KR20240041949A - 암 치료제 - Google Patents

Abstract

CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제를 제공하는 것. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제.

Description

암 치료제

본 발명은, 암 치료제 등에 관한 것이다.

암의 악성도를 좌우하는 인자로서, 암 조직 중에 존재하는 면역 세포, 특히 매크로파지 (종양 수반 매크로파지, 약칭 TAM) 의 중요성이 지적되고 있다. TAM 의 기능을 저해하거나 조절함으로써 암 치료 효과를 발휘하는 약제가 개발되고 있다. 그러나 선택성에 한계가 있어, 유효성이나 안전성의 면에서 실용적인 것은 아직도 존재하지 않는다. 이 때문에, TAM 에 선택적으로 약제를 딜리버리할 수 있는 기술이 희구되고 있다.

면역 다당 결합 수용체 단백 (렉틴) 의 1 종인 CD209 (별명： DC-SIGN) 는, 일부의 TAM 에 선택적으로 발현하여, 암의 스테이지나 예후와도 잘 상관되는 것이 알려져 있다. CD209 는, TAM 에 대한 약제 딜리버리가 좋은 표적이 된다고 생각된다.

콜레스테릴풀루란 등의 소수화 다당류는, 자기 조직화하여 나노 겔을 구성할 수 있고, 높은 생체 적합성, 단백질 캐리어로서 기능, 내포 단백질의 분해 및 응집 억제능을 가지므로, 단백질과 복합체화하여 항원 캐리어로서 사용하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 1).

Muraoka, D. et al., ACS Nano, 8 (9), 9209-9218, 2014

본 발명은, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 감안하여 예의 연구를 진행시킨 결과, 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자가, CD209 양성 세포에 선택적으로 결합하여, 도입되는 것을 알아냈다. 본 발명자는 이 지견에 기초하여 더욱 연구를 진행시킨 결과, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은, 하기의 양태를 포함한다.

항 1. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제.

항 2. 상기 겔 입자가 나노 겔 입자인, 항 1 에 기재된 암 치료제.

항 3. 상기 수식 다당류의 구성 다당류가 풀루란, 만난, 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 항 1 또는 2 에 기재된 암 치료제.

항 4. 상기 수식 다당류의 구성 다당류가 풀루란을 포함하는, 항 1 ∼ 3 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 5. 상기 소수성기가 스테롤 골격을 갖는 소수성기를 포함하는, 항 1 ∼ 4 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 6. 상기 수식 다당류의 중량 평균 분자량이 5000 ∼ 2,000,000 인, 항 1 ∼ 5 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 7. 상기 겔 입자의 중량 평균 입자경이 20 ∼ 200 nm 인, 항 1 ∼ 6 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 8. 상기 겔 입자가 약제를 함유하는, 항 1 ∼ 7 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 9. 상기 약제가 아쥬반트, 암항원, 항암제, 및 핵산 의약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 항 8 에 기재된 암 치료제.

항 10. 상기 CD209 양성 세포가 매크로파지인, 항 1 ∼ 9 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 11. 암 조직을 갖는 환자로부터 선별된, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직을 갖는 환자에게 투여하도록 사용하기 위한, 항 1 ∼ 10 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 12. 약제와의 병용에 사용되는, 항 1 ∼ 11 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.

항 13. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 함유하는, CD209 양성 세포로의 송달용 담체.

항 14. CD209 양성 세포가 암 조직에 존재하는, 항 13 에 기재된 송달용 담체.

항 15. 항 13 또는 14 에 기재된 송달용 담체 및 조영제를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출제.

항 16. CD209 결합성 분자를 함유하는, 항 1 ∼ 12 중 어느 하나에 기재된 암 치료제에 대한 컴패니언 진단약.

항 1A. CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직을 갖는 환자에게, 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.

항 1B. 암 조직을 갖는 환자로부터, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직을 갖는 환자를 선별하는 것, 그리고 선별된 환자에게, 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 투여하는 것을 포함하는, 항 1A 에 기재된 방법.

항 1C. CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제로서의 사용을 위한, 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자 또는 상기 겔 입자를 함유하는 제제.

항 1D. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자 또는 상기 겔 입자를 함유하는 제제의, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제의 제조를 위한 사용.

항 1E. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자 또는 상기 겔 입자를 함유하는 제제의, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제로서의 사용.

항 2A. 약제 또는 조영제를, 소수성기를 포함하는 수식 다당류에 함유하는 겔 입자에 탑재시켜 투여하는 것을 특징으로 하는, 약제 또는 조영제를 CD209 양성 세포에 송달하는 방법.

항 2B. CD209 양성 세포가 암 조직에 존재하는, 항 2A 에 기재된 송달하는 방법.

항 2C. CD209 양성 세포로의 송달용 담체로서의 사용을 위한, 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자 또는 상기 겔 입자를 함유하는 제제.

항 2D. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자 또는 상기 겔 입자를 함유하는 제제의, CD209 양성 세포로의 송달용 담체의 제조를 위한 사용.

항 2E. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자 또는 상기 겔 입자를 함유하는 제제의, CD209 양성 세포로의 송달용 담체로서의 사용.

항 3A. 항 13 또는 14 에 기재된 송달용 담체 및 조영제 혹은 이들을 함유하는 제제를, CD209 양성 세포를 함유하는 조직을 갖는 대상에 투여하는 것을 포함하는, CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출 방법.

항 3B. CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출제로서의 사용을 위한, 항 13 또는 14 에 기재된 송달용 담체 및 조영제 혹은 이들을 함유하는 제제.

항 3C. 항 13 또는 14 에 기재된 송달용 담체 및 조영제 혹은 이들을 함유하는 제제의, CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출제의 제조를 위한 사용.

항 3D. 항 13 또는 14 에 기재된 송달용 담체 및 조영제 혹은 이들을 함유하는 제제의, CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출제로서의 사용.

본 발명에 의하면, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제를 제공할 수 있다.

