KR20240050462A - 항-aav 중화 항체의 검출 및 정량을 위한 신규 시스템 - Google Patents
항-aav 중화 항체의 검출 및 정량을 위한 신규 시스템 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240050462A KR20240050462A KR1020247011255A KR20247011255A KR20240050462A KR 20240050462 A KR20240050462 A KR 20240050462A KR 1020247011255 A KR1020247011255 A KR 1020247011255A KR 20247011255 A KR20247011255 A KR 20247011255A KR 20240050462 A KR20240050462 A KR 20240050462A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- aav
- component
- promoter
- reporter
- luciferase
- Prior art date
Links
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 14
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims abstract description 78
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 167
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 105
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 103
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 102
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 101
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 claims description 94
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 89
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 86
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 79
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 72
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 claims description 50
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 45
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 40
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 claims description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 34
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 29
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 26
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 22
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 21
- 241000186243 Metridia Species 0.000 claims description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 19
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 claims description 17
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 16
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 claims description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 11
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 10
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims description 9
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 7
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 5
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- VGEREEWJJVICBM-UHFFFAOYSA-N phloretin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O VGEREEWJJVICBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N protochatechuic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 3
- WKOLLVMJNQIZCI-UHFFFAOYSA-N vanillic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC=C1O WKOLLVMJNQIZCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- TUUBOHWZSQXCSW-UHFFFAOYSA-N vanillic acid Natural products COC1=CC(O)=CC(C(O)=O)=C1 TUUBOHWZSQXCSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZWTDXYUDJYDHJR-UHFFFAOYSA-N (E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(2,4-dihydroxyphenyl)-2-propen-1-one Natural products OC1=CC(O)=CC=C1C=CC(=O)C1=CC=C(O)C=C1O ZWTDXYUDJYDHJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101000994307 Homo sapiens Protein ITPRID2 Proteins 0.000 claims description 2
- YQHMWTPYORBCMF-UHFFFAOYSA-N Naringenin chalcone Natural products C1=CC(O)=CC=C1C=CC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O YQHMWTPYORBCMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100032831 Protein ITPRID2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 2
- -1 for example Proteins 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 17
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 405
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 89
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 44
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 34
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 102100025907 Dyslexia-associated protein KIAA0319-like protein Human genes 0.000 description 13
- 101001076904 Homo sapiens Dyslexia-associated protein KIAA0319-like protein Proteins 0.000 description 13
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 10
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 10
- 101100377295 Arabidopsis thaliana ZHD11 gene Proteins 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 8
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 6
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 102100034142 Protein GPR108 Human genes 0.000 description 6
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 6
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 4
- 101001015103 Catostomus commersonii Isotocin receptor Proteins 0.000 description 4
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 101001040800 Homo sapiens Integral membrane protein GPR180 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 3
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 3
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 3
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 3
- 101001070470 Homo sapiens Protein GPR108 Proteins 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 101710146168 Protein GPR108 Proteins 0.000 description 3
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 2
- 101100165660 Alternaria brassicicola bsc6 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 101100499295 Bacillus subtilis (strain 168) disA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100226894 Phomopsis amygdali PaGT gene Proteins 0.000 description 2
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 2
- 101100024330 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MSB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 108010038082 heparin proteoglycan Proteins 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 2,3,14,20,22-pentahydroxy-(2β,3β,5β,22R)-Cholest-7-en-6-one Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 0.000 description 1
- 108050003620 Arrestin-C Proteins 0.000 description 1
- 102100026440 Arrestin-C Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000004437 G-Protein-Coupled Receptor Kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091004242 G-Protein-Coupled Receptor Kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 244000249914 Hemigraphis reptans Species 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000858031 Homo sapiens Coxsackievirus and adenovirus receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N Ponasterone A Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@@](O)([C@@H](O)CCC(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 108090000799 Rhodopsin kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 101710102803 Tumor suppressor ARF Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 108010074774 long-wavelength opsin Proteins 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010054609 middle-wavelength opsin Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000017610 release of virus from host Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 개선된 민감도 및 특이성을 갖는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체의 검출 및 정량을 위한 신규 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체의 검출 및 정량화를 위한 신규 2성분 시스템이다. 본 발명은 하기를 포함한다: (i) 항체 반응을 결정하고자 하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 패킹 세포주로서, 이는 바이러스 게놈 또는 전이유전자(transgene) 구조물 내에 태그 서열을 포함하는, 패킹 세포주 및 (ii) 상기 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자-프로모터 구조물을 포함하는 리포터-유전자 세포주, 및 이를 이용하여 캡시드, 바이러스 게놈, 및/또는 테스트 샘플에 포함된 전이유전자 또는 전이유전자 산물에 대해 유도되는 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량하기 위한 방법. 본 발명은 또한 최적의 민감도, 신호 강도 및 생물학적 충실도로 AAV에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 고처리량 스크리닝 방법에 관한 것이다. 더 넓은 의미에서, 본 발명은 또한 진단에서 리포터-유전자 세포주와 조합된 패키징 세포주의 용도에 관한 것이다.
재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 점점 더 많은 유전 질환을 치료하는 데 사용되며 대부분의 경우 AAV 기반 유전자 치료법이 잘 허용되지만 AAV 캡시드, AAV 게놈, 전이유전자 또는 전이유전자 산물에 대한 면역 반응은 전이유전자의 발현 수준 감소 또는 완전한 상실과 연관되어 있으며, 이로 인해 효능 상실이 발생한다(1). 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체의 발생은 일반적으로 유아기에 하나 이상의 AAV 혈청형에 대한 이전 노출(previous exposure) 및 다양한 AAV 혈청형에 대한 항-AAV 항체의 높은 교차 반응성과 관련이 있는 경우가 많다(1,2).
AAV는 단일 가닥 DNA 바이러스로, 그 게놈은 3개의 유전자 rep, cap 및 aap로 구성되며, 그 옆에는 145bp의 역위 말단 반복부(ITR)가 있고, 처음 125개의 뉴클레오티드는 자체적으로 접혀 T자 모양의 헤어핀 루프 2차 구조를 형성하는 회문 서열(palindromic sequence)이다. 상기 ITR은 제2 가닥 합성을 위한 프라이머 역할을 하며 바이러스 복제 또는 전이유전자 발현을 위해 cis에서 요구된다(3). 상기 rep 유전자는 두 개의 서로 다른 프로모터(Rep78/68의 경우 p5, Rep52/40의 경우 p19)를 사용하여 단일 ORF에 의해 인코딩된 4개의 비구조 단백질인 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 인코딩하고 대체 스플라이싱에 의해 생성된다. 상기 Rep78 및 Rep68 단백질은 ITR에 결합하여 게놈 복제에 필요한 반면 Rep52 및 Rep40은 바이러스 복제 중에 바이러스 게놈을 캡시드 내로 패키징하는 역할을 한다. 상기 Rep 단백질은 또한 부위별 게놈 통합에서도 역할을 한다. 상기 cap 유전자는 대체 시작 코돈과 대체 스플라이싱을 사용하여 p40 프로모터의 제어 하에 동일한 ORF에서 전사된 3개의 구조 단백질 Vp1, Vp2 및 Vp3을 인코딩하고 1:1:10 비율로 조립되어 바이러스 캡시드를 형성한다(4). 상기 Aap 유전자는 Cap ORF 내의 대체 판독 프레임으로부터 조립 활성 단백질(AAP: Assembly-Activated Protein)을 인코딩한다. AAP는 AAV 캡시드 단백질을 핵소체(nucleolus)에 위치시키고 3개의 Cap 단백질을 60량체 정이십면체 바이러스 캡시드로 조립한다(3).
rep, cap 및 aap 유전자가 없는 재조합 AAV 벡터는 약 4.8kb의 크기로 제한되며, 의도된 적용에 따라 구성적이거나 조직-특이적일 수 있는 적합한 프로모터, 전이유전자 및 ITR 내에 포함된 폴리 A 테일로 구성된다. AAV는 복제 결함이 있으며 바이러스 복제 또는 전이유전자 발현에 필요한 초기 보조 단백질을 공급하기 위해 보조 바이러스, 보통 아데노바이러스 5를 요구한다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 및 어느 정도의 백시니아 바이러스는 초기 보조 단백질 공급을 위해 아데노바이러스의 존재를 대체할 수 있다(5, 6). 그러나 효율적인 AAV 벡터 생산에 필요한 초기 유전자는 전이유전자-프로모터 구조물과 rep, cap 및 aap 유전자를 인코딩하는 플라스미드 외에 보조 단백질을 발현하는 플라스미드로 적절한 패키징 세포주를 형질감염시킴으로써 공급될 수도 있다(7).
상기 캡시드는 초기에 세포 표면의 탄수화물에 결합함으로써 혈청형-특이적 바이러스-세포 상호작용에서 중요한 역할을 한다. 따라서 AAV 혈청형 2, 3, 및 6은 헤파린 황산염 프로테오글리칸과 결합하고, AAV1, 4, 5, 및 6은 시알산과 결합하며, AAV9은 갈락토스와 결합한다(8). 대부분의 AAV 혈청형은 세포 내재화에 필요한 신규 AAV 수용체(AAVR)의 다양한 부분과 상호작용한다(9). 트랜스-골지체에 위치하는 단백질 GPR108과 같은 추가로 고도로 보존된 G 단백질-결합 수용체가 최근에 확인되었으며, 이는 AAVR 의존적이지만 GPR108에 독립적인 매우 다양한 AAV5 혈청형을 제외하고 모든 AAV 혈청형의 출입에 요구된다(10). 따라서 현재까지 확인된 모든 AAV 혈청형은 세포 형질도입을 위해 AAVR이나 GPR108 또는 AAVR과 GPR108 둘 다를 필요로 한다(9, 10).
AAV 감염은 인간이나 다른 포유동물의 질병과 관련이 없지만 AAV 매개 유전자-치료의 효능은 종종 AAV에 대한 이전 노출 및 다른 혈청형들 사이의 높은 수준의 교차 반응과 관련된 항-AAV 항체의 발생으로 인해 제한되어, 전이유전자의 발현 수준이 감소하거나 완전히 상실되어 효능의 상실을 초래한다. 세포주의 체외 형질도입 전에 테스트 샘플과 함께 배양되는 리포터 AAV 벡터의 사용을 기반으로 하는 세포-기반 분석, 소위 형질도입 저해 분석(transduction inhibition assay)은 종종 높은 감염 다중도(MOI)를 요구하여 민감도가 낮고, 비특이적 효과를 받기 쉬우며, 항체 반응이 결정되는 실제 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 면역 반응의 최선의 대용물이다. 따라서 AAV 감염 및 재조합 AAV 벡터를 사용한 치료 모두에 대한 중화 항체 반응의 검출 및 정량화를 위해 증가된 민감도 및 특이성을 갖는 개선된 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 상술한 선행 기술을 고려하여 이루어졌으며, 본 발명의 목적은 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체의 검출 및 정량을 위해 민감도와 특이성이 향상된 신규 시스템을 제공하는 것이다.
상기 기술적 효과를 얻고, 이와 관련하여 보다 향상된 방법 및 세포주를 제공하기 위해, 본 발명은 이 중에서도 특히 세포주(cell line)에 관한 것이다. 이 세포주는 패키징(packaging) 세포주로 표시될 수 있으며, 제1 구성요소 또는 구성요소 1(Component 1)로 지칭될 수도 있고, 이 모두가 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 패키징 세포주는 하나 이상의 상이한 태그 서열을 포함할 수 있다.
더욱이, 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 패키징 세포주의 하나 이상의 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자 프로모터 구조물을 포함하는 리포터-유전자 세포주에 관한 것이다. 상기 리포터-유전자 세포주는 제2 구성요소로 간주되거나 구성요소 2(Component 2)로 지칭될 수 있으며, 모두 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 일 측면에서, 구성요소 1과 구성요소 2는 함께 기능할 수 있거나 서로 조합하여 사용될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 테스트 샘플에서 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량화하기 위해 구성요소 1 및 구성요소 2를 사용하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 AAV 감염 및 재조합 AAV 벡터를 이용한 치료 모두에 대한 중화 항체 반응의 검출 및 정량화를 위한 개선된 민감도 및 특이성을 위한 구성요소 1 및 구성요소 2의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 반응이 결정되고 바이러스 게놈 또는 전이유전자 구조물 내 태그 서열을 함유하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 패킹 세포주(구성요소 1)를 포함하고, 및 구성요소 1의 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자 프로모터 구조물을 함유하는 리포터-유전자 세포주(구성요소 2)를 포함하는 2성분에 관한 것이며, 및 이를 사용하여 테스트 샘플 내 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 최적의 민감도, 신호 강도 및 생물학적 충실도로 AAV에 대한 면역 반응을 검출하고 모니터링하기 위한 고처리량 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 태그 서열과 관련하여, 본원에 개시된 세포주는 하나 이상의 태그 서열(tag sequence)을 포함할 수 있다. 여러 태그 서열이 존재하는 경우, 상기 태그 서열은 동일할 수도 있고 또는 다를 수도 있다. 또 다른 측면에서, 그리고 여러 태그 서열이 존재하는 경우, 태그 서열 그룹은 동일할 수 있지만 나머지 태그 서열은 다를 수 있다.
일 측면에서, 상기 태그 서열은 예를 들어 AAV 게놈 내에 포함된 태그 서열일 수 있으며, 또는 예를 들어 상기 전이유전자-프로모터 구조물은 Gal4 DNA 결합 도메인이거나 또는 AAV 게놈 내에 포함된 태그 서열이거나 또는 cGMP 특이적 수용체 단백질(CRP)을 인코딩하는 전이유전자-프로모터 구조물이거나, 또는 예를 들어 AAV 게놈 내에 포함된 태그 서열 또는 트랜스-활성인자 VP16에 융합된 트랜스-사일런서 VanR을 인코딩하는 전이유전자 구조물이다.
상기로부터 명백한 바와 같이, 그리고 구성요소 1이 구성요소 2와 조합하여 사용된다는 측면에서, 상기 리포터-유전자 프로모터 구조물을 포함하는 리포터-유전자 세포주는 패키징 세포주의 하나 이상의 태그 서열에 특이적으로 반응함으로써 리포터-유전자 프로모터 구조물이 구성요소 1의 동일하거나 다른 태그 서열 각각에 반응하도록 한다.
구성요소 1: 패키징 세포주.
일 측면에서, 본 발명은 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 발현에 필요한 구성 성분이 일시적 형질감염(transfection)에 의해 공급되거나 바람직하게는 선택된 세포주의 게놈 내로 부분적으로 또는 완전히 통합되어 확립된 패킹 세포주에 관한 것이다. 상기 선택된 세포주는 숙주 세포주로 지칭될 수 있다.
상기 숙주 세포주의 선택은 생물학적 샘플 분석에 대한 안전성 프로파일과 rep 유전자 및 E4orf6의 조절된 발현 후 AAV Rep 단백질의 독성을 견딜 수 있는 세포의 능력에 따라 결정된다(11). 이러한 세포주에는 인간 폐 선암종 세포주 A549(ATCC 카탈로그 # CCL-185) 또는 인간 배아 신장 세포주 HEK293T(ATCC 카탈로그 # ACS-4500)가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
상기 선택된 세포주(숙주 세포주)는 적합한 프로모터의 제어 하에 선택된 전이유전자로 형질감염된다. 상기 프로모터는 원칙적으로 당업계에 공지된 임의의 적합한 프로모터일 수 있다. 일 측면에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉각 초기 프로모터와 같은 구성적 프로모터(constitutive promoter)이거나, 전이유전자의 발현을 조절하는 적절한 조직-특이적 프로모터일 수 있으며, 이는 전이유전자의 원하는 조직-특이적 발현의 함수로서 선택되고, 그리고 AAV2의 ITR 내에 포함된 SV40 또는 대체 폴리아데닐화 부위와 같은 적합한 폴리아데닐화 부위(도 1 참조)로 선택된다. 중요한 것은 구성요소 1의 세포주가, 선택한 특정 재조합 AAV 벡터를 모니터링하기 위해 ITR 내에 태그 서열을 포함한다는 것이다.
