KR20240042000A - 분리된 다당류 화합물 및 사용 및 제조의 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서 설명되는 것은 분리된 생물학적 다당류 화합물이다. 생물학적 다당류 화합물은 분리됨으로써 그리고 65-95%wt의 1:3 결합 글루코피라노실 잔기 및 5-25%wt의 1:6 결합 글루코피라노실 잔기를 포함하는 글리코실 결합; 및 85-100%의 순도 β-글루칸; 및 0.5 내지 2.2MDa의 분자량; 및 인체 바이오어세이에서 음성 대조 TNF-알파 사이토카인 반응보다 적어도 1.5배 더 큰 인체 바이오어세이에서 TNF-알파 사이토카인 반응; 및 수용액에서 본질적으로 불용성을 가짐으로써 특징 지어질 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 상처 또는 화상 등 피부 부위로 분리된 생물학적 다당류를 포함하는 운반체의 국소적 적용에 의해 피부를 치료하는 방법이 설명된다. 제조의 방법 또한 설명된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 7월 30일자로 출원되고 WIPO DAS 코드 8235를 가진 미국 유틸리티 특허 출원 제17/390,809호에서부터의 PCT 특허 출원이며, 그것의 명세서는 참조에 의해 본 명세서에서 통합된다.
기술 분야
본 명세서에서 설명되는 것은 분리된 생물학적 다당류 화합물, 이의 사용의 방법 및 제조의 방법이다. 더 구체적으로, 다당류는 생물학적으로 유래된 다당류의 고순도(highly pure) 형태일 수 있고, 사용의 방법은 국소적 피부 치료와 관련될 수 있다. 제조의 방법은 예상치 못하게 임상적으로 효능 있는 다당류 화합물을 제공하는 것으로 보이는, 최신 기술 방법에 대해 추가적인 제조 단계를 포함한다.
본 명세서에서 다당류 화합물 및 관련된 측면이 설명된다. 설명의 용이함을 위해, 본 명세서에서 설명되는 다당류는 효모에서 유래되고, 따라서 이후로 생물학적 다당류, 생물학적으로 유래되는 다당류, 글루칸, 또는 β-글루칸으로 호환적으로 지칭될 수 있다.
효모에서부터 생물학적으로 유래되는 다당류는 글리코실 결합(glycosyl linkage)으로 구성되는 알려진 화합물이다. 다른 사용들 중에서 상처 회복을 촉진하기 위한 그들의 사용이 알려져 있다. 비-셀룰로오스성 β-글루칸은 강력한 면역학적 활성제로 인식된다. β-글루칸은 일반적으로 안전하고 시술후(postoperative) 감염의 비율을 약화시키는 것으로 알려져 있다.
기존 기술은 조직 재건(repair), 피부 케어 및 그러한 제품에서 하나의 필수적인 화합물이 효모 세포 막 제품인 경우 다른 사용들에 관한 결과물들을 설명한다. 최신 기술은 피부 상태를 치료하기 위한 효모 세포 제품의 사용; 효모에서부터 β-글루칸을 제조하는 과정; 효모에서부터 피부 세포 제품의 처치(treatment); 국소적으로 적용되는 효모-유래 입자 β-글루칸을 사용하여 피부를 재활력하는 것; 겔 또는 크림으로 화상의 국소적 치료를 위한 곡물(cereal) 유래 β-글루칸; 동결 건조를 사용하여 작은 입자 글루칸의 제조(preparation); 효소를 사용하여 β-글루칸을 추출하는 과정; 레이저 또는 화학적 필링 치료 후 피부를 치료하기 위해서 캐리어 내에 카르복시메틸 β-글루칸을 사용하는 것; 레이저 또는 화학적 필링 치료 후 피부를 치료하기 위한 미세입자 β-글루칸의 국소적 적용; 1-3 결합 및 제한된 1-6 측쇄만을 가지는 정제된 효모 추출 β-글루칸의 효능; 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces Cerevisiae)에서부터 유래되는 겔 글루칸 제품을 설명한다.
임상적 해석에 대한 접근에서 이질성 및 이러한 물질(agent)을 추출하고 정제하는 접근에서 변형과 함께, β-글루칸 구조 및 그들의 효능 프로파일 사이의 복잡한 관계의 이해에서 결함이 존재한다. 이러한 결함은 이중 맹검 무작위 배정 위약 대조 시험에서 규제관들에 의해 설정된 임상적으로 승인되는 종결점을 달성하는 것에서 실제 입증된 성공을 가지는 분자에 대한 연구를 방해하였다.
현재까지 β-글루칸은 상처 치유에서 적응증(indication)에 대한 약물 또는 생물학적 승인을 획득하는 것에 성공한 바 없다. 상처 치유에 사용하기 위한 분자와 관련된 선행 기술에도 불구하고, 제형(formulation)을 포함하는 어떠한 β-글루칸도 규제 의무 임상적 종결점에 관한 이중 맹검 위약 대조 인체 시험에서 정맥성 하지 궤양(venous leg ulcer) 또는 다른 만성 상처에서 임상적 효능을 입증한 바 없다.
본 발명자들의 경험에서, 선행 기술은 어떤 분자 특성화(characterisation)가 임상적 효능의 증거를 생성하는지를 해결하거나 설명한 바 없다. 예를 들어, 최신 기술은 상처 치유 종결점에 관한 실제 입증된 임상적 효능과 결합되는 최종 제품의 일관성에 관한 모든 규제적 승인을 달성하기 위해, 글루칸 분지형 구조가 무엇이어야 하는지; 분자량이 무엇이어야 하는지; 이상적인 순도 및 측정된 면역 반응이 무엇이어야 하는지 등을 설명한 바 없다.
글루칸의 분야에서 상당한 양의 선행 기술에도 불구하고 지금까지 어떠한 글루칸도 임상 시험에 관한 미국 식품의약국의 유효한 종결점을 충족한다고 승인된 바 없다. 그러나 유효하고 효능 있는 피부 치료에 대한 필요성이 남아 있고, 효능 있는 새로운 치료는 상당한 가치를 가진다. 막대한 미충족 필요를 가지는 적응증에도 불구하고지난 30년간 정맥성 하지 궤양을 치료하기 위한 치료상의 주장과 더불어 어떠한 약물도 승인된 바 없음을 유념한다.
구체적으로, 본 발명자들은 최신 기술이 다음을 설명하지 않는다는 것을 확인하였다:
- 정맥성 하지 궤양 및 만성 상처의 치료에서 규제관들에 의해 설정된 황금 기준(gold standard) 상처 치유 종결점에 관한 임상적 효능을 입증하는 β-글루칸 화합물의 정확한 특성화 및 설명;
- 불용성 효모(사카로마이세스 세레비지에) 유래 β-글루칸의 US 6,242,594 에 설명된 것 이상의 추가적인 처리;
- US 6,242,594에 설명된 것 보다 더 높은 순도 β-글루칸 화합물;
- 미세입자 β-글루칸;
- 미용의 피부 상태 및 만성 상처의 치료에서 예상치 못한 입증된 임상적 효능;
- 탄력 섬유증(elastosis) 및 주름에 의해 측정되는 피부 품질을 개선하기 위해 국소적으로 적용되는 미세입자 생물학적 다당류 화합물의 사용.
- 레이저 절제 레이저 수술 후 피부 품질 이점에서 가속(acceleration)에서 임상적 증거를 제공하기 위한 생물학적 다당류 화합물의 사용;
- 정맥성 궤양의 치유를 개시(initiate)하는 것 뿐만 아니라 가속화하는 생물학적 다당류 화합물의 사용;
- 인체 이중 맹검 무작위 배정 위약 대조 시험에서 상처 치유에서 입증된 임상적 효능;
- 인체 이중 맹검 무작위 배정 위약 대조 시험에서 탄력 섬유증 및 주름에서의 임상적 등급된 개선에 의해 측정되는 가속화된 피부 품질에서 입증된 임상적 효능;
- 최신 기술은 또한 불용성 생물적 다당류 화합물 또는 불용성 β-글루칸 자체에서부터 멀어진다. 최신 기술은 과도한 염증 반응이 해로움 및 실제로 더 불량한(poorer) 치유 결과를 야기하므로 불용성이 고도로 염증성이고 국소적 상처/피부 환경에서 사용되어서는 아니된다는 것을 실제로 나타낸다.
- 예상치 못한 긍정적 효과를 생성하는 상처 치유를 위한 선행 기술 화합물에 비하여 매우 고도의 면역 반응의 증거;
- 정맥성 하지 궤양의 적응증에서뿐만 아니라 FDA 및 치료적 라벨을 부여하는 다른 규제관에 의해 수용 가능한 종결점에 관한 미용술(cosmesis)에서도 긍정적 제IIB상 데이터를 달성한 생물학적 다당류 화합물.
생물학적 다당류 화합물, 이의 사용의 방법 및 이의 제조의 방법의 추가적인 측면 및 장점은 예시적으로만 주어지는 다음 설명에서부터 분명해질 것이다.
본 명세서에서 설명되는 것은, 고순도의 형태에, 분리된, 불용성 생물학적으로 유래된 다당류 화합물이다. 본 화합물의 사용의 방법이 설명되며 특히 국소적 피부 치료에서, 본 화합물의 효능의 예상된 수준보다 더 높다는 것을 나타낸다. 제조의 방법이 또한 설명되며 예상치 못하게 효능 있는 다당류 화합물을 제공하는 것으로 보이는, 최신 기술 방법에 대안적인/추가적인 제조 단계를 나타낸다.
제1 측면에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 생물학적 다당류 화합물이 제공된다:
65-95%wt의 1:3 결합 글루코피라노실 잔기(glucopyranosyl residue) 및 5-25%wt의 1:6 결합 글루코피라노실 잔기를 포함하는 글리코실 결합;
85-100%의 순도 β-글루칸;
0.5 내지 2.2MDa의 분자량;
인체 바이오어세이에서 음성 대조 TNF-알파 사이토카인 반응보다 적어도 1.5배 더 큰 인체 바이오어세이에서 TNF-알파 사이토카인 반응;
수용액에서 본질적으로 불용성.
제2 측면에서, 상처 부위로 운반체의 국소적 적용에 의해 피부 치료를 필요로 하는 환자의 피부를 치료하는 방법으로서, 운반체는 실질적으로 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 분리된 생물학적 다당류 화합물의 치료적으로 유효한 양을 포함하는 방법이 제공된다.
제3 측면에서, 피부 치료를 필요로 하는 환자의 피부의 국소적 치료를 위해, 의약의 제조에서, 실질적으로 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 분리된 생물학적 다당류 화합물의 사용이 제공된다.
제4 측면에서, 실질적으로 위에서 설명된 바와 같은 분리된 생물학적 다당류 화합물을 제조하는 방법이 다음의 단계에 의해 제공된다:
효모 세포를 선택하는 단계;
세포를 용해하고 세포 벽 조각을 수집하는 단계;
만난 및 키틴을 제거하기 위해 세포 벽 조각을 산성화하고 가열하는 단계;
단백질, 글리코겐 및 지질과 함께 추가적인 만난 및 추가적인 키틴을 제거하기 위해 용매로 상 분리를 수행하는 단계;
비등 및 건조를 통하여 용매 및 다른 비-다당류 화합물을 분리하는 단계; 및
용해 후에 및 산성화 전에 적어도 1번의 물 헹굼 단계를 수행하는 단계.
위에서 설명된 분리된 생물학적 다당류 화합물, 사용의 방법 및 제조의 방법은 다수의 장점을 포함할 수 있고, 하나는 본 화합물이 임의의 유해한 염증성 영향없이 국소적 치료에 대해 예상치 못한 그리고 최적의 면역원성(immunogenic) 반응을 제공하는 것이다.
