CN118119697A - 通过pH诱导的相分离制备可食用多孔交联中空纤维和膜的方法及其用途 - Google Patents
通过pH诱导的相分离制备可食用多孔交联中空纤维和膜的方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
一种制备适用于制备清洁肉产品的交联、可食用、多孔的中空纤维和膜片的方法、由其制成的中空纤维和膜片及其使用方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月19日提交的美国临时专利申请第63/234,796号的优先权,该申请的全部内容通过引用整体并入本文。
背景技术
膜完整性和孔性能对于基于膜的生物反应器的有效使用至关重要。膜需要是自支撑的,以允许培养基和营养物质通过膜转移而不影响支撑结构,并为贴壁细胞(adherentcell)的培养提供更大的表面积。此外,为了生产可食用食品,膜需要由公认安全的(GRAS)材料制成。而且,从技术方面(即无毒且可消化)和从可行、消费者可接受方面(即具有消费者可接受的质构(texture)和口感)两方面来看,在本领域中尚未实现可食用膜的制备。此类膜的生产,无论是扁平片状(例如纳米多孔膜)还是纤维(例如中空纤维)都难以实现。所需要的是用于基于膜的生物反应器且具有高度完整性(integrity)的膜,其适合于细胞培养并且是可食用的。
发明内容
本发明人已开发出一种新颖且非显而易见的制备膜(即膜型薄膜和纤维)的方法,所述方法通过例如pH诱导的相分离或质子诱导的相分离来实现,所述膜具有用于生产供人类和动物消费的食品的生物反应器所必需的结构完整性。这些膜由GRAS材料制成,具有自支撑性(即,在处理或暴露于生物反应器中培养条件所需的流体力时,不会自行坍塌,也不会容易撕裂或容易撕破),并且从技术方面和从可行、消费者可接受方面是可食用的。
在最宽泛的实施方案中,本发明的膜包含一种或多种植物或动物蛋白、一种或多种可食用多糖以及任选存在的一种或多种多糖交联剂。将一种或多种蛋白、一种或多种多糖和任选存在的一种或多种交联剂共混合并挤出到形成浴(formation bath)中。形成浴含有导致膜中多糖交联的一种或多种离子(即,阳离子或阴离子)。另外,在本发明的一些方面,形成浴中的pH变化导致相分离诱导的膜形成。
本发明人根据经验了解到,膜中多糖的交联通常不足以确保足够的膜完整性,尤其是在细胞培养条件下(参见实施例)。本发明人还发明了一种赋予膜所需完整性的方法。在形成浴中形成膜之后,然后将膜暴露于能源(energy source)诸如热或辐射。虽然不受理论限制,但是本发明人相信,暴露于能源导致膜中的多糖和/或蛋白交联,从而为膜提供必需的完整性,同时保持消费者接受所需的品质。
还考虑了提供用于食品的膜,化学交联的现有技术经常使用有毒化合物,而对于该应用需要避免这些有毒化合物。替代地,现有技术的聚合物改性技术可用于增加交联位点,但可能遇到监管挑战。
另一方面,可以用一种或多种试剂对本发明的膜进行涂布或其他方式改性,以例如增强细胞附着(cell attachment)和细胞生长。可以在暴露于热或辐射之前或之后对膜进行涂布。
在形成、暴露于能源和任选的涂布之后,可以将膜部分干燥和/或储存或进行进一步加工(例如,通过切割成一定尺寸并结合到生物反应器柱筒(cartridge)或胶囊中)。
因此,本发明涉及用于(基于膜或纤维的)膜生物反应器的可食用3D纳孔和微孔(nano and micro porous)结构,用于生产例如结构化清洁肉(clean meat)产品。培养基穿过膜以在膜的一个或两个表面上喂饲细胞。对于贴壁细胞存在现有技术的中空纤维膜生物反应器,但需要胰蛋白酶或其他化学/酶促步骤来去除这些细胞。这对于商业规模的清洁肉生产来说过于昂贵,而且还会破坏任何组织状结构。因此,本发明考虑了一种与用于生产培养肉(cultured meat)产品的肉细胞一起消耗的膜。本发明还考虑了一种至少部分可溶解的膜。这方面可能需要例如使最终的结构化肉(structured meat)产品达到所需的质构。