상기 숙주 세포는 CMV 최소 프로모터와 같은 구성적 프로모터의 제어 하에 cap 유전자로 추가로 공동 형질감염될 수 있다(도 1에 도시됨). 별도의 플라스미드에서 cap 및 rep 유전자의 발현이 AAV 벡터 생산을 증가시키는 것으로 보고되었기 때문에 상기 숙주 세포는 두 개의 독립적인 플라스미드에서 cap 및 rep 유전자로 공동 형질감염될 수 있다(12).
E1과 E1A 및 E1B ORF를 인코딩하는 유전자는 HEK293T 세포와 달리 A549 세포에서 발현되지 않는다. 따라서, A549 세포를 E1A 유전자로 형질감염시켰고, 이는 E1a 단백질이 Rep, E2 및 E4 유전자를 활성화시켜 세포 독성을 일으키는 것을 방지하기 위해 적합한 유도성 프로모터의 제어 하에 발현되었다. 따라서 실시예 1에서 rep 및 E1 유전자는 FK506 결합 단백질(FKBP)에 융합된 DNA 결합 도메인 ZFHD1의 12배 직렬 반복부(tandem repeat)으로 구성된 라파마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되었다. FKBP-라파마이신-관련 단백질(FRAP)은 HSV-1의 VP16 트랜스-활성인자에 융합되어 라파마이신을 첨가하면 FKBP와 FRAP 사이의 이종-이합체(hetero-dimer) 형성이 유도되어 E1 초기 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현이 엄격하게 제어된다.
Rep78/68의 조절된 발현은 또한 AAV 벡터 생산 수준을 증가시키는 것으로 나타났다(12). E4 orf6 단독을 사용한 HEK293 세포의 형질감염은 아데노바이러스-없는 재조합 AAV 벡터 생산에 충분한 것으로 보고되었지만(13), 초기 단백질 E2A, E4 및 VA RNA는 재조합 AAV의 효율적인 생산에 필요한 것으로 보고되었다(14). 따라서, 일 측면에서, 패키징 세포주는 E2A, E4 및 VA RNA를 발현하는 발현 벡터로 공동 형질감염될 수 있다.
구성요소 2: 리포터 세포주.
일 측면에서, 본 발명은 또한 중화 항체가 정량화될 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 게놈 내에서 태그 서열을 발현하는 바이러스 제제 또는 패키징 세포주 생산 바이러스와 리포터 세포의 접촉이 상기 리포터 세포에 의해 발현되는 리포터-유전자가 활성화되도록 하는 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 포함된 태그 서열(구성요소 1에서 선택된 특정 재조합 AAV 벡터를 모니터링하기 위한 ITR 내의 태그 서열)에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자 세포주의 개발에 관한 것이다. 민감도를 증가시키기 위해 상기 리포터-유전자 세포주는, 세포 표면 AAV 수용체 단독(9), 또는 엔도솜 AAV 수용체 단독(10), 또는 세포 표면 수용체와 엔도솜 AAV 수용체 둘 모두를 사용하여 안정적으로 형질감염될 수 있음이 이해된다. 실시예 1에서 패키징 세포주는, 리포터 세포에서 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 Gal4 상류 활성화 서열(UAS)에 특이적으로 결합할 Gal4 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 태그 서열을 함유하는 전이유전자-프로모터 구조물을 발현한다. 구체적으로 실시예 1에서 AAV-2 반응성 리포터 세포주는 HEK293 숙주 세포에서 FL 리포터-유전자 구조물의 발현을 조절하는 Gal 4 UAS의 5배 직렬 반복부를 포함한다(도 2). 바람직한 일 구현예에서, 상기 AAV-반응성 리포터 세포주는 또한, AAV-유도성 반딧불이 루시퍼라아제 활성의 정규화(normalization)를 허용하는, 도 3에 도시된 SV40 최소 프로모터와 같은 구성적 프로모터의 제어 하에 도 3에 도시된 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 리포터-유전자와 같은 제2 리포터-유전자를 함유할 수 있다. 상기 레닐라 루시퍼라아제(RL) 정규화 유전자를 사용하면 AAV-반응성 반딧불이 루시퍼라아제 및/또는 레닐라 정규화 유전자를 활성화하는 능력을 기반으로 다양한 유형의 인간 혈청을 정의할 수 있다(표 1). 따라서 정상 개체로부터의 두 인간 혈청 HS0 및 HS4의 명백한 중화 효과는, HS0 및 HS4의 두 혈청에 의한 AAV 반응성 FL 리포터-유전자와 레닐라 루시퍼라아제 정규화 유전자 둘 모두의 활성화에 기초한 인간 IV-IgG 풀(pool)의 실제 중화 활성과 구별될 수 있는 반면, 이와 대조적으로 인간 IV-IgG에 의한 FL 활성 단독의 활성화는 세포 독성으로 인한 AAV 활성의 비특이적 저해를 반영한다(도 18-20).
바람직한 일 구현예에서, 상기 리포터 세포주(구성요소 2)는, AAV2 또는 AAV5 cap 단백질 중 하나를 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)와 함께 배양될 때 GAL4-UAS 조절 반딧불이 루시퍼라아제 발현을 상당히 증가시키는 즉각 초기 인핸서 단백질 E4orf6로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염된다(도 7 및 8).
패키징 세포주와 리포터 세포의 상호 작용
일 측면에서, 본 발명은 두 세포주가 서로 상호작용하도록 조합된 구성요소 1 및 구성요소 2에 관한 것이다(도 4 내지 6). 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 본 발명에 따른 패키징 세포에 의해 생성된 바이러스를, +4, 20 또는 37℃ 중 어느 하나 또는 예를 들어 약 +4℃ 내지 약 37℃ 중 다양한 간격의 임의의 온도를 포함하거나 내포하는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 테스트할 샘플(들)과 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉 후, 바이러스 제제 및 샘플(들)을 리포터 세포와 함께 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 18시간 이상 동안 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을 정량화함에 있어서, 마이크로타이터 플레이트의 단일 웰에서 FL 활성 및 RL 활성의 순차적인 정량화를 허용하는, 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질, 또는 임의의 수단에 의해 검출을 가능하게 하는 임의의 다른 적합한 기질, 또는 상업적으로 이용 가능한 기질 Dual-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질을 사용하는, 단계.
(b) +4, 20 또는 37℃ 온도 중 어느 하나 또는 다양한 온도 또는 예를 들어 약 +4℃ 내지 약 37℃ 중 다양한 간격의 임의의 온도를 포함하거나 내포하는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 테스트할 샘플(들)과 바이러스-생산 패키징 세포를 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉 후, 상기 패키징 세포주 및 샘플(들)을 리포터-세포와 함께 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 6 내지 약 18시간 이상 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성 단독의 정량화를 함에 있어서, 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)과 같은 적합한 기질, 또는 Dual-Glo를 사용한 FL 및 RL 활성, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질을 사용하는, 단계.
(c) 상기 바이러스-생산 패키징 세포주를 테스트할 샘플(들) 및 리포터-세포와 접촉시키고 약 37℃에서 다양한 시간, 바람직하게는 약 18시간 이상 직접 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을 정량하는 단계로서, 상기 정량화는 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질, 또는 Dual-Glo를 사용한 FL 및 RL 활성, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질을 사용하는, 단계,
(d) 바이러스-생산 패키징 세포주를 리포터 세포와 함께 적절한 동결-보호 배지에서 적절한 세포 농도로 동결하고, 상기 세포를 해동하여, 상기 패키징 세포/리포터-유전자 세포를 테스트할 샘플과 접촉시키며 및 상기 샘플(들), 패키징 세포-리포터-세포를 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 18시간 이상 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을 정량하는 단계로서, 상기 정량화는 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질, 또는 Dual-Glo를 사용한 FL 및 RL 활성, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질을 사용하는, 단계,
(e) 바람직한 일 구현예에서, 바이러스-생산 패키징 세포주와 리포터 세포를 적절한 동결 보호 배지에서 적절한 세포 농도로 별도로 동결하고, 세포를 해동하여, 상기 바이러스-생산 패키징 세포주를 테스트될 샘플(들)과 접촉시키며, 및 상기 바이러스-생산 패키징 세포주와 상기 샘플(들)을 리포터-세포와 함께 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 6 내지 약 18시간 이상 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을 정량하는 단계로서, 상기 정량화는 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질, 또는 Dual-Glo를 사용한 FL 및 RL 활성, 또는 임의의 수단으로든 검출이 가능한 임의의 다른 적합한 기질을 사용하는, 단계. 냉동 해동 후 사용하는 바이러스-생산 패키징 세포를 사용하면 최종 사용자가 중화 항체가 검출될 특정 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터를 생산할 필요가 없어지며, 바이러스-생산 패키징 세포주를 테스트될 샘플(들)과 접촉시킴으로써 챌린지 바이러스를 추출하고 정제할 필요가 없게된다.
무세포(cell-free) AAV 챌린지 바이러스/재조합 AAV 벡터 또는 AAV 바이러스/AAV 재조합 벡터-생산 패키징 세포는 리포터-유전자 세포주와 상호작용하여 바이러스 흡수, 내재화 및 FL 리포터-유전자의 AAV-혈청형 특이적 활성화를 초래한다. 상기 무세포 챌린지 바이러스 또는 AAV 생산 패키징 세포와 리포터 세포의 초기 상호작용은 아마도 바이러스 방출과 혈청형-특이적 상호작용에서의 세포 표면의 탄수화물과 캡시드의 상호작용에 의해 매개될 가능성이 높다. 따라서 AAV 혈청형 2, 3, 및 6은 헤파린 황산염 프로테오글리칸에 결합하는 것으로 알려져 있고, AAV 혈청형 1, 4, 5, 및 6은 시알산에 결합하고 AAV9는 갈락토스에 결합하는 것으로 알려져 있다(8). 그런 다음 상기 AAV 혈청형은 세포 내재화에 필요한 AAV 수용체(9) 및/또는 트랜스-골지체에 국한된 단백질 GPR108과 같은 신규 G 단백질-결합 수용체(10)와 상호작용한다. 일 구현예에서, 상기 리포터-유전자는 효소를 인코딩한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 리포터는 루시퍼라아제, 예컨대 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 메트리디아(Metridia) 루시퍼라아제, 또는 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규한 루시퍼라아제이다. 또는 용해성 활성 단량체로서 용액에 존재하는 신규 루시퍼라아제 또는 루시퍼라아제나 녹색 형광 단백질(GFP) 강화 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 및 서로 다른 여기/방출 스펙트럼을 나타내는 이의 변이체, 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 또는 이의 다양한 접합체, 분비된 인간 태반 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 또는 이의 다양한 접합체, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 또는 입자, 비드, 분석 플레이트 또는 튜브와 같은 고체 표면에 부착하는 다양한 링커 단백질을 포함하는 다른 단백질과의 융합 단백질이다.
다른 구현예에서, 상기 리포터-유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 유용한 형광 단백질에는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 관련 형광 단백질, 가령 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 및 다양한 여기/방출 스펙트럼을 나타내는 이의 변형체들을 포함한다.
추가 구현예에서 상기 리포터-세포는 AAV 게놈 내에 존재하는 태그 서열 또는 AAV ITR 내에 함유된 전이유전자 프로모터 구조물이 인코딩된 재조합 AAV에 특이적으로 반응하는 키메라 프로모터의 조절 하에 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 리포터-유전자와 같은 제1 리포터-유전자 및 제2 리포터-유전자로 공동 형질감염될 수 있는데, 상기 제2 리포터-유전자는 가령, 세포 수와 무관한 분석 결과를 만들고 세포 손실 또는 접종된 세포 수의 변화로 인한 세포 밀도의 샘플 간 편차를 보상하기 위한 수단을 제공하는 RL 활성 발현의 구성적 수준에 대해 상기 태그 서열 활성화된 FL 활성이 정규화되도록 하는 구성적 프로모터의 제어 하에서의 레닐라 루시퍼라아제(RL)와 같다. RL 활성의 구성적 발현과 관련하여 AAV-활성화된 FL 활성을 정규화하는 능력은 또한 혈청 매트릭스 효과를 보상하는 수단을 제공한다(15). 유용한 구성적 활성 프로모터에는 이에 제한되지는 않지만, 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서/프로모터, SV40 프로모터, UBC 프로모터, PGK 프로모터, 인간 β-액틴(hACTB), 인간 신장 인자-1α(hEF-1α) 및 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터를 포함한다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 테스트 샘플에서 항-AAV 중화 항체의 활성을 검출하고 작동가능하게 정량하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 항-AAV 항체를 포함할 것으로 생각되는 테스트 샘플(들)과 항-AAV 항체가 없는 대조구 샘플 및 항-AAV 중화 항체를 포함하는 것으로 알려진 양성 대조구 샘플(들)을 함께 제공하는 단계,
(ii) 상기 테스트 샘플(들)을 본 발명에 따른 무세포 AAV 챌린지 바이러스/재조합 AAV 벡터 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 AAV 챌린지 바이러스/재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형의 게놈 또는 예를 들어 Gal4 DNA 결합 도메인과 같은 전이유전자 프로모터 구조물 내의 서열 태그를 발현하는, 단계.
(iii) 상기 테스트 샘플(들)을 본 발명에 따른 무세포 AAV 챌린지 바이러스/재조합 AAV 벡터 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 리포터 세포에 접촉시키는 단계로서, 상기 세포는 리포터-유전자-프로모터 구조물, 예를 들어, 패키징 세포에 의해 생성된 AAV 혈청형 또는 전이유전자 구조물의 게놈 내의 태그 서열에 특이적으로 반응할 Gal4 UAS의 직렬 반복부의 제어 하에 있는 반딧불이 루시퍼라아제를 발현하는, 단계.
(iv) 선택적으로, 바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 리포터 세포주는 AAV-반응성 리포터-유전자 구조물에서 사용된 것과 다른 리포터-유전자의 구성적 생산을 위한 구조물을 추가로 함유한다. 예를 들어, 상기 구성적 생산은 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제, 메트리디아(Metridia) 루시퍼라아제와 같은 제2 루시퍼라아제 또는 예를 들어 이는 전체 내용이 참고로 본원에 포함된 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 리포터-유전자 세포주는 96, 384 또는 1536 웰 분석 플레이트에 접종된다.
(v) 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 기질 Dual-Glo 또는 임의의 상업적으로 이용 가능한 루시퍼라아제 기질과 같은 적합한 기질을 사용하여 상기 세포주에서 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
(vi) 태그-반응성 리포터-유전자 루시퍼라아제가, 예를 들어 Dual-Glo 시스템의 Stop & Glo 시약 또는 예를 들어 반딧불이 루시퍼라아제와 같은 제1 리포터 단백질의 활성을 효율적으로 저해하는 상업적으로 이용 가능한 루시퍼라아제 기질을 사용하여 동일한 샘플에서 측정된 후, 상기 세포주에서 제2 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계(Lallemand C. et al J Immunol Res. 390:1-19, 2017, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨).
(vii) 상기 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화된 제1 루시퍼라아제의 활성은 US 2011/0189658에 기재되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
(viii) 제1 세포 샘플의 리포터 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 방법은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 US 2011/0189658에 설명되어 있으며, 참고로 그 전체 내용이 본원에 포함된다.
(ix) 및 제2 대조구 세포 샘플의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 방법은 US 2011/0189658에 설명되어 있으며, 이는 참조로 그 전체가 본원에 포함된다.