생물학적 다당류 화합물, 이의 사용의 방법 및 제조의 방법의 추가적인 측면은 예시적으로만 주어지는 다음의 설명에서부터 그리고 첨부 도면을 참조하여 분명해질 것이다:
도 1A 및 도 1B는 설명되는 생물학적 다당류가 (1→3)(1→6)-β-글루칸의 일반적인 구조를 가지는 β-글루칸 기반 다당류인 경우에 1H NMR 그래프 및 분자를 개략적으로 도시한다. 단순화를 위해, 주요 잔기는 'BC', 'Br' 및 'SC'로 표시된다. BC는 백본(backbone) 잔기를 나타내는 반면, Br은 분지(branching) 잔기를 나타내고 SC는 측쇄(side-chain) 잔기를 나타낸다;
도 2는 본 발명 화합물의 미세입자 형태의 안전성 및 효능을 확립하기 위한 제Ⅰ상 호주 시험에서부터의 결과를 도시한다. 6명의 환자를 포함하는 개방적, 비-대조 시험이 수행되었다. 운반체 내 본 발명 화합물이 기준 상처 치료법에 실패한 환자에 대해 4주간 2-3일마다 국소적으로 적용되었다. 본 시험 물질(article)의 사용과 관련하여 어떠한 중대한 불내성(intolerance) 또는 독성도 관찰되거나 보고되지 않았다. 치유 반응은 모든 6명의 환자에서, 56일 기간에 걸쳐 측정된, 26% 내지 82% 범위의 상처 표면적에서 감소와 함께 관찰되었다;
도 3은 기준 상처 관리 치료법에 난치성(refractory)이 된 CDVI 궤양을 가지는 18명의 환자에서 단일 센터(single-centre), 무작위 배정(randomised), 이중-맹검, 운반체-대조 시험에서 본 발명 화합물의 효능을 결정하기 위해 수행된 제2 제Ⅰ/Ⅱ상 연구에서부터의 결과를 도시한다. 본 발명 화합물은 더 낮은 분자량 범위 및 더 적은 비율의 (1:6)-β-글루칸 측-분지(side-branching)를 가지는 다른 형태의 글루칸(GlucodineTM) 및 운반체(대조)와 비교되었다. 효능은 상처의 표면적을 측정하는 면적측정(planimetry)에 의해 평가되었다. 4주에 걸친 개선의 평균 비율은 운반체 그룹에서 4.4%, 본 발명 화합물 그룹에서 36.7%, 및 GlucodineTM 그룹에서 17.3%였다. 본 결과는 본 발명 화합물이 상처 치유의 촉진에 대해 더 효능적인 유효 물질을 수용하였다는 것을 나타내었다;
도 4는 당시 최종 규제 제Ⅲ상 연구의 기반을 형성할 적절한 제형을 확인하는 것을 목표로 수행된 제3 연구 제ⅡA상 연구의 결과를 도시한다. 이것은 컴퓨터가 생성한 배정 순서를 사용하는 무작위 배정 기반 상의 세 개의 치료 그룹 중 하나에 배정된 환자와 함께한 제2상, 이중-맹검, 무작위 배정, 운반체-대조 연구였다. 만성 정맥성 궤양을 가진 58명의 환자가 두 지역에서 모집되었고, 고-용량 활성(1.0% 본 발명 화합물 겔) 또는 저-용량 활성(0.1% 본 발명 화합물 겔), 또는 겔 베이스 단독(운반체 대조) 중 하나에 무작위로 배정되었다. 본 연구는 하지의 만성 정맥성 부전(insufficiency) 궤양을 가진 환자에서 본 발명 화합물의 효능 및 안전성의 통계적 평가를 제공하기 위해 의도되었다. 제Ⅱ상 연구에서부터의 데이터는 본 발명 화합물이 상처가 치유되는 속도를 촉진하였다는 것과 더불어 치료된 궤양은 위약-치료된 궤양과 비교하여 통계적으로 상당한 속도의 개선으로 치유되었다는 것을 나타내었다. 본 발명 화합물은 55%-59% 사이의 위약은 10%에서의 평균 상처 영역 감소를 나타내었다;
도 5는 분획(fractionated) 미용 레이저 시술(procedure)인 제어된(controlled) 화상 후에 본 발명 화합물을 포함하는 겔의 사용에서부터 26명의 환자 제ⅡA상 시험에서부터의 결과를 도시한다. 본 연구는 상처 치유 시간(in time wound healing)의 평균 30% 개선을 나타내었다. 본 발명 화합물(GLYC-101 0.1% 및 GLYC-101 1.0%로 표시) 그룹이 위약과 비교되었을 때, 상처 폐쇄를 완료하는 시간의 효능 결과는 더 빨랐다(각각 p = 0.0062 및 0.0331);
도 6, 도 7 및 도 8은 본 발명 화합물을 사용하여 완료된 제ⅡA상 호주 시험에서 정맥성 궤양의 환자 상처 크기 감소의 비전형적(atypical) 예시 사진을 도시한다;
도 9는 기존(incumbent) 제품 ApiligrafTM의 제Ⅲ상 데이터 및 그것의 제Ⅲ상 결과 대 미국 기반 82명의 환자 제ⅢB상 시험에서 운반체 및 본 발명 화합물을 위한 활성 그룹 사이에 완전 폐쇄의 원시 발생률(raw incidence)에서 차이를 도시한다. ApiligrafTM(www.apiligraf.com 참조)는 적용 당 대략 $1200US로 상환되며(reimbursed), ApiligrafTM를 사용하는 VLU의 일반적인 치료에서 3-15회의 적용이 요구될 수 있는, 정맥성 하지 궤양(VLU) 폐쇄에 대해 거의 틀림없는(arguable) 황금 기준이다. 본 발명 화합물은 ApiligrafTM의 17% 조정된 완전 폐쇄 발생률에 비해 완전 폐쇄 발생률에서 21% 조정된 차이를 달성하였다. ITT 그룹 및 PP 그룹에 대한 유의미한 차이가 기록된다. 결과는 시험 설계(맹검 포함), 포함 및 제외 기준에서 차이를 고려하면 엄격하게 비교 가능하지 않으나, 황금 기준 제품에 비해 본 발명 화합물의 비교 가능하거나 더 우수한 효능의 강력한 징후를 제공한다;
도 10은 정맥성 하지 궤양에서 82명의 환자 제ⅡB상 시험에서부터 승산비(ODDS RATIO, OR) 결과를 도시한다. 그것은 위약에 비해 활성 그룹에 대한 100% 치유를 달성한 OR을 나타낸다. 결과는 치유에 영향을 주는 것으로 알려진 공변량(covariate)을 조정하는 로지스틱 회귀에서부터 유래한다. OR의 해석은, 예시적으로, OR이 1.4인 경우, TR 987 그룹에서 치유의 승산은 위약 그룹에서 치유의 승산보다 1.4배 더 높다. 1을 초과하는 값은 치료를 지지(favour)하고, 1 미만의 값은 위약을 지지한다; 모든 그룹에 대한 승산비는 임상적으로 유의미하고(2.0초과), 모든 것이 완전 치유를 달성하는 승산이 위약에 비해 활성 그룹에서 2배라는 것을 시사하는 본 발명 화합물을 지지한다;
도 11은 제ⅡA상 및 제ⅡB상 시험을 완료한 환자의 평균 상처 영역 감소의 비교를 도시한다. 본 데이터는 두 개의 별도의 독립적인 제Ⅱ상 시험에서 상처 영역 감소에 의해 측정된 바와 같이 본 발명 화합물이 일관된 효능을 생성하는 것을 설명한다;
도 12는 정맥성 하지 궤양 치료에 대해 ApiligrafTM 대 본 발명 화합물 효능을 도시한다. 그것은 위약 대 완전 폐쇄의 발생률에서 차이를 도시한다. 본 도면에서, 본 발명 화합물은 TR-987로 표시된다. 본 도면은 활성 및 위약 사이에 완전 폐쇄를 달성한 환자의 비율에서 차이를 도시한다. 본 발명 화합물은 ApiligrafTM에 대한 완전 폐쇄의 조정된 발생률 17% 대 완전 폐쇄의 발생률에서 21% 조정된 차이를 달성하며, 거의 틀림없는 황금 기준 제품 대비 본 발명 화합물의 더 우수한 차이를 도시한다;
도 13은 인체 태반(placenta)에서부터 유래되고 인체 조직 치유 제품으로 승인된 제품인 EpifixTM(https://mimedx.com/epifix/ 참조)와 비교하여, 상처 영역 감소의 메트릭(metric)을 사용하여 본 발명 화합물의 효능의 비교를 도시한다;
도 14, 도 15 및 도 16은 본 발명 화합물을 사용하여 완료된 제ⅡB상 82명의 환자 시험에서 정맥성 궤양 상처의 환자 상처 크기 감소의 비전형적 예시 사진을 도시한다.
도 17은 최소 침습적 미용 시술(흉부의 CO2 분획 레이저 시술) 후에 본 발명 화합물을 받은 환자의 비전형적 예시 및 제ⅡB상 레이저 절제 시험 n=40에서 관찰된 개선된 피부 품질 결과의 비전형적 예시를 도시한다. 제ⅡB상 시험에서 본 발명 화합물을 사용한 환자는 겔 운반체 내 본 발명 화합물의 사용에서부터 28일차에 탄력 섬유증 및 주름에 의해 측정된 가속화된 피부 품질의 발생률에서, 위약 겔 + 케어의 기준에 비해, 두 배에 근사하는 발생률을 경험하였다(p<0.04, n=40);
도 18은 본 발명 화합물 및 운반체 그룹 각각 내에서 기준선 및 28일차 사이에 주름 점수에서 ≥ 1점 개선을 달성한 환자의 비율을 도시한다(Fitzpatrick-Goldman 분류). 위약 그룹(응답자의 50%만이 1 이상의 주름 점수를 달성) 대 본 발명 화합물 그룹에 대해서 응답자의 85%가 1 이상의 주름 점수를 달성하였다. 카이 제곱(chi square), 또는 피셔 정확을 사용한 70% 분산, P<0.04;
도 19는 본 발명 화합물 및 운반체 그룹 각각 내에서 28일차에 탄력 섬유증 점수에서 ≥ 3점 개선을 달성한 환자의 비율을 도시한다(Fitzpatrick-Goldman 분류). 조정되지 않은 비율에 대하여 카이 제곱 시험이 p값으로 표현되는 중요도(significance)를 결정하기 위해 사용되었다. 28일차에 위약 그룹에 대해서 응답자의 오직 35% 대 활성 그룹에 대해서 응답자의 75%가 탄력 섬유증에서 3 이상의 개선 점수를 달성하였다(114% 분산 P<0.011); 및
도 20은 본 발명자들에 의해 상처 치유에 대해서 가장 관련된 β-글루칸 특허 공개로 고려된 WoulganTM으로 지칭된 추가적인 최신 기술 제품 대비 본 발명 화합물의 효능을 도시한다. WoulganTM은 인체 채취된 대식세포(macrophage) 세포에서부터 TNF 알파 반응을 측정하는 어세이에 의해 측정된 바와 같이, 대조에 비해 8.9배의 면역 반응을 생성하였다. 이에 반해, 본 발명 화합물은 동일한 운반체 대조 대 본 발명 화합물(TR-987로 표시)에 대해서 25.4배의 반응을 검정(assay)하였다. 이것은 본 발명 화합물이 WoulganTM 겔 보다 대략 3배 더 강력하며, 효능에서 최신 기술 화합물보다 매우 높은 증가라는 것을 암시한다.
도 1A 및 도 1B는 설명되는 생물학적 다당류가 (1→3)(1→6)-β-글루칸의 일반적인 구조를 가지는 β-글루칸 기반 다당류인 경우에 1H NMR 그래프 및 분자를 개략적으로 도시한다. 단순화를 위해, 주요 잔기는 'BC', 'Br' 및 'SC'로 표시된다. BC는 백본(backbone) 잔기를 나타내는 반면, Br은 분지(branching) 잔기를 나타내고 SC는 측쇄(side-chain) 잔기를 나타낸다;
도 2는 본 발명 화합물의 미세입자 형태의 안전성 및 효능을 확립하기 위한 제Ⅰ상 호주 시험에서부터의 결과를 도시한다. 6명의 환자를 포함하는 개방적, 비-대조 시험이 수행되었다. 운반체 내 본 발명 화합물이 기준 상처 치료법에 실패한 환자에 대해 4주간 2-3일마다 국소적으로 적용되었다. 본 시험 물질(article)의 사용과 관련하여 어떠한 중대한 불내성(intolerance) 또는 독성도 관찰되거나 보고되지 않았다. 치유 반응은 모든 6명의 환자에서, 56일 기간에 걸쳐 측정된, 26% 내지 82% 범위의 상처 표면적에서 감소와 함께 관찰되었다;
도 3은 기준 상처 관리 치료법에 난치성(refractory)이 된 CDVI 궤양을 가지는 18명의 환자에서 단일 센터(single-centre), 무작위 배정(randomised), 이중-맹검, 운반체-대조 시험에서 본 발명 화합물의 효능을 결정하기 위해 수행된 제2 제Ⅰ/Ⅱ상 연구에서부터의 결과를 도시한다. 본 발명 화합물은 더 낮은 분자량 범위 및 더 적은 비율의 (1:6)-β-글루칸 측-분지(side-branching)를 가지는 다른 형태의 글루칸(GlucodineTM) 및 운반체(대조)와 비교되었다. 효능은 상처의 표면적을 측정하는 면적측정(planimetry)에 의해 평가되었다. 4주에 걸친 개선의 평균 비율은 운반체 그룹에서 4.4%, 본 발명 화합물 그룹에서 36.7%, 및 GlucodineTM 그룹에서 17.3%였다. 본 결과는 본 발명 화합물이 상처 치유의 촉진에 대해 더 효능적인 유효 물질을 수용하였다는 것을 나타내었다;
도 4는 당시 최종 규제 제Ⅲ상 연구의 기반을 형성할 적절한 제형을 확인하는 것을 목표로 수행된 제3 연구 제ⅡA상 연구의 결과를 도시한다. 이것은 컴퓨터가 생성한 배정 순서를 사용하는 무작위 배정 기반 상의 세 개의 치료 그룹 중 하나에 배정된 환자와 함께한 제2상, 이중-맹검, 무작위 배정, 운반체-대조 연구였다. 만성 정맥성 궤양을 가진 58명의 환자가 두 지역에서 모집되었고, 고-용량 활성(1.0% 본 발명 화합물 겔) 또는 저-용량 활성(0.1% 본 발명 화합물 겔), 또는 겔 베이스 단독(운반체 대조) 중 하나에 무작위로 배정되었다. 본 연구는 하지의 만성 정맥성 부전(insufficiency) 궤양을 가진 환자에서 본 발명 화합물의 효능 및 안전성의 통계적 평가를 제공하기 위해 의도되었다. 제Ⅱ상 연구에서부터의 데이터는 본 발명 화합물이 상처가 치유되는 속도를 촉진하였다는 것과 더불어 치료된 궤양은 위약-치료된 궤양과 비교하여 통계적으로 상당한 속도의 개선으로 치유되었다는 것을 나타내었다. 본 발명 화합물은 55%-59% 사이의 위약은 10%에서의 평균 상처 영역 감소를 나타내었다;
도 5는 분획(fractionated) 미용 레이저 시술(procedure)인 제어된(controlled) 화상 후에 본 발명 화합물을 포함하는 겔의 사용에서부터 26명의 환자 제ⅡA상 시험에서부터의 결과를 도시한다. 본 연구는 상처 치유 시간(in time wound healing)의 평균 30% 개선을 나타내었다. 본 발명 화합물(GLYC-101 0.1% 및 GLYC-101 1.0%로 표시) 그룹이 위약과 비교되었을 때, 상처 폐쇄를 완료하는 시간의 효능 결과는 더 빨랐다(각각 p = 0.0062 및 0.0331);
도 6, 도 7 및 도 8은 본 발명 화합물을 사용하여 완료된 제ⅡA상 호주 시험에서 정맥성 궤양의 환자 상처 크기 감소의 비전형적(atypical) 예시 사진을 도시한다;
도 9는 기존(incumbent) 제품 ApiligrafTM의 제Ⅲ상 데이터 및 그것의 제Ⅲ상 결과 대 미국 기반 82명의 환자 제ⅢB상 시험에서 운반체 및 본 발명 화합물을 위한 활성 그룹 사이에 완전 폐쇄의 원시 발생률(raw incidence)에서 차이를 도시한다. ApiligrafTM(www.apiligraf.com 참조)는 적용 당 대략 $1200US로 상환되며(reimbursed), ApiligrafTM를 사용하는 VLU의 일반적인 치료에서 3-15회의 적용이 요구될 수 있는, 정맥성 하지 궤양(VLU) 폐쇄에 대해 거의 틀림없는(arguable) 황금 기준이다. 본 발명 화합물은 ApiligrafTM의 17% 조정된 완전 폐쇄 발생률에 비해 완전 폐쇄 발생률에서 21% 조정된 차이를 달성하였다. ITT 그룹 및 PP 그룹에 대한 유의미한 차이가 기록된다. 결과는 시험 설계(맹검 포함), 포함 및 제외 기준에서 차이를 고려하면 엄격하게 비교 가능하지 않으나, 황금 기준 제품에 비해 본 발명 화합물의 비교 가능하거나 더 우수한 효능의 강력한 징후를 제공한다;
도 10은 정맥성 하지 궤양에서 82명의 환자 제ⅡB상 시험에서부터 승산비(ODDS RATIO, OR) 결과를 도시한다. 그것은 위약에 비해 활성 그룹에 대한 100% 치유를 달성한 OR을 나타낸다. 결과는 치유에 영향을 주는 것으로 알려진 공변량(covariate)을 조정하는 로지스틱 회귀에서부터 유래한다. OR의 해석은, 예시적으로, OR이 1.4인 경우, TR 987 그룹에서 치유의 승산은 위약 그룹에서 치유의 승산보다 1.4배 더 높다. 1을 초과하는 값은 치료를 지지(favour)하고, 1 미만의 값은 위약을 지지한다; 모든 그룹에 대한 승산비는 임상적으로 유의미하고(2.0초과), 모든 것이 완전 치유를 달성하는 승산이 위약에 비해 활성 그룹에서 2배라는 것을 시사하는 본 발명 화합물을 지지한다;
도 11은 제ⅡA상 및 제ⅡB상 시험을 완료한 환자의 평균 상처 영역 감소의 비교를 도시한다. 본 데이터는 두 개의 별도의 독립적인 제Ⅱ상 시험에서 상처 영역 감소에 의해 측정된 바와 같이 본 발명 화합물이 일관된 효능을 생성하는 것을 설명한다;
도 12는 정맥성 하지 궤양 치료에 대해 ApiligrafTM 대 본 발명 화합물 효능을 도시한다. 그것은 위약 대 완전 폐쇄의 발생률에서 차이를 도시한다. 본 도면에서, 본 발명 화합물은 TR-987로 표시된다. 본 도면은 활성 및 위약 사이에 완전 폐쇄를 달성한 환자의 비율에서 차이를 도시한다. 본 발명 화합물은 ApiligrafTM에 대한 완전 폐쇄의 조정된 발생률 17% 대 완전 폐쇄의 발생률에서 21% 조정된 차이를 달성하며, 거의 틀림없는 황금 기준 제품 대비 본 발명 화합물의 더 우수한 차이를 도시한다;
도 13은 인체 태반(placenta)에서부터 유래되고 인체 조직 치유 제품으로 승인된 제품인 EpifixTM(https://mimedx.com/epifix/ 참조)와 비교하여, 상처 영역 감소의 메트릭(metric)을 사용하여 본 발명 화합물의 효능의 비교를 도시한다;
도 14, 도 15 및 도 16은 본 발명 화합물을 사용하여 완료된 제ⅡB상 82명의 환자 시험에서 정맥성 궤양 상처의 환자 상처 크기 감소의 비전형적 예시 사진을 도시한다.
