KR20240037315A - 심층 필터 매체 - Google Patents

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KR20240037315A
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악셀 델프
미카엘 슐테
존 폴 아마라
달시 엘 첸
마이클 제임스 수시엔카
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메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 치료용 생체분자를 함유하는 세포 배양물 유래 공급 스트림의 수확물 정화를 위한 심층 여과 매체에 관한 것이다. 상기 심층 여과 매체는 중합체성 흡착제와 열가소성 바인더의 소결된 혼합물로 구성되며, 초-저의 추출성 물질을 보유하고 있어서 사용 전의 사전-플러싱을 필요로 하지 않는다. 또한, 소결된 심층 필터 매체에 사용되는 구성 재료는 감마 방사선에 대하여 높은 안정성을 나타냄으로써, 감마-기반 사용-전 멸균 공정과 상용성이다.

Description

심층 필터 매체
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 2021년 8월 27일자 U.S. 특허 임시 출원 제63/237,680호의 우선권 혜택을 주장하는 바, 그의 전체 내용이 전체적으로 의거 참조로서 개재된다.
포유동물 세포 배양물 현탁액으로부터 치료용 생물학적 생성물을 단리하고 정제하기 위하여, 현행 생물약제 제조 공정들은 일련의 여과 및 크로마토그래피 정제 단계들을 사용한다. 그러한 치료용 생물학적 생성물에는 특히 단일클론 항체, 효소, 항체 단편, 단백질, 융합 단백질이 포함될 수 있다. 치료용 생물학적 생성물의 단리 및 정제에 사용되는 상기 일련의 여과 및 크로마토그래피 정제 단계들은 보통 하류 정제 공정 (DSP)으로 지칭된다. DSP의 첫 번째 단계는 종종 치료용 생물학적 생성물을 함유하는 공급 스트림으로부터 전세포, 세포 잔사 및 콜로이드성 물질을 제거하고자 하는 정화 단계이다. DSP에서 사용되는 정화 단계에는 원심분리, 미세여과 (접선 유동 여과 또는 표준 유동 여과 중 어느 하나에 의함), 또는 더 최근에는 심층 여과(depth filtration)가 포함될 수 있다.
DSP 정화 공정에서 사용되는 통상적인 심층 필터는 종종 셀룰로스, 규조토 및 습윤-강도 바인더 수지(wet-strength binder resin)의 습윤-레이드(wet-laid) 혼합물을 기재로 한다. DSP 정화 공정에서 사용되는 다른 통상적인 심층 필터들은 합성 섬유, 실리카 겔 필터 조제 및 습윤-강도 바인더 수지의 습윤-레이드 혼합물을 기재로 한다. 상기한 유형의 심층 필터들은 응결 또는 다른 수단에 의한 예비-처리된 세포 배양물 공급 스트림의 정화용으로, 또는 전세포 및 세포 잔사의 제거용으로 예정되는 합성 부직 섬유 층들을 포함할 수도 있다. 이와 같은 유형의 통상적인 심층 필터의 선택 예로는 모두 EMD 밀리포어 코포레이션(EMD Millipore Corporation) 사 (매사추세츠 벌링턴 소재)로부터 시중에서 구입가능한 밀리스탁(MILLISTAK)+®, 밀리스탁+® HC, 밀리스탁+® HC 프로(Pro), 또는 클라리솔브(CLARISOLVE)® 심층 필터가 포함된다.
습윤-레이드 제조 공정에 의해 제조되는 통상적인 심층 필터들은 통상적으로 유기 및 무기 추출성 물질들을 감소시키기 위하여 고순도수를 사용한 광범위한 사용-전 플러싱을 필요로 한다.
상기 유기 및 무기 추출성 물질들의 다양한 공급원이 존재하는데, 이들은 통상적으로 습윤-레이드 제조 공정 동안 심층 필터 매체로 도입된다. 셀룰로스 및 규조토와 같은 자연-유래 구성 재료 역시 특정 유기 및 무기 추출성 물질 성분의 공급원이 될 가능성이 있다. DSP 공정에서, 심층 필터 추출성 물질은 치료용 생물학적 생성물을 함유하는 공급 스트림을 오염시킬 수 있기 때문에, 이러한 추출성 물질들은 DSP 여과 공정에서 사용하기 전에 심층 필터로부터 제거되어야 한다.
야보르스키(Yavorsky) (U.S. 특허 제7,673,757호; '757호 특허)는 공정액으로부터의 생물학적 오염물의 제거를 위한 필터 매체에 대해 개시하고 있다. 야보르스키의 필터는 수-불용성 열가소성 바인더와 융합된 흡착제 재료로 구성된다. 야보르스키의 필터는 셀룰로스 함유 필터와 비교하였을 때 사용 전에 사전플러싱을 사용한 제거를 필요로 하는 외인성 오염물 (총 유기 탄소: TOC)이 감소되어 있는 것으로 기술되고 있다. 그러나, 본 발명자들은 '757호 특허의 필터가 여전히 사전플러싱을 필요로 하는 허용되지 않는 높은 수준의 유기 및 무기 오염물을 포함하며, 또한 생물공정 분야에서 필요로 하는 필터 멸균에 사용되는 감마 조사에 대하여 필수적인 안정성을 가지고 있지 않을 수 있다는 것을 발견하였다.
DSP 여과 및 정화 적용분야를 위한 감소된 추출성 물질을 보유하는 개선된 심층 여과 매체에 대한 현존하는 필요성이 존재한다. 또한, 감마 조사-기반 필터 멸균 공정과 상용성인 개선된 심층 여과 매체에 대한 현존하는 필요성이 존재한다.
[발명의 개요]
본원에서, 본 발명자들은 폴리에틸렌 바인더와 고도 표면적 합성 필터 조제의 열적으로 융합된 혼합물을 포함하는 신규하고 비-자명성인 완전-합성 심층 여과 매체의 개발에 대해 보고한다. 본 발명의 완전-합성 심층 여과 매체는 선행 기술 심층 필터에 비해 상당히 감소된 유기 및 무기 추출성 물질을 나타낸다. 본 발명의 완전-합성 심층 여과 매체는 폴리에틸렌 바인더를 고도 표면적 합성 필터 조제에 융합시키기 위한 열 공정에 의해 제조된다. 이와 같은 공정은 바인더 및 고도 표면적 필터 조제를 함유하는 강력한 필터 시트를 형성시키며, 습윤-레이드 필터 매체 제조 공정에 대한 필요성을 제거한다. 습윤-레이드 필터 제조 공정은 통상적인 심층 여과 매체에서 증가된 유기 및 무기 추출성 물질의 공급원이 될 가능성이 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 습윤-레이드 필터 제조 공정은 본 발명의 필터를 제조하는 수단으로서 특별히 배제된다. 또한, 본 발명에서 사용되는 열 공정은 통상적인 심층 여과 매체에서 현재 사용되고 있는 습윤-강도 바인더 수지에 대한 필요성도 제거한다. 습윤-강도 바인더 수지는 통상적인 심층 여과 매체에서의 증가된 유기 추출성 물질의 또 다른 가능성 있는 공급원이다. 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 심층 필터 매체에서의 습윤-강도 바인더 수지의 사용은 본 발명 심층 필터의 실시양태 또는 측면으로서 특별히 배제된다.
중요한 것은 본 발명의 신규 심층 매체가 멸균에 사용되는 감마 조사에의 노출 후에도 감소된 유기 및 무기 오염을 제공한다는 것이다. 이는 감마 조사 후 증가된 양의 오염물을 "배출"함으로써 사전-플러싱 시간 및 물 부피의 추가적인 증가를 필요로 하는 선행 기술 필터 매체와 분명히 대조되는 것이다.