(x) 제1 및 제2 대조구 세포 샘플의 리포터 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 여기서 1보다 낮은 비율(제1/제2)은 상기 샘플에 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 항체가 존재함을 나타낸다.
본 발명의 추가 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 항-AAV 항체의 고처리량 스크리닝 방법에 관한 것이다:
(i) 항-AAV 항체가 없는 대조구 샘플(들)과 함께 항-AAV 항체를 함유하는 것으로 생각되는 테스트 샘플(들), 바람직한 일 구현예에서 항-AAV 표준 샘플(들)을 제공하는 단계.
(ii) 상기 테스트 샘플(들) 및 대조구 샘플(들)을 본 발명에 따른 챌린지 바이러스 제제 또는 바이러스-생산 패키징 세포에 접촉시키는 단계로서, 상기 세포는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 세포이며, 항체 반응이 결정되어야 하고, 상기 챌린지 바이러스/재조합 AAV 벡터는 바이러스 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 태그 서열을 함유하는, 단계.
(iii) 상기 테스트 샘플(들), 대조구 샘플(들) 및 챌린지 바이러스/바이러스-생산 패키징 세포를 본 발명에 따른 리포터-유전자 세포주와 접촉시키는 단계로서, 상기 리포터 세포주는, AAV 혈청형의 게놈 또는 재조합 AAV 벡터의 전이유전자-프로모터 구조물 내에 존재하는 태그 서열을 사용하여 세포주의 처리에 반응하는이종 시스-작용 조절 서열을 함유하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 테스트 샘플(들)에 존재하는 항체가 검출되거나 또는 검출되고 정량화되는, 단계.
(iv) 상기 리포터 세포주의 상기 프로모터는 예를 들어 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제 또는 본원에 참조로 그 전체가 포함된 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규한 루시퍼라아제를 포함하는 제1 리포터 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동적으로 연결되어 있다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포주는 96, 384 또는 1536 웰 분석 플레이트에 접종된다.
(v) 바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 리포터-세포주는 AAV-반응성 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 생산을 위한 구조물을 추가로 갖는다. 예를 들어, 상기 구성적 생산은 제2 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제 또는 그 전체가 참고로 본원에 포함된 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규한 루시퍼라아제일 수 있으며, Dual-Glo 시스템으로부터 상업적으로 이용 가능한 Dual-Glo 루시퍼라아제 시약, 또는 임의의 상업적으로 적합한 루시퍼라아제 기질과 같은 적합한 기질을 사용하여 상기 세포주 내 제1 리포터 단백질의 활성을 결정한다.
(vi) 태그-반응성 리포터 유전자 루시퍼라아제가 예를 들어 제1 리포터 단백질의 활성을 효과적으로 저해하는, Dual-Glo 시스템(Promega, Madison, WI)의 Stop & Glo 시약을 사용하여 동일한 샘플에서 측정된 후 상기 세포주에서 제2 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계. 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화된 제1 루시퍼라아제의 활성은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 US 2011/0189658에 설명되어 있다.
(vii) 제1 세포 샘플의 리포터 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 방법은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 US 2011/0189658에 설명되어 있으며, 참고로 그 전체 내용이 본원에 포함된다.
(viii) 및 제2 대조구 세포 샘플의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 방법은 US 2011/0189658에 설명되어 있으며, 이는 참조로 그 전체가 본원에 포함된다.
(ix) 제1 및 제2 대조구 세포 샘플의 리포터 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 여기서 1보다 낮은 비율(제1/제2)은 상기 샘플에 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 항체가 존재함을 나타낸다.
결과적으로, 본 발명은 특정 AAV 혈청형의 게놈을 인코딩하는 유전자, 또는 자연 발생 캡시드, 하이브리드 캡시드, 키메라 캡시드 또는 합리적으로 설계된 캡시드를 발현하고 특정 태그 서열로 표지된 특정 전이유전자/프로모터 구조물을 인코딩하는 특정 재조합 AAV 벡터로 형질감염된 패키징 세포주를 제공하며, 특정 AAV 혈청형 또는 특정 재조합 AAV 벡터에 의해 인코딩된 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터 세포주를 제공한다. 공통 태그 서열을 사용하여 각각의 특정 AAV 혈청형 또는 각 특정 재조합 AAV 벡터를 표지하는 경우 단일 리포터 세포주를 사용하여 동일한 태그 서열로 표지된 모든 다른 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터를 검출할 수 있다. 그러나 개별 AAV 혈청형 또는 개별 재조합 AAV 벡터를 표지하기 위해 다른 태그 서열을 사용하는 경우 각 개별 특정 태그 서열에 특이적으로 반응하는 다른 리포터 세포주 또는 각 개별 태그를 포함하는 리포터 세포주가 요구된다. 본 발명에 따라 결정되는, 특정 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체를 함유하는 샘플의 용량-반응 곡선의 EC50이 선행 기술 방법과 비교하여 적어도 감소되도록 다양한 맥락에서 본 발명의 이들 사용은 더 높은 감도로 중화 항체의 활성을 검출할 수 있게 한다. 상기 감소는 약 2배일 수 있으며, 가령 약 3배, 가령 약 4배, 가령 약 5배, 가령 약 6배, 가령 약 7배, 가령 약 8배, 가령 약 9배, 가령 약 10배, 가령 약 50배, 가령 약 100배, 또는 가령 약 1000배일 수 있다.
일 측면에서, 진단 방법에서 구성요소 1 및 2의 사용, 또는 본 발명에 따른 구성요소 1 및 2의 사용을 포함하는 임의의 방법은 구성요소 1의 세포와 구성요소 2의 세포를 중화 항체의 존재 여부를 테스트할 피험자로부터 채취한 생물학적 샘플과 함께 공동 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 상기 중화 항체는 특정 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도된 항체일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 세포 또는 세포주 및 이와 관련된 더 높은 특이성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다. 상기 특이성은 예를 들어 약 75% 이상일 수 있으며, 가령 적어도 약 80%, 가령 적어도 약 85%, 가령 적어도 약 90%, 가령 적어도 약 95%, 가령 적어도 약 97.5%, 가령 적어도 약 98%, 가령 적어도 약 99%, 가령 적어도 약 99.5%일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 증가된 민감도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 증가된 특이성을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 증가된 민감도와 증가된 특이성을 모두 제공한다.
도 1은 구성요소 1: 실시예 1의 패키징 세포주를 확립하기 위해 사용된 분자 구조물을 예시한다. 인간 폐 선암종 세포주 A549는 다음 구조물로 안정적으로 형질감염되었다; 선택된 전이유전자 및 적합한 프로모터의 제어 하에 도시된 예에서 2A 자가절단 펩타이드, F2A를 인코딩하는 서열에 의해 분리된 gal4-VP16 태그 서열, 도시된 예에서 CMV 구성적 프로모터, 및 도시된 예에서 SV40의 폴리아데닐화 부위가 도시된 예에서 주어진 AAV 혈청형인 AAV2의 ITR 내에 포함되어 있다.
rep 및 cap 유전자는 구성적 프로모터의 제어 하에 다양한 플라스미드에서 발현된다.
E1 유전자는 도시된 예에서 FL506 결합 단백질(KFBP)에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인의 12배 직렬 반복부로 구성된 라파마이신-유도성 프로모터인 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다.
세포는 또한 구성적 프로모터의 제어 하에 E2A, E4 및 VA RNA를 인코딩하는 유전자로 안정적으로 형질감염되었다.
도 2는 구성요소 2: 실시예 1의 리포터 세포주를 확립하기 위해 사용된 분자 구조물을 예시한다. 인간 배아 신장 세포주 HEK293은 Gal4 상류 활성화 서열의 5배 직렬 반복부(UAS) 및 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 최소 프로모터로 구성된 키메라 프로모터로, 도시된 예에서 SV40으로부터의 폴리아데닐화 부위와 함께 안정적으로 형질감염되었다.
도 3은 구성요소 2: 실시예의 리포터 세포주를 확립하는 데 사용된 분자 구조물을 예시하며, 여기서 인간 배아 신장 세포주 HEK293은 Gal4 상류 활성화 서열의 5배 직렬 반복부(UAS) 및 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 최소 프로모터로 구성된 키메라 프로모터로, 도시된 예에서 SV40으로부터의 폴리아데닐화 부위와 함께 안정적으로 형질감염되었으며, 제1 리포터-유전자로 표시되었다. 상기 세포는 또한 제2 리포터-유전자로 표시된 SV40 최소 구성 프로모터의 제어하에 레닐라 루시퍼라아제로 안정적으로 공동 형질감염되었다.
도 4는 구성요소 1: 실시예 1의 패키징 세포주에 의한 재조합 AAV 비리온의 생산 및 구성요소 2: 실시예 1의 리포터 세포주로의 흡수를 예시한다.
도 5는 재조합 AAV 벡터의 게놈의 발현 및 Gal4 DNA 결합 도메인-VP6 하이브리드 단백질의 Gal4 상류 활성화 서열(UAS)의 5배 직렬 반복부와의 결합 및 반딧불이 루시퍼라아제 리포터 유전자의 강한 활성화를 예시하며, 바이러스의 비특이적 세포 독성을 반영하는 구성적 프로모터의 제어 하에 레닐라 루시퍼라아제 리포터-유전자의 최소 활성화와 함께 예시한다.
도 6은 샘플에 존재하는 항-AAV 항체가 패키징 세포주(구성요소 1)에서 가라앉아 리포터 세포주(구성요소 2)로 들어가서 Gal-4-UAS 조절된 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 활성화하는 것을 방지하는, 샘플에 존재하는 항-AAV 항체에 의한 AAV 바이러스 입자의 중화를 예시한다. 이로 인해 중화 항-AAV 항체가 존재하는 경우 반딧불이 루시퍼라아제 신호가 낮아진다. 구성적 프로모터의 제어 하에 있는 레닐라 루시퍼라아제 리포터-유전자의 발현은 바이러스의 비특이적 세포 독성을 반영하여 변하지 않은 채로 남아있다.
도 7은 즉각 초기 인핸서 단백질 E4orf6을 인코딩하는 유전자로 리포터-세포주(구성요소 2)를 일시적으로 형질감염시키고 리포터 세포를, AAV2 cap 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)와 배양한 후의 Gal4-UAS 조절된 FL 발현의 강화를 예시한다.
도 8은 즉각 초기 인핸서 단백질 E4orf6을 인코딩하는 유전자로 리포터-세포주(구성요소 2)를 일시적으로 형질감염시키고 리포터 세포를, AAV5 cap 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)와 배양한 후의 Gal4-UAS 조절된 FL 발현의 강화를 예시한다.
도 9는 마이크로타이터 플레이트의 웰당 접종된 리포터 세포(구성요소 2)의 수와 AAV2 cap 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)의 존재 하에서 Gal4-UAS 조절된 FL 발현 사이의 관계를 예시한다. 7,500개의 패키징 세포가 있는 상태에서 웰당 총 15,000개의 리포터 세포가 최적의 FL 발현을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
도 10은 재조합 AAV2 벡터를 발현하는 패키징 세포주를 20℃에서 30분 동안 테스트되거나 되지않을 샘플과 접촉시킨 후 상기 패키징 세포주와 샘플을 리포터-세포와 함께 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 이어서 상업적으로 이용 가능한 기질(Bright-Glo, Promega, Madison, WI)을 이용하여 FL 리포터-유전자 활성을 정량하고, 발광측정기(Glo-Max, Promega, WI)에서 빛 방출을 정량화한 후, 혈청 샘플의 중화 활성을 정량화함을 예시한다.
도 11은 37℃에서 18시간 동안 리포터 세포(구성요소 2)와 함께 배양하기 전, AAV2 Cap 단백질을 인코딩하는 유전자를 발현하는 패키징 세포(구성요소 1)와 함께 항-AAV2 중화 항체의 존재 여부를 테스트할 샘플을 실온에서 30분 동안 사전 배양한 경우 및 배양하지 않은 경우의 효과를 예시한다.
도 12는 본원에 기술된 발명 또는 형질도입 억제 참조 방법을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 샘플을 테스트하기 위해 사용된 절차의 비교를 예시한다.
도 13은 본원에 기술된 발명 또는 형질도입 억제 참조 방법을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 샘플 적정의 비교를 예시한다.
도 14는 본원에 기술된 발명을 사용하여 다양한 동물 AAV와 교차반응하는 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 인간 IVIG 샘플의 적정 결과를 예시한다.
도 15는 100,000 kDa의 단백질에 대해 컷오프를 적용한 한외여과 전후에 본원에 기술된 본 발명을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 개별 정상 인간 공여자로부터의 혈청 샘플의 적정 비교를 예시한다.
도 16은 본원에 기술된 발명을 사용하여 다양한 인간 야생형 AAV 혈청형 및 AAV 발현 키메라 CJ 캡시드에 대한 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 인간 IVIG 샘플의 적정 결과를 예시한다.
도 17은 본원에 기술된 방법을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 샘플 적정의 비교를 예시하는데, 여기서 바이러스-생산 패키징 세포는 리포터-세포와 밤새 배양되거나, 동등한 감염 다중도(MOI)의 무세포 바이러스가 리포터 세포와 함께 밤새 배양된다.
도 18은 Gal4 UAS의 5배 직렬 반복부에 의해 조절된 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자 및 AAV8 패키징 세포(본 발명의 구성요소 1) 존재 하에서 티미딘 키나제 구성 프로모터에 의해 조절되는 레닐라 루시퍼라아제 정규화 유전자를 모두 포함하는 리포터 세포주(본 발명의 구성요소 2)의 활성화에 대한 정상 개체의 두 인간 혈청과 인간 IgG 풀(IV-IgG)의 명백한 중화 효과를 예시한다.
도 19는 UAS의 5배 직렬 반복부에 의해 조절되는 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 리포터-유전자와 티미딘 키나제 구성 프로모터에 의해 조절되는 레닐라 루시퍼라아제(RL) 정규화 유전자를 모두 함유하는 리포터 세포주(본 발명의 구성요소 2)에서 레닐라 루시퍼라아제(RL)의 발현을 예시한다.
레닐라 발현은 IV-IgG를 사용하는 경우 안정적이지만 정상 개체의 두 인간 혈청(HS0 및 HS4)을 사용하는 경우 감소하는데, 이는 AAV8 패키징 세포(본 발명의 구성요소 1)가 존재하는 경우 혈청 HS0 및 HS4의 명백한 중화 효과는 비특이적인 세포독성에 기인함을 입증한다.
도 20은 리포터 세포주(본 발명의 구성요소 2)의 활성화에 대한 정상 개체의 두 인간 혈청 HSO 및 HS4와 인간 IgG 풀(IV-IgG)의 RL에 대한 FL 활성의 비율을 예시하는데, 상기 리포터 세포주는 Gal4 UAS의 5배 직렬 반복부에 의해 조절되는 FL 리포터-유전자와 AAV8 패키징 세포(본 발명의 구성요소 1)의 존재 하에 티미딘 키나제 구성 프로모터에 의해 조절되는 RL 정규화 유전자를 모두 함유하며, 혈청 HSO 및 HS4의 명백한 중화 효과는 사실상 비특이적 세포 독성에 기인함을 나타낸다.
rep 및 cap 유전자는 구성적 프로모터의 제어 하에 다양한 플라스미드에서 발현된다.
E1 유전자는 도시된 예에서 FL506 결합 단백질(KFBP)에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인의 12배 직렬 반복부로 구성된 라파마이신-유도성 프로모터인 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다.
세포는 또한 구성적 프로모터의 제어 하에 E2A, E4 및 VA RNA를 인코딩하는 유전자로 안정적으로 형질감염되었다.