도 17은 최소 침습적 미용 시술(흉부의 CO2 분획 레이저 시술) 후에 본 발명 화합물을 받은 환자의 비전형적 예시 및 제ⅡB상 레이저 절제 시험 n=40에서 관찰된 개선된 피부 품질 결과의 비전형적 예시를 도시한다. 제ⅡB상 시험에서 본 발명 화합물을 사용한 환자는 겔 운반체 내 본 발명 화합물의 사용에서부터 28일차에 탄력 섬유증 및 주름에 의해 측정된 가속화된 피부 품질의 발생률에서, 위약 겔 + 케어의 기준에 비해, 두 배에 근사하는 발생률을 경험하였다(p<0.04, n=40);
도 18은 본 발명 화합물 및 운반체 그룹 각각 내에서 기준선 및 28일차 사이에 주름 점수에서 ≥ 1점 개선을 달성한 환자의 비율을 도시한다(Fitzpatrick-Goldman 분류). 위약 그룹(응답자의 50%만이 1 이상의 주름 점수를 달성) 대 본 발명 화합물 그룹에 대해서 응답자의 85%가 1 이상의 주름 점수를 달성하였다. 카이 제곱(chi square), 또는 피셔 정확을 사용한 70% 분산, P<0.04;
도 19는 본 발명 화합물 및 운반체 그룹 각각 내에서 28일차에 탄력 섬유증 점수에서 ≥ 3점 개선을 달성한 환자의 비율을 도시한다(Fitzpatrick-Goldman 분류). 조정되지 않은 비율에 대하여 카이 제곱 시험이 p값으로 표현되는 중요도(significance)를 결정하기 위해 사용되었다. 28일차에 위약 그룹에 대해서 응답자의 오직 35% 대 활성 그룹에 대해서 응답자의 75%가 탄력 섬유증에서 3 이상의 개선 점수를 달성하였다(114% 분산 P<0.011); 및
도 20은 본 발명자들에 의해 상처 치유에 대해서 가장 관련된 β-글루칸 특허 공개로 고려된 WoulganTM으로 지칭된 추가적인 최신 기술 제품 대비 본 발명 화합물의 효능을 도시한다. WoulganTM은 인체 채취된 대식세포(macrophage) 세포에서부터 TNF 알파 반응을 측정하는 어세이에 의해 측정된 바와 같이, 대조에 비해 8.9배의 면역 반응을 생성하였다. 이에 반해, 본 발명 화합물은 동일한 운반체 대조 대 본 발명 화합물(TR-987로 표시)에 대해서 25.4배의 반응을 검정(assay)하였다. 이것은 본 발명 화합물이 WoulganTM 겔 보다 대략 3배 더 강력하며, 효능에서 최신 기술 화합물보다 매우 높은 증가라는 것을 암시한다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 명세서에서 설명되는 것은, 고순도 형태의, 분리된 생물학적으로 유래되는 다당류 화합물이다. 본 화합물의 사용의 방법은 특히 국소적 피부 치료에서 본 화합물의 예상치 못한 효능을 설명하면서 설명된다. 제조의 방법 또한 예상치 못하게 효능 있는 다당류 화합물을 제공하는 것으로 보이는, 최신 기술 방법에 대한 대안적인/추가적인 제조 단계를 설명하면서 설명된다.
본 명세서의 목적을 위해, 용어 '약(about)' 및 '대략(approximately)' 및 이의 문법적인 변형은 참조 양(quantity), 수준, 정도, 값, 수(number), 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양(amount), 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1%만큼 변동하는 양, 수준, 정도, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
용어 '실질적으로' 또는 이의 문법적인 변형은 적어도 약 50%, 예를 들어 75%, 85%, 95% 또는 98%를 의미한다.
용어 '포함하다' 및 이의 문법적인 변형은 포괄적인 의미를 가져야 한다. 즉, 그것이 직접 참조하는 나열된 구성요소뿐만 아니라, 다른 비-명세된(non-specified) 구성요소 또는 요소의 포함을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
용어 '다당류 화합물' 및 본 명세서에 사용되는 바와 같이 이의 문법적인 변형은 글리코실 결합을 포함하는 효모에서부터 유래되는 화합물을 포괄한다. 용어 '다당류 화합물'은 이후 용어 '생물학적 다당류', '생물학적으로 유래되는 다당류', '글루칸' 또는 'β-글루칸'과 호환적으로 사용될 수 있다. 달리 명세되지 않는 한, 하나의 용어에 대한 참조는 다른 용어의 사용을 제한하는 것으로 보여져서는 아니된다.
용어 β-글루칸 또는 이의 문법적인 변형이 본 명세서에서 사용된다. 이것은 β-D-글루칸을 포괄하거나 β-D-글루칸이다.
분리된 생물학적 다당류 화합물
제1 측면에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 생물학적 다당류 화합물이 제공된다:
65-95%wt의 1:3 결합 글루코피라노실 잔기 및 5-25%wt의 1:6 결합 글루코피라노실 잔기를 포함하는 글리코실 결합;
85-100%의 순도 β-글루칸;
0.5 내지 2.2MDa의 분자량;
인체 바이오어세이에서 음성 대조 TNF-알파 사이토카인 반응보다 적어도 1.5배 더 큰 인체 바이오어세이에서 TNF-알파 사이토카인 반응;
수용액에서 본질적으로 불용성인 것.
분리된
본 명세서의 맥락에서, 용어 '분리된'은 세포 또는 세포 벽에서부터와 같은 자연 상태에서부터 정제된 형태로 분리되는 생물학적 다당류 화합물을 의미한다. 분리의 정확한 방법은 다양할 수 있으나 단백질 및 지질 등 불순물을 세척하고 제거하는 다양한 단계를 포함할 수 있다.
분리된 생물학적 다당류 화합물은 실질적으로 온전(intact)할 수 있다. 즉, 분리의 과정은 화합물에서 화학적 결합의 파괴를 최소화하거나 피하고, 생물학적 다당류 화합물의 복잡성 및 크기를 온전하게 유지한다. 이러한 경우에서 복잡성은 생물학적 당 화합물의 분지된 1:3 대 1:6 측쇄의 비율과 구체적으로 관련될 수 있다.
생물학적 다당류 화합물
위에서 언급된 바와 같이, 분리된 생물학적 다당류 화합물이 본 명세서에서 설명된다.
적어도 하나의 실시예에서, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물은 효모에서부터 유래된다. 본 생물학적 다당류 화합물은 효모 세포에서부터 유래될 수 있다. 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지에 종에서부터 유래될 수 있다.
생물학적 다당류 화합물은 글루칸 화합물일 수 있다. 생물학적 다당류 화합물은 β-글루칸 화합물일 수 있다.
불용성
생물학적 다당류 화합물은 수용액에서 불용성이다.
용해도는 주어진 온도 및 압력에서 주어진 용매에 완전하게 용해될 수 있는 물질의 최대 농도로 정의될 수 있다. 물질의 용해도는 다양한 방식으로 설명될 수 있다. USP/NF는 일반적으로 특정 온도에서 약물 1g을 용해시키기 위해 요구되는 용매의 부피 측면에서 용해도를 표현한다. 본 방법을 사용하여, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물은 거의 불용성 또는 불용성이고, 하나의 부분의 용질에 필요한 용매의 부분은 10,000을 초과한다.
아래에 추가적으로 설명되는 제조의 방법에서부터 이해될 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물은 제조 동안 분리된 형태에 도달하기 위해 많은 수성 세척 단계의 대상일 수 있다. 임의의 용해성 화합물 또는 잔기는 제조 동안 불용성 완료된 화합물에서부터 제거될 것이다.
생물학적 다당류 화합물
생물학적 다당류 화합물은 특정 글리코실 화합물에 의해 특징 지어질 수 있다. 글리코실 사슬은 인체에서 염증 반응을 유발하는 생물학적 다당류 화합물의 일부일 수 있다. 설명되는 본 분리된 생물학적 다당류 화합물은 다수의 글리코실 측쇄를 가질 수 있고 이들은 글리코실 사슬에서 노출되는 항원 영역(region)을 포함하는 것이 본 발명자들에 의해 이해된다.
위에서 언급된 바와 같이 본 생물학적 다당류 화합물은 그것이 상당한 양의 1:6 결합 글루코피라노실 잔기를 가지는 점에서 독특하다. 최신 기술 β-글루칸 화합물은 종종 매우 높은 비율의 1:3 측쇄를 남기기 위해 이러한 측쇄(및 다른 제거되는 측쇄)를 가진다. 본 발명자들은 원하는 효능을 달성하기 위해 1:6 측쇄(및 분지된 vs 분지되지 않은 형태의 다른 것들)를 보존하는 것이 매우 중요할 수 있다는 것을 발견하였다.
추가적으로, 본 발명자들은 본 생물학적 다당류 화합물이 개방된 상처에 위치될 때 감염 또는 원하지 않는 영향을 유발할 수 있는 효모 세포 내에 임의의 구성요소를 가지는 것 없이, 효능을 달성하는 면역 반응의 최적 수준을 전달하는 것을 발견하였다.
측쇄 분석
적어도 하나의 실시예에서, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물은 설명되는1:3 및 1:6 측쇄 만을 포함한다.
적어도 하나의 실시예에서, 설명되는 1:3 및 1:6 측쇄 이외에 추가적인 측쇄가 존재할 수 있다. 만약 존재한다면, 추가적인 측쇄는 다음 측쇄 유형 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:
1:4 결합 글루코피라노실 잔기;
3:4 결합 글루코피라노실 잔기;
2:3 결합 글루코피라노실 잔기;
3:6 결합 글루코피라노실 잔기;
2:6 및 4:6 결합 글루코피라노실 잔기;
3:4:6 결합 글루코피라노실 잔기;
말단 결합 글루코피라노실 잔기.
이러한 추가적인 측쇄의 양은 가변적일 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 그들은 다음 대략적인 농도(중량 %)로 존재할 수 있다(모두 또는 일부 또는 하나):
1:4 결합 글루코피라노실 잔기 2-6%
3:4 결합 글루코피라노실 잔기 0.01-0.5%
2:3 결합 글루코피라노실 잔기 0.5-4%
3:6 결합 글루코피라노실 잔기 3-10%
2:6 및 4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.2-1%
3:4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.01-0.5%
말단 결합 글루코피라노실 잔기 2-8%
적어도 하나의 실시예에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 대략적으로 다음의 글리코실 화합물 분석을 가짐으로써 특징 지어질 수 있다(중량 %):
1:3 결합 글루코피라노실 잔기 67.7%
1:6 결합 글루코피라노실 잔기 12.7%
1:4 결합 글루코피라노실 잔기 4.4%
3:4 결합 글루코피라노실 잔기 0.3%
2:3 결합 글루코피라노실 잔기 2%
3:6 결합 글루코피라노실 잔기 6.3%
2:6 및 4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.6%
3:4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.2%
말단 결합 글루코피라노실 잔기 5.8%
이론에 의해 구속되지 않으면서, 특히 1:6 측쇄(및 언급되는 가능한 다른 측쇄)의 존재가 β-글루칸 화합물 등 기존 생물학적 다당류 화합물에 대해 최신 기술에 언급된 바와 같이 관찰된 잠재적으로 억제되지 않는 염증 연쇄반응(cascade)이 아닌, 생물학적 다당류 화합물에 대해 관찰되는 강력한 면역원성 반응을 달성하기 위해 중요할 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 예상된다.
순도
위의 본 생물학적 다당류 화합물은 극(extremely) 또는 초(ultra) 순수에 의해 특징 지어질 수 있다. 이러한 맥락에서 순도는 β-글루칸에서부터 세포 구성 요소 예를 들어 단백질, 효소, 지질, 핵산 물질 및 이에 더해 추출 과정에서부터 모든 잔기의 제거를 의미한다.
위에서 언급된 바와 같이, 순도는 85-100%(wt.) β-글루칸에서부터 유래할 수 있다. 순도는 또한 90-100%, 또는 95-100% β-글루칸일 수 있다.
순도는 또한 단백질 또는 지질 불순물 함량 측면에서 측정될 수 있다.
적어도 하나의 실시예에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 3, 또는 2, 또는 1, 또는 1, 또는 0.5%wt 보다 작거나 동일한 단백질 함량을 가짐으로써 특징 지어질 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 본 생물학적 다당류 화합물에서 잔여(residual) 단백질 함량은 0.3% 미만일 수 있다. 잔여 단백질 함량은 아미노산 분석을 통하여 측정될 수 있다.
추가적으로, 본 생물학적 다당류 화합물은 3, 또는 2, 또는 1 또는 0.5 %wt. 보다 작거나 동일한 지질 함량을 가짐으로써 특징 지어질 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 본 생물학적 다당류 화합물에서 잔여 지질 함량은 0.3% 미만일 수 있다. 잔여 지질 함량은 중량측정 추출(gravimetric extraction)을 통하여 측정될 수 있다.
적어도 하나의 실시예에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 그것의 추출에서 활용되는 어떠한 용매 또는 화학 물질에서부터 사실상 잔여물을 가지지 않음에 따라 특징 지어질 수 있다.
설명되는 순도는 그것이 용량 및 결과의 일관성을 허용하고, 다양한 순도 및 다른 화합물의 존재와 관련된 효능에서 부 적응증(side indication) 및 다양성을 피할 수 있으므로 최신 기술에 비해 상당한 이점이 될 수 있다. 생물학적 다당류 화합물 및 특히, β-글루칸 화합물은 그들의 자연 상태에서 자연적으로 생성된다. 고도의 순도로의 분리는 특히 본 명세서에서 설명되는 것들과 같은 불용성 생물학적 다당류 화합물에 대해서 최신 기술에서 언급되는 효능에서 변동, 혼란스러운 결과 및 가능한 부작용 또는 염증 연쇄반응을 가지는 최신 기술 문제를 극복한다.