本领域已经描述了用于贴壁细胞支架的食品基材料。然而,这些材料型式(format)并不适合(中空纤维)膜生物反应器。这些材料型式通常是无孔薄膜、纤维基垫(诸如静电纺丝或旋转喷射纺丝)或海绵(通常源自冷冻干燥、挤出工艺和/或发泡工艺)。
膜生物反应器需要非常特定的孔径和特定的膜几何形状。中空纤维生物反应器(HFBR)的孔径通常在5KDa至0.1μm之间,取决于细胞类型、生物反应器设计和生物工艺。
虽然本发明考虑了中空纤维,但是本发明的一般概念也可以应用于扁平片状(薄膜状)膜。例如,通过以下方法来形成膜片(sheet membrane):将聚合物流延在牺牲表面上,然后其进入设计用于固化聚合物的浴中。中空纤维通过从喷嘴/喷丝头纺入浴中而形成。当生产中空纤维时,还必须正确地确定和控制芯液(bore fluid),这点为本领域技术人员所知。有关膜片和中空纤维生产的更多详细信息如下。
我们发明的用于产生本发明的膜的方法利用多个步骤。出于人类营养考虑和细胞粘附(cell adherence)考虑,优选高蛋白含量。然而,蛋白的分子量通常太低,无法为形成纤维的性能提供足够的链缠结或结构完整性。因此,将额外的“载体”聚合物添加到膜聚合物(即纺液溶液(dope solution))中。如本文所教导,载体聚合物是多糖,例如选自海藻酸盐、纤维素、果胶、甲壳素、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)、葡甘露聚糖(glucomannan)和本领域普通技术人员已知的其他多糖中的一种或多种。
一种或多种蛋白和一种或多种多糖在GRAS溶剂共混物中混合。一旦选择了一种或多种蛋白和一种或多种多糖并形成了其混合物,则它们在固化(形成)浴中固化以瞬时或几乎瞬时锁定正在流延的膜的尺寸。在一个实施方案中,考虑了所述浴含有多价阳离子,例如Ca2+、Mg2+或类似物。具体地,本发明人证明了,Ca2+将瞬时交联膜中的海藻酸盐、果胶或其他多糖。这固定了纤维/片材的尺寸,实现了所需的三维目标。
然而,此时蛋白并未交联,而多糖仅以离子方式交联。如文献中所述并在实践中发现,以离子方式交联的多糖可以在细胞培养基中解离。因此,需要额外的交联步骤来进一步提高膜的稳定性并确保其在用于细胞培养时的完整性。由于共价交联需要刺激性(harsh)化学物质,因此这种方法对于可食用产品来说不是优选的。本发明的创新之处在于使用物理交联,所述物理交联通过能源,诸如热、γ射线、电子束、β射线、X射线或紫外光(UV)中的一种或多种,来产生。本领域技术人员理解这些在食品中使用是安全的,因为它们在食品工业中用于杀死或削弱潜在的病原体。
本发明还考虑了的一种替代方法是使用已经批准用于食品用途的、针对蛋白的交联剂,诸如转谷氨酰胺酶。还考虑了,作为将蛋白交联的补充和替代,可以在产生混合物之前对一种或多种多糖进行改性,以增加聚合物上潜在的交联位点。
本发明还考虑了其他方法,诸如将蛋白直接溶解到醇/水共混物中,并且在酸浴中将膜固化。本发明还考虑了将植物蛋白分离物溶解在碱性溶液中,然后用有机凝结剂如醇或中和酸/苛性碱溶液固化。例如,如果将壳聚糖溶解在5%的乙酸中,并且挤出到pH值较高的浴中,则聚合物将固化成纤维形状。
也可以将壳聚糖溶解在微酸性浴(约5%的乙酸、柠檬酸或类似物)中,然后在含有一定浓度的三聚磷酸盐/三聚磷酸钠(TPP)的浴中沉积/纺丝,这将保持和/或维持固化壳聚糖的孔隙率。芯液还可以含有与浴液类似的溶液。
还可以将一种或多种化学或酶交联剂添加到芯液(当形成实心或中空纤维时在喷嘴孔处使用的流体;芯液是本领域普通技术人员已知的)和/或形成浴中以有助于多糖和蛋白共混物中植物蛋白的交联。可以任选地包含在浴或芯液中的交联剂的实例是转谷氨酰胺酶、三聚磷酸盐、京尼平(genipin)(京尼平是一种在靛榄(Genipa americana)果实提取物中发现的化合物)或本领域普通技术人员已知的其他氧化酶。
本发明的另一个方面是纺液溶液(即蛋白和多糖的混合物)可以浸渍不溶性(至少在所使用的溶剂系统中不溶)纤维。这些纤维可以例如是细菌纳米纤维素、纳米纤维素或其他合适的纤维。这些纤维可以起到两种作用,第一种是机械增强作用,这将导致如应力-应变曲线图所定义的增加的“韧性”。这些纤维的第二种作用是促进肌管对齐。在挤出期间,这些纤维将其本身自然地与中空纤维对齐,并且位于中空纤维膜表面的那些纤维将促进在那里生长的细胞的对齐。
