermore, the obtained extracellular matrix contains collagen, actinin, and actin-binding-like protein (filamin-C), and may be in the form of tangled nanofibers. In other words, the extracellular matrix in the form of nanofibers is rapidly mixed with kidney proximal tubule epithelial cells (mainly), and as it covers the entire surface area of the cells and is cultured, it stably mimics the in vivo environment to produce kidney proximal tubule organoids in a short period of time. can be formed within. Accordingly, the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention includes the above-described extracellular matrix, and thus can form and produce kidney proximal tubule organoids in a short period of time at low cost and high efficiency.

나아가, 제 1 배양 배지의 기본 배양 배지는 BME(Basal medium Eagle's), MEM(Minimum essential medium), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), DMEM/F12, HAM'S F-10, HAM'S F-12, MEDIUM 199 및 RPMI 1640 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상업적으로 이용되는 다양한 기본 배양 배지가 이용될 수 있다. Furthermore, the basic culture medium of the first culture medium is BME (Basal medium Eagle's), MEM (Minimum essential medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), DMEM/F12, HAM'S F-10, HAM'S F-12, MEDIUM 199, and It may include at least one of RPMI 1640, but is not limited thereto, and various commercially available basic culture media can be used.

제 1 배양하는 단계에서 신장 근위 세뇨관 상피세포주 및 제 1 배양 배지는 1 : 1 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 제 1 배양 배지 1mL을 기준으로 신장 근위 세뇨관 상피세포주는 1 x 105 내지 1 x 107 세포수로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In the first culture step, the renal proximal tubular epithelial cell line and the first culture medium may be included in a 1:1 ratio, but are not limited to this, and preferably, based on 1 mL of the first culture medium, the renal proximal tubular epithelial cell line is 1:1. It may include, but is not limited to, x 10 5 to 1 x 10 7 cells.

제 1 배양하는 단계는 약 1 시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 종래의 오가노이드 형성은 수주 이상의 기간이 소요되었다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법은 3일 이내의 단 시간 내에 빠르게 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 형성될 수 있는 종래의 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 제조 방법의 한계를 극복한 방법일 수 있다. The first culturing step may be performed for at least one period of about 1 hour to 3 days, but is not limited thereto. In this regard, conventional organoid formation takes several weeks or more. However, the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention overcomes the limitations of the conventional method for producing kidney proximal tubule organoids in which kidney proximal tubule organoids can be formed quickly within a short time of less than 3 days. That could be one way.

나아가, 제 1 배양하는 단계가 수행된 후 3일(약 72시간) 이내에, 생체 내 신장과 동일한 바이오마커가 발현되어 생체 신장의 병태생리학적 기능 및 반응을 모사할 수 있는 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 형성(생성)될 수 있다. Furthermore, within 3 days (about 72 hours) after the first culturing step is performed, a kidney proximal tubule organoid that expresses the same biomarkers as the kidney in vivo and can mimic the pathophysiological function and response of the kidney in vivo is created. It can be formed (created).

한편, 제 1 배양하는 단계에 의하여 형성된 오가노이드들은 100 μm 미만의 크기를 가질 수 있으며, 이의 크기는 실험 또는 임상적인 약물(화합물) 평가에 있어, 오가노이드의 반응을 현미경으로 관찰하기에 충분하지 않을 수 있다. 나아가, 제 1 배양하는 단계에 의하여 형성된 오가노이드들은 각각의 크기 및 성숙도가 상이할 수 있음에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법은 균질한 특성을 가진 오가노이드 즉, 크기가 균일하고 동일한 바이오마커 발현을 포함하는 오가노이드 형성을 위하여, 제 2 배양하는 단계를 포함할 수 있다. Meanwhile, the organoids formed by the first culturing step may have a size of less than 100 μm, and this size is not sufficient to observe the reaction of the organoids under a microscope in experimental or clinical drug (compound) evaluation. It may not be possible. Furthermore, as the organoids formed by the first culturing step may have different sizes and degrees of maturity, the method for producing renal proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention produces organoids with homogeneous characteristics, that is, In order to form organoids that are uniform in size and contain the same biomarker expression, a second culture step may be included.

즉, 제 2 배양하는 단계는 형성된 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 성장(성숙)하도록, 오가노이드를 제 2 배양 배지에서 배양하는 단계이다. That is, the second culturing step is a step of culturing the organoids in the second culture medium so that the formed kidney proximal tubule organoids grow (mature).

이때, 제 2 배양 배지는 제 1 배양 배지의 기본 배양 배지일 수 있다. 예를 들어, 제 2 배양 배지는 기본 배양 배지로써, BME(Basal medium Eagle's), MEM(Minimum essential medium), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), DMEM/F12, HAM'S F-10, HAM'S F-12, MEDIUM 199 및 RPMI 1640 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상업적으로 이용되는 다양한 기본 배양 배지가 제 2 배양 배지로써 이용될 수 있다. At this time, the second culture medium may be the basic culture medium of the first culture medium. For example, the second culture medium is a basic culture medium, such as BME (Basal medium Eagle's), MEM (Minimum essential medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), DMEM/F12, HAM'S F-10, HAM'S F-12, It may include at least one of MEDIUM 199 and RPMI 1640, but is not limited thereto, and various commercially available basic culture media can be used as the second culture medium.

제 2 배양하는 단계의 기간 동안 제 2 배양 배지는 3일에 한번씩(1회/3일) 교체될 수 있다. During the period of the second culturing step, the second culture medium may be replaced once every three days (once/3 days).

제 2 배양하는 단계는 약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The second culturing step may be performed for at least one period of about 3 to 50 days, but is not limited thereto.

한편, 본 발명의 제 2 배양하는 단계에 의하여 성장되는 오가노이드들은 약 7일차(약 168 시간) 전후로 약 100 μm 이상의 크기(지름)를 가질 수 있다. 즉, 균일하고 높은 재현성을 가지는 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 약 7일 이상의 배양 기간에 의하여 형성(생산)될 수 있다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 상업적으로 이용되기 위한 제 2 배양하는 단계의 기간은 약 7일 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Meanwhile, organoids grown by the second culturing step of the present invention may have a size (diameter) of about 100 μm or more around day 7 (about 168 hours). That is, uniform and highly reproducible kidney proximal tubule organoids can be formed (produced) over a culture period of about 7 days or more. Accordingly, the period of the second culture step for commercial use of the kidney proximal tubule organoid of the present invention may be about 7 days or more, but is not limited thereto.

나아가, 본 발명의 제 2 배양하는 단계가 수행된 7일차 이상의 신장 근위 세뇨관 오가노이드은 모두 균질한 특성 즉, 동일한 바이오마커를 발현하고 있다.Furthermore, all kidney proximal tubule organoids on the 7th day or more after the second culturing step of the present invention were performed had homogeneous characteristics, that is, expressed the same biomarkers.

보다 구체적으로, 도 2a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 바이오마커에 대한 형광 이미지가 도시된다. 이때, 현미경 관찰된 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 약 21일 차의 오가노이드이다. More specifically, referring to Figure 2A, a fluorescence image for biomarkers of kidney proximal tubule organoids according to a method of producing kidney proximal tubule organoids according to one embodiment of the present invention is shown. At this time, the kidney proximal tubule organoid according to an embodiment of the present invention observed under a microscope is an organoid of about 21 days.