도 2는 구성요소 2: 실시예 1의 리포터 세포주를 확립하기 위해 사용된 분자 구조물을 예시한다. 인간 배아 신장 세포주 HEK293은 Gal4 상류 활성화 서열의 5배 직렬 반복부(UAS) 및 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 최소 프로모터로 구성된 키메라 프로모터로, 도시된 예에서 SV40으로부터의 폴리아데닐화 부위와 함께 안정적으로 형질감염되었다.
도 3은 구성요소 2: 실시예의 리포터 세포주를 확립하는 데 사용된 분자 구조물을 예시하며, 여기서 인간 배아 신장 세포주 HEK293은 Gal4 상류 활성화 서열의 5배 직렬 반복부(UAS) 및 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 최소 프로모터로 구성된 키메라 프로모터로, 도시된 예에서 SV40으로부터의 폴리아데닐화 부위와 함께 안정적으로 형질감염되었으며, 제1 리포터-유전자로 표시되었다. 상기 세포는 또한 제2 리포터-유전자로 표시된 SV40 최소 구성 프로모터의 제어하에 레닐라 루시퍼라아제로 안정적으로 공동 형질감염되었다.
도 4는 구성요소 1: 실시예 1의 패키징 세포주에 의한 재조합 AAV 비리온의 생산 및 구성요소 2: 실시예 1의 리포터 세포주로의 흡수를 예시한다.
도 5는 재조합 AAV 벡터의 게놈의 발현 및 Gal4 DNA 결합 도메인-VP6 하이브리드 단백질의 Gal4 상류 활성화 서열(UAS)의 5배 직렬 반복부와의 결합 및 반딧불이 루시퍼라아제 리포터 유전자의 강한 활성화를 예시하며, 바이러스의 비특이적 세포 독성을 반영하는 구성적 프로모터의 제어 하에 레닐라 루시퍼라아제 리포터-유전자의 최소 활성화와 함께 예시한다.
도 6은 샘플에 존재하는 항-AAV 항체가 패키징 세포주(구성요소 1)에서 가라앉아 리포터 세포주(구성요소 2)로 들어가서 Gal-4-UAS 조절된 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 활성화하는 것을 방지하는, 샘플에 존재하는 항-AAV 항체에 의한 AAV 바이러스 입자의 중화를 예시한다. 이로 인해 중화 항-AAV 항체가 존재하는 경우 반딧불이 루시퍼라아제 신호가 낮아진다. 구성적 프로모터의 제어 하에 있는 레닐라 루시퍼라아제 리포터-유전자의 발현은 바이러스의 비특이적 세포 독성을 반영하여 변하지 않은 채로 남아있다.
도 7은 즉각 초기 인핸서 단백질 E4orf6을 인코딩하는 유전자로 리포터-세포주(구성요소 2)를 일시적으로 형질감염시키고 리포터 세포를, AAV2 cap 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)와 배양한 후의 Gal4-UAS 조절된 FL 발현의 강화를 예시한다.
도 8은 즉각 초기 인핸서 단백질 E4orf6을 인코딩하는 유전자로 리포터-세포주(구성요소 2)를 일시적으로 형질감염시키고 리포터 세포를, AAV5 cap 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)와 배양한 후의 Gal4-UAS 조절된 FL 발현의 강화를 예시한다.
도 9는 마이크로타이터 플레이트의 웰당 접종된 리포터 세포(구성요소 2)의 수와 AAV2 cap 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 함유하는 패키징 세포(구성요소 1)의 존재 하에서 Gal4-UAS 조절된 FL 발현 사이의 관계를 예시한다. 7,500개의 패키징 세포가 있는 상태에서 웰당 총 15,000개의 리포터 세포가 최적의 FL 발현을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
도 10은 재조합 AAV2 벡터를 발현하는 패키징 세포주를 20℃에서 30분 동안 테스트되거나 되지않을 샘플과 접촉시킨 후 상기 패키징 세포주와 샘플을 리포터-세포와 함께 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 이어서 상업적으로 이용 가능한 기질(Bright-Glo, Promega, Madison, WI)을 이용하여 FL 리포터-유전자 활성을 정량하고, 발광측정기(Glo-Max, Promega, WI)에서 빛 방출을 정량화한 후, 혈청 샘플의 중화 활성을 정량화함을 예시한다.
도 11은 37℃에서 18시간 동안 리포터 세포(구성요소 2)와 함께 배양하기 전, AAV2 Cap 단백질을 인코딩하는 유전자를 발현하는 패키징 세포(구성요소 1)와 함께 항-AAV2 중화 항체의 존재 여부를 테스트할 샘플을 실온에서 30분 동안 사전 배양한 경우 및 배양하지 않은 경우의 효과를 예시한다.
도 12는 본원에 기술된 발명 또는 형질도입 억제 참조 방법을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 샘플을 테스트하기 위해 사용된 절차의 비교를 예시한다.
도 13은 본원에 기술된 발명 또는 형질도입 억제 참조 방법을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 샘플 적정의 비교를 예시한다.
도 14는 본원에 기술된 발명을 사용하여 다양한 동물 AAV와 교차반응하는 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 인간 IVIG 샘플의 적정 결과를 예시한다.
도 15는 100,000 kDa의 단백질에 대해 컷오프를 적용한 한외여과 전후에 본원에 기술된 본 발명을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 개별 정상 인간 공여자로부터의 혈청 샘플의 적정 비교를 예시한다.
도 16은 본원에 기술된 발명을 사용하여 다양한 인간 야생형 AAV 혈청형 및 AAV 발현 키메라 CJ 캡시드에 대한 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 인간 IVIG 샘플의 적정 결과를 예시한다.
도 17은 본원에 기술된 방법을 사용하여 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 테스트된 샘플 적정의 비교를 예시하는데, 여기서 바이러스-생산 패키징 세포는 리포터-세포와 밤새 배양되거나, 동등한 감염 다중도(MOI)의 무세포 바이러스가 리포터 세포와 함께 밤새 배양된다.
도 18은 Gal4 UAS의 5배 직렬 반복부에 의해 조절된 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자 및 AAV8 패키징 세포(본 발명의 구성요소 1) 존재 하에서 티미딘 키나제 구성 프로모터에 의해 조절되는 레닐라 루시퍼라아제 정규화 유전자를 모두 포함하는 리포터 세포주(본 발명의 구성요소 2)의 활성화에 대한 정상 개체의 두 인간 혈청과 인간 IgG 풀(IV-IgG)의 명백한 중화 효과를 예시한다.
도 19는 UAS의 5배 직렬 반복부에 의해 조절되는 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 리포터-유전자와 티미딘 키나제 구성 프로모터에 의해 조절되는 레닐라 루시퍼라아제(RL) 정규화 유전자를 모두 함유하는 리포터 세포주(본 발명의 구성요소 2)에서 레닐라 루시퍼라아제(RL)의 발현을 예시한다.
레닐라 발현은 IV-IgG를 사용하는 경우 안정적이지만 정상 개체의 두 인간 혈청(HS0 및 HS4)을 사용하는 경우 감소하는데, 이는 AAV8 패키징 세포(본 발명의 구성요소 1)가 존재하는 경우 혈청 HS0 및 HS4의 명백한 중화 효과는 비특이적인 세포독성에 기인함을 입증한다.
도 20은 리포터 세포주(본 발명의 구성요소 2)의 활성화에 대한 정상 개체의 두 인간 혈청 HSO 및 HS4와 인간 IgG 풀(IV-IgG)의 RL에 대한 FL 활성의 비율을 예시하는데, 상기 리포터 세포주는 Gal4 UAS의 5배 직렬 반복부에 의해 조절되는 FL 리포터-유전자와 AAV8 패키징 세포(본 발명의 구성요소 1)의 존재 하에 티미딘 키나제 구성 프로모터에 의해 조절되는 RL 정규화 유전자를 모두 함유하며, 혈청 HSO 및 HS4의 명백한 중화 효과는 사실상 비특이적 세포 독성에 기인함을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 실시예를 기술함에 있어서, 명확성을 위해 특정 용어가 사용될 것이다. 그러나, 본 발명은 그렇게 선택된 특정 용어에 한정되는 것이 아니며, 각각의 특정 용어는 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 동작하는 모든 기술적 등가물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 상술한 선행 기술을 고려하여 이루어졌으며, 본 발명의 목적은, 민감도와 특이성이 향상된, 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체의 검출 및 정량을 위한 신규 시스템을 제공하는 것이다. 이러한 목표를 달성하기 위해 본 발명은 항체 반응이 결정될 수 있는, AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 패킹 세포주(구성요소 1)를 제공하는데, 바이러스 게놈 내의 태그 서열 또는 AAV ITR 내에 포함된 전이유전자 프로모터 구조물을 포함한다.
본 발명은 또한 구성요소 1의 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자 프로모터 구조물을 포함하는 리포터-유전자 세포주(구성요소 2) 및 테스트 샘플 내의 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량화하기 위해 상기를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 최적의 민감도, 신호 강도 및 생물학적 충실도로 AAV에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 고처리량 스크리닝 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 또한 예를 들어 진단 또는 진단 방법, 가령 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체(NAbs)의 검출 및 정량화를 위한 방법에서의 구성요소 1 및/또는 구성요소 2의 용도에 관한 것이다.
구성요소 1: 패키징 세포주
본 명세서에 언급된 바와 같이, 본 발명은, 일시적 형질감염에 의해 공급되거나 바람직하게는 선택된 세포주의 게놈 내에 부분적으로 또는 완전히 통합되는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 발현에 요구되는 구성 성분을 포함할 수 있는 AAV 패킹 세포주에 관한 것이다. 상기 선택된 세포주는 숙주 세포 또는 숙주 세포주로 지칭될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음 중 적어도 하나 이상을 포함하는 세포 또는 세포주(구성요소 1)에 관한 것이다.
(i) AAV ITR 내에 포함된, 하나 이상의 태그 서열을 포함하는 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물,
(ii) 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된, 자연 발생 Cap, 하이브리드 Cap, 키메라 Cap, 또는 합리적으로 설계된 Cap을 인코딩하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 cap 유전자,
(iii) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV rep 유전자,
(iv) 각각 다른 개별 천연 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E2A, E4 및 VA 유전자,
(v) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E1A 유전자.
일 측면에서, 상기 세포는 (i), (ii), (iii), (iv) 및 (v) 중 일부 또는 전부를 포함한다.
특정 측면에서, 상기 세포는 (i), (ii), (iii), (iv) 및 (v)를 모두 포함한다.
일 측면에서, (iii), (iv) 및 (v)의 유도성 프로모터는 서로 상이하고 Tet-on/Tet-off 시스템, 큐메이트-유도성 억제자 CymR 시스템, 플라보노이드 플로레틴 조절된 TtgR 억제 시스템, 및 바닐산 조절된 VanR 억제/KRAP 시스템으로부터 선택될 수 있다.
추가 일 측면에서, 상기 AAV E1A 유전자는 유도성 상기 프로모터 또는 프로모터들을 사용함으로써 rep 유전자 또는 E2A, E4 및 VA 유전자를 조절할 필요성을 제거하는 유도성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 다르게 말하면, 일 측면에서는 E1A 유전자는 유도성 프로모터에 의해 조절될 필요가 있다는 것이다. 따라서, 일 측면에서, (ii)의 유도성 프로모터는 rep 유전자 또는 E2A, E4 및 VA 유전자를 조절할 필요성을 제거하는 유도성 프로모터일 수 있다.
일 측면에서, (ii)의 유도성 프로모터는 예를 들어 옥타머 Van O 작동자(operator)인 VanO8을 사용하는 바닐산 유도성 프로모터로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, (ii)의 유도성 프로모터는 예를 들어 Tet-On, Tet-off 및 포나스테론 A(Ponasterone A)/엑디손(ecdysone) 시스템으로부터 선택될 수 있다.
감수성을 증가시키기 위해, 숙주 세포주는 세포 표면 AAV 수용체 단독(9), 또는 엔도솜 AAV 수용체 단독(10), 또는 세포 표면 수용체와 엔도솜 AAV 수용체 둘 모두를 사용하여 안정적으로 형질감염될 수 있는 것으로 이해된다.
숙주 세포주의 선택은 생물학적 샘플 분석을 위한 안전성 프로파일과 rep 유전자 및 E4orf6의 발현 조절 후 AAV Rep 단백질의 독성을 견딜 수 있는 세포의 능력에 따라 결정된다(11). 일 측면에서, 상기 숙주 세포는 후생동물(metazoan) 세포이다. 또 다른 측면에서, 상기 숙주 세포주는 인간 폐 선암종 세포주 A549(ATCC 카탈로그 # CCL-185) 또는 인간 배아 신장 세포주 HEK293T(ATCC 카탈로그 # ACS-4500)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 선택된 숙주 세포주는 구성적 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터, 또는 전이유전자의 발현을 조절하는 적절한 조직-특이적 프로모터, 및 적합한 폴리아데닐화 부위, 예를 들어, SV40 유래 또는 예를 들어 AAV2의 ITR 내에 포함된 대체 폴리아데닐화 부위(도 1)의 제어 하에서 선택된 전이유전자로 형질감염될 수 있다. 다른 측면에서, 상기 구성적 프로모터는 예를 들어 SV40, UBC, EF1A, PGK 및 CAGG 프로모터일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 조직-특이적 프로모터는 예를 들어 레드 옵신 2.1 및 1.7 프로모터, 그린 옵신 2.1 및 1.7 프로모터, 로돕신 키나제 2(hGPK1) 프로모터, 콘 어레스틴 hCAR 프로모터, 난황체 황반 이영양증(VMD2) 프로모터를 포함하는 인간 망막-특이적 프로모터일 수 있다. 일반적인 근육-특이적 프로모터에는 크레아틴 키나제(CK), 및 미오신 중쇄(MyHC) 프로모터, 또는 시냅신 프로모터와 같은 뉴런 특이적 프로모터를 포함한다.
상기 숙주 세포는 또한, 예를 들어, 구성적 프로모터, 가령 CMV 즉각 초기 프로모터(도 1)의 제어 하에 cap 유전자로 공동-형질감염될 수 있다. 별도의 플라스미드에서 cap 및 rep 유전자의 발현이 AAV 벡터 생산을 증가시키는 것으로 보고되었기 때문에 세포는 2개의 독립적으로 조절되는 cap 및 rep 유전자로 공동 형질감염된다(12).
E1 및 E1A 및 E1B ORF를 인코딩하는 유전자는 HEK293T 세포와 달리 A549 세포에서 발현되지 않으므로 A549 세포는 E1a 단백질이 Rep, E2 및 E4 유전자를 활성화시키는 것을 방지하기 위해 적합한 유도성 프로모터의 제어하에 E1 유전자로 형질감염되었다. 따라서, 실시예 1 및 본 발명의 일 측면에 예시된 바와 같이, E1 유전자는 FK506 결합 단백질(FKBP)에 융합된 DNA 결합 도메인 ZFHD1의 12배 직렬 반복부로 구성된 라파마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. FKBP-라파마이신 관련 단백질(FRAP)은 HSV-1의 VP16 트랜스-활성인자에 융합되어 라파마이신을 첨가하면 FKBP와 FRAP 사이의 이종이합체 형성이 유도되어 E1 초기 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현이 엄격하게 제어된다.
Rep78/68의 조절된 발현은 또한 AAV 벡터 생산 수준을 증가시키는 것으로 나타났다(9). E4 orf6 단독을 사용한 HEK293 세포의 형질감염은 아데노바이러스 없는 재조합 AAV 벡터 생산에 충분한 것으로 보고되었지만(14) 초기 보조 단백질 E2A, E4 및 VA RNA는 재조합 AAV의 효율적인 생산에 필요한 것으로 보고되었다(15). 따라서, 패키징 세포주는 어떤 경우에는 E2A, E4 및 VA RNA를 발현하는 발현 벡터와 함께 공동 형질감염될 수 있다.