本发明的另一方面是纤维本身的几何形状和形貌。优选地,纤维具有约300至约700微米的外径。与纤维长度平行、基本上平行或根本上平行延伸的条纹或凹槽可以是期望的结构特征并且构建到通过本发明方法制备的纤维中。沿着纤维的条纹或凹槽可以通过本领域普通技术人员已知的方法构建到纺丝过程中:通过纺液溶液配制和混合、通过喷嘴几何形状、或通过形成浴的湍流。
还考虑了所述方法中的另一步骤可以通过使用改变膜或纤维表面或涂布膜或纤维的所需化学方法或化合物,来增加膜和纤维上的细胞粘附。合适的方法和化合物的实例包括但不限于等离子体处理、通过添加蛋白(包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、胶原、明胶等)或从这些蛋白分离的短肽序列(包括但不限于RGD、YIGSR、IKVAV、DGEA、PHRSN、PRARI等)来添加细胞结合位点。
考虑了也可用于细胞粘附之外的目标应用的涂层。肝素可以增加纤维表面处生长因子的浓度。也可以应用有助于细胞分化的化合物。例如,具有高脂质含量的涂层可以促进合适的细胞分化为脂肪细胞。
还考虑了针对非生物(即,与所期望细胞的生长和维持不直接相关)结果的一种或多种涂层。防腐剂和/或抗生素可用于在培养之前和期间防止腐败或维持无菌环境。染料、颜料、β-胡萝卜素等可以作为涂层施用或直接施用到纤维纺液溶液中以获得所需的外观。类似地,香料和芳香剂可以作为涂层施用或直接施用到纤维纺液溶液中以提供所期望的风味特征。增塑剂(例如,糖醇诸如山梨糖醇和甘油)也可以作为涂层施用或直接施用到纺液溶液中或施用到芯液中。增塑剂将提高可处理性,最大限度地减少孔坍塌,延长保质期,并且改变口感。
本发明还包括通过本发明方法制备的膜(中空纤维和膜片)。
本发明考虑了一种用于制备交联、可食用、多孔的中空纤维和膜片的方法,其包括:a)提供:i)一种或多种可食用蛋白,ii)一种或多种可食用多糖,iii)一种或多种溶剂和iv)形成浴,其中所述一种或多种溶剂或所述形成浴还包含一种或多种多价阳离子或阴离子;b)将所述一种或多种可食用蛋白和所述一种或多种可食用多糖在所述一种或多种溶剂中共混合以形成混合物;c)将混合物挤出到形成浴中以形成挤出中空纤维或将混合物流延在浴上以形成膜片;和d)将挤出中空纤维或膜片暴露于能源,所述能源选自热和辐射中的一种或多种,并且足以使所述一种或多种蛋白至少部分地交联以形成交联、可食用、多孔的中空纤维。
本发明方法还考虑了所述一种或多种蛋白选自豌豆、大豆、小麦、南瓜、大米、糙米、向日葵、油菜籽(canola)、鹰嘴豆、小扁豆(lentil)、绿豆、菜豆、玉米、燕麦、马铃薯、藜麦、高粱和花生。
本发明方法还考虑了所述一种或多种多糖选自琼脂、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、海藻酸钠、纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、结冷胶、黄原胶、果胶、木薯淀粉、瓜尔胶和豆胶。
本发明方法还考虑了所述一种或多种溶剂选自水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸、氢氧化钠、乙醇、甘油和丙二醇。
本发明方法还考虑了所述离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、三聚磷酸盐和柠檬酸三钠,并且其中选出的离子至少能使所述一种或多种多糖部分交联。
本发明方法还考虑了所述加热为约120℃至约140℃,在约0psi至约20psi表压(gauge)的压力下、在约50%至约100%的相对湿度下施加约2至约60分钟,或在大气条件下将纤维浸入约60℃至约100℃的水浴中。
本发明方法还考虑了所述辐射选自电子束、紫外光和γ辐射,所述辐射在处理中(in process)或处理后(post process)施加,并且所述辐射为约1至约100kGy或约10至约50kGy。