본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 OAT, F-actin, Na+/K+ ATPase, E-cadherin, 8-OHdG 및 Vimentin 포함할 수 있다.Kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention may include OAT, F-actin, Na+/K+ ATPase, E-cadherin, 8-OHdG, and Vimentin.

먼저, 도 2a의 (a)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 OAT1을 발현하는 것으로 나타난다. OAT은 유기 음이온 운반체(organic anion transporter, OAT)로써, 내인성 혹은 외인성 유기 음이온을 체외로 배출하는 역할을 하며, 유기 음이온의 배출뿐만 아니라, 임상적으로 중요한 유기 음이온 약물, 항-HIV 치료 약물, 항암제, 항생제, 항고혈압 제제 및 항염증성 약물 등 다양한 약물이나 uremic toxin과 같은 대사물질을 체내에서 수송 및 배출할 수 있다. First, referring to (a) of FIG. 2A, the kidney proximal tubule organoid according to an embodiment of the present invention appears to express OAT1. OAT is an organic anion transporter (OAT), which plays a role in excreting endogenous or exogenous organic anions out of the body. In addition to excreting organic anions, it is also used as a clinically important organic anion drug, anti-HIV treatment drug, and anticancer drug. , various drugs such as antibiotics, antihypertensive agents, and anti-inflammatory drugs, or metabolites such as uremic toxin can be transported and excreted from the body.

이러한, OAT는 OAT1, OAT2, OAT3, OAT4, OAT5 및 URAT1의 아형(OAT family)을 포함하고 있으며, 이들의 발현 분포는 조직 및 세포에 따라 상이할 수 있으나, OAT 아형은 주로 신장에서 발현되며 일부 간, 뇌, 및 태반에서 관찰된다. OAT family 중 OAT1은 근위 세뇨관 기저외측막에서 주로 발현되며, PAH 수송체 및 OA/dicarboxylate 교환체로서 OA를 혈액에서 근위 세뇨관 상피세포 내로 수송하고 있다. 보다 구체적으로, OAT1은 신장에서 3차 수송 기작(tertiary transport mechanism)을 사용하여 유기 음이온들을 기저측세포막(basolateral membrane)을 통해 이동시킨 후, 소변과 함께 배출하게 한다. OAT includes the following subtypes (OAT family): OAT1, OAT2, OAT3, OAT4, OAT5, and URAT1. Their expression distribution may differ depending on the tissue and cell, but OAT subtypes are mainly expressed in the kidney and some It is observed in the liver, brain, and placenta. Among the OAT family, OAT1 is mainly expressed in the basolateral membrane of the proximal tubule, and as a PAH transporter and OA/dicarboxylate exchanger, it transports OA from the blood into the epithelial cells of the proximal tubule. More specifically, OAT1 uses a tertiary transport mechanism in the kidney to move organic anions through the basolateral membrane and then excrete them with urine.

나아가, OAT1은 요세관에서 근위 세뇨관에서만 발현되며, alpha-ketoglutarate와 같은 dicarboxylate, cyclic nucleotide, prostaglandin, urate, 및 여 러 약제 등 100가지가 넘는 물질의 수송에 관여하고 있다. 즉, 신장의 주요 기능인 체내 약물을 포함하는 다양한 대사물질 수송 및 배출을 모사하기 위해선, OAT1의 발현이 매우 중요할 수 있다. 일반적으로 신장 상피세포는 배양 과정에서 이러한 OAT1 및 이를 포함하는 OAT family의 발현이 감소되며, 신장 조직에 대한 특성이 상실된다. 이와 마찬가지로, 종래의 신장 오가노이드 또한, OAT1 및 이를 포함하는 OAT family의 발현이 감소되어, 신장 근위 세뇨관의 병태생리학적 특성을 대변할 수 없었다. 이에, 종래에서는 인위적으로 OAT1 및 이를 포함하는 OAT family를 과발현시킨 세포주가 이용되어 왔다. Furthermore, OAT1 is expressed only in the proximal tubules of the urinary tubules and is involved in the transport of over 100 substances, including dicarboxylates such as alpha-ketoglutarate, cyclic nucleotides, prostaglandins, urate, and various drugs. In other words, the expression of OAT1 may be very important to simulate the transport and excretion of various metabolites, including drugs in the body, which are the main functions of the kidney. Generally, during the culture process, kidney epithelial cells lose the expression of OAT1 and the OAT family including it, and their characteristics for kidney tissue are lost. Likewise, conventional kidney organoids also had reduced expression of OAT1 and the OAT family including it, and could not represent the pathophysiological characteristics of the renal proximal tubules. Accordingly, conventionally, cell lines that artificially overexpress OAT1 and the OAT family including it have been used.

그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 OAT1 및 이를 포함하는 OAT family의 과발현 유도 없이, OAT1가 발현 및 유지되는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 신장 세포주를 통한 오가노이드 배양 과정에서 신장 근위 세뇨관의 특성이 상실되지 않고, 유지 및 향상되어 생체 내 신장 조직(기관)을 대변할 수 있는, 모사도 높은 오가노이드임을 의미할 수 있다. However, in the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention, OAT1 is expressed and maintained without inducing overexpression of OAT1 and the OAT family including it. In other words, the kidney proximal tubule organoid of the present invention does not lose the characteristics of the kidney proximal tubules during the organoid culture process using kidney cell lines, but maintains and improves them, so it can represent kidney tissue (organ) in vivo, and has a high degree of mimicry. This may mean that it is an organoid.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 도시된 바와 같이, OAT1가 생체 내 신장에서와 같이 외측막(lateral)에 존재하는 것을 나타난다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 OAT1의 발현양 뿐만 아니라 발현 위치에 기초하여 다양한 약물의 효능 및 독성 평가를 수행할 수 있다. Furthermore, as shown, the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention shows that OAT1 is present in the lateral membrane as in the kidney in vivo. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can evaluate the efficacy and toxicity of various drugs based on not only the expression amount of OAT1 but also the expression location.

그 다음, 도 2a의 (b)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 F-actin을 발현하는 것으로 나타난다. F-actin은 세포골격 요소로써, 세포가 조직으로 형성됨에 있어 이의 구조 형성 등에 관여할 수 있다. 예를 들어, F-actin은 신장 내 족세포(podocyte)를 사구체 기저막에 연결시키며, 일련의 연결 연결 단백질을 통해 족세포를 세극막에 부착시킬 수 있다. 이에, F-actin의 발현은 신장 조직의 구조 형성에 있어 매우 중요하며, 이의 발현 양상에 의하여 신장 기능의 다양한 변화를 관찰할 수 있다. Next, referring to (b) of FIG. 2A, the kidney proximal tubule organoid according to one embodiment of the present invention appears to express F-actin. F-actin is a cytoskeletal element that can participate in the structure formation of cells as they form tissues. For example, F-actin connects podocytes in the kidney to the glomerular basement membrane, and a series of connecting proteins can attach podocytes to the slit membrane. Accordingly, the expression of F-actin is very important in the structural formation of kidney tissue, and various changes in kidney function can be observed depending on its expression pattern.

본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 도시된 바와 같이, F-actin이 생체 내 신장에서와 같이 상피세포, 내피세포 및 사구체 기저막과 같은 영역에 존재하는 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 F-actin의 발현양 뿐만 아니라 발현 위치에 기초하여 다양한 약물의 효능 및 독성 평가를 수행할 수 있다. As shown, the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention contains F-actin in areas such as epithelial cells, endothelial cells, and glomerular basement membrane, as in the kidney in vivo. appears to exist. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can evaluate the efficacy and toxicity of various drugs based on not only the expression amount of F-actin but also the expression location.

