KR20240036608A - Ph 유도 상 분리에 의한 식용 다공성 가교된 중공 섬유 및 멤브레인을 위한 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 청정 육류 생성물의 제조에 적합한 가교된 식용 다공성 중공 섬유 및 쉬트 멤브레인의 제조 방법, 그로부터 제조된 중공 섬유 및 쉬트 멤브레인 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

PH 유도 상 분리에 의한 식용 다공성 가교된 중공 섬유 및 멤브레인을 위한 제조 방법 및 그의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 8월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/234,796의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

멤브레인 완전성 및 기공 특성은 멤브레인-기반 생물반응기에서의 효과적인 사용을 위해 중요하다. 멤브레인은 지지 구조를 방해하지 않으면서 멤브레인을 통해 배지 및 영양소의 전달을 허용하고, 부착성 세포의 배양을 위한 보다 큰 표면적을 허용하도록 자기-지지적일 필요가 있다. 또한, 식용 식품의 생성을 위해, 멤브레인은 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 물질로 제조될 필요가 있다. 더 나아가, 기술적 측면 (즉, 비-독성 및 소화가능함) 및 실현가능한 소비자 허용가능한 측면 (즉, 소비자에게 허용가능한 텍스처 및 식감을 가짐) 둘 다로부터, 식용인 멤브레인을 제조하는 것은 관련 기술분야에서 달성되지 않았다. 플랫 쉬트 (예를 들어, 나노 다공성 멤브레인)이든 섬유 (예를 들어, 중공 섬유)이든 막론하고, 이러한 멤브레인의 생성은 달성하기 힘들었다. 필요한 것은 세포 배양에 적합하고 식용인 멤브레인-기반 생물반응기에 사용하기 위한 높은 완전성의 멤브레인이다.

본 발명자들은 인간 및 동물 소비를 위한 식품의 생성을 위한 생물반응기에 사용하기 위한 필수 구조적 완전성을 갖는, 예를 들어, pH 유도 상 분리 또는 양성자 유도 상 분리에 의해 멤브레인 (즉, 멤브레인 필름 및 섬유)을 제조하는 신규하고 비-자명한 방법을 개발하였다. 멤브레인은 GRAS 물질로 제조되고, 자기-지지적이며 (즉, 그 자체로 붕괴되지 않고, 취급시 또는 생물반응기에서의 배양 조건에 의해 필요한 유체력에 노출되는 경우 쉽게 찢어지거나 쉽게 뜯어지지 않음), 기술적 및 실현가능한 소비자 허용가능한 측면 둘 다로부터 식용이다.

본 발명의 멤브레인은, 가장 넓은 실시양태에서, 1종 이상의 식물 또는 동물 단백질, 1종 이상의 식용 폴리사카라이드, 및, 임의로, 1종 이상의 폴리사카라이드 가교제를 포함한다. 단백질(들), 폴리사카라이드(들) 및 임의적 가교제(들)는 공동-혼합되고, 형성 조 내로 압출된다. 형성 조는 멤브레인에서 폴리사카라이드의 가교를 제공하는 1종 이상의 이온 (즉, 양이온 또는 음이온)을 함유한다. 추가적으로, 본 발명의 일부 측면에서, 형성 조에서의 pH 변화는 상 분리 유도된 멤브레인 형성을 제공한다.

본 발명자들은 멤브레인에서의 폴리사카라이드의 가교가 특히 세포 배양 조건 하에서 적절한 멤브레인 완전성을 보장하는데 종종 불충분함을 경험적으로 알았다 (예시 참조). 본 발명자들은 필수 완전성을 멤브레인에 부여하는 공정을 추가로 발명하였다. 형성 조에서의 멤브레인의 형성 후, 멤브레인은 이어서 에너지 공급원, 예컨대 열 또는 조사에 노출된다. 이론에 제한되지는 않지만, 본 발명자들은 에너지 공급원에의 노출이 멤브레인에서 폴리사카라이드 및/또는 단백질의 가교를 제공함으로써, 소비자 허용성을 위해 필요한 품질을 유지하면서 필수 완전성을 멤브레인에 제공한다고 믿고 있다.

또한, 식품에 사용하기 위한 멤브레인을 제공하는 것에 관한 고려사항으로, 선행 기술의 화학적 가교 기술은 본 출원에 대해서는 회피될 필요가 있을 독성 화합물을 종종 사용한다. 대안적으로, 선행 기술의 중합체 변형 기술은 가교 부위를 증가시키기 위해 사용될 수 있지만, 규제적 과제와 충돌할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 멤브레인은 예를 들어, 세포 부착 및 세포 성장을 향상시키기 위해, 1종 이상의 작용제로 코팅되거나 다른 방식으로는 변형될 수 있다. 멤브레인은 열 또는 조사에의 노출 전에 또는 후에 코팅될 수 있다.

형성, 에너지 공급원에의 노출 및 임의적 코팅 후, 멤브레인은 부분적으로 건조되고/거나 저장되거나, 추가의 프로세싱에 적용될 수 있다 (예를 들어, 크기에 맞게 절단되고, 생물반응기 카트리지 또는 캡슐 내로 혼입됨으로써).

따라서, 본 발명은 예를 들어, 구조화된 청정 육류 생성물의 생성을 위해 멤브레인 생물반응기 (필름 또는 섬유-기반)에서 사용하기 위한 식용 3D 나노 및 마이크로 다공성 구조에 관한 것이다. 배양 배지는 멤브레인을 통해 통과하여 멤브레인의 하나 또는 둘 다의 표면 상에 세포를 공급한다. 부착성 세포를 위한 선행 기술의 중공 섬유 멤브레인 생물반응기가 존재하지만, 세포를 제거하기 위해 트립신 또는 다른 화학적/효소적 단계가 요구된다. 이는 상업적 규모 청정 육류 생성을 위해 너무 고비용이고, 또한, 임의의 조직-유사 구조를 파괴한다. 따라서, 본 발명은 배양된 육류 생성물의 생성에 사용되는 육류 세포와 함께 소비되는 멤브레인을 고려한다. 본 발명은 적어도 부분적으로 용해가능한 멤브레인을 추가로 고려한다. 이 측면은 예를 들어, 최종 구조화된 육류 생성물에 대한 목적하는 텍스처를 달성하기 위해 필요할 수 있다.

부착성 세포 스캐폴드에 대한 식품-기반 물질은 관련 기술분야에 기재되었다. 그러나, 이들 물질 형식은 (중공 섬유) 멤브레인 생물반응기에는 적합하지 않다. 이들 물질 형식은 통상적으로 비-다공성 필름, 섬유-기반 매트 (예컨대 전기방사 또는 회전 제트 방사), 또는 스폰지 (통상적으로 동결 건조, 압출 공정, 및/또는 발포 공정으로부터 유래됨)이다.

멤브레인 생물반응기는 특정한 멤브레인 기하구조를 갖는 매우 특정한 기공 크기를 요구한다. 중공 섬유 생물반응기 (HFBR)는 전형적으로 5KDa 내지 0.1μm의 기공 크기를 갖는다 - 세포 유형, 생물반응기 디자인 및 생물공정에 따라.

본 발명은 중공 섬유를 고려하지만, 본 발명의 일반적 개념은 플랫 쉬트 (필름-유사) 멤브레인에도 또한 적용될 수 있다. 쉬트 멤브레인은 예를 들어, 중합체를 희생 표면 상으로 캐스팅함으로써 형성되고, 이는 이어서 중합체의 고화를 위해 디자인된 조로 들어간다. 중공 섬유는 노즐/방사돌기로부터 조 내로 방사됨으로써 형성된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 중공 섬유를 생성할 때, 보어(bore) 유체는 또한 정확하게 결정되고 제어되어야 한다. 쉬트 멤브레인 및 중공 섬유 생성에 관한 추가의 상세사항이 이어진다.

본 발명자들이 본 발명의 멤브레인을 생성하기 위해 발명한 방법은 다수의 단계를 이용한다. 인간 영양적 고려사항 및 세포 부착성 고려사항을 위해, 높은 단백질 함량이 바람직하다. 그러나, 단백질의 분자량은 일반적으로 너무 낮아서 섬유 형성 특성을 위한 충분한 쇄 얽힘 또는 구조적 완전성을 제공할 수 없다. 이 때문에, 추가적인 "캐리어" 중합체가 멤브레인 중합체에 첨가된다 (즉, 도프(dope) 용액). 본원에 교시된 바와 같이, 캐리어 중합체는 예를 들어, 알기네이트, 셀룰로스, 펙틴, 키틴, 키토산, 겔란 검, 크산탄 검, 아라비녹실란, 글루코만난 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타의 것들 중 1종 이상으로부터 선택되는 폴리사카라이드이다.

단백질(들) 및 폴리사카라이드(들)는 GRAS 용매의 블렌드에서 혼합된다. 1종 이상의 단백질 및 1종 이상의 폴리사카라이드가 선택되고, 그의 혼합물이 형성되면, 이들은 캐스팅되는 멤브레인의 치수를 즉각적으로 또는 거의 즉각적으로 가두어 두기 위해 고화 (형성) 조에서 고화된다. 실시양태에서, 조는 다가 양이온, 예컨대, 예를 들어, Ca2+, Mg2+, 또는 유사한 것을 함유함이 고려된다. 구체적으로, 본 발명자들에 의해 입증된 것은 Ca2+가 멤브레인에서 알기네이트, 펙틴 또는 다른 폴리사카라이드를 즉각적으로 가교할 것이라는 것이었다. 이는 섬유/쉬트의 치수를 고정시켜, 목적하는 3차원 표적을 달성한다.

그러나, 이 시점에서, 단백질은 가교되지 않고, 폴리사카라이드는 단지 이온적으로 가교된다. 문헌에 기재되고 실시에서 발견된 바와 같이, 이온적으로 가교된 폴리사카라이드는 세포 배양 배지에서 해리될 수 있다. 따라서, 멤브레인의 안정성을 추가로 증가시키고 세포 배양을 위해 사용할 경우 그의 완전성을 보장하기 위해 추가 가교 단계가 요구된다. 가혹한 화학물질이 공유 가교에 요구되기 때문에, 이 접근법은 식용 생성물에 대해서는 바람직하지 않다. 본 발명의 혁신은 물리적 가교를 사용하는 것이며, 상기 물리적 가교는 에너지 공급원, 예컨대 열, 감마, e-빔, 베타, x-선, 또는 UV 중 1종 이상을 통해 생성된다. 이들은 식품 산업에서 잠재적 병원체를 죽이거나 약화시키는데 사용되기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 식품 생성물에 사용하기 위해 안전한 것으로 이해된다.

대안적 접근법은 식품 용도를 위해 이미 승인된 단백질에 대한 가교제, 예컨대 트랜스글루타미나제를 사용하는 것임이 본 발명에 의해 추가로 고려된다. 단백질을 가교시키는 것에 추가적으로 또는 그 대신에 중합체 상의 잠재적 가교 부위를 증가시키기 위해 폴리사카라이드(들)는 혼합물을 생성하기 전에 변형될 수 있음이 또한 추가로 고려된다.

본 발명은 다른 접근법, 예컨대 단백질을 알콜/물 블렌드 내로 직접적으로 용해시키고, 멤브레인을 산 조에서 고화시키는 것을 추가로 고려한다. 본 발명은 식물 단백질 단리물을 알칼리성 용액에서 용해시키고, 이어서 알콜과 같은 유기 응고제 또는 중화 산/부식성 용액으로 고화시키는 것을 또한 추가로 고려한다. 예를 들어, 키토산을 5% 아세트산에서 용해시키고, 보다 높은 pH 조 내로 압출시키는 경우, 중합체는 섬유의 형상으로 고화될 것이다.

키토산은 또한 약간 산성 조 (약 5% 아세트산, 시트르산, 또는 유사한 것)에서 용해되고, 이어서 고화된 키토산의 다공도를 지키고/거나 유지할 트리폴리포스페이트/ 나트륨 트리폴리포스페이트 (TPP)의 일부 농도를 함유하는 조에서 침착/방사될 수 있다. 보어 유체는 또한 조 용액과 유사한 용액을 함유할 수 있다.

폴리사카라이드 및 단백질 블렌드 내에 있는 식물 단백질의 가교를 돕는 보어 유체 (고체 또는 중공 섬유를 형성할 때 노즐 보어에서 사용되는 유체; 보어 유체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있음) 및/또는 형성 조에 첨가되는 화학적 또는 효소 가교제가 또한 첨가될 수 있다. 조 또는 보어 유체에 임의로 포함될 수 있는 가교제의 예는 트랜스글루타미나제, 트리폴리포스페이트, 게니핀 (게니핀은 게니파 아메리카나(Genipa americana) 과실 추출물에서 발견되는 화학적 화합물임), 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 산화 효소이다.

본 발명의 또 다른 측면은 도프 용액 (즉, 단백질, 폴리사카라이드 혼합물)이 비-가용성 (적어도 사용된 용매 시스템에서) 섬유로 함침될 수 있다는 것이다. 이들 섬유는 예를 들어, 박테리아 나노셀룰로스, 나노셀룰로스, 또는 다른 적합한 섬유일 수 있다. 이들 섬유는 2가지 기능을 할 수 있는데, 첫번째는 응력 변형도 곡선 차트에 의해 정의된 바와 같은 증가된 "강인성"을 제공할 기계적 강화이다. 이들 섬유의 두번째 기능은 근관 정렬을 촉진시키는 것일 것이다. 압출 동안, 이들 섬유는 그 자신을 중공 섬유와 자연적으로 정렬하고, 중공 섬유 멤브레인의 표면에 있는 섬유는 거기에서 성장된 세포의 정렬을 촉진시킬 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 섬유 자체의 기하구조 및 토포그래피이다. 바람직하게는, 섬유는 약 300 내지 약 700 마이크로미터의 외경을 갖는다. 섬유 길이와 평행한, 실질적으로 평행한, 또는 본질적으로 평행한 줄무늬 또는 홈은 목적하는 구조적 특색일 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 제조된 섬유 내로 짜 넣어질 수 있다. 섬유를 따른 줄무늬 또는 홈은 도프 용액 제제화 및 혼합을 통해, 노즐 기하구조를 통해, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의한 형성 조의 난류를 통해 방사 공정 내로 짜 넣어질 수 있다.

공정에서의 또 다른 단계는 멤브레인 또는 섬유의 표면을 변경시키거나 멤브레인 또는 섬유를 코팅하는 목적하는 화학적 공정 또는 화합물을 사용함으로써 멤브레인 및 섬유 상의 세포 부착성을 증가시킬 수 있음이 추가로 고려된다. 적합한 공정 및 화합물의 예는 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질, 또는 RGD, YIGSR, IKVAV, DGEA, PHRSN, PRARI 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그러한 단백질로부터 단리된 짧은 펩티드 서열의 첨가를 통해 세포 결합 부위를 첨가하는, 플라스마 처리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

세포 부착을 넘어 표적 적용을 위해 적용될 수 있는 코팅이 또한 고려된다. 헤파린은 섬유 표면에서 성장 인자 농도를 증가시킬 수 있다. 세포 분화를 도울 화합물은 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, 높은 지질 함량을 갖는 코팅은 적합한 세포의 지방세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

비-생물학적 (즉, 목적하는 세포의 성장 및 유지와 직접적으로 관련되지 않는) 결과에 관련된 코팅(들)은 또한 고려된다. 보존제 및/또는 항생제는 배양 전에 및 동안 부패를 방지하거나 무균성 환경을 유지하는데 사용될 수 있다. 염료, 안료, 베타-카로텐 등은 목적하는 외관을 제공하기 위해 코팅으로서 또는 섬유 도프 용액 내로 직접적으로 적용될 수 있다. 유사하게, 향미제 및 착향제는 목적하는 향미 프로파일을 제공하기 위해 코팅으로서 또는 섬유 도프 용액 내로 직접적으로 적용될 수 있다. 가소제 (예를 들어, 당 알콜, 예컨대 소르비톨 및 글리세롤)는 또한 코팅으로서 또는 도프 용액 내로 또는 보어 유체 내로 직접적으로 적용될 수 있다. 가소제는 취급성을 증가시키고, 기공 붕괴를 최소화화고, 저장 수명을 연장시킬 뿐만 아니라 식감을 변경시킬 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 멤브레인 (중공 섬유 및 쉬트 멤브레인)을 포함한다.

본 발명은 a) i) 1종 이상의 식용 단백질, ii) 1종 이상의 식용 폴리사카라이드, iii) 1종 이상의 용매 및 iv) 형성 조를 제공하는 단계로서, 여기서 1종 이상의 용매 또는 형성 조는 또한 1종 이상의 다가 양이온 또는 음이온을 포함하는 것인 단계; b) 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 식용 단백질 및 1종 이상의 식용 폴리사카라이드를 공동-혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; c) 혼합물을 형성 조 내로 압출시켜 압출된 중공 섬유를 형성하거나, 또는 혼합물을 형성 조 상으로 캐스팅하여 멤브레인 쉬트를 형성하는 단계; 및 d) 압출된 중공 섬유 또는 멤브레인 쉬트를 1종 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 가교시키는데 충분한 열 및 조사 중 1종 이상으로부터 선택되는 에너지 공급원에 노출시켜 가교된 식용 다공성 중공 섬유를 형성하는 단계를 포함하는, 가교된 식용 다공성 중공 섬유 및 멤브레인 쉬트를 제조하는 방법을 고려한다.

본 방법은 1종 이상의 단백질이 완두콩, 대두, 밀, 호박, 쌀, 현미, 해바라기, 카놀라, 병아리콩, 렌틸, 녹두, 흰강낭콩, 옥수수, 귀리, 감자, 퀴노아, 수수 및 땅콩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 1종 이상의 폴리사카라이드가 아가, 키토산, 키틴, 알기네이트, 알긴산나트륨, 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 겔란 검, 크산탄 검, 펙틴, 타피오카, 구아 검 및 빈 검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 1종 이상의 용매가 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산, 수산화나트륨, 에탄올, 글리세린 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 이온이 Ca2+, Mg2+, Fe3+, Zn2+, 트리폴리포스페이트 및 시트르산삼나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 선택된 이온이 1종 이상의 폴리사카라이드의 부분 가교를 적어도 가능하게 할 수 있는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 열이 약 0 PSI 내지 약 20 PSI 게이지의 압력 하에서, 약 50% 내지 약 100%의 상대 습도에서, 약 2 내지 약 60분 동안 적용된 약 120 ℃ 내지 약 140 ℃이거나, 또는 섬유가 대기 조건에서 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃인 수조에서 침지되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 조사가 전자 빔, UV 광 및 감마 조사로 이루어진 군으로부터 선택되고, 조사가 공정 중에 또는 공정 후에 적용되고, 조사가 약 1 내지 약 100 kGy 또는 약 10 내지 약 50 kGy인 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 중공 섬유 또는 멤브레인 쉬트의 다공도가 약 1% 내지 약 90% 또는 약 50% 내지 약 80%인 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 방법이 가교된 식용 다공성 중공 섬유를 코팅으로 코팅하여 세포 부착을 향상시키는 것을 추가로 포함하는 것임을 고려한다.