도 1 은 시험예 1 에 있어서, 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입률을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2 는 시험예 2 에 있어서, 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입률을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3 은 시험예 3 에 있어서, 형광 현미경으로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입 (적색) 을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4 는 시험예 4 에 있어서, 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입 강도 (형광 강도) 를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5 는 시험예 5 에 있어서, 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입 강도 (형광 강도) 를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6 은 시험예 6 에 있어서, 형광 현미경 관찰과 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7 은 시험예 7 에 있어서, 플로 사이토메트리로 표시의 세포 집단으로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가한 결과를 나타낸다.
도 8 은 시험예 8 에 있어서, 형광 현미경으로 관찰하여 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가한 결과를 나타낸다.
도 9 는 시험예 9 에 있어서, 플로 사이토메트리로 표시의 세포 집단으로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가한 결과를 나타낸다.
도 10 은 시험예 10 에 있어서, Cell Counting Kit-8 로 세포 활성을 평가한 결과를 나타낸다. 세로축은 생 세포수의 상대 비율을 나타내고, 가로축은 풀루란 나노 겔 PE 복합체 혹은 PE 의 투여 농도를 나타낸다. 범례 중, 5a 는 CMS5a 세포를 사용한 경우를 나타내고, 209b 는 CMS5a 세포에 마우스 SIGNR1/CD209b 를 발현시킨 세포를 사용한 경우를 나타낸다.
도 11 은 시험예 11 에 있어서, 종양 사이즈를 경시적으로 측정한 결과를 나타낸다. 세로축은 종양 사이즈 (단위： mm³) 를 나타내고, 가로축은 투여로부터의 경과일수를 나타낸다.

본 명세서 중에 있어서,「함유」및「포함한다」가 되는 표현에 대해서는,「함유」,「포함한다」,「실질적으로 이루어진다」및「만으로 이루어진다」라는 개념을 포함한다.

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제 (본 명세서에 있어서,「본 발명의 암 치료제」라고 나타내는 경우도 있다) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

수식 다당류는, 다당류가 수식하여 이루어지는 화합물로서, 수식기로서 소수성기를 포함하는 한, 특별히 제한되지 않는다.

수식 다당류를 구성하는 다당류 (즉, 수식 전의 다당류) 로는, 당잔기가 글리코시드 결합한 고분자이면 특별히 한정되지 않는다. 다당류를 구성하는 당잔기로는, 예를 들어, 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 푸코오스 등의 단당류, 또는 이당류 또는 올리고당류 등의 당류에서 유래하는 잔기를 채용할 수 있다. 당잔기는 1,2-, 1,3-, 1,4- 또는 1,6-글리코시드 결합하고 있어도 되고, 그 결합은 α- 또는 β- 형 결합 중 어느 것이어도 된다. 또, 다당류는 직사슬형이나 분지 사슬형 중 어느 것이어도 된다. 당잔기로는 글루코오스 잔기가 바람직하고, 다당류로는, 예를 들어 천연 또는 합성 유래의 풀루란, 만난, 덱스트란, 아밀로오스, 아밀로펙틴 등, 바람직하게는 풀루란, 만난, 덱스트란 등, 보다 바람직하게는 풀루란, 만난 등, 특히 바람직하게는 풀루란 등이 사용된다.

다당류의 중량 평균 분자량은, 수식 다당류가 겔 입자를 구성 가능한 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 5,000 ∼ 2,000,000 이다. 그 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 10,000 ∼ 1,000,000, 보다 바람직하게는 20,000 ∼ 500,000, 더욱 바람직하게는 40,000 ∼ 250,000, 보다 더 바람직하게는 80,000 ∼ 125,000 이다.

다당류로는, 시판품을 사용할 수 있고, 혹은 공지된 제조 방법에 따라서 얻어진 것을 사용할 수 있다.

소수성기는, 소수성을 갖는 기이고, 수식 다당류가 겔 입자를 구성 가능한 한 특별히 제한되지 않는다. 소수성기로는, 바람직하게는 스테롤 골격을 갖는 소수성기, 탄화수소기 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 스테롤 골격을 갖는 소수성기를 들 수 있다.

스테롤 골격은, 식 (I) 에 나타내는 시클로펜타하이드로페난트렌 고리에 하이드록시기가 결합된 알코올이다. 식 (I) 의 A ∼ D 의 기호는, 시클로펜타하이드로페난트렌 고리를 구성하는 각 고리를 나타낸다.

[화학식 1]

스테롤 골격에 있어서는, 시클로펜타하이드로페난트렌 고리에 이중 결합을 갖고 있어도 되고, 수산기의 결합하는 위치도 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, C-3 위치의 위치에 하이드록시기가 결합하고, B 고리에 이중 결합을 갖는 스테롤류, 또는, C-3 위치의 위치에 하이드록시기가 결합하고, 포화 고리로 구성된 스탄올류이다. 스테롤 골격을 갖는 소수성기는, 스테롤 골격이 수식되어 이루어지는, 예를 들어, 고리 구성 탄소에 있어서 탄화수소기 (예를 들어 탄소 원자수 1 ∼ 20 의 직사슬형 또는 분기 사슬형의 알킬기 등) 로 치환되어 이루어지는 화합물에서 유래하는 기를 들 수 있다. 여기서,「유래하는 기」란, 어느 화합물에 있어서, 수소 원자, 또는 수산기 등의 관능기가 제외되어 이루어지는 기를 나타낸다.

스테롤 골격을 갖는 소수성기로는, 예를 들어 콜레스테롤 유래의 기, 콜레스탄올 유래의 기, 라노스테롤 유래의 기, 에르고스테롤 유래의 기, β-시토스테롤 유래의 기, 캄페스테롤 유래의 기, 스티그마스테롤 유래의 기, 브라시카스테롤 유래의 기 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 바람직하게는 콜레스테롤 유래의 기, 콜레스탄올 유래의 기, 라노스테롤 유래의 기, 에르고스테롤 유래의 기 등의 스테롤 유래의 기를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 콜레스테롤 유래의 기를 들 수 있다.

소수성기로서의 탄화수소기로는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 탄소 원자수 8 ∼ 50 (바람직하게는 10 ∼ 30, 보다 바람직하게는 12 ∼ 20) 의 사슬형 (바람직하게는 직사슬형) 탄화수소기 (바람직하게는 알킬기) 를 들 수 있다.

수식 다당류의 중량 평균 분자량은, 수식 다당류가 겔 입자를 구성 가능한 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 5,000 ∼ 2,000,000 이다. 그 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 10,000 ∼ 1,000,000, 보다 바람직하게는 20,000 ∼ 500,000, 더욱 바람직하게는 40,000 ∼ 250,000, 보다 더 바람직하게는 80,000 ∼ 125,000 이다.