그 다음, 도 2a의 (c)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 Na+/K+ ATPase를 발현하는 것으로 나타난다. Na+/K+ ATPase는 기저막에 위치하여 세포 내 Na 및 K를 유지시킨다. 보다 구체적으로, 신장의 근위관은 신장의 요산(uric acid) 운송을 담당하며, 요산의 재흡수가 주로 일어하는 곳이다. 근위 신장 관상피세포(Proximal Renal Tubular Epithelial Cells, PTECs)는 요산을 배출하고, 이온 및 유산 운송 채널을 발현함에 따라, 미토콘드리아 및 리소좀이 풍부하게 포함되어 있다. 이때, 신장 근위 세뇨관 상피세포에서의 요산 수송(uric acid transporter)의 추진력은 세관 상피 기저(tubule epithelium basolateral)에 존재하는 Na+/K+ ATPase에서 발생된다. Na+/K+ ATPase의 주요 기능은 신장 내 전해질 및 액체의 항상성을 제어하는 것임에 따라, 신장 오가노이드에서의 Na+/K+ ATPase의 발현은 매우 중요할 수 있다. Next, referring to (c) of FIG. 2A, the kidney proximal tubule organoid according to one embodiment of the present invention appears to express Na+/K+ ATPase. Na+/K+ ATPase is located in the basement membrane and maintains intracellular Na and K. More specifically, the proximal duct of the kidney is responsible for the transport of uric acid to the kidney and is where uric acid reabsorption primarily occurs. Proximal Renal Tubular Epithelial Cells (PTECs) are rich in mitochondria and lysosomes, as they excrete uric acid and express ion and lactic acid transport channels. At this time, the driving force of uric acid transporter in renal proximal tubular epithelial cells is generated from Na+/K+ ATPase present at the tubule epithelium basolateral. As the main function of Na+/K+ ATPase is to control electrolyte and fluid homeostasis in the kidney, expression of Na+/K+ ATPase in kidney organoids may be very important.

나아가, 신장 오가노이드에서의 Na+/K+ ATPase는 발현 유무뿐만 아니라, 이의 위치 또한 매우 중요할 수 있다. 보다 구체적으로, Na+/K+ ATPase는 세뇨관 및 간질액과의 Na+/K+ 평형을 유지해야함에 따라, 상피세포막(기저막)에 존재해야 하며, 이의 위치 변경은 약물 및 질병에 의한 신장 근위 세뇨관의 병태생리학적 변화를 대변할 수 있다. Furthermore, not only the presence or absence of Na+/K+ ATPase expression in kidney organoids, but also its location may be very important. More specifically, Na+/K+ ATPase must be present in the epithelial cell membrane (basement membrane) as it must maintain Na+/K+ balance with the tubule and interstitial fluid, and its location change is associated with the pathophysiology of the renal proximal tubule due to drugs and diseases. It can represent academic change.

이와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 도시된 바와 같이, Na+/K+ ATPase의 발현이 내강을 감싸고 있는 상피세포막(basolateral)에 존재하는 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 Na+/K+ ATPase의 발현양 뿐만 아니라 발현 위치에 기초하여 다양한 약물의 효능 및 독성 평가를 수행할 수 있다. In this regard, as shown in the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention, the expression of Na+/K+ ATPase is present in the epithelial cell membrane (basolateral) surrounding the lumen. It appears that it does. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can evaluate the efficacy and toxicity of various drugs based not only on the expression level of Na+/K+ ATPase but also on the expression location.

그 다음, 도 2a의 (d)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 E-cadherin을 발현하는 것으로 나타난다. E-cadherin은 세포 간의 첩착을 유지하는 cadherin 계열의 분자로써, 특히, 신장의 근위 세뇨관 상피세포에서 주로 발현되어 상피세포간 연결을 안정적으로 유지하는 중요한 단백질이다. 약물 또는 질병에 의하여 신장 근위 세뇨관 상피세포의 특성이 변화되면, 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT)가 활성화되어, 섬유화, 암의 침윤 및 전이와 같은 병리적 변화 현상이 관찰될 수 있다. 이에, E-cadherin의 변화는 병리적 현상에 의하여 발생됨에 따라, 이에 기초하여 신장 근위 세뇨관 상피 세포의 기능 및 구조 변화를 예측할 수 있다. 즉, E-cadherin의 발현은 신장 근위 세뇨관에서 약물 및 질병에 의한 병태생리학적 기능을 예측할 수 있는 중요한 바이오마커이다. Next, referring to (d) of FIG. 2A, the kidney proximal tubule organoid according to one embodiment of the present invention appears to express E-cadherin. E-cadherin is a cadherin family molecule that maintains adhesion between cells. In particular, it is an important protein that is mainly expressed in the proximal tubular epithelial cells of the kidney and stably maintains the connection between epithelial cells. When the characteristics of kidney proximal tubular epithelial cells are changed by drugs or diseases, epithelial-mesenchymal transition (EMT) is activated, and pathological changes such as fibrosis, cancer invasion, and metastasis can be observed. there is. Accordingly, as changes in E-cadherin occur due to pathological phenomena, changes in function and structure of renal proximal tubular epithelial cells can be predicted based on this. In other words, the expression of E-cadherin is an important biomarker that can predict pathophysiological functions caused by drugs and diseases in the renal proximal tubule.

이와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 도시된 바와 같이, E-cadherin의 발현이 내강을 감싸고 있는 상피세포에 존재하는 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 E-cadherin의 발현에 기초하여 다양한 약물의 효능 및 독성 평가를 수행할 수 있다. In this regard, as shown in the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention, the expression of E-cadherin appears to be present in the epithelial cells surrounding the lumen. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can evaluate the efficacy and toxicity of various drugs based on the expression of E-cadherin.

그 다음, 도 2a의 (e)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 8-OHdG를 발현하는 것으로 나타난다. 8-OHdG(8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine)는 DNA 손상의 주요 산화적 변형 제품 중 하나로써, 라디칼(radical)에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)에 대한 병리학적 마커이다. 8-OHdG 발현의 증가는 세포의 노화 및 암 등을 포함하는 다양한 질환과 연관될 수 있으며, 신장 근위 세뇨관에서의 8-OHdG 발현의 증가는 신장의 산화적 스트레스가 증가되어 신장의 기능 상실과 같은 다양한 질병이 초래될 수 있다. 이에, 8-OHdG 발현의 변화(증가)는 병리적 현상을 초래하거나, 병리적 현상에 의하여 발생됨에 따라, 이에 기초하여 신장 근위 세뇨관의 병태생리학적 변화를 예측할 수 있다. Next, referring to (e) of FIG. 2A, it appears that the renal proximal tubules express 8-OHdG according to one embodiment of the present invention. 8-OHdG (8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine) is one of the major oxidative modification products of DNA damage and is a pathological marker for oxidative stress caused by radicals. Increased 8-OHdG expression can be associated with various diseases, including cellular aging and cancer, and increased 8-OHdG expression in the renal proximal tubules increases oxidative stress in the kidney, leading to loss of kidney function. Various diseases can result. Accordingly, changes (increases) in 8-OHdG expression cause pathological phenomena or are caused by pathological phenomena, and based on this, pathophysiological changes in the renal proximal tubules can be predicted.