추가적으로, 치료적 주장에 대해서 규제 승인을 달성할 수 있기 위해서, 최종 화합물에서 생물학적 다당류 화합물의 이전(previous) 추출에 의해 시달렸던 높은 정도의 변동성을 극복해야만 하고, 다시 말해, 선행 기술 내에서, 규제관에 의해 임의의 약물 승인의 필수적인 구성요소를 형성하는 CMC 패키지의 승인을 달성할 수 있는 일관된 수준의 효능 및 약물 유사 특성을 주장할 수 있는 생물학적 다당류 화합물의 일관성을 달성한다는 확신이 없다.
분자량
위에서 언급된 바와 같이, 본 생물학적 다당류 화합물은 0.5 내지 2.2MDa의 분자량을 가지는 큰 화합물일 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 분자량은 0.5 내지 2.2, 또는 0.6 내지 2.2, 또는 0.7 내지 2.2, 또는 0.8 내지 2.2, 또는 0.9 내지 2.2, 또는 1.0 내지 2.2, 또는 1.1 내지 2.2 또는 1.2 내지 2.2, 또는 1.3 내지 2.2, 또는 1.4 내지 2.2, 또는 1.5 내지 2.2MDa일 수 있다. 이러한 분자량은 분포 또는 평균 몰 질량으로 측정될 수 있다.
분자량은 겔 투과 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
바이오어세이
언급되는 바이오어세이는 화합물이 인체 채취된 대식세포 세포에 관한 TNF-알파 반응에 대해 시험되는 바이오어세이를 사용하여 측정되는 생물학적 다당류 화합물에 의해 유발되는 염증 반응의 척도(measure)이다. 사용되는 본 생물학적 다당류 화합물은 폭주하는(runaway) 염증 연쇄반응을 유발하지 않는 것으로 보이지만, 염증 및 치유를 시작하는 것으로 보인다. 최신 기술은 불용성 생물학적 다당류가 본 발명자들이 위에서 설명된 본 화합물에 대해서 관찰한 것이 아닌 심각한 염증 반응을 유발하는 예시를 제공한다.
무균성(Sterility)
적어도 하나의 실시예에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 매우 낮은 생물학적-부하(bio-burden)를 가짐으로써 추가적으로 특징 지어질 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 화합물은 무균성일 수 있다. 본 명세서의 맥락에서, 용어 '매우 낮은 생물학적-부하' 또는 '무균성'은 병원균(pathogens)의 부재에 더해, <10cfu/g 의 미생물 수를 의미한다.
적어도 하나의 실시예에서, 설명되는 본 화합물은 USP51(항균 유효성) 및 USP61(미생물 한도) 기준을 충족한다. 적어도 하나의 실시예에서, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물은 USP71 (무균성) 기준을 충족한다.
USP 기준은 무균성을 측정하기 위해 규제 기관에 의해 시행되는(enforced) 기준이다. USP71 테스트를 완료하는 하나의 방법은 성장 촉진 테스팅을 수행하고 USP 71 무균성 테스트에 명시된 6개의 미생물의 성장을 지지할 수 있는 배지(media)를 확인하기 위한 다른 품질 지표를 평가하는 것일 수 있다. 그 이후, 폐쇄된 막 여과 방법 또는 배지에 접종하는 직접 접종 방법 중 하나를 사용하고, 그 후 테스트 용기가 적절한 온도에서 적어도 14일간 배양되고 임의의 미생물의 성장이 측정된다. 샘플이 USP71을 준수하기 위해서는, 배양 기간 말에, 성장의 증거가 없어야 하고, 약물 제품은 테스트의 조건 하에 검사된 샘플에서 어떠한 오염성 미생물도 발견되지 않는다는 것을 나타내는 "무균" 결과가 주어진다.
이것을 추가적으로 예시하기 위해, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물은 다음의 무균성 기준을 가짐으로써 추가적으로 특징 지어질 수 있다:
미세입자(microparticulate)
본 생물학적 다당류 화합물은 미세입자 형태일 수 있다. 입자 크기는 40μm미만일 수 있다. 이것은 Malvern 입자 크기 테스트 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 분리된 생물학적 다당류 화합물을 미세입자로 제시하는 것은 표면적을 증가시키고 본 생물학적 다당류 화합물(주로 1-3 및 1-6 글리코실 측쇄)의 더 많은 항원 영역을 노출시키는데 유용할 수 있다.
외관
본 분리된 생물학적 다당류 화합물은 흰색 내지 미색(slightly off-white)일 수 있고, 순수 형태에서 분말일 수 있다.
잔류(Residual) 용매
β-글루칸 화합물/생물학적 다당류 화합물을 분리하는 최신 방법은 다양한 용매/시약, 물, 클로로포름, 에탄올 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는 예시에 의존할 수 있다.
본 발명자의 경험에서, 잔류 용매는 본 명세서에서 설명되는 본 분리된 생물학적 다당류 화합물에서 사실상 감지될 수 없다.
안정성
본 생물학적 다당류 화합물은 고도로 안정적이다. 본 발명자들에 의해 완료된 시험에서, 본 분리된 생물학적 다당류 화합물은 주위 온도에서 저장 후에 적어도 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5년 간 저장 안정적(shelf stable)이다. 본 생물학적 다당류 화합물은 또한 열 안정적으로 보인다. 본 발명자들을 위해 완료된 하나의 시험에서, 본 화합물이 안정성에 대해 현저히 높은 온도인 220℃에서의 처리 후에도 안정하게 남았음을 설명하는 열중량측정(thermogravimetric) 분석이 완료되었다.
이것은 본 분리된 생물학적 다당류 화합물의 높은 순도 및 높은 무균성의 결과일 수 있으며, 따라서 시간의 흐름에 따라 저장될 때 만약 임의의 분해가 있다면, 본 화합물은 분해를 거의 나타내지 않는 이유일 것이다.
치료의 방법
제2 측면에서, 상처 부위로 운반체의 국소적 적용에 의해 피부 치료를 필요로 하는 환자의 피부를 치료하는 방법으로서, 운반체는 실질적으로 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 분리된 생물학적 다당류 화합물의 치료적으로 유효한 양을 포함하는 방법이 제공된다.
구체적인 방법의 추가적인 예시는 아래에서 더 설명된다.
사용
제3 측면에서, 피부 치료를 필요로 하는 환자의 피부의 국소적 치료를 위해, 의약의 제조에서, 실질적으로 본 명세서에서 설명된 바와 같은 분리된 생물학적 다당류 화합물의 사용이 제공된다.
구체적인 사용의 추가적인 예시는 아래에서 더 설명된다.
효능
본 발명자들은 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물이 상처 치유에 이용 가능한 가장 최적의 면역원성 분자일 수 있다는 것을 발견하였다.
2020년에 완료된 최근 두 건의 제ⅡB상 이중 맹검 무작위 배정 임상 시험에서부터 설명되는 효능의 요약은 아래에서 언급되고 예시 및 도면에서 추가적으로 설명된다.
만성 상처
82명의 환자 무작위 배정 이중 맹검 무작위 배정 위약-대조 제ⅡB상 시험에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 운반체 겔 대 다음을 포함하는 효능의 강력한 징후를 설명하였다:
● 위약에 비해 프로토콜 준수 그룹에서 완전 폐쇄의 발생률에서 27% 조정된 차이(p=0.1);
● ITT 그룹에서 위약 대 완전 폐쇄의 발생률에서 22% 조정된 차이(p=0.12);
완전 폐쇄의 발생률에서 10% 차이는 당해 기술분야에서 임상적으로 유의미한 것으로 간주되는 점에 유의한다.
미용 시술
피부 품질을 측정하고 치유하는 분획 레이저 시술 후에, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물의 효능을 평가하는 40명의 환자 제ⅡB상 이중 맹검 위약-대조 시험에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 다음을 설명하였다:
● 위약 그룹 대 주름에서 70% 개선(P<0.04);
● 탄력 섬유증에서 114% 개선(P<0.13), 28일차에서 탄력 섬유증의 개선이 2배.
작용(action)의 면역-자극 메커니즘은 다수의 적용을 허용하는 서로 다른 적응증에 맞추기 위해 수정될 수 있다.
확인되는 본 분리된 생물학적 다당류 화합물이 대식세포에서 NF-kB 경로의 활성화를 통하여 면역계가 반응하는 것을 유발하는 생물학적 위협(예: 효모 감염)을 모방함으로써 선천적 피부 면역계를 자극한다는 것이 본 발명자들의 이해이다.
대식세포는 상처 치유 반응을 조절하고 통제한다. 설명된 본 생물학적 다당류 화합물은 상처 치유 반응의 자연스러운 연쇄반응을 촉발하고 가속화하지만, 억제되지 않는 염증 반응을 유도하지 않는 단순 항원 반응 메커니즘을 자극한다. 본 결과는 새로운 조직의 재생 및 상처 폐쇄에서 예상치 못하게 높은 효능으로 보인다.
본 분리된 생물학적 다당류 화합물은 병원성 미생물에 대항하여 방어하기 위해 인류의 진화 동안 발달된 면역 세포 상에 패턴 인식 수용체를 활성화하는 것으로 보인다.
생물학적 다당류 화합물의 항원 영역, 예를 들어 효모 글루칸은 몸의 대식세포에 의해 감지된 위협에 대한 미끼(decoy)로 인식될 수 있고, 이는 상처 대식세포 상의 톨-유사 수용체(toll-like receptor, TLR) 2 및 덱틴-1 막 수용체의 자극을 유발하고, 위협과 싸우기로 정해진 경로에 신호를 보내게 한다. 그러나, 미끼는 감지된 손상을 유발하지 않으며 결과적인 대식세포 활성화는 여러 가지 유익한 방식으로 상처 치유를 자극하는 것으로 보인다.
본 방법은 상처 대식세포 활동을 자극하고 그 결과 증가된 식균 작용(phagocytosis), 상처 치유 사이토카인의 증가된 분비, 및 혈관신생(angiogenesis) 및 상처 재건의 자극이 본 발명자에 의해 이해된다.
본 발명자의 경험에서, 본 방법/사용은 어떠한 관찰된 부작용도 가지지 않으며, 우려 또는 최신 기술이 불용성 생물학적 다당류 화합물에 대해서 제안하는 것에 모두 반하는(contrary) 어떠한 측정된 염증도 가지지 않는다.
운반체
하나의 실시예에서, 운반체는 본 분리된 생물학적 다당류 화합물을 포함하는 겔 조성물일 수 있다. 운반체는 고도로 점성이 있는 겔일 수 있다. 예를 들어, 겔의 점성은 3000cps를 초과할 수 있다. 겔은 파라핀 또는 전통적인 화학적 방부제와 같은 임의의 화학적 방부제를 포함하지 않을 수 있다. 이것은 개방된 상처에 임의의 간섭 또는 유해한 영향을 피하는데 바람직할 수 있다. 본 겔은 수성 겔일 수 있다. 본 생물학적 다당류 화합물은 미세입자 형태일 수 있다. 위에서 언급된 바와 같이, 본 생물학적 다당류 화합물은 불용성이고 따라서 본 생물학적 다당류 화합물은 미세입자 현탁액(suspension)으로 겔에서 현탁될 수 있다.
운반체는 또한 다른 약학적으로 그리고 생리학적으로 수용 가능한 형태를 취할 수 있다. 운반체는 일반적으로 수성일 수 있다. 운반체는 국소적으로 적용될 때까지 미세입자 현탁액으로 또는 기질(substrate) 상에 입자로 본 생물학적 다당류 화합물을 현탁하거나 보유하는 역할을 할 수 있다. 대안적인 운반체의 예시는 크림, 연고, 드레싱, 상처 및 화상 등을 치료하는 기구와 같은 피부를 치료하기 위해 사용되는 의학적 기구일 수 있다.
생물학적 다당류 화합물 농도/용량
적어도 하나의 실시예에서, 운반체는 0.05, 또는 0.06, 또는 0.07, 또는 0.08, 또는 0.09, 또는 0.1, 또는 0.2, 또는 0.3, 또는 0.4, 또는 0.5, 또는 0.6, 또는 0.7, 또는 0.8, 또는 0.9, 또는 1.0, 또는 1.1, 또는 1.2, 또는 1.3, 또는 1.4, 또는 1.5% 중량 보다 적거나 동일한 분리된 생물학적 다당류 화합물을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 운반체는 0.05 내지 1.5%wt or 0.1 내지 1.0%wt 분리된 생물학적 다당류 화합물을 포함한다.
운반체는 매일 또는 하루에 두 번 상처 부위로 국소적으로 적용될 수 있다. 운반체는 수 일 또는 수 주간 적용될 수 있다. 투여 요법은 운반체 내 화합물의 농도, 수행되는 치료에서 다른 요인들 중에 환자에 의해 보여지는 반응의 함수(function)이다. 본 발명자들의 경험에서, 치료 요법은 5 내지 14일의 시간 기간에 매일 한번 또는 두번 적용인 경향이 있고, 또는 만성 상처의 치료의 경우에, 12-20 주 치료 기간에 걸쳐 매일 한번 또는 두번 또는 세번인 경향이 있다. 이러한 시간 기간은 가변적일 수 있다.
운반체는 가정에서 환자에 의해 그들의 피부 부위로 적용될 수 있다.
본 화합물을 포함하는 운반체는 1-5mm 두께의 층으로서 부위에 적용될 수 있다. 시간이 지남에 따라, 층은 피부에 흡수될 수 있다.
만성 상처 치료
본 방법/사용은 만성 상처를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 만성 상처는 궤양일 수 있다. 궤양은 정맥성 하지 궤양일 수 있다. 본 발명자들의 경험에서, 본 생물학적 다당류 화합물은 정맥성 하지 궤양을 치료하는데 있어 위약과 비교하여 예상치 못한 그리고 상승(synergistic)의 효과를 제공하였다.
적어도 하나의 실시예에서, 본 발명자들은 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물이, 67명의 환자 제ⅡB상 이중 맹검 무작위 배정 위약 대조 시험에서 정맥성 하지 궤양을 치료하기 위해 사용되었을 때, 2-12cm2 궤양 크기의 만성 정맥성 하지 궤양에 대해 운반체 겔과 비교하여 완전 상처 폐쇄의 발생률에서 약 27%의 차이를 가졌다는 것을 발견하였다. 이러한 수준의 효능은 현재 승인된 임의의 경쟁 제품보다 거의 틀림없이 더 우수할 것이다.
본 저자들은 또한 위에서 설명된 본 생물학적 다당류 화합물을 통하여 만성 정맥성 하지 궤양에서 91%라는 46.6% 위약의 두 배의 퍼센트 상처 영역 감소를 발견하였다. 본 결과들은 아래의 예시에서 추가적으로 설명된다.
미용 치료
본 방법/사용은 미용 피부 치료일 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, 미용 피부 치료의 효능은 미용술 피부 품질의 측면에서 구체적으로, 피부 탄력 섬유증 및 주름에 의해 측정되는 것으로서 측정될 수 있다. 본 발명자들의 경험에서, 설명된 본 생물학적 다당류 화합물은 미용 피부 치료에서 예상치 못한 그리고 상승의 효과를 가졌다.