本发明方法还考虑了中空纤维或膜片的孔隙率为约1%至约90%或约50%至约80%。
本发明方法还考虑了所述方法还包括用涂料涂布交联、可食用、多孔的中空纤维以增强细胞粘附。
本发明方法还考虑了所述涂料选自纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、胶原、明胶或从这些蛋白分离的短肽序列中的一种或多种。
本方法还考虑了所述短肽序列选自RGD、YIGSR、IKVAV、DGEA、PHRSN和PRARI。
本方法还考虑了所述方法还包括将所述交联、可食用、多孔的中空纤维的外表面改性以增强细胞粘附并且所述表面改性选自等离子体、电晕、磨蚀(abrasion)、蚀刻、烧蚀或溅射涂布中的一种或多种。
本方法还考虑了在将蛋白溶解在溶剂中之前将所述蛋白粉末化或精细研磨。
本方法还考虑了所述蛋白的纯度至少为70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%。
本发明方法还考虑了所述多糖的纯度至少为70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%。
本发明方法还考虑了所述混合物中蛋白与多糖的比率为约10:1至约1:10,或所述混合物中蛋白与多糖的比率为约4:1至约1:4。本发明方法还考虑了所述混合物中蛋白与多糖的比率为约1:1。本方法还考虑了所述混合物中蛋白与多糖的比率为约1:7或约7:1。在一些情况下,蛋白与多糖的固体比率为100:1或约1:100,或仅为100%蛋白分离物。
本发明方法还考虑了所述形成浴包含例如RO(反渗透)水,RO水含有浓度为15g/L或约15g/L的溶解氯化钙,然而,期望的浓度可以为约4g/L至约20g/L、约12g/L至约18g/L或约14g/L至约16g/L。在连续工艺中,形成浴将具有进料和放料系统,其中将制备好的15g/L的氯化钙进料到浴的一侧,并且以相同的速率对浴进行放料。
本发明方法还考虑了所述形成浴包含具有钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种的RO水与以下物质的组合:i)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或ii)氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
本发明方法还考虑了一种用于制备交联、可食用、多孔的中空纤维和膜片的方法,其包括:a)提供:i)一种或多种可食用蛋白,ii)一种或多种可食用多糖,iii)一种或多种溶剂和iv)形成浴,其中所述形成浴主要是水并且还包含氯化钙、氯化锌、镁离子、钾中的一种或多种,与以下物质的组合:1)乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸或其他合适的酸中的一种或多种,或2)氢氧化钠和氢氧化钾或其他合适的碱中的一种或多种;b)将所述一种或多种可食用蛋白和所述一种或多种可食用多糖在所述一种或多种溶剂中共混合以形成混合物;c)将混合物挤出到形成浴中以形成挤出中空纤维或将混合物流延在浴上以形成膜片;和d)将挤出中空纤维或膜片暴露于能源,所述能源选自热和辐射中的一种或多种,并且足以使所述一种或多种蛋白至少部分地交联以形成交联、可食用、多孔的中空纤维。在该实施方案中,形成浴补充有离子。
本方法还涉及并考虑了通过本发明方法制备的任何中空纤维或膜片(即,片状膜)。
本发明还涉及用本发明的膜生产的清洁肉(clean meat)、结构化肉(structuredmeat)、培养肉(cultured meat)、实验室生长肉(lab grown meat)、栽培肉(cultivatedmeat)、细胞基肉(cell-based meat)等及其制备方法。