수식 다당류가 포함하는 소수성기의 수는, 수식 다당류가 겔 입자를 구성 가능한 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 다당류를 구성하는 당잔기 100 개당, 예를 들어 1 ∼ 10 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개다.

소수성기는, 다당류에, 직접 또는 간접적으로 (예를 들어 링커를 통하여) 연결할 수 있다.

수식 다당류로는, 예를 들어, 다당류를 구성하는 당잔기 100 개당 예를 들어 1 ∼ 10 개 (바람직하게는 1 ∼ 5 개) 의 당단위의 1 급 수산기가, 식 (II) ： -O-(CH₂)_mCONH(CH₂)_nNH-CO-O-R (II) (식 중, R 은 스테롤 골격을 갖는 소수성기 또는 탄화수소기를 나타내고；m 은 0 또는 1 을 나타내고；n 은 임의의 양의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 것이 바람직하다. n 은 바람직하게는 1 ∼ 8 이다.

수식 다당류는, 공지된 방법 (예를 들어 국제 공개 제WO00/12564호) 에 따라서 또는 준하여, 합성할 수 있다. 일례로서 다음의 방법은 들 수 있다. 최초로, 탄소수 12 ∼ 50 의 수산기 함유 탄화수소 또는 스테롤과, OCN-R¹ NCO (식 중, R¹ 은 탄소수 1 ∼ 50 의 탄화수소기이다) 로 나타내는 디이소시아네이트 화합물을 반응시키고, 탄소수 12 ∼ 50 의 수산기 함유 탄화수소 또는 스테롤이 1 분자 반응한 이소시아네이트기 함유 소수성 화합물을 제조한다. 이어서, 얻어진 이소시아네이트기 함유 소수성 화합물과 다당류를 추가로 반응시키고, 소수성기로서 탄소수 12 ∼ 50 의 탄화수소기 또는 스테릴기를 함유하는 소수성기 함유 다당류를 제조한다. 얻어진 반응 생성물을 케톤계 용매로 정제하여 고순도 소수성기 함유 다당류의 제조가 가능하다.

수식 다당류는, 1 종 단독일 수도 있고, 2 종 이상의 조합일 수도 있다.

겔 입자는, 수식 다당류를 함유한다. 「겔 입자」란 하이드로 겔 구조를 갖는 고분자 겔 입자를 말한다. 하이드로 겔이란, 친수성의 폴리머가 가교되어 형성되는 3 차원의 망목 구조가 물을 포함하여 팽윤한 것이다. 겔 입자에 있어서는, 수식 다당류가, 소수성기에 의한 소수성 상호 작용에 기초하여 형성되는 물리적 가교부를 통하여 자체 조직화하여, 3 차원의 망목 구조를 형성하고 있다.

겔 입자의 형상은, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 통상적으로 구상이다.

겔 입자는, 나노 사이즈인 (즉 나노 겔 입자인) 것이 바람직하고, 그 중량 평균 입자경은, 예를 들어 200 nm 이하, 바람직하게는 10 ∼ 200 nm, 보다 바람직하게는 15 ∼ 200 nm, 더욱 바람직하게는 20 ∼ 200 nm 이다. 당해 중량 평균 입자경의 상한은, 바람직하게는 100 nm, 보다 바람직하게는 70 nm, 더욱 바람직하게는 50 nm 이다. 그 입자경은, 동적 광 산란법에 의해 측정할 수 있다.

겔 입자는, 수식 다당류 이외의, 다른 물질을 함유할 수 있다. 다른 물질로는, 예를 들어 단백질, 펩티드, 핵산, 당류, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 무기물 등, 나아가서는 이들의 복합체 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 다른 물질로는, 예를 들어 아쥬반트, 암항원, 항암제, 핵산 의약 등의 약제, 조영제 등을 들 수 있다.

아쥬반트로는, 불활성화 균체나 균체 추출물, 핵산 리포다당, 리포펩티드, 합성 저분자 화합물 등에서 선택할 수 있고, 바람직하게는 이미다조퀴놀린 (예를 들어 R848 이나 이미퀴모드 등), 사포닌 (예를 들어 QuilA 나 QS21 등), STING 아고니스트 (예를 들어 사이클릭 di-GMP 등), 모노포스폴릴리피드나 리포펩티드 등이 사용된다. 또, 상기 이외에도, 아쥬반트로는, 예를 들어, 탁산계의 약물, 안트라사이클린계의 약물, JAK/STAT 의 저해 물질, 인돌데옥시게나아제 (IDO) 의 저해 물질, 트립토판데옥시게나아제 (TDO) 의 저해 물질 등을 들 수 있다. 이들의 저해 물질에는, 당해 인자에 대해 길항 작용을 가지는 화합물 외에, 당해 인자의 중화 항체도 포함된다.

암항원은, 항원 폴리펩티드를 들 수 있고, 바람직하게는 항원 폴리펩티드이다. 항원 폴리펩티드는, 암세포에 많이 발현하는 항원 또는 그 부분 펩티드이고, 몇개의 경우에는, 암세포에 의해서만 발현한다. 항원 폴리펩티드는, 암세포 내, 또는 암세포의 표면 상에 발현될 수 있다.

항원 폴리펩티드로는, 한정되지 않지만, ERK1, ERK2, MART-1/Melan-A, gp100, 아데노신디아미나아제 결합 단백질 (ADAbp), FAP, 시클로필린 b, 결장 직장 관련 항원 (CRC)-C017-1A/GA733, 암태아성 항원 (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, 전립선 특이적 항원 (PSA), PSA-1, PSA-2, PSA-3, 전립선 특이적 막항원 (PSMA), T 세포 수용체/CD3-제타 사슬, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8 및 GAGE-9, BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 타이로시나아제, p53, MUC 패밀리, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-페토프로테인, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌, γ-카테닌, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 대장 선종증 단백질 (APC), 포드린, 코넥신 37, Ig 이디오타이프, p15, gp75, GM2 강글리오시드, GD2 강글리오시드, 인유두종 바이러스 단백질, 종양 항원의 Smad 패밀리, lmp-1, P1A, EBV 가 코드하는 핵항원 (EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라아제, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, CD20, c-erbB-2, 이들의 부분 펩티드에서 선택될 수 있다.

항암제로는, 예를 들어 알킬화제, 대사 길항제, 미소관 저해제, 항생 물질 항암제, 토포이소머라아제 저해제, 백금 제제, 분자 표적약, 호르몬제, 생물 제제 등을 들 수 있다.