적어도 하나의 실시예에서, 흉부의 CO2 분획 레이저 시술인 제어된 화상 시술 후에 설명되는 본 겔의 사용을 위한 제ⅡB상 42명의 환자 이중 맹검 위약 대조 시험에서, 설명된 본 생물학적 다당류 화합물은 레이저 절제 후에 두 배에 근사하는 개선된 피부 품질, 탄력 섬유증 75% vs 35% 위약(p<0.01), 및 주름 85% vs 50% 위약을 제공하였다(p<0.04).
추가적인 또는 관련된 효과
위에서 설명된 본 생물학적 다당류 화합물은 다음 중 하나 이상을 포함하는 추가적인 조직 재건 및 치유 효과를 가질 수 있다:
피부 치유 및 피부 품질의 최적화;
미용 시술 후에 감소하는 피부 주름;
치유 동안 증가하는 피부 탄력 섬유증;
분획 그리고 전체 절제 박피(resurfacing) 후에 피부의 치료(UV 유도의 광-손상, 주름증(rhytidosis), 색소침착 이상(dyspigmentation) 및 차선의 피부 질감의 외관을 향상시키기 위한 치료적 선택지로 알려짐);
피부 품질 이점을 가속화하기 위해 보조적 시술-후 국소 적용 겔.
본 생물학적 다당류 화합물이 위에서 설명된 것과 같은 겔 형태에 있을 때, 다음 치료/시술 중 하나 이상 후에 치유를 포함하는 임의의 상처 치유를 포함하는 임의의 미용 시술에 적용을 가진다:
절개;
니들링(needling);
찰과상(abrasions);
심각한 화학적 필링;
피부 이식(grafts);
침습적이고 경도(light)의 레이저 시술.
본 생물학적 다당류 화합물을 포함하는 겔의 적용은 가속화된 피부 품질 및 치유 이점을 전달하는 미용 시술의 임상적 효과를 증가시킬 수 있다. 이것은 기본적인(underlying) 미용 시술-그것은 레이저 시술, 화학적 필링 또는 절개 또는 임의의 다른 형태의 찰과상이 될 수 있다-에 의해 개시되는 상처에 반응하는 조직 재생 및 콜라겐 생성에 대해서 신체 고유의 과정을 자극하는, 설명되는 본 생물학적 다당류 화합물 때문인 것으로 생각된다.
본 생물학적 다당류 화합물의 제조의 방법
제4 측면에서, 실질적으로 위에서 설명된 바와 같은 분리된 생물학적 다당류 화합물을 제조하는 방법이 다음의 단계에 의해 제공된다:
효모 세포를 선택하는 단계;
세포를 용해하고 세포 벽 조각을 수집하는 단계;
만난 및 키틴을 제거하기 위해 세포 벽 조각을 산성화하고 가열하는 단계;
단백질, 글리코겐 및 지질과 함께 추가적인 만난 및 추가적인 키틴을 제거하기 위해 용매로 상 분리를 수행하는 단계;
비등 및 건조를 통하여 용매 및 다른 비-다당류 화합물을 분리하는 단계; 및
용해 후에 및 산성화 전에 적어도 1번의 물 헹굼 단계를 수행하는 단계.
용해
적어도 하나의 실시예에서, 용해는 알칼리 처리 또는 열 처리 또는 두 가지 모두의 처리를 통하여 발생할 수 있다. 용해는 일반적인(common) 기술이고 다른 방법 예를 들어, 압력 변화, 초음파 파쇄, 균질기, 효소 및 세제가 또한 사용될 수 있다.
물 헹굼
본 방법은 전술한 산성화 후에 및 전술한 상 분리 전에 적어도 1번의 물 헹굼을 추가적으로 포함할 수 있다. 추가적인 물 헹굼은 추가적인 정제를 완료할 수 있으나, 더 가혹(harsh)할 수 있고 다당류 구조에서 변화를 유도할 수 있는 최신 방법과 달리, 다당류의 글리코실 분지형 구조를 유지하는 온화한(mild) 방식으로 완료할 수 있다고 생각된다.
pH 변화
물 헹굼에 더해서, 산성화 후에 및 전술한 상 분리 전에, 수집된 혼합물은 또한 pH 변화 및 알코올 세척의 대상일 수 있다. 적어도 하나의 실시예에서, pH는 4.0으로 감소될 수 있고, 전술한 알코올은 세척되며, 그 후 pH 9.0으로 증가될 수 있고 전술한 알코올은 세척되며, 그 후 pH 7.0으로 조정될 수 있고 전술한 알코올은 세척된다. 알코올 및 물 헹굼은 또한 상 분리 후에 발생할 수 있다. 사용되는 알코올은 하나 이상의 저급 알코올에서부터 선택될 수 있다. 알코올의 예시는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
용매
위에서 사용되는 용매는 유기 용매일 수 있다. 사용되는 용매는 비극성 용매일 수 있다. 사용되는 용매는 1.0 이상의 비중을 가질 수 있다. 사용될 수 있는 잠재적인 용매의 예시는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 메틸 클로로포름, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로에탄, 사염화탄소, 에틸 아세테이트, 및 이들의 조합. 용매 추출의 이러한 단계는 실온에서 완료될 수 있다. 이러한 성질의 용매의 사용은 혼합물에서부터 지질을 제거하고, 그러므로 본 생물학적 다당류 화합물을 정제하는데 도움될 수 있다는 것이 이해된다.
전술한 용매와 함께 언급된 상 분리는 실온 및 중성 pH에서 완료될 수 있다. 본 발명자들의 경험에 기반하여 어떠한 특별한 조건도 요구되지 않는다.
비등 및 건조
적어도 하나의 실시예에서, 본 방법은 비등 및 건조를 통하여 용매 및 다른 비-다당류 화합물의 분리 후에, 최종 생성물이 다시 건조되기 전에, 적어도 1번의 추가적인 일련의 용매 헹굼, 알코올 헹굼 및 선택적으로, 추가적인 물 헹굼을 통하여 추가적인 정제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 단계에서 사용되는 용매는 상 분리에서 사용되는 위에서 설명된 것과 동일할 수 있다. 이러한 추가적인 단계에서 사용되는 알코올은 알코올 세척을 위해 위에서 설명된 것과 동일할 수도 있다. 이러한 추가적인 단계 및 단계들에서 물 헹굼 및 헹굼들은 뜨거운 물(>50℃)을 사용하여 행해질 수 있다. 설명되는 건조는 하나의 단계에서 또는 여러 단계들을 통하여 및 여러 건조 기술 예를 들어 스프레이 건조, 오븐 건조, 동결 건조, 진공 건조 등을 사용하여 행해질 수 있다.
위의 본 방법은 US 6,242,594에서 설명된 과정 등 가장 가까운 최신 기술과 매우 다르다는 것이 이해되어야 한다. US 6,242,594에서, 설명되는 과정은 4단계 과정이고 위에서 설명된 방법은 다양한 세척 및 용매 단계 및 추가적인 정제 및 건조 단계를 광범위하게 포함하는 다수의 추가적인 단계를 필요로 한다.
예비(pilot) 및 상업적 규모에서 다당류를 생성하는 측면에서, 추가적인 물 헹굼 단계가 본 발명자들에 의해 다량의 염 결정(salt crystal)의 축적을 막기 위해서 추가되었다. 이러한 물 헹굼 단계는 비-다당류 물질을 제거하고 과정에서 초기-단계 정제를 제공하는 추가된 이점을 가질 수 있다. 물 헹굼 과정은 또한 분지형 분자와 비분지형 분자를 분리하는데 중요할 수 있으므로 최종 분리된 제품에서 1-3:1-6 화합물의 분지의 더 높은 비율을 수집한다.
상이한 구조
위에서 설명된 바와 같이, 설명되는 본 방법은 선행 기술에서 설명되는 것보다 근본적으로 상이한 구조(및 효능)를 가지는 화합물을 생성한다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 방법은 다음을 가지는 분리된 생물학적 다당류 화합물을 생성한다.
● 최신 기술보다 실질적으로 더 높은 분자량(큰 순서대로 0.7m-2.2m 달톤 대 US 6,242,594에서 설명되는 바와 같이 60k 내지 250k 달톤의 분자량(평균 140k 달톤));
● 더 큰 비율의 분지된 1-6 측쇄로 구성되는 더 크고 더 복잡한 분자;
● US 6,242,594는 96%-97% 1-3 사슬을 포함하고 3-4% 1-6 사슬을 가지는 화합물을 생성하는 것을 교시한다. 본 방법에서부터 분리되고 본 명세서에서 설명되는 화합물은 비분지된 1-3 및 1-6 측쇄에 비해 훨씬 더 큰 비율의 분지된 1-3 및 1-6 결합을 가진다;
● 여기에서 설명되는 본 방법에 의해 생성되는 본 분리된 화합물은 2% 미만의 단백질 또는 2% 지질을 가지는 초-순수 다당류를 생성하며, 이는 일반적으로 US 6,242,594에서 포함하는 최신 기술에서 설명되는 그것보다 훨씬 더 높다;
● 임의의 외래성 세포 물질이 최종 형태 화합물에 있으면, 최소로 존재하는, 매우 낮은 생물학적-부하 화합물. 이것은 본 분리된 화합물의 한번의 사용이 개방된 상처 상에 사용하기 위한 것일 수도 있다는 것을 고려하면 매우 중요할 수 있다.
위에서 설명된 본 분리된 생물학적 다당류 화합물, 사용 및 제조의 방법은, 위에서 설명된 바와 같이, 다수의 이점을 포함한다. 일부 이점들의 예시는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
● 임의의 유해한 염증 영향없이 최적 수준의 면역 반응과 더불어 상처 치료를 위해 설계되는 최적의 면역원성 화합물을 제공하는 것;
● 만성 상처에서 임상적 검증된 개선된 치유(황금 기준 치료법보다 더 우수한 이중 맹검 무작위 배정 위약-대조 시험);
● 기준 레이저 치료 이중 맹검 위약 대조 인체 시험 후에 피부 품질에서 거의 2배의 개선;
● 제조의 방법은 배치별로 측정 가능한 일관적 수준의 효능을 제공하는 적절하게 특징 지어진 분자를 생성하는 능력과 더불어 기존 제조 상의 어려움을 해소하는 것으로 보인다;
● 시술 후에 더 낮은 가려움증 및 당김의 적응증.
위에서 설명된 실시예는 또한 본 출원의 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로, 및 임의의 둘 이상의 부분, 요소 및 특징 중 임의의 또는 모든 조합에서 참조되거나 명시된 부분, 요소 및 특징으로 광범위하게 구성된다고 할 수 있다.
추가적으로, 실시예와 관련된 기술분야에서 알려진 균등물을 가지는 구체적인 완전체(integer)가 본 명세서에서 언급되는 경우, 그러한 알려진 균등물은 개별적으로 설명된 것처럼 본 명세서에 통합된 것으로 간주된다.
실시예(WORKING EXAMPLES)
위에서 설명된 본 다당류 화합물, 이의 사용의 방법 및 제조의 방법이 구체적인 예시를 참조하여 지금 설명된다.
예시 1
아래에 표 1은 위에서 설명된 분리된 생물학적 다당류 화합물의 전체 특징을 나타낸다.
| 테스트 | 테스트 방법 | 사양 | 테스트 결과 |
| 외관 | 시각적 검사 | 흰색 내지 미색 분말 | 준수(Complies) |
| 확인 | H NMR APFP - 1023 | 분리된 생물학적 다당류의 표준 H NMR 스펙트럼을 준수 | 예시3 참조 |
| 어세이 | Total Hexose PTM26 | >90% | |
| 글리코실 결합 분석 | Heiss 등에 의해 서술된 Analysis by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) (2009) Carbohydr. | 65% | 예시2 참조 1:3 결합 글루코피라노실 잔기 67.7% 1:6 결합 글루코피라노실 잔기 12.7% 1:4 결합 글루코피라노실 잔기4.4% 3:4 결합 글루코피라노실 잔기0.3% 2:3 결합 글루코피라노실 잔기 2% 3:6 결합 글루코피라노실 잔기 6.3% 2:6 및 4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.6% 3:4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.2% 말단 결합 글루코피라노실 잔기 5.8% |
|
어세이 -
분자량 |
겔 투과 크로마토그래피 | 중량 평균 몰 질량 Mw=0.5-2.2MDa |
1MDa |
| 평균 분자량 (Mw) | 1.2 | ||
| 수분 함량 % | USP <921> Method 1c | <15% | 7.5% |
| 입자 크기 | Malvern Particle Sizer- APFP-1035Malvern | <40μm | 21μm |
| 바이오어세이 | 효능 바이오어세이(Lonza) | ||
| 활성 결과 | 64pg/mL | ||
| 대조 결과 | 3pg/mL | ||
| 비율: 활성 대 대조 반응 | TNF(알파) 활성이 대조보다 1.5배 높음 | 21 | |
| 잔류 용매 | |||
| 모든 용매 | USP<467> | <5000ppm | <5000pm (대략 160ppm) |
| 불순물 테스트 | 0.22% | ||
| 단백질 | 아미노산 분석 | <5% | 0.3% |
| 점화 시 잔류물(Residue on ignition) | USP <281> | <1% | <20ppm |
| 중금속 | USP<231> | <20ppm | 0.3% |
| 지질 | 중량측정 추출 | <5% | 0.30% |
| 박테리아 내독성 | 발열성 물질(pyrogene) 내독성 검사 | <1 EU/mg | <0.1 EU/mg |
| 무균성 | USP<71> | 논문(monograph)을 준수 | 준수 |
| 미생물학 | 무균성에 실패한 경우에만 적용 | 준수 | |
| TVAC | <100 CFU/g | 준수 | |
| 효모 | <10 CFU/g | 준수 | |
| 곰팡이 | <10 CFU/g | 준수 | |
| 황색포도상구균 | 부재 / 10g | 준수 | |
| 대장균 | 부재 / 10g | 준수 | |
| 녹농균 | 부재 / 10g | 준수 | |
| 살모넬라균 | 부재 / 10g | 준수 |
예시 2
본 예시에서, 본 명세서에서 설명되는 본 분리된 생물학적 다당류 화합물을 특징 지우는 것을 돕기 위해 사용되는, 글리코실 결합 분석에서부터 방법 및 결과가 설명된다.
방법
글리코실 결합 분석을 위해, 샘플(1.2 mg)이 400 μL의 DMSO에서 먼저 용해되었다. 그 후 해당 샘플이 퍼메틸화(permethylated)되었고, 해중합(depolymerized)되었고, 환원되었고, 아세틸화되었고; 및 그에 따른 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트(PMAAs)가 Heiss et al. (2009) Carbohydr. Res. 344:915.에 의해 설명되는 바와 같이 가스 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS)에 의해 분석되었다.
퍼메틸화는 400μL의 수산화나트륨(15분) 및 100μL의 요오드화 메틸(45분)로 2회의 처리에 의해 수행되었다. 반응을 종결(quench)시키기 위해 2mL의 물이 첨가되었고, 과량의 요오드화메틸이 질소 스트림에 의해 제거되었다. 디클로로메탄과 함께 추출 후에, 물 세척(3x), 및 용매 제거, 2M TFA를 사용하여 퍼메틸화된 물질이 가수분해되었고(400μL, 121℃에서 밀봉된 튜브 안에서 2시간), NaBD4로 환원되었고, 아세트산 무수물/TFA를 사용하여 아세틸화되었다(250μL + 230μL, 15분, 50℃). 결과적인 PMAA는 5975C MSD(질량 선택적 검출기, 전자 충격 이온화 모드)에 인터페이스된 Agilent 7890A GC 상에서 분석되었고; 분리는 30m Supelco SP-2331 결합 상(phase) 용융 실리카 모세관 컬럼에서 수행되었다.