이와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 도시된 바와 같이, 8-OHdG의 발현이 내강을 감싸고 있는 상피세포에 존재하는 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 8-OHdG의 발현에 기초하여 다양한 약물의 효능 및 독성 평가를 수행할 수 있다. In this regard, as shown in the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoid according to an embodiment of the present invention, the expression of 8-OHdG appears to be present in the epithelial cells surrounding the lumen. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can evaluate the efficacy and toxicity of various drugs based on the expression of 8-OHdG.

그 다음, 도 2a의 (f)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 Vimentin을 발현하는 것으로 나타난다. Vimentin은 중간 사이즈의 섬유 단백질로써, 주로 중간엽 및 신경 조직의 세포에서 발견된다. 질병 및 약물에 의하여 상피세포가 손실되고, 이에, 상피세포가 이동성을 가진 중간엽 세포로 변환되는 EMT가 활성화되면 vimentin이 증가된다. 이와 관련하여, 생체 내 신장이 질환 특히, 신경병증이나 섬유화가 발생하였을 경우, 신장 근위 세뇨관의 EMT가 활성화되어 신장 근위 세뇨관 상피세포에서도 vimentin이 상향조절(upregulation)된다. 이에, vimentin 발현의 변화(증가)는 병리적 현상을 초래하거나, 병리적 현상에 의하여 발생됨에 따라, 이에 기초하여 신장 근위 세뇨관의 병태생리학적 변화를 예측할 수 있다. Next, referring to (f) of FIG. 2A, it appears that the kidney proximal tubules express Vimentin according to an embodiment of the present invention. Vimentin is a medium-sized fibrous protein found mainly in cells of mesenchymal and nervous tissue. When epithelial cells are lost due to disease or drugs, and EMT, which converts epithelial cells into mobile mesenchymal cells, is activated, vimentin increases. In this regard, when kidney disease, especially neuropathy or fibrosis, occurs in vivo, EMT in the renal proximal tubules is activated, and vimentin is upregulated in the renal proximal tubular epithelial cells. Accordingly, as changes (increases) in vimentin expression cause pathological phenomena or are caused by pathological phenomena, pathophysiological changes in the renal proximal tubules can be predicted based on this.

이와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 도시된 바와 같이, vimentin의 발현이 내강을 감싸고 있는 상피세포에 존재하는 것으로 나타난다. 이에, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 vimentin의 발현에 기초하여 다양한 약물의 효능 및 독성 평가를 수행할 수 있다. In this regard, as shown in the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention, the expression of vimentin appears to be present in the epithelial cells surrounding the lumen. Accordingly, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can evaluate the efficacy and toxicity of various drugs based on the expression of vimentin.

결국, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 전술한 바와 같이, Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin을 포함함에 따라, 생체 내 신장과 동일한 특성(바이오마커 발현)을 모사할 수 있어 다양한 약물에 의한 신장의 병태생리학적 변화를 예측할 수 있다. Ultimately, the kidney proximal tubule organoid of the present invention contains Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin, and F-actin, as described above, and thus has the same properties (biomarkers) as the kidney in vivo. expression) can be simulated, making it possible to predict pathophysiological changes in the kidney caused by various drugs.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 바이오마커의 발현뿐만 아니라, 생체 신장과 유사한 구조를 가진다.Furthermore, the kidney proximal tubule organoid according to the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention not only expresses biomarkers but also has a structure similar to that of a living kidney.

보다 구체적으로, 도 2b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 구조에 대한 형광 이미지가 도시된다. More specifically, referring to Figure 2B, a fluorescence image of the structure of a kidney proximal tubule organoid according to a method of producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention is shown.

본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 내강(lumen), 및 내강을 감싸고 있는 상피세포층을 포함하고, 둥근 구상의 입체적 형태인 것으로 나타난다.The renal proximal tubular organoid according to the method for producing renal proximal tubular organoid according to an embodiment of the present invention includes a lumen and an epithelial cell layer surrounding the lumen, and appears to have a round spherical three-dimensional shape.

결국, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 생체 내 신장과 동일한 구조를 모사할 수 있어 다양한 약물에 의한 신장의 병태생리학적 변화를 보다 용이하게 예측할 수 있다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 생체 대응성이 높은 생체 유사 모델로 이용될 수 있다.Ultimately, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can mimic the same structure as the kidney in vivo, making it possible to more easily predict pathophysiological changes in the kidney caused by various drugs. In other words, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can be used as a biosimilar model with high biocorrespondence.

다시 도 1을 참조하면, 앞서 도 2a 및 2b에서 전술된 바와 같이, 제 2 배양하는 단계에서의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 약물의 효능 및 독성을 평가할 수 있는 바이오마커 및 구조를 포함함에 따라, 제 2 배양하는 단계는 약물을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법을 포함할 수 있다.Referring again to FIG. 1, as previously described in FIGS. 2A and 2B, the kidney proximal tubule organoids in the second culture step contain biomarkers and structures that can evaluate the efficacy and toxicity of the drug. 2 The culturing step may further include the step of treating the drug. That is, the present invention may include a drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.

보다 구체적으로, 도 3a을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법의 절차를 예시도가 도시된다. More specifically, referring to FIG. 3A, an exemplary diagram showing the procedure of a drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention is shown.

본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 제조 방법의 제 2 배양 단계에 포함되어 동시에 수행될 수 있다.The drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention can be performed simultaneously by being included in the second culture step of the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention.

즉, 일부 오가노이드들을 하나 이상의 다른 용기에 분류하여 제 2 배양을 수행함과 동시에, 특정 용기에 약물을 추가하며 배양될 수 있다. That is, some organoids can be sorted into one or more different containers to perform a second culture, and at the same time, drugs can be added to a specific container and cultured.

이때, 약물의 처리(treatment group, 처리군)는 배양 7일차에 수행되는 것이 바람직할 수 있다. 이에, 도 3a에서의 T0은 제 2 배양에서 7일차의 신장 근위 세뇨관 오가노이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용자의 실험 목적 및 계획에 따라 다양한 기간의 제 2 배양에서의 오가노이드가 이용될 수 있다. 예를 들어, 신장 근위 세뇨관의 발달 과정에서의 약물의 효능 및 독성 평가가 요구되는 경우, 제 2 배양의 0일차의 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 T0에서 이용될 수 있다.At this time, it may be desirable to perform drug treatment (treatment group) on the 7th day of culture. Accordingly, T0 in Figure 3a may be the kidney proximal tubule organoid on day 7 in the second culture, but is not limited thereto, and organoids in the second culture for various periods of time may be used depending on the user's experimental purpose and plan. It can be. For example, if evaluation of the efficacy and toxicity of a drug during the development of the kidney proximal tubules is desired, kidney proximal tubule organoids from day 0 of the second culture can be used at T0.

본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법은 도시된 바와 같이, 21일간 오가노이드에 약물이 처리되어 수행될 수 있으며, 약물 처리 기간은 21일에 제한되는 것은 아니며, 사용자의 실험 목적 및 계획에 따라 다양하게 설정될 수 있다. As shown, the drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention can be performed by treating the organoids with a drug for 21 days, and the drug treatment period is not limited to 21 days. It can be set in various ways depending on the user's experiment purpose and plan.