구성요소 2: 리포터 세포주.
일 측면에서, 본 발명은 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 함유된 태그 서열에 특이적으로 반응할 수 있는 리포터-유전자 세포주(본원에서는 구성요소 2라고도 함)에 관한 것이며, 상기 리포터 세포를 AAV 챌린지 바이러스/재조합 AAV 벡터, 또는 중화 항체가 정량화될, 필요한 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터를 생산하는 패키징 세포에 접촉시킴으로써 상기 세포주에 의해 발현된 리포터-유전자의 활성화를 가져올 것이다. 실시예 1에서 상기 패키징 세포주는 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 Gal4 상류 활성화 서열(UAS)에 특이적으로 결합할 Gal4 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 태그 서열을 함유하는 전이유전자-프로모터 구조물을 발현한다. 구체적으로 실시예 1에서 상기 리포터 세포는 HEK293 세포 배경에서 FL 리포터-유전자의 발현을 조절하는 Gal4 UAS의 5배 직렬 반복부를 포함한다(도 1).
패키징 세포주와 리포터 세포의 상호 작용
다양한 구현예에서, 본 발명은 다음 중 적어도 하나를 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 본 발명에 따른 패키징 세포(구성요소 1)에 의해 생성된 바이러스를, 약 +4℃, 약 20℃ 또는 약 37℃ 중 어느 하나를 포함하는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 테스트할 샘플(들)과 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉 후, 바이러스 제제 및 샘플(들)을 리포터-세포(구성요소 2)와 함께 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 15 내지 약 18시간 또는 그 이상 배양한 다음, 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질을 사용하여 FL 리포터-유전자 활성을 정량하는, 단계.
(b) 약 +4℃, 약 20℃ 또는 약 37℃ 온도 중 어느 하나를 포함하는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 테스트할 샘플(들)과 바이러스-생산 패키징 세포(구성요소 1)를 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉 후, 상기 바이러스-생산 패키징 세포 및 샘플(들)을 리포터-세포(구성요소 2)와 함께 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 15 내지 약 18시간 또는 그 이상 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을 정량하는, 단계.
(c) 및 바람직한 일 구현예에서 상기 바이러스-생산 패키징 세포주(구성요소 1)를 테스트할 샘플(들) 및 리포터-세포(구성요소 2)와 접촉시키고 약 37℃에서 다양한 시간, 바람직하게는 약 6 내지 약 18시간 또는 그 이상 직접 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을, 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질을 사용하여 정량하는, 단계.
(c) 바이러스-생산 패키징 세포(구성요소 1)를 리포터 세포(구성요소 2)와 함께 적절한 동결-보호 배지에서 적절한 세포 농도로 동결하고, 상기 세포를 해동하여, 상기 패키징 세포/리포터-유전자 세포를 테스트할 샘플과 접촉시키며 및 상기 샘플(들), 패키징 세포-리포터-세포를 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 18시간 이상 배양한 후 FL 리포터-유전자 활성을, 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질을 사용하여 정량하는 단계.
(d) 바람직한 일 구현예에서, 바이러스-생산 패키징 세포(구성요소 1)와 리포터 세포(구성요소 2)를 적절한 동결-보호 배지에서 적절한 세포 농도로 별도로 동결하고, 세포를 해동하여, 상기 패키징 세포주를 테스트할 샘플(들)과 다양한 시간 동안, 및 다양한 온도, 약 +4℃, 약 20℃, 또는 약 37℃ 중 어느 하나를 포함하는 온도에서 접촉시키고, 상기 패키징 세포 및 상기 샘플(들)을 리포터-세포와 함께 약 37℃에서 다양한 시간 동안, 바람직하게는 약 18시간 또는 그 이상 배양한 후, FL 리포터-유전자 활성을, 상업적으로 이용 가능한 기질 Bright-Glo(Promega, Madison, WI)와 같은 적합한 기질을 사용하여 정량하는 단계.
따라서, 본 발명의 일 측면에서, 구성요소 1, 구성요소 2 및 생물학적 샘플 사이의 배양 기간은 약 1시간 내지 약 48시간의 임의의 시간 범위일 수 있으며, 가령 약 6시간부터 약 36시간까지. 가령 약 9시간부터 약 32시간까지. 가령 약 12시간부터 약 24시간까지, 또는 대안적으로 약 1시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 28시간 , 약 30시간, 약 32시간 등일 수 있다. 일 측면에서, 배양 기간은 예를 들어 하룻밤 동안일 수 있으며, 또는 약 6시간 내지 약 10시간 사이의 임의의 기간 또는 약 6시간 내지 약 18시간 사이의 임의의 기간일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 배양 기간은 예를 들어 약 15시간부터 약 30시간까지일 수 있다.
추가적인 일 측면에서, 구성요소 1, 구성요소 2 및 생물학적 샘플 사이의 배양 기간은 약 15시간 내지 약 18시간의 임의의 시간 범위일 수 있다.
배양 중 온도는 약 4℃ 내지 약 37℃의 임의의 온도 범위일 수 있으며, 또는 대안적으로 약 4℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃ 또는 약 37℃일 수 있다. 대안적으로, 상기 온도는 약 30℃ 내지 약 39℃ 범위일 수 있다. 따라서 상기 온도는 구성요소 1 및/또는 구성요소 2의 세포 및/또는 분석할 생물학적 샘플의 배양과 관련이 있을 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 샘플과 패키징 세포(구성요소 1)를 사전 배양 없이, 도 9에 도시된 바와 같이 약 7,500개의 패키징 세포(구성요소 1)를 약 15,000개의 리포터 세포(구성요소 2)와 혼합한 후, 리포터 세포(구성요소 2)와 접촉시키고 37℃에서 약 18시간 동안 배양한다(도 10).
일 측면에서, AAV 제제 또는 바이러스-생산 패키징 세포는 리포터-유전자 세포와 상호작용하여 바이러스 흡수, 내재화 및 FL 리포터-유전자의 AAV 혈청형 특이적 활성화를 초래할 수 있다. 바이러스 제제 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 리포터 세포의 초기 상호 작용은 아마도 바이러스 방출 및 혈청형 특이적 상호 작용에서 세포 표면의 탄수화물과 캡시드의 상호 작용에 의해 매개될 가능성이 높다. 따라서, AAV 혈청형 2, 3, 및 6은 헤파린 황산염 프로테오글리칸에 결합하는 것으로 알려져 있고, AAV1, 4, 5, 및 6은 시알산에 결합하며, AAV9는 갈락토스에 결합한다(8). 그런 다음 상기 AAV 혈청형은 세포 내재화에 필요한 AAV 수용체(9) 및/또는 트랜스-골지체에 국한된 단백질 GPR108과 같은 신규 G 단백질 결합 수용체(10)와 상호작용한다. 일 구현예에서, 리포터 유전자는 효소 또는 적합한 방식으로 검출을 가능하게 하는 임의의 다른 수단을 인코딩한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 리포터는 루시퍼라아제, 예컨대 반딧불이 루시퍼라아제 또는 레닐라 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 전체 내용이 참고로 본원에 포함되어 있는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제, 또는 용해성 활성 단량체로 용액에 존재하는 신규 루시퍼라아제, 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 강화 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 및 서로 다른 여기/방출 스펙트럼을 나타내는 이의 변이체, 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 또는 이의 다양한 접합체, 분비된 인간 태반 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 또는 이의 다양한 접합체, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 또는 입자, 비드, 분석 플레이트 또는 튜브와 같은 고체 표면에 부착하는 다양한 링커 단백질을 포함하는 다른 단백질과의 융합 단백질이다.
다른 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 유용한 형광 단백질에는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 관련 형광 단백질, 가령 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 및 다양한 여기/방출 스펙트럼을 나타내는 이의 변형체들을 포함한다.
추가 구현예에서 상기 리포터-세포는 AAV 게놈 내에 존재하는 태그 서열 또는 전이유전자 구조물이 인코딩된 재조합 AAV에 특이적으로 반응하는 키메라 프로모터의 조절 하에 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 리포터-유전자와 같은 제1 리포터-유전자 및 제2 리포터-유전자로 공동 형질감염되는데, 상기 제2 리포터-유전자는 가령, 세포 수와 무관한 분석 결과를 만들고 세포 손실 또는 접종된 세포 수의 변화로 인한 세포 밀도의 샘플 간 편차를 보상하기 위한 수단을 제공하는 RL 활성 발현의 구성적 수준에 대해 상기 태그 서열 활성화된 FL 활성이 정규화되도록 하는 구성적 프로모터의 제어 하에서의 레닐라 루시퍼라아제(RL)와 같다. RL 활성의 구성적 발현과 관련하여 AAV-활성화된 FL 활성을 정규화하는 능력은 또한 혈청 매트릭스 효과를 보상하는 수단을 제공한다(16). 유용한 구성적 활성 프로모터에는 이에 제한되지는 않지만, 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서/프로모터, SV40 프로모터, UBC 프로모터, PGK 프로모터, 인간 β-액틴(hACTB), 인간 신장 인자-1α(hEF-1α), 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터를 포함한다.
본 발명자들은 개선된 민감도, 정밀도 및 특이성을 갖는 야생형 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도된 중화 항체의 검출 및 정량화를 위한 신규한 시스템을 제공한다.
상기 개략된 기술적 문제를 해결하기 위해, 항체 반응이 결정될 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 패킹 세포주(구성요소 1)를 포함하는 2성분 시스템이 기술되며, 이는 바이러스 게놈 내의 태그 서열 또는 AAV ITR 내에 포함된 전이유전자 프로모터 구조물을 포함하며, 상기 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자를 포함하는 리포터-유전자 세포주(구성요소 2) 및 이를 이용하여 테스트 샘플(들)에서 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 최적의 민감도, 신호 강도 및 생물학적 충실도로 AAV 감염에 대한 면역 반응 또는 재조합 AAV 벡터를 사용한 치료를 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 고처리량 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구성요소 1: 패키징 세포주. AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 발현에 필요한 구성 성분이 일시적 형질감염에 의해 공급되거나 본 발명의 바람직한 일 구현예에서 선택된 세포주의 게놈에 통합되는 안정적인 AAV 패킹 세포주가 확립될 수 있다.
비제한적인 예로서, 특정 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 안정적인 세포주는 인간 폐 선암종 세포주 A549(ATCC 카탈로그 # CCL-185)를 구성적 프로모터 또는 의도된 용도의 함수에 따라 선정된 적절한 조직-특이적 프로모터의 제어 및 AAV2의 ITR 내에 포함된 폴리아데닐화 부위하에 선택된 전이유전자로 형질감염시킴으로써 확립될 수 있다(도 1에 도시된 바와 같음).
가능한 최고 수준의 발현을 부여할 전이유전자-프로모터 구조물에 대한 발현 벡터를 구성하기 위해, 프로모터의 다양한 유형의 변이체를 인실리코(in silico)에서 설계하여 프로모터의 크기를 모두 줄이고 전이유전자의 전사를 증가시킨다. 예를 들어, 실시예 1의 Gal4 DNA 결합 도메인과 같은 태그 서열을 함유하는 코돈 최적화된 전이유전자-프로모터 구조물이 생체 외(in vitro)에서 합성되고 일련의 키메라 전이유전자-프로모터 서열과, AAV2의 ITR 내에 포함된 효율성의 함수로서 선택된 합성 폴리아데닐화 부위, SV40 폴리아데닐화 부위 또는 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위 중 하나를 구성하는 데 사용한다.
일 측면에서, 구성요소 1의 세포는 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 Gal4 상류 활성화 서열(UAS)에 특이적으로 결합할 Gal4 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 태그 서열을 함유하는 전이유전자-프로모터 구조물을 발현할 수 있거나 또는 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물, 또는 AAV 게놈 또는 cGMP 특이적 수용체 단백질(CRP)을 인코딩하는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 VanR 서열을 발현한다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 함유된 태그 서열은 트랜스-활성화인자 VP16에 융합된 트랜스-사일런서 VanR을 인코딩할 수 있다.
또 다른 추가 일 측면에서, 구성요소 1의 세포는 하나 이상의 태그 서열을 포함할 수 있다.
추가 일 측면에서, 그리고 2개 이상의 태그 서열이 있는 경우, 이러한 태그 서열은 서로 상이할 수 있다.
다른 일 측면에서, 상기 태그 서열은 같고/동일할 수 있다.
일 측면에서, 구성요소 1의 세포는 재조합 AAV 벡터를 포함할 수 있다.
전이유전자 발현은 ITR을 변형하여 자가-상보적 중간체를 생성함으로써 둘째 가닥 DNA 합성에 대한 필요없이 전이유전자가 발현되도록 함으로써 증가될 수 있다(13). 그런 다음 AAV 벡터에 의해 인코딩된 전이유전자를 복제하는 데 필요한 모든 초기 보조 단백질을 포함하지만, AAV2의 ITR 내에 포함된 태그 서열을 갖는 전이유전자-프로모터 구조물은 결핍된 가령 A549 세포에 확립된 패키징 세포주에서 일련의 일시적 형질감염 실험을 통해 이들 구조물은 전이유전자의 전사를 유도하는 능력에 대해 테스트된다. 발현 수준은 적절한 검출 항체를 사용하는 웨스턴 블롯과 키메라 전이유전자 반응성 프로모터의 제어 하에 있는 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 리포터-유전자의 활성화 수준에 의해 모니터링된다. 결과는 구성적 프로모터의 제어 하에 RL 리포터-유전자로 세포를 공동 형질감염시킨 후 레닐라 루시퍼라아제(RL)의 발현과 관련하여 정규화된다.
웨스턴 블롯에 의해 모니터링된 전이유전자의 정규화된 발현 수준이 표준 ITR의 발현에 비해 최적인 것으로 추정되고, AAV 게놈 또는 재조합 AAV 벡터 내에 포함된 Gal4 DNA 결합 도메인 태그에 특이적으로 반응하는 반딧불이 루시퍼라아제 리포터 유전자의 발현을 조절하는 Gal4 UAS의 직렬 반복부를 발현하는 실시예 1과 같은 리포터 세포주를 사용하여 결정된 FL 발현의 정규화된 증가가 충분하다고 추정된다면, 상기 구조물(들)을 사용하여 패키징 세포주를 확립하는데, 이는 일시적인 형질감염에 의하거나, 또는 바람직한 일 구현예에서는 필요한 성분이 A549 세포와 같은 숙주 세포주의 게놈에 안정적으로 통합되는 안정한 패키징 세포주의 확립에 의해 이루어진다.
상기 패키징 세포주는 구성적 프로모터의 제어 하에 cap 유전자에 대한 발현 벡터로 형질감염될 수 있다. 따라서, 실시예 1에서 상기 cap 유전자는 CMV 즉각 초기 프로모터의 제어 하에 발현되고, 구성 성분에 의한 일시적인 형질감염 또는 바람직한 일 구현예에서는 필요한 성분이 A549 세포와 같은 숙주 세포주의 게놈에 안정적으로 통합되는 안정한 패키징 세포주의 확립 후에 패키징 세포주를 확립하는데 사용된다.
실시예 1에서 전이유전자를 발현하는데 필요한 rep 유전자 및 초기 유전자의 최적의 조절된 발현을 보장하기 위해, E1을 인코딩하는 유전자는 인실리코로 설계된 FK506 결합 단백질(FKBP)에 융합된 DNA 결합 도메인 ZFHD1의 변이체의 직렬 반복부로 구성된 라파마이신-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되었다. FKBP-라파마이신-관련 단백질(FRAP)의 변이체는 역시 인실리코로 설계된 HSV-1의 VP16 트랜스-활성인자에 융합되어 라파마이신의 첨가가 FKBP와 FRAP 사이의 이종이량체 형성을 유도하여 E1 초기 보조 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 엄격하게 제어하였다.