본 발명 심층 여과 매체의 구성에 사용되는 고도 표면적 필터 조제는 정전기 및 소수성 상호작용을 포함한 흡착 메커니즘에 의해 전세포, 마이크로미터이하 입자, 콜로이드성 물질, 가용성 불순물 (HCP 및 DNA) 및 세포 잔사를 제거하는 기능을 한다. 그와 같은 종들은 달리는 입자 체질에 의해 포획될 수 없다. 이러한 목적을 위한 필터 조제를 포함하는 심층 필터의 사용에 대해서는 이전에 보고된 바 있다 (문헌 [Nguyen, et al., Biotechnol. J. 2018, 1700771]).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 합성 흡착제는 폴리스티렌이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 적합한 폴리스티렌의 예에는 하기 중 1종 이상이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: PrAOH (디비닐벤젠과 가교결합된 폴리스티렌: 음이온, 히드록시드 형태; 퓨롤라이트(Purolite) Corp. 사, 펜실베이니아 킹 오브 프루씨아 소재), PrCH (디비닐벤젠과 가교결합된 폴리스티렌: 양이온, 수소 형태; 퓨롤라이트 Corp. 사, 펜실베이니아 킹 오브 프루씨아 소재), MB1/1h (디비닐벤젠과 가교결합된 폴리스티렌: 양이온/음이온 수소 형태; 퓨롤라이트 Corp. 사, 펜실베이니아 킹 오브 프루씨아 소재), 폴리스티렌 흡착제 (메다포어(Medapore) P787 (>63 μm), 머크(Merck) KGAa 사, 독일 다름슈타트 소재), 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠) (밀리포어시그마(MilliporeSigma) 사, 매사추세츠 벌링턴 소재), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠) (밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재). 추가적인 흡착제에는 앰버라이트(Amberlite)™, 앰버라이트™ XAD™ 및 앰버크롬(AmberChrom)™ 이온 교환 수지 (듀퐁(DuPont) 사, 델라웨어 윌밍턴 소재)와 같은 이온 교환 수지들이 포함될 수 있다. 본 발명에 적합한 고도 표면적 필터 조제에는 또한 특히 모두 EMD 밀리포어 사 (매사추세츠 벌링턴 소재)로부터 구입가능한 에쉬무노(ESHMUNO)® 이온 교환 크로마토그래피 수지 및 프락토겔(FRACTOGEL)® 이온 교환 크로마토그래피 수지를 포함한 다양한 크로마토그래피 수지들 중 1종 이상이 포함될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 심층 필터 매체 시트 형성에서 사용되는 소결 공정에서 생존하기 위하여 필터 조제가 충분한 열 안정성을 나타낸다는 것을 전제로 하여 적합한 합성 고도 표면적 필터 조제가 선택될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 단독 또는 조합으로서의 규조토, 실리카, 다공성 유리, 제올라이트, 활성탄, 비-합성 크로마토그래피 매체 및 셀룰로스-기재 재료는 본 발명 심층 필터의 실시양태 또는 측면으로서 특별히 배제된다.
본 발명의 완전-합성 심층 여과 매체는 또한 감마 방사선에 대하여 고도의 안정성을 나타내는 구성 재료로 구성된다. 결과적으로, 본 발명의 완전-합성 심층 여과 매체는 하류 정제 공정 (DSP) 정화 적용분야에서 심층 여과 성능에 대한 어떠한 부정적인 영향도 없이 감마 방사선 또는 다른 방사선 멸균 양태 예컨대 X-선 및 전자 빔에 의해 멸균될 수 있다. 또한, 선행 기술 필터 매체와 달리, 본 발명 완전-합성 심층 여과 매체 구성 재료의 높은 감마 안정성은 감마 조사에 의한 멸균 후에도 매우 낮은 유기 및 무기 추출성 물질을 제공한다.
이에 따라, 본 발명의 모든 합성 심층 필터는 감마 조사 후에도 유기 및 무기 추출성 물질이 사실상 없는 심층 필터를 제공하며, 사용 전의 사전-플러싱을 매우 적게 필요로 하거나 필요로 하지 않는다. 셀룰로스 및 폴리아크릴 섬유와 같은 통상적인 심층 여과 매체에서 사용되는 중합체성 재료가 감마선, X-선 및 전자 빔과 같은 이온화 방사선 공급원의 존재하에서 결합 파열을 경험할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 그러한 분자 변화는 종종 사슬 절단, 재조합 및/또는 가교을 초래하며, 그것은 원래 재료의 기계적 및/또는 화학적 특성을 변경시켜 그것이 외인성인 추출성 물질처럼 공정액으로 "배출"되도록 할 수 있다. 감마 방사선의 멸균 선량에 대한 다양한 중합체들의 상용성은 이미 평가되어 있다. 문헌 [Kawamura, Y. "Effects of Gamma Irradiation on Polyethylene, Polypropylene, and Polystyrene" In: Irradiation of Food and Packaging. Chapter 16 ACS Symposium Series. American Chemical Society, Washington, D.C., 2004; 262-276]을 참조하라. 본 발명의 또 다른 측면에서는, 여과용으로 예정된 물 또는 용액을 사용하여 필터 매체가 들어있는 여과 장치를 충전하는 것 이외에는 사용 전의 사전-플러싱을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 또 다른 측면에서는, 본 발명의 실시양태로서, 필터를 습윤화하는 데에 충분한 액체 이외에는 본 발명의 심층 필터를 사전-플러싱하는 것이 특별히 배제된다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 폴리에틸렌 바인더의 열적으로 융합된 혼합물을 포함하는 소결된 심층 필터 매체, 및 b) PrAOH, PrCH, MB1/1h, 폴리스티렌 흡착제, 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 흡착제를 포함하는 심층 필터를 고려한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 심층 필터 매체가 상당히 균질한 것을 고려한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 심층 필터가 약 1 mm - 약 4 mm 두께 또는 약 2 mm - 약 3 mm 두께인 것을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 습윤-강도 바인더 수지가 특별히 배제되는 것을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:10 내지 약 10:1; 약 1:5 내지 약 5:1; 약 1:2 내지 약 2:1이거나; 또는 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:1인 것을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 폴리스티렌 흡착제의 크기가 직경 약 10 μm 내지 약 120 μm; 직경 약 30 μm 내지 100 μm; 직경 약 50 μm 내지 80 μm; 직경 약 60 μm 내지 70 μm이거나, 또는 직경 약 63 μm인 것을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리에틸렌 바인더를 PrAOH, PrCH, MB1/1h, 폴리스티렌 흡착제, 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)으로 이루어진 군으로부터 선택된 흡착제와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 실질적으로 균일한 두께로 스프레딩(spreading)하고, 상기 혼합물을 약 165℃에서 약 60분 동안 가열하는 것을 포함하는, 소결된 심층 필터 매체를 제조하는 방법을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 소결된 심층 필터 매체를 포함하는 심층 필터를 제공하는 단계로서, 상기 심층 필터 매체는 폴리에틸렌 바인더를, PrAOH, PrCH, MB1/1h, 폴리스티렌 흡착제, 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)으로 이루어진 군으로부터 선택된 흡착제와 함께 포함하는 것인 단계; b) 표적 단백질이 심층 필터를 통과하여 투과물 중에 보유되고 오염물은 심층 필터에 의해 흡착되도록 심층 필터를 공급 스트림과 접촉시켜, 투과물 중의 오염물에 대한 표적 단백질의 농도가 공급 스트림 중에서의 비와 비교하였을 때 적어도 20%만큼 증가되도록 하는 것인 단계를 포함하는, 표적 단백질을 함유하는 공급 스트림을 정화하는 방법을 고려한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 투과물 중의 오염물에 대한 표적 단백질의 상기 농도가 공급 스트림 중에서의 비와 비교하였을 때 적어도 50%만큼 증가되는 것을 고려한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 투과물 중의 오염물에 대한 표적 단백질의 농도가 공급 스트림 중에서의 비와 비교하였을 때 적어도 100%만큼 증가되는 것을 고려한다.
도 1은 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 사진을 나타낸다. 상기 소결된 심층 필터 매체는 실시예 3의 실시예 ID 3-2에서 기술된 바와 같이 제조된 것이다. 비교를 위하여, 셀룰로스-기재 표준 샘플인 밀리스탁+® CE25 필터 매체 (밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)의 사진을 나타내었다.
도 2 (A-D)는 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 단면 SEM 현미경사진을 나타낸다. 상기 소결된 심층 필터 매체는 실시예 3의 실시예 ID 3-2에서 기술된 바와 같이 제조된 것이다. 상기 SEM 현미경사진은 100x (A & B) 및 500x (C & D) 배율로 제공되었다. SEM 현미경사진은 대형인 > 63 μm의 폴리스틸렌 비드가 훨씬 더 작은 융합된 폴리에틸렌 입자에 의해 포획된다는 것을 보여준다.
도 3은 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 단일 층이 들어 있으며 실시예 3에서 기술된 바와 같은 23 cm2 미니캡 필터 장치에서의 TOC 플러싱 아웃 곡선(flush out curve)을 나타낸다.