21일일 간의 약물 처리가 수행된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 형태학적 및 단백질 발현 분석이 수행될 수 있다. The kidney proximal tubule organoids of the present invention that underwent drug treatment for 21 days can be subjected to morphological and protein expression analysis.

형태학적 분석으로는 현미경적 구조 분석이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Morphological analysis may include, but is not limited to, microscopic structural analysis.

단백질 발현 분석으로는 Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나의 바이오마커의 발현 수준에 기초한 분석이 이용될 수 있으며, 이의 발현양 및 발현 위치 여부에 따라 약물의 효능 또는 독성 여부가 결정될 수 있다. As protein expression analysis, analysis based on the expression level of at least one biomarker among Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin, and F-actin can be used, as well as the amount and location of expression. Depending on this, the efficacy or toxicity of the drug can be determined.

즉, 약물 처리군(treatment, Che-1, Che-2)의 바이오마커 발현 수준을 약물 미처리군(control, CTL)의 바이오마커 발현 수준과 비교하여, 약물을 효능 또는 독성 여부가 결정될 수 있다. In other words, the efficacy or toxicity of a drug can be determined by comparing the biomarker expression level of the drug-treated group (treatment, Che-1, Che-2) with the biomarker expression level of the drug-untreated group (control, CTL).

이에, 도 3b를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법에 대한 흐름도가 도시되며, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법은 신장 근위 세뇨관 오가노이드에 약물을 처리하는 단계(S310) 및 약물이 처리된 오가노이드의 바이오마커에 대한 발현 수준에 기초하여 약물의 효능 또는 독성 여부를 결정하는 단계(S320)을 포함할 수 있다.Accordingly, referring to Figure 3b, a flow chart of a drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention is shown, and drug evaluation using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. The method may include treating a kidney proximal tubule organoid with a drug (S310) and determining whether the drug is effective or toxic based on the expression level for a biomarker in the drug-treated organoid (S320). there is.

보다 구체적으로, 결정하는 단계(S320)는 약물이 처리된 오가노이드의 바이오마커 발현 수준을 약물 미처리군 또는 대조군(control)에서의 바이오마커 발현 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 비교 결과에 기초하여 약물의 효능 또는 독성 여부가 결정될 수 있다.More specifically, the determining step (S320) may include comparing the biomarker expression level of the drug-treated organoid with the biomarker expression level in the drug-untreated group or control group, and the comparison result may include: Based on this, the efficacy or toxicity of the drug can be determined.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 특정 바이오마커들이 생체 신장 기관에서의 동일한 위치에 발현될 수 있다. 이에, 결정하는 단계(S320)는 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase 또는 E-cadherin의 발현 위치에 기초하여, 약물의 효능 또는 독성 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. Furthermore, the kidney proximal tubule organoid according to one embodiment of the present invention can express specific biomarkers at the same location in the living kidney organ. Accordingly, the determining step (S320) may further include determining the efficacy or toxicity of the drug based on the expression location of Na+/K+ ATPase or E-cadherin in the organoid treated with the drug.

더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법에 기초하여, 약물 스크리닝이 가능할 수 있다. 이에, 본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 평가 방법과 동일한 단계를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 스크리닝 방법이 포함될 수 있다. Furthermore, drug screening may be possible based on the drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. Accordingly, the present invention may include a drug screening method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention, which includes the same steps as the drug evaluation method according to an embodiment of the present invention.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법은 생체 신장을 높은 유사도로 재현가능한 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 제공할 수 있으며, 이는 다양한 약물 평가 및 스크리닝 방법에 이용가능할 수 있다. Therefore, the method for producing kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention can provide kidney proximal tubule organoids that can reproduce living kidneys with a high degree of similarity, which can be used in various drug evaluation and screening methods.

실시예Example 1. 본 발명의 일 1. Work of the present invention 실시예에In the example 따른 신장 Height according to 근위proximal 세뇨관 tubules 오가노이드를Organoids 이용한 약물 평가 방법 Drug evaluation methods used

이하에서는, 도 4 내지 9를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 평가 방법 즉, 오가노이드의 바이오마커 발현에 기초한 약물 평가 방법에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다. Hereinafter, with reference to FIGS. 4 to 9, a drug evaluation method using kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention, that is, a drug evaluation method based on biomarker expression in organoids, will be described in detail.

이때, 도 4 내지 9의 약물 평가는 약 7일차의 약 100 μm의 지름의 크기를 가지는 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 이용되었으며, 약물의 처리는 21일간 수행되었다. 나아가, 약물이 처리되어 배양되는 기간 동안 3일에 한번씩 배지가 교체되었다. At this time, the drug evaluation in FIGS. 4 to 9 used the kidney proximal tubule organoid of the present invention with a diameter of about 100 μm at about 7 days, and drug treatment was performed for 21 days. Furthermore, the medium was changed every three days during the drug treatment and culture period.

나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약물"은, 생물의 이익을 위해 생리적 시스템 또는 질병 상태를 변화시키거나 검토하기 위해서 사용되는 모든 물질을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 비타민제, 호르몬제, 금속염류, 백신, 항혈청제, 항생제, 화학요법제제, 강심제, 혈압조절제, 항히스타민제, 스테로이드제, 해독제 및 조영제로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Furthermore, the term “drug” as used herein may include any substance used to change or modify a physiological system or disease state for the benefit of an organism. More specifically, it may include at least one of the group consisting of vitamins, hormones, metal salts, vaccines, antiserum agents, antibiotics, chemotherapy agents, cardiotonic agents, blood pressure regulators, antihistamines, steroids, antidotes, and contrast agents. It is not limited.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 OAT1 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다. 이때, 오가노이드에 처리된 약물은 bisphenol A이며, 10 νM의 농도로 처리되었다. Figure 4 is a microscopic image of drug evaluation based on OAT1 expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, the drug treated with the organoid was bisphenol A, and it was treated at a concentration of 10 νM.

대조군(vehicle CTL) 및 처리군(bisphenol A)은 모두 OAT1를 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 독성 평가에 이용된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 OAT1를 발현함에 따라, 신장의 유기 음이온 수송 과정의 병태생리학적 기능을 대변(모사)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.Both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (bisphenol A) appear to express OAT1. In other words, this may mean that the kidney proximal tubule organoid of the present invention used for toxicity evaluation expresses OAT1, thereby mimicking the pathophysiological function of the kidney's organic anion transport process.

본 발명에서의 실험결과는 대조군(vehicle CTL)과 처리군(bisphenol A)에서 모두 OAT1 발현이 생체 신장과 마찬가지로 상피세포층에 발현되는 것으로 나타난다. 본 실험에서 사용된 bisphenol A는 신장 근위 세뇨관 오가노이드에서 OAT1을 포함한 OAT의 발현이 대조군과 차이를 나타내지 않았다. 하지만, 본 발명인 신장근위세뇨관 오가노이드를 활용하여 OAT1을 포함한 OAT에 영향을 주는 약물에 대한 평가 가능성을 제시할 수 있고, 이의 변화를 통하여 표적 약물이 신장 기능 중 유기 음이온 배출 및 대사에 어떠한 영향을 미치는지 예측할 수 있다. The experimental results of the present invention show that OAT1 is expressed in the epithelial cell layer in both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (bisphenol A), similar to the living kidney. The bisphenol A used in this experiment did not show any difference in the expression of OAT, including OAT1, in kidney proximal tubule organoids compared to the control group. However, by using the renal proximal tubule organoid of the present invention, it is possible to present the possibility of evaluating drugs that affect OAT, including OAT1, and how the target drug affects organic anion excretion and metabolism during kidney function through changes in this. The impact can be predicted.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 F-actine 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다. 이때, 오가노이드에 처리된 약물은 과거 방수 및 코팅을 위한 제품에 널리 사용되었으나, 독성으로 인하여 현재 사용이 금지된 과불화화합물 중 PFOA 와 PFDA이며, 각각 10 μM로 21일간 처리되었다. Figure 5 is a microscopic image of drug evaluation based on F-actine expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, the drugs treated with the organoids were PFOA and PFDA, which are perfluorinated compounds that were widely used in waterproofing and coating products in the past, but are currently banned due to their toxicity, and were treated at 10 μM each for 21 days.