그런 다음 구조물을 생체 외에서 합성하고 A549 패키징 세포주에서 일련의 일시적인 형질감염 실험을 통해 E1 단백질의 발현을 조절하는 능력을 테스트하였다. E1A 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 p5 및 p19 프로모터를 트랜스활성화하여 rep 발현을 증가시켜 AAV 복제를 개시한다. AAV 벡터 생산 수준을 증가시키는 것으로 밝혀진 Rep78/68 단백질(14)의 조절된 발현을 보장하기 위해, 상기 rep 유전자도 ZFHD1 프로모터의 조절하에 두었다. FK506 결합 단백질(FKBP)에 융합된 DNA 결합 도메인 ZFHD1의 직렬 반복부과 VP16 트랜스-활성화인자에 융합된 FKBP-라파마이신 관련 단백질(FRAP)의 변이체를 인실리코로 설계하고 생체 외에서 합성하였으며 A549 세포에서의 일시적인 형질감염 실험으로 테스트하였는데, 라파마이신의 첨가가 FKBP와 FRAP 사이의 이종이량체의 형성을 유도하여 E1 초기 인핸서 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 엄격하게 제어하도록 하였다.
실시예 1에서는 재조합 AAV의 효율적인 생산에 필요한 초기 인핸서 단백질 E2A, E4 및 VA RNA가 자가-절단 2A 펩타이드를 포함하는 단일 폴리시스트론 서열로 발현되어 3개의 개별 단백질이 ZFHD1 프로모터의 제어하에 E1을 발현하는 A549 세포에서 E1a의 제어하에 필요한 수준 및 일정한 화학량론으로 발현되도록 보장한다. 구조물(들)의 기능성은 본 발명의 리포터 세포를 사용하여 결정된 캡슐화된 전이유전자의 정규화된 발현 수준의 생산 효율성에 의해 모니터링되었다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 패키징 세포주의 구성 성분은 실시예 1에 기술된 바와 같이 선택된 세포주의 게놈에 통합되었다. 인간 A549 세포는 개발된 최적의 전이유전자-프로모터 구조물로 공동-형질감염되었다. 상기 세포는 또한 라파마이신 조절된 ZFHD1 프로모터의 제어 하에 rep 유전자 및 E1A 유전자 둘 뿐만 아니라, E2A, E4 및 VA 유전자로 공동-형질감염되었으며, 이의 발현은 E1A 발현에 의해 조절되었다. 염색질의 전사 활성 영역에 전이유전자의 통합을 보장하는 인테그라제/트랜스포존 시스템을 사용하여 인간 A549 세포를 상기 구조물로 형질감염시켰다. 개별 안정 클론을 분리하고 ZFHD1 프로모터의 12배 직렬 반복부의 제어 하에 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자를 발현하는 벡터와 일시적 공동-형질감염하고, E1A, Rep 및 E2/E4의 발현 수준에 대한 웨스턴 블롯을 수행한 후 라파마이신 유도성을 특성화하였다. 개별 클론은 또한 qPCR에 의해 측정된 전체 캡슐화된 항체반응성(competent) 재조합 AAV 벡터의 발현 수준에 대해 테스트되었다. AAV 벡터 게놈의 정량화는 실험실 간 결과를 직접 비교할 수 있는 AAV2 ITR 특이적 표적 서열의 사용을 기반으로 했지만 선형 또는 원형 ITA 표준의 사용과 AAV2 ITR의 광범위한 2차 헤어핀 구조로 인한 확장된 변성 주기에 의존하였다(15).
인간 A549 세포에서 전이유전자의 안정성을 결정하기 위해 선택된 클론의 안정성을 20회 계대 동안 일정한 간격으로 테스트하였다. 선택된 클론은 전이유전자 반응성 리포터 세포주의 활성화 수준에 의해 모니터링되는 전체 캡슐화된 항체반응성 재조합 AAV 벡터 수준의 손실을 나타내지 않았다. 상기 클론은 또한 필요한 선택 물질을 함유하는 배양 배지에서 표준화된 성장 조건 하에서 달성된 분열시간과 최대 세포 밀도를 모두 포함하는 안정적인 성장 특성을 나타냈다.
정의
벡터
"벡터(vector)" 또는 벡터 구조물(vector construct)"이라는 용어는 재조합 유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 운반체로 사용되는 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 네 가지 주요 유형은 플라스미드, 박테리오파지 및 기타 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체이다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입물(이종 핵산 서열, 전이유전자) 및 벡터의 "백본(backbone)" 역할을 하는 더 큰 서열로 구성된 DNA 서열이다. 유전정보를 숙주에게 전달하는 벡터의 목적은 일반적으로 표적 세포에서 삽입물을 분리, 증식 또는 발현하는 것이다. 발현 벡터(발현 구조물)로 불리는 벡터는 표적 세포에서 이종 서열의 발현을 위해 특이적으로 개조되고, 일반적으로 이종 서열의 발현을 유도하는 프로모터 서열을 갖는다. 본 발명의 구현예에 사용되는 벡터의 선택은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 벡터의 특정 적용에 따라 달라진다.
전이유전자(transgene)
전이유전자는 오픈 리딩 프레임(ORF), 개시 및 종결 코돈을 인코딩하는 DNA 부분으로, 적합한 벡터를 사용하여 한 유기체에서 다른 유기체로 종종 전달된다.
작동적으로 연결된(operatively linked)
"작동적으로 연결된"이라는 용어는 유전자 또는 오픈 리딩 프레임과 같은 기능적 단위의 일부인 요소들의 연결을 의미한다. 따라서, 프로모터를 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열(오픈 리딩 프레임, ORF)에 작동적으로 연결함으로써 두 요소는 기능적 단위, 즉 유전자의 일부가 된다. 발현 조절 서열(프로모터)을 핵산 서열에 연결하면 프로모터에 의해 지시되는 핵산 서열의 전사가 가능해진다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 2개의 이종 핵산 서열을 작동적으로 연결함으로써 서열은 기능적 단위, 즉 이종 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 일부가 된다. 2개의 아미노산 서열을 작동적으로 연결함으로써, 서열은 동일한 기능 단위인 폴리펩타이드의 일부가 된다. 2개의 이종 아미노산 서열을 작동적으로 연결하면 하이브리드(융합) 폴리펩타이드가 생성된다.
최소 구성적 프로모터(minimal constitutive promoter)
리포터 유전자의 발현을 지시하는 프로모터는 일반적으로 본 발명의 리포터 세포주를 확립하는데 사용되는 포유동물 숙주 세포에서 최소한으로 구성적으로 활성을 가지며, 단독으로는 약리학적 활성 분자를 이용한 세포 처리에 반응하지 않는다. 유용한 구성적 활성 프로모터에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서/프로모터, SV40 프로모터, UBC 프로모터, PGK 프로모터, 인간 β-액틴(hACTB), 인간 신장 인자-1α(hEF-1α), 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터들을 포함한다.
유도성 프로모터(inducible promoter)
유도성 프로모터는 세포 내 조절 인자 또는 단백질의 존재 또는 존재량 또는 형태의 가역적 변화에 따라 mRNA의 전사가 일어나는 DNA 서열로, 전사 인자를 활성화시켜 RNA 중합효소 II를 모집할 수 있게 한다. 본 발명에 따르면, 유도성 프로모터는 화학 작용제에 반응하거나 화학 작용제에 의해 활성화(유도)되는 임의의 프로모터일 수 있으며, 온도 및 빛은 모두 프로모터 유도를 유도할 수 있는 요인의 예이다. 화학적으로 조절되는 프로모터는 가장 일반적인 유도성 프로모터 중 하나이다. 원핵생물과 진핵생물에 사용하기 위해 개발된 다용도 도구인 양성 유도성 테트라사이클린 ON(Tet-On) 시스템은 직접 활성화를 통해 작동한다. 이 시스템에서 활성인자 rtTA(역 테트라사이클린 제어 트랜스활성인자)는 일반적으로 비활성이며 프로모터의 테트라사이클린 반응 요소(TRE)에 결합할 수 없다. 테트라사이클린 및 그 유도체는 프로모터 활성화를 허용하는 유도제 역할을 한다.
가장 일반적으로 사용되는 원핵생물 프로모터 중 하나는 음성 유도성 pLac 프로모터이다. 이 프로모터는 전사가 활성화되려면 lac 억제인자(lacI 단백질)를 제거해야 한다. 유당 또는 유당 유사체 IPTG가 있는 경우, 상기 lac 억제인자는 프로모터 내 lacO 부위에서 이를 제거하고 표적 유전자의 억제를 중단하는 형태 변화를 겪는다. 단순화된 lac 유도성 시스템은 많은 박테리아 발현 벡터에서 발견된다.
음성 유도성 프로모터 pBad는 세균 단백질 정제에 종종 사용되는 또 다른 대중적인 원핵 프로모터이다. 아라비노스가 없으면 조절 단백질 AraC가 pBad 상류의 O 및 I1 부위와 결합하여 전사를 차단한다. 아라비노스를 첨가하면 AraC가 I1 및 I2 부위에 결합하여 전사가 개시된다. 아라비노스 외에도 cAMP 활성화 단백질(CAP)과 복합된 cAMP는 I1 및 I2 부위에 대한 AraC 결합을 자극할 수도 있다. 세포 성장 배지에 포도당을 보충하면 cAMP가 감소하고 pBad가 억제되어 프로모터 누출이 감소한다.
온도에 민감한 발현 시스템은 일반적으로 화학적으로 유도된 프로모터보다 누출이 적다; 이는 일반 온도에서는 거의 0에 가까운 발현을 보이지만 열이나 추위에 노출되면 유발될 수 있다. 예로는 열 충격을 유발하는 Hsp70 또는 Hsp90 유래 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지는 않으며, 여기서 선택한 유전자는 짧은 열 충격에 노출된 후에만 발현된다. Hsp70의 경우, 상기 열 충격은 열 충격 인자 1(HSF-1)을 방출하고, 이는 이후 프로모터의 열 충격 요소에 결합하여 전사를 활성화한다. 다른 비제한적인 예로는 예를 들어 예쁜꼬마선충(C.elegans)과 초파리(Drosophila)와 같이 종의 게놈 공학을 위한 열 충격을 유발하는 Cre 및 Cas9가 있다.
빛은 유전자 발현을 활성화하는 또 다른 방법이며 합성 생물학에 사용되는 2성분 시스템은 빛을 사용하여 전사를 조절한다. 적색 불꽃 플라스미드 pDawn에는 청색광 감지 단백질 YFI가 포함되어 있다. 빛이 없을 때 YFI는, FixK2 프로모터에 결합하여 파지 억제인자 cI의 전사를 유도하는 FixJ를 인산화한다. 억제인자 cI는 파지 프로모터 pR의 전사를 억제하여 리포터-유전자의 발현을 방지한다. 빛이 존재하면 YFI는 비활성화되고 억제인자 cI 합성을 방지하여 리포터-유전자 전사가 일어나도록 한다.
본 발명의 구현예를 설명함에 있어서, 가능한 모든 구현예의 조합 및 순열은 명시적으로 설명되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 특정 방안이 서로 다른 종속항들에 인용되거나 다른 구현예에서 설명되어 있다는 단순한 사실이 이들 방안의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 의미하지는 않는다. 본 발명은 설명된 구현예의 모든 가능한 조합 및 순열을 고려한다.
본 명세서의 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"라는 용어는 선택적으로 모든 경우들에서 각각 용어들 "구성되는(consisting of)", "구성한다(consist of)" 및 "구성한다(consist of)"로 대체될 수 있도록 의도된다. 본 발명은 본 발명의 상세한 설명을 참조함으로써 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나 이것은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 모든 문헌 인용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 아래의 비제한적인 실시예에서 추가로 설명될 것이다.
실시예 1
HEK293 세포에 확립되고 ITR 사이에 Gal-4 태그 서열을 보유하고 AAV2의 캡시드를 인코딩하는 cap 유전자를 발현하는 도 1에 예시된 패키징 세포주(구성요소 1)를 약 37℃에서 밤새 또는 약 15시간 내지 약 30시간의 시간 범위의 특정 기간 동안 도 2에 예시된 GAL4 UAS(구성요소 2)의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주와 함께 AAV2에 대한 중화 항체의 존재에 대해 테스트될 인간 혈청 샘플의 존재하에서 공동-배양하였다. 그런 다음 BrightGlo 기질을 사용하는 발광측정기에서 반딧불이 루시퍼라아제 발현을 정량화하였다(도 10).
실시예 2
HEK293 세포에 확립되고 ITR 사이에 Gal-4 태그 서열을 보유하고 AAV2의 캡시드를 인코딩하는 cap 유전자를 발현하는 도 1에 예시된 패키징 세포주(구성요소 1)를, 도 2에 예시된 GAL4 UAS의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주(구성요소 2)와 함께, 본원에 기술된 발명을 이용하여, 전처리 없거나 100,000kDa의 단백질에 대한 컷오프로 한외여과한 후에 AAV2에 대한 중화 항체의 존재에 대해 테스트될 정상 인간 공여자의 혈청 샘플의 존재하에서 밤새 공동-배양하였다. 그런 다음 BrightGlo 기질을 사용하는 발광측정기에서 반딧불이 루시퍼라아제 발현을 정량화하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, 처리되지 않은 혈청 및 필터에 의해 보유된 물질 둘 다 AAV2에 대한 중화 항체의 존재를 반영하는 RLU 값이 유사하게 감소함을 나타냈다. 대조적으로, 여과액은 RLU 값이 감소되지 않음을 보였는데, 이는 AAV2에 대한 중화 항체가 없음을 나타낸다. 샘플 58은 AAV2에 대한 중화 항체를 나타내지 않는 것으로 알려진 정상 인간 공여자로부터의 대조구 혈청 샘플이다. 샘플 58은 한외여과 전과 후 모두 유사한 RLU 값을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3
HEK293 세포에 확립되고 ITR 사이에 Gal-4 태그 서열을 보유하고 AAV2의 캡시드를 인코딩하는 cap 유전자를 발현하는 도 1에 예시된 점점 더 많은 수의 패키징 세포주(구성요소 1)를, 도 2에 예시된 GAL4 UAS의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주(구성요소 2)의 일정한 수와 함께 밤새 공동-배양하였다. 동시에, 동일한 실험에서, 증가하는 감염 다중도(MOI)를 갖는 정제된 무세포 AAV2 비리온을 도 2에 예시된 GAL4 UAS의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주(구성요소 2)의 일정한 수와 함께 밤새 공동-배양하였다. 예기치 않게, AAV2 생산 패키징 세포주(구성요소 1)와 도 2에 예시된 GAL4 UAS의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주(구성요소 2) 사이를 직접 접촉한 경우, 정제된 무세포 AAV2 비리온의 등가 MOI를 첨가하고 GAL4 UAS의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주(구성요소 2)와 함께 밤새 배양한 경우보다 FL 리포터-유전자 활성이 더 크게 활성화되는 결과를 가져왔다. 이는 도 17에 예시되어 있으며, 이는 주어진 양의 AAV2 생산 패키징 세포주(구성요소 1)가 도 2에 예시된 GAL4 UAS의 5배 직렬 반복부의 제어 하의 반딧불이 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하는 리포터 세포주(구성요소 2)와 함께 밤새 배양한 것은, 무세포 AAV2 비리온의 등가 MOI를 첨가하고 리포터 세포주(구성요소 2)와 함께 밤새 배양한 것보다 FL 리포터-유전자 활성이 더 크게 활성화되었음을 보여주는데, 이는 본 발명의 2개 구성요소 시스템의 일정 기간에 걸친, 상기 바이러스 생산 패키징 세포(구성요소 1) 및 상기 리포터 세포(구성요소 2) 사이의 공동 배양 및 이로 인한 직접 접촉은 특히, 정제된 무세포 바이러스 비리온의 등가의 MOI 및 리포터 세포 사이의 직접 접촉보다 리포터-유전자를 활성화하는데 있어 본질적으로 보다 효과적임을 시사한다. 따라서, 야생형 AAV 혈청형 또는 본 발명의 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체를 함유할 것으로 생각되는 샘플과 일정 기간 동안 바이러스 생산 패키징 세포(구성요소 1)와 리포터 세포(구성요소 2) 사이의 접촉에 의해 제공되는 효과적인 항원 부하(antigen load)는 무세포 바이러스 비리온이 야생형 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체를 함유할 것으로 생각되는 샘플과 종종 37℃에서 1시간 이하의 기간 동안 접촉하는 통상적인 중화 분석보다 효과적으로 더 낮기 때문에 본 발명의 민감도 증가를 초래한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 하기 항목에 관한 것이다;
1. 하기를 포함하는, 항체 반응을 결정하고자 하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 제1 후생동물(metazoan) 세포(구성요소 1)
(i) AAV ITR 내에 포함된 태그 서열을 포함하는 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물
(ii) 구성적 프로모터에 작동적으로 연결된 자연 발생 Cap, 하이브리드, Cap 또는 키메라 Cap을 인코딩하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 cap 유전자
(iii) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV rep 유전자
(iv) 각각 개별 천연 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E2A, E4 및 VA 유전자,
(v) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E1A 유전자
구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 태그 서열과 특이적으로 반응하는 리포터-유전자를 포함하는 제2 후생동물 세포(구성요소 2)
및 이를 사용하여 테스트 샘플(들) 내 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량하는 방법.