考虑了本发明涉及一种用于制备交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片的方法,所述方法包括:a)提供:i)一种或多种可食用蛋白,ii)一种或多种溶剂,iii)形成浴;其中所述一种或多种溶剂或形成浴还包含一种或多种多价阳离子或阴离子或缓冲溶液;b)将所述一种或多种可食用蛋白在所述一种或多种溶剂中共混合以形成混合物;c)将混合物挤出到形成浴中以形成挤出中空纤维或将混合物流延到形成浴中以形成膜片;和d)将挤出中空纤维或膜片暴露于能源,所述能源选自热和辐射中的一种或多种,并且足以使所述一种或多种蛋白至少部分地交联以形成交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片。
还考虑了本发明方法涉及提供一种或多种可食用多糖并且将所述一种或多种多糖与所述一种或多种可食用蛋白在所述一种或多种溶剂中共混合。
还考虑了本发明方法涉及提供增塑剂并将增塑剂与所述一种或多种可食用蛋白在所述一种或多种溶剂中共混合。
还考虑了本发明方法涉及其中所述一种或多种蛋白选自豌豆、大豆、小麦、南瓜、大米、糙米、向日葵、油菜籽、鹰嘴豆、小扁豆、绿豆、菜豆、玉米、燕麦、马铃薯、藜麦、高粱和花生。
还考虑了本发明方法涉及所述一种或多种多糖选自琼脂、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、海藻酸钠、纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、结冷胶、黄原胶、果胶、木薯淀粉、瓜尔胶和豆胶。
还考虑了本发明方法涉及所述一种或多种选自水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸、氢氧化钠、乙醇、甘油和丙二醇。
还考虑了本发明方法涉及其中所述形成浴包含钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种,与以下物质的组合:1)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或2)氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
还考虑了本发明方法涉及其中所述离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、三聚磷酸盐和柠檬酸三钠,并且其中选出的离子至少能使所述一种或多种多糖部分交联。
还考虑了本发明方法涉及其中将步骤b)的混合物加热。
还考虑了本发明方法涉及其中将所述形成的中空纤维或膜片在约0psi至约20psi(表压)的压力下、在约50%至约100%的相对湿度下、在约70℃至约140℃或约120℃至140℃下加热,持续约2至约60分钟,或在大气条件下将中空纤维或膜片浸入约60℃至约100℃的水浴中。
还考虑了本发明方法涉及其中所述共混合在约0℃至约90℃下进行。
还考虑了本发明方法涉及其中所述混合物的pH为约10至约13并且所述形成浴的pH为约3至约5。
还考虑了本发明方法涉及其中在形成之后,将膜中和至约6.8至约7.8的pH。
还考虑了本发明方法涉及其中在形成之后,将膜中和至约7.3至约7.5的pH。
还考虑了本发明方法涉及其中所述辐射选自电子束、紫外光和γ辐射。
还考虑了本发明方法涉及其中在处理中或处理后施加辐射。还考虑了本发明方法涉及其中所述辐射为约1至约100kGy或约10至约50kGy。
还考虑了本发明方法涉及其中所述中空纤维或膜片的孔隙率为约1%至约90%、约25%至约75%或约40%至约60%。
还考虑了本发明方法涉及其中所述中空纤维或膜片的孔隙率为约50%至约80%。
还考虑了所述方法还包括用涂料涂布所述交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片以增强细胞粘附。
还考虑了本发明方法涉及其中所述涂料选自纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、胶原、明胶或从这些蛋白分离的短肽序列中的一种或多种。