대조군(vehicle CTL) 및 처리군(PFOA, PFDA)은 모두 F-actin을 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 독성 평가에 이용된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 F-actine를 발현함에 따라, 질병 및 약물에 의한 신장의 구조적 변화를 대변(모사)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.Both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (PFOA, PFDA) appear to express F-actin. In other words, the kidney proximal tubule organoid of the present invention used for toxicity evaluation expresses F-actine, which means that it can represent (simulate) structural changes in the kidney caused by disease and drugs.

대조군(vehicle CTL)의 F-actine은 생체 신장과 마찬가지로 상피세포층에 명확히 발현되는 것으로 나타난다. 그러나, 처리군(PFOA, PFDA)의 F-actine은 오가노이드의 내강까지 발현되는 것으로 확인이 되며, 이는 처리군에서 신장근위세뇨관의 내강이 좁아져 정상적 기능을 하기 어렵다는 것을 간접적으로 증명한다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 F-actine의 발현이 약물 처리에 의하여 차이를 가지는 것으로 나타남에 따라, 이의 변화를 통하여 표적 약물이 신장의 구조적 세포의 기능 및 대사에 어떠한 영향을 미치는지 예측할 수 있다.F-actine in the control group (vehicle CTL) appears to be clearly expressed in the epithelial cell layer, similar to the living kidney. However, F-actine in the treatment group (PFOA, PFDA) was confirmed to be expressed even in the lumen of the organoid, which indirectly proves that the lumen of the renal proximal tubule in the treatment group was narrowed, making it difficult to function normally. In other words, as the kidney proximal tubule organoid of the present invention appears to have differences in the expression of F-actine depending on drug treatment, it is possible to predict how the target drug affects the function and metabolism of structural cells of the kidney through this change. You can.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 Na+/K+ ATPase 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다. 이때, 오가노이드에 처리한 약물은 PFOA 와 PFDA이며, 각각 10 μM로 21일간 처리되었다. Figure 6 is a microscopic image of drug evaluation based on Na+/K+ ATPase expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, the drugs treated with the organoids were PFOA and PFDA, each treated at 10 μM for 21 days.

대조군(vehicle CTL) 및 처리군(PFOA, PFDA)은 모두 Na+/K+ ATPase를 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 독성 평가에 이용된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 Na+/K+ ATPase를 발현함에 따라, 신장 내 전해질 및 액체의 항상성의 병태생리학적 기능을 대변(모사)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.Both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (PFOA, PFDA) appear to express Na+/K+ ATPase. In other words, the kidney proximal tubule organoid of the present invention used for toxicity evaluation expresses Na+/K+ ATPase, which means that it can represent (simulate) the pathophysiological function of electrolyte and liquid homeostasis in the kidney. .

대조군(vehicle CTL)의 Na+/K+ ATPase는 생체 신장과 마찬가지로 상피세포 기저막(basolateral)에 발현되는 것으로 나타난다. 그러나, 처리군(PFOA, PFDA)의 Na+/K+ ATPase는 오가노이드의 세포질(cytosol)에 발현되는 것으로 나타난다. 특히, long chain PFAC로서 PFOA 보다 독성이 더 심하다고 알려진 PFDA를 처리한 오가노이드에서 Na+/K+ ATPase 발현은 대조군과 현격한 차이를 보인다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 Na+/K+ ATPase의 발현이 약물 처리에 의하여 차이를 가지는 것으로 나타나며, Na+/K+ ATPase가 막(membrane)에서 세포기질(cytosol)로 이동(translocation)되는 변화 또한 관찰될 수 있다. 결국, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 Na+/K+ ATPase 변화를 통하여 표적 약물이 신장 기능 중 신장 내 전해질 및 액체의 항상성에 어떠한 영향을 미치는지 예측할 수 있다. Na+/K+ ATPase in the control group (vehicle CTL) appears to be expressed on the epithelial cell basement membrane (basolateral), similar to the living kidney. However, Na+/K+ ATPase in the treatment groups (PFOA, PFDA) appears to be expressed in the cytosol of the organoids. In particular, the expression of Na+/K+ ATPase in organoids treated with PFDA, which is a long chain PFAC and is known to be more toxic than PFOA, shows a significant difference from the control group. That is, the kidney proximal tubule organoid of the present invention appears to have differences in the expression of Na+/K+ ATPase due to drug treatment, and a change in the translocation of Na+/K+ ATPase from the membrane to the cytosol. It can also be observed. Ultimately, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can predict how a target drug affects electrolyte and liquid homeostasis in the kidney during kidney function through changes in Na+/K+ ATPase.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 E-cadherin 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다. 이때, 오가노이드에 처리된 약물은 PFOA 와 PFDA이며, 각각 10 μM로 21일간 처리되었다. Figure 7 is a microscopic image of drug evaluation based on E-cadherin expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, the drugs treated with the organoids were PFOA and PFDA, each treated at 10 μM for 21 days.

대조군(vehicle CTL) 및 처리군(PFOA, PFDA)은 모두 E-cadherin를 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 독성 평가에 이용된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 E-cadherin를 발현함에 따라, 신장 내 상피세포 및 이의 EMT와 관련된 병태생리학적 기능을 대변(모사)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.Both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (PFOA, PFDA) appear to express E-cadherin. In other words, the kidney proximal tubule organoid of the present invention used for toxicity evaluation expresses E-cadherin, which means that it can mimic (mimicking) the pathophysiological functions related to epithelial cells in the kidney and their EMT. .

대조군(vehicle CTL)의 E-cadherin은 생체 신장과 마찬가지로 상피세포층에 발현되는 것으로 나타난다. 그러나, 처리군 중 PFOA는 E-cadherin 발현의 양이 대조군에 비하여 감소되었으며, 처리군 중 PFDA는 오가노이드의 세포기질(cytosol)에 발현이 뚜렷하여 E-cadherin의 기능을 상실하였음을 명백히 보여주고 있다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 정상 상피세포의 세포막에 발현되는 E-cadherin이 약물 처리에 의하여 세포막에 발현되는 양이 감소하거나, 세포막(membrane)에서 세포기질(cytosol)로 이동(translocation)되는 변화 또한 관찰될 수 있다. 결국, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 E-cadherin 변화를 통하여 표적 약물이 신장 기능 중 신장의 상피세포 내 구조적 지지(접착) 및 이에 따른 기능에 어떠한 영향을 미치는지 예측할 수 있다. E-cadherin in the control group (vehicle CTL) appears to be expressed in the epithelial cell layer as in the living kidney. However, among the treatment groups, the amount of E-cadherin expression in PFOA was reduced compared to the control group, and among the treatment groups, PFDA was clearly expressed in the cytosol of the organoid, clearly showing that the function of E-cadherin was lost. there is. That is, in the kidney proximal tubule organoid of the present invention, the amount of E-cadherin expressed on the cell membrane of normal epithelial cells is reduced by drug treatment, or the amount of E-cadherin expressed on the cell membrane is reduced or translocated from the cell membrane to the cytosol. ) changes can also be observed. Ultimately, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can predict how a target drug affects structural support (adhesion) within kidney epithelial cells and subsequent functions during kidney function through changes in E-cadherin.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 8-OHdG 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다. 이때, 오가노이드에 처리된 약물은 과불화화합물 중 사용이 금지된 약물중 하나인 PFOA이며, 10 μM로 21일간 처리되었다. Figure 8 is a microscopic image of drug evaluation based on 8-OHdG expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, the drug treated with the organoids was PFOA, one of the banned perfluorinated compounds, and was treated at 10 μM for 21 days.