본 방법은 코팅이 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴 또는 그러한 단백질로부터 단리된 짧은 펩티드 서열 중 1종 이상으로부터 선택되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 짧은 펩티드 서열이 RGD, YIGSR, IKVAV, DGEA, PHRSN 및 PRARI로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 방법이 가교된 식용 다공성 중공 섬유의 외표면을 변형시켜 세포 부착을 증가시키는 것을 추가로 포함하고, 표면 변형이 플라스마, 코로나, 연마, 식각, 삭마, 또는 스퍼터 코팅 중 1종 이상으로부터 선택되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 단백질이 용매에서의 그의 용해 전에 분말화되거나 미세 분쇄되는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 단백질이 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 순수한 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 폴리사카라이드가 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 순수한 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 10:1 내지 대략 1:10이거나, 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 4:1 내지 대략 1:4인 것임을 추가로 고려한다. 본 방법은 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 1:1인 것임을 추가로 고려한다. 본 방법은 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 1:7 또는 대략 7:1인 것임을 추가로 고려한다. 일부 경우에 단백질 및 폴리사카라이드 사이의 고체 비는 100:1 또는 대략 1:100, 또는 배타적으로 100% 단백질 단리물이다.

본 방법은 형성 조가 예를 들어, 정확하게 또는 대략 15g/L의 농도의 용해된 염화칼슘을 갖는 RO (역삼투) 물을 포함하는 것임을 추가로 고려하지만, 목적하는 농도는 약 4g/L 내지 약 20g/L, 약 12 g/l 내지 약 18 g/L 또는 약 14 g/L 내지 약 16 g/L일 수 있다. 연속 공정에서, 형성 조는 공급 또는 블리딩 시스템을 가질 것이고, 여기서 제조된 15g/L 염화칼슘은 조의 측 내로 공급되고, 여기서 조는 동일한 속도로 블리딩된다.

본 방법은 형성 조가 i) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 ii) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 갖는 RO 물을 포함하는 것임을 추가로 고려한다.

본 방법은 a) i) 1종 이상의 식용 단백질, ii) 1종 이상의 식용 폴리사카라이드, iii) 1종 이상의 용매 및 iv) 형성 조를 제공하는 단계로서, 여기서 형성 조는 우세하게는 물이고, 1) 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 또는 다른 적합한 산 중 1종 이상, 또는 2) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 또는 다른 적합한 염기 중 1종 이상과 조합으로, 염화칼슘, 염화아연, 마그네슘 이온, 칼륨 중 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 단계; b) 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 식용 단백질 및 1종 이상의 식용 폴리사카라이드를 공동-혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; c) 혼합물을 형성 조 내로 압출시켜 압출된 중공 섬유를 형성하거나, 또는 혼합물을 조 상으로 캐스팅하여 멤브레인 쉬트를 형성하는 단계; 및 d) 압출된 중공 섬유 또는 멤브레인 쉬트를 1종 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 가교시키는데 충분한 열 및 조사 중 1종 이상으로부터 선택되는 에너지 공급원에 노출시켜 가교된 식용 다공성 중공 섬유를 형성하는 단계를 포함하는, 가교된 식용 다공성 중공 섬유 및 멤브레인 쉬트를 제조하는 방법을 고려한다. 이 실시양태에서, 형성 조는 이온으로 보충된다.

본 방법은 추가로 본 발명의 방법에 의해 제조된 임의의 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인 (즉, 멤브레인 쉬트)에 관한 것이고, 이를 고려한다.

본 발명은 추가로 멤브레인 또는 본 발명으로 생성된, 청정 육류, 구조화된 육류, 배양된 육류, 실험실에서 성장된 육류, 재배된 육류, 세포-기반 육류 등, 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 a) i) 1종 이상의 식용 단백질, ii) 1종 이상의 용매 iii) 형성 조를 제공하는 단계로서, 여기서 1종 이상의 용매 또는 형성 조는 또한 1종 이상의 다가 양이온 또는 음이온 또는 완충 용액을 포함하는 것인 단계; b) 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 식용 단백질을 공동-혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; c) 혼합물을 형성 조 내로 압출시켜 압출된 중공 섬유를 형성하거나, 또는 혼합물을 형성 조 내로 캐스팅하여 쉬트 멤브레인을 형성하는 단계; 및 d) 압출된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 1종 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 가교시키는데 충분한 열 및 조사 중 1종 이상으로부터 선택되는 에너지 공급원에 노출시켜 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 형성하는 단계를 포함하는, 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 제조하는 방법에 관한 것임이 고려된다.

본 발명의 방법은 1종 이상의 식용 폴리사카라이드를 제공하고, 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 폴리사카라이드를 1종 이상의 식용 단백질과 공동-혼합하는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 가소제를 제공하고, 1종 이상의 용매에서 가소제를 1종 이상의 식용 단백질과 공동-혼합하는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 1종 이상의 단백질이 완두콩, 대두, 밀, 호박, 쌀, 현미, 해바라기, 카놀라, 병아리콩, 렌틸, 녹두, 흰강낭콩, 옥수수, 귀리, 감자, 퀴노아, 수수 및 땅콩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 1종 이상의 폴리사카라이드가 아가, 키토산, 키틴, 알기네이트, 알긴산나트륨, 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 겔란 검, 크산탄 검, 펙틴, 타피오카, 구아 검 및 빈 검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 1종 이상의 용매가 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산, 수산화나트륨, 에탄올, 글리세린 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 형성 조가 1) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 2) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 포함하는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 상기 이온이 Ca2+, Mg2+, Fe3+, Zn2+, 트리폴리포스페이트 및 시트르산삼나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 선택된 이온이 1종 이상의 폴리사카라이드의 부분 가교를 적어도 가능하게 할 수 있는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 단계 b)의 혼합물이 가열되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 상기 형성된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인이 약 0 PSI 내지 약 20 PSI 게이지의 압력 하에서, 약 50% 내지 약 100%의 상대 습도에서, 약 2 내지 약 60분 동안 적용된 약 70 ℃ 내지 약 140 ℃ 또는 약 120 ℃ 내지 약 140 ℃로 가열되거나, 또는 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인이 대기 조건에서 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃인 수조에서 침지되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 공동-혼합이 약 0 ℃ 내지 약 90 ℃에서 수행되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 상기 혼합물이 약 10 내지 약 13의 pH이고, 상기 제제화 조가 약 3 내지 약 5의 pH인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 형성 후, 멤브레인이 약 6.8 내지 약 7.8의 pH로 중화되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 형성 후, 멤브레인이 약 7.3 내지 약 7.5의 pH로 중화되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 조사가 전자 빔, UV 광 및 감마 조사로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 조사가 공정 중에 또는 공정 후에 적용되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다. 본 발명의 방법은 조사가 약 1 내지 약 100 kGy 또는 약 10 내지 약 50 kGy인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인의 다공도가 약 1% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 75% 또는 약 40% 내지 약 60 %인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인의 다공도가 약 50% 내지 약 80%인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

방법은 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 코팅으로 코팅하여 세포 부착을 향상시키는 것을 추가로 포함하는 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 코팅이 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴 또는 그러한 단백질로부터 단리된 짧은 펩티드 서열 중 1종 이상으로부터 선택되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 짧은 펩티드 서열이 RGD, YIGSR, IKVAV, DGEA, PHRSN 및 PRARI로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 가교된 식용 다공성 중공 섬유의 외표면을 변형시켜 세포 부착을 향상시키는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다. 본 발명은 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 가소제로 코팅하는 것을 추가로 포함하는 방법에 관한 것임이 추가로 고려된다. 본 발명은 표면 변형이 플라스마, 코로나, 연마, 식각, 삭마, 또는 스퍼터 코팅 중 1종 이상으로부터 선택되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 단백질이 용매에서의 그의 용해 전에 분말화되거나 미세 분쇄되는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 단백질이 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 순수한 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 폴리사카라이드가 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 순수한 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명의 방법은 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비 (단백질:폴리사카라이드)가 대략 10:1 내지 대략 1:10 또는 대략 1:99 내지 대략 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5 또는 90:10인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다. 본 발명은 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 4:1 내지 1:4인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다. 본 발명은 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 1:1 또는 7:1인 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명은 형성 조가 i) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 ii) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 포함하는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 제조된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인에 관한 것임이 추가로 고려된다.

본 발명은 a) i) 1종 이상의 식용 단백질, ii) 1종 이상의 식용 폴리사카라이드, iii) 1종 이상의 용매 및 iv) 형성 조를 제공하는 단계로서, 여기서 형성 조는 1) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 2) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 포함하는 것인 단계; b) 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 식용 단백질 및 1종 이상의 식용 폴리사카라이드를 공동-혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; c) 혼합물을 형성 조 내로 압출시켜 압출된 중공 섬유를 형성하거나, 또는 혼합물을 캐스팅하여 쉬트 멤브레인을 형성하는 단계; 및 d) 압출된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 1종 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 가교시키는데 충분한 열 및 조사 중 1종 이상으로부터 선택되는 에너지 공급원에 노출시켜 가교된 식용 다공성 중공 섬유를 형성하는 단계를 포함하는, 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 제조하는 방법에 관한 것임이 고려된다.

본 발명은 1종 이상의 단백질, 1종 이상의 폴리사카라이드, 1종 이상의 용매, 가소제(들) 및/또는 형성 조의 1종 이상의 구성성분이 미국 식품 의약국 (FDA)에 의해 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 것인 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인의 제조를 위한 방법에 관한 것임이 고려된다.

본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 제조된 생성된 멤브레인 또는 중공 섬유가 건조하기 위해 물 중 10 - 50% 글리세롤 교체를 겪고, 상기 건조가 기공 붕괴를 발생시키지 않는 것에 관한 것임이 추가로 고려된다.

도 1은 본 발명의 멤브레인 및 중공 섬유를 생성하는데 사용된 한 공정의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 멤브레인 및 중공 섬유를 생성하는데 사용된 또 다른 공정의 개략도를 나타낸다.
도 3 (a & b)은 본 발명의 방법으로 생성된 중공 섬유 멤브레인을 나타낸다.
도 4 (a - c)는 본 발명의 방법으로 생성된 섬유의 주사 전자 현미경사진 (SEM)을 나타낸다. a는 유장 단백질 및 알기네이트 블렌드의 표면 기공이 대략 20 nm 또는 약 1000 kDa인 것으로 보여질 수 있음을 나타낸다. 이 화상은 또한 공정으로부터의 줄무늬가 섬유의 길이와 평행함을 나타낸다. b는 대략 100 nm 및 미만의 표면 기공을 갖는 호박 단백질 단리물 및 알기네이트 블렌드의 표면 기공을 나타낸다. c는 호박 단백질 단리물로 제조된 섬유의 보다 낮은 해상도 화상을 나타낸다.
도 5 a & b는 본 발명의 방법에 의해 제조된 섬유를 나타낸다. 본 발명의 중공 섬유는 그의 중량을 용이하게 지지할 수 있고, 이는 생물반응기에서 필요할 것이다. (a) 나타낸 섬유는 2 미터 길이이다. (b) 본 발명의 방법에 의해 생성된 섬유는 적어도 9 그램을 지지할 수 있다.
도 6은 우레아 및 수산화나트륨 용액으로부터의 녹두 캐스팅된 필름을 나타낸다. 화상은 닥터 블레이드 기술을 통해 유리 상으로의 녹두 도프 용액 캐스트의 것이다. 도프 용액은 응고 전에 투명한 것으로 보여질 수 있다.
도 7은 S64 스핀들이 구비된 브룩필드(Brookfield) (미국 매사추세츠주 미들보로) 점도계를 사용한 점도를 나타낸다. 2% 알기네이트 및 10 % 단백질 단리물의 점도가 표시된다. 각각의 믹스는 측정 전에 11 pH로 조정된 pH를 가졌다.
도 8은 양으로 표시된 단순한 디자인 플롯을 나타낸다. 이는 수산화나트륨을 갖는 우레아, 에탄올, 및 물을 조사하는 미니탭(Minitab) (미국 펜실베니아주 스테이트 칼리지)을 사용한 실험의 디자인이다.
도 9는 도 8로부터의 용매 블렌드 중 15% 제인의 온도 스위프를 나타낸다. 12.5%만큼 낮은 에탄올을 갖는 용매 시스템은 제인을 용해시킬 수 있음을 나타낸다.
도 10은 물 중 동일한 아가로스와 비교할 경우, 도 8로부터의 용매 조건을 사용함으로써, 아가로스의 겔화 특성이 변경될 수 있음을 나타낸다.
도 11은 주어진 혼합 온도 범위 내에서, 제인 및 아가로스가 도 8로부터의 주어진 용매 시스템; 특히 40℃ 초과로 양쪽 성분의 고화 없이 블렌딩될 수 있음을 나타낸다.
도 12a & b는 필름 캐스팅 단계 (a: 좌측) 및 아세테이트 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 중에서의 응고 단계 (b: 우측)로 이루어진 제인 멤브레인 생성 공정의 화상을 나타낸다.
도 13은 1시간에 걸쳐 120 ℃에서 설정된 고온 글리세롤 조를 사용한 녹두 알기네이트 멤브레인의 가교 단계를 나타낸다.
도 14a & b는 멤브레인의 탄성 모듈러스 (a: 좌측) 및 변형도 (b: 우측)를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 15a & b는 각각 다양한 조직 (a: 좌측) 및 본 발명의 예시적인 멤브레인 물질 (b: 우측)의 탄성 모듈러스를 나타낸다.
도 16은 각각의 생성 단계를 탐구하고 입증하기 위한 상이한 제조 프로토콜에 따라 생성된 멤브레인의 화상 (1 - 6)을 나타낸다. AC는 "아세테이트 조 0.2 M, pH 4.5"를 나타내고, H는 "HEPES 완충액" (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 조 0.1 M, pH 7.4를 나타내고, G는 "글리세롤 조"를 나타내고, HG는 "고온 글리세롤 조"를 나타내고, HW는 "온수" (오토클레이브)를 나타내고, 0는 "단계가 수행되지 않음"을 나타낸다.
도 17a & b는 각각 멤브레인의 탄성 모듈러스 (a: 좌측) 및 파단 변형도 (b: 우측)를 나타낸다. 샘플 6은 프로토콜 AC-0-G-HG에 따라 생성되고, 5는 프로토콜 AC-0-0-HG에 따라 생성되고, 2는 프로토콜 AC-0-0-HW에 따라 생성된다.
도 18a - c는 열 처리된 (글리세롤-기반 프로토콜) 녹두 멤브레인에 대한 아세트산 조에서의 응고 시간의 증가시 탄성 모듈러스 (a; 좌측), 변형도 (b: 중앙) 및 최종 응력 (c: 우측)의 변화를 나타낸다. 도면은 10분 내지 3시간 동안 응고된 멤브레인의 기계적 특성을 나타낸다.
도 19a - c는 녹두 멤브레인에 대한 글리세롤-기반 열 처리 시간의 증가시 탄성 모듈러스 (a: 좌측), 변형도 (b: 중앙) 및 최종 응력 (c: 우측)의 변화를 나타낸다. 응고 조 (10분) 및 물-글리세롤 교체 (10분) 둘 다의 지속기간을 일정하게 유지하고, 120 ℃의 최종 온도에 도달한 후 열 처리 지속기간을 달리 함으로써 글리세롤-기반 열 처리를 조사하였다.
도 20은 글리세롤을 사용한 녹두 멤브레인의 열처리에 대한 유동학 조사를 나타낸다. 그래프는 온도 구배에 걸친 Tan 델타 (δ)의 변동을 나타낸다.
도 21a - c는 녹두 멤브레인에 대한 글리세롤-기반 열 처리 시간의 증가시 a) 탄성 모듈러스, b) 변형도 및 c) 최종 응력의 변화를 나타낸다.
도 22는 37 ℃ 세포-배지에서 인큐베이션된 경우, 밀 글루텐, 녹두 및 제인을 포함하는 알기네이트 및 글루텐 단백질 블렌드에 대한 탄성 모듈러스 값을 나타낸다. 기계적 장력 측정을 3, 10, 및 21일의 인큐베이션 전후에 취하였다.
도 23은 37 ℃ 세포-배지에서 인큐베이션된 경우, 밀 글루텐, 녹두 및 제인을 포함하는 알기네이트 및 글루텐 단백질 블렌드에 대한 파단 변형도 값을 나타낸다. 기계적 장력 측정을 3, 10, 및 21일의 인큐베이션 전후에 취하였다.
도 24는 37 ℃ 세포-배지에서 인큐베이션된 경우, 밀 글루텐, 녹두 및 제인을 포함하는 알기네이트 단백질 블렌드에 대한 멤브레인 표면적을 나타낸다. 측정을 3, 10, 및 21일의 인큐베이션 전후에 취하였다.
도 25는 37 ℃에서 세포-배지에서 인큐베이션된 경우, 밀 글루텐, 녹두 및 제인을 포함하는 아가로스 단백질 블렌드에 대한 멤브레인 표면적을 나타낸다. 측정을 3, 10, 및 21일의 인큐베이션 전후에 취하였다.
도 26a & b는 37 ℃에서 세포 배지에서 3, 10 및 21일의 인큐베이션 전후에, 트랜스글루타미나제 가교의 존재 및 부재 하에 제조된 현미-알기네이트 블렌드 사이의 a) 탄성 모듈러스 및 b) 변형도의 비교를 나타낸다.
도 27a - f는 대두 단백질 단리물 (a - c: 상부) 및 녹두 (d - f: 하부)를 포함하는 단백질 멤브레인의 탄성 모듈러스 (a & d: 좌측), 파단 변형도 값 (b & e: 중앙) 및 표면적 (c & f: 우측)을 나타낸다. 측정을 대두 단백질 단리물에 대해 37 ℃에서 세포 배지에서 3, 10 및 21일의 인큐베이션 전후에 및 녹두에 대해 37 ℃에서 세포 배지에서 5, 12 및 30일의 인큐베이션 전후에 취하였다.
도 28은 대두 단백질 단리물 멤브레인 표면 (상부) 및 단면 (하부)의 주사 전자 현미경검사 화상을 나타낸다.
도 29는 녹두 단백질 단리물 멤브레인 표면 (상부) 및 단면 (하부)의 주사 전자 현미경검사 화상을 나타낸다.
도 30은 제인 단백질 단리물 멤브레인 표면 (상부) 및 단면 (하부) 및 제인 단백질 단리물 & 아가로스 멤브레인 표면 (상부) 및 단면 (하부)의 주사 전자 현미경검사 화상을 나타낸다.
도 31은 제인-알기네이트 (좌측) 및 완두콩 단백질-k-카라기난 (우측) 멤브레인의 표면 및 단면의 주사 전자 현미경검사 화상을 나타낸다.
도 32는 녹두-아가로스 (좌측) 및 대두-알기네이트 (우측) 멤브레인의 표면 및 단면의 주사 전자 현미경검사 화상을 나타낸다.
도 33은 녹두-알기네이트 중공 섬유 단면 (상부) 및 표면 (하부)의 주사 전자 현미경검사를 나타낸다.
도 34는 C2C12 세포주를 사용한, 제인, 대두, 녹두 TG-가교된 녹두 멤브레인 상에서 수행된 형광 세포 부착 및 증식 연구를 나타낸다. 48시간의 성장 기간 후에 수행된 라이브 (녹색)/데드 (적색) 검정. 현미경사진은 적색 염색이 거의 없음을 보여주며, 이는 거의 모든 세포가 살아 있음을 지시한다.
도 35는 C2C12 세포주를 사용한, 피브로넥틴-, 콜라겐- 및 키토산-코팅된 녹두 멤브레인 및 키토산 멤브레인 상에서 수행된 세포 형광 부착 및 증식 연구를 나타낸다. 48시간의 성장 기간 후에 수행된 라이브 (녹색)/데드 (적색) 검정. 현미경사진은 적색 염색이 거의 없음을 보여주며, 이는 거의 모든 세포가 살아 있음을 지시한다.
도 36은 C2C12 세포주를 사용한, 열 처리된 및 비-열 처리된 대두-알기네이트, 땅콩-알기네이트 및 제인-아가로스 멤브레인 상에서 수행된 형광 세포 부착 및 증식 연구를 나타낸다. 48시간의 성장 기간 후에 수행된 라이브 (녹색)/데드 (적색) 검정. 현미경사진은 적색 염색이 거의 없음을 보여주며, 이는 거의 모든 세포가 살아 있음을 지시한다.
도 37은 QM7 세포주를 사용한, 대두, 피브로넥틴- 및 콜라겐-코팅된 녹두 및 키토산 멤브레인 상에서 수행된 형광 세포 부착 및 증식 연구를 나타낸다. 48시간의 성장 기간 후에 수행된 라이브 (녹색)/데드 (적색) 검정. 현미경사진은 적색 염색이 거의 없음을 보여주며, 이는 거의 모든 세포가 살아 있음을 지시한다.
도 38은 알기네이트:녹두-기반 멤브레인에 대한 건조 및 재수화의 효과를 나타낸다.