도 4는 감마 조사-전 및 -후의 실시예 3에서 기술된 바와 같은 각각 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 단일 층이 들어 있는 23 cm2 미니캡 필터 장치에서의 TOC 플러싱 아웃 곡선을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 단일 층이 들어 있으며 실시예 3에서 기술된 바와 같은 23 cm2 미니캡 필터 장치에서의 금속계 추출성 물질 데이터를 나타낸다.
도 6은 감마 조사가 있고 없는, 선택된 추출성 물질에 있어서의 각각 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 단일 층이 들어 있으며 실시예 3에서 기술된 바와 같은 23 cm2 미니캡 필터 장치에서의 금속계 추출성 물질 데이터를 나타낸다.
도 7은 CHO 세포 배양 수확물의 정화를 위하여 소결된 심층 필터 매체를 사용하여 수행된 적용 시험에서의 필터 저항성 프로파일을 나타낸다. 이와 같은 적용/실험의 세부사항은 실시예 6에서 제공된다.
도 8은 펩톤 HY-SOY® T (밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재) 모델 공급 스트림의 정화를 위하여 소결된 심층 필터 매체를 사용하여 수행된 적용 시험에서의 필터 저항성 프로파일을 나타낸다. 적용/실험의 세부사항은 실시예 7에서 제공된다.
도 9는 플러싱 동안의 다양한 선행 기술 필터 매체의 '757호 특허로부터의 물 여과액 전도도의 선행 기술 비교를 나타낸다.
도 10은 감마 조사 전 및 후의 2종 선행 기술 매체와 비교하였을 때의 본 발명 필터 매체의 플러싱 동안의 물 여과액 전도도를 나타낸다.
도 11은 감마 조사 후의 선행 기술 CE25 매체의 플러싱 동안의 물 여과액 전도도 증가를 나타낸다.
도 12는 감마 조사 후의 선행 기술 DE40 매체의 플러싱 동안의 물 여과액 전도도 증가를 나타낸다.
도 13은 감마 조사 후의 본 발명 매체의 플러싱 동안의 물 여과액 전도도 증가 없음을 나타낸다.
도 14는 감마 조사에의 노출이 있고 없는 것 양자에서 다양한 공지의 선행 기술 매체에 대비한 본 발명 필터 매체의 플러싱 동안의 물 여과액의 감소된 전도도를 예지적으로 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 하기 참고문헌이 본 발명에서 사용되는 용어들 중 많은 것에 대한 일반적인 정의를 통상의 기술자에게 제공하게 될 것이다: 문헌 [Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, edited by Abhinav A. Shukla, Mark R. Etzel, and Shishir Gadam]. 본원에서 사용될 때, 하기의 용어들은 달리 상술되지 않는 한 그에 부여되는 의미를 가진다.
본 개시 또는 그의 바람직한 실시양태(들)의 요소들을 소개할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 그 요소들 중 1종 이상이 존재한다는 것을 의미하고자 하는 것이다. "포함하는", "포함한" 및 "가지는"이라는 용어는 열거된 요소들이 아닌 다른 추가적인 요소가 존재할 수 있다는 것을 포괄적으로 의미하고자 하는 것이다.
"포함하는", "본질적으로 ~로 구성되는" 및 "~로 구성되는"이라는 전환 구는 MPEP 2111.03 (특허 심사 절차 매뉴얼(Manual of Patent Examining Procedure); 미국 특허상표국)에서 제공되는 것과 같은 의미를 가진다. "본질적으로 ~로 구성되는"이라는 전환 구를 사용하는 임의의 청구항은 본 발명의 본질적인 요소만을 언급하는 것으로 이해될 것이며, 종속항에서 언급되는 임의의 다른 요소들은 그것이 종속하는 청구항에서 언급되는 본 발명에 대하여 비-본질적인 것으로 이해된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적상, 달리 표시되지 않는 한, 성분의 양, 물질의 백분율 또는 비율, 반응 조건을 나타내는 모든 숫자, 그리고 명세서 및 청구범위에서 사용되는 기타 숫자 값들은 명시적으로 표시되는 지 여부에 관계없이 모든 경우에서 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. "약"이라는 용어는 일반적으로 언급되는 값과 동등한 것으로 간주하게 되는 (즉 동일한 기능 또는 결과를 가지는) 숫자 범위를 지칭한다. 많은 경우에서, "약"이라는 용어는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 숫자를 포함할 수 있다.
이에 따라, 반대로 표시되지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 제시되는 숫자 파라미터들은 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 가변적일 수 있는 개략치이다. 청구범위의 영역에 대한 등가물 원칙의 적용을 제한하고자 하는 것은 아니나, 적어도 각 숫자 파라미터는 적어도 기록되는 유효 숫자의 수에 비추어, 그리고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 또한, 본원에서 개시되는 모든 범위는 그 안에 포함되는 모든 하위 범위들을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 다른 말로 하면, 임의의 숫자 범위는 그것이 명시적으로 언급된 것처럼 범위 내의 모든 숫자를 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명을 더 상세하게 기술하기 전에, 수많은 용어들이 정의되게 된다. 그러한 용어들의 사용이 본 발명의 영역을 제한하는 것은 아니며, 대신 본 발명의 설명을 용이하게 하는 기능만을 한다.
상기 또는 하기에 관계없이, 본원에서 언급되는 모든 공표물, 특허 및 특허 출원들은 각 개별 공표물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 참조로서 개재되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도까지 그 전체가 의거 참조로서 개재된다. 본원에서 언급되는 모든 공표물, 특허 및 특허 출원들은 또한 본 발명의 시점에 본 발명의 분야와 관련하여 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하게 되는 것을 대표한다.
"기포점 세공 크기(bubble point pore size)" 또는 "BP"라는 용어는 필터 매체 중 최대 세공에서의 세공 크기이다.
본원에서 사용될 때, "세포 배양물"이라는 구는 세포, 세포 잔사 및 콜로이드성 입자, 해당 생체분자, HCP 및 DNA를 포함한다.
본원에서 호환가능하게 사용될 때의 "중국 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"라는 용어는 중국 햄스터 난소 ("CHO") 세포 배양물로부터 유래하는 숙주 세포 단백질들 ("HCP")의 혼합물을 지칭한다. HCP 또는 CHOP는 일반적으로 세포 배양 배지 또는 용해물 (예컨대 해당 단백질 또는 폴리펩티드 (예컨대 CHO 세포에서 발현된 항체 또는 이뮤노어드헤신)를 함유하는 수확된 세포 배양액) 중에 불순물로서 존재한다. 일반적으로, 해당 단백질을 포함하는 혼합물에 존재하는 CHOP의 양은 해당 단백질 순도의 척도를 제공한다. 통상적으로, 단백질 혼합물 중 CHOP의 양은 혼합물 중 해당 단백질의 양에 대비하여 백만 당 부로 표현된다.
본원에서 사용될 때, "정화 단계" 또는 단순하게 "정화"라는 용어는 일반적으로 생체분자의 정제에서 최초로 사용되는 1종 이상의 단계를 지칭한다. 정화 단계는 일반적으로 단독 또는 그의 다양한 조합으로서의 하기 중 어느 것, 예컨대 원심분리 및 심층 여과, 접선 유동 여과, 미세여과, 침전, 응결 및 침강을 포함한 1종 이상의 단계를 사용한 세포 및/또는 세포 잔사의 제거를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 다양한 정제 체계에서 통상적으로 사용되는 통상적인 정화 단계에 대비한 개선을 제공한다. 정화 단계는 일반적으로 1종 이상의 바람직하지 않은 것의 제거를 포함하며, 통상적으로 원하는 표적 분자의 포획을 포함하는 단계 전에 수행된다. 정화의 또 다른 측면은 나중에 정제 공정에서 멸균 필터의 폐색을 초래할 수 있는 샘플 중 가용성 및 불용성 성분들의 제거로써, 그에 의해 전체적인 정제 공정이 더 경제적이 된다. 정화 단계는 종종 상류의 일차 정화 단계(들) 및 하류의 이차 정화를 포함한다. 현대의 제조 배치 생물반응기로부터의 대형 수확 부피 (<25,000 L) 및 높은 세포 밀도에서의 세포 배양 수확물 및 고도-고체 공급재료의 정화는 종종 임의의 후속하는 크로마토그래피 작업 등의 전에 일차 정화 단계는 물론 이차 정화 단계도 필요로 한다.