알킬화제로는, 예를 들어 시클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 다카르바진, 테모졸로마이드, 니무스틴, 부술판, 멜파란, 프로카르바진, 라니무스틴 등을 들 수 있다.

대사 길항제로는, 예를 들어, 에노시타빈, 카모푸르, 카페시타빈, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실칼륨, 젬시타빈, 시타라빈, 시타라빈옥포스페이트, 넬라라빈, 플루오로우라실, 플루다라빈, 페메트렉시드, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 클라드리빈, 독시플루리딘, 하이드록시카르바미드, 메르캅토푸린 등을 들 수 있다.

미소관 저해제로는, 예를 들어, 빈크리스틴 등의 알칼로이드계 항암제, 도세탁셀, 파클리탁셀 등의 탁산계 항암제를 들 수 있다.

항생 물질 항암제로는, 예를 들어, 마이토마이신 C, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 블레오마이신, 액티노마이신 D, 아클라루비신, 이다루비신, 피라루비신, 페플로마이신, 미톡산트론, 암루비신, 지노스타틴 스티말라머 등을 들 수 있다.

토포이소머라아제 저해제로는 토포이소머라아제 I 저해 작용을 갖는 CPT-11, 이리노테칸, 노기테칸, 토포이소머라아제 II 저해 작용을 가지는 에토포시드, 소부족산을 들 수 있다.

백금 제제로는, 예를 들어, 시스플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴 등을 들 수 있다.

호르몬제로는, 예를 들어, 덱사메타손, 피나스테리드, 타목시펜, 아스트로조르, 엑스메스탄, 에티닐 에스트라디올, 클로르마디논, 고세렐린, 비칼루타미드, 플루타미드, 프레드니솔론, 류프로렐린, 레트로졸, 에스트라무스틴, 토레미펜, 포스페스트롤, 미토탄, 메틸테스토스테론, 메드록시프로게스테론, 메피티오스탄 등을 들 수 있다.

생물 제제로는, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, 인터류킨 2, 우베니멕스, 건조 BCG, 세포 외 독소 등을 들 수 있다. 세포 외 독소로서 구체적으로는, Pseudomonas Exotoxin (PE) 이라는 박테리아가 산생하는 외독소 (단백질) 를 들 수 있고, PE 에는 NAD＋-diphthamide-ADP-ribosyl transferase 라는 효소 활성이 있어, 단백 합성을 저해하여 강한 독성을 발휘한다. 지금까지, PE 를 CD22 항체라는 항체에 콘주게이트한 것이, 항암제로서 승인되어 있다.

분자 표적약으로는, 예를 들어, 리툭시맙, 알렘투주맙, 트라스투주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 게피티닙, 에를로티닙, 템시롤리무스, 베바시주맙, VEGF trap, 수니티닙, 소라페닙, 토실리주맙, 보르테조밉, 겜투주맙·오조가마이신, 이브리투모맙·오조가마이신, 이브리투모맙 티욱세탄, 타미바로텐, 트레티노인 등을 들 수 있다. 여기에 특정하는 분자 표적약 이외에도, 인간 상피성 증식 인자 수용체 2 저해제, 상피성 증식 인자 수용체 저해제, Bcr-Abl 티로신 키나아제 저해제, 상피성 증식 인자 티로신 키나아제 저해제, mTOR 저해제, 혈관 내피 증식 인자 수용체 2 저해제 (α-VEGFR-2 항체) 등의 혈관 신생을 표적으로 한 저해제, MAP 키나아제 저해제 등의 각종 티로신 키나아제 저해제, 사이토카인을 표적으로 한 저해제, 프로테아솜 저해제, 항체-항암제 배합체 등의 분자 표적약 등도 포함시킬 수 있다. 이것들 저해제에는 항체도 포함한다.

핵산 의약은, 핵산인 의약 유효 성분이고, 그 한정에 있어서 특별히 제한되지 않는다.

조영제는, 그 존재 장소를 가시화하는 것이 가능한 물질인 한, 특별히 제한되지 않는다. 조영제로는, 예를 들어 황산바륨, 차탄산비스무트, 산화비스무트, 산화지르코늄, 불화이테르븀, 요오드포름, 바륨아파타이트, 티탄산바륨, 란탄 유리, 바륨 유리, 스트론튬 유리 등의 X 선 조영제；요오드 조영제 등의 Computed Tomography (CT) 용 조영제；가돌리늄 제제, 초상자성 산화철 제제 (Super Paramagnetic Iron Oxide, SPIO) 등의 MRI 용 조영제；테크네튬 99m (99mTc), 몰리브덴 99 (99Mo) 등의 Single photon emission computed tomography (SPECT) 용 방사성 동위체, 그 외 각종 방사성 동위체 또는 그것을 포함하는 물질 등을 들 수 있다.

다른 물질의 함유량은, 수식 다당류의 함유량 100 질량부에 대하여, 예를 들어 0 ∼ 10000 질량부, 0 ∼ 1000 질량부, 0 ∼ 500 질량부, 0 ∼ 100 질량부, 0 ∼ 50 질량부, 또는 0 ∼ 10 질량부이다.

겔 입자는, 공지된 방법에 따라서 제조할 수 있다. 예를 들어, 수식 다당류 함유 용액을 초음파 처리하거나, 혹은 당해 용액에 우레아, DMSO, 계면 활성제 등의 변성제를 첨가 후에 투석에 의해 변성제를 제거함으로써 제조할 수 있다. 간편성의 관점에서, 전자의 방법이 보다 바람직하다. 후자의 방법은, 공지된 방법에 따라서 또는 준하여 실시할 수 있다.

수식 다당류 함유 용액은, 수식 다당류를 용매에 용해함으로써 조제할 수 있다. 용매로는, 예를 들어 물이나, DMSO 등의 유기 용매를 사용할 수 있다. 수식 다당류 용액은, 통상적으로 용매로서 물을 사용하여, 조제할 수 있다. 이 때, 물 대신에, PBS 등의 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.

수식 다당류 함유 용액 중의 수식 다당류의 농도는, 특별히 제한되지 않지만, 겔 입자의 형성 효율 등의 관점에서, 예를 들어 5 ∼ 100 uM, 바람직하게는 5 ∼ 80 uM, 보다 바람직하게는 8 ∼ 50 uM 이다.