결과
결합 분석 결과에서부터, 포도당에 대해서 가장 풍부한 글리코시딕 결합은 3-결합 글루코피라노실 잔기였으며, 6-결합 글루코피라노실 잔기보다 더 많았다. 6-Glc 대 3,6-Glc의 비율은 약 2 대 1이었고, 이는 3개의 Glc 잔기의 평균 측쇄 길이를 시사하며, 3-Glc 대 3,6-Glc의 비율은 약 11 대 1이었고, 이는 평균적으로 매 10번째 백본 Glc 잔기 상에 측쇄를 시사한다. 아래에 표 2는 확인된 결합 및 그들의 상대 풍부도를 나타낸다.
| 피크 | 면적%* |
| 말단 만노피라노실 잔기(t-Man) | 0.1 |
| 말단 글루코피라노실 잔기(t-Glc) | 5.8 |
| 3-결합 글루코피라노실 잔기(3-Glc) | 67.7 |
| 6-결합 글루코피라노실 잔기(6-Glc) | 12.7 |
| 4-결합 갈락토피라노실 잔기(4-Gal) | 4.4 |
| 3,4-결합 글루코피라노실 잔기(3,4-Glc) | 0.3 |
| 2,3-결합 글루코피라노실 잔기(2,3-Glc) | 2.0 |
| 3,6-결합 글루코피라노실 잔기(3,6-Glc) | 6.3 |
| 2,6-및 4,6-결합 글루코피라노실 잔기(2,6-및 4,6-Glc) | 0.6 |
| 3,4,6-결합 글루코피라노실 잔기(3,4,6-Glc) | 0.2 |
예시 3
본 예시에서, 본 명세서에 설명되는 본 분리된 생물학적 다당류 화합물을 특징 지우는 것을 돕기 위해 사용되는, NMR 연구에서부터 방법 및 결과가 설명된다.
1H NMR 샘플은 본 발명 화합물 샘플을 D6MSO 및 D-TFA 안에서 용해시킴으로써 준비되었다. 샘플은 400MHz NMR 장비를 사용하여 테스트 되었다. 테스트 결과는 아래에 표 3 및 도 1A에서 도시된다. 백본 및 측쇄의 아노머 H1 및 H6 양성자 신호가 확인되었다. 1-3-Glc 백본 대 1-6-Glc 분지 비율은 NMR 데이터 기반으로 계산되었다. 평균적으로, 측쇄 길이는 약 4개의 Glc 잔기였다. 1-3-Glc 대 1-6-Glc의 비율은 약 10 대 1이었으며, 이는 평균적으로 측쇄가 매 10번째 백본 Glc 잔기에 부착되는 것을 시사한다.
아래에 표 3은 NMR 요약 결과를 나타낸다.
| H의 유형 | 화학적 이동 | 인티그레이션 | 참조 |
| H6SC | 3.98 | 2.7 | H6SC: H6 측쇄 (SC-NRT 제외) & 분기점의 H6 |
| H1SC | 4.24 | 2.0 | H1SC: H1 측쇄 (SC-NRT 제외) |
| H1BC | 4.50 | 7.1 | H1BC: 백본 사슬 H1 |
본 발명 생물학적 다당류가 3- 및 3,6-결합 글루코스 잔기 단위로 구성되는 β-글루칸 기반 당인 경우로서, 도 1B에 도시된 바와 같이 분자가 개략적으로 표시되었다. 도 1B는 (1→3)(1→6)-β-글루칸의 일반적인 구조를 도시한다. 간결함을 위해, 주요 잔기는 'BC', 'Br' 및 'SC'로 표시된다. BC가 백본 잔기를 나타내는데 반해, Br은 분지형 잔기 및 SC는 측쇄 잔기를 나타낸다.
예시 4
본 예시에서, 현재까지 본 출원인에 의해 완료된 임상 시험의 요약이 제공된다.
200명 이상의 환자가 본 발명 화합물과 제Ⅰ상, 제ⅡA상 및 제ⅡB상 임상 연구에 걸쳐 연구되었으며, 그들 중 대부분(150명 이상의 피험자)이 이중-맹검, 무작위 배정, 위약-대조 연구에서 연구되었다. 대부분의 환자는 미국에 있었고 나머지는 호주에서 시행된 연구였다.
최근 몇 년 동안, 본 출원인은 만성 상처 및 미용 피부과(aesthetic dermatology)의 치료라는 두 적응증에 걸쳐 제ⅡB상 임상 시험 프로그램을 완료하였다.
무작위 배정, 이중 맹검 및 위약-대조 제ⅡB상 만성 상처 시험은 FDA 승인된 프로토콜 하에 2020년에 완료되었고, 결과는 황금 기준 치료법보다 더 우수하지 않으면 비교 가능한 약물 효능을 제시한다.
흉부의 CO2 분획 레이저 후에 미용 피부과 상의 제ⅡB상 무작위 배정 이중 맹검 위약 대조 시험은 시술 후 28일차에 위약 겔의 그것에 두 배에 근사하는 피부 품질에서의 개선을 나타내었다.
모든 제Ⅱ상 시험은 선택 및/또는 배정 편향을 감소시키기 위해 기회의 요소를 사용하여 치료 또는 대조 그룹에 배정되는 FDA-승인 프로토콜 무작위 배정 시험 피험자를 채택하여 수행되었다.
이중-맹검(Double-blind): 참가자도 투여자도 그들이 위약 또는 시험 치료를 투여받는지 여부를 모른다.
위약-대조(Placebo-controlled): 대조 그룹은 시험되고 있는 치료를 다시 벤치마킹하기 위해 실제 효과가 없게 구체적으로 설계된 비-효과적 "위약" 치료를 받았다.
아래에 표 4는 현재까지 임상적 검증(validation)의 요약을 나타낸다.
| 상 | 적응증 | 국가 | 환자 |
프로토콜
디자인 |
결과 |
| 제Ⅰ/Ⅱ상 | 정맥성 하지 궤양 |
호주 | 6 | 개방성, 관측의 |
● 모든 환자에서 상처 표면적에서 감소 35% vs. 기준선(baseline) |
| 18 | 이중-맹검, 무작위 배정, 위약 대조 |
● 4주의 치료 후에 36.7% (평균)의 상처 표면적에 감소 | |||
| 제ⅡA상 | 정맥성 하지 궤양 |
호주 | 66 | 이중-맹검, 무작위 배정, 위약 대조 |
● "완료자(completer) 코호트"에서 85일의 치료 후에 상처 표면적에서 통계적으로 상당한(p<0.008) 45% 감소 vs. 기준선 |
| 제ⅡB상 | 정맥성 하지 궤양 |
미국 | 82 | 이중-맹검, 무작위 배정, 위약 대조 FDA 승인된 |
● 무작위 배정된 80명의 환자 ● 효능의 강력한 징후 달성 ● TR-987은 프로토콜 준수 그룹에서 위약에 비해 완전 폐쇄의 발생률에서 조정된 27% 차이를 달성 p=0.1 ● TR-987은 ITT 그룹에서 위약 대 완전 폐쇄의 발생률에서 조정된 20.6% 차이를 달성(p=0.12). ● 제Ⅲ 상 파워링 분석은 n=300-400 환자에서 달성된 통계적 중요도를 제시 |
| 제ⅡA상 | 안면 레이저 절제 |
호주 | 예비 - 13 주요 - 26 |
이중-맹검, 무작위 배정, 위약 대조 |
● 안전성 및 타당성 확립 ● 상처 폐쇄를 완료한 시간에서 위약 대 통계적으로 상당한 감소(p<0.0062); 대략 30% (평균) 상처 폐쇄의 가속화 vs. 위약 10.9일(GlycoprimeTM 0.1% 농도) vs. 16.3일(위약) |
| 제ⅡB상 | 안면 레이저 절제 |
미국 | 40 | 이중-맹검, 무작위 배정, 위약 대조 FDA 승인된 |
● 위약 그룹 대 주름에서 70% 개선(P<0.04) ● 탄력 섬유증에서 114% 개선(P<0.13), 28일차에 탄력 섬유증의 개선이 두 배 |
예시 5
제Ⅰ상 시험은 위에서 설명된 본 분리된 생물학적 다당류 화합물의 안전성 및 효능을 정립하기 위해 호주에서 수행되었다. 6명의 환자를 포함하는 개방적, 비-대조 시험이 수행되었다. 본 발명 화합물은 기준 상처 치료법에 실패했던 환자에 4주간 매 2-3일마다 국소적으로 적용되었다.
면적측정에 의한 상처 영역에서 감소의 분석 및 결정은 치료 개시 후 56일차에 치료 이전 상처 영역과 비교하여 평가되었다. 이에 더하여, 안전성 및 독성학 분석이 수행되었다.
시험 물질의 사용과 관련하여 어떠한 중대한 불내성 또는 독성이 관찰되거나 보고되지 않았다. 56일의 기간에 걸쳐 26% 내지 82% 범위에서 측정된 상처 표면적에서 감소와 더불어 치유 반응이 6명의 모든 환자에서 관찰되었다.
도 2에 도시된 바와 같이, 치료의 1일차와 비교하여 56일차에서 상처 표면적에서 56%의 상처 크기에서 평균 감소가 관찰되었다.
요약하면, 이러한 제Ⅰ상 연구는 만성 영양(trophic) 궤양 내에서 치유를 자극하는 본 발명 화합물의 능력을 확인하였다.
예시 6
본 예시에서, 제Ⅰ/Ⅱ상 시험이 설명된다.
본 발명 화합물의 효능을 결정하는 제2 제Ⅰ/Ⅱ상 연구가 수행되었다. 본 발명 화합물의 효능은 기준 상처 관리 치료법에 대해 난치성이 된 CDVI 궤양을 가진 18명의 환자를 대상으로 단일-센터, 무작위 배정, 이중-맹검, 운반체-대조 시험에서 연구되었다. 본 발명 화합물은 더 낮은 분자량 범위 및 더 적은 비율의 (1-6)-β-글루칸 측-분지형을 가지는 다른 형태의 글루칸(GlucodineTM) 및 운반체(대조)와 비교되었다.
두 유형의 글루칸 물질(본 발명 및 GlucodineTM)이 크림 베이스(0.1% w/w; 파라벤-보존)에서 현탁되었다.
환자는 그룹 별 6명으로, 3 개의 치료 그룹(두 개의 활성 그룹 및 하나의 운반체 대조 그룹)에 무작위로 배정되었다.
치료는 4주간 매주 3회였다.
활성 시험 물질 또는 운반체 대조 중 어느 하나의 사용과 관련하여 어떠한 불내성 또는 독성도 관찰되거나 보고되지 않았다.
효능은 상처의 표면적을 측정하는 면적측정에 의해 평가되었다. 주요 유효성 지표(parameter)는 기준선(방문1)에서부터 시험의 종료(방문 6)까지 궤양 표면적에서의 개선이었다. 4주에 걸친 평균 개선율은 운반체 그룹에서 4.4%, 본 발명 화합물 그룹에서 36.7%, 및 GlucodineTM 그룹에서 17.3%였다. 8주에 걸친 치유의 정도는 아래에 표 5 및 도 3에 도시된 바와 같다(본 발명 화합물은 도 3에 'Glucoprime'으로 표시되는 것을 유의한다).
| 상처 표면적에서 % 감소 | |
| 위약 화합물 | 4.4% |
| 본 발명 화합물 | 36.7% |
| GlucodineTM | 17.3% |
본 결과는 본 발명 화합물이 상처 치유제로서 상당하게 더 효능 있다는 것을 나타내었다.
예시 7
본 예시에서, 만성 상처, 이러한 경우에 정맥성 궤양을 치료하기 위한 본 발명 화합물의 사용을 위한 제ⅡA상 시험이 설명된다.
대식세포를 억제하는 가능성을 가졌던 파라벤(제2 임상적 연구에서 사용) 등 방부제를 피하기 위한 전략적 결정에 의해 제형에서의 변형이 추진되었다(driven). 제1 임상적 연구에서 사용된 메탄올 방부제로 돌아가기로 결정되었다. 다양한 정도의 방부성 물질로 보존되는 겔 베이스를 사용하는 결정을 이끈 제형 연구들이 그 후 수행되었다.
0.1 및 1.0% 활성을 포함하는 준비(preparation)들이 시험되었다.
이것은 컴퓨터가 생성한 배정 순서를 사용하여 무작위 배정 기반 상의 3가지 치료 그룹 중 하나에 배정된 환자와의 제Ⅱ상, 이중-맹검, 무작위 배정, 운반체-대조 연구였다. 만성 정맥성 궤양을 가진 58명의 환자(남성 36명 및 여성 22명)가 두 지역에서 모집되었고, 고-용량 활성(1.0% 본 발명 화합물 겔) 또는 저-용량 활성(0.1% 본 발명 화합물 겔), 또는 겔 베이스 단독(운반체 대조) 중 하나에 무작위로 배정되었다. 환자의 나이는 3가지 치료 그룹에 걸쳐 비교 가능한 인구 통계학적 특징을 가진 34세 및 93세 사이의 범위에 있었다. 치료는 기준 상처 케어 관리의 시간에 전체 상처 면적에 걸쳐 대략 3mm의 깊이로 12주간, 매주 3회 적용되었다. 본 연구는 다리에 만성 정맥성 부전 궤양을 가진 환자에서 본 발명 화합물의 효능 및 안전성의 통계적인 평가를 제공하는 것이 의도되었다.
본 연구의 일부로서, 최대 12주간 매주 3회, 궤양이 세척되었고, 제거되었으며, 시험 제품이 적용되었고, 압박 붕대로 상처가 드레싱되었다. 상처 가장자리가 매주 추적되었고, 치유의 속도 및 치유의 정도 모두 결정되었다.
활성 그룹 중 어느 하나에서 시험 동안 어떠한 약물-관련 독성도 발견되지 않았다.
제Ⅱ상 연구에서부터 데이터는 위약-치료된 궤양과 비교하여 본 발명 화합물-치료된 궤양이 통계적으로 상당한 개선의 속도로 치유되면서, 본 발명 화합물이 상처가 치유되는 속도를 촉진시켰다는 것을 제시하였다. 본 연구에서 발견된 상처 폐쇄의 속도(Rate)는 아래에 표 6과 같다.
| 그룹 | 상처 폐쇄의 속도 |
위약 그룹과 비교하여
관찰된 중요도 수준(P-값) |
| 위약 | 5.4 mm 2 /주 | - |
| 0.1% 본 발명 화합물 | 20.4 mm 2 /주 | 0.01 |
| 1.0% 본 발명 화합물 | 15.4 mm 2 /주 | 0.04 |
궤양의 표면적에서 감소에 의해 측정된 12주에 걸친 치유의 전체적인 평균 수준은 아래에 표 7과 같다.
| 그룹 | 상처 표면적에서 퍼센트 감소 |
| 위약 | 10% |
| 0.1% 본 발명 화합물 | 59% |
| 1.0% 본 발명 화합물 | 55% |
궤양 영역에서 기준선에서부터 중앙값 퍼센트 변화는 또한 표 4에 도시되며, '고(1.0%)'는 고 용량 샘플을 의미하고 '저(0.1%)'는 저 용량 샘플을 의미한다.