还考虑了本发明方法涉及其中所述短肽序列是选自RGD、YIGSR、IKVAV、DGEA、PHRSN和PRARI中的一种或多种。
还考虑了本发明方法涉及将所述交联、可食用、多孔的中空纤维的外表面改性以增强细胞粘附。还考虑了本发明涉及还包括用增塑剂涂布交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片的方法。还考虑了本发明涉及其中所述表面改性选自等离子体、电晕、磨蚀、蚀刻、烧蚀或溅射涂布中的一种或多种。
还考虑了本发明方法涉及其中在将蛋白溶解于溶剂中之前,将所述蛋白粉末化或精细研磨。
还考虑了本发明方法涉及其中所述蛋白的纯度至少为70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%。
还考虑了本发明方法涉及其中所述多糖的纯度至少为70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%。
还考虑了本发明方法涉及其中所述混合物中蛋白与多糖的比率(蛋白:多糖)为约10:1至约1:10或约1:99至约99:1、98:2、97:3、96:4、95:5或90:10。还考虑了本发明涉及其中所述混合物中蛋白与多糖的比率为约4:1至1:4。还考虑了本发明涉及其中所述混合物中蛋白与多糖的比率为约1:1或7:1。
还考虑了本发明涉及其中所述形成浴包含钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种,与以下物质的组合:i)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或ii)氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
还考虑了本发明涉及通过本发明的任何方法制备的中空纤维或膜片。
考虑了本发明涉及一种用于制备交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片的方法,其包括:a)提供:i)一种或多种可食用蛋白,ii)一种或多种可食用多糖,iii)一种或多种溶剂和iv)形成浴,其中所述形成浴包含钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种,与以下物质的组合:1)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或2)氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种;b)将所述一种或多种可食用蛋白和所述一种或多种可食用多糖在所述一种或多种溶剂中共混合以形成混合物;c)将混合物挤出到形成浴中以形成挤出中空纤维或将混合物流延到形成浴中以形成膜片;和d)将挤出中空纤维或膜片暴露于能源,所述能源选自热和辐射中的一种或多种,并且足以使所述一种或多种蛋白至少部分地交联以形成交联、可食用、多孔的中空纤维。
考虑了本发明涉及用于制备中空纤维或膜片的方法,其中一种或多种蛋白、一种或多种多糖、一种或多种溶剂、一种或多种增塑剂和/或形成浴的一种或多种成分是美国食品药品监督管理局(FDA)公认安全的(GRAS)。
还考虑了本发明涉及通过本发明的任何方法制备的所得膜或中空纤维经历10-50%甘油与水的交换以便干燥,并且所述干燥没有导致孔坍塌。
附图说明
图1示出了用于生产本发明的膜和中空纤维的一种方法的示意图。
图2示出了用于生产本发明的膜和中空纤维的另一种方法的示意图。
图3(A和B)示出了用本发明方法生产的中空纤维膜。
图4(A-C)示出了用本发明方法生产的纤维的扫描电子显微照片(SEM)。A示出了可以看出乳清蛋白与海藻酸盐共混物的表面孔为约20nm或约1000kDa。该图像还示出了来自该方法的条纹与纤维的长度平行。B示出了南瓜蛋白分离物与海藻酸盐共混物的表面孔,该表面孔为约100nm或更小。C示出了用南瓜蛋白分离物制成的纤维的较低分辨率图像。
图5A和5B示出了通过本发明方法制备的纤维。本发明的中空纤维可以容易地支撑其重量,这在生物反应器中是需要的。(A)所示纤维的长度为2米。(B)通过本发明方法生产的纤维至少可以支撑9克。