초음파 처리는, 예를 들어, 수식 다당류 함유 용액이 들어간 플라스틱 튜브를 배스형 초음파조 내의 물 위에 고정시키고, 초음파 조사함으로써 실시할 수 있다. 초음파 처리의 조건은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 10 ∼ 40 ℃ (바람직하게는 20 ∼ 35 ℃), 10 ∼ 50 kHz (바람직하게는 20 ∼ 40 kHz), 30 ∼ 200 W (바람직하게는 70 ∼ 150 W), 2 ∼ 30 분간 (바람직하게는 5 ∼ 15 분간) 이다.

겔 입자의 용도는, 일 양태에 있어서, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제이다. 겔 입자는, CD209 를 표적으로 하여 이것을 발현하는 세포에 결합하여, 도입된다. 이 때문에, 겔 입자에 포함되는 성분을, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 선택적으로 수송할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 겔 입자에 포함되는 약제 (아쥬반트, 암항원, 항암제, 핵산 의약 등) 를, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 선택적으로 수송하고, 면역 부활 작용, 항암 작용 등을 발휘시켜, 암을 치료할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 겔 입자에 포함되는 암항원을 CD209 양성 세포 (바람직하게는 매크로파지, 종양 수반 매크로파지) 에 도입시키고, 당해 세포에 항원 제시시키고, T 세포 등의 임파구를 활성화하여, 암을 치료할 수 있다.

겔 입자는, CD209 를 표적으로 하여 이것을 세포막 상에 발현하는 세포에 결합하여, 도입되므로, CD209 양성 세포로의 송달용 담체 (본 발명의 송달용 담체) 로서 사용하는 것이 가능하다. CD209 양성 세포는, 암 조직에 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 송달용 담체를 송달시키는 물질 (상기 서술한 겔 입자가 포함할 수 있는 다른 물질 (예를 들어 아쥬반트, 암항원, 항암제, 핵산 의약 등의 약제, 조영제 등)) 과 함께 투여함으로써 (바람직하게는, 다른 물질을 겔 입자에 탑재 (예를 들어 결합, 유지) 시켜 투여함으로써), 다른 물질을 CD209 양성 세포 (바람직하게는, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직) 에 송달할 수 있다. 송달용 담체의 일 양태로서, 예를 들어 드러그 딜리버리 담체를 들 수 있다.

본 발명의 송달용 담체를 조영제와 함께 사용하는 경우 (바람직하게는 조영제가 겔 입자에 탑재되어 있는 (예를 들어 결합하고 있는, 유지하고 있는) 경우, CD209 양성 세포를 함유하는 조직 (바람직하게는 CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직) 의 검출제로서 사용할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 송달용 담체 및 조영제를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출제에 관한 것이다. 당해 검출제는, 조영제의 종류에 따라, 예를 들어 MRI, PE T, CT 등에서 사용하는 검출제로서 사용할 수 있다. 당해 검출제에 의해, CD209 양성 세포를 함유하는 조직을 가시화하는 것이 가능하다.

CD209 는, 인간이면 DC-SIGN 이라고도 표시되는 C 타입의 렉틴 수용체이고, 세포 표면상에 발현된다. 다른 동물에 있어서의 CD209 는, 인간 CD209/DC-SIGN 과의 서열 동일성에 기초하여, 결정할 수 있다. 예를 들어, 마우스에 있어서의 CD209 의 기능적 호모로그는 CD209b 이고, 이것은 SIGNR1 이라고도 표시되는 것이다.

CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직은, 예를 들어 암 조직 중의 특정한 세포군 (바람직하게는 매크로파지) 을 선별하여, 당해 암 조직 중에 CD209 양성 세포가 어느 정도 포함되는지의 여부를 판정함으로써 결정할 수 있다. 상기 선별 및 판정은, 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들어, 면역 조직 염색법을 들 수 있다. 이 방법에서는 암 조직 중의 CD209 양성 세포를 항인간 CD209 항체 염색하고 (형광법 또는 발색법), 염색된 세포가 발하는 색소량 (예를 들어, 형광량 또는 가시광량) 에 기초하여 양성 또는 음성을 판단함으로써 실시된다. 당해 염색은, 대표적으로는 CD209 결합성 분자를 이용하여 실시할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은, 그 일 양태에 있어서, CD209 결합성 분자를 함유하는, 본 발명의 암 치료제에 대한 컴패니언 진단약 (본 발명의 진단약) 에 관한 것이다. CD209 결합성 분자와, 피검체의 암 조직 중의 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법에 의해, 본 발명의 암 치료제에 대한 유효성을 예측할 수 있다.

CD209 결합성 분자는, CD209 에 대해 결합 가능한 (바람직하게는 특이적으로 결합 가능한) 분자인 한, 특별히 제한되지 않는다. CD209 결합성 분자로는, 예를 들어 항체, 보다 구체적으로는 예를 들어 이뮤노글로불린, Fab, F(ab')₂, 미니보디 (minibody), scFv­Fc, Fv, scFv, 디아보디 (diabody), 트리아보디 (triabody), 테트라보디 (tetrabody), 모노보디 등을 들 수 있다.

상기 선별 및 판정의 일련의 작업은, 예를 들어 현미경 관찰을 사용하여 실시할 수 있다. 양성 또는 음성의 판정은, 공지된 방법에 따라서, 염색된 세포가 발하는 색소량에 기초하여 실시된다. 이 판단은, 공지된 수법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들어, 네거티브 컨트롤 세포 (구체적으로는, 예를 들어 아이소타입 컨트롤 항체로 염색된 세포) 가 발하는 색소량을 백그라운드의 색소량으로 하고, 백그라운드에 대해 충분히 높은 색소량을 기준으로, 그 기준보다 색소량이 낮은 세포를 음성 세포로 판단하고, 그 기준보다 형광량이 많은 세포를 양성 세포로 판단한다. 보다 간편한 방법으로서, 암 조직으로부터 추출한 mRNA 를 대상으로 하여 CD209 의 역전사 정량 PCR 을 실시하고, CD209 mRNA 량의 다과로 판정하는 방법도 생각된다.