2. 항목 1의 세포에 있어서, 상기 세포는 SF9 세포와 같은 배큘로바이러스 감염성 곤충 세포, DT-40, MSB1 또는 LMH와 같은 조류 세포, L929 세포 또는 LS 변이체와 같은 마우스 세포, 모든 변이체를 포함하는 CHO-K1, CHO-DXB11, CHO-DG44, CHOK1SV와 같은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 모든 변이체를 포함하는 CHOK1SV-GSKO(글루타민 합성효소 넉아웃), 모든 변이체 및 모든 현탁액 또는 부착 변이체, HeLa 세포, HT1080 세포, ARPE-19, U937, Jurkat, HuH-7, HepG2, K562, A431 또는 A549 세포를 포함하는 HEK293 세포와 같은 인간 세포이다.
3. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 함유된 태그 서열은 Gal4 DNA 결합 도메인이다.
4. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 함유된 태그 서열은 cGMP 특이적 수용체 단백질(CRP)을 인코딩한다.
5. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 함유된 태그 서열은 트랜스-활성인자 VP16에 융합된 트랜스-사일런서 VanR을 인코딩한다.
6. 구성요소 2의 세포는 Gal 4 상류 활성화 서열(UAS) 및 전사 개시점 TATAA 또는 이의 변이체를 포함하는 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자를 포함하거나, 또는 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 gal4 태그 서열에 특이적으로 반응하는, Gal4 UAS의 직렬 반복부, 바람직한 일 구현예에서 이의 5배 직렬 반복부를 포함한다.
7. 구성요소 2의 세포는 GTA 작동자 서열 및 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자, 또는 이의 직렬 반복부, 바람직한 일 구현예에서 이의 4배 직렬 반복부를 포함하며, 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 CRP 서열과 특이적으로 반응한다.
8. 구성요소 2의 세포는 VanO 작동 모듈, 바람직한 일 구현예에서는 팔량성(octameric) VanO 작동 모듈(Van08), 및 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 VanR 서열과 특이적으로 반응하는 CMV 즉각 초기 프로모터와 같은 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자를 포함한다.
9. 전술한 항목 중 어느 하나의 구성요소 1의 세포에 있어서, 상기 세포는 적어도 5개의 재조합 표적 부위를 포함한다.
10. 1 내지 3 항목 중 어느 하나의 구성요소 2의 세포에 있어서, 상기 리포터는 루시퍼라아제, 예컨대 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제, 또는 신규 루시퍼라아제를 포함하는 다른 단백질, 또는 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질 및 다른 여기/방출 스펙트럼을 표시하는 이의 변이체와 같은 형광 단백질이다.
(i) 바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 구성요소 2의 세포는 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 포함된 태그 서열과 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 가진다. 예를 들어, 구성적 생산은 제2 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 설명된 것과 같은 신규한 루시퍼라아제일 수 있다.
11. 테스트 샘플에서 항-AAV 중화 항체의 활성을 검출하고 선택적으로 정량하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(i) 항-AAV 항체가 없는 대조구 샘플(들) 및 바람직한 일 구현예에서 항-AAV 중화 항체를 함유하는 것으로 알려진 양성 대조구 샘플(들)과 함께 항-AAV 항체를 함유할 것으로 생각되는 테스트 샘플(들)를 제공하는 단계,
(ii) 상기 테스트 샘플(들)을 구성요소 1의 세포에 의해 생산된 바이러스 또는 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 바이러스 생산 세포와 접촉시키는 단계,
(iii) 상기 테스트 샘플(들)을 구성요소 1의 세포에 의해 생산된 바이러스 또는 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 바이러스-생산 세포 및 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 37℃에서 다양한 시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주에서 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
이전 항목 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 리포터 세포주는 제2 리포터 단백질을 발현하고, 상기 방법은 추가로 하기를 포함하는 방법:
(iv) 상기 세포주에서 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
(v) 제1 리포터 단백질과 제2 리포터 단백질의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계,
(vi) 제1 세포 샘플의 리포터 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계로서, 이는 US 2011/0189658에 설명된다.
(vii) 및 제2 대조구 세포 샘플의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계로서, 이는 US 2011/0189658에 설명된다.
(viii) 제1 및 제2 대조구 세포 샘플의 리포터 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 여기서 1보다 낮은 비율(제1/제2)은 상기 샘플에 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 항체가 존재함을 나타낸다.
12. AAV 캡시드, AAV 게놈, 전이유전자 또는 전이유전자 산물에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 환자 샘플의 고처리량 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 선별할 환자 샘플로 구성된 테스트 샘플(들)을 제공하는 단계,
(ii) 상기 테스트 샘플(들)을 본 발명 및 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 챌린지 바이러스 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 접촉시키는 단계,
(iii) 상기 테스트 샘플(들)을 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 챌린지 바이러스 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 37℃, 및 다양한 시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주 내의 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
이전 항목 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 세포주가 제2 리포터 단백질을 발현하고, 상기 방법이 하기 단계들을 추가로 포함하는 방법:
(iv) 상기 세포주에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
(v) 구성요소 2의 상기 세포주의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, AAV 혈청형 게놈 또는 재조합 AAV 벡터 구조물에 존재하는 태그 서열에 의한 상기 세포주의 처리에 반응하는 이종 시스-작용 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 하류 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 여기서 상기 프로모터는 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 또는 메트리디아 루시퍼라아제와 같은 제1 리포터 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동적으로 연결된, 단계,
바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 구성요소 2의 세포는 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 포함된 태그 서열과 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 가진다. 예를 들어, 구성적 생산은 제2 루시퍼라아제일 수 있으며, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제일 수 있다.
(vi) 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포는 96, 384 또는 1536 웰 플레이트 분석 플레이트에 접종된다.
13. 하기를 포함하는, 항체 반응을 결정하고자 하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 제1 후생동물(metazoan) 세포(구성요소 1):
(i) AAV ITR 내에 포함된 태그 서열을 포함하는 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물,
(ii) 구성적 프로모터에 작동적으로 연결된 자연 발생 Cap, 하이브리드, Cap 또는 키메라 Cap을 인코딩하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 cap 유전자,
(iii) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV rep 유전자,
(iv) 각각 개별 천연 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E2A, E4 및 VA 유전자,
(v) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E1A 유전자.
구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 태그 서열과 특이적으로 반응하는 리포터-유전자를 포함하는 제2 후생동물 세포(구성요소 2) 및 이를 사용하여 테스트 샘플(들) 내 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량하는 방법.
14. 항목 1의 세포에 있어서, 상기 세포는 SF9 세포와 같은 배큘로바이러스 감염성 곤충 세포, DT-40, MSB1 또는 LMH와 같은 조류 세포, L929 세포 또는 LS 변이체와 같은 마우스 세포, 모든 변이체를 포함하는 CHO-K1, CHO-DXB11, CHO-DG44, CHOK1SV와 같은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 모든 변이체를 포함하는 CHOK1SV-GSKO(글루타민 합성효소 넉아웃), 모든 변이체 및 모든 현탁액 또는 부착 변이체, HeLa 세포, HT1080 세포, ARPE-19, U937, Jurkat, HuH-7, HepG2, K562, A431 또는 A549 세포를 포함하는 HEK293 세포와 같은 인간 세포이다.
15. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 함유된 태그 서열은 Gal4 DNA 결합 도메인이다.
16. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 함유된 태그 서열은 cGMP 특이적 수용체 단백질(CRP)을 인코딩한다.
17. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 함유된 태그 서열은 트랜스-활성인자 VP16에 융합된 트랜스-사일런서 VanR을 인코딩한다.
18. 구성요소 2의 세포는 Gal 4 상류 활성화 서열(UAS) 및 전사 개시점 TATAA 또는 이의 변이체를 포함하는 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자를 포함하거나, 또는 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 gal4 태그 서열에 특이적으로 반응하는, Gal4 UAS의 직렬 반복부, 바람직한 일 구현예에서 이의 5배 직렬 반복부를 포함한다.
19. 구성요소 2의 세포는 GTA 작동자 서열 및 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자, 또는 이의 직렬 반복부, 바람직한 일 구현예에서 이의 4배 직렬 반복부를 포함하며, 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 CRP 서열과 특이적으로 반응한다.
20. 구성요소 2의 세포는 VanO 작동 모듈, 바람직한 일 구현예에서는 팔량성(octameric) VanO 작동 모듈(Van08), 및 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 VanR 서열과 특이적으로 반응하는 CMV 즉각 초기 프로모터와 같은 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자를 포함한다.
21. 전술한 항목 중 어느 하나의 구성요소 1의 세포에 있어서, 상기 세포는 적어도 5개의 재조합 표적 부위를 포함한다.
22. 1 내지 3 항목 중 어느 하나의 구성요소 2의 세포에 있어서, 상기 리포터는 루시퍼라아제, 예컨대 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제, 또는 신규 루시퍼라아제를 포함하는 다른 단백질, 또는 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질 및 다른 여기/방출 스펙트럼을 표시하는 이의 변이체와 같은 형광 단백질이다.
(i) 바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 구성요소 2의 세포는 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 포함된 태그 서열과 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 가진다. 예를 들어, 구성적 생산은 제2 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 설명된 것과 같은 신규한 루시퍼라아제일 수 있다.
23. 테스트 샘플에서 항-AAV 중화 항체의 활성을 검출하고 선택적으로 정량하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(i) 항-AAV 항체가 없는 대조구 샘플(들) 및 바람직한 일 구현예에서 항-AAV 중화 항체를 함유하는 것으로 알려진 양성 대조구 샘플(들)과 함께 항-AAV 항체를 함유할 것으로 생각되는 테스트 샘플(들)를 제공하는 단계,
(ii) 상기 테스트 샘플(들)을 구성요소 1의 세포에 의해 생산된 바이러스 또는 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 바이러스 생산 세포와 접촉시키는 단계,
(iii) 상기 테스트 샘플(들)을 구성요소 1의 세포에 의해 생산된 바이러스 또는 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 바이러스-생산 세포 및 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 37℃에서 다양한 시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주에서 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
이전 항목 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 리포터 세포주는 제2 리포터 단백질을 발현하고, 상기 방법은 추가로 하기를 포함하는 방법:
(iv) 상기 세포주에서 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
(v) 제1 리포터 단백질과 제2 리포터 단백질의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계,
(vi) 제1 세포 샘플의 리포터 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계로서, 이는 US 2011/0189658에 설명된다.
(vii) 및 정규화되거나 되지 않은 제2 대조구 세포 샘플의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성과 비교하여 결정하는 단계로서, 이는 US 2011/0189658에 설명된다.
(viii) 제1 및 제2 대조구 세포 샘플의 리포터 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 여기서 1보다 낮은 비율(제1/제2)은 상기 샘플에 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 항체가 존재함을 나타낸다.
24. AAV 캡시드, AAV 게놈, 전이유전자 또는 전이유전자 산물에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 환자 샘플의 고처리량 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(iv) 선별할 환자 샘플로 구성된 테스트 샘플(들)을 제공하는 단계,
(v) 상기 테스트 샘플(들)을 본 발명 및 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 챌린지 바이러스 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 접촉시키는 단계,
(vi) 상기 테스트 샘플(들)을 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 챌린지 바이러스 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 37℃, 및 다양한 시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주 내의 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
이전 항목 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 세포주가 제2 리포터 단백질을 발현하고, 상기 방법이 하기 단계들을 추가로 포함하는 방법:
(iv) 상기 세포주에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
구성요소 2의 상기 세포주의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, AAV 혈청형 게놈 또는 재조합 AAV 벡터 구조물에 존재하는 태그 서열에 의한 상기 세포주의 처리에 반응하는 이종 시스-작용 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 하류 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 여기서 상기 프로모터는 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제와 같은 제1 리포터 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동적으로 연결된, 단계,
(vii) 바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 구성요소 2의 세포는 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 포함된 태그 서열과 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 가진다. 예를 들어, 구성적 생산은 제2 루시퍼라아제일 수 있으며, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제일 수 있다.
(viii) 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포는 96, 384 또는 1536 웰 플레이트 분석 플레이트에 접종된다.
25. 하기를 포함하는, 항체 반응을 결정하고자 하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 제1 후생동물(metazoan) 세포(구성요소 1)
(i) AAV ITR 내에 포함된 태그 서열을 포함하는 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물
(ii) 구성적 프로모터에 작동적으로 연결된 자연 발생 Cap, 하이브리드, Cap 또는 키메라 Cap을 인코딩하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 cap 유전자
(iii) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV rep 유전자
(iv) 각각 개별 천연 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E2A, E4 및 VA 유전자,
(v) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 AAV E1A 유전자
구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 태그 서열과 특이적으로 반응하는 리포터-유전자를 포함하는 제2 후생동물 세포(구성요소 2)
및 이를 사용하여 테스트 샘플(들) 내 항-AAV 중화 항체를 검출하고 최적으로 정량하는 방법.
26. 구성요소 1의 세포에 있어서, AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에 함유된 태그 서열은 cGMP 특이적 수용체 단백질(CRP)을 인코딩한다.
27. 구성요소 2의 세포는 Gal 4 상류 활성화 서열(UAS) 및 전사 개시점 TATAA 또는 이의 변이체를 포함하는 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 FL 루시퍼라아제 리포터-유전자를 포함하거나, 또는 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 gal4 태그 서열에 특이적으로 반응하는, Gal4 UAS의 직렬 반복부, 바람직한 일 구현예에서 이의 5배 직렬 반복부를 포함한다.
28. 테스트 샘플에서 항-AAV 중화 항체의 활성을 검출하고 선택적으로 정량하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(i) 항-AAV 항체가 없는 대조구 샘플(들) 및 바람직한 일 구현예에서 항-AAV 중화 항체를 함유하는 것으로 알려진 양성 대조구 샘플(들)과 함께 항-AAV 항체를 함유할 것으로 생각되는 정상 인간 공여자의 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 상기 테스트 샘플(들)을 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 바이러스 생산 세포와 접촉시키는 단계,
(iii) 상기 테스트 샘플(들)을 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 바이러스-생산 세포 및 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 37℃에서 다양한 시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주에서 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
이전 항목 중 어느 한 방법에 있어서, 상기 리포터 세포주는 제2 리포터 단백질을 발현하고, 상기 방법은 추가로 하기를 포함하는 방법:
(iv) 상기 세포주에서 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
(v) 제1 리포터 단백질과 제2 리포터 단백질의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계,
(vi) 제1 세포 샘플의 리포터 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계로서, 이는 US 2011/0189658에 설명된다.