환자는 무작위 배정되었음에도 불구하고 위약 그룹보다 두 개의 본 발명 화합물 치료 그룹이 실질적으로 더 큰 평균 궤양 크기를 가지며 궤양의 크기에서 큰 차이가 있었음에도 불구하고 이러한 결과가 관찰되었다.
예시 8
제ⅡA상 시험에서부터 전체 요약 결과가 아래에 표 8에 제시된다.
제ⅡA상 호주 만성 정맥성 궤양 시험 결과
위에 결과에서 나타낸 바와 같이, 본 발명 화합물은 상처가 치유된 속도를 촉진시켰다. 본 발명 화합물-치료된 궤양은 위약-치료된 궤양과 비교하여, 상당히 더 빠른 속도(하루 당 mm2)로 치유되었다. 12주에 걸친 치료의 전체 평균 수준은 10%(위약), 59%(저 용량 본 발명 화합물) 및 55%(고 용량 본 발명 화합물)였다.
예시 9
본 예시에서, 제ⅡA상 화상 시험이 설명된다. 아래 눈꺼풀의 이산화탄소 레이저 피부 박피(laser skin resurfacing, LSR)를 경험한 환자에서, 위약과 비교하여 0.1% 및 1.0% 국소적으로 적용된 본 발명 화합물(운반체는 겔)의 안전성 및 효능을 조사하기 위한 이중-맹검, 무작위 배정, 위약-대조 제2상 연구인 미국 연구가 완료되었다.
설계 및 종결점: 본 연구는 미용 목적으로(주름 감소) CO2 LSR를 경험한 26명의 피험자의 아래 눈꺼풀 피부 상에 상처 치유를 촉진하는데 있어, 위약(겔 베이스)와 비교하여, 본 발명 화합물 겔의 두 농도(GLYC-101, 0.1% 농도, 및 GLYC-101, 1.0% 농도로 명칭)의 안전성 및 효능을 평가하였다. 본 연구 화합물은 각각의 아래 눈꺼풀 상에 절제된 피부 영역에 국소적으로 적용되어 전체 상처 표면은 대략 0.5 mm 두께로(1 mm를 초과하지 않는) 시험 물질(위약 또는 GYC-101 중 하나)의 층으로 덮였다. 시험 물질은 총 5일간 매일(이전 적용에서부터 대략 24 시간) 적용되었다. 전반적으로, 위약과 비교하여, 본 발명 화합물(GLYC-101 1.0% 또는 GLYC-101 0.1%)을 사용한 치료는 안전하고 잘 견뎌내었다.
결과: 본 연구 약물은 발생률을 증가시키거나 임의의 기존 안전 문제를 악화시키지 않고 주름 제거의 목적을 위해 아래 눈꺼풀 영역의 CO2 LSR 절제 시술후와 관련된 안전 이벤트의 수를 감소시키거나 안전 이벤트의 심각성을 감소시키지도 않는 것으로 보였다.
주요 종결점(상처 폐쇄를 완료하는데 시간)에 관하여 각 GLYC-101(현재 TR-987로 명명된 본 발명 화합물) 군(arm)과 위약의 비교는 모든 치료 조합에서부터 전체 피험자 데이터세트를 고려할 때 긍정적 결과를 나타내었다. 도 5는 상처 폐쇄까지의 제2상 시험 레이저 데이터 시간을 도시한다. 상처 치유 시간에 평균 30% 개선이 나타나 있다. 더 구체적으로, 본 발명 화합물(GLYC-101 0.1% 및 GLYC-101 1.0%) 그룹을 위약과 비교했을 때, 상처 폐쇄를 완료하는데 시간의 효능 결과는 더 빨랐다(각각 p = 0.0062 및 0.0331). 이러한 결과는 본 발명 화합물에 대한 효능을 설명한다.
예시 10
본 예시에서, 제ⅡA상 시험 결과는 도 6, 도 7 및 도 8을 참조하여 도시된다.
구체적으로, 도 6, 도 7 및 도 8에서, 본 발명 화합물을 사용하여 완료된 시험에서 정맥성 궤양 상처의 상처 크기 감소의 비전형적 예시가 도시된다. 완료자 코호트에서 58명의 환자에 걸쳐, 본 발명 화합물을 받은 환자에 대해 45%의 통계적으로 상당한 감소가 12주에 걸쳐 입증되었다(p<0.008).
본 발명 화합물 치료를 받은 환자의 예시는 호주 정맥성 궤양 시험에서부터 기반하여 도시된다. 이미지에 도시된 바와 같이, 시간의 흐름에 따라 궤양화(ulceration)가 상당히 감소하며, 도시된 3가지 예에서, 치유 또는 거의 완전한 치유는 8 내지 12주 내에 발생한다.
예시 11
본 예시에서, 제ⅡB상 시험에서부터 상처 폐쇄 결과를 나타내는 시험이 설명된다.
만성 정맥성 궤양의 치료에서 위약 겔 대 본 발명 화합물을 평가하는 이중 맹검 위약 대조 무작위 배정 제ⅡB상 임상 시험 제ⅡB상 연구가 완료되었다.
전체적으로, 82명의 피험자가 치료에 무작위로 배정되었고(42명 본 발명 화합물, 38명 위약) 궤양 영역의 적어도 하나의 사후 기준선 평가가 제공되었다(ITT 모집단). 프로토콜 준수 모집단(per protocol population)은 스폰서에 의해 정의되었다: 그들이 초기에 철회했거나(withdrew), 물질 프로토콜 이탈 또는 연쇄 감염을 가졌을 경우, PP 모집단은 피험자들을 제외하였다.
시험의 주요 기준은 다음을 포함하였다:
● 제ⅡB상 정맥성 하지 궤양 시험;
● 시험은 야심차고(ambitious) 강건했다;
● 이중 맹검 위약 대조;
● 활성 IND 하에 FDA 승인된 프로토콜;
● 위약 겔 및 케어의 기준 대 본 발명 화합물 + 압박 붕대의 동일한 케어의 기준으로 치료된 VLUs;
● 위약 겔은 모든 면에서 활성 군에서부터 위장 가능한 진정한(genuine) 운반체 대조였다;
● 미국 10개 지역 및 호주 3개 지역에서 모집;
● 치료 기간 12주;
● 2-12cm2의 궤양을 검사하는 프로토콜 변형으로 2-20cm2 궤양을 치료;
● 도입 기간(run in period)이 포함 기준의 일부여서 더 불량한 치유 궤양만이 시험에 포함되는 것을 보장하기 위해 30% 초과의 감소를 보인 빠른 치유자(healer)는 무작위 배정에서부터 제외되도록 하였다;
● 궤양에 관한 어떠한 시기(age) 제한도 없음. 등록된 일부 궤양은 무작위 배정 전에 약 300주 지속되었다.
분석은 비록 치유하기 위한 시간의 주요 목적이 그룹 사이에 차이가 없다는 것을 보여주었지만, 100% 치유된 상처의 비율에서 핵심적인 2차 목적이 효능의 강건한 징후를 보여주었다는 것을 나타내었다. 100% 폐쇄를 달성한 상처의 비율은 상처 치유에 대해 황금 기준 FDA 종결점으로 고려된다.
요약하면, 활성 및 위약 사이에 상처 폐쇄 및 상처 영역 감소의 발생률에 관한 핵심적인 초기 분석은 시험에서 다음의 것이 있었음을 확인하였다:
● 2-12 cm2 궤양에 대해 ITT 그룹(n=67)에 대해 완전 폐쇄의 발생률(p=0.12)에서 20.6% 조정된 차이;
● 프로토콜 준수 그룹(n-69) 2-12 cm2 궤양에 대해 완전 폐쇄의 발생률(p=0.1)에서 27% 차이;
● 프로토콜 준수 그룹 2-12cm2 궤양에 대해 만성 정맥성 하지 궤양(VLUs)에서 91% 본 발명 화합물 vs 46.6% 위약, 퍼센트 상처 영역 감소가 두 배(p=0.035)2.
상처 영역에서 감소에 관한 추가적인 목표는 또한 효과의 강력한 징후를 보여주었고, 위약과 비교하여 전체적인 통증에서 감소(통계적으로 중요했던)는 효능의 강력한 징후를 추가적으로 보여주었다.
도 9는 ApiligrafTM 제Ⅲ상 표시에서부터 제Ⅲ상 데이터 대 본 발명 화합물에 대해 운반체 및 활성 그룹 사이에 완전 폐쇄의 원시 발생률에서 차이를 도시한다. ApiligrafTM는 VLU 폐쇄에 대해 거의 틀림없이 황금 기준이고 적용 당 대략 $1200US로 상환되고, 3-15 적용이 VLU의 일반적인 치료에서 요구될 수 있다.
제ⅡB상 시험에서부터 본 발명 화합물 프로토콜 준수 그룹은 12주 기간에 걸쳐 시험을 완료하고 전체 약물 복용을 받았던 환자이다(본 발명자들은 이러한 그룹을 약물에 대한 효능의 정확한 척도로 고려한다).
ITT 그룹은 전체 12주의 치료를 받지 않은 모든 초기 철회를 포함하여 무작위 배정된 모든 환자를 포함한다.
임상적으로 유의미한 차이는 일반적으로 절대적 폐쇄의 +10% 차이로 고려된다.
도 9에 도시된 바와 같이, 본 발명 화합물은 17%의 ApiligrafTM에 대해 완전 폐쇄의 조정된 발생률 대 완전 폐쇄의 발생률에서 20.6% 조정된 차이를 달성한다. ITT 그룹 및 PP 그룹에 대한 유의미한 차이는 기록된다.
조정된 데이터는 그룹 사이에 치유에 영향을 미치는 것으로 알려진 요인들(예: 기준선, 궤양 크기 등)을 제어하는 로지스틱 회귀(본 발명 화합물) 및 콕스(Cox) 회귀(ApiligrafTM)에 기반한다.
결과는 시험 설계(맹검 포함), 포함 및 제외 기준에서 차이를 고려하면 엄격하게 비교 가능하지 않으나, 본 발명 화합물에 대해 비교 가능한 또는 더 우수한 효능의 징후를 제공한다.
도 10은 위약에 비해 활성 그룹에 대해 100% 치유를 달성한 기록된 로지스틱 회귀 승산비(Odds ratio, "OR")를 도시한다. 결과는 치유에 영향을 미치는 것으로 알려진 공변량을 조정하는 로지스틱 회귀에서부터 유래한다. OR의 해석은, 예시적으로, OR이 1.4인 경우, 본 발명 화합물 그룹에서 치유의 승산은 위약 그룹에서 치유의 승산보다 1.4배 더 높다. 1을 초과하는 값은 치료를 지지하고 1 미만의 값은 위약을 지지한다.
기록된 OR은 모두 2 초과로 치료를 지지하며, 이는 활성 그룹에서 치유의 승산이 위약 그룹에서 완전 치유를 달성하는 그것의 두 배를 초과한다는 것을 시사한다.
도 10은 프로토콜 2-20cm2 및 2-12 cm2에서 확인된 두 크기 그룹에 대한 완전 치유를 위해, 디스플레이된 ITT 및 PP 그룹 각각에 대한 OR을 나타낸다. 상한 및 하한 신뢰 구간이 또한 나타나 있다.
모든 그룹에 대한 승산비는 임상적으로 유의미하게 중요하고 "n"이 증가함에 따라 (제Ⅲ상 시험에서) 모든 것이 치료를 지지한다. 나타낸 신뢰 구간이 통계적 중요성을 달성하기 위해 좁아질 것이 가정된다. 결과는 환자가 운반체 또는 위약 그룹에 비해 본 발명 화합물 그룹에서 100% 폐쇄를 달성할 가능성이 두 배 이상이었다는 것을 설명한다.
예시 12
본 예시에서, 제ⅡA상 및 제ⅡB상 시험에서 평균 상처 영역 감소가 도 11을 참조하여 설명된다. 본 데이터는 두 개의 별도의 독립적인 제Ⅱ상 시험에서 상처 영역 감소에 의해 측정된 바와 같이 본 발명 화합물이 일관적 효능을 생성한다는 것을 설명한다.
평균 상처 영역 감소는 치유에 관하여 효능을 측정하기 위한 제Ⅱ상 시험에 대해 FDA에 의해 수용 가능한 종결점으로 고려된다. 그것은 치유의 전조(precursor) 또는 징후로 고려되고, 따라서 FDA에 의해 유효한 제Ⅱ상 종결점으로만 수용된다. 그것은 유효한 제Ⅲ상 종결점으로 수용되지 않는다. 제ⅡB상 시험에서부터 프로토콜 준수 그룹에 대한 본 발명 화합물 결과는 시험을 완료하고 전체 약물 용량을 받은 환자 및 제ⅡA상 시험에서 시험을 완료한 환자인 완료자 코호트에 대한 결과를 나타낸다.
도 13은 상처 영역 감소의 메트릭을 사용하여 EpifixTM와 비교하여 본 발명의 효능의 비교를 설명한다.
사용된 EpifixTM 데이터는 이중 맹검이 아니었던, 즉 의사들이 맹검되지 않았던 공개된 스폰서 자금지원의 시험(FDA를 통하지 않은)에서부터 유래한다. EpifixTM는 인체 조직 제품으로 승인되고 적정한 상용화를 달성한 ApiligrafTM와 유사한 생물학적 패치이다. EpifixTM는 적용 당 $1000 이상으로 상환되며, 폐쇄를 위해 다수의 적용이 요구된다. EpifixTM에 관한 더 많은 정보는 https://mimedx.com/epifix/.에서 설명된다.
도 13에 도시된 바와 같이, 본 발명 화합물은 본 발명 화합물과 위약 사이에, 평균 상처 영역 감소에서 91% (TR-987로 표시) vs 47% 위약으로 위약의 두 배에 근사하는 차이를 달성하며, 44%의 절대적 차이를 달성하며(p=0.035), EpifixTM는 25%의 절대적 차이를 달성한다(p<0.02).
예시 13
본 예시에서, 본 발명 화합물은 정맥성 하지 궤양(VLU) 치료에 대해 최신 기술 제품 ApiligrafTM(www.apiligraf.com 참조)와 비교되었다. 도 12는 ApiligrafTM 제Ⅲ상 표시에서부터 제Ⅲ상 데이터 대 본 발명 화합물에 대해 운반체 및 활성 그룹 사이에 완전 폐쇄의 원시 발생률에서 차이를 도시한다. ApiligrafTM는 VLU 폐쇄에 대해 거의 틀림없이 황금 기준이고, 적용 당 대략 $1200US로 상환되며, 3-15 적용이 요구될 수 있다.
제ⅡB상 시험에서부터 본 발명 화합물 프로토콜 준수 그룹은 시험을 완료하고 12주 기간에 걸쳐 전체 약물 용량을 받은 환자이다(이러한 그룹은 본 화합물에 대한 효능의 정확한 척도이다).