대조군(vehicle CTL) 및 처리군(PFOA)은 모두 8-OHdG를 발현하는 것으로 나타났으나, 처리군에서 그 발현이 증가되었음을 관찰할 수 있다. 즉, 독성 평가에 이용된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 8-OHdG를 발현함에 따라, 신장의 산화적 스트레스 와 관련된 병태생리학적 기능을 대변(모사)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.Both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (PFOA) were found to express 8-OHdG, but its expression was observed to be increased in the treatment group. In other words, this may mean that the kidney proximal tubule organoid of the present invention used for toxicity evaluation expresses 8-OHdG, thereby mimicking the pathophysiological functions related to oxidative stress in the kidney.

대조군(vehicle CTL)의 8-OHdG은 생체 신장과 마찬가지로 상피세포층에 매우 적은 양으로 발현되는 것으로 나타난다. 그러나, 처리군(PFOA)의 8-OHdG은 오가노이드의 다양한 위치에 발현되며, 이의 발현양이 증가한 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 8-OHdG의 발현이 약물 처리에 의하여 차이를 가지는 것으로 나타난다. 결국, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 8-OHdG 변화를 통하여 표적 약물의 신장에 대한 독성 여부를 예측(평가)할 수 있다. 8-OHdG in the control group (vehicle CTL) appears to be expressed in a very small amount in the epithelial cell layer, as in living kidneys. However, 8-OHdG in the treatment group (PFOA) was expressed in various locations in the organoid, and its expression level appeared to be increased. That is, the kidney proximal tubule organoids of the present invention appear to have differences in the expression of 8-OHdG depending on drug treatment. Ultimately, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can predict (evaluate) the toxicity of a target drug to the kidney through changes in 8-OHdG.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드의 vimentin 발현에 기초한 약물 평가의 현미경 이미지이다. 이때, 오가노이드에 처리된 약물은 PFOA 와 PFDA이며, 각각 10 μM로 21일간 처리되었다.Figure 9 is a microscopic image of drug evaluation based on vimentin expression in kidney proximal tubule organoids according to an embodiment of the present invention. At this time, the drugs treated with the organoids were PFOA and PFDA, each treated at 10 μM for 21 days.

대조군(vehicle CTL) 및 처리군(PFOA, PFDA)은 모두 vimentin을 발현하는 것으로 나타난다. 즉, 독성 평가에 이용된 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 vimentin를 발현함에 따라, 신장의 병적 상태를 대변(모사)할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.Both the control group (vehicle CTL) and the treatment group (PFOA, PFDA) appear to express vimentin. In other words, this may mean that the kidney proximal tubule organoid of the present invention used for toxicity evaluation expresses vimentin, thereby mimicking the pathological state of the kidney.

대조군(vehicle CTL)의 vimentin은 생체 신장과 마찬가지로 상피세포층에 매우 적은 양으로 발현되는 것으로 나타난다. 그러나, 처리군(PFOA, PFDA)의 vimentin은 오가노이드의 다양한 위치에 발현되며, 이의 발현양이 증가한 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 vimentin의 발현이 약물 처리에 의하여 차이를 가지는 것으로 나타난다. 결국, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 vimentin 변화를 통하여 표적 약물의 신장에 대한 독성 여부 및 이에 따른 신장의 병적 상태를 예측(평가)할 수 있다. Vimentin in the control group (vehicle CTL) appears to be expressed in a very small amount in the epithelial cell layer, similar to the living kidney. However, vimentin in the treatment groups (PFOA, PFDA) was expressed in various locations in the organoids, and its expression level appeared to be increased. That is, the kidney proximal tubule organoids of the present invention appear to have differences in vimentin expression depending on drug treatment. Ultimately, the kidney proximal tubule organoid of the present invention can predict (evaluate) whether a target drug is toxic to the kidney and the resulting pathological state of the kidney through changes in vimentin.

이상의 결과에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 구조적인 형태뿐만 아니라, 특성 즉, 바이오마커의 발현 또한 생체 신장과 매우 유사함에 따라, 보다 생체 대응성이 높은 생체 유사 모델로 이용될 수 있다.According to the above results, the kidney proximal tubule organoid according to an embodiment of the present invention is not only a structural form but also the characteristics, that is, the expression of biomarkers, are very similar to living kidneys, making it a bio-mimetic model with a higher biocorrespondence. It can be used as

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 근위 세뇨관 오가노이드는 약물에 대한 부작용, 독성 및 유효성 평가에 있어 인체 모사 모델로 이용될 수 있으며, 신약 개발 과정에서 후보물질의 독성에 대한 안정성 및 효과 판별 실험에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 약물과 함께 플레이트(용기)에서 반응시킨 뒤, 이의 상태를 현미경적 방법으로 관찰하거나, 단백질 분석 등을 통하여 이의 변화를 확인할 수 있다.Accordingly, the kidney proximal tubule organoid according to an embodiment of the present invention can be used as a human model to evaluate side effects, toxicity, and effectiveness of drugs, and to determine the safety and effectiveness of candidate substances for toxicity in the process of developing new drugs. It can also be used in experiments. For example, after the kidney proximal tubule organoid of the present invention is reacted with a drug in a plate (container), its condition can be observed microscopically, or changes in it can be confirmed through protein analysis, etc.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although embodiments of the present invention have been described in more detail with reference to the accompanying drawings, the present invention is not necessarily limited to these embodiments, and may be modified and implemented in various ways without departing from the technical spirit of the present invention. Accordingly, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention, but rather to explain it, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be interpreted in accordance with the claims below, and all technical ideas within the equivalent scope should be construed as being included in the scope of rights of the present invention.