구조화된 육류 생성물

본 발명은 예를 들어, 구조화된 청정 육류의 생성을 위한 생물반응기에 사용하기 위한 적합한 완전성의 중공 섬유를 포함하지만 이에 제한되지 않는 식용 멤브레인, 및 이를 사용한 구조화된 청정 육류의 생성 방법 및 본 발명의 중공 섬유로 생성된 구조화된 청정 육류를 고려한다. 청정 육류 (또한 관련 기술분야에서 "배양된 육류" 또는 "실험실에서 성장된 육류"로 공지됨)는 실험실, 공장 또는 세포의 대규모 배양에 적합한 다른 생산 시설에서 세포로부터 성장된 육류 또는 육류-유사 생성물 (본원에서 총체적으로 "청정 육류" 또는 "청정 육류 생성물"로 지칭됨)로서 관련 기술분야에서 정의된다.

"구조화된 육류 생성물", "구조화된 청정 육류 생성물," "구조화된 배양된 육류" 또는 "구조화된 배양된 육류 생성물"은 동물로부터의 자연 육류와 같은, 그와 유사한 또는 그를 연상시키는 텍스처 및 구조를 갖는 육류 생성물 또는 청정 육류 생성물을 의미한다. 본 발명의 구조화된 육류 생성물은 1) 텍스처 및 외관에서, 2) 조리 및 소비를 위해 준비 중일 때 (예를 들어, 슬라이싱, 분쇄, 조리 중일 때 등)의 취급성에서, 및 3) 사람에 의해 소비될 때의 식감에서 자연 육류와 유사한 텍스처 및 구조를 갖는다. 본 발명의 물질 및 방법은, 구조화된 청정 육류의 생성에서 사용되는 경우, 이들 기준 중 적어도 하나, 이들 기준 중 두 가지 또는 이들 기준 세 가지 모두를 달성한다. 선행 기술은 이들 기준 중 임의의 것을 충분히 충족시키는 구조화된 육류 생성물을 생성할 수 없다.

본 발명의 구조화된 육류 생성물은 적합한 세포 (하기에서 논의됨)를 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 생물반응기 (또한, 하기에서 논의됨)에서 배양함으로써 이들 기준을 충족시킨다. 본 발명의 중공 섬유는, 적어도 상당한 부분에서, 생성물의 목적하는 외관, 취급성 및 식감을 제공하는 구조 및 텍스처를 최종 구조화된 청정 육류 생성물에 제공한다. 또한, 본 발명의 중공 섬유는 구조화된 청정 육류 생성물로의 세포의 성장을 위한 적합한 환경을 제공하는 것을 돕는다. 이와 관련하여, 본 발명의 중공 섬유는, 배양된 세포의 부착, 세포의 근세포 또는 근세포-유사 세포와 유사한 (즉, 구조 및 외관에 있어서 근세포와 실질적으로 유사한) 모폴로지로의 연신, 및 근세포의 근소관 또는 근소관-유사 구조 (즉, 구조 및 외관에 있어서 근소관과 실질적으로 유사함)로의 형성에 적합한 적어도 하나의 표면을 제공한다.

본 발명의 멤브레인의 생성

본 발명에서 용어 "멤브레인" 또는 "멤브레인들"은 중공 섬유 멤브레인 및 쉬트 (즉, 플랫) 멤브레인을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 발명의 방법에 의해 생성된 임의의 다공성 멤브레인 구조를 지칭함이 이해된다. 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, "멤브레인", "중공 섬유", "중공 섬유 멤브레인" 및 "쉬트 멤브레인"에 대한 언급은 형상, 형태 또는 외관과 무관하게 본 발명의 방법에 의해 생성된 임의의 멤브레인 구조를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

예시적인 생성 공정은 도 1 & 2에 개략적 형태로 나타내어진다.

본 발명의 식용 및/또는 용해가능 중공 섬유 및 쉬트 멤브레인은 히드로콜로이드 (즉, 폴리사카라이드, 예컨대 크산탄, 메틸 셀룰로스(들), 알기네이트, 아가, 펙틴, 젤라틴, 카라기난, 셀룰로스/겔란/구아/타라/빈/다른 검), 단백질 (예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질 및 아미노산; 예를 들어, 다양한 전분 (옥수수/감자/쌀/밀/수수), 식물 단리물 (예를 들어, 대두/제인/카세인/밀/녹두 단백질), 지질, (예를 들어, 유리 지방산, 트리글리세리드, 천연 왁스, 및 인지질), 알콜 (예를 들어, 폴리알콜), 탄수화물 및 다른 천연 물질, 예컨대 알기네이트 중 1종 이상으로부터 제조됨이 고려된다. 또한, 세포 부착 및 세포 성장을 돕는 다른 물질이 중공 섬유에 첨가되거나 중공 섬유 상에 코팅될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 중공 섬유 첨가제 또는 코팅은, 식물로부터 단리된 또는 보다 단순한 물질로부터 합성된 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 세포외 매트릭스 (ECM) 성분 및 추출물, 폴리-D-리신, 라미닌, 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV), 젤라틴, 피브로넥틴, 식물-기반 ECM 물질, 콜라겐-유사, 피브로넥틴-유사 및 라미닌-유사 물질을 포함하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 단백질, 히드로겔, 또는 다른 코팅 중 1종 이상임이 고려된다. 전반적 결과로, 본 발명의 섬유는 육류 및 육류 생성물의 텍스처 및 구조를 부여하여, 본 발명에 의해 생성된 구조화된 청정 육류 생성물에 실제 육류와 유사한 텍스처, 외관, 취급성 및 식감을 제공한다.

대두 및 녹두 단백질 단리물은 본 발명의 방법에 의해 생성된 멤브레인에 몇몇 목적하는 특성을 부여함이 본 발명의 발명자들에 의해 주목된다. 대두 (글리시네 막스(Glycine max)) 및 녹두 (비그나 라디아타(Vigna radiata)) 둘 다는 콩과식물 (즉, 완두콩 또는 콩)과 관련된 동일한 분류 과로부터의 것임이 본 발명자들에 의해 또한 주목된다, Fabaceae. Doyle, J. J., Leguminosae, Encyclopedia of Genetics, 2001, 1081 - 1085. 본 발명은 이론에 제한되지는 않지만, 이 과의 다른 구성원, 특히 글리시네(Glycine) 및 비그나(Vigna) 속을 포함하는 밀레티오이드(Millettioid) 및 파세올로이드(Phaseoloid)는 대두 및 녹두 단백질 단리물과 실질적으로 유사하게 작용할 것으로 믿어진다. 도 39를 참조한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 중공 섬유는 셀룰로스, 키토산, 콜라겐, 제인, 알기네이트, 아가, 이눌린, 글루텐, 펙틴, 콩과식물 단백질, 메틸 셀룰로스(들), 젤라틴, 타피오카, 크산탄/구아/타라/빈/다른 검, 단백질 (예를 들어, 모두 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는, 다양한 형태의 옥수수/감자/쌀/밀/수수 전분, 식물 단리물 및 대두/제인/카세인/밀 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질 및 아미노산), 지질, (예를 들어, 유리 지방산, 트리글리세리드, 천연 왁스, 및 인지질) 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 셀룰로스 중합체는 셀룰로스 아세테이트-부티레이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 니트로셀룰로스 등을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 중공 섬유는 1종 이상의 콩과식물 단백질 및 히드로콜로이드의 혼합물을 포함할 수 있다.

실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유는 식용, 용해가능, 또는 식용 및 용해가능함이 고려된다. 다시 말해서, 섬유는 식용 또는 용해가능 또는 이들 둘 다일 수 있다. 더 나아가, 용해가능한 섬유에 대해, 상이한 정도의 용해성이 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 섬유는 적합한 용매 (예를 들어, 미국 식품의약국 (FDA) 또는 소비성 물질의 안전성을 평가할 자격이 있다고 인정되는 다른 조직에 의해 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 비-독성 용매)에 노출시 용이하게 용해가능할 수 있다. 다른 섬유는 덜 용이하게 용해가능할 수 있다. 이와 관련하여, 덜 용이하게 용해가능한 섬유는 배양 중인 세포가 컨플루언시의 필수 수준에 도달한 후 부분적으로 용해됨으로써 본 발명의 구조화된 청정 육류에 목적하는 식감 및 텍스처를 제공하기에 충분한 섬유를 남기지만, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물이 거칠거나 질긴 것처럼 보이게 만들 수 있는 과도한 섬유를 남기지는 않을 수 있다. 용해가능 중공 섬유 구성성분은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 알기네이트는 Ca²⁺ 킬레이터에 노출시 용해가능하다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유는 섬유를 부분적으로 용해가능하게 만드는 양의 알기네이트를 포함하고/거나 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 장치 내의 섬유의 일정 비율은 알기네이트를 포함함이 고려된다.

본 발명의 실시양태에서, 1종 이상의 가교제가 본 발명의 중공 섬유에 사용됨이 고려된다. 가교제는, 명칭에서 알 수 있듯이, 섬유를 강화시키도록 중공 섬유의 다른 구성성분 중 1종 이상을 결합시킨다. 본 발명의 실시양태에서, 가교제는 용해가능 성분 또는 본 발명의 중공 섬유의 용해가능 성분 중 하나일 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 바와 같은 예시적인 가교제 및 가교 메카니즘은, 공유 결합된 에스테르 가교 (미국 특허 번호 7,247,191) 및 UV-가교 (미국 특허 번호 8,337,598) (이들 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 중공 섬유의 생성에서의 가교제의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호: 9,718,031; 8,337,598; 7,247,191; 6,932,859 및 6,755,900 (이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.

본 발명의 멤브레인 및 섬유는 단백질(들) 및 폴리사카라이드(들)의 블렌드로부터 생성된다. 단백질 대 폴리사카라이드의 비는 대략 1:99 내지 대략 99:1, 대략 1:10 내지 10:1, 대략 2:5 내지 5:2, 대략 3:7 내지 7:3, 대략 4:6 내지 6:4 또는 대략 1:1, 또는 언급된 비율 내의 임의의 비인 것으로 고려된다. 바람직한 실시양태에서, 혼합물의 단백질 함량은 폴리사카라이드 함량보다 더 높다. 바람직한 실시양태에서, 단백질 함량은 약 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 초과이다.

본 발명의 멤브레인은 추가로 강화되며, 즉, 증가된 완전성 및 강도가 주어지지만, 멤브레인에서 단백질을 가교시키는 제조 공정 단계가 포함됨이 추가로 고려된다. 본 발명자들은 본 발명의 멤브레인의 형성 후, 이들이 적절한 양의 시간 동안 적절한 수준의 에너지로 에너지 공급원에 노출되는 경우, 단백질은 적어도 부분적으로 가교됨으로써 본 발명의 멤브레인에 선행 기술의 멤브레인에 비해 증가된 완전성을 제공할 것임을 밝혀내었다. 이어지는 예시 섹션은 열 또는 조사의 존재 및 부재 하에 프로세싱된 몇몇 멤브레인 (즉, 중공 섬유 멤브레인)의 예를 제공한다. 언급된 에너지 공급원에의 노출이 추가되지 않고 생성된 중공 섬유는 에너지 공급원에의 노출을 추가하여 생성된 것들에 비해 완전성을 결여하였다.

열은 건조 또는 습식 열 중 어느 하나를 통해 공급될 수 있다. 본 발명의 한 공정은 약 50% 내지 100%의 상대 습도를 갖는 및 약 2 내지 약 60분 동안 0 psi (주위 압력) 내지 20 psi 또는 그 초과의 압력에서 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도를 이용한다. 또한, 열은 본 발명의 멤브레인 또는 섬유를 대기 조건에서 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃의 수조 내로 침지하는 것을 통해 공급될 수 있다.

본 발명의 멤브레인 및 섬유는 또한 임의의 형태의 방사선 (예를 들어, 전자 빔, 감마, UV 등)을 통해 에너지에 노출될 수 있다. 본 발명의 멤브레인 및 섬유는 약 1 내지 약 100 kGy, 약 5 kGy 내지 약 75 kGy 또는 약 10 kGy 내지 약 50 kGy로 조사될 수 있다. 본 발명의 멤브레인 및 섬유는 약 0.1분 내지 약 60분, 약 1분 내지 약 50분, 약 2분 내지 약 40분, 및 약 2분 내지 약 30분, 및 언급된 값 내에 해당하는 임의의 값 동안 상기 방사선에 노출될 수 있다.

중공 섬유 제조 기술, 특히, 및 막 제조 기술은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Vandekar, V.D., Manufacturing of Hollow Fiber Membrane, Int'l J Sci & Res, 2015, 4:9, pp. 1990 - 1994], 및 그에 인용된 참고문헌 참조). 플랫 쉬트 멤브레인과 같이, 공지된 중공 섬유 제조 방법은 전형적으로 상 분리의 일부 기술을 포함한다. 통상적인 방법 비용매 유도 상 분리는 열 유도 상 분리, 증기 유도 상 분리, 열 유도 상 분리 (예를 들어 미국 특허 번호 5,444,097 (밀리포어시그마(MilliporeSigma)) (본원에 참조로 포함됨) 참조), 또는 이들의 조합을 포함한다. 그러나, 열 압출 및 신장과 같은 다른 기술은 중공 섬유 및 멤브레인 형성을 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 비용매, 열 불안정화, 또는 용매의 제거에 의해 중합체를 용액에서 불안정화시킬 것이다. 여기에 기재된 바와 같이, 중합체 (이 경우 폴리사카라이드 및 단백질)의 용해에 이어서 다수의 가교 공정을 통한 겔화 또는 고화가 이어질 것이다. 섬유를 더욱 신장시켜 100 μm 미만의 직경 및 10 μm만큼 얇은 벽 두께를 갖는 섬유를 생성할 수 있다.

멤브레인 쉬트는 액체 중합체 용액을 그것이 켄칭 용액에 들어갈 때 고화시키고 용매를 드로잉하는 유사한 상 반전, 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2020/0368696 (밀리포어시그마) 참조), 예컨대 용매 증발 (그러나 이에 제한되지 않음)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gas Separation Membranes, Polymeric and Inorganic, Chapter 4, Ismail, et al., Springer, 2015] 및 미국 특허 공개 번호 2007/0084788 (밀리포어시그마)을 참조한다.

본 발명의 일부 측면에서, pH 유도 상 분리 ("pH 유도 상 분리" 또는 "양성자 유도 상 분리;" Satoru Tokutomi, Kazuo Ohki, Shun-ichi, Ohnishi, Proton-induced phase separation in phosphatidylserine/phosphatidylcholine membranes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA), Biomembranes, Volume 596, Issue 2, 28 February 1980, Pages 192-200.)가 본 발명의 멤브레인 (즉, 중공 섬유 및 쉬트 멤브레인)의 제조에 사용된다. pH 유도 상 분리는 하기 실시예 섹션에서 예시된다. pH에 의해 제어된 거대분자의 액체 상 분리는 세포 생리학에서 연구되지만 (Adame-Arana, O., et al., Liquid Phase Separation Controlled by pH, 2020 Oct 20;119(8):1590-1605; Epub 2020 Sep 16), 중공 섬유 및 쉬트 멤브레인 및 특히 청정 육류 또는 청정 구조화된 육류 생성물의 생성에 적합한 멤브레인의 생성에서 pH 유도 상 분리는 본 발명자들이 처음으로 이용하는 것으로 믿어진다. pH 유도 상 분리의 사용은 본 발명의 멤브레인에 대해 예상치 않고 놀라운 이익을 부여한다. 즉, 기계적 완전성, 기공 크기, 및 다공도가 통상적인 공정에 비해 향상된다.

건식 방사는 중합체를 매우 휘발성인 용매 중에 용해시키는 것을 포함한다. 용매/중합체 혼합물을 가열하고 압출 및 용매의 증발 후 중합체가 고화된다.

습식 방사는 공정이 달라질 수 있는 보다 많은 수의 파라미터를 포함하기 때문에 보다 다용성이다. 중합체 및 용매 혼합물을 비-용매 조 내로 압출하고, 여기서 용매 및 비-용매의 교체로 인해 탈혼합 및/또는 상 분리가 발생한다. 압출 및 비-용매 조 사이에는 에어 갭이 존재하며, 여기서 중공 섬유 멤브레인 형성이 시작된다.