ITT 그룹은 모든 철회를 포함하는 무작위로 배정된 모든 환자를 포함한다.
임상적으로 유의미한 차이는 일반적으로 100% 상처 폐쇄에서 +10% 차이로 고려된다.
본 발명 화합물은 위약에 비해 완전 폐쇄의 발생률에서 21% 조정된 차이를 달성하였고, 위약에 비해 ApiligrafTM의 완전 폐쇄의 조정된 발생률은 17%이고, ITT 그룹 및 PP 그룹 모두에 걸쳐 거의 틀림없는 황금 기준 제품에 대하여 본 발명 화합물에 더 우수한 차이를 나타낸다.
본 발명 화합물(TR-987로 지칭) 연구에 대해 21% 조정된 차이는 그 시험에서 사용된 TR-987 및 위약 사이에 관찰된 완전 치유의 절대적 차이이다.
조정된 데이터는 그룹 사이에 치유에 영향을 미치는 것으로 알려진 요인들(예: 기준선, 궤양 크기)을 제어하는 로지스틱 회귀(본 발명 화합물) 및 콕스 회귀(ApiligrafTM)에 기반한다.
결과는 시험 설계(맹검 포함), 포함 및 제외 기준에서 차이를 고려하면 엄격하게 비교 가능하지 않으나, 본 발명 화합물에 대해 비교 가능한 효능의 강력한 징후를 제공한다.
예시 14
본 예시에서, 본 발명 화합물 및 최신 기술 제품 EpifixTM를 비교하는 상처 영역 감소를 비교하는 시험이 제시된다. 본 발명 화합물(TR-987로 표시) 대 EpifixTM의 퍼센트 상처 영역 감소는 도 13에 도시된다.
평균 상처 영역 감소는 제Ⅲ상 또는 핵심 시험(pivotal trial)이 아닌 오직 효능을 측정하는 제Ⅱ상 시험에 대한 FDA에 의해 수용 가능한 종결점으로 고려된다.
본 발명 화합물은 제ⅡB상 시험에서부터 시험을 완료하고 전체 약물 용량을 받은 환자인 프로토콜 준수 그룹을 제시한다(이러한 그룹은 약물에 대해 효능의 정확한 척도이다).
EpifixTM 데이터는 이중 맹검이 아닌, 즉 의사의 새로운 활성 vs 치료인 스폰서 자금지원의 시험(FDA를 통하지 않은)이다.
본 발명 화합물은 평균 상처 영역 감소에서 91% vs 47% 위약으로 위약의 두 배에 근사하는 차이를 달성하며, 44%의 절대적 차이를 달성하며(p=0.035), EpifixTM는 25%의 절대적 차이를 달성한다(p<0.02).
상처 영역에서 본 발명 화합물 감소는 더 초기의 제ⅡA상 시험 데이터 55% vs 25%를 반영한다(p<0.01).
EpifixTM는 인체 조직 제품으로 승인되고 상당한 시장 침투를 달성한 ApiligrafTM와 유사한 생물학적 패치이다. EpifixTM는 적용 당 c+$1000로 상환되며, 폐쇄를 위해 다수의 적용이 요구된다.
결과는 시험 설계, 포함 및 제외 기준, 환자의 정도(level) 및 의사 맹검에서 차이를 고려하면 엄격하게 비교 가능하지 않으나, 본 발명 화합물에 대해 비교 가능한 효능의 강력한 징후를 제공한다.
예시 15
본 예시에서, 제ⅡB상 시험 결과는 제ⅡB상 정맥성 하지 궤양 시험 n=67 (2-12cm2)에서 본 발명 화합물로 치유된 VLU 상처의 전형적 예시를 도시하기 위한 도 14 및 도 15를 참조하여 설명된다.
도 14 및 도 15는 궤양 크기가 무작위적으로 7.53cm2였던 경우에서 12주 내 치유를 나타낸 시험에서부터 다른 예시를 도시한다. 호주 멜버른의 Heidelberg Repatriation Hospital에서 발표되었으며, 궤양은 등록 이전에 4년에 걸쳐 개방되어 있었다. TR-987을 사용한 10주의 치료로 궤양은 폐쇄된다.
예시 16
본 발명 화합물은 본 출원인에 의해 28일차에 피부 품질 및 미용 시술의 임상적 효과에서 두 배 개선에 근사하는 유용한 시술 후 국소적 겔이라는 것이 확인되었다.
도 17은 최소 침습적 미용 시술(흉부의 CO2 분획 레이저 시술) 후에 본 발명 화합물을 받은 환자의 비전형적 예시 및 제ⅡB상 레이저 절제 시험 n=42에서 발견된 비전형적 향상된 피부 품질 결과를 도시한다. 좌측 상의 이미지는 분획 레이저 시술 후의 흉부를 도시한다. 우측 상의 이미지는 시술 후 그리고 본 발명 화합물을 사용하여 치료된 피부의 매일 치료 후 28일차에 동일한 흉부를 도시한다.
제ⅡB상 시험에서 본 발명 화합물을 사용한 환자는 위약 겔 + 케어의 기준 대 겔의 사용에서부터 28일차에 탄력 섬유증 및 주름에 의해 측정된 가속화된 피부 품질의 발생률에서 두 배에 근사하는 발생률을 경험하였다(p<0.04, n=40).
절제 분획 레이저는 UV-유도의 광-손상, 피부 주름(wrinkles)(rhytides) 및 상처의 외관을 향상시키기 위해 최근 몇 년 내 더 많이 사용되었다. 시술후 피부 케어는 치료법 후에 최적의 상처 치유를 촉진하는데 중요하지만, 현재 황금 기준 시술 후 물질은 없다.
제ⅡB상 시험에서 본 발명 화합물 결과는 본 발명 화합물이 가속화된 속도(pace)로 주름 및 미세 선(fine line)을 채우는(filling out) 추가적인 콜라겐 생성 및 섬유 형성(fibrosis)을 생성한다는 것을 설명하였다.
완료된 제ⅡB상 시험(CO
2
분획 레이저 후)
위에서 사용된 임상 시험 방법론(n=40)은 분획 CO2 레이저 시술에 의해 전체 흉부 영역 상에 생성된 기준화된 화상 상처를 모방하기 위한 것이었다. 이중 맹검 / 위약 대조 임상 연구는 제3자에 의해 수행되었다.
주름
도 18은 기준선 및 28일차 사이에 주름 점수에서 ≥ 1점 개선을 달성한 본 발명 화합물 및 운반체 그룹 각각 내에서 환자의 비율을 상세히 설명한다(Fitzpatrick-Goldman분류). 조정되지 않은 비율에 대하여 카이 제곱 시험이 p 값으로 표현되는 중요도를 결정하기 위해 사용되었다.
위약 그룹(응답자의 50%만이 1 이상의 주름 점수를 달성) 대 본 발명 화합물 그룹에 대해서 응답자의 85%가 1 이상(33% 개선)의 주름 점수를 달성하였다.
카이 제곱, 또는 피셔 정확을 사용하여 70% 분산 P<0.04.
탄력 섬유증
28일차에 위약 그룹에 대해서 응답자의 오직 35% 대 활성 그룹에 대해서 응답자의 75%가 탄력 섬유증에서 3 이상의 개선 점수를 달성하였다(33% 개선)(114% 분산 P<0.011).
도 19는 기준선 및 28일차 사이에 탄력 섬유증 점수에서 ≥ 3점 개선을 달성한 본 발명 화합물 및 운반체 그룹 각각 내에서 환자의 비율을 상세히 설명한다(Fitzpatrick-Goldman 분류). 조정되지 않은 비율에 대하여 카이 제곱 시험이 p 값으로 표현되는 중요도를 결정하기 위해 사용되었다.
예시 17
본 예시에서, 본 발명자들에 의해 상처 치유에 대해 가장 관련된 β-글루칸 특허 공개로 고려되는 WoulganTM으로 마케팅되고 US 9,956,245 B2로 공개된 추가적인 최신 기술 제품 대비 본 발명 화합물의 효능이 테스트되었다.
도 20에 도시된 바와 같이, WoulganTM은 인체 채취된 대식세포 세포에서부터 TNF 알파 반응을 측정하는 어세이에 의해 측정되어 대조 대 8.9배의 면역 반응을 생성하였다. 이것은 면역 반응 또는 자극의 측정이다. 대조적으로, TR-987로 표시된 본 발명 화합물은 동일 운반체 대조 대 본 발명 화합물에 대해 25.4배의 반응을 검정하였다. 이것은 본 발명 화합물이 WoulganTM 겔보다 대략 3배 더 강력하다는 것을, 즉 효능에서 최신 기술 화합물보다 매우 높은 증가를 시사한다. WoulganTM의 농도는 2%였으며, 본 발명 화합물의 농도(0.1%)였다는 것에 주목한다. 본 발명 화합물은 WoulganTM 겔의 농도 1/20th로 존재하였으나 3배의 면역 반응을 생성하였고, 이는 면역 반응을 생성하는데 있어 60배 강력한 분자를 시사한다.
다당류 화합물, 이의 사용의 방법 및 제조의 방법의 측면은 예시적으로만 설명되었고, 본 명세서에서 청구범위의 범위에서부터 이탈하는 것 없이 이에 대해 변형 및 추가가 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
Claims (29)
- 65-95%wt의 1:3 결합 글루코피라노실 잔기 및 5-25%wt의 1:6 결합 글루코피라노실 잔기를 포함하는 글리코실 결합; 및
85-100%의 순도 β-글루칸; 및
0.5 내지 2.2MDa의 분자량; 및
인체 바이오어세이에서 음성 대조 TNF-알파 사이토카인 반응보다 적어도 1.5배 더 큰 인체 바이오어세이에서 TNF-알파 사이토카인 반응; 및
수용액에서 본질적으로 불용성을 포함하는 분리된 생물학적 다당류 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 다당류 화합물은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 종의 효모 세포에서부터 유래되는 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 다당류 화합물은 다음 중 하나 이상에서부터 선택되는 추가적인 측쇄를 포함하는 상기 화합물에 의해 추가적으로 특징 지어지는 화합물:
1:4 결합 글루코피라노실 잔기;
3:4 결합 글루코피라노실 잔기;
2:3 결합 글루코피라노실 잔기;
3:6 결합 글루코피라노실 잔기;
2:6 및 4:6 결합 글루코피라노실 잔기;
3:4:6 결합 글루코피라노실 잔기; 및/또는
말단 결합 글루코피라노실 잔기.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 다당류 화합물은 다음을 포함하는 추가적인 측쇄를 포함하는 상기 화합물에 의해 추가적으로 특징 지어지는 화합물:
1:4 결합 글루코피라노실 잔기 2-6%;
3:4 결합 글루코피라노실 잔기 0.01-0.5%;
2:3 결합 글루코피라노실 잔기 0.5-4%;
3:6 결합 글루코피라노실 잔기 3-10%;
2:6 및 4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.2-1%;
3:4:6 결합 글루코피라노실 잔기 0.01-0.5%; 및
말단 결합 글루코피라노실 잔기 2-8%.
- 상처 부위로 운반체의 국소적 적용에 의해 피부 치료를 필요로 하는 환자의 피부를 치료하는 방법으로서, 상기 운반체는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 분리된 생물학적 다당류 화합물의 치료적으로 유효한 양을 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 운반체는 겔 조성물인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 겔은 수용성 겔이고 상기 분리된 생물학적 다당류는 미세입자 형태이며 상기 겔에서 현탁되는 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 운반체는 0.05-1.5%wt 분리된 생물학적 다당류 화합물을 포함하는 방법.
- 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 운반체는 만성 상처로 국소적으로 적용되는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 만성 상처는 궤양인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 궤양은 정맥성 하지 궤양인 방법.
- 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 운반체는 미용 피부 치료로 국소적으로 사용되는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 운반체는 치유된 피부 탄력 섬유증 및 주름을 개선시키기 위해 사용되는 방법.
- 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 운반체는 분획 및/또는 전체 절제 피부 박피 후에 피부의 치료에서 사용되는 방법.
- 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 운반체는 피부 품질 이점을 가속화하기 위해 보조적 시술-후 국소 적용 겔로 사용되는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리된 생물학적 다당류 화합물을 제조하는 방법으로서 다음을 포함하는 방법:
효모 세포를 선택하는 단계;
상기 세포를 용해하고 상기 세포 벽 조각을 수집하는 단계;
만난 및 키틴을 제거하기 위해 상기 세포 벽 조각을 산성화하고 가열하는 단계;
단백질, 글리코겐 및 지질과 함께 추가적인 만난 및 추가적인 키틴을 제거하기 위해 용매로 상 분리를 수행하는 단계;
비등 및 건조를 통하여 용매 및 다른 비-다당류 화합물을 분리하는 단계; 및
용해 후에 및 산성화 전에 적어도 1번의 물 헹굼 단계를 수행하는 단계.
- 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 산성화 후에 및 상기 상 분리 전에 적어도 1번의의 물 헹굼을 추가적으로 포함하는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 산성화 후에 및 상기 상 분리 전에 pH를 변경하고 알코올 세척을 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 pH는 4.0으로 감소되고 상기 알코올은 세척되고, 그 후 pH 9.0으로 증가되고 상기 알코올은 세척되고, 그 후 pH 7.0으로 조정되며 상기 알코올은 세척되는 방법.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비등 및 건조를 통하여 상기 용매 및 상기 다른 비-다당류 화합물의 분리 후에, 적어도 1번의 추가적인 일련의 용매 헹굼, 알코올 헹굼 및 선택적으로, 최종 생성물이 다시 건조되기 전에 추가적인 물 헹굼을 통하여 추가적으로 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 상기 알코올은 하나 이상의 저급 알코올에서부터 선택되는 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 이들의 조합에서부터 선택되는 방법.
- 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리 처리 또는 열 처리 또는 두 가지 모두의 처리를 통하여 용해가 발생하는 방법.
- 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 상기 용매는 유기 용매 및 비극성 용매이고 1.0보다 큰 비중을 가지는 방법.
- 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매는 메틸 클로로포름, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로에탄, 사염화탄소, 에틸 아세테이트, 및 이들의 조합에서부터 선택되는 방법.
- 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매로 상기 상 분리가 실온 및 중성 pH에서 완료되는 방법.
- 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 비등 및 건조를 통하여 상기 용매 및 상기 다른 비-다당류 화합물의 분리 후에, 생성되는 건조된 다당류는 적어도 1번의 추가적인 일련의 용매 헹굼, 알코올 헹굼 및 선택적으로, 최종 생성물이 다시 건조되기 전에 적어도 1번의 추가적인 일련의 물 헹굼을 통하여 추가적으로 정제되는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 적어도 1번의 추가적인 일련의 상기 용매 헹굼 및 상기 알코올 헹굼은 메틸 클로로포름, 클로로포름, 디클로로메탄, 테트라클로로에탄, 사염화탄소, 에틸 아세테이트, 및 이들의 조합에서부터 선택되는 용매 및 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 이들의 조합에서부터 선택되는 알코올을 사용하여 수행되는 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 적어도 1번의 추가적인 일련의 상기 물 헹굼은 50℃ 초과의 온도의 물을 사용하여 완료되는 방법.
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