본원에서 사용될 때, "조질 여과" 또는 "조질/중간 여과"라는 용어는 일반적으로 생체분자 정제에서의 대부분 전세포 및 일부 세포 잔사의 제거를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "미세 여과"라는 용어는 일반적으로 생체분자 정제에서의 대부분 세포 잔사, 콜로이드성 입자 및 가용성 불순물 예컨대 HCP, DNA, 내독소, 바이러스 및 지질의 제거를 지칭한다.
필터 처리량 값은 일반적으로 "리터/제곱 미터" 또는 "L/m2" 기준으로 표현되지만, 등가의 비교물인 경우 샘플들 사이의 커다란 두께 차이를 설명하기 위하여 "컬럼 부피" 또는 "CV"가 사용된다.
"오염물", "불순물" 및 "잔사"라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용되며, 본 발명에 따른 심층 필터를 사용하여 외래이거나 바람직하지 않은 분자들 중 1종 이상으로부터 분리되는 해당 단백질 또는 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 함유하는 샘플 중에 존재할 수 있는, 생물학적 거대분자 예컨대 DNA, RNA, 1종 이상의 숙주 세포 단백질 (HCP 또는 CHOP), 내독소, 바이러스, 지질 및 1종 이상의 첨가제를 포함한 임의의 외래이거나 바람직하지 않은 물질을 지칭한다.
숙주 세포가 또 다른 포유동물, 비-포유동물, 또는 세균 세포 유형, 예를 들면 이. 콜리 (E. coli ), 효모 세포, 곤충 또는 식물인 경우, HCP는 숙주 세포의 용해물에서 발견되는 표적 단백질이 아닌 다른 단백질을 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용될 때의 "단일클론 항체" 또는 "mAb"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득되는 항체를 지칭하는 것으로서, 다시 말하자면 부차량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이의 가능성 이외에는 군집을 구성하는 개별 항체들이 동일하다는 것이다.
본원에서 사용될 때의 "평균 유동 세공 크기" 또는 "MFP"라는 용어는 습윤화된 필터 매체를 통한 유동이 건조한 필터 매체를 통한 유동의 50%인 압력 강하에서의 세공 직경이다.
본원에서 사용될 때, "유기 추출성 물질(들)"이라는 용어는 플러싱 동안 사용되는 물 또는 다른 수성 용액의 존재하에서 잠재적으로 다공성 심층 필터 매체와 같은 필터 매체 또는 멤브레인을 제조하는 데에 사용된 재료로부터 이동하거나 추출될 수 있는 오염물을 지칭한다. 그러한 오염물에는 잠재적으로 사용 동안 필터로부터 배출될 수 있어서 상기 유기 추출성 물질(들)을 제거하기 위하여 필터 사용 전의 필터의 사전-플러싱을 필요로 하는 구성 재료 자체도 포함될 수 있다.
"총 유기 추출성 물질(들)" 및 "TOC"라는 용어는 물과 같은 수성 용액에 존재하는 유기 분자의 측정치를 지칭하는 것으로서, 탄소 함량으로 측정된다. TOC를 측정하는 데에 사용되는 분석 기술은 통상적으로 이산화 탄소로의 용액 중 모든 유기 분자의 산화, 생성되는 CO2 농도를 측정하는 것, 및 이와 같은 반응을 공지의 탄소 농도에 상관시키는 것을 포함한다.
"무기 추출성 물질"이라는 용어는 필터로부터 공정액으로 추출될 수 있는 중금속을 포함한 미량의 금속 종들을 지칭한다. 그러한 금속 종들은 유도 연관 플라스마 광학 방출 분광측정법(inductively coupled plasma optical emission spectrometry) (ICP-OES), ICP 질량 분광측정법 (ICP-MS) 및 흑연 노 원자 흡수 분광측정기(graphite furnace atomic absorption spectrometer) (GFAAS) 기술과 같은 분석 기술에 의해 측정될 수 있다.
"사전-플러싱"은 본원에서 보통 멸균수를 사용하여 사용 전에 필터를 플러싱함으로써, 사용 전에 필터로부터 유기 및 무기 추출성 물질을 제거하는 것으로 정의된다.
"백만 당 부" 또는 "ppm"이라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용된다.
세공 크기 등급은 보통 공칭 값으로 제공된다. 일부 경우에서는, 제조자가 평균 유동 세공 (MFP) 크기 또는 기포점 (BP) 세공 크기를 제공한다. MFP 및 BP 모두는 모세관 유동 세공측정기를 사용하여 측정될 수 있다.
"표적 분자", "표적 생체분자", "원하는 표적 분자" 및 "원하는 표적 생체분자"라는 용어들은 본원에서 호환가능하게 사용되며, 일반적으로 해당 폴리펩티드 또는 생성물을 함유하는 샘플 중에 존재할 수 있는 1종 이상의 바람직하지 않은 것, 예컨대 1종 이상의 불순물로부터 정제되거나 분리되기를 원하는 해당 폴리펩티드 또는 생성물 (예컨대 단일클론 항체)을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "처리량"이라는 용어는 필터를 통하여 여과되는 부피 나누기 필터의 전면 면적을 의미한다. 처리량은 여과되는 유체의 L/m2 필터 면적 기준으로 표현된다.
본원에서 사용될 때, "불순물 유지 용량(dirt holding capacity)"이라는 용어는 비처리 수확물인지 또는 미리 정화된 것인지에 관계없이, 주어지는 세포 배양물 유체의 필터 처리량에 상당한다. 더 높은 처리량은 더 높은 불순물 유지 용량을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 그리고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, "습윤-강도 바인더 수지"는 섬유 및/또는 입자들을 서로 결합시킴으로써 필터 시트의 형성을 가능하게 하며, 필터의 습윤 강도를 증가시키고, 사용되는 바인더에 따라서는 고유의 전하 특성을 부여할 수 있는 수지이다. 습윤-강도 수지의 예로는 우레아 또는 멜라민-포름알데히드 기재 중합체, 폴리아미노폴리아미드-에피클로로히드린 (PAE) 중합체 및 글리옥살레이트화 폴리아크릴아미드 (GPAM) 수지의 합성 중합체를 포함하는 수지가 있다.
본 발명의 소결된 필터
본 발명의 필터는 본원에서 "소결된 필터"로 지칭된다. "소결된"이라는 용어는 액화 없이 가열에 의해 분말화된 재료를 고체 또는 다공성 덩어리로 합체시키는 공정인 소결에 의해 제조되거나 거기에 적용된 품목을 지칭하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 본 발명의 필터는 열 융합을 통하여 폴리에틸렌 바인더에 의해 결합된 고도 표면적 합성 필터 조제를 포함한다 (또는 "본질적으로 그것으로 구성"되거나, 또는 "그것으로 구성"됨). 고도 표면적 합성 필터 조제는 10 m2/g을 초과하는 BET 표면적을 가지는 것으로 정의된다. 일부 경우에서, 합성 필터 조제의 BET 표면적은 100 m2/g을 초과할 수 있다. BET는 기체 흡착을 기준으로 표면적을 측정한다 (문헌 [Adsorption of Gases in Multimolecular Layers, Brunauer, Emmett, Teller, J. Am. Chem. Soc., Feb 1938, vol. 60, 309]). 대안적인 바인더로는 나일론 6 분말 (PA6, 밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재) 및 나일론 12 분말 (PA12, 밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)을 포함한 열가소성 수지 분말도 포함될 수 있다. 대안적인 바인더로는 또한 아크릴 스테이플 섬유, 피브렐(Fybrel)® 합성 목질 펄프, 숏 스터프(Short Stuff)® 피브릴화 HDPE (미니파이버스(Minifibers), Inc. 사)가 포함될 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 필터는 "균질"하거나 또는 "상당히 균질"한데, 합성 필터 조제 대 바인더의 비가 전체 필터에 걸쳐 동일하거나 실질적으로 동일하다는 것, 그리고 합성 필터 조제 대 바인더의 비와 관련하여 조성물이 제조 공차 내에서만 가변적이라는 것을 의미한다.