Claims (19)

신장 근위 세뇨관 상피세포주를 기반으로 제조된, 약물의 효능 또는 독성 평가용 신장 근위 세뇨관 오가노이드(renal proximal tubule organoid)로써,
상기 오가노이드는 내강(lumen), 및
상기 내강을 감싸고 있는 상피세포층을 포함하고,
둥근 구상의 입체적 형태인, 신장 근위 세뇨관 오가노이드.A renal proximal tubule organoid manufactured based on a renal proximal tubule epithelial cell line for evaluating drug efficacy or toxicity.
The organoid has a lumen, and
It includes an epithelial cell layer surrounding the lumen,
Kidney proximal tubular organoids, which are round and spherical in shape. 제 1항에 있어서,
상기 상피세포층은,
Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드. According to clause 1,
The epithelial cell layer is,
A renal proximal tubular organoid containing at least one of Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin, and F-actin. 제 2항에 있어서,
상기 OAT는,
OAT1, OAT2, OAT3, OAT4, OAT5 및 URAT1 중 적어도 하나를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드.According to clause 2,
The OAT is,
A kidney proximal tubule organoid comprising at least one of OAT1, OAT2, OAT3, OAT4, OAT5 and URAT1. 제 2항에 있어서,
상기 Na+/K+ ATPase 및 E-cadherin은
약물 처리에 의하여 상기 상피세포의 세포막 또는 세포기질(cytosol)로 이동(translocation) 가능한, 신장 근위 세뇨관 오가노이드. According to clause 2,
The Na+/K+ ATPase and E-cadherin are
Kidney proximal tubular organoids capable of translocation to the cell membrane or cytosol of the epithelial cells by drug treatment. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 신장 근위 세뇨관 오가노이드에 약물을 처리하는 단계;
상기 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나의 바이오마커에 대한 발현 수준에 기초하여 약물의 효능 또는 독성 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물의 평가 방법. Treating the kidney proximal tubule organoid according to any one of claims 1 to 4 with a drug;
Determining the efficacy or toxicity of the drug based on the expression level of at least one biomarker among Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin, and F-actin in the organoid treated with the drug. A method for evaluating a drug using kidney proximal tubule organoids, comprising the steps: 제 5항에 있어서,
상기 결정하는 단계는,
상기 바이오마커 발현 수준을 약물 미처리군 또는 대조군(control)에서의 바이오마커 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물의 평가 방법. According to clause 5,
The determining step is,
A method for evaluating a drug using kidney proximal tubule organoids, comprising comparing the biomarker expression level with the biomarker expression level in a drug-untreated group or control group. 제 5항에 있어서,
상기 결정하는 단계는,
상기 약물이 처리된 오가노이드의 상기 Na+/K+ ATPase 또는 E-cadherin의 발현 위치에 기초하여,
약물의 효능 또는 독성 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물의 평가 방법.According to clause 5,
The determining step is,
Based on the expression location of the Na+/K+ ATPase or E-cadherin in the drug-treated organoid,
A method for evaluating a drug using kidney proximal tubule organoids, further comprising determining whether the drug is effective or toxic. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 신장 근위 세뇨관 오가노이드에 적어도 하나 이상의 약물을 처리하는 단계;
상기 약물이 처리된 오가노이드의 Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin 및 F-actin 중 적어도 하나의 바이오마커에 대한 발현 수준에 기초하여 약물 후보군을 결정하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 스크리닝 방법. Treating the kidney proximal tubule organoid according to any one of claims 1 to 4 with at least one drug;
Comprising the step of determining drug candidates based on the expression level of at least one biomarker of Na+/K+ ATPase, OAT, E-cadherin, 8-OHdG, Vimentin, and F-actin in the organoid treated with the drug. , Drug screening method using kidney proximal tubule organoids. 제 8항에 있어서,
상기 결정하는 단계는,
상기 바이오마커 발현 수준을 약물 미처리군 또는 대조군(control)에서의 바이오마커 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 스크리닝 방법. According to clause 8,
The determining step is,
A drug screening method using kidney proximal tubule organoids, comprising comparing the biomarker expression level with the biomarker expression level in a drug-untreated group or control group. 제 8항에 있어서,
상기 결정하는 단계는,
상기 약물이 처리된 오가노이드의 상기 Na+/K+ ATPase 또는 E-cadherin의 발현 위치에 기초하여,
약물의 후보군을 결정하는 단계를 더 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 이용한 약물 스크리닝 방법.According to clause 8,
The determining step is,
Based on the expression location of the Na+/K+ ATPase or E-cadherin in the drug-treated organoid,
A drug screening method using kidney proximal tubule organoids, further comprising determining drug candidates. 내강(lumen) 및 상피세포층을 포함하는 신장 근위 세뇨관 오가노이드를 형성하기 위한 제조 방법에 있어서,
신장 근위 세뇨관 오가노이드가 형성되도록 신장 근위 세뇨관 상피세포주를 인체 세포외기질(ECM)을 포함하는 제 1 배양 배지에서 제 1 배양하는 단계, 및
형성된 상기 신장 근위 세뇨관 오가노이드가 성장하도록 상기 오가노이드를 제 2 배양 배지에서 제 2 배양하는 단계를 포함하는, 약물의 효능 또는 독성 평가용 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법.In the manufacturing method for forming renal proximal tubular organoids comprising a lumen and an epithelial cell layer,
first culturing the renal proximal tubular epithelial cell line in a first culture medium containing human extracellular matrix (ECM) to form renal proximal tubular organoids, and
A method of producing kidney proximal tubule organoids for evaluating the efficacy or toxicity of a drug, comprising the step of second culturing the formed kidney proximal tubule organoids in a second culture medium to allow growth of the kidney proximal tubule organoids. 제 11항에 있어서,
상기 ECM은,
3차원 세포 배양용인, 약물의 효능 또는 독성 평가용 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법. According to clause 11,
The ECM is,
Method for producing kidney proximal tubule organoids for 3D cell culture and for evaluating drug efficacy or toxicity. 제 11항에 있어서,
상기 ECM은,
섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고,
탈세포화한 후 수득된, 약물의 효능 또는 독성 평가용 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법. According to clause 11,
The ECM is,
Treat the fibroblast patch with proteolytic enzymes,
Method for preparing kidney proximal tubule organoids obtained after decellularization for evaluating drug efficacy or toxicity. 제 11항에 있어서,
상기 제 1 배양하는 단계는,
약 1시간 내지 3일 중 적어도 하나의 기간 동안 배양하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법.According to clause 11,
The first culturing step is,
A method of producing kidney proximal tubule organoids, comprising culturing for at least one of about 1 hour to 3 days. 제 11항에 있어서,
상기 ECM은,
섬유아세포 패치에 단백질 분해효소를 처리하고,
탈세포화한 후 수득된, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법. According to clause 11,
The ECM is,
Treat the fibroblast patch with proteolytic enzymes,
Method for producing renal proximal tubule organoids obtained after decellularization. 제 11항에 있어서,
상기 신장 근위 세뇨관 상피세포주 및 제 1 배양 배지는,
1:1 비율로 포함되는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법. According to claim 11,
The renal proximal tubule epithelial cell line and the first culture medium,
Method for producing kidney proximal tubule organoids, comprising a 1:1 ratio. 제 11항에 있어서,
상기 제 2 배양하는 단계는,
약 3일 내지 50일 중 적어도 하나의 기간동안 배양하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법.According to clause 11,
The second culturing step is,
A method of producing kidney proximal tubule organoids, comprising culturing for at least one of about 3 to 50 days. 제 11항에 있어서,
상기 제 2 배양하는 단계는,
약물을 처리하는 단계를 더 포함하는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법. According to claim 11,
The second culturing step is,
A method of producing kidney proximal tubule organoids, further comprising processing a drug. 제 18항에 있어서,
상기 약물을 처리하는 단계는,
배양 7일 이내 처음 수행되는, 신장 근위 세뇨관 오가노이드 제조 방법.

According to clause 18,
The step of processing the drug is,
Method for producing renal proximal tubule organoids, first performed within 7 days of culture.
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