용매의 사용을 제거하거나 최소화할 수 있는 기술은 저온 신장을 사용한 용융 방사 (MSCS)이다. 이 접근법은 비용 효율적인 생성을 제공하지만, 구조 제어 및 식품 물질의 잠재적인 열화를 희생시킬 수 있다. 이 기술에서는, 물질을 압출을 위해 가열하고 이어서 중공 섬유 벽에 기공을 기계적으로 형성하기 위해 이들이 냉각됨에 따라 당긴다. 이들 기술 세 가지 모두 폭넓게 연구되었고 관련 기술분야에 공지되어 있고 이들이 잘 요약되어 있다 (문헌 [Tan, XM. and Rodrigue, D., Polymers (Basel), 2019, Aug 5:11(8)] 참조).

이들 기술의 변형 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 다수의 중합체 및 중합체 층을 포함하는 중공 섬유의 생성을 위한 변형된 습식 방사 압출 공정이 개시되어 있는 WO 2011/108929 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 비-합성 물질로부터의 중공 섬유의 제조 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,824,569 (Suzuki) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.

구조화된 육류 생성물의 생성을 위한 본 발명의 중공 섬유 멤브레인

본 발명의 중공 섬유의 거시적 구조는, 실시양태에서, 섬유를 따르는 세포의 배향을 촉진시키는 것으로 고려된다. 이와 관련하여, 중공 섬유를 구성하는 성분 분자의 배향이 중공 섬유의 길이에 평행하게, 본질적으로 평행하게 또는 우세하게 평행하게 배향되는 것이 본 발명에 의해 요망된다. 성분 분자가 중공 섬유의 적어도 외표면 상에 세포 부착을 돕고 세포 배향을 돕는 표면 텍스처를 생성한다는 것이 추가로 고려된다. 따라서, 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유의 표면 텍스처는 세포 부착을 위한 부착점을 생성함이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 상에서 성장된 세포 (특히, 근세포, 근세포-유사 세포 또는 근세포의 특징을 갖는 세포)는 생체내에서의 근세포와 유사하게, 또한 비슷하게 중공 섬유의 길이를 따라 배향되고 연장된다는 것이 추가로 고려된다.

따라서, 스캐폴드의 표면 구조의 배향은 형성 동안 근관의 정렬에 직접적으로 상관된다. 골격근이 기존 구조를 따라 형성되기를 원하는 것처럼 생각될 수 있다. 섬유 다발이 정렬된 근관의 형성을 위해 골격근 구조를 가깝게 모방함을 구상할 수 있다. 따라서, 중공 섬유 생물반응기는 조직-유사 세포 밀도를 달성할 뿐만 아니라 다른 기술이 달성하지 못하는 근관 정렬을 달성하여, 논의된 모든 기술 중 가장 현실적인 식감을 제공한다. 하기 문헌을 검토함으로써 정렬 현상을 더 잘 이해할 수 있다: My mistake: Decellularized Apium graveolens Scaffold for Cell Culture and Guided Alignment of C2C12 Murine Myoblast - Santiago Campuzano, 2020, Ph.D. thesis, University or Ottawa, pp 58-59.

구조화된 청정 육류 생성물을 생성하는 것에 관하여, 본 발명의 중공 섬유는 본 발명에 적합할 크기 범위를 가짐이 고려된다. 본 발명의 중공 섬유는 중공 섬유 상에서 성장된 세포가 실제 육류의 그것과 유사한 밀도를 달성하고 세포 사이의 공극 공간을 최소로 갖도록 이격되어 있다는 것이 또한 고려된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유는 약 0.1 mm 내지 약 3.0 mm의 외경, 약 0% 다공도 (확산 기반의 것으로 함) 내지 약 75%의 다공도, 및 약 .008 내지 약 0.5 mm 또는 약 0.01 mm 내지 약 0.2 mm 또는 상기에 구체적으로 반복되지 않은 .008 mm 내지 0.5 mm 사이의 임의의 두께의 벽 두께를 가짐이 고려된다. 이 크기는 섬유의 루멘을 통한 배지의 수송에 적합하고 중공 섬유의 벽을 통한 배지의 적절한 유동을 허용하면서 동시에 세포 성장을 지지하고, 또한 목적하는 최종 생성물 구조, 텍스처, 취급성 및 식감을 제공하기에 충분히 강성임이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 그러나, 목적하는 구조화된 청정 육류 생성물 (예를 들어, 소고기, 가금류 고기, 생선, 돼지고기 등)에 따라, 섬유의 직경, 벽 두께 및 다공도의 변동과 관련하여 다른 실시양태가 고려되며; 이는 하기에서 논의된다.

섬유 다공도. 본 발명의 중공 섬유는 섬유의 벽을 통한 배지의 적절한 유동을 허용하면서 동시에 세포 성장 및 세포 지지에 적합한 표면을 보장하는 다공도를 가질 필요가 있다. 중공 섬유의 다공도는, 부분적으로, 중공 섬유의 벽의 두께 및 중공 섬유의 조성과 관련된다. 벽이 충분히 얇은 경우, 중공 섬유 벽을 통한 배지 확산을 허용하기에 약 0% 다공도로 충분할 수 있다. 본 발명의 중공 섬유의 다공도는 75% 또는 90%만큼 높을 수 있다. 따라서, 본 발명의 중공 섬유의 다공도의 범위는 0% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 60%, 또는 상기에 구체적으로 반복되지 않은 0% 내지 75% 사이의 임의의 백분율이다.

본 발명의 중공 섬유는 또한 기공 형성 단계에 적용될 수 있다. 기공 형성 메카니즘은 멤브레인 형성 기술분야에서 널리 공지된 하기 기술 중 하나일 것이다: TIPS = 열 유도 상 분리, NIPS = 비-용매 유도 상 분리, VIPS = 증기-유도 상 분리, pH 유도된 상 분리, MSCS = 신장과 조합된 용융-방사 (문헌 [Review on Porous Polymeric Membrane Preparation. Part II: Production Techniques with Polyethylene, Polydimethylsiloxane, Polypropylene, Polyimide, and Polytetrafluoroethylene, Xue Mei Tan, 1, 2, 2019] 참조). 모든 시나리오에서, 중합체는 이것의 열 용융 또는 화학적 용해에 의해 액체 상 중에 존재할 것이다. 그로부터, 중합체를 실린더 형상으로 압출하고, 스핀들 상으로 드로잉한다. 압출 단계 동안, 보어 유체를 사용하여 중공 섬유 형태가 자체적으로 붕괴되는 것을 방지할 수 있다. 압출 노즐과 재권취(rewind) 스핀들 사이에는, 기공 형성 챔버, 예컨대 수조 또는 대기 환경 챔버가 또한 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 생물반응기에서의 본 발명의 중공 섬유의 구성을 고려한다. 섬유 구성은 섬유 배치 및 간격 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 섬유는 컨플루언시에서 세포 사이의 최소 공극 공간으로 세포 집단의 성장을 허용하는 임의의 구성으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 섬유는 정사각형/직사각형 (행과 열) 또는 삼각형/육각형 (벌집) 패킹 모드로 배향될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 섬유가 단부에서 볼 때 행과 열의 질서화된 패턴을 형성하도록 섬유가 배열됨이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 섬유가 단부에서 볼 때 벌집 패턴을 형성함이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 섬유는 무작위로 또는 반-무작위로 배열됨이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 중공 섬유는 다양한 밀도의 질서화된 또는 반-질서화된 패턴으로 배열됨이 고려된다.

중공 섬유는 외경이 약 0.1 mm 내지 약 3.0 mm, 약 0.5 mm 내지 약 2.0 mm 및 약 0.8 mm 내지 약 1.3 mm, 및 언급된 값들 사이의 임의의 값의 범위일 수 있다. 1.0 mm 중공 섬유는 외경 주위의 약 0.3 mm 내지 약 0.5 mm의 육류 성장을 가정한다. 대략 1.1 mm의 단부 직경은 약 85개 중공 섬유/cm²를 갖는 육류를 제공할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 섬유는 섬유 사이에 다양한 정도 또는 양의 공간을 가짐이 고려된다. 예를 들어, 보다 낮은 밀도의 섬유 사이에 산재된 보다 높은 밀도의 섬유의 열을 갖는 것이, 자연 어육에서 통상적인 것과 같이, 최종 구조화된 청정 육류 생성물의 텍스처 변화를 생성하는 데 사용될 수 있다. 더 나아가, 다양한 직경, 다공도 및 벽 두께의 섬유가, 또한 자연 육류의 외관, 텍스처, 취급성 및 식감을 모사하기 위해, 동일한 중공 섬유 카트리지에서 사용될 수 있음이 고려된다.

임의의 구성에서, 섬유는, 섬유 사이의 간격이 모든 세포 덩어리에 도달하기 위한 배지 (및 그에 함유된 영양소, 성장 인자 등)의 적절한 유동을 허용하는 거리를 갖도록 이격되어 있다. 이는, 물론, 적어도 부분적으로 배지의 유속 및 중공 섬유 벽의 다공도와 관련될 것이지만, 대부분 중공 섬유의 외벽의 표면으로부터 세포까지의 물리적 거리와 관련된다. 다시 말해서, 배지 및 영양소는 세포 덩어리를 통해 단지 제한된 거리를 이동하거나 완화될 것이다. 현재, 산소 및 영양소의 확산의 최대는 200 μm인 것으로 생각된다. Rouwkema, J. , et al., (2009) Supply of Nutrients to Cells in Engineered Tissues, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 26:1, 163-178. 따라서, 섬유 사이의 간격은 하나의 섬유의 외벽으로부터 인접 섬유의 외벽까지 약 400 μm여야 한다. 배지가 중공 섬유를 통해, 또한 중공 섬유 사이의 간격을 통해 유동하는 배양 조건에서는, 간격이 더 클 수 있다. 예를 들어, 간격은 하나의 섬유의 외벽으로부터 인접 섬유의 외벽까지 800 μm일 수 있다. 이들 수치는 배양 공정이 확산 단독에만 의존하는 경우이다. 그러나, (예를 들어) 펌프의 사용은 중공 섬유로부터, 중공 섬유 사이의 세포 배양 공간을 통해, 또한 하우징 출구까지의 배지의 유동을 생성할 것이고 (확산 단독에만 의존하지 않고), 이는 섬유가 더 멀리 이격될 수 있게 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 섬유 사이의 최대 거리는 약 0.05 mm (50 μm) 내지 약 5.0 mm; 약 0.1 mm 내지 약 3.0 mm; 약 0.1 mm 내지 약 2.0 mm; 약 0.1 mm 내지 약 1.0 mm 또는 약 0.2 mm 내지 약 0.5 mm 또는 언급된 값들 사이의 임의의 거리임이 고려된다. 배지가 중공 섬유의 중심으로부터 배양을 통해 하우징 출구까지 유동하는 것이 바람직한 실시양태이지만, 목적하는 바에 따라, 배지 유동이 역방향일 수 있거나 하나의 방향으로부터 다른 방향까지 교호될 수 있음이 또한 고려된다. 배지 유동 방향의 교호는 모든 세포가 적절한 배지 공급을 갖는 것을 보장하도록 돕는 것으로 믿어진다.

무작위성의 정도는 본 발명의 중공 섬유의 거리에 내재될 것이라는 것이 본 발명의 실시양태이다. 이전 단락에 주어진 수치는 주어진 조립체에 대한 평균 섬유간 거리이다. 본 발명의 실시양태에서, 스페이서 및/또는 조립 기술은 섬유 사이의 거리를 보장, 정규화 또는 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Han G, Wang P, Chung TS., Highly robust thin-film composite pressure retarded osmosis (PRO) hollow fiber membranes with high power densities for renewable salinity-gradient energy generation, Environ Sci Technol. 2013 Jul 16;47(14):8070-7. Epub 2013 Jun 28 또는 Chun Feng Wana, Bofan Li a, Tianshi Yang a, Tai-Shung Chung, Design and fabrication of inner-selective thin-film composite (TFC) hollow fiber modules for pressure retarded osmosis (PRO), Separation and Purification Technology, 172:32 - 42, 2017.

세포 밀도가 지나치게 조밀해지거나 세포 덩어리의 두께가 지나치게 두꺼워지면, 배지가 중공 섬유로부터 가장 멀리 떨어진 세포에 도달하는 능력이 어려워진다. 이들 세포에 대한 배지의 부족은 반응기 내의 죽은 세포 및/또는 세포가 성장할 수 없는 죽은 공간을 초래할 수 있다. 그 결과, 배지는 중공 섬유 카트리지를 통해 하우징 출구로 유동할 필요가 있다. 즉, 배지의 유동은 적어도 컨플루언시에 도달하고 구조화된 청정 육류 생성물이 수확될 때까지 유지될 필요가 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서의 교시내용에 기반하여, 주어진 목적하는 구조화된 청정 육류 생성물에 대해 본 발명의 섬유의 정확한 간격 및 다공도를 계산할 수 있을 것이다.

본 발명의 중공 섬유는 본원에서 "중공 섬유 카트리지"로 지칭되는 것에 배열되고 고정될 수 있다. 한 실시양태에서, 중공 섬유 카트리지는 중공 섬유의 단부가 목적하는 배열로 단부 피스에 고정되도록 함으로써 만들어짐이 고려된다. 예를 들어, 각각의 섬유는 제1 단부 및 제2 단부를 갖는다. 각각의 단부는 단부 피스, 즉, 제1 및 제2 단부 피스에 고정된다. 단부 피스는, 예를 들어, 불활성이고 세포에 대해 비-독성인 것으로 관련 기술분야에 공지된 수지 또는 플라스틱일 수 있다. 중공 섬유의 제1 또는 제2 단부 중 적어도 하나는, 중공 섬유의 내부 루멘이 외부 환경과 유체 소통되도록 단부 피스에 배치된다. 따라서, 단부 피스에서의 중공 섬유의 이러한 배치로, 배지는 중공 섬유의 외부 환경 (즉, 중공 섬유의 외측이지만 예를 들어 멸균 생물반응기의 내측)으로부터 중공 섬유의 내부 루멘으로 유동될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 중공 섬유를 모듈 또는 카트리지로 조립하는 방법을 이해한다. 이들 기술은 본 발명의 중공 섬유에 적용가능하다. 요약하면, 방사 후, 중공 섬유를 길이로 절단하고, 섬유의 단부를 섬유 단부 주위로 유동하고 고화될 수지 내에 인케이싱한다 (즉, 포팅한다). 때때로, 섬유의 섹션을, "포팅 용액", 즉, 액체 수지가 섬유의 기공에 들어가거나 이를 플러깅하지 않도록 섬유의 기공을 폐쇄시키기 위한 물질 (예를 들어, 파리 석고(Plaster of Paris) 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 용이하게 제거가능한 물질) 내에 인케이싱할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vandekar, V.D., Manufacturing of Hollow Fiber Membrane, Int'l J Sci & Res, 2015, 4:9, pp. 1990 - 1994], 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다. 본 발명에서는, "포팅된" 다발의 단부 중 하나 또는 둘 다를 트리밍하거나 커팅하여 섬유의 개방 단부를 노출시켜, 본 발명의 구조화된 청정 육류의 생성에서의 사용을 위해 다발이 하우징 내에 삽입되면 배지의 유동을 허용한다.

더 나아가, 일부 실시양태에서는, 본 발명의 중공 섬유 카트리지가 제1 및 제2 단부 피스 사이의 목적하는 거리를 유지하기 위해 고정 장치를 가짐이 고려된다. 이는, 예를 들어, 본 발명의 중공 섬유 카트리지의, 예를 들어, 생물반응기 하우징 내로의 보다 용이한 삽입을 위해, 필수적이거나 바람직할 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 중공 섬유 카트리지는 목적하는 배열로 배열된 과잉의 중공 섬유를 함유함이 고려된다. 본 발명의 중공 섬유는 제1 단부 및 제2 단부를 갖는다. 배열은 중공 섬유의 제1 단부 및 제2 단부를 제1 및 제2 단부 피스에 고정함으로써 유지된다. 중공 섬유는, 기재된 바와 같이 고정되면, 이어서 서로 평행하게, 실질적으로 평행하게 또는 본질적으로 평행하게 배치된다. 또한, 제1 및 제2 단부 피스는 서로 평행하게, 실질적으로 평행하게 또는 본질적으로 평행하게 배치된다. 더 나아가, 본 발명의 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 본 발명의 중공 섬유 카트리지의 단부 피스에 수직으로, 실질적으로 수직으로 또는 본질적으로 수직으로 배치된다. 중공 섬유 카트리지의 직경 및 길이는 생성되는 목적하는 구조화된 청정 육류 생성물 및 생물반응기 구성에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지의 중공 섬유는 약 40 - 약 120개/cm²의 평균 밀도, 약 60 - 약 100개/cm²의 평균 밀도, 약 70 - 약 90개/cm² 또는 상기에 주어졌지만 구체적으로 반복되지는 않은 값들 사이의 임의의 값의 평균 밀도로 존재함이 고려된다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지에서의 중공 섬유는 세포의 첨가 전에 중공 섬유 사이의 공극 공간을 갖고, 중공 섬유 사이의 공극 공간은 중공 섬유 카트리지의 총 면적의 약 25% - 약 75% 또는 중공 섬유 카트리지의 총 면적의 약 40% - 약 60% 또는 상기에 주어졌지만 구체적으로 반복되지는 않은 값들 사이의 임의의 값임이 고려된다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 중공 섬유 카트리지는 하우징 내로 제거가능하게 삽입되도록 디자인됨이 고려된다. 즉, 카트리지는 생성 실행의 시작시에 하우징 내로 삽입되고, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물의 임의의 추가의 목적하는 프로세싱을 위해 생성 실행 종료시에 제거, 즉 수확될 수 있다. 구조화된 청정 육류 생성물의 수확 후, 새로운 본 발명의 중공 섬유 카트리지를 하우징 내로 삽입하고 공정을 반복할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 중공 섬유 카트리지에 대한 하우징은 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 부분이다.

반응기 구성. 본 발명은, 적절한 배지 유동이 배양을 통해 유지되고 폐기물이 제거될 수 있는 한, 임의의 특정 반응기 구성 또는 반응기 시스템 구성에 제한되지 않는다. 중공 섬유 반응기는 전형적으로 형상이 튜브형이지만, 이들은 타원형, 편평형 (시트-유사), 직사각형 또는 임의의 다른 형상일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 반응기는 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 삽입가능/제거가능 삽입부를 포함한다. 컨플루언트 세포 성장 (본원에서 정의된 바와 같음)에 도달한 후, 삽입부를 제거할 수 있고, 삽입부 단부의 제거 및 임의의 목적하는 추가의 프로세싱에 의해 생성물을 마무리할 수 있다. 추가의 프로세싱은, 예를 들어, 슬라이싱, 표면 텍스처링, 향미제 첨가 등의 형태를 취할 수 있다. 대안적으로, 추가의 육류 향상이 장치의 수확 및 분해 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 배지를 중공 섬유 장치 외부로 플러싱할 수 있고, 이어서 첨가제를 섬유 내로 또는 주위에 직접적으로 펌핑할 것이다.