암 조직을 갖는 환자로부터, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직을 갖는 환자를 선별하고, 당해 선별된 환자에 대해 본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체를 투여하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체는, 암 조직을 갖는 환자로부터 선별된, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직을 갖는 환자에게 투여하도록 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체는, 겔 입자를 함유하는 한 특별히 제한되지 않고, 필요에 따라 추가로 다른 성분을 포함하고 있어도 된다. 다른 성분으로는, 약학적으로 허용되는 성분이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 다른 성분으로는, 약리 작용을 갖는 성분 외에 첨가제도 포함된다. 첨가제로는, 예를 들어 기제, 담체, 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 증점제, 보습제, 착색료, 향료, 킬레이트제 등을 들 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체는, 겔 입자에 더하여, 상기 서술한 겔 입자가 포함할 수 있는 다른 물질 (예를 들어 아쥬반트, 암항원, 항암제, 핵산 의약 등의 약제, 조영제 등) 을 포함할 수 있다. 또, 본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체는, 상기 서술한 겔 입자가 포함할 수 있는 다른 물질 (예를 들어 아쥬반트, 암항원, 항암제, 핵산 의약 등의 약제, 조영제 등) 과 병용할 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체의 적용 대상은 특별히 한정되지 않지만, 포유 동물에서는, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 말, 소, 양, 염소, 사슴 등을 들 수 있다. 또한, 세포로는, 동물 세포 등을 들 수 있다. 세포의 종류도 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 혈액 세포, 조혈 줄기 세포·전구 세포, 배우자 (정자, 난자), 선유아 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포, 간세포, 케라틴 생성 세포, 근세포, 표피 세포, 내분비 세포, ES 세포, iPS 세포, 조직 줄기 세포, 암 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체의 대상 암으로는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 백혈병 (만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병을 포함한다), 림프종 (비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, T 세포계 림프종, B 세포계 림프종, 버킷 림프종, 악성 림프종, 미만성 림프종, 여포성 림프종을 포함한다), 골수종 (다발성 골수종을 포함한다), 유방암, 대장암, 신장암, 위암, 난소암, 췌장암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 식도암, 간암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 악성 흑색종, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 협막종, 남성배종, 자궁 내막 과형성, 자궁 내막증, 배아종, 섬유 육종, 카포지 육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상 세포종, 신경 섬유종, 희돌기류종, 수아종, 신경아종, 신경교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성 육종, 평활근 육종, 갑상 육종 및 빌름스 종양 등을 들 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체는, 임의의 제형, 예를 들어 정제 (구강 내측 붕괴정, 저작 가능정, 발포정, 트로키제, 젤리상 드롭제 등을 포함한다), 환제, 과립제, 세립제, 산제, 경질 캡슐제, 연질 캡슐제, 드라이 시럽제, 액제 (드링크제, 현탁제, 시럽제를 포함한다), 젤리제 등의 경구 제제 형태, 주사용 제제 (예를 들어, 점적 주사제 (예를 들어 점적 정주용 제제 등), 정맥 주사제, 근육 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제), 외용제 (예를 들어, 연고제, 파프제, 로션제), 좌제 흡입제, 안제, 안연고제, 점비제, 점이제, 리포솜제 등의 비경구 제제 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체의 투여 경로로는, 원하는 효과가 얻어지는 한 특별히 제한되지 않고, 경구 투여, 경관 영양, 주장 투여 등의 경장 투여； 경정맥 투여, 경동맥 투여, 근육 내 투여, 심장 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 복강 내 투여 등의 비경구 투여 등을 들 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체 중의 유효 성분의 함유량은, 사용 양태, 적용 대상, 적용 대상 상태 등에 좌우되는 것으로, 한정은 되지 않지만, 예를 들어 0.0001 ∼ 100 중량％, 바람직하게는 0.001 ∼ 50 중량％ 로 할 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 본 발명의 송달용 담체의 투여량은, 약효를 발현하는 유효량이면 특별히 한정되지 않고, 통상적으로는, 유효 성분의 중량으로서, 일반적으로 경구 투여의 경우에는 1 일당 0.1 ∼ 1000 mg/kg 체중, 바람직하게는 1 일당 0.5 ∼ 500 mg/kg 체중이고, 비경구 투여의 경우에는 1 일당 0.01 ∼ 100 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.05 ∼ 50 mg/kg 체중이다. 상기 투여량은, 연령, 병태, 증상 등에 따라 적절히 증감시킬 수도 있다.

실시예

이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

조제예 1. 풀루란 나노 겔의 조제

기보 (Macromolecules 1993, 23, 3062-3068) 의 기재에 따라, 중량 평균 분자량 100,000 인 풀루란에 100 단당당 콜레스테롤이 1.2 개 도입된 콜레스테롤 수식 풀루란 (CHP) 을 제조하였다.

CHP 를 PBS 에 1 mg/mL 가 되도록 첨가하고, 스터러에 의해 25 ℃ 에서 15 시간 교반 용해시킨 후, 프로브형 초음파 조사기에 의해 초음파를 6 분간 간헐 조사하였다. 이 용액을 25 ℃, 20000 g 으로 30 분간 원심 분리 처리한 후, 상청을 0.22 um 필터에 통과시켜 여과 멸균을 실시하여, 풀루란 나노 겔 (나노 겔 중량 평균 분자량 450,000) 을 얻었다.

동적 광 산란계 (DLS) 에 의한 큐물런트법 해석에 의해, 얻어진 풀루란 나노 겔의 평균 입자경의 측정을 실시하였다. 그 결과, 풀루란 나노 겔의 평균 입자경은 32.2 ± 2.1 nm, 다분산 지수는 0.26 ± 0.01 이었다.

시험예 1. 풀루란 나노 겔의 마우스 CD209 로의 결합

HEK293 세포에 마우스 SIGNR1/CD209b 또는 마우스 DC-SIGN/CD209a 의 cDNA 를 코드하는 발현 벡터를 리포펙션법으로 일과성 도입하였다. 컨트롤로서 cDNA 를 포함하지 않는 발현 벡터를 사용하여 동일하게 실시하였다 (Vector control). 48 시간 후에, 각 세포에 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 도 1 에 표시의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 세포를 냉 PBS 로 세정하고, EDTA 함유 냉 PBS 로 박리하여 싱글 셀이 되도록 현탁하였다. 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입률을 측정하였다.

결과를 도 1 에 나타낸다. 마우스 SIGNR1/CD209b 발현 세포에서는 48.9 ％ (2 ㎍ 풀루란 나노 겔/mL 일 때) 또는 67.8 ％ (10 ㎍ 풀루란 나노 겔/mL 일 때) 의 세포로 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입이 확인된 데에 반하여, 마우스 DC-SIGN/CD209a 발현 세포에서는 5.5 ％ (2 ㎍ 풀루란 나노 겔/mL 일 때) 또는 16.6 ％ (10 ㎍ 풀루란 나노 겔/mL 일 때) 로 저치였다. 마우스 SIGNR1/CD209b 는 인간 DC-SIGN/CD209 와 기능적으로 가깝다. 또한, 이 때 Green fluorescent protein (GFP) cDNA 를 코드하는 발현 벡터의 일과성 발현으로 평가한 도입 효율은 약 40 ％ 였다.

시험예 2. 풀루란 나노 겔의 인간 CD209 로의 결합

시험예 1 과 동일하게 하여, HEK293 세포에 마우스 SIGNR1/CD209b, 마우스 DC-SIGN/CD209a, 또는 인간 DC-SIGN/CD209 의 cDNA 를 코드하는 발현 벡터를 리포펙션법으로 일과성 도입하였다. 컨트롤로서 cDNA 를 포함하지 않는 발현 벡터를 사용하여 동일하게 실시하였다 (Vector control). 48 시간 후에, 각 세포에 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 도 2 에 표시의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 세포를 냉 PBS 로 세정하고, EDTA 함유 냉 PBS 로 박리하여 싱글 셀이 되도록 현탁하였다. 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입률을 측정하였다.

결과를 도 2 에 나타낸다. 마우스 DC-SIGN/CD209a 발현 세포, 마우스 SIGNR1/CD209b 발현 세포, 인간 DC-SIGN/CD209 발현 세포에서 각각 3.1 ％, 22.3 ％, 31.4 ％ 의 세포로 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입이 확인되었다. 이 때 Green fluorescent protein (GFP) cDNA 를 코드하는 발현 벡터의 일과성 발현으로 평가한 도입 효율은 약 29 ％ 였다.

시험예 3. 풀루란 나노 겔의 CD209 로의 특이적 결합

COS7 세포에 표시의 C 형 렉틴의 cDNA 를 코드하는 발현 벡터를 리포펙션법으로 일과성 도입하였다. 컨트롤로서 cDNA 를 포함하지 않는 발현 벡터를 사용하여 동일하게 실시하였다 (Vector control). 48 시간 후에, 각 세포에 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 2 ㎍/mL 의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 세포를 냉 PBS 로 세정하고, TryPLE (Thermo Scientific) 로 박리하여 싱글 셀이 되도록 현탁하였다. 형광 현미경으로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입 (적색) 을 관찰하였다.

인간 C 형 렉틴 발현 세포의 결과를 도 3a 에 나타내고, 마우스 C 형 렉틴 발현 세포의 결과를 도 3b 에 나타낸다. 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입은 인간 DC-SIGN/CD209, 인간 L-SIGN, 마우스 SIGNR1/CD209b 를 발현하는 세포에서만 관찰되고, 다른 C 형 렉틴을 발현하는 세포에서는 확인되지 않았다.

시험예 4. 다당 나노 겔과 직사슬형 다당의 CD209 로의 결합

마우스 SIGNR1/CD209b 유전자를 안정 발현하는 마우스 RAW264.7세포 (도 4 중 RAW SR-1) 에, 로다민 표지 풀루란 나노 겔 (도 4 중 CHP) 또는 로다민 표지 풀루란 (직사슬형, 유니머) (도 4 중 Pullulan 400K) 을 도 4 에 표시의 각 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 세포를 스크레이퍼로 박리하여 싱글 셀이 되도록 현탁하였다. 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입 강도 (형광 강도) 를 측정하였다. 또, 만난 (직사슬형, 유니머) 과 만난 나노 겔을 사용하여, 동일하게 시험하였다.

결과를 도 4 에 나타낸다. 풀루란 나노 겔과 풀루란 모두 농도 의존적으로 RAW SR-1 세포에 도입되었다. 도입은 풀루란 (유니머, 직사슬형) 보다 풀루란 나노 겔 (나노 입자상) 쪽이 높았다.

시험예 5. RAW SR-1 세포로의 풀루란 나노 겔의 결합의 SIGNR1 의존성

시험예 4 와 동일한 실험을 실시하였다. 단, 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 첨가하기 전에 세포를 SIGNR1 특이적 항체 (클론 22D1 (IgG) 또는 클론 ERTR9 (IgM)) 로 1 시간 처리하였다.

결과를 도 5 에 나타낸다. 22D1 항체 (IgG) 로 처리한 세포에서는 풀루란 나노 겔의 도입의 유의한 저하가 확인되었다. 22D1 은 SIGNR1/CD209b 의 당 사슬 인식 부위에 결합하는 점에서, SIGNR1/CD209b 와 풀루란 나노 겔의 결합을 22D1 이 방해함으로써 풀루란 나노 겔의 도입이 저해되었다고 생각된다. ERTR9 는 SIGNR1/CD209b 의 당 사슬 인식 부위에는 결합하지 않기 때문에, 풀루란 나노 겔의 도입의 저해가 발생하지 않았다고 생각된다. 이 결과로부터, 풀루란 나노 겔과 SIGNR1 이 특이적으로 결합하는 것이 지지되었다.

시험예 6. 풀루란 나노 겔의 CD209 로의 특이적 결합

마우스 섬유 육종 세포주 CMS5a 세포에 마우스 SIGNR1/CD209b 의 cDNA 를 코드하는 발현 벡터를 일렉트로포레이션법으로 일과성 도입하였다. 다음날에, 각 세포에 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 2 ㎍/mL 의 농도로, 또 항 SIGNR1 항체 (22D1) 를 도 6 에 표시의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 세포를 트립신으로 박리하여 싱글 셀이 되도록 현탁하였다. 형광 현미경 관찰과 플로 사이토메트리로 각 세포로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. SIGNR1/CD209b 발현 세포 (도 6 중 컨트롤) 에서 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입이 명확하게 확인되었다. 이것에 대해 22D1 항체의 첨가에 의해, 그 농도 의존적으로 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입이 감약하였다. 도 5 와 마찬가지로, 풀루란 나노 겔과 SIGNR1/CD209b 가 특이적으로 결합하는 것이 지지되었다.

시험예 7. 풀루란 나노 겔의 종양 수반 매크로파지 (TAM) 로의 선택적 도입

마우스 대장암 세포주 CT26 세포를 정상 BALB/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 피하에 이식하고, 8 일 후에 종양을 회수하여 젠틀맥스 (밀테니) 로 파쇄하여 세포 현탁액으로 한 후, 배양 플레이트 상에서 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 이것에 대해 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 2 ㎍/mL 의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 그 후, 세포를 트립신으로 박리하여 싱글 셀이 되도록 현탁하였다. 이것을 항 CD45 항체, CD11b 항체, Gr1 항체, SIGNR1/CD209b 항체, MHC 클래스 II 항체로 염색하고, 플로 사이토메트리로 표시의 세포 집단으로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가하였다.

결과를 도 7 에 나타낸다. 마이엘로이드 세포 중, CD11b＋Gr1-CD209b＋세포 (CD209b 양성 TAM) 에 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 높은 도입이 명확하게 확인되었다 (도 7 우측).

시험예 8. 풀루란 나노 겔의 종양 수반 매크로파지 (TAM) 로의 선택적 도입

마우스 대장암 세포주 CT26 세포를 정상 BALB/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 피하에 이식하고, 8 일 후에 종양을 회수하고 젠틀맥스 (밀테니) 로 파쇄하여 세포 현탁액으로 한 후, 배양 플레이트 상에서 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 이것에 대해 로다민 표지 풀루란 나노 겔을 2 ㎍/mL 의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 이 때, SIGNR1 항체 (22D1) 를 도 8 에 표시의 농도로 동시 첨가하였다. 그 후, 형광 현미경으로 관찰하여 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가하였다. ×400 의 시야에서 강하게 발광하고 있는 세포수를, 도입 세포수로 하였다.

결과를 도 8 에 나타낸다. 22D1 항체의 존재하에서는, 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입이 현저히 저해되었다.

시험예 9. 풀루란 나노 겔의 종양 수반 매크로파지 (TAM) 로의 선택적 도입

마우스 대장암 세포주 CT26 세포를 정상 BALB/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 피하에 이식하고, 8 일 후에 로다민 표지 풀루란 나노 겔 (600㎍) 을 정맥 내 투여하였다. 이 때 SIGNR1 항체 (22D1) 를 표시의 농도로 동시 투여하였다. 6 시간 후에 종양을 회수하고, 젠틀맥스 (밀테니) 로 파쇄하여 세포 현탁액으로 한 후, 항 CD45 항체, CD11b 항체, Gr1 항체, CD209b 항체, CD206 항체, MHC 클래스 II 항체로 염색하고, 플로 사이토메트리로 표시의 세포 집단으로의 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 도입을 평가하였다.

결과를 도 9 에 나타낸다. CD11b＋Gr1-CD209b＋세포 (CD209 양성 TAM) 에 로다민 표지 풀루란 나노 겔의 높은 도입이 명확하게 확인되었다 (도 9 좌측). 이것에 대하여, SIGNR1 항체는 농도 의존적으로 동세포로의 풀루란 나노 겔의 도입을 저해하였다.

시험예 10. 풀루란 나노 겔 녹농균 외독소 (Pseudomonas Exotoxin, PE) 복합체에 의한 세포 장해

마우스 섬유 육종 세포주 CMS5a 세포에 마우스 SIGNR1/CD209b 의 cDNA 를 코드하는 발현 벡터를 일렉트로포레이션법으로 일과성 도입하였다. 다음날에, 각 세포에 풀루란 나노 겔 PE 복합체 혹은 PE 를 0.3, 1, 3, 9, 10, 30, 90 ㎍/mL 의 농도로 투여하고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하였다. 1 시간 후에 10 ％ FCS RPMI 로 세정한 후, 10 ％ FCS RPMI 에서 24 시간 배양, 그 후, Cell Counting Kit-8 로 세포 활성을 평가하였다.

결과를 도 10 에 나타낸다. PE 단독으로는, SIGNR1/CD209b 발현에 관계없이 농도 의존적으로 세포 장해 활성이 관찰되는 데에 반하여, 풀루란 나노 겔 PE 복합체에서는 SIGNR1/CD209b 발현 세포에서 우위에 세포 장해 활성이 확인되었다.

시험예 11. 풀루란 나노 겔 PE 복합체에 의한 세포 장해

마우스 대장암 세포주 CMS5a 세포를 정상 BALB/c 마우스 (8 주령, 암컷) 의 피하에 이식하고, 8, 10, 12 일 후에 풀루란 나노 겔 PE 복합체 및 PE 를 (0.1 ㎍) 을 CpG (50 ug) 와 함께 정맥 내 투여하였다. 종양 사이즈를 경시적으로 측정하였다.

결과를 도 11 에 나타낸다. CpG 단독 투여군 및 풀루란 나노 겔 PE 단독 투여군에 비하여, 풀루란 나노 겔 PE 복합체와 CpG 의 병용 투여에 의해 우위에 종양 증식 억제 효과가 관찰되었다. PE 투여 마우스에 대해서는, 투여 24 시간에 사망하였다.

Claims (16)

1. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직에 대한 암 치료제.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 겔 입자가 나노 겔 입자인, 암 치료제.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 수식 다당류의 구성 다당류가 풀루란, 만난, 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 암 치료제.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 수식 다당류의 구성 다당류가 풀루란을 포함하는, 암 치료제.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 소수성기가 스테롤 골격을 갖는 소수성기를 포함하는, 암 치료제.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 수식 다당류의 중량 평균 분자량이 5000 ∼ 2,000,000 인, 암 치료제.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 겔 입자의 중량 평균 입자경이 20 ∼ 200 nm 인, 암 치료제.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 겔 입자가 약제를 함유하는, 암 치료제.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 약제가 아쥬반트, 암항원, 항암제, 및 핵산 의약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, 암 치료제.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD209 양성 세포가 매크로파지인, 암 치료제.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 조직을 갖는 환자로부터 선별된, CD209 양성 세포를 함유하는 암 조직을 갖는 환자에게 투여하도록 사용하기 위한, 암 치료제.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제와의 병용에 사용되는, 암 치료제.
13. 소수성기를 포함하는 수식 다당류를 함유하는 겔 입자를 함유하는, CD209 양성 세포로의 송달용 담체.
14. 제 13 항에 있어서,
    CD209 양성 세포가 암 조직에 존재하는, 송달용 담체.
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 기재된 송달용 담체 및 조영제를 함유하는, CD209 양성 세포를 함유하는 조직의 검출제.
16. CD209 결합성 분자를 함유하는, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 암 치료제에 대한 컴패니언 진단약.