계류 발명 심층 필터의 필터 보유력 특징(filter retention characteristic)은 선택되는 중합체, 혼합물 및 비에 따라 가변적일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 심층 필터는 고도 표면적 합성 필터 조제 적재량의 증가에 따라 증가된 투과도 및 감소된 미세 입자 보유력을 나타내게 된다. 반대로, 본 발명의 소결된 심층 필터에서의 고도 표면적 합성 필터 조제 적재량의 감소는 감소된 투과도 및 증가된 미세 입자 보유력을 나타내게 된다. 나아가, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, > 70 중량%의 높은 고도 표면적 합성 필터 조제 적재량 값에서 소결된 필터 시트의 기계적 완전성 감소에 비추어 소결된 필터 매체 시트의 필터 투과도와 필터 보유력 사이의 절충을 고려하게 된다.
심층 필터 시트의 투과도는 LMH로 나타낸 여러 물 유량(flux rate)에서 심층 필터 시트가 들어 있는 여과 장치의 PSI로 나타낸 압력 강하를 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다. 더 높은 압력 강하는 더 낮은 필터 시트 투과도를 표시한다.
공정 유량은 여과되는 유체의 부피 유량 나누기 m2로 나타낸 여과 장치 전면 면적 기준으로 표현된다. 공정 유량은 L/m2/hr (LMH) 기준으로 표현된다. 생물약제 심층 여과 공정의 통상적인 공정 유량은 75 내지 300 LMH 사이의 범위이다. 본 발명의 소결된 필터 매체에서의 압력 강하는 574 LMH의 유량에서 1.1 psi 미만이다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 필터는 열 융합에 의해 제조된다. 열 융합 공정의 예에 대해서는 하기 실시예 부문에서 제공된다. 때로는 열 융합(heat fusion)으로도 지칭되는 열 융합(thermal fusion)은 예를 들면 열가소성 물질들을 서로 결합시키는 데에 사용되는 것으로 관련 기술분야에 알려져 있는 공정이다. 예를 들면 접착제, 땜납 또는 기계적 연결 및 개스킷을 사용하는 대신, 열 융합은 실제로는 냉각될 경우 다른 열가소성 물질(들)에 결합하기에 충분하게 열가소성 물질들 중 1종 이상을 연화하고/거나 용융시키는 것에 의해 2개의 플라스틱 조각을 하나의 고체 조각으로 전환시킨다. 본 발명의 융합 소결된 필터는 구성요소들 사이의 구별을 유지하는데, 다시 말하자면 합성 필터 조제와 바인더가 확대하에서 여전히 구성요소로서 가시가능하다. 도 2를 참조하라.
본 발명의 합성 소결된 심층 필터가 두께에 의해 제한되는 것은 아니나, 바람직한 실시양태에서는 두께가 0.1 mm - 5.0 mm, 0.5 mm - 4.0 mm, 1.0 mm - 4.0 mm, 1.0 mm - 3.0 mm 및 2.0 mm - 3.0 mm 범위일 수 있다.
본 발명의 합성 소결된 심층 필터가 바인더 대 합성 흡착제 필터 조제의 비에 의해 제한되는 것은 아니다. 일 측면에서, 상기 비는 1:10 - 10:1 바인더:합성 흡착제 필터 조제, 1:5 - 5:1 바인더:합성 흡착제 필터 조제, 1:2 - 2:1 바인더:합성 흡착제 필터 조제, 또는 약 1:1 바인더:합성 흡착제 필터 조제일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 명세서에서 제공되는 지침에 따라 과도한 실험 없이 임의의 구체적인 용도를 위한 적합한 비를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 합성 흡착제 필터 조제는 통상적으로 구형 또는 약간 타원형이며, 직경 약 10 μm 내지 약 120 μm, 직경 약 30 μm 내지 약 100 μm, 직경 약 50 μm 내지 약 80 μm, 직경 약 60 μm 내지 약 70 μm, 또는 직경 약 63 μm의 직경을 가진다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 명세서에서 제공되는 지침에 따라 과도한 실험 없이 임의의 구체적인 용도를 위한 최적의 크기를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 소결된 심층 필터를 제조하는 방법
본 발명은 또한 본 발명의 소결된 심층 필터를 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 하기 실시예 부문에서 제공된다. 일 측면에서는, 폴리에틸렌 바인더와 폴리스티렌 흡착제가 원하는 비로 혼합된다. 상기 혼합물은 대형 금속 베이킹 시트(baking sheet)상에 균일하게 분배된 후, 드로우바(drawbar)를 사용하여 2 mm로 평탄화된다. 다음에, 약 165℃에서 약 60분 동안, 베이킹 시트가 베이킹된다. 냉각 후, 필터 재료의 시트는 원하는 크기로 절단된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 발명에서 제공되는 지침에 따라 과도한 실험 없이, 상이한 바인더 또는 바인더들, 또는 상이한 흡착제 또는 흡착제들을 이용하는 본 발명의 합성 심층 필터를 제조하기 위한 시간 및 온도를 결정할 수 있을 것이다. 마찬가지로, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 발명에서 제공되는 지침에 따라 과도한 실험 없이, 2 mm에 비해 더 두껍거나 더 얇은 본 발명의 합성 심층 필터를 제조하기 위한 시간 및 온도를 결정할 수 있을 것이다.
심층 필터의 다른 제조 방법은 효율적인 방식으로 대량 필터 매체의 제조를 가능하게 하는 자동화된 기계를 사용할 수도 있다.
본 발명의 소결된 심층 필터의 사용 방법
본 발명은 본 발명 합성 소결된 심층 필터의 사용 방법을 고려한다. 예를 들면, 본 발명의 소결된 심층 필터는 생물생성물(bioproduct)이 생성되어 있는 세포 배양 배지 (즉 공급 스트림)을 여과하는 데에 사용될 수 있다. 공급 스트림의 처리 단계에 따라, 다양한 세공 크기, 다공성 및 유량 등급의 필터가 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 본 명세서 교시의 도움으로 구체적인 용도를 위한 올바른 세공 크기, 다공성 및 유량 등급을 결정할 수 있을 것이다. 일 측면에서, 본 발명의 합성 심층 필터는 추가적인 하류 처리 전에 공급 스트림을 정화하는 데에 사용될 수 있다. 정화 단계는 예를 들면 표적 단백질이 필터를 통과하는 것을 가능하게 하면서, 세포 배양물 잔사 예컨대 전세포, 파열된 세포, 대형 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 기타 오염물 등을 제거하게 된다. 일 실시양태에서, 표적 단백질은 단일클론 항체, 인간화된 단일클론 항체, CAR-T 세포 생성 항체 등이다. 표적 단백질은 예를 들면 원하는 표적 단백질의 발현용으로 조작된 발현 벡터에 의해 형질감염된 세포에 의해 생성되거나, 또는 주어지는 세포 유형에 의해 자연적으로 발현되는 다른 유전적으로 조작되거나 자연적으로 발생하는 단백질일 수도 있다.
본 발명의 심층 필터로 세포 배양물 공급 스트림을 통과시키는 것의 결과는 투과물 (즉 필터를 통과하는 공급 스트림)에서의 오염물(들)에 대한 표적 단백질의 상대적인 비율을 증가시키는 것이다. 이와 같은 맥락에서, 오염물에는 전세포, 세포 잔사 및 콜로이드성 입자가 포함될 수 있다. 일 측면에서, 오염물(들)에 대한 표적 단백질의 농도는 공급 스트림과 비교하였을 때 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500% 및 적어도 1000%만큼 증가된다. 일 측면에서, 오염물(들)에 대한 표적 단백질의 농도는 공급 스트림과 비교하였을 때 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 100% 이하, 200% 이하, 500% 이하 및 1000% 이하만큼 증가된다. 일 측면에서, 오염물(들)에 대한 표적 단백질의 농도는 10% - 1000% 및 50% - 500%만큼 증가된다.
본 발명은 본 발명의 심층 필터가 공급 스트림을 여과하는 데에 사용하기 전에 사전-플러싱되지 않는 것을 고려한다. 일 측면에서, 공급 스트림을 여과하기 전의 본 발명 심층 필터의 사전-플러싱은 특별히 배제된다.
[ 실시예 ]
실시예 1
본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 제조. 폴리에틸렌 바인더인 PE (미펠론(MIPELON)™ XM-221u 폴리에틸렌 바인더, 미츠이 케미칼스 아메리카(Mitsui Chemicals America), Inc. 사) 및 폴리스티렌 흡착제인 PS (메다포어(Medapore) P787, >63 μm, 머크 KGaA 사, 독일 다름슈타트 소재) 재료를 하기 표 1에 기술되어 있는 비로 혼합하였다. 상기 분말 혼합물을 PTFE 방출 필름이 구비된 대형 금속 베이킹 시트상에 분배하였다. 드로우바를 사용하여 2 mm의 두께로 분말 혼합물을 균일하게 분배하였다. 베이킹 시트를 165℃의 사전-가열된 오븐에 60분 동안 위치시켰다. 오븐으로부터 샘플을 제거하여, 실온으로 냉각시켰다. 다음에, 소결된 심층 필터 시트를 23 cm2 디스크로 절단하고, 적용 시험을 위하여 미니캡(minicap) 필터 시험 장치에 도입하였다. 심층 필터 성능의 평가에서의 미니캡 필터 시험 장치의 사용에 대해서는 이전에 보고된 바 있다 (본 주제 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식을 대표하는 문헌 [Lutz, H., et al. Biotechnol. Prog., 2015, 31, 6, 1542- 1550]).
<표 1>
Figure pct00001
실시예 2
본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 제조. 폴리에틸렌 바인더인 PE (미펠론™ XM-221u 폴리에틸렌 바인더, 미츠이 케미칼스 아메리카, Inc. 사) 및 마이크로라이트(MICROLITE)® 이온 교환 흡착제 (PrAOH, PrCH, 및 MBl/lH (퓨로라이트(PUROLITE)® 코포레이션 사, 펜실베이니아 발라 신위드 소재)) 재료를 하기 표 2에 기술되어 있는 비로 혼합하였다. 실시예 2-4, 2-5 및 2-6 (하기 표 2에 표시되어 있는 바와 같음)의 경우에는, 마이크로라이트® 이온 교환 흡착제를 125℃에서 3 내지 18시간 동안 건조하였다. 상기 분말 혼합물을 PTFE 방출 필름이 구비된 대형 금속 베이킹 시트상에 분배하였다. 드로우바를 사용하여 3 mm의 두께로 분말 혼합물을 균일하게 분배하였다. 베이킹 시트를 165℃의 사전-가열된 오븐에 60분 동안 위치시켰다. 오븐으로부터 샘플을 제거하여, 실온으로 냉각시켰다. 다음에, 소결된 심층 필터 시트를 5 cm2 디스크로 절단하고, 적용 시험을 위하여 5 cm2 필터 시험 장치에 도입하였다.
<표 2>
Figure pct00002
실시예 3
본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 제조. 폴리에틸렌 바인더인 PE (미펠론™ XM-221u 폴리에틸렌 바인더, 미츠이 케미칼스 아메리카, Inc. 사) 및 폴리스티렌 흡착제인 PS (메다포어 P787, >63 μm, 머크 KGaA 사, 독일 다름슈타트 소재) 재료를 하기 표 3에 기술되어 있는 비로 혼합하였다. 상기 분말 혼합물을 PTFE 방출 필름이 구비된 대형 금속 베이킹 시트상에 분배하였다. 드로우바를 사용하여 2 mm의 두께로 분말 혼합물을 균일하게 분배하였다. 베이킹 시트를 165℃의 사전-가열된 오븐에 60분 동안 위치시켰다. 오븐으로부터 샘플을 제거하여, 실온으로 냉각시켰다. 다음에, 소결된 심층 필터 시트를 23 cm2 디스크로 절단하고, 적용 시험을 위하여 미니캡 필터 시험 장치에 도입하였다. 심층 필터 성능의 평가에서의 미니캡 필터 시험 장치의 사용에 대해서는 이전에 보고된 바 있다 (본 주제 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식을 대표하는 문헌 [Lutz, H., et al. Biotechnol. Prag., 2015, 31, 6, 1542-1550]).
<표 3>
Figure pct00003
본 실시예에 따라 제조된 필터 매체를 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1은 실시예 ID 3-2에서와 같이 제조된 소결된 심층 필터 매체를 나타낸다 (A). 셀룰로스-기재 표준 샘플 (밀리스탁+® CE25 필터 매체)의 사진을 비교용으로 나타내었다 (B).
도 2는 본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 단면 SEM 현미경사진이다. 도 2에 나타낸 소결된 심층 필터 매체는 실시예 ID 3-2에 따라 제조된 것이다. SEM 현미경사진들은 100X (A & B) 및 500X (C & D) 배율로 제공하였다.
실시예 ID 3-7에 대하여 기술된 바와 같이 소결된 심층 필터 매체를 제조하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 600 LMH로 100 L/m2의 밀리(Milli)-Q수 (밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)를 사용하여 미니캡 필터 장치를 플러싱하였다. 각 25 L/m2 플러싱 후에, TOC 추출성 물질 샘플을 수집하였다. 실시예 ID 3-7의 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 시험 장치에서 기록된 TOC 추출성 물질 값들은 밀리스탁+® HC (밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)의 통상적인 TOC 플러싱 아웃(flush out) 목표 (100 L/m2의 플러싱-아웃에서 < 3 ppm TOC)에 비해 훨씬 더 낮다.
실시예 ID 3-7에 대하여 기술된 바와 같이 소결된 심층 필터 매체를 제조하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 23 cm2 미니캡 필터 장치 중 하나 (사각형)를 40-60 kGy의 감마 방사선 선량에 적용하였으며, 하나는 그렇게 하지 않았다 (원). 각 미니캡 필터 장치를 100 L/m2의 밀리-Q수를 사용하여 600 LMH로 플러싱하였다. 각 25 L/m2 플러싱 후에, TOC 추출성 물질 샘플을 수집하였다. 실시예 ID 3-7의 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 시험 장치에서 기록된 TOC 추출성 물질 값들은 밀리스탁+® HC의 통상적인 TOC 플러싱 아웃 목표 (100 L/m2의 플러싱-아웃에서 < 3 ppm TOC)에 비해 훨씬 더 낮다. 40-60 kGy의 감마 방사선에 적용된 장치에서, TOC 추출성 물질의 유의성 있는 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 소결된 심층 필터 매체가 생물약제 제조에서 사용되는 통상적인 정화 작업에서 사용-전 장치 플러싱을 필요로 하지 않게 된다는 것을 나타낸다. 또한, 소결된 심층 필터 매체의 구성 재료는 감마 방사선에 대하여 우수한 안정성을 나타낸다.
실시예 ID 3-7에 대하여 기술된 바와 같이 소결된 심층 필터 매체를 제조하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 600 LMH로 100 L/m2의 밀리-Q수를 사용하여 미니캡 필터 장치를 플러싱하였다. 각 25 L/m2 플러싱 후에, 금속계 추출성 물질 샘플을 수집하였다. 유도 연관 플라스마 광학 방출 분광법 (ICP-OES)에 의해, 금속계 추출성 물질을 측정하였다. 실시예 ID 3-7의 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 시험 장치에서 기록된 금속계 추출성 물질 값들은 규소 및 소듐을 제외한 모든 금속에서 기기 검출 한계 (0.02 ppm) 미만이다.
실시예 ID 3-7에 대하여 기술된 바와 같이 소결된 심층 필터 매체를 제조하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 23 cm2 미니캡 필터 장치 중 하나를 40-60 kGy의 감마 방사선 선량에 적용하였다. 각 미니캡 필터 장치를 100 L/m2의 밀리-Q수를 사용하여 600 LMH로 플러싱하였다. 각 25 L/m2 플러싱 후에, 금속계 추출성 물질 샘플을 수집하였다. 유도 연관 플라스마 광학 방출 분광법 (ICP-OES)에 의해, 금속계 추출성 물질을 측정하였다. 40-60 kGy의 감마 방사선에 적용된 장치에서 금속계 추출성 물질의 유의성 있는 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 소결된 심층 필터 매체가 생물약제 제조에서 사용되는 통상적인 정화 작업에서 사용-전 장치 플러싱을 필요로 하지 않게 된다는 것을 나타낸다. 또한, 소결된 심층 필터 매체의 구성 재료는 감마 방사선에 대하여 뛰어난 안정성을 나타낸다.
실시예 4
본 발명의 소결된 심층 필터 매체의 제조. 폴리에틸렌 바인더인 PE (미펠론™ XM-221u 폴리에틸렌 바인더, 미츠이 케미칼스 아메리카, Inc. 사) 및 가교된 폴리(4-비닐피리딘) 흡착제인 PVP. 상기 PVP 흡착제는 모두 미국 미주리 세인트루이스 소재 밀리포어시그마 사로부터 구매한 디비닐벤젠과 가교된 폴리(4-비닐피리딘) 2%, 및 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)을 포함하였다. 이들 재료를 하기 표 4에 기술되어 있는 비로 혼합하였다. 상기 분말 혼합물을 PTFE 방출 필름이 구비된 대형 금속 베이킹 시트상에 분배하였다. 드로우바를 사용하여 2 mm의 두께로 분말 혼합물을 균일하게 분배하였다. 베이킹 시트를 165℃의 사전-가열된 오븐에 120분 동안 위치시켰다. 오븐으로부터 샘플을 제거하여, 실온으로 냉각시켰다.
<표 4>
Figure pct00004
실시예 5
감마 조사 후 소결된 심층 필터 매체의 물 유량 시험. 실시예 1에서 기술된 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 23 cm2 미니캡 시험 장치를 제공하였다. 본 발명의 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 23 cm2 미니캡 시험 장치 중 하나를 40-60 kGy의 선량으로 감마 조사에 적용하였다. 기술된 미니캡 장치를 연동 펌프에 결합하고, 장치를 통하여 탈이온수를 펌핑하면서, 스케일(scale) 및 타이머에 의해 유량을 측정하였다. 전자 압력 변환기에 의해, 압력 강하를 측정하였다. 물 유량 시험의 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 본 발명의 소결된 심층 여과 매체를 포함하는 여과 장치는 수확물 정화 단위 작업에서의 적용에 적격인 유량에서 충분히 낮은 압력 강하를 나타낸다.
<표 5>
Figure pct00005
실시예 6
CHO 세포 배양 수확물의 정화. 실시예 3에서 기술된 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 23 cm2 미니캡 시험 장치를 제공하였다. 본 발명의 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 23 cm2 미니캡 시험 장치 중 하나를 40-60 kGy의 선량으로 감마 조사에 적용하였다. 25.7 x 106 세포/ml (89% 생존력)의 총 세포 밀도를 가지는 CHO 세포 배양 수확물을 사용하여, 상기 필터 시험 장치를 시험하였다. 기술된 미니캡 장치를 연동 펌프에 결합하고, 장치를 통하여 세포 배양 수확물을 펌핑하였다. 스케일 및 데이터 기록장치의 시스템을 이용하여 여과액 부피를 연속적으로 기록하였다. 실시예 3에서 기술된 바와 같은 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 장치에, 사용-전 장치 플러싱은 필요하지 않았다. 전자 압력 변환기에 의해, 필터 압력 강하를 측정하였다. 필터 처리량의 함수로서의 여과 저항성 프로파일을 플로팅하고 (표 6 및 도 7 참조), 그것을 대조군 샘플로서 시험된 통상적인 셀룰로스-기재 심층 필터 (밀리스탁+® CE25 필터 매체)와 비교하였다. 이와 같은 실험의 결과에서, 몇 가지 관찰이 이루어질 수 있었다. (1) 실시예 ID 6-6의 필터 매체에서는, 시스템 저항성의 유의성 있는 증가가 관찰되지 않았다. 실시예 ID 6-2 내지 6-5의 더 높은 필터 저항성 프로파일로 나타나는 바와 같이, 증가된 PE 바인더 적재량은 증가된 필터 보유력을 제공하였다. (2) 실시예 ID 6-4 및 6-5의 필터 저항성 프로파일은 유사하였다. 이러한 결과는 실시예 ID 3-7의 소결된 심층 필터 매체가 40-60 kGy의 감마 방사선 선량에 의해 유의성 있게 분해되지 않았음을 표시한다. (3) 관찰되는 필터 저항성 프로파일 및 보유력 특징은 수확물 정화 단위 작업에 있어서 통상적인 셀룰로스-기재 심층 여과 매체 (밀리스탁+® CE, 밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)와 유사하였다.
<표 6>
Figure pct00006
실시예 7
모델 공급 스트림 (펩톤(Peptone) HY-SOY® T)의 정화. 실시예 ID 3-2에서 기술된 소결된 심층 필터 매체가 들어 있는 23 cm2 미니캡 시험 장치를 제공하였다. 600 LMH의 유량으로 100 L/m2의 밀리-Q수를 사용하여 필터 시험 장치를 플러싱하였다. DI (증류, 탈이온)수 중 펩톤 HY-SOY® T (P6463, 밀리포어시그마 사) 15 g/L 현탁액을 포함하는 모델 공급 스트림을 사용하여, 상기 필터 시험 장치를 시험하였다. 모델 공급 용액의 혼탁도는 10x 희석에서 179 NTU인 것으로 측정되었다. 이와 같은 모델 공급 스트림은 통상적인 이차 정화 적용시 직면하는 심층 필터 막힘 특징을 모사하여 선택되었다. 이차 정화 단계는 일반적으로 특정 하류 중간물들의 원심분리후, 관류 생물반응기-후, 세포 보유 장치-후, 일차 심층 여과-후 및 단백질 A-후를 포함한 선택된 적용분야에서의 미세 입자의 제거 또는 혼탁도 감소에 사용된다. 기술된 미니캡 장치를 연동 펌프에 결합하고, 장치를 통하여 펩톤 HY-SOY® T 공급 스트림을 펌핑하면서, 스케일 및 데이터 기록장치를 이용하여 여과액 부피를 연속적으로 기록하였다. 전자 압력 변환기에 의해, 필터 압력 강하를 측정하였다. 필터 처리량의 함수로서의 여과 저항성 프로파일을 플로팅하였다. 표 7 및 도 8을 참조하라. 이와 같은 실험의 결과에서, 몇 가지 관찰이 이루어질 수 있었다. 관찰되는 필터 저항성 프로파일 및 보유력 특징 (여과액 혼탁도 감소)은 이차 정화 단위 작업에 있어서 통상적인 단일-층 규조토-기재 심층 여과 매체 등급 (밀리스탁+® DE 유형 필터 매체, 밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)의 성능과 유사하였다.
<표 7>
Figure pct00007
실시예 8
시중의 선행 기술 매체 (예컨대 DE 및 CE 매체)들은 고도의 무기 추출성 물질을 나타낸다 (그 전체가 본원에 개재되는 US 특허 제7,673,757호; '757호 특허). 결과적으로, 50 L/m2 플러싱 후, 8-12 μS/cm의 높은 여과액 전도도 값이 측정되었다. '757호 특허에서 기술된 매체는 감소된 무기 추출성 물질 함량을 나타내며, 여과액 전도도 값이 58 L/m2 플러싱 후 2 μS/cm로 감소된다. '757호 특허의 매체가 "셀퓨어(Celpure)"라는 명칭으로 나타나 있는 선행 기술 참조 도면인 도 9를 참조하라. '757호 특허에서 제공된 데이터로 볼 때, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, CE 또는 DE 필터 매체를 사용하는 데에는 50 L/m2를 초과하는 사용-전 플러싱 부피가 필요할 것임을 알게 된다. 그러나, '757호 특허 매체의 경우, 적어도 58 L/m2라는 감소된 사용-전 플러싱 부피이면 충분하게 되기는 하지만, 요구되는 플러싱 부피가 여전히 허용되지 않는 것으로 생각된다.
반면, 본 명세서에서 기술되는 PE:PS 1:1 필터 매체는 크게 감소된 사용 전 플러싱 부피를 필요로 하거나 그것을 필요로 하지 않는데, 해당 필터 재료로부터의 무기 추출성 물질이 매우 적게 존재하기 때문이다. 여과액 전도도 값은 25 L/m2 플러싱 후 < 0.5 μS/cm이다 (도 13 참조). 본 명세서의 교시로 무장한 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 그와 같은 낮은 무기 추출성 물질을 포함하는 필터 매체가 사용-전 플러싱을 필요로 하지 않게 된다는 것을 알고 있을 것이다.
이어지는 연구에서는, CE 매체, DE 매체 및 PE:PS 1:1 필터 매체의 샘플을 감마 방사선의 멸균 선량 (25-40 kGy)에 노출시켰다. CE 및 DE 매체 양자는 감마 조사 후 여과액 전도도 값의 증가를 나타낸 반면 (각각 도 11 및 12 참조), 본 명세서에서 기술되는 PE:PS 1:1 재료에서는 증가가 관찰되지 않았다 (도 13 참조). 또한, PE:PS 1:1 필터 매체의 여과액 전도도 값은 시험된 CE 및 DE 필터 매체 샘플에 비해 50-100배 더 낮은 것으로 관찰되었다.
실시예 9
본 예지적 실시예에서는, 깨끗한 탈이온수 (밀리큐(MILLIQ)®, 밀리포어시그마 사, 매사추세츠 벌링턴 소재)를 사용하여 '757호 특허의 실시예 3에서 기술된 유형의 복합 재료를 플러싱하고, 58 L/m2의 정해진 플러싱 부피 후의 유출물의 전도도를 측정한다. 전도도 값은 필터 매체에 존재하는 가용성 금속의 농도를 대표하는 것으로 간주된다. 도 14는 본 발명의 PE:PS 1:1 재료에서 측정된 값 (도 13 참조)에 대비한 '757호 특허의 다양한 셀퓨어/폴리에틸렌 복합 재료 샘플에서 수득된 전도도 값들을 나타낸다. 비교를 위하여, 밀리스탁+® CE25 (도 11) 및 DE40 심층 필터 매체 (도 12)에서 기록된 전도도 데이터도 제공된다. '757호 특허 셀퓨어/폴리에틸렌 복합 재료 샘플들의 유출물 전도도 데이터는 58 L/m2의 플러싱 후 약 2 μS/cm 수준을 나타낸다. 유출물 전도도 값은 필터 매체에 존재하는 가용성 금속의 농도를 대표하는 것이므로, 이러한 값이 감마 방사선에의 노출 후에 선행 기술 셀퓨머/폴리에틸렌 복합재에서 증가하거나 감소할 것으로 예상되지는 않는다. '757호 특허의 7 페이지, 컬럼 2, 라인 14에 기술되어 있는 바와 같이, "전도도에 기여하는 추출성 물질 (무기물질)이 전적으로 또는 주로 규조토에서 유래하는 것은 아니며..., 실제로 셀룰로스 및 열경화성 바인더가 없는 본 발명의 복합 재료는 통상적인 셀룰로스계 매체에 비해 75-90%의 유출물 전도도 감소를 초래한다". 그러나, '757호 특허의 필터 재료에 의해 유출물 전도도가 실질적으로 감소되기는 하지만, 참고문헌에서 기술되는 복합 재료에서 사용된 규조토 필터 조제로부터의 금속계 추출성 물질 기여가 제거된 것은 아니다. 반면, 본 발명의 PE:PS 1:1 필터 매체에 의하면, 유출물 전도도는 DE40과 같은 통상적인 셀룰로스계 매체에 비해 95% 이하만큼 추가적으로 감소되며, '757호 특허의 재료와 비교하였을 때 수배 더 낮다. 본 발명에서 기술되는 PE:PS 1:1 필터 매체와 같은 심층 필터 재료는 '757호 특허의 필터 매체를 포함한 선행 기술 필터 재료에 의해 요구되는 것과 같은 "사용 전에 허용되는 수준으로 유기 또는 무기 오염물의 농도를 감소시키기 위한 사용-전 플러싱을 필요로" ('757호 특허, 컬럼 1, 라인 53)하지 않게 된다.

Claims (44)

  1. a) 폴리에틸렌 바인더의 열적으로 융합된 혼합물을 포함하는 소결된 심층 필터 매체, 및
    b) PrAOH, PrCH, MB1/1h, 폴리스티렌 흡착제, 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 흡착제
    를 포함하는 심층 필터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 심층 필터 매체가 상당히 균질한 것인 심층 필터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 심층 필터가 약 1 mm - 약 4 mm 두께인 심층 필터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 심층 필터가 약 2 mm - 약 3 mm 두께인 심층 필터.
  5. 제1항에 있어서, 습윤-강도 바인더 수지가 특별히 배제된 것인 심층 필터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:10 내지 약 10:1인 심층 필터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:5 내지 약 5:1인 심층 필터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:2 내지 약 2:1인 심층 필터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:1인 심층 필터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리스티렌 흡착제의 크기가 직경 약 10 μm 내지 약 120 μm인 심층 필터.
  11. 제1항에 있어서, 폴리스티렌 흡착제의 크기가 직경 약 30 μm 내지 100 μm인 심층 필터.
  12. 제1항에 있어서, 폴리스티렌 흡착제의 크기가 직경 약 50 μm 내지 80 μm인 심층 필터.
  13. 제1항에 있어서, 폴리스티렌 흡착제의 크기가 직경 약 60 μm 내지 70 μm인 심층 필터.
  14. 제1항에 있어서, 폴리스티렌 흡착제의 크기가 직경 약 63 μm인 심층 필터.
  15. 폴리에틸렌 바인더를 PrAOH, PrCH, MB1/1h, 폴리스티렌 흡착제, 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)으로 이루어진 군으로부터 선택된 흡착제와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 실질적으로 균일한 두께로 스프레딩하고, 상기 혼합물을 약 165℃에서 약 60분 동안 가열하는 것을 포함하는, 소결된 심층 필터 매체를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 심층 필터 매체가 상당히 균질한 것인 소결된 심층 필터 매체.
  17. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 심층 필터가 약 1 mm - 약 4 mm 두께인 소결된 심층 필터 매체.
  18. 제17항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 심층 필터가 약 2 mm - 약 3 mm 두께인 소결된 심층 필터 매체.
  19. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 습윤-강도 바인더 수지가 특별히 배제된 것인 소결된 심층 필터 매체.
  20. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:10 내지 약 10:1인 소결된 심층 필터 매체.
  21. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:5 내지 약 5:1인 소결된 심층 필터 매체.
  22. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:2 내지 약 2:1인 소결된 심층 필터 매체.
  23. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:1인 소결된 심층 필터 매체.
  24. 제15항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 상기 흡착제의 크기가 직경 약 10 μm 내지 약 120 μm인 소결된 심층 필터 매체.
  25. 제24항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 흡착제의 크기가 직경 약 30 μm 내지 100 μm인 소결된 심층 필터 매체.
  26. 제25항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 흡착제의 크기가 직경 약 50 μm 내지 80 μm인 소결된 심층 필터 매체.
  27. 제26항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 흡착제의 크기가 직경 약 60 μm 내지 70 μm인 소결된 심층 필터 매체.
  28. 제27항에 따른 방법에 의해 제조되는 소결된 심층 필터 매체이며, 흡착제의 크기가 직경 약 63 μm인 소결된 심층 필터 매체.
  29. 표적 단백질을 함유하는 공급 스트림을 정화하는 방법이며,
    a) 소결된 심층 필터 매체를 포함하는 심층 필터를 제공하는 단계로서, 상기 심층 필터 매체는 폴리에틸렌 바인더를, PrAOH, PrCH, MB1/1h, 폴리스티렌 흡착제, 디비닐벤젠과 2% 가교된 폴리(4-비닐벤젠), 디비닐벤젠과 25% 가교된 폴리(4-비닐피리딘-co-에틸비닐벤젠)으로 이루어진 군으로부터 선택된 흡착제와 함께 포함하는 것인 단계;
    b) 표적 단백질이 심층 필터를 통과하여 투과물 중에 보유되고 오염물은 심층 필터에 의해 흡착되도록 심층 필터를 공급 스트림과 접촉시켜, 투과물 중의 오염물에 대한 표적 단백질의 농도가 공급 스트림 중에서의 비와 비교하였을 때 적어도 20%만큼 증가되도록 하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 투과물 중의 오염물에 대한 표적 단백질의 상기 농도가 공급 스트림 중에서의 비와 비교하였을 때 적어도 50%만큼 증가되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 투과물 중의 오염물에 대한 표적 단백질의 상기 농도가 공급 스트림 중에서의 비와 비교하였을 때 적어도 100%만큼 증가되는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 심층 필터 매체가 상당히 균질한 것인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 심층 필터가 약 1 mm - 약 4 mm 두께인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 심층 필터가 약 2 mm - 약 3 mm 두께인 방법.
  35. 제29항에 있어서, 습윤-강도 바인더 수지가 특별히 배제된 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:10 내지 약 10:1인 방법.
  37. 제29항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:5 내지 약 5:1인 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:2 내지 약 2:1인 방법.
  39. 제29항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 대 흡착제의 비가 약 1:1인 방법.
  40. 제29항에 있어서, 상기 흡착제의 크기가 직경 약 10 μm 내지 약 120 μm인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 흡착제의 크기가 직경 약 30 μm 내지 100 μm인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 흡착제의 크기가 직경 약 50 μm 내지 80 μm인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 흡착제의 크기가 직경 약 60 μm 내지 70 μm인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 흡착제의 크기가 직경 약 63 μm인 방법.
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