적합한 반응기 시스템의 비-제한적 예. 반응기 시스템의 가장 적합한 유형은 공급 배치 시스템이지만, 임의의 이용가능한 반응기가 본 발명의 중공 섬유 및 중공 섬유 카트리지와의 사용을 위해 적합할 것임이 고려된다. 예를 들어, 모비우스(MOBIUS)^® 시스템 (밀리포어시그마, 미국 매사추세츠주 베드포드)은 본 발명과의 사용으로 용이하게 전환될 수 있는 상업적 시스템의 일례이다. 구조화된 청정 육류 생성물이 생성되는 생물반응기 (즉, 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 반응기)를 또 다른 생물반응기에서 성장된 세포로 시딩할 수 있다. 중공 섬유 장치를 시딩하는 생물반응기 (세포 성장 (증식) 및 세포 확장에 적합한 반응기)는 기존의 상업적 반응기, 예를 들어 교반 탱크 또는 파동-유형 반응기일 수 있다. 증식/확장 생물반응기는, 예를 들어, 교반 탱크 또는 파동-유형 반응기 (관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같음)이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 현탁액, 응집된 바이오매쓰, 마이크로캐리어 배양, 또는 다른 적합한 반응기인 것으로 고려된다. 생성 생물반응기 (즉, 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 반응기)는, 예를 들어, 단일 사용, 다중-사용, 반-연속적 또는 연속적일 수 있음이 고려된다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 다수의 반응기의 매니폴드를 고려한다.

따라서, 본 발명의 예시적인 반응기 시스템은 본 발명의 하나 이상의 중공 섬유 카트리지, 상기 중공 섬유 카트리지를 유지하도록 사이징된 하우징; 상기 하우징 내의 하나 이상의 유입구에 유동적으로 연결된 배지 공급원; 상기 하우징 내의 하나 이상의 배지 유출구; 및 상기 배지 유입구(들) 및/또는 유출구(들)를 통해 상기 중공 섬유 카트리지에 배지를 공급하고/거나 그로부터 폐기 배지를 제거하기 위한 하나 이상의 펌프를 포함함이 고려된다. 더 나아가, 유입구는 중공 섬유의 내부에 유동적으로 연결된다. 또한 더 나아가, 중공 섬유 생물반응기는 자동화된 제어기 또는 자동 제어 시스템을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 중공 섬유 반응기 내의 중공 섬유 사이의 공극 공간을 근세포, 근세포-유사 세포 또는 하나 이상의 근세포-유사 특징을 발현하는 조작된 세포 중 하나 이상으로, 예를 들어, 100,000개 세포 내지 100,000,000 (10⁵- 10⁸)개의 밀도로 시딩하고 (Radisic, et al., Biotechnol Bioeng, 2003 May 20:82(4):403-414.), 약 80% - 약 99% 컨플루언시, 85% - 약 99% 컨플루언시, 약 90% - 약 99% 컨플루언시, 약 95% - 약 99% 컨플루언시, 약 98% - 약 99% 컨플루언시 또는 약 100% 컨플루언시 (또는 언급된 퍼센트 값 사이의 임의의 값)를 달성할 때까지 세포를 배양하고, 상기 중공 섬유의 각각 제1 단부 및 제2 단부로부터 상기 제1 유지 장치 및 상기 제2 유지 장치를 제거하는 것을 포함하는, 육류 생성물의 생성 방법을 고려한다.

시딩 후, 중공 섬유 카트리지는 중공 섬유의 제1 단부 및 제2 단부 중 하나 또는 둘 다를 통해 중공 섬유의 내부로, 중공 섬유의 벽을 통해 세포가 시딩되는 중공 섬유 사이의 공극 공간 내로, 및 상기 하우징 내의 상기 유출구 중 하나 이상을 통해 세포에 공급된 배지를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 배지는 또한 장치의 유입구(들) 및 유출구(들) 둘 다로부터 섬유 사이에서 유동할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 하나의 유체 경로는 섬유 벽을 통한 것이고, 제2 유체 경로는 섬유 주위의 것이다. 장치는 다수의 유입구 및 유출구를 가질 수 있음이 고려된다. 세포가 컨플루언시를 달성한 후, 임의의 잔류 배지 및 폐기물을 플러싱하고 중공 섬유의 내부 및/또는 세포 사이의 임의의 남아있는 공극 공간에 지방, 향미제, 색소, 염 및 보존제 중 1종 이상을 주입한다.

본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에 첨가하기에 적합한 지방은 하기의 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 포화, 단일불포화, 다중불포화 지방, 예컨대 옥수수 오일, 카놀라 오일, 해바라기 오일, 및 홍화 오일, 올리브 오일, 땅콩 오일, 대두, 아마인 오일, 참깨 오일, 카놀라 오일, 아보카도 오일, 종자 오일, 너트 오일, 홍화 및 해바라기 오일, 팜 오일, 코코넛 오일, 오메가-3, 어유(들), 라드, 버터, 가공 동물 지방, 지방질 조직, 또는 세포 농업 유래 지방, 또는 이들의 조합. 합성 지방, 예컨대 올레오레진이 사용될 수도 있다. 사실상, 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 인정되는 임의의 지방이 본 발명에서의 사용에 적합하고, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. FDA 식품 첨가제 목록에는, 천연 물질 및 추출물 (NAT), 영양소 (NUTR), 에센셜 오일 및/또는 올레오레진 (용매 무함유) (ESO)이 있다.

본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용에 적합한 향미제는 FDA의 식품 첨가제 목록에 기재된 임의의 향미제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들은 천연 향미 작용제 (FLAV), 에센셜 오일 및/또는 올레오레진 (용매 무함유) (ESO), 효소 (ENZ), 천연 물질 및 추출물 (NAT), 비-영양 감미료 (NNS), 영양 감미료 (NUTRS), 향신료, 다른 천연 시즈닝 & 향료 (SP), 합성 향미 (SY/FL), 훈증제 (FUM), 아스파탐, 수크랄로스, 사카린 및 아세술팜 칼륨 및 효모 추출물을 포함하는 인공 감미료, 또는 이들의 조합으로서 기재될 수 있으며, 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다.

본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용에 적합한 텍스처 향상제는 퓨레형 식물 물질, 구아 검, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌, 베타 글루칸, 대두, 밀, 옥수수 또는 쌀 단리물 및 사탕무 섬유, 완두콩 섬유, 대나무 섬유, 식물 유래 섬유, 식물 유래 글루텐, 카라기난, 크산탄 검, 레시틴, 펙틴, 아가, 알기네이트, 및 다른 천연 폴리사카라이드, 곡물 껍질, 시트르산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 황산마그네슘 및 염, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들은 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. 이들은 가용화 및 분산 작용제 (SDA), 및 천연 물질 및 추출물 (NAT)로서 FDA의 식품 첨가제 목록에 기재되어 있을 수 있다.

본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용에 적합한 영양 첨가제는 비타민, 미량 원소, 생물활성 화합물, 내인성 항산화제, 예컨대 A, B-복합체, C, D, E 비타민, 아연, 티아민, 리보플라빈, 셀레늄, 철, 니아신, 칼륨, 인, 오메가-3, 오메가-6, 지방산, 마그네슘, 단백질 및 단백질 추출물, 아미노산 염, 크레아틴, 타우린, 카르니틴, 카르노신, 유비퀴논, 글루타티온, 콜린, 글루타티온, 리포산, 스페르민, 안세린, 리놀레산, 판토텐산, 콜레스테롤, 레티놀, 폴산, 식이 섬유, 아미노산, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들은 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 또는 FDA에 의해 승인된 임의의 식품 첨가제 또는 첨가제들이 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려되며, 이들은 본원에 포함된다. 예를 들어 하기를 참조한다: www.fda.gov/food/food-additives-petitions/food-additive-status-list.

안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 또는 FDA에 의해 승인된 천연 또는 인공의 임의의 색소 또는 색소들이 본 발명의 구조화된 청정 육류 생성물에서의 사용을 위해 고려된다. 예를 들어 하기를 참조한다: www.fda.gov/industry/color-additive-inventories/color-additive-status-list.

예언적 세포 유형. 본 발명의 중공 섬유는 시험관내에서 또는 실험실에서 성장된 육류 및 육류 생성물, 즉, 본 발명의 구조화된 청정 육류의 생성에 적합한 특정 세포 유형을 성장시키기 위해 사용되도록 디자인된다. 따라서, 많은 상이한 유형의 세포가 중공 섬유 상에서 (및, 목적하는 경우, 본 발명의 중공 섬유 카트리지에서) 성장할 수 있지만, 근육 세포 (즉, 근세포), 또는 근육 세포의 특징을 갖는 또는 근육 세포의 특징을 갖도록 조작된 세포 (본원에서 총체적으로 근육 세포 또는 근세포로 지칭됨)를 컨플루언시까지 성장시키기 위해, 및 근육 (즉, 육류)의 자연 구조를 모방하기 위해 사용되도록 섬유가 개발되었다. 바람직하게는, 근육은 골격근이다. 즉, 본 발명의 중공 섬유는 근세포를 성장시켜 근육 섬유 또는 근원섬유를 수득하기에 적합하도록 본 발명자에 의해 디자인된다. 또한, 다른 유형의 세포가 본 발명의 중공 섬유 상에서, 및 본 발명의 중공 섬유를 포함하는 반응기에서 성장될 수 있다. 이들 세포는 독립적으로 또는 근육 세포와 조합으로 성장될 수 있다. 예를 들어, 지방세포 또는 지방세포의 특징을 갖는 또는 지방세포의 특징을 갖도록 조작된 세포 (본원에서 총체적으로 지방세포로 지칭됨)를 근육 세포와 배양하여 자연 근육 또는 육류와 유사한 최종 생성물을 달성할 수 있다. 본 발명의 중공 섬유는 또한, 다른 세포, 예를 들어, 섬유모세포, 섬유모세포의 특징을 갖는 세포 또는 섬유모세포의 특징을 갖도록 조작된 세포를 본 발명의 근육 세포와 공동-배양되기 위해 포함시키기에 적합하다.

특히 근육 세포 및 지방세포의 공동-배양과 관련하여, 근육 세포 대 지방세포의 비는 99:1, 95:5, 92:8, 90:10, 88:12, 85:15 82:18, 80:20, 75:25 또는 100:0 내지 75:25 (경계값 포함)의 임의의 비일 수 있다.

본 발명에서의 사용에 적합한 세포는 식품이 현재 수득되는 임의의 동물로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 눈에 띄는 예는 소, 돼지, 양, 어류 (예를 들어, 생선, 예컨대 참치, 연어, 대구, 해덕, 상어 등), 조개류, 조류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리 등)이다. 양식되기보다는 전통적으로 사냥되는 동물 (예를 들어, 사슴, 엘크, 무스, 곰, 토끼, 메추라기, 야생 칠면조 등) 또는 이들의 조합과 같은 보다 외래적인 세포 공급원이 사용될 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 세포는 목적하는 특징을 갖는 분화된 세포의 생성에 적합한 임의의 방식에 의해 유래될 수 있다. 예를 들어, 임의의 절차가 분화된 근세포-유사 특징, 지방세포-유사 특징 등을 갖는 세포 유래에 적합하다. 근세포에 대한 이러한 특징은, 예를 들어 (그러나, 반드시 이에 제한되지는 않음), 긴 튜브형 세포의 외관을 갖는 것, 및 미오신 및 액틴의 큰 상보체를 갖는 것을 포함한다. 근세포는 또한, 다른 근세포와 융합되어, 근육, 즉, 육류에 그의 독특한 텍스처를 제공하는 데 도움이 되는 근육 단위인 근원섬유를 형성하는 능력을 갖는다. 지방세포 (또한 관련 기술분야에서 리포사이트 및 지방 세포로 지칭됨)에 대한 이러한 특징은, 예를 들어 (그러나, 반드시 이에 제한되지는 않음), 세포 부피의 90% 이상을 차지할 수 있는 큰 지질 액포를 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 중공 섬유는, 적어도 부분적으로, 골격근에서 전형적으로 나타나는 결합 조직 (관련 기술분야에서 "근막"으로 지칭됨)의 대체물을 제공한다.

본 발명에서 유용한 세포는, 중간엽 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. iPSC는 수많은 세포 유형이 유래될 수 있는 만능 상태로 되돌아가도록 조작된 세포이다. 다시 말해서, iPSC는 체세포로부터 직접적으로 생성될 수 있는 만능 줄기 세포이다. 기술은 2006년에 처음 보고되었고 (Takahashi K, Yamanaka S, 25 August 2006, "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors" Cell, 126 (4): 663-76), 그 시점부터 진보되었고 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Li, et al., 30 April 2014, "Generation of pluripotent stem cells via protein transduction" Int. J. Dev. Biol., 58: 21 - 27), 이는 근육 세포의 생성을 포함하고 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Rao, et al., 9 January 2018, "Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue" Nat Commun., 9 (1): 1 - 12), 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 개시내용 또는 그의 바람직한 실시양태(들)의 요소를 도입할 때, 단수형 "하나" 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 존재함을 의미하도록 의도된다. 용어 "포함하는(comprising, including)" 및 "갖는"은 포함적인 것으로 의도되며 열거된 요소 이외의 추가의 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.

전환 어구 "포함하는", "본질적으로 ~로 이루어진" 및 "~로 이루어진"은 MPEP 2111.03 (특허 심사 절차 매뉴얼, 제9판, 2019년 10월 개정; 미국 특허청)에 주어진 바와 같은 의미를 갖는다. 전환 어구 "본질적으로 ~로 이루어진"을 사용한 청구항은 본 발명의 필수 요소만을 언급하는 것으로 이해될 것이고, 종속 청구항에서 언급된 임의의 다른 요소는 이들이 종속되는 청구항에서 언급된 본 발명에 있어 비-필수적인 것으로 이해된다.

본원에서 언급된 모든 범위는 모든 정수, 분수 및 십진수를 포함하는 인용된 범위 내의 모든 값을 경계값을 포함하여 포함한다.

예시

일반적 물질 및 방법:

모든 시약은 상업적으로 입수가능하였고, 달리 언급되지 않는 한, 추가의 정제 없이 사용하였다. 제인, 수산화나트륨, 우레아, 히드록시프로필 셀룰로스, k-카라기난, 아세트산나트륨, 트리폴리포스페이트 (TPP), (히드로콜레레트산 37%, 항생제 항진균제 용액 (100x) 및 밀 글루텐, 소 혈청으로부터의 피브로넥틴은 밀리포어시그마 (미국 매사추세츠주 벌링턴)로부터 구입하였다. 소 콜라겐은 코닝(Corning) (미국 뉴욕주 코닝)으로부터 구입하였고; 대두 단백질 단리물 (SPI)은 벌크서플먼츠(BulkSupplements) (미국 네바다주 헨더슨)로부터 구입하였고; 키토산 (버섯으로부터)은 모더니스트 팬티(Modernist Panty) (미국 메인주 엘리엇)로부터 구입하였고; 완두콩 및 땅콩 버터 단백질 단리물은 노칼 오가닉(NorCal Organic) (미국 캘리포니아주 크레센트 시티)으로부터 구입하였고; 녹두, 파바빈, 및 병아리콩 단백질 단리물은 그린 보이(Green Boy) (미국 캘리포니아주 레돈도 비치)로부터 구입하였고; 아가로스는 히스파나가(Hispanagar) (스페인 버고스)로부터 구입하였고; 현미 단백질 단리물은 젠 프린시플(Zen Principle) (미국 네바다주 인클라인 빌리지)로부터 구입하였고; 알긴산나트륨 및 무글루(MooGloo)™ RM 트랜스글루타미나제는 모더니스트 팬트리(Modernist Pantry) (미국 메인주 엘리엇)로부터 구입하였다.

세포-배지 안정성 시험:

멤브레인을 1 X 3.5 인치 정사각형 샘플로 커팅하고, 실험에 따라 항생제 항진균제 용액 (2x) (관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지됨)을 함유하는 세포 배지에서 37 ℃에서 21 또는 30일까지 인큐베이션하였다. 각각의 멤브레인 유형에 대해, 3개의 샘플을 각각의 시점에서 인큐베이션 동안 기계적으로 시험하였다.

점도:

제조된 도프 용액의 점도 측정을 브룩필드 (미국 매사추세츠주 미들보로) 점도계 DV-II+ 프로(Pro) 상에서 S64 스핀들을 사용하여 취하였다.

기계적 시험:

멤브레인 인장 시험을 1 X 3.5 또는 0.5 X 3.5 인치 정사각형 샘플 상에서 즈윅 로엘(Zwick Roell) (미국 조지아주 케네소) 테스트컨트롤(TestControl) II 장치를 사용하여 수행하고, 데이터를 즈윅 로엘 테스트엑스퍼트(testXpert) II V3.71 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

동결-건조:

샘플을 물에서 액체 질소 하에서 1시간에 걸쳐 섬광 바이알 내부에서 동결시켰다. 그 후, 동결된 샘플을 랩콘코(Labconco) (미국 미주리주 칸사스 시티) 동결-건조기 2.5 L -80 ℃를 사용하여 건조시켰다.

주사 전자 현미경검사:

샘플을 스터브 상에 실장하고, 3 nm의 이리듐으로 코팅하고, 써모사이언티픽(ThermoScientific) (미국 매스추세츠주 월섬) 콴타(Quanta) 200F 또는 JOEL (미국 매사추세츠주 피바디) JCM 6000 주사 전자 현미경 (일본 도쿄) 중 어느 하나를 사용하여 화상화하였다.

통계적 분석:

오차 막대를 평균의 표준 오차로서 계산하였다.

유동학:

제제화된 도프 및 멤브레인 상의 유동학적 분석을 TA 아레스(Ares) 유량계 (미국 델라웨어주 뉴 캐슬) 상에서 원뿔형 고정기를 사용하여 수행하였다.

실시예 1 - 식용 중공 섬유를 생성하는 방법

본 발명의 멤브레인을 생성하기 위한 예시적인 생성 공정의 개략적 표시에 대해 도 1 & 2를 참조한다.