(vii) 및 제2 대조구 세포 샘플의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 루시퍼라아제의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계로서, 이는 US 2011/0189658에 설명된다.
(viii) 제1 및 제2 대조구 세포 샘플의 리포터 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 여기서 1보다 낮은 비율(제1/제2)은 상기 샘플에 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 항체가 존재함을 나타낸다.
29. AAV 캡시드, AAV 게놈, 전이유전자 또는 전이유전자 산물에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 환자 샘플의 고처리량 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(vii) 선별할 환자 샘플로 구성된 테스트 샘플(들)을 제공하는 단계,
(viii) 상기 테스트 샘플(들)을 본 발명 및 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 챌린지 바이러스 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 접촉시키는 단계,
(ix) 상기 테스트 샘플(들)을 이전 항목 중 어느 하나에 따른 구성요소 1의 챌린지 바이러스 또는 바이러스-생산 패키징 세포와 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 37℃, 및 다양한 시간, 바람직하게는 6 내지 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주 내의 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계.
이전 항목 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 세포주가 제2 리포터 단백질을 발현하고, 상기 방법이 하기 단계들을 추가로 포함하는 방법:
(iv) 상기 세포주에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
구성요소 2의 상기 세포주의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, AAV 혈청형 게놈 또는 재조합 AAV 벡터 구조물에 존재하는 태그 서열에 의한 상기 세포주의 처리에 반응하는 이종 시스-작용 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 하류 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 여기서 상기 프로모터는 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제와 같은 제1 리포터 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동적으로 연결된, 단계,
(ix) 바람직한 일 구현예에서, 분석의 정규화를 제공하기 위해, 본 발명에 따른 구성요소 2의 세포는 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 포함된 태그 서열과 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 가진다. 예를 들어, 구성적 생산은 제2 루시퍼라아제일 수 있으며, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제일 수 있다.
(x) 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포는 96, 384 또는 1536 웰 플레이트 분석 플레이트에 접종된다.
참고문헌들
1. Fitzpatrick Z. et al. Mol Therapy: Methods & Clinical Develop. 9:119-129, 2018
2. Colella, P. et al. Molecular Therapy. 8:87-104, 2018.
3. Lee, EJ., Guenther, CM., Suh, J (2018). Curr. Opin., Biomed. Eng. 7:58-63
4. Muzcyzka, N. (1992).. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129.
5. Buller RM, et al. J. Virol. 40 :241-247, 1981
6. Schlehofer, JR., et al. Virology. 152:110-117, 1986.
7. King, JA., et al EMBO J. 20:3282-3291. (2001).
8. Agbandje-McKenna, M. & Kleinschmidt, in Adeno-associated Virus 47-92, 2012
9. Pillay, S., et al. Nature 530: 108-112, 2016
10. Dudek, AM. Molecular Therapy. 28:1-15, 2019.
11. Li, J., Samulski, RJ., & Xiao, X. J. Virol. 71:5236-5243, 1997
12. Xiao, X., Li, J., and Samulski, RJ. J. Virol. 72:2224-2232, 1998
13. Allen, JM., et al. Mol. Therapy. 1:88-95. 2000
14. Li, C., and Samulski, RJ. Nat. Rev. Gen.. 21:255-272, 2020.
15. Lallemand C. A J Immunol Res. 390:1-19, 2017
Claims (16)
- 진단 방법에서의 2개의 세포주의 용도로서, 제1 세포주는 하기를 포함하는 구성요소 1로 지칭되며:
(i) AAV ITR 내에 포함된, 하나 이상의 태그 서열을 포함하고 상기 태그 서열은 서로 다른, AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물,
(ii) 구성적 프로모터나 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된, 자연 발생 Cap, 하이브리드 Cap, 또는 키메라 Cap을 인코딩하는 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터의 cap 유전자,
(iii) 천연 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된, AAV rep 유전자,
(iv) 각각 개별 천연 프로모터에 작동적으로 연결된, AAV E2A, E4, 및 VA 유전자,
(v) 유도성 프로모터에 작동적으로 연결되거나 HEK293 세포의 경우와 같이 세포에 내인적으로 존재하는, AAV E1A 유전자,
및 추가의 세포주는 하기를 포함하는 구성요소 2로 지칭되는:
구성요소 1의 세포의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내에서 (i)에 따른 하나 이상의 태그 서열에 특이적으로 반응하는 리포터-유전자,
진단 방법에서의 2개의 세포주의 용도. - 제1항에 있어서,
상기 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서/프로모터, SV40 프로모터, UBC 프로모터, PGK 프로모터, 인간 β-액틴(hACTB), 인간 신장 인자-1α(hEF-1α), 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택되는, 용도. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 유도성 프로모터는 Tet-on/Tet-off 시스템, 쿠메이트-유도성 억제인자 CymR 시스템, 플라보노이드 플로레틴 조절된 TtgR 억제인자 시스템, 및 바닐산 조절된 VanR 억제인자/KRAP 시스템으로부터 선택되며, 상기 (iii), (iv), (v)에서의 유도성 프로모터는 서로 다른, 용도. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
구성요소 1의 세포가 Gal4 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 태그 서열을 함유하는 전이유전자-프로모터 구조물을 발현하고, 이는 반딧불이 루시퍼라아제(FL) 유전자의 발현을 조절하는 Gal4 상류 활성화 서열(UAS)에 특이적으로 결합하며, 또는 AAV 게놈이나 전이유전자 구조물 내의 VanR 서열을 발현하거나, 또는 AAV 게놈이나 전이유전자-프로모터 구조물 내의 cGMP 특이적 수용체 단백질(CRP)을 인코딩하는 서열을 발현하는, 용도. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 함유된 태그 서열이 트랜스-활성화인자 VP16에 융합된 트랜스-사일런서 VanR을 인코딩하는, 용도. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
구성요소 2는 Gal 4 상류 활성화 서열(UAS) 및 전사 개시점 TATAA 또는 이의 변이체를 포함하는 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자를 포함하거나, 또는 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 gal4 태그 서열에 특이적으로 반응하는, Gal4 UAS의 직렬 반복부 또는 선택적으로 이의 5배 직렬 반복부를 포함하는, 용도. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구성요소 2는 OTG 작동자 서열 및 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자, 또는 이의 직렬 반복부 또는 이의 4배 직렬 반복부를 포함하며, 이는 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자-프로모터 구조물 내의 CRP 서열에 특이적으로 반응하고, 제1 리포터 단백질로 지칭되는 상기 리포터는 반딧불이 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제와 같은 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제, 또는 신규한 루시퍼라아제를 포함하는 다른 단백질, 또는 예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 청색 형광 단백질 및 다양한 여기/방출 스펙트럼을 표시하는 이의 변형체인, 용도. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구성요소 2는 VanO 작동자 모듈, 또는 이의 직렬 반복부, 또는 옥타머 VanO 작동자 모듈(Van08), 및 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내의 VanR 서열에 특이적으로 반응하는 CMV 즉각 초기 프로모터와 같은 최소 프로모터를 포함하는 키메라 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터-유전자를 포함하는, 용도. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구성요소 2는, 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 포함된 하나 이상의 태그 서열에 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 포함하며, 상기 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현은 제2 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제의 구성적 생산인, 용도. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구성요소 1은 적어도 5개의 재조합 표적 부위를 포함하는, 용도. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 진단 방법은 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 재조합 AAV 벡터에 대해 유도되는 중화 항체의 검출 및 정량하는 단계를 포함하거나, 구성요소 1과 구성요소 2 모두의 도움으로 AAV 캡시드, AAV 게놈, 전이유전자, 또는 전이유전자 산물에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위해 환자 샘플을 고처리량으로 스크리닝하는 단계를 포함하는, 용도. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구성요소 1 및 상기 구성요소 2의 세포를 야생형 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 중화 항체를 함유할 것으로 생각되는 생물학적 샘플과 공동-배양하는, 용도. - 테스트 샘플에서 항-AAV 중화 항체의 활성을 검출하고 선택적으로 정량하는 방법으로서,
(i) 항-AAV 항체가 없는 대조구 샘플(들) 및 선택적으로 항-AAV 중화 항체를 함유하는 것으로 알려진 양성 대조구 샘플(들)과 함께 항-AAV 항체를 함유할 것으로 생각되는 테스트 샘플(들)을 제공하는 단계,
(ii) (i)의 상기 테스트 샘플(들)을 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 구성요소 1의 바이러스-생산 세포, 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 구성요소 1 내의 바이러스-생산 세포, 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 약 37℃에서 다양한 시간, 바람직하게는 약 6 내지 약 18시간 또는 그 이상 접촉시킨 후, 구성요소 2의 세포 내 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서,
상기 구성요소 2의 세포는 제1 태그 리포터 단백질과 다른 제2 리포터 단백질을 발현하며, 상기 방법은 하기 단계들을 추가로 포함하는 방법:
(i) 제1 세포 샘플의 상기 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 리포터 단백질의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계,
(ii) 제2 대조구 세포 샘플의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 제2 리포터 단백질의 활성에 대해 정규화 또는 정규화아닌 방식으로 결정하는 단계,
(iii) 제1 및 제2 대조구 세포 샘플의 리포터 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 여기서 1보다 낮은 비율(제1/제2)은 상기 샘플에 AAV 혈청형 또는 재조합 AAV 벡터에 대한 항체가 존재함을 나타내는, 단계. - AAV 캡시드, AAV 게놈, 전이유전자 또는 전이유전자 산물에 대한 면역 반응을 검출하고 최적으로 모니터링하기 위한 환자 샘플의 고처리량 스크리닝 방법으로서,
(i) 선별할 환자 샘플로 구성된 테스트 샘플(들)을 제공하는 단계,
(ii) 상기 테스트 샘플(들)을 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 1의 바이러스-생산 세포와 접촉시키는 단계,
(iii) 상기 테스트 샘플(들)을, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 1의 바이러스-생산 세포와 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 2의 세포와 함께 다양한 온도, 바람직하게는 약 37℃에서 및 다양한 시간, 바람직하게는 약 6 내지 약 18시간 또는 그 이상 배양한 후, 상기 세포주 내의 AAV-태그 반응성 제1 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서,
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 2의 상기 세포가 제1 태그 리포터 단백질과 다른 제2 리포터 단백질을 추가로 포함하고, 상기 방법은 하기 단계들을 추가로 포함하는 방법:
(i) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 2의 세포에서 제1 태그-반응성 리포터 단백질의 활성을 결정하는 단계,
(ii) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 2의 세포들의 활성 사이의 비율을 제공하는 단계로서, 상기 세포들은 구성요소 1의 AAV 혈청형 게놈 또는 재조합 AAV 벡터 구조물에 존재하는 태그 서열에 의한 세포주의 처리에 반응하는 이종 시스-작용 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이는 하류 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 있으며, 여기서 상기 프로모터는 루시퍼라아제, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제와 같은 제1 리포터 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동적으로 연결된, 단계,
(iii) 선택적으로, 분석의 정규화를 제공하는 단계로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 명시된 구성요소 2의 세포는 구성요소 1의 AAV 게놈 또는 전이유전자 구조물 내에 포함된 태그 서열과 반응하는 리포터 유전자 구조물에 사용된 것과 다른 루시퍼라아제의 구성적 발현을 위한 구조물을 추가로 포함하며, 구성적 생산은 예를 들어, 제2 루시퍼라아제와 같은 것이며, 예를 들어 레닐라 루시퍼라아제, 반딧불이 루시퍼라아제, 메트리디아 루시퍼라아제, 또는 EP 출원 21170068.7에 기술된 것과 같은 신규 루시퍼라아제인, 단계.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21198072.7A EP4151736A1 (en) | 2021-09-21 | 2021-09-21 | Novel system for the quantification of anti-aav neutralizing antibodies |
| EP21198072.7 | 2021-09-21 | ||
| PCT/EP2022/076161 WO2023046717A1 (en) | 2021-09-21 | 2022-09-21 | Novel system for the detection and quantification of anti-aav neutralizing antibodies. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240050462A true KR20240050462A (ko) | 2024-04-18 |
Family
ID=78080132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020247011255A KR20240050462A (ko) | 2021-09-21 | 2022-09-21 | 항-aav 중화 항체의 검출 및 정량을 위한 신규 시스템 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP4151736A1 (ko) |
| KR (1) | KR20240050462A (ko) |
| WO (1) | WO2023046717A1 (ko) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2543381T3 (es) | 2008-03-04 | 2015-08-18 | Centre National De La Recherche Scientifique | Ensayo con gen indicador, las células y el kit para realizar dicho ensayo |
| US20210293784A1 (en) * | 2017-04-07 | 2021-09-23 | Svar Life Science Ab | System for the adaptation of cell-based assays for analysis on automated immuno-assay platforms |
| CN112513641A (zh) * | 2018-06-20 | 2021-03-16 | 百时美施贵宝公司 | Aav疗法的方法 |
| SG11202113048SA (en) * | 2019-05-29 | 2021-12-30 | Encoded Therapeutics Inc | Compositions and methods for selective gene regulation |
-
2021
- 2021-09-21 EP EP21198072.7A patent/EP4151736A1/en not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-09-21 EP EP22793409.8A patent/EP4405491A1/en active Pending
- 2022-09-21 WO PCT/EP2022/076161 patent/WO2023046717A1/en active Application Filing
- 2022-09-21 KR KR1020247011255A patent/KR20240050462A/ko active Search and Examination
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4151736A1 (en) | 2023-03-22 |
| WO2023046717A1 (en) | 2023-03-30 |
| EP4405491A1 (en) | 2024-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240018545A1 (en) | Adeno-associated virus (aav) producer cell line and related methods | |
| US20130023033A1 (en) | Pharmacologically induced transgene ablation system | |
| US11926841B2 (en) | AAV-based conditional expression system | |
| US20230279427A1 (en) | Cell lines for recombinant aav production and aav-implemented protein production | |
| JP2020533973A (ja) | 改変されたホスホリパーゼドメインを含むアデノ随伴ウイルス（ａａｖ） | |
| CN116323953A (zh) | 诱导产生raav病毒粒子的稳定细胞系 | |
| WO2021195491A2 (en) | Inducible promoter for viral vector production | |
| WO2021195494A2 (en) | Inducible promoter for viral vector production | |
| KR20240050462A (ko) | 항-aav 중화 항체의 검출 및 정량을 위한 신규 시스템 | |
| US20230111672A1 (en) | Compositions and methods for production of recombinant adeno-associated virus | |
| JP2024534725A (ja) | 抗ａａｖ中和抗体の検出及び定量のための新規系。 | |
| JP2023546116A (ja) | Ｖａ ｒｎａ転写のための核酸構築物 | |
| JP2023546113A (ja) | 同時遺伝子活性化のための核酸構築物 | |
| US20210388343A1 (en) | Nucleic acid molecules and methods for aav vector selection | |
| US20020182595A1 (en) | Method of identifying cellular regulators of adeno-associated virus (AAV) | |
| CN115885046A (zh) | 用于病毒载体生产的诱导型启动子 | |
| WO2023198685A1 (en) | Method for determining aav genomes | |
| WO2024145499A2 (en) | Materials and methods for characterizing potency | |
| Rampalli et al. | 903. Scaleable Recombinant Herpes Simplex Virus 1 Vector Production for Gene Therapy Applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |