KR20240041364A

KR20240041364A - 배양된 지방 조직

Info

Publication number: KR20240041364A
Application number: KR1020247006859A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 캐플런; 존 세 킷 유엔
Original assignee: 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2024-03-29
Also published as: CN117940140A; IL310647A; AU2022324120A1; WO2023015317A1

Abstract

본 개시내용은 세포 배양된 지방 조직에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 상기 배양된 지방 조직은 시험관내 배양 배지에서 지방 세포를 배양하는 것, 목적하는 양의 지방 세포가 생성된 후 지방 세포를 수확하는 것, 및 수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 수확된 지방 세포를 응집시키는 것은 3-차원 (3D) 몰드 중에서 수확된 지방 세포를 히드로겔 또는 바인더와 혼합하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 수확된 지방 세포를 응집시키는 것은 3D 몰드 중에서 수확된 지방 세포를 가교시키는 것을 포함한다. 배양된 지방 조직은 정해진 3D 형상 및 거대규모 상의 크기를 가진다. 일부 실시양태에서, 배양된 지방 조직은 식품 생성물일 수 있다.

Description

배양된 지방 조직

[관련 출원의 상호-참조]

본 출원은 2021년 8월 5일자 U.S. 특허 임시 출원 제63/203,980호에 관한 것으로, 그를 우선권 주장하며, 그는 모든 목적에 있어서 본원에 참조로 포함된다.

[발명의 분야]

고기 (근육 및 지방 조직)의 제조를 위한 통상적인 축산업은 환경 오염, 동물 질환 발생, 항균제 내성 및 동물 복지 우려와 같은 수많은 결점과 연관된다. 동물 및 환경에 대하여 감소된 부정적인 영향을 가지는 동물 생성물의 대안을 세상에 제공하기 위하여, 배양된 (시험관내) 지방 조직을 제조하는 데에 점증하는 관심이 모이고 있다.

대안 단백질 분야에서, 고기의 지방 함량을 재현하기 위한 기존의 해결책은 대부분 식물 지방 및 오일 (예컨대 코코넛 오일)의 직접적인 첨가 또는 이용에 관한 것이다. 이와 같은 영역에서의 최근의 발전에는 식물성 오일의 나노규모 소구체(globule)가 생성되어 있어서 고체 지방 (즉 동물 지방)의 질감을 더 우수하게 창출하는 올레오젤(oleogel)의 사용이 포함된다. 그러나, 식물-기재 지방은 고기의 종종 복잡한 방향 및 향미는 물론, 소, 돼지, 닭, 어류 등에서 고기를 구별하는 종-특이적 향미를 포함하고 있지 않다.

자연의 (생체내) 지방 조직은 대부분 성긴 세포외 매트릭스 (ECM)에 의해 함께 유지되는 지질-충전된 지방세포의 조밀한 충진물 (응집물)이다. 이는 다중-계층 구조로 정렬된 섬유로 구성되는 근육 조직과는 반대되는 것이다. 지금까지는, 3-차원 (3D) 배양이 대량/거대규모 조직을 생성시키기 위한 주 접근법이었다. 이러한 조직 공학적 전략은 3D 스캐폴드 상에서의 세포의 시험관내 성장을 포함한다. 그러나, 산소, 영양소 및 폐기물과 관련한 물질 수송 한계로 인하여, 3D 배양을 규모증대하는 것은 까다롭다. 해당 분야에서, 혈액 또는 배양 배지 공급원의 약 200 마이크로미터 이내에 그것이 존재하지 않는 한, 세포는 3D 조직에서는 생존가능하게 유지될 수 없다고 일컬어지고 있다. 이러한 난제를 극복하여 3D 조직에서 세포 생존력을 유지하는 것은 세포에 영양소를 분배하는 혈관화 또는 정교한 조직 관류 시스템의 통합을 필요로 할 수 있다. 관류 또는 관련 방법의 사용 없이 현대 조직 공학 기술을 사용하여, 또는 생체내에서 발견되는 것과 같은 지방의 구조적 특징을 동반하여 거대규모 (밀리미터 규모 이상)로 대형 조직을 직접 성장시키는 것은 현재 실현가능하지 않다. 어쩌면 이러한 난제로 인하여, 생체내에서 발견되는 것을 모방한 지방 조직의 대-규모 제조는 오늘날까지 실행되지 않고 있는 것으로 보인다.

이에 따라, 배양된 지방 조직의 대-규모 제조를 위한 전략에 대한 필요성이 남아 있다. 본 개시내용은 이와 같은 필요성에 대한 기술적 해결책을 제공한다.

[발명의 개요]

본원에서 개시되는 것은 배양된 지방 조직의 제조 방법이다. 상기 방법은 제1 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것, 제2 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것, 및 지방 세포를 수확하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것 및 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것은 생물반응기에서 수행된다.

또한, 본원에서 개시되는 것은 배양된 지방 조직의 제조 방법이다. 상기 방법은 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것, 및 상기 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 지방 세포를 수확하는 것, 및 수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본원에서 개시되는 것은 배양된 지방 조직의 제조 방법이다. 상기 방법은 2-차원 (2D) 기재 상에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것, 2D 기재 상에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것, 및 지방 세포를 수확하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 2D 기재는 컨베이어 벨트이며, 상기 방법은 연속식 조립 라인-형 공정으로 수행된다.

역시 본원에서 개시되는 것은 배양된 지방 조직의 제조 방법이다. 상기 방법은 배양 배지에서 지방생성 전구 세포로부터 지방 세포를 배양하는 것, 목적하는 양의 지방 세포가 생성된 후 지방 세포를 수확하는 것, 및 수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본원에서 개시되는 것은 배양된 지방 조직이다. 상기 배양된 지방 조직은 히드로겔(hydrogel) 또는 바인더(binder)에 매립되어 있는 지방 세포를 포함할 수 있다. 배양된 지방 조직은 3D 형상 및 거대규모 상의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양된 지방 조직은 식품 생성물이다.

또한, 본원에서 개시되는 것은 배양된 지방 조직이다. 상기 배양된 지방 조직은 서로 가교된 지방 세포를 포함할 수 있다. 배양된 지방 조직은 3D 형상 및 거대규모 상의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양된 지방 조직은 식품 생성물이다.

도 1은 본 개시내용에 따른 배양된 지방 조직의 개략적 표시이다.
도 2는 본 개시내용에 따른 배양된 지방 조직을 제조하는 데에 포함될 수 있는 단계의 흐름도이다.
도 3은 본 개시내용에 따른, 생물반응기를 사용한 배양된 지방 조직 제조 방법의 개략적 표시이다.
도 4는 본 개시내용에 따른, 컨베이어 벨트 상에서 배양된 지방 조직을 제조하는 연속식 공정의 개략적 표시이다.
도 5는 본 개시내용의 실시양태에 따른 3T3-L1 지방생성 분화의 일정이다.
도 6은 본 개시내용에 따른, 회전 벽체 용기 생물반응기를 사용한 배양된 지방 조직 제조 방법의 개략적 표시이다.

더욱 상세하게 본 발명을 기술하기 전에, 본 발명이 기술되는 특정 실시양태로 제한되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어법은 특정 실시양태만을 기술할 목적의 것으로써, 제한하고자 하는 것이 아니라는 것 또한 이해되어야 한다. 본 발명의 영역은 청구범위에 의해서만 제한되게 된다. 본원에서 사용될 때, 단수 형태 "하나"는 문맥상 분명하게 달리 지정되지 않는 한 복수의 실시양태를 포함한다.

관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본 발명의 개념에서 벗어나지 않고도 이미 기술된 것 이외의 많은 추가적인 변형이 가능하다는 것을 알고 있을 것이다. 본 개시내용을 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가장 넓은 가능한 방식으로 해석되어야 한다. "포함하는"이라는 용어의 변형은 비-배제적인 방식으로 요소, 성분 또는 단계를 언급하는 것이며, 그에 따라 언급되는 요소, 성분 또는 단계는 명시적으로 언급되지 않은 다른 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 특정 요소를 "포함하는" 것으로 언급되는 실시양태는 그 요소로 "본질적으로 이루어진 것" 및 "이루어진 것"으로도 고려된다. 특정 값에 대한 2개 이상의 범위가 언급되는 경우, 본 개시내용은 명시적으로 언급되지 않은 해당 범위 상위 및 하위 경계의 모든 조합을 고려한다. 예를 들어, 1 내지 10 사이 또는 2 내지 9 사이의 값에 대한 언급은 1 내지 9 사이 또는 2 내지 10 사이의 값도 고려한다.

본원에서 사용될 때, "지방생성 전구 세포" 또는 "전구-지방세포"는 성숙한 지방 세포로 분화할 수 있는 전구 세포를 지칭한다. "지방생성 전구 세포" 또는 "전구-지방세포"는 본 개시내용 전체에 걸쳐 호환가능하게 사용될 수 있다. 지방생성 전구 세포의 비-제한적인 예에는 줄기 세포 예컨대 다능성 줄기 세포 (PSC), 중간엽 줄기 세포 (MSC), 근육-유래 줄기 세포 (MDSC) 및 지방-유래 줄기 세포 (ADSC) (예컨대 돼지, 소, 인간, 조류 (닭), 어류 등)가 포함된다. 또한, 전환분화된(transdifferentiated) 세포가 이용될 수도 있다. 다른 지방생성 전구 세포에는 분화된 지방 (DFAT) 세포 (예컨대 돼지, 소, 어류 등), 전구지방세포 (예컨대 인간, 소, 조류 (닭), 뮤린, 어류 등) 및 섬유모세포 (예컨대 조류 (닭), 소, 돼지, 뮤린, 어류 등)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "지방 세포(adipose cell)"는 지방 세포(fat cell) 또는 지방세포(adipocyte)이다. "지방 세포(adipose cell)", "지방 세포(fat cell)" 및 "지방세포(adipocyte)"는 본 개시내용 전체에 걸쳐 호환가능하게 사용될 수 있다.

지금부터 도면을 참조하며, 특히 도 1을 참조하면, 배양된 지방 조직 (10)의 개략적 표시를 나타낸다. 배양된 지방 조직 (10)은 세포외 매트릭스 중에 지방 세포 (12) (또는 지방세포 (12))를 포함할 수 있다. 배양된 지방 조직 (10)은 정해진 3-차원 (3D) 형상으로 배열될 수 있으며, 거대규모 상의 크기 (즉 밀리미터 규모 이상)를 가질 수 있다. 단순성을 위하여 도 1에는 정육면체-형 구조를 나타내었지만, 배양된 지방 조직 (10)이 실제로는 어떠한 적합한 3D 형상도 가질 수 있다는 것은 알고 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 배양된 지방 조직 (10)은 소비에 적합한 식품 생성물일 수 있다. 다른 실시양태에서, 배양된 지방 조직 (10)은 소비에 적합한 식품 생성물에 성분으로 도입될 수 있다. 하기에서 추가로 설명할 바와 같이, 배양된 지방 조직 (10)은 대량 또는 대규모 3D 조직을 직접 배양하는 것과 연관된 물질 수송 한계를 극복하는 방법을 사용하여 제조된다.

도 2를 보면, 배양된 지방 조직 (10)을 제조하기 위한 일반적인 대표적 방법을 나타낸다. 첫 번째 블록 (14)에서는, 배양 배지에서 지방생성 전구 세포로부터 지방 세포 (12) (개별 지방 세포 (12), 또는 지방 세포 (12)의 소형 클러스터)의 덩어리가 배양된다. 예를 들면, 블록 (14)는 제1 배양 배지에서 전면생장(confluency)시까지 (또는 표면 상 또는 현탁액 중에서의 목적하는 세포 점유율/수까지) 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것, 및 이후 제2 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포 (12)로 분화시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 제1 배양 배지는 지방생성 전구 세포의 증식을 부양하는 지방생성 유도 배지일 수 있으며, 상기 제2 배양 배지는 많은 수의 지질-충전 지방 세포 (12)를 제공하기 위한 지질 축적 배지일 수 있다. 대안적인 실시양태에서는, 단일 배양 배지가 지방생성 전구 세포의 증식/성장 및 지방생성 전구 세포의 지방 세포로의 분화 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 배양 시간은 지질 수율 및 액적 크기를 조절하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 본 출원인은 더 긴 배양 시간 (약 1개월)이 생체내 지방 (예컨대 닭)과 유사한 액적을 산출한다는 것을 발견하였다. 일부 실시양태에서, 지방 세포 (12)는 더 효율적인 규모 증대를 위하여 그의 성장 및 지질 축적을 향상시키도록 유전자 변형될 수 있다.

지방 세포 (12)가 충분한 지질을 축적하고 목적하는 양의 지방 세포 (12)가 생성된 후에는, 배양이 종료되고, 블록 (16)에 따라 지질-적재 지방 세포 (12)가 수확된다. 일부 실시양태에서, 블록 (16)은 기재로부터 지방 세포 (12)를 탈착시키는 것, 및 지방 세포로부터 비-세포 액체를 배수시키는 것을 포함할 수 있다.

다음 블록 (18)에서는, 수확된 지방 세포 (12)가 목적하는 3D 형상을 가지는 3D 몰드 (예컨대 3D 인쇄된 몰드) 중에서 응집됨으로써, 3D 지방 조직 (10)이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 블록 (18)은 수확된 지방 세포 (12)를 3D 몰드 중 히드로겔 또는 바인더에 매립하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 히드로겔 또는 바인더에는 식품 안전 화합물 예컨대 알기네이트, 셀룰로스, 젤라틴, 전분, 히알루론산, 피브린, 카라기난, 구아 검, 이눌린, 곤약, 귀리 겨, 펙틴, 로커스트 콩 검, 크산탄 검, 대두 단백질, 밀 글루텐, 제인(zein) 단백질, 실크 피브로인, 풀루란, 셀룰로스 유도체 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 히드로겔 또는 바인더는 식품 산업에서 지방 대체제로 사용되는 재료인 알기네이트이다. 예를 들면, 블록 (18)은 3D 몰드 중에서 특정 부피 비로 수확 및 배수된 지방 세포 (12)를 알기네이트 용액과 혼합하는 것을 포함할 수 있다. 일 특정 실시양태에서는, 칼슘 카르보네이트 및 글루코노 델타-락톤 (GDL) 분말을 알기네이트 용액에 첨가하는 것에 의해 저속 젤화 알기네이트 용액이 제조될 수 있으며, 상기 저속 젤화 알기네이트 용액이 3D 인쇄된 몰드 중에서 1:1 부피 비로 수확 및 배수된 지방 조직과 조합될 수 있다 (실시예 3 참조).

일부 측면에서, 블록 (18)은 3D 몰드 중에서 수확된 지방 세포 (12)를 가교시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 가교는 비제한적으로 트랜스글루타미나제, 티로시나제, 퍼옥시다제 및 라카제와 같은 적합한 단백질-단백질 가교 효소를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 수확된 지방 세포를 가교시키는 것은 트랜스글루타미나제를 사용하여 수확된 지방 세포를 효소적으로 가교시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 수확된 지방 세포를 가교시키는 것은 3D 몰드 중에서 특정 부피 비로 트랜스글루타미나제의 용액을 수확된 지방 세포와 혼합하는 것을 포함할 수 있다 (실시예 3 참조). 블록 (18)은 또한 가교 동안 헬퍼 단백질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 헬퍼 단백질은 카세인 및 젤라틴에서 선택될 수 있다. 산과 아민 기 사이의 EDC-NHS 반응과 같이 반응물 또는 촉매가 식품 안전성인 경우에는, 화학적 가교가 사용될 수도 있다. 감광제가 식품 안전성인 경우, 광화학적 가교 또한 이용될 수 있다.

대안적으로는, 비제한적으로 알데히드 기에 의해 관능화된 중합체, 제니핀, 페놀계 화합물 및 이들의 조합과 같은 다른 유형의 고정, 포획 또는 가교 작용제가 지방 세포 응집에 사용될 수 있다. 알데히드 기에 의해 관능화된 적합한 중합체에는 페리오데이트 산화된 펙틴, 덱스트란, 키토산, 아라비아 검, 수크로스, 라피노스, 스타키오스, 시클로덱스트린 및 전분이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 페놀계 화합물에는 카페산, 클로로젠산, 카프타르산, 퀘르세틴, 그리고 포도 및 커피와 같은 식물로부터 유래하는 루틴이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

지방 세포 (12) 또는 지방 조직 (10)은 배양된 지방 조직 (10)의 감각적 특징 (예컨대 질감, 색상 및 향미) 및/또는 영양 상의 특질을 조정하기 위하여 다양한 단계에 보충될 수 있다. 예를 들면, 비제한적으로 향미제, 착색제, 질감부여제, 비타민, 무기질, 아미노산, 단백질/펩티드 및 지방산과 같은 첨가제를 사용한 보충이 본 개시내용에 의해 포괄되기도 한다. 일부 실시양태에서는, 지방 영양 및 건강의 조정가능한 조절이 실행될 수 있다. 배양된 지방 조직의 지방산 조성은 세포 섭식 전략을 통하여, 예컨대 시험관내 배양 동안 배양 배지에 지방산을 보충하는 것에 의해 설계될 수 있다. 유전학적 개재 역시 배양된 지방 조직 (10)의 영양을 보강하는 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서는, 오메가 3 데새츄라제가 발현될 수 있거나, 또는 지방 세포 (12)에서 친지질성 영양소 (예컨대 베타 카로텐, 비타민 A)를 생성시키는 경로가 활성화될 수 있다. 이는 소비자에게 유익할 수 있는데, 어떤 영양소는 미세영양소 보충제 대비 식품 중에서 소비될 때 더 생체이용성이기 때문이다. 또한, 배양된 지방의 질감은 히드로겔/바인더 (예컨대 알기네이트) 농도, 가교제 수준, 그리고 가교 동안의 헬퍼 단백질 (예컨대 카세인, 젤라틴 등)의 포함과 같은 변수를 기준으로 조정될 수 있다. 일 실시양태에서, 배양된 지방 세포 (12)에는 배양된 지방 세포 (12)에 "양고기" 향미를 부여하기 위하여 메틸화된 분지형 지방산이 보충될 수 있다. 또한, 상대적 세포외 매트릭스 생성 및 지방 생성 수준은 목적하는 질감, 풍미 및/또는 영양 상의 결과를 고려하여 최적화될 수 있다.

도 3은 배양된 지방 조직 (10)의 대량 제조를 위한 규모화가능한 방법을 나타낸다. 상기 방법은 교반 현탁 탱크 생물반응기 (22) (상부) 또는 중공 섬유 멤브레인 (26)을 포함하는 중공 섬유 생물반응기 (24) (저부)와 같은 생물반응기 (20)에서 수행될 수 있다. 비제한적으로 회전 벽체 용기 생물반응기 (RWVB), 고정상 생물반응기 및 충진상 생물반응기와 같은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 자명한 다른 유형의 생물반응기가 사용될 수도 있으며, 본 개시내용의 영역에 포함된다. 도 6을 참조하면, RWVB를 사용하는 한 가지 예시적인 배열이 도시되어 있다. 생물반응기 (20)에서의 지방 조직 (10)의 제조는 생물반응기 (20) 중 제1 배양 배지 (30) (지방생성 유도 배지)에 지방생성 전구 세포 (32)를 시딩하는 것 (28)을 포함할 수 있다. 지방생성 전구 세포 (32)는 이후 생물반응기 (20)에서 전면생장시까지 (또는 표면 상 또는 현탁액 중에서의 목적하는 세포 점유율/수까지) 증식될 수 있다 (34). 일부 실시양태에서, 지방생성 전구 세포 (32)는 그것이 증식하면서 소형 응집물 또는 회전타원체 (36)를 형성할 수 있다 (도 3 상부 참조). 회전타원체 (36)는 단일 지방생성 전구 세포 (32)로 해리되어 (38) 추가로 증식이 허용될 수 있다 (34) (도 3 상부 참조). 중공 섬유 반응기 (24)에서는, 지방생성 전구 세포 (32)가 중공 섬유 멤브레인 (26)의 표면 상에서 증식될 수 있다 (도 4 저부 참조). 이와 같은 경우, 지방생성 전구 세포 (32)는 중공 섬유 멤브레인 (26)으로부터 탈착될 수 있으며(40), 탈착된 지방생성 전구 세포 (32)는 추가적인 증식 (34)을 위하여 배지 (30)를 재-시딩하는 데에 사용될 수 있다.

제1 배양 배지 (30)가 제2 배양 배지 (42) (지질 축적 배지)로 교체되면, 세포는 지질을 축적하고 지방 세포 (12)로 분화될 수 있다 (44). 지방 세포 (12)는 분리되어, 또는 소형 클러스터(46)로서 성장될 수 있다 (도 3 상부 참조). 중공 섬유 생물반응기 (24)에서는, 지방 세포 (12)가 중공 섬유 멤브레인 (26)의 표면 상에서 발생될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 증식 (34) 및 분화 (44) 둘 다를 위해 단일 배양 배지가 사용될 수 있다. 지방 세포 (12)가 성장되고 충분한 지질이 축적된 후, 지방 세포 (12)는 수확될 수 있다 (48). 중공 섬유 생물반응기 (24)에서, 수확하는 것은 중공 섬유 멤브레인 (26)으로부터 지방 세포 (12)를 탈착시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서는, 중공 섬유 멤브레인 (26)이 식용이어서, 탈착의 필요성이 생략될 수 있다. 수확된 지방 세포 (12)는 이후 3D 몰드 중에서 응집됨으로써 (50), 배양된 지방 조직 (10)을 제공할 수 있다. 상기에서 설명된 바와 같이, 지방 세포 (12)를 결합시키고 응집시키는 (50) 데에 적합한 방법에는 가교시키는 것 (예컨대 트랜스글루타미나제로의 효소적 가교)은 물론, 알기네이트와 같은 히드로겔에 지방 세포 (12)를 매립하는 것이 포함된다.

본 개시내용의 배양 방법은 2차원 (2D) 배양 전략과 상용성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방 세포 (12)는 배양 플레이트와 같은 2D 기재 상의 박층에서 배양된 다음, 상기한 절차에 따라 3D 지방 조직 (10)으로 응집될 수 있다. 예를 들면, 지방생성 전구 세포 (32)가 전면생장시까지 (또는 표면 상 또는 현탁액 중에서의 목적하는 세포 점유율/수까지) 성장된 후, 2D 기재 상에서 지방 세포 (12)로 분화될 수 있다. 2D 기재로부터의 지방 세포 (12)의 수확 또는 수집 후 이어지는 수확된 지방 세포 (12)의 응집은 배양된 지방 조직 (10)을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2D 기재는 식용이어서 최종 식품 생성물에 통합될 수 있으며, 그에 따라 지방 세포 (12)는 2D 기재로부터 탈착될 필요가 없다.

배양된 지방 조직 (10)의 대량 제조를 위한 연속식 조립 라인-형 공정에서, 상기 2D 기재는 컨베이어 벨트 (52)일 수 있다 (도 4 참조). 연속식 제조 공정은 그 위에 배양 배지를 포함하는 컨베이어 벨트 (52) 상에 지방생성 전구 세포 (32)를 시딩하는 것 (54)을 포함할 수 있다. 지방생성 전구 세포 (32)는 이후 컨베이어 벨트 (52) 상에서 전면생장시까지 (또는 표면 상 또는 현탁액 중에서의 목적하는 세포 점유율/수까지) 증식될 수 있다 (56). 지질 축적 배지로 배양 배지를 교체하는 것은 지방생성 전구 세포 (32)가 지질을 축적하고 지방 세포 (12)로 분화하는 것 (58)을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로는, 단일 배양 배지가 증식 (56) 및 분화 (58) 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 지방 세포 (12)는 컨베이어 벨트 (52)로부터의 탈착에 의해 수확된 다음 (60), 상기한 절차에 따라 응집됨으로써 (62), 배양된 지방 조직 (10)을 제공할 수 있다.

본원에서 개시되는 기술은 배양된 지방 생성에 대한 신규하고 규모화가능한 접근법을 제공한다. 본 개시내용은 대-규모 세포 증식 및 규모 증대 기술을 활용하여 필요한 양의 시험관내 지방 세포를 생성시키는데, 이후 세포는 응집되거나, 또는 거대규모로 고체 3D 구축물에 충진된다. 지방 세포는 배양 배지에의 접근이 용이한 박층 (2D 배양) 또는 생물반응기에서 배양된 후 이어서 충분한 지방세포 성숙 후 거대규모 3D 조직으로 응집된다. 지방세포 또는 지방세포 클러스터의 응집은 감각적인 관점에서 자연 지방 조직을 재현하는데, 생체내의 지방 조직이 대부분 성긴 세포외 매트릭스를 동반하는 지질 충전된 지방세포의 조밀한 응집물이기 때문이다. 또한, 2D 배양 전략을 사용한 지방 조직 제조 방법의 상용성은 컨베이어 벨트 조립 라인 접근법을 사용한 연속식 제조 공정을 가능하게 한다.

또한, 본 개시내용의 방법은 대형 3D 조직을 직접 배양하거나 조작하는 것과 연관된 물질 수송 한계를 극복하는 방식으로 대량 배양된 지방 조직을 산출한다. 세포 배양 종료시의 응집은 혈관화 또는 정교한 조직 관류 시스템을 통한 지방 세포에의 영양소 전달에 대한 필요성을 제거한다. 이는 식품 적용분야의 경우 일단 최종 식용 조직으로 형성되고 나면 배양된 지방 세포가 살아있도록 유지될 필요가 없기 때문이다. 이는 도살 후에는 근육 및 지방 세포가 점차적으로 생존하기를 중단하는 통상적인 축산업에서의 고기 제조와 유사하다. 반면, 의학 적용분야의 경우에는, 신체에의 이식 또는 시험관내 조직 모델에서의 시험에 사용되도록 3D 조직 중 세포가 생존 유지될 것으로 기대될 수 있다. 이에 따르면, 본 개시내용의 지방 조직 제조 방법은 세포 성장 동안 영양소를 분배하는 복잡한 관류 및 혼합 시스템에 의존하는 다른 방법에 비해 비용이 덜 든다.

본 개시내용의 방법에 따르면, 지방세포 및 전구-지방세포의 단일배양이 지원 세포 유형에 대한 필요성 없이도 대형 지방 액적의 제조에 충분할 수 있다. 표준 세포 배양 조건이면 본 개시내용에서 개괄되는 유형의 지방세포 배양에 충분하며, 목적하는 지방세포 성장 및 발생을 달성하기 위한 조직 배양 플라스틱 상의 특별한 코팅은 필요하지 않다. 또한, 다양한 가축 종의 전구-지방세포 및 지방세포가 본 개시내용에 따른 무-혈청 배양 배지에서 성장될 수 있어서, 시험관내 지방 배양에 있어서의 주요 장애를 제거한다. 이러한 장점은 제조 비용을 감소시키는 데에도 도움이 된다. 강화된 지방 산출을 위하여, 예컨대 지방 생성물의 품질을 증가시키거나 질감 및 조성을 변경하기 위한 배양물 중에서의 섬유모세포 또는 근육 세포의 사용과 같은 공동-배양 역시 고려될 수 있다.

본 출원인은 배양된 지방세포의 대형 하위군집이 조직 배양 플레이트에 강하게 부착하여 부상 분리되지 않음으로써, 지방세포가 지방이 될 때 부력이 증가되는 것으로 인한 시험관내에서의 부착성 지방세포의 부상 문제를 방지한다는 것도 발견하였다. 본원에서 개시되는 2D 배양 시스템은 부착성 세포 군집용으로 자체-분류한다.

[실시예]

실시예 1: 3T3-L1 지방생성 분화 일정

도 5는 3T3-L1 지방생성 세포의 분화 일정을 나타낸다. 0일차 (d0), 2일차 (d2), 15일차 (d15) 및 30일차 (d30)를 일정에 표시하였다. 전면생장 전구-지방세포를 처음 2일 동안 지방생성 유도 배지에서 성장시킨 다음, 15일차의 배양된 지방 조직 형성을 위한 수확시까지 지질 축적 배지로 교체하였다 (실시예 2 참조). 더 긴-기간 배양 동안의 지질 축적을 분석하기 위하여, 지질 축적 배지에서 30일 동안 추가적인 샘플을 성장시켰다.

실시예 2: 지질-적재 지방세포의 수확 및 3D 배양된 지방 구축물의 형성

지질 축적 후, 세포 스크레이퍼(scraper)를 사용하여 지질-충전된 지방세포를 탈착시켰다. 다음에, 0.22 마이크로미터 진공 필터를 사용하여 지방세포로부터 비-세포 액체를 배수시켰다. 탈착 및 배수 후 (탈착 전에 세포로부터 액체를 배수시킴으로써 일단 탈착된 후의 결과가 미처리 지방세포 슬러리가 되도록 하는 것이 가능하다는 것을 알아야 함), 이어서 시험관내 지방세포를 트랜스글루타미나제 또는 알기네이트와 조합함으로써, 3D 인쇄된 몰드 중에 별도의 거대규모 조직으로 형성시켰다. 마지막으로, 3D 배양된 지방 구축물을 압축 강도에 대하여 기계적으로 시험하고, 지질을 형광 염색하였으며, 휘발성 화합물에 대하여 분석하였다.

실시예 3: 알기네이트 또는 트랜스글루타미나제를 사용한 3D 배양된 지방의 생성 방법

알기네이트 응집. 1.6 % 또는 3.2 % 알기네이트 용액에 칼슘 카르보네이트 및 글루코노 델타-락톤 (GDL) 분말을 첨가함으로써 저속-젤화 알기네이트 용액을 제조한 후, 3D 인쇄된 몰드 중에서 1:1 부피 비로 수확 및 배수된 시험관내 지방 조직과 조합하였다.

트랜스글루타미나제 응집. 3D 인쇄된 몰드 중에서 2:8 부피 비로 트랜스글루타미나제의 15 % 용액을 배수된 지방 조직과 혼합하는 것에 의해 배양된 지방을 제조하였다.

Claims

제1 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것;
제2 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것;
지방 세포를 수확하는 것; 및
수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것
을 포함하는, 배양된 지방 조직의 제조 방법.
제1항에 있어서, 제1 배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것이 제1 배양 배지를 함유하는 생물반응기에 지방생성 전구 세포를 시딩하는 것, 및 생물반응기에서 지방생성 전구 세포를 증식시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것이 생물반응기에서 제1 배양 배지를 제2 배양 배지로 교체하는 것을 포함하는 것인 방법.
배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것;
배양 배지에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것;
지방 세포를 수확하는 것; 및
수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것
을 포함하는, 배양된 지방 조직의 제조 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 생물반응기에서 수행되는 방법.
제2항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 교반 현탁 탱크 생물반응기인 방법.
제2항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 회전 벽체 용기 생물반응기인 방법.
제2항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기가 중공 섬유 생물반응기인 방법.
2-차원 (2D) 기재 상에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것;
2D 기재 상에서 지방생성 전구 세포를 지방 세포로 분화시키는 것;
지방 세포를 수확하는 것; 및
수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것
을 포함하는, 배양된 지방 조직의 제조 방법.
제9항에 있어서, 2D 기재 상에서 지방생성 전구 세포를 성장시키는 것이 2D 기재 상에 지방생성 전구 세포를 시딩하는 것, 및 2D 기재 상에서 지방생성 전구 세포를 증식시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 2D 기재가 컨베이어 벨트의 적어도 일부를 형성하는 것인 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조립 라인 공정에서 연속식으로 수행되는 방법.
배양 배지에서 지방생성 전구 세포로부터 지방 세포를 배양하는 것;
목적하는 양의 지방 세포가 생성된 후 지방 세포를 수확하는 것; 및
수확된 지방 세포를 응집시켜 배양된 지방 조직을 제공하는 것
을 포함하는, 배양된 지방 조직의 제조 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 지방생성 전구 세포가 다능성 줄기 세포인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 지방생성 전구 세포가 중간엽 줄기 세포인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 지방 세포를 응집시키는 것이 3D 몰드 중에서 수확된 지방 세포를 히드로겔 또는 바인더와 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 히드로겔 또는 바인더가 알기네이트, 셀룰로스, 젤라틴, 전분, 히알루론산, 피브린, 카라기난, 구아 검, 이눌린, 곤약, 귀리 겨, 펙틴, 로커스트 콩 검, 크산탄 검, 대두 단백질, 밀 글루텐, 제인 단백질, 실크 단백질, 셀룰로스 유도체, 풀루란 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 지방 세포를 응집시키는 것이 수확된 지방 세포를 알기네이트와 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 수확된 지방 세포를 알기네이트와 혼합하는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
칼슘 카르보네이트 및 글루코노 델타-락톤을 알기네이트의 용액에 첨가하는 것; 및
3D 몰드 중에서 수확된 지방 세포를 알기네이트의 용액과 합하는 것.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 지방 세포를 응집시키는 것이 3D 몰드 중에서 수확된 지방 세포를 가교시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 수확된 지방 세포를 가교시키는 것이 트랜스글루타미나제, 티로시나제, 퍼옥시다제 및 라카제로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 사용하여 수확된 지방 세포를 가교시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 3D 몰드 중에서 수확된 지방 세포를 가교시키는 것이 트랜스글루타미나제를 사용하여 수확된 지방 세포를 효소적으로 가교시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 트랜스글루타미나제로 수확된 지방 세포를 가교시키는 것이 3D 몰드 중에서 미리결정된 부피 비로 트랜스글루타미나제의 용액을 수확된 지방 세포와 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 수확된 지방 세포를 가교시키는 것이 알데히드 기에 의해 관능화된 중합체, 제니핀 및 페놀계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 가교제를 사용하여 수확된 지방 세포를 가교시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 알데히드 기에 의해 관능화된 중합체가 페리오데이트 산화된 펙틴, 덱스트란, 키토산, 아라비아 검, 수크로스, 라피노스, 스타키오스, 시클로덱스트린 및 전분으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제24항에 있어서, 페놀계 화합물이 카페산, 클로로젠산, 카프타르산, 퀘르세틴 및 루틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 지방 세포를 응집시키는 것이 응집 동안 단백질을 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 단백질이 카세인 및 젤라틴에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 세포를 수확한 후 및 수확된 지방 세포를 응집시키기 전에 지방 세포를 배수시킴으로써 비-세포 액체를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 지방 조직이 거대규모 상의 크기를 가지는 것인 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 지방 조직이 정해진 3D 형상을 가지는 것인 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 세포에 메틸화된 분지형 지방산을 보충하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 세포가 오메가 3 데새츄라제를 발현하는 것인 방법.
히드로겔 또는 바인더에 매립되어 있는 지방 세포를 포함하며 3-차원 (3D) 형상 및 거대규모 상의 크기를 가지는 배양된 지방 조직.
제34항에 있어서, 히드로겔 또는 바인더가 알기네이트, 셀룰로스, 젤라틴, 전분, 히알루론산, 피브린, 카라기난, 셀룰로스, 구아 검, 이눌린, 곤약, 귀리 겨, 펙틴, 로커스트 콩 검, 크산탄 검, 대두 단백질, 밀 글루텐, 제인 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 배양된 지방 조직.
제34항 또는 제35항에 있어서, 대량의 지방 세포가 알기네이트로 가교되는 것인 배양된 지방 조직.
함께 가교된 지방 세포를 포함하며 3-차원 (3D) 형상 및 거대규모 상의 크기를 가지는 배양된 지방 조직.
제37항에 있어서, 지방 세포가 트랜스글루타미나제, 티로시나제, 퍼옥시다제 및 라카제로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 사용하여 가교되는 것인 배양된 지방 조직.
제37항에 있어서, 지방 세포가 트랜스글루타미나제로 가교되는 것인 배양된 지방 조직.
제37항에 있어서, 지방 세포가 알데히드 기에 의해 관능화된 중합체, 제니핀 및 페놀계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 가교제로 가교되는 것인 배양된 지방 조직.
제40항에 있어서, 알데히드 기에 의해 관능화된 중합체가 페리오데이트 산화된 펙틴, 덱스트란, 키토산, 아라비아 검, 수크로스, 라피노스, 스타키오스, 시클로덱스트린 및 전분으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 배양된 지방 조직.
제40항에 있어서, 페놀계 화합물이 카페산, 클로로젠산, 카프타르산, 퀘르세틴 및 루틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 배양된 지방 조직.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 지방 조직이 식품 생성물인 방법 또는 배양된 지방 조직.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 지방 조직이 식품 생성물의 성분인 방법 또는 배양된 지방 조직.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 조직의 1종 이상 성분이 식품 생성물 중 성분인 방법 또는 배양된 지방 조직.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 배양된 지방 조직이 혈관화 또는 관류 없이 제조되는 것인 방법 또는 배양된 지방 조직.