1. 도프 용액의 생성

a. 도프 용액의 제조는 다단계 혼합 공정을 요구한다

i. 먼저 단백질 용액을 제조하였다. 이는 약알칼리성 완충 용액에서 14 중량% 식물 단백질 농축물의 용해를 요구하였다. 믹스를 20,000 rpm에서 수 분 동안 균질화하였다. 구체적으로, 마이크로미터화된 식물 단백질 분말을 사용하였다.

ii. 제2 용액은 단백질 믹스로서 동일한 완충액에 용해된 2% 알기네이트, 2% 히드록시프로필 셀룰로스를 포함하는 캐리어 중합체를 함유한다. 이를 혼성화기에 의해 35 ℃에서 48시간 동안 용해시켰다.

iii. 1:1 비로 단백질 용액 및 캐리어 중합체 용액을 혼합하였다. 혼합을 오버헤드 교반 장치로, 이어서 혼성화기에서 35 ℃에서 12시간 완결하였다.

iv. 최종 믹스는 2% 폴리사카라이드 및 7% 식물 단백질의 생성된 농도를 가지며, 도프 용액으로 지칭된다.

b. 보어 용액의 제조는 15 g/l 염화칼슘을 0 - 1 g/l 트랜스글루타미나제를 갖는 역삼투 (RO) 물에 용해시킴으로써 완결된다.

2. 드로잉 및 고화

a. 가압화된 용기 및 기어 펌프를 사용하여, 도프 용액을 공동축 오리피스를 통해 푸시하였다. 방사돌기 및 조 사이에는 특정 거리가 있었으며, 이는 도프 용액 유동학적 특성에 기반하여 조정될 수 있다.

b. 고화 조 (또한 본원에서 형성 조로 지칭됨)는 또한 15 g/l 염화칼슘이고, 알기네이트를 이온 가교시킴으로써 섬유의 3D 구조에서 잠겨진다.

3. 가교 단계

a. 본 출원에 대해, 알기네이트의 이온 가교는 세포 배양 배지 중 나트륨 염에 의해 제조된 1가 결합에 의한 2가 결합의 해리를 위해 충분하게 기능하지 않을 수 있다. 효소적 트랜스글루타미나제 가교 및 알기네이트-칼슘 가교를 넘어선 가교가 요망되었다.

b. 이어서 섬유를 100 ℃에 가까운 열에 노출시켜 섬유 내의 단백질을 열 가교시켰다. 개념 입증은 121 ℃에서 60분 동안 오토클레이브를 통해 입증되었다.

c. 대안적으로, 또는 추가적으로, 섬유를 대략 50 kGy (킬로그레이)의 전자 빔 또는 감마 조사에 노출시켜 믹스의 셀룰로스 부분을 물리적으로 가교시켰으며, 즉, 단백질을 가교시켰다. 최종 투여량은 본 명세서의 교시내용을 이용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 전자 빔을 통해 통과하는 물질의 체류 시간 및 물질의 등급에 따라 대략 5 kGy 내지 대략 100 kGy일 수 있다.

4. 코팅 단계

a. 섬유를 플라스마 챔버를 통해 연속적으로 통과시키고, 이어서 물 중 15% 글리콜/소르비톨 (1:1) 믹스의 용액 내로 침지시켰다 (용도에 따라, 글리콜/소르비톨의 비는 1:14 내지 14:1의 범위일 수 있음). 이 단계는 가소제를 통한 중공 섬유의 다공성 구조의 붕괴를 최소화하도록 디자인되었다.

도 3a & b는 실시예 1의 공정 (방법)으로 제조된 중공 섬유 멤브레인의 현미경사진을 나타낸다. 도 4a - c는 본 실시예의 공정으로 제조된 중공 섬유 멤브레인의 주사 전자 현미경사진을 나타낸다. 도 5a는 본 실시예의 공정으로 제조된 하나의 중공 섬유의 길이를 나타낸다. 도 5b는 중공 섬유 중 하나의 인장 강도의 입증을 제공한다.

실시예 2 - 2차 가교 단계 없는 섬유의 예언적 실시예

a. 중공 섬유 도프 용액을 실시예 1에서 상기 정의된 바와 같이 생성한다. 본 실시예에서, 3개의 조건이 표적화된다. 모든 조건은 동일한 도프 용액으로부터 형성된다. 이 도프 용액은 1-부 히드록시프로필 셀룰로스, 1-부 알기네이트 산 나트륨 염 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스), 및 7부 완두콩 단백질 단리물이다.

b. 제1 조건에서, 섬유를 15 g/l 염화칼슘 조 내로 직접적으로 압출시켜, 즉시 고화시킨다. 조에서 10분 후, 섬유를 밀리큐(MilliQ)™ 물 (밀리포어시그마, 미국 매사추세츠주 베드포드) 물로 세정하고, 이어서 DMEM F12 배지에 72시간 동안 함침시킨다. 세포 배양 배지로부터 섬유를 제거할 때, 이들은 취급가능하지 않다. 섬유는 용액 외부에서 그 자신의 중량을 더 이상 지지할 수 없다. 대다수의 이온 가교된 부위가 해리되었다.

c. 제2 조건에서, 섬유를 15g/l 염화칼슘 조 내로 직접적으로 압출시켜, 즉시 고화시킨다. 조에서 10분 후, 섬유를 밀리큐™ 물로 세정하고, 이어서 121 ℃에서 30분 동안 오토클레이빙하였다. 실온으로 냉각되면 섬유를 이어서 DMEM/F12 (둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/영양소 혼합물 F-12; 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬) 배지에 72시간 동안 함침시킨다. 세포 배양 배지로부터 섬유를 제거할 때, 이들은 일부 정도의 완전성을 소실하였다. 섬유는 제거될 수 있지만, 단지 그 자신의 대략 5 인치를 자기-지지할 수 있다. 대부분의 이온 가교된 부위는 해리되었지만, 열 가교된 단백질은 여전히 섬유 완전성을 증가시키는 것을 담당한다.

d. 제3 조건에서, 섬유를 15g/l 염화칼슘 조 내로 직접적으로 압출시켜, 즉시 고화시킨다. 조에서 10분 후, 섬유를 밀리큐™ 물로 세정하고, 이어서 벤치톱 전자 빔 변형 장비에서 50 kGy에서 단일 통과에 노출시키고, DMEM/F12 배지에 72시간 동안 함침시킨다. 세포 배양 배지로부터 섬유를 제거할 때, 이들은 그들의 완전성을 유지하고, 그 자신의 중량을 지지할 수 있다. 이온 가교된 부위는 세포 배양 배지에서의 해리에 민감하고, 알기네이트 및 셀룰로스 둘 다의 백본의 일부 쇄 절단이 있을 수 있지만, 단백질 중합체 망상체의 물리적 가교는 배지에서의 해리에 대해 내성을 갖는다.

이들 실시예는 열 및/또는 조사를 사용한 단백질의 가교가 본 발명의 중공 섬유의 향상된 완전성을 제공하여 이들을 예를 들어, 세포 배양 장치 또는 여과 장치에서 사용하기 위해 적합하게 함을 나타낸다.

실시예 3 - 도프 용액 제조

1.1. 단백질 용액

1.1.2. 우레아-기반 방법:

제인: 57 g의 제인 분말을 300 mL의 밀리큐™ 물에 0 ℃에서 및 기계적 교반 하에서 첨가함으로써 제인 용액 (15% w/v)을 제조하였다. 30분 후, 11.25 g의 우레아를 현탁액에 첨가하고, 이어서 83 mL의 NaOH 용액 (0.4 N)을 첨가하였다 (도 12). 그 후, 반응물을 실온 (23 ℃)까지 가온하고, 추가의 사용 전에 18시간 동안 교반하였다.

제인: 72 g의 제인 분말을 300 mL의 밀리큐™ 물에 0 ℃에서 및 기계적 교반 하에서 첨가함으로써 제인 용액 (19%w/v)을 제조하였다. 30분 후, 14.30 g의 우레아를 현탁액에 첨가하고, 이어서 83 mL의 NaOH 용액 (0.6 N)을 첨가하였다 (도 12). 그 후, 반응물을 실온 (23 ℃)까지 가온하고, 추가의 사용 전에 18시간 동안 교반하였다.

제인-히드록시프로필 셀룰로스 블렌드: 1.75 g의 HPC를 밀리큐™ 물 중에 첨가하고, 18시간에 걸쳐 기계적 교반에 의해 혼합함으로써 0.5% w/v 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC) 용액 (0.5% w/v)을 제조하였다. 그 후, 용액을 빙조를 사용하여 0 ℃로 냉각시키고, 제인 (72 g)을 그것에 첨가하였다. 현탁액을 0 ℃에서 추가의 20분 동안 교반한 후, 14.30 g의 우레아 및 83 mL의 NaOH 용액 (0.6 N)을 첨가하였다. 반응물을 실온 (23 ℃)까지 가온하고, 추가의 사용 전에 추가의 18시간 동안 교반하였다.

대두 단백질 단리물: 76 g의 SPI 분말을 300 mL의 밀리큐™ 물에 기계적 교반 하에서 첨가함으로써 대두 단백질 단리물 (SPI) 용액 (20% w/v)을 제조하였다. 30분 후, 11.25 g의 우레아를 현탁액에 첨가하고, 이어서 83 mL의 NaOH 용액 (0.4 N)을 첨가하였다. 그 후, 반응물을 추가의 사용 전에 18시간 동안 교반하였다.

완두콩 단백질 단리물: 76 g의 PPI 분말을 300 mL의 밀리큐™ 물에 기계적 교반 하에서 첨가함으로써 대두 단백질 단리물 (SPI) 용액 (20% w/v)을 제조하였다. 30분 후, 11.25 g의 우레아를 현탁액에 첨가하고, 이어서 83 mL의 NaOH 용액 (0.4 N)을 첨가하였다. 그 후, 반응물을 추가의 사용 전에 18시간 동안 교반하였다.

녹두: 57 g의 PPI 분말을 300 mL의 밀리큐™ 물에 기계적 교반 하에서 첨가함으로써 녹두 용액 (15% w/v)을 제조하였다. 30분 후, 11.25 g의 우레아를 현탁액에 첨가하고, 이어서 83 mL의 NaOH 용액 (0.4 N)을 첨가하였다. 그 후, 반응물을 추가의 사용 전에 18시간 동안 교반하였다. 도 6을 참조한다.

밀 글루텐: 56 g의 글루텐 분말을 300 mL의 밀리큐™에 물에 기계적 교반 하에서 첨가함으로써 글루텐 용액 (15% w/v)을 제조하였다. 30분 후, 11.25 g의 우레아를 현탁액에 첨가하고, 이어서 83 mL의 NaOH 용액 (0.4 N)을 첨가하였다. 그 후, 반응물을 추가의 사용 전에 16시간 동안 교반하였다.

1.1.3. 혼성화기-기반 방법:

녹두 알기네이트 블렌드:

252 그램의 물 중 45 그램의 녹두 단백질 단리물을 칭량하고, 이를 25000 rpm에서 5분 동안 균질화시킴으로써 녹두 단백질 단리물 (그린 보이) 및 알기네이트 (]모더니스트 팬트리) 블렌드를 제제화한다. 그로부터 3mL의 10N NaOH (및 임의적 6g의 우레아)를 첨가하고, 이를 추가의 5분 동안 균질화시킨다. 그로부터, 겔-용액을 균질화기 내로 40℃에서 밤새 정치한다.

1.2. 알기네이트-단백질 블렌드 용액

대안적 녹두 및 알기네이트 도프 제제화:

따라서, 다양한 연구를 수행하여 단백질 단리물 및 알기네이트의 다수의 가능한 제제화를 밝혀내었다. 한 예시적인 제제화 및 혼합 방법은 중량으로 표현된다: 0.2% 알기네이트, 15% 녹두 단백질 단리물, 1% 10N NaOH, 2% 우레아 (임의적), 81.8% 밀리큐™ 물.

제1 단계는 단백질 단리물을 용액에서 습화시키고 (즉, 현탁시키고), 분산시키는 것이다. 단백질 단리물을 칭량하고, 밀리큐™ 물을 첨가한다. 고 전단 혼합기, 예컨대 균질화기 (IKA, 독일 스타우펜)를 25,000 rpm으로 5-10분 동안, 또는 슬러리가 유체 유사 거동으로 복귀할 때까지 설정한다. 분산되면, NaOH (및 목적하는 경우 - 우레아)를 단백질 및 물에 첨가하고, 이어서 용액을 점성 겔이 형성될 때까지 추가의 5분 동안 균질화시킨다. 그로부터, 프로펠러를 갖는 오버헤드 혼합기를 100-500 rpm으로 설정하여 용해된 단백질을 교반한다. 알기네이트를 혼합 용액에 15분의 과정에 걸쳐 서서히 첨가한다. 알기네이트가 믹스 전반에 걸쳐 균질하게 분산되고 부분적으로 용해되면, 용액을 자 내에 놓고, 캡핑하고, 혼성화기 내에 24시간 동안 정치한다. 도 7을 참조한다.

i. 1.2.1. 우레아-기반 방법

제인-알기네이트: 기계적 교반 하에서, 20분 동안, 우레아-방법에 따라 제조된 제인 용액 (15% w/v)을 다양한 농도 (2% w/v, 4% w/v, 6% w/v 및 8% w/v)의 사전-제조된 알기네이트 물 용액과 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 제인-알기네이트 블렌드를 제조하였다.

SPI-알기네이트: 기계적 교반 하에서, 20분 동안, 우레아-방법에 따라 제조된 SPI 용액 (20% w/v)을 다양한 농도 (2% w/v, 4% w/v, 6% w/v 및 8% w/v)의 사전-제조된 알기네이트 물 용액과 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 SPI-알기네이트 블렌드를 제조하였다.

PPI-알기네이트: 기계적 교반 하에서, 20분 동안, 우레아-방법에 따라 제조된 PPI 용액 (20% w/v)을 다양한 농도 (2% w/v, 4% w/v, 6% w/v 및 8% w/v)의 사전-제조된 알기네이트 물 용액과 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 SPI-알기네이트 블렌드를 제조하였다.

녹두-알기네이트: 기계적 교반 하에서, 20분 동안, 우레아-방법에 따라 제조된 녹두 용액 (15% w/v)을 다양한 농도 (2% w/v, 4% w/v, 6% w/v 및 8% w/v)의 사전-제조된 알기네이트 물 용액과 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 녹두-알기네이트 블렌드를 제조하였다.

글루텐-알기네이트: 기계적 교반 하에서, 1시간 동안, 우레아-방법에 따라 제조된 글루텐 용액 (15% w/v)을 다양한 농도 (2% w/v, 4% w/v, 6% w/v 및 8% w/v)의 사전-제조된 알기네이트 물 용액과 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 글루텐-알기네이트 블렌드를 제조하였다.

1.3. 단백질-아가로스 블렌드 용액

1.3.1. 우레아-기반 방법

제인-아가로스: 우레아-방법에 따라 제조된 제인 용액 (15% w/v)을 다양한 농도 (1% w/v, 2% w/v 및 4% w/v)의 사전-제조된 아가로스 물 용액과 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 제인-아가로스 블렌드를 제조하였다. 각각의 양의 아가로스를 300 mL의 밀리큐™ 물 중에 60 ℃에서 첨가하고, 이들을 용해가 완결될 때까지 2시간 동안 교반함으로써 아가로스 용액을 제조하였다. 균질한 블렌드를 수득하고 캐스팅 전의 아가로스의 고화를 회피하기 위해, 새롭게 제조된 아가로스 용액을 사전-가열된 제인 용액에 40 ℃에서 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. 용액을 캐스팅 전에 40 ℃에서 유지하였다.

제인-아가로스로 탐구하였지만, 제제화 결과 및 방법은 다른 식물-기반 단백질로 유사한 결과를 가질 것으로 예상된다. 아가로스 및 옥수수 단백질 (제인)을 제제화하는 것은 2가지 중합체가 공통적인 용매 또는 용해 온도를 이용하지 않기 때문에 사소한 작업이 아니다. 40 ℃ 초과에서 제인을 안정화시키는 것 뿐만 아니라 요구되는 에탄올의 요구된 퍼센트를 약 20% 미만의 수준으로 저하시키는 것의 조합이 동시에 달성된다. 제제화를 위한 실험의 미니탭 (미국 펜실베니아주 스테이트 칼리지) 디자인을 사용하여, 0.04 N 수산화나트륨, 우레아, 및 에탄올을 갖는 용매 시스템을 퍼센트 w/v에 의해 탐구한다.

에탄올, 우레아, 및 0.04N NaOH의 조합은 제인을 용해시킬 수 있음이 밝혀졌다. 놀랍게도, 제인은 0.04N NaOH 및 우레아의 존재 하에서 10%에서의 에탄올 함량에서 용해될 수 있었다. 단순한 디자인 플롯이 도 8에 나타내어진다. 그러나, 에탄올의 부재 하에서 제인은 약 40 ℃ 미만의 온도에서 안정하지 않았다. 이 관찰은 온도-스위프 유동학 데이터로 지지된다. 도 9를 참조한다.

더욱이, 약 5% 우레아, 19% 에탄올, 및 76% 0.04 N NaOH로 구성된 이 용매 시스템은 아가로스의 겔화 특성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 도 10을 참조한다.

더욱이, 본 발명자들이 아가로스 및 제인을 이 용매 시스템에서 함께 혼합하는 경우, 본 발명자들은 하나의 시스템 내에서 둘 다의 중합체를 함께 혼합하는 것의 실현가능성을 지시하는 유동학적 특성을 보게 된다. 도 11을 참조한다.

녹두-아가로스: 우레아-방법에 따라 제조된 녹두 용액 (15% w/v), 및 다양한 농도 (1% w/v, 2% w/v 및 4% w/v)의 사전-제조된 아가로스 물 용액을 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 녹두-아가로스 블렌드를 제조하였다. 각각의 양의 아가로스를 300 mL의 밀리큐™ 물 중에 60 ℃에서 첨가하고, 이들을 완전한 용해까지 2시간 동안 교반함으로써 아가로스 용액을 제조하였다. 균질한 블렌드를 수득하고 캐스팅 전의 아가로스의 고화를 회피하기 위해, 새롭게 제조된 아가로스 용액을 사전-가열된 녹두 용액에 40 ℃에서 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. 용액을 캐스팅 전에 40 ℃에서 유지하였다.

글루텐-아가로스: 우레아-방법에 따라 제조된 글루텐 용액 (15% w/v), 및 다양한 농도 (1% w/v, 2% w/v 및 4% w/v)의 사전-제조된 아가로스 물 용액을 혼합함으로써 상이한 생체중합체 비의 글루텐-아가로스 블렌드를 제조하였다. 각각의 양의 아가로스를 300 mL의 밀리큐™ 물 중에 60 ℃에서 첨가하고, 이들을 완전한 용해까지 2시간 동안 교반함으로써 아가로스 용액을 제조하였다. 균질한 블렌드를 수득하고 캐스팅 전의 아가로스의 고화를 회피하기 위해, 새롭게 제조된 아가로스 용액을 사전-가열된 제인 용액에 40 ℃에서 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. 용액을 캐스팅 전에 40 ℃에서 유지하였다.

1.4 식물-기반 키토산

버섯-기반 키토산은 모더니스트 팬트리로부터 구입하였다. 다양한 농도의 키토산 (5% w/v 및 7% w/v)을 35℃ 혼성화기를 통해 밤새 5% 아세트산에 용해시켰다. 10 g/L 트리페닐 포스페이트를 함유하는 형성 조를 고화/가교를 위해 사용하였다. 키토산 멤브레인을 취급 전에 밤새 가교시켰다.

1.5 K-카라기난

K-카라기난: K-카라기난을 다양한 농도 (2% w/v, 4% w/v 및 10% w/v)에서 밀리큐™ 물에서 90 ℃로 가열하였다. 승온에서 용액을 사전가열된 플레이트 상으로 캐스팅하고, 15g/L의 염화칼슘을 함유하는 형성 조 내로 함침시켰다. 또 다른 시나리오에서, K-카라기난을 용액에서 염화칼슘과 함께 가열하였다. 냉각시, 용액은 멤브레인으로 고화되었다.

b. 멤브레인 제조/형성

멤브레인을 524 마이크로미터-갭 바 또는 600 마이크로미터의 갭을 갖는 핸드-캐스터를 구비한 자동 필름 캐스터 (BYK 드라이브 6 필름 캐스터, 미국 매사추세츠주 레민스터)를 사용하여 캐스팅하였다. 둘 다의 경우, 각각의 멤브레인에 대해 40 mL의 도프 용액을 사용하였고, 약 25 X 15 cm² 면적의 멤브레인 치수가 생성되었다. 멤브레인 제제화에 따라, 상이한 응고 조건이 적용되었다.

중공 섬유에 대해, 도프 용액을 라메-하르트 인스트루먼트, 컴퍼니(Rame-hart instrument, Co.) (미국 뉴저지주 서카서나)로부터 구입한 공동-축 니들을 통해 압출시켰다. 대안적으로, 주문-제조된 실험실-규모 중공 섬유 방사 기계를 사용하였다 - 훨씬 더 높은 점도 (최대 100,000 센티포이즈: cP)의 프로세싱을 허용함.

2.1. 단백질 멤브레인

우레아 또는 혼성화기 방법을 통해 수득되었든지를 막론하고, 플랫 쉬트 단백질 멤브레인을 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고 (도 12a & b 참조), 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, 멤브레인을 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 세척하고, 에탄올/물 용액 70/30% w/v에서 저장하였다.

상이하게, 제인 멤브레인을 2X의 항생제 항진균제 용액을 함유하는 HEPES 완충 용액 (0.1 M, pH 7.4)에서 저장하였다.

2.2. 단백질-알기네이트 블렌드 멤브레인

우레아 또는 혼성화기 방법을 통해 수득되었든지를 막론하고, 플랫 쉬트 단백질-알기네이트 블렌드 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 세척하고, 에탄올/물 용액 70/30% w/v에서 저장하였다.

닥터 블레이드 기술 (관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같음)을 사용하여, 알기네이트 및 녹두 단백질 혼합물을 PTFE 쉬트 상으로 코팅한다. 이어서 쉬트를 15 g/L 염화칼슘을 함유하는 4.5 pH의 아세테이트 완충액 내로 정치한다. pH 11에서 pH 4.5로의 이동은 단백질의 응고를 유발하였고, 염화칼슘은 알기네이트를 가교시켰다. 벤치 상에서, 멤브레인을 10분 동안 완충 용액에 둔다. 멤브레인이 형성되고 백색 (회백색)으로 변하면, 멤브레인을 제거하고, 진탕 99.5% 글리세린 조 내로 10분 동안 넣는다.

2.3. 단백질-아가로스 블렌드 멤브레인

우레아 또는 혼성화기 방법을 통해 수득되었든지를 막론하고, 단백질-아가로스 블렌드 멤브레인을 40 ℃에서 유지된 고온 용액으로부터 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 세척하고, 에탄올/물 용액 70/30% w/v에서 저장하였다.

3. 멤브레인 가교:

3.1 트랜스글루타미나제 (TG)로 가교된 단백질-알기네이트

제인-알기네이트-TG: 상기 기재된 바와 같이 제조된 제인-알기네이트 멤브레인을 HEPES (0.1 M, pH 7.4) 및 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 모더니스트 팬트리 (미국 메인주 엘리엇)로부터 구입한 무글루™ 용액 (TG) (25% w/v)에서 4 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 멤브레인에 대해 125 mL의 무글루™ 용액을 사용하였다. 그 후 각각의 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 250 mL의 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 마지막으로, 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L) 및 2X 농축된 페니실린-스트렙타비딘 및 항진균제를 함유하는 HEPES (0.1 M, pH 7.4)에서 저장하였다.

PPI-알기네이트-TG: 상기 기재된 바와 같이 제조된 PPI-알기네이트 멤브레인을 HEPES (0.1 M, pH 7.4) 및 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 무글루™ (TG) 용액 (25% w/v)에서 4 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 멤브레인에 대해 125 mL의 무글루™ 용액을 사용하였다. 그 후, 각각의 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 250 mL의 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 마지막으로, 멤브레인을 에탄올/물 용액 70/30% w/v에서 저장하였다.

현미-알기네이트-TG: 상기 기재된 바와 같이 제조된 현미-알기네이트 멤브레인을 HEPES (0.1 M, pH 7.4) 및 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 무글루™ (TG) 용액 (25% w/v)에서 4 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 멤브레인에 대해 125 mL의 무글루™ 용액을 사용하였다. 그 후, 각각의 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 250 mL의 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 마지막으로, 멤브레인을 에탄올/물 용액 70/30% w/v에서 저장하였다.

녹두-알기네이트-TG: 상기 기재된 바와 같이 제조된 녹두-알기네이트 멤브레인을 HEPES (0.1 M, pH 7.4) 및 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 무글루™ (TG) 용액 (25% w/v)에서 4 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 멤브레인에 대해 125 mL의 무글루™ 용액을 사용하였다. 그 후, 각각의 멤브레인을 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 250 mL의 HEPES (0.1 M, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 마지막으로, 멤브레인을 에탄올/물 용액 70/30% w/v에서 저장하였다.

3.2 글리세롤과의 열 가교

3.2.1 단백질 멤브레인

멤브레인은 물이 다공성 구조 전반에 걸쳐 교체됨에 따라 반투명에서 투명으로 변화한다. 그로부터, 멤브레인을 제거하고, 130 ℃로 설정된 제3 조 내에 10분 동안 정치한다. 단백질이 가교되면, 스캐폴드가 생물학적 성능을 위한 생리학적 pH에 있음을 보장하기 위해 멤브레인을 7.4 pH의 HEPES 완충액을 함유하는 최종 조에 정치한다.

SPI: SPI 플랫 쉬트 멤브레인을 PTFE 지지 쉬트를 사용하여 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5)에서 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, PTFE 지지된 멤브레인을 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 내지 3시간에 걸쳐 물 용액을 글리세롤에 대해 교체하였다. 그 후, 멤브레인을 고온 글리세롤 조를 통해 또는 오븐을 사용함으로써 열 가교시켰다. 첫번째 경우, 멤브레인을 100 ℃에서 교반된 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 글리세린 조의 최종 온도 (110 ℃ 내지 140 ℃) 및 온도 증가를 달리 함으로써 상이한 온도 경사를 조사하였다. 오븐 처리의 경우, 멤브레인을 100 ℃ 내지 140 ℃의 범위의 상이한 온도에서, 및 10 내지 24시간의 상이한 시간 지속기간 동안 인큐베이션하였다.

녹두: 녹두 플랫 쉬트 멤브레인을 PTFE 지지 쉬트를 사용하여 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, PTFE 지지된 멤브레인을 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 내지 3시간에 걸쳐 물 용액을 글리세롤에 대해 교체하였다. 그 후, 멤브레인을 고온 글리세롤 조를 통해 또는 오븐을 사용함으로써 열 가교시켰다. 첫번째 경우, 멤브레인을 100 ℃에서 교반된 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 글리세린 조의 최종 온도 (110 ℃ 내지 140 ℃) 및 온도 증가를 달리 함으로써 상이한 온도 경사를 조사하였다. 오븐 처리의 경우, 멤브레인을 100 ℃ 내지 140 ℃의 범위의 상이한 온도에서, 및 10 내지 24시간의 상이한 시간 지속기간 동안 인큐베이션하였다.

밀 글루텐: 밀 글루텐 플랫 쉬트 멤브레인을 PTFE 지지 쉬트를 사용하여 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, PTFE 지지된 멤브레인을 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 내지 3시간에 걸쳐 물 용액을 글리세롤에 대해 교체하였다. 그 후, 멤브레인을 고온 글리세롤 조를 통해 또는 오븐을 사용함으로써 열 가교시켰다. 첫번째 경우, 멤브레인을 100 ℃에서 교반된 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 글리세린 조의 최종 온도 (100 ℃ 내지 140 ℃)를 달리 함으로써 상이한 온도 경사를 조사하였다. 오븐 처리의 경우, 멤브레인을 100 ℃ 내지 140 ℃의 범위의 상이한 온도에서, 및 10시간 내지 24시간의 상이한 시간 지속기간 동안 인큐베이션하였다.

3.2.2 단백질-알기네이트 멤브레인

녹두-알기네이트: 녹두-알기네이트 플랫 쉬트 멤브레인을 PTFE 지지 쉬트를 사용하여 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, PTFE 지지된 멤브레인을 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 내지 3시간에 걸쳐 물 용액을 글리세롤에 대해 교체하였다. 그 후, 멤브레인을 고온 글리세롤 조를 통해 또는 오븐을 사용함으로써 열 가교시켰다. 첫번째 경우, 멤브레인을 100 ℃에서 교반된 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 글리세린 조의 최종 온도 (110 ℃ 내지 140 ℃) 및 온도 증가를 달리 함으로써 상이한 온도 경사를 조사하였다. 오븐 처리의 경우, 멤브레인을 100 ℃ 내지 140 ℃의 범위의 상이한 온도에서, 및 10 내지 24시간의 상이한 시간 지속기간 동안 인큐베이션하였다. 도 13을 참조한다.

밀 글루텐-알기네이트: 밀 글루텐-알기네이트 플랫 쉬트 멤브레인을 PTFE 지지 쉬트를 사용하여 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, PTFE 지지된 멤브레인을 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 내지 3시간에 걸쳐 물 용액을 글리세롤에 대해 교체하였다. 그 후, 멤브레인을 고온 글리세롤 조를 통해 또는 오븐을 사용함으로써 열 가교시켰다. 첫번째 경우, 멤브레인을 100 ℃에서 교반된 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 글리세린 조의 최종 온도 (110 ℃ 내지 140 ℃) 및 온도 증가를 달리 함으로써 상이한 온도 경사를 조사하였다. 오븐 처리의 경우, 멤브레인을 100 ℃ 내지 140 ℃의 범위의 상이한 온도에서, 및 10 내지 24시간의 상이한 시간 지속기간 동안 인큐베이션하였다.

제인-알기네이트: 제인-알기네이트 플랫 쉬트 멤브레인을 PTFE 지지 쉬트를 사용하여 CaCl₂ (15 g/L)를 함유하는 아세트산나트륨 완충액 (0.2 M, pH 4.5) 내로 캐스팅하고, 동일한 완충액에서 10분 내지 3시간 동안 평형화시켰다. 그 후, PTFE 지지된 멤브레인을 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 내지 3시간에 걸쳐 물 용액을 글리세롤에 대해 교체하였다. 그 후, 멤브레인을 고온 글리세롤 조를 통해 또는 오븐을 사용함으로써 열 가교시켰다. 첫번째 경우, 멤브레인을 100 ℃에서 교반된 글리세롤 조 내로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 글리세린 조의 최종 온도 (100 ℃에서 110 ℃ 내지 100 ℃에서 140 ℃)를 달리 함으로써 상이한 온도 경사를 조사하였다. 오븐 처리의 경우, 멤브레인을 100 ℃ 내지 140 ℃의 범위의 상이한 온도에서, 및 10 내지 24시간의 상이한 시간 지속기간 동안 인큐베이션하였다.

4 멤브레인 코팅

4.1 소 콜라겐 코팅 (방법 1)

녹두 멤브레인을 소 콜라겐으로 코팅하여 세포에 대한 그들의 친화도를 증가시켜 세포 부착 및 증식을 촉진시켰다. 건조 14 mm-직경 녹두 멤브레인 디스크를 3 mg/mL 콜라겐 용액 (20 mL 콜라겐 용액당 20개의 디스크)에 실온에서 2시간 동안 담그었다. 그 후, 콜라겐 용액을 제거하고, 디스크를 100% 에탄올 용액에 넣고, 사용 전에 4 ℃에서 저장하였다.

4.2 소 콜라겐 코팅 (방법 2)

녹두 멤브레인을 소 콜라겐으로 코팅하여 세포에 대한 그들의 친화도를 증가시켜 세포 부착 및 증식을 촉진시켰다. 건조 14 mm-직경 녹두 멤브레인 디스크를 3 mg/mL 콜라겐 용액 (20 mL 콜라겐 용액당 20개의 디스크)에 실온에서 2시간 동안 담그었다. 그 후, 콜라겐 용액을 제거하고, 디스크를 HEPES 용액 (0.1 M, pH 7.4)에서 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, HEPES 용액을 제거하고, 디스크를 사용 전에 4 ℃에서 70/30 w/v 에탄올-물 용액에서 저장하였다.

4.3 소 피브로넥틴 코팅 (방법 1)

녹두 멤브레인을 소 피브로넥틴으로 코팅하여 세포에 대한 그들의 친화도를 증가시켜 세포 부착 및 증식을 촉진시켰다. 건조 14 mm-직경 녹두 멤브레인 디스크를 2.5 mg/mL 피브로넥틴 용액 (20 mL 피브로넥틴 용액당 20개의 디스크)에 실온에서 2시간 동안 담그었다. 그 후, 피브로넥틴 용액을 제거하고, 디스크를 100% 에탄올 용액에 넣고, 사용 전에 4 ℃에서 저장하였다.

4.4 키토산 코팅

녹두 멤브레인을 키토산으로 코팅하여 세포에 대한 그들의 친화도를 증가시켜 세포 부착 및 증식을 촉진시켰다. 건조 14 mm-직경 녹두 멤브레인 디스크를 1% w/v 키토산 아세트산 용액 (0.2 M, pH 4.5, 20 mL 키토산 용액당 20개의 디스크)에 실온에서 1시간 동안 담그었다. 그 후, 키토산 용액을 제거하고, 디스크를 10% TPP 용액에 넣고, 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 디스크를 밀리큐™ 물로 2X 세척하고, 4 ℃에서 70/30 w/v에서 저장하였다.

저장:

멤브레인을 70/30 에탄올/밀리큐™ w/v 또는 항생제/항진균제를 갖는 HEPES에서 저장할 수 있다. 또는 건조될 수 있는 경우, 그러나 기공 붕괴에 대한 주위가 고려되어야 한다. 건조는 동결 건조 장비로 달성될 수 있다. 물 및 20-40% 글리세린으로 이루어진 또 다른 교체 조가 HEPES를 교체하는데 사용되는 경우, 보다 확장가능하고 유연한 멤브레인이 건조될 수 있다. 멤브레인의 기공이 20-40% 글리세린으로 충전되는 경우, 다공성 구조가 건조될 수 있다. 도 38을 참조한다.

5. 멤브레인에 대한 기계적 연구

멤브레인 기계적 특성을 즈윅로엘 테스터를 사용하여 인장 모드에서 특징규명하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 멤브레인의 탄성 모듈러스는 폭넓은 범위의 값을 커버하여, 본 발명자들의 물질 포트폴리오가 중공 섬유에 대한 다양한 디자인 명세를 포괄적으로 다루는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, k-카라기난-기반 멤브레인은 100 kPa 미만의 탄성 모듈러스를 가지며, 따라서 근육 세포 성장 및 분화를 위한 기질로서 적합하다 (도 15 참조). 중공 섬유는 최종 배양된 육류 생성물의 부분이 되기 때문에, 실제 육류의 텍스처 프로파일은 또한 본 발명자들의 물질에 대한 디자인 명세로서 고려될 필요가 있다. 이에 관하여, 본 발명자들은 육류, 특히 홀 컷 스테이크에 대한 특징인 것으로 공지되어 있는 100-300 kPa 탄성 모듈러스 범위에 해당하는 열 처리된 대두, 아가로스-블렌드 및 일부 알기네이트 블렌드를 디자인하였다. 탄성 모듈러스 및 파단 변형도의 관점에서 가장 높은 기계적 성능은 녹두 및 제인과 같은 순수한 단백질, 또는 알기네이트-단백질 블렌드로 달성된다. 이들 마지막 물질은 중공 섬유가 폭넓은 범위의 제작 공정을 겪고 마지막으로 생물반응기에서 설치되는 경우 작업 조건을 지속하는 것을 허용하는 구조적 성분으로서 사용될 수 있다.

결과

5.1 글리세롤 방법의 최적화

순차적 응고 (1), 중화 (2), 글리세린-물 교체 (3) 및 글리세린 열 처리 (4) 단계를 포함하는 글리세롤 가교를 위한 최종 공정을 표 1에 나타낸 바와 같은 각각의 단계의 효과를 시험함으로써 입증하였다. 아세테이트에서의 응고 및 HEPES에서의 중화 후, 글리세롤 열 처리의 부재 (샘플 1, AC-H-0-0)는 기계적으로 불안정하고 페이스트 일관성을 갖는 멤브레인을 제공한다 (도 16 참조). 유사하게, 글리세롤 처리를 오토클레이빙 (121 ℃)으로 대체하는 것은 불안정하고 취약한 멤브레인을 제공한다 (샘플 4 AC-0-0-HW). 분말-유사 및 기계적 불안정한 멤브레인은 또한 초기 아세테이트 응고 및 중화 단계를 제거하고 단지 글리세롤 열 처리를 적용한 경우 수득되었다 (샘플 3 0-0-G-HG) (도 16 참조). 이는 멤브레인의 안정성을 위해 필수적인 응고된 단백질 망상체를 갖는 것의 중요성을 강조한다. 또한, 응고가 산성 조건에서 일어나지 않고, 오히려 중성 조건 (HEPES)에서 일어나는 경우, 매우 취약한 멤브레인이 수득된다 (샘플 4 0-H-G-HG). 마지막으로, 열 처리 전에 실온에서 물을 글리세롤로 교체하는 것은 가열된 글리세롤 조와 접촉할 때 물의 갑작스런 팽창으로부터 초래되는 큰 버블의 형성을 회피하는 것을 돕는다 (샘플 5 AC-0-0-HG). 그 결과, 가장 좋은 멤브레인은 아세테이트 조를 사용하여 도프 용액을 응고시키고, 실온에서 물을 글리세롤로 교체하고, 마지막으로 가열된 글리세롤 조를 사용하여 단백질 망상체를 열 가교시킴으로써 수득되었다 (샘플 6 AC-0-G-HG). 다른 멤브레인 샘플에 비해, AC-0-G-HG에 따라 수득된 것은 가장 높은 영 모듈러스 및 가장 낮은 변형도를 갖는 가장 안정한 멤브레인을 제공하며, 이는 보다 높은 정도의 단백질 가교를 지시한다 (도 17 참조).

표 1: 글리세롤 가교 방법의 최적화를 위한 실험 조건. AC는 "아세테이트 조 0.2 M, pH 4.5"를 나타내고, H는 "HEPES 조 0.1 M, pH 7.4"를 나타내고, G는 "글리세롤 조"를 나타내고, HG는 "고온 글리세롤 조"를 나타내고, HW는 "온수 처리" (121 ℃ 오토클레이빙)를 나타내고; 0는 "단계가 수행되지 않음"을 나타내고; Y는 "있음"을 나타내고, N은 "없음"을 나타낸다.

글리세롤-기반 열 처리의 각각의 단계를 추가로 최적화하여 멤브레인 모폴로지 및 기계적 특성을 개선시켰다. 아세테이트 조 지속기간을 달리 하고, 물-글리세롤 교체 (10분) 및 글리세롤-기반 열 처리 (온도 경사: 100 ℃에서 10분, 120 ℃로 경사 및 120℃에서 30분) 조건 둘 다를 일정하게 유지함으로써 아세테이트 응고 단계의 효과를 조사하였다. 도 18은 10분 내지 3시간 동안 응고된 멤브레인의 기계적 특성을 나타낸다. 응고 시간의 증가시 탄성 모듈러스, 최종 변형도 및 최종 응력에 대한 통계적 차이는 관찰되지 않으며, 이는 응고가 탐구된 10분 창 내에 완결됨을 지시한다. 이들 결과는 멤브레인 pH의 중화, 따라서 성공적인 응고 공정을 허용하기 위해 10분이 충분함을 시사한다. 다음으로, 응고 조 (10분) 및 물-글리세롤 교체 (10분) 둘 다의 지속기간을 일정하게 유지하고, 120 ℃의 최종 온도에 도달한 후 열 처리 지속기간을 달리 함으로써 글리세롤-기반 열 처리를 조사하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 열 처리 시간의 증가시 최종 변형도 및 응력이 각각 값이 2배 및 3배가 되는 보다 강하고 보다 거친 멤브레인이 수득된다. 30분 후, 멤브레인 기계적 특성은 안정기에 도달하기 시작하며, 30분 및 60분 샘플 사이에 최종 응력의 차이는 거의 없음이 또한 주목된다. 열 처리는 멤브레인의 기계적 특성에 대해 보다 큰 효과를 갖는 것으로 보였기 때문에, 최종 경사 온도의 효과를 평가하기 위한 추가의 조사를 수행하였다. 이 때, 멤브레인의 물리적 특성의 변화를 유동학적 분석을 사용하여 모니터링하였다. 먼저 응고되고 (10분), 물-글리세롤 교체 (10분)를 겪은 멤브레인 상의 유량계 챔버에서 열 처리를 직접적으로 수행하였다. 도 20 & 21에 나타낸 바와 같이, 멤브레인을 20 ℃에서 시작하여 분당 4도의 열 경사에 적용하였고, 100 ℃, 120 ℃ 및 140 ℃의 3개의 상이한 최종 온도에서 평형화시켰다. 50-60 ℃에서, tan(δ)는 감소하기 시작하며, 따라서 이는 단백질 어닐링 공정의 개시가 멤브레인 고화를 초래함을 시사한다. 열-유도된 단백질 언폴딩 및 쇄간 물리적 가교의 형성은 고화 공정을 위한 메카니즘인 것으로 믿어진다. 흥미롭게도, 등온 경사의 최종 온도의 변화시 tan(δ)의 경향이 관찰된다. 경사 최종 온도의 증가에 걸쳐 tan(δ)의 보다 낮은 값이 수득되며, 따라서 이는 어닐링 온도의 증가시 멤브레인이 강화 공정을 겪음을 시사한다. 이 경향은 유동학 실험으로부터 수득된 샘플에 대해 수행된 인장 시험에 의해 확인되었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 최종 등온 온도의 증가시 탄성 모듈러스, 최종 응력 및 변형도의 증가가 관찰된다.

멤브레인 구조 형성은 대략 50-60 ℃에서 시작하고, 그들의 최종 등온 온도와 무관하게 동일한 속도로 형성하기를 계속한다. 그러나, 최종 생성된 멤브레인 구조 강도는 최종 등온 상태에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 보다 높은 등온 온도는 보다 큰 탄성 (보다 낮은 tan(δ))을 갖는 멤브레인을 제공한다.

6. 세포 배지에서의 안정성 시험

세포-배양 조건 하에서 물질의 안정성을 시험하기 위해, 멤브레인을 세포 배지에서 37 ℃에서 30일까지 인큐베이션하고, 기계적 시험을 상이한 시점에서 수행하여 그들의 완전성을 조사하였다. K-카라기난 및 그의 완두콩 단백질 단리물 블렌드는 세포 배양 배지에서 매우 불안정한 것으로 변하여, 이미 1일의 인큐베이션 후 완전한 용해를 겪었다. 상이하게, 알기네이트 및 아가로스 블렌드는 보다 긴 인큐베이션 시간에 걸쳐 보다 안정한 것으로 밝혀졌다. 후자의 경우, 멤브레인의 성능은 알기네이트 및 아가로스 폴리사카라이드 성분의 안정성에 의해 주로 영향을 받는 것으로 믿어진다. 이 관찰은 폴리사카라이드의 성질에 따라 2개의 별개의 안정성 경향의 존재에 의해 지지된다. 알기네이트 블렌드는 탄성 모듈러스 및 변형도 둘 다의 극적인 감소를 겪고, 제인 블렌드는 10배 초과의 탄성 모듈러스의 감소를 겪는다. 대조적으로, 아가로스 블렌드는 21일의 전체 인큐베이션 기간 전반에 걸쳐 거의 완전히 그들의 기계적 특성을 보존한다. 도 22, 23, 24 및 25를 참조한다.

알기네이트 블렌드의 경우, 기계적 안정성의 점차적 감소는 칼슘-글루타르산 가교 중합체 망상체의 탈착물화에 의해 유발되는 것으로 믿어졌다. 이 가설은 멤브레인 표면적의 증가로서 정량화된 인큐베이션 시간시 멤브레인의 주목할 만한 팽윤 거동에 의해 지지된다 (도 22). 대조적으로, 아가로스 블렌드-기반 멤브레인에 대해서는 팽윤이 관찰되지 않았다. 팽윤 및 기계적 안정성 경향 사이의 상관관계는 폴리사카라이드 망상체가 멤브레인의 주요 구조적 성분임을 지시하며, 이는 알기네이트의 경우, 배양 조건 하에서 실패하기 쉬웠다.

세포-배양 조건에서 알기네이트-단백질 블렌드의 안정성을 증가시키기 위해, 단백질 성분의 가교를 조사하였다. 트랜스글루타미나제를, 그것이 프로세싱된 육류의 제조를 위해 식품 산업에서 통상적으로 사용되기 때문에, 시험하기 위한 첫번째 가교 후보로서 선택하였다. 현미-알기네이트 블렌드에 대해 나타낸 바와 같이, 또한 이 경우, 인큐베이션 시간의 증가시 탄성 모듈러스 및 변형도 둘 다의 감소가 관찰되었다. 도 26을 참조한다.

단백질 중합체 망상체의 물리적 가교를 유도하고 궁극적으로 세포 배양 동안 멤브레인을 안정화시키는 대안적 접근법으로서 열 어닐링을 선택하였다. 상 역전이를 통해 형성된 멤브레인 다공성 구조의 붕괴를 회피하기 위해, 글리세롤을 물 교체 배지 및 또한 어닐링 공정을 위한 열 전달 벡터 둘 다로서 사용하였다. 알기네이트 블렌드에 비해, 열 어닐링된 대두 및 녹두 둘 다는 37 ℃에서 세포 배지에서 인큐베이션된 경우 탄성 모듈러스의 감소를 나타내지 않는다. 21일 후, 대두 멤브레인은 그의 값의 거의 2배인 탄성 모듈러스의 증가를 겪었다. 파단 변형도 (파단 연신율)는 영향을 받지 않았지만, 대두의 경우, 표면적의 약간의 감소는 시간 경과에 따라 발생하는 가능한 추가의 가교 공정을 시사하였다. 30일의 인큐베이션 후 녹두에 대해 파단을 유발하는데 필요한 힘의 약간의 감소가 관찰되었다. 알기네이트-단백질 블렌드에 비해 세포 배양 조건에서 보다 높은 기계적 안정성 및 아가로스-단백질 블렌드에 비해 보다 높은 파단 변형도는 이들 열-처리된 순수한 단백질 물질을 생물반응기 적용을 위한 멤브레인의 개발을 위한 바람직한 후보로 만든다. 도 27을 참조한다.

7. 다공도의 화상화

7.1 플랫 쉬트 멤브레인

생성된 멤브레인의 다공도를 주사 전자 현미경검사를 통해 조사하였다. 도 28 및 29에 각각 나타낸 바와 같이, 열-처리된 대두 및 녹두 단백질 멤브레인은 이질적인 다공도를 제시하며, 이는 표면 상의 서브마이크로미터 범위의 보다 작은 기공 및 단면에 위치한 20-50-마이크로미터 범위의 보다 큰 기공을 특징으로 한다. 응고 공정 동안 멤브레인-조 용액 계면에서 발생하는 빠른 응고 공정은 표면 상에 위치한 보다 얇은 다공도에 기원하는 것으로 믿어진다. 대조적으로, 멤브레인의 코어에서 발생하는 보다 느린 응고 공정은 보다 큰 기공을 제공하는 보다 큰 상 분리를 허용한다. 균질한 다공도가 전체 멤브레인 전반에 걸쳐 관찰되는 제인 및 아가로스-제인의 경우 상이한 시나리오가 관찰된다. 도 30은, 이 후자의 경우, 상 분리 공정이 매우 균질한 기공 크기 분포를 초래하는 원섬유형성의 결과였음을 나타낸다. 본 발명은 이론에 제한되지는 않지만, 아가로스 및 제인 둘 다가 단백질 자기-조립을 통해 원섬유형성을 겪는 것으로 공지되어 있다고 가설화된다. 알기네이트-제인 및 완두콩-k-카라기난 멤브레인의 경우 유사한 결과가 관찰되었으며 (도 31 참조), 여기서 생체중합체 원섬유형성은 또한 멤브레인 형성을 위한 선두적인 공정이었다. 대조적으로, 녹두-아가로스 및 대두-알기네이트 멤브레인에 대해 스키닝 효과가 관찰되었다. 도 32를 참조한다.

7.2 중공 섬유 멤브레인

중공 섬유의 다공도를 주사 전자 현미경을 사용하여 조사하였다. 도 33은 녹두-알기네이트 (15% - 0.2%) 중공 섬유의 단면 (상부) 및 표면 (하부)을 나타낸다. 섬유는 전체 단면 전반에 걸쳐 50-마이크로미터 범위 및 미만의 기공을 제시하는 반면, 스키닝 효과는 관찰되지 않았다. 섬유 벽 두께는 100-마이크로미터 범위였으며, 이는 200 마이크로미터 초과의 두께를 갖는 조직에서 전형적으로 관찰되는 이론적 확산을 고려하는 외부 영양소 확산을 최적화하도록 표적화된 값이다.

8. 세포 부착 및 증식 연구

생성된 멤브레인을 C2C12 (도 34, 35 및 36 참조) 및 QM7 (도 37 참조) 세포주를 사용하여 세포 부착 및 증식에 대해 시험하였다. 일반적으로, 순수한 단백질 멤브레인의 경우 보다 높은 정도의 부착 및 증식이 관찰되었으며, 이 관찰은 C2C12 및 QM7 둘 다의 경우 보다 연신된 모폴로지를 갖는 세포의 존재에 의해 지지되었다. 단백질 멤브레인을 세포-부착 단백질, 예컨대 콜라겐 및 피브로넥틴으로 코팅한 경우 가장 좋은 결과가 달성되었다. 상이하게, 단백질-폴리사카라이드 블렌드의 경우 보다 구형 및 클러스터-유사 조립된 세포가 발견되었으며, 이는 C2C12 및 QM7 세포주 둘 다에 대한 물질의 보다 낮은 친화도를 지시한다.

Claims (37)

1. a) i) 1종 이상의 식용 단백질, ii) 1종 이상의 용매 iii) 형성 조를 제공하는 단계로서, 여기서 1종 이상의 용매 또는 형성 조는 또한 1종 이상의 다가 양이온 또는 음이온 또는 완충 용액을 포함하는 것인 단계;
   b) 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 식용 단백질을 공동-혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
   c) 혼합물을 형성 조 내로 압출시켜 압출된 중공 섬유를 형성하거나, 또는 혼합물을 형성 조 내로 캐스팅하여 쉬트 멤브레인을 형성하는 단계; 및
   d) 압출된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 1종 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 가교시키는데 충분한 열 및 조사 중 1종 이상으로부터 선택되는 에너지 공급원에 노출시켜 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 형성하는 단계
   를 포함하는, 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 1종 이상의 식용 폴리사카라이드를 추가로 제공하고, 단계 b)에서, 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 폴리사카라이드를 1종 이상의 식용 단백질과 공동-혼합하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 가소제를 추가로 제공하고, 단계 b)에서 1종 이상의 용매에서 가소제를 1종 이상의 식용 단백질과 공동-혼합하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 1종 이상의 단백질이 완두콩, 대두, 밀, 호박, 쌀, 현미, 해바라기, 카놀라, 병아리콩, 렌틸, 녹두, 흰강낭콩, 옥수수, 귀리, 감자, 퀴노아, 수수 및 땅콩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 1종 이상의 폴리사카라이드가 아가, 키토산, 키틴, 알기네이트, 알긴산나트륨, 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 겔란 검, 크산탄 검, 펙틴, 타피오카, 구아 검 및 빈 검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 용매가 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산, 수산화나트륨, 에탄올, 글리세린 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 형성 조가 1) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 2) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 이온이 Ca2+, Mg2+, Fe3+, Zn2+, 트리폴리포스페이트 및 시트르산삼나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 선택된 이온이 1종 이상의 폴리사카라이드의 부분 가교를 적어도 가능하게 할 수 있는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 단계 d)에서 상기 열이 약 0 PSI 내지 약 20 PSI 게이지의 압력 하에서, 약 50% 내지 약 100%의 상대 습도에서, 약 2 내지 약 60분 동안 적용된 약 70 ℃ 내지 약 140 ℃이거나, 또는 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인이 대기 조건에서 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃인 수조에서 침지되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 단계 b)의 혼합물이 가열되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 단계 b)의 공동-혼합이 약 0 ℃ 내지 약 90 ℃에서 수행되는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 혼합물이 약 10 내지 약 13의 pH이고, 상기 제제화 조가 약 3 내지 약 5의 pH인 방법.
13. 제12항에 있어서, 형성 후에 상기 멤브레인이 약 6.8 내지 약 7.8의 pH로 중화되는 것인 방법.
14. 제12항에 있어서, 형성 후에 상기 멤브레인이 약 7.3 내지 약 7.5의 pH로 중화되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 조사가 전자 빔, UV 광 및 감마 조사로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 조사가 공정 중에 또는 공정 후에 적용되는 것인 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 조사가 약 1 내지 약 100 kGy 또는 약 10 내지 약 50 kGy인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 다공도가 약 1% 내지 약 90%인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 다공도가 약 50% 내지 약 80%인 방법.
20. 제1항에 있어서, 방법이 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 코팅으로 코팅하여 세포 부착을 향상시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 코팅이 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴 또는 그러한 단백질로부터 단리된 짧은 펩티드 서열 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 짧은 펩티드 서열이 RGD, YIGSR, IKVAV, DGEA, PHRSN 및 PRARI로 이루어진 군 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 방법이 가교된 식용 다공성 중공 섬유의 외표면을 변형시켜 세포 부착을 향상시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
24. 제1항에 있어서, 방법이 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 가소제로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 표면 변형이 플라스마, 코로나, 연마, 식각, 삭마, 또는 스퍼터 코팅 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 용매에서의 그의 용해 전에 분말화되거나 미세 분쇄되는 것인 방법.
27. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 순수한 것인 방법.
28. 제1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드가 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% 순수한 것인 방법.
29. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 10:1 내지 대략 1:10 또는 대략 1:99 내지 대략 99:1인 방법.
30. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 4:1 내지 대략 1:4인 방법.
31. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 내의 단백질 대 폴리사카라이드의 비가 대략 1:1 또는 대략 7:1인 방법.
32. 제1항에 있어서, 형성 조가 i) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 ii) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인.
34. a) i) 1종 이상의 식용 단백질, ii) 1종 이상의 식용 폴리사카라이드, iii) 1종 이상의 용매 및 iv) 형성 조를 제공하는 단계로서, 여기서 형성 조는 1) 물, 아세트산, 시트르산, 락트산, 인산, 말산, 타르타르산 중 1종 이상, 또는 2) 수산화나트륨 및 수산화칼륨 중 1종 이상과 조합으로, 칼슘, 아연, 마그네슘, 철 및 칼륨 중 1종 이상을 포함하는 것인 단계;
    b) 1종 이상의 용매에서 1종 이상의 식용 단백질 및 1종 이상의 식용 폴리사카라이드를 공동-혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
    c) 혼합물을 형성 조 내로 압출시켜 압출된 중공 섬유를 형성하거나, 또는 혼합물을 캐스팅하여 쉬트 멤브레인을 형성하는 단계; 및
    d) 압출된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 1종 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 가교시키는데 충분한 열 및 조사 중 1종 이상으로부터 선택되는 에너지 공급원에 노출시켜 가교된 식용 다공성 중공 섬유를 형성하는 단계
    를 포함하는, 가교된 식용 다공성 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인을 제조하는 방법.
35. 제34항의 방법에 의해 제조된 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 단백질, 1종 이상의 폴리사카라이드, 1종 이상의 용매, 가소제 및/또는 형성 조의 1종 이상의 구성성분이 미국 식품 의약국 (FDA)에 의해 안전한 것으로 일반적으로 인정되는 (GRAS) 것인 방법 또는 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 쉬트 멤브레인 또는 중공 섬유가 기공 붕괴 없이 건조하기 위해 물 중 10 - 50% 글리세롤 교체를 겪는 것인 방법 또는 중공 섬유 또는 쉬트 멤브레인.

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