图6示出了从尿素和氢氧化钠溶液制成的绿豆流延膜。该图像是通过刮刀(doctoral blade)技术流延在玻璃上的绿豆纺液溶液的图像。可以看出,纺液溶液在凝结之前是透明的。
图7示出了使用配备S64转子的Brookfield(Middleboro,MA)粘度计测量的粘度,示出了2%海藻酸盐和10%蛋白分离物的粘度。测量前将每种混合物的pH值调整至11。
图8示出了以量计的单纯形设计图(Simplex Design Plot)。这是使用Minitab(State College,PA)研究尿素、乙醇和水(含氢氧化钠)的实验设计。
图9示出了15%玉米醇溶蛋白在来自图8的溶剂共混物中的温度扫描。这表明乙醇含量低至12.5%的溶剂系统可以溶解玉米醇溶蛋白。
图10示出了通过使用来自图8的溶剂条件,可以改变琼脂糖与水中的相同琼脂糖相比的凝胶性能。
图11示出了,在给定的混合温度范围内、尤其是在高于40℃下,玉米醇溶蛋白和琼脂糖可以用来自图8的给定溶剂系统共混而任一组分均不会固化。
图12A和12B示出了玉米醇溶蛋白膜生产工艺的图像,其包括薄膜流延步骤(A:左)和在乙酸盐缓冲液(0.2M,pH 4.5)中的凝结步骤(B:右)。
图13示出了使用设定为120℃的热甘油浴进行的持续1小时的绿豆海藻酸盐膜的交联步骤。
图14A和14B图示了膜的弹性模量(A:左)和应变(B:右)。
图15A和15B分别示出了各种组织(A:左)和本发明的示例性膜材料(B:右)的弹性模量。
图16示出了根据不同的制备方案生产的膜的图像(1-6),以探究和验证每个生产步骤。AC代表“0.2M乙酸盐浴,pH 4.5”,H代表0.1M“HEPES缓冲液”(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)浴,pH 7.4,G代表“甘油浴”,HG代表“热甘油浴”,HW代表“热水”(高压灭菌器),0代表“未执行该步骤”。
图17A和17B分别示出了膜的弹性模量(A:左)和断裂应变(B:右)。样品6根据方案AC-0-G-HG生产,样品5根据方案AC-0-0-HG生产,样品2根据方案AC-0-0-HW生产。
图18A-C示出了在用于热处理(基于甘油的方案)绿豆膜的乙酸浴中凝结时间增加后弹性模量(A:左)、应变(B:中)和最终应力(C:右)的变化。该图示出了凝结10分钟至3小时的膜的机械性能。
图19A-C示出了在用于绿豆膜的甘油基热处理时间增加后弹性模量(A:左)、应变(B:中)和最终应力(C:右)的变化。通过保持凝结浴(10分钟)和水-甘油交换(10分钟)的持续时间恒定并在达到120℃的最终温度后改变热处理持续时间,来研究基于甘油的热处理。
图20示出了对使用甘油的绿豆膜进行热处理的流变学研究。该图表显示了TanΔ(δ)随温度梯度变化。
图21A-C示出了绿豆膜的基于甘油的热处理时间增加后A)弹性模量、B)应变和C)最终应力的变化。
图22示出了海藻酸盐和谷蛋白蛋白共混物(包括小麦谷蛋白、绿豆和玉米醇溶蛋白)在37℃的细胞培养基中温育时的弹性模量值。在温育之前和3、10和21天之后进行机械拉伸测量。
图23示出了海藻酸盐和谷蛋白蛋白共混物(包括小麦谷蛋白、绿豆和玉米醇溶蛋白)在37℃的细胞培养基中温育时的断裂应变值。在温育之前和3、10和21天之后进行机械拉伸测量。
图24示出了海藻酸盐蛋白共混物(包括小麦谷蛋白、绿豆和玉米醇溶蛋白)在37℃的细胞培养基中温育时的膜表面积。在温育之前和3、10和21天之后进行测量。
图25示出了琼脂糖蛋白共混物(包括小麦谷蛋白、绿豆和玉米醇溶蛋白)在37℃的细胞培养基中温育时的膜表面积。在温育之前和3、10和21天之后进行测量。
图26A和B示出了使用和不使用转谷氨酰胺酶交联制备的糙米-共混物在细胞培养基中于37℃下温育之前和3、10和21天之后的A)弹性模量和B)应变的比较。
图27A-F示出了包括大豆蛋白分离物(A-C:上)和绿豆(D-F:下)的蛋白膜的弹性模量(A和D:左)、断裂应变值(B和E:中)和表面积(C和F:右)。对于大豆蛋白分离物,在37℃下在细胞培养基中温育之前和3、10和21天之后进行测定;对于绿豆,在37℃下在细胞培养基中温育之前和5、12和30天之后进行测定。
图28示出了大豆蛋白分离物膜表面(上)和横截面(下)的扫描电子显微镜图像。
图29示出了绿豆蛋白分离物膜表面(上)和横截面(下)的扫描电子显微镜图像。
图30示出了玉米醇溶蛋白分离物膜表面(上)和横截面(下)以及玉米醇溶蛋白分离物&琼脂糖膜表面(上)和横截面(下)的扫描电子显微镜图像。
图31示出了玉米醇溶蛋白-海藻酸盐(左)和豌豆蛋白-K-卡拉胶(右)膜的表面和横截面的扫描电子显微镜图像。
图32示出了绿豆-琼脂糖(左)和大豆-海藻酸盐(右)膜的表面和横截面的扫描电子显微镜图像。
图33示出了绿豆-海藻酸盐中空纤维横截面(上)和表面(下)的扫描电子显微镜图像。
图34示出了使用C2C12细胞系对玉米醇溶蛋白、大豆、绿豆TG交联的绿豆膜进行的荧光细胞粘附和增殖研究。生长48小时后进行活(绿色)/死(红色)测定。显微照片显示几乎没有红色染色,表明几乎所有细胞都是活的。
图35示出了使用C2C12细胞系对涂布有纤连蛋白、胶原和壳聚糖的绿豆膜和壳聚糖膜进行的细胞荧光粘附和增殖研究。生长48小时后进行活(绿色)/死(红色)测定。显微照片显示几乎没有红色染色,表明几乎所有细胞都是活的。
图36示出了使用C2C12细胞系对经热处理和未经热处理的大豆-海藻酸盐、花生-海藻酸盐和玉米醇溶蛋白-琼脂糖膜进行的荧光细胞粘附和增殖研究。生长48小时后进行活(绿色)/死(红色)测定。显微照片显示几乎没有红色染色,表明几乎所有细胞都是活的。
图37示出了使用QM7细胞系对涂布有大豆、纤连蛋白和胶原的绿豆和壳聚糖膜进行的荧光细胞粘附和增殖研究。生长48小时后进行活(绿色)/死(红色)测定。显微照片显示几乎没有红色染色,表明几乎所有细胞都是活的。
图38示出了干燥和再水合对基于海藻酸盐:绿豆的膜的影响。
具体实施方式
结构化肉产品
本发明考虑了可食用膜,包括但不限于用于生物反应器中用于生产例如结构化清洁肉的具有适当完整性的中空纤维,以及用其生产结构化清洁肉的方法和用本发明的中空纤维生产的结构化清洁肉。清洁肉(在本领域中也称为“培养肉”或“实验室生长肉”)在本领域中定义为在实验室、工厂或其他适合大规模细胞培养的生产设施中由细胞生长而成的肉或肉样产品(本文统称为“清洁肉”或“清洁肉产品”)。
“结构化肉产品”、“结构化清洁肉产品”、“结构化培养肉”或“结构化培养肉产品”是具有像、类似或暗示来自动物的天然肉的质构和结构的肉产品或清洁肉产品。本发明的结构化肉产品具有在以下方面类似于天然肉的质构和结构:1)质构和外观,2)在准备烹饪和食用时(例如,当被切片、磨碎、烹饪等时)的可处理性,以及3)人食用时的口感。当本发明的材料和方法用于生产结构化清洁肉时,达到这些标准中的至少一项、这些标准中的两项或这些标准的全部三项。现有技术无法生产充分满足这些标准中的任一项的结构化肉产品。
本发明的结构化肉产品通过在包含本发明的中空纤维的生物反应器(如下文讨论)中培养合适的细胞(也如下文讨论)来满足这些标准。本发明的中空纤维至少在相当大的程度上为最终的结构化清洁肉产品提供了结构和质构,从而提供了产品所需的外观、可处理性和口感。此外,本发明的中空纤维有助于提供适合细胞生长成结构化清洁肉产品的环境。在该上下文中,本发明的中空纤维至少提供了适合于培养细胞附着的表面、成为类似于肌细胞或肌细胞样细胞形态(即,在结构和外观方面基本上类似于肌细胞)的细胞伸长,以及成为肌管或肌管样结构(即,在结构和外观方面基本上类似于肌管)的肌细胞形成。
本发明的膜的生产
应当理解,在本发明中,术语“膜”或“多个膜”是指通过本发明方法生产的任何多孔膜结构,包括但不限于中空纤维膜和片(即,扁平)膜。除非另有具体说明,否则提及“膜”、“中空纤维”、“中空纤维膜”和“膜片”将被理解为包括通过本发明方法生产的任何膜结构,而不论形状、形式或外观如何。
示例性生产方法如图1和2中的示意图所示。
考虑了本发明的可食用和/或可溶解的中空纤维和膜片由以下中的一种或多种制成:水胶体(即多糖,诸如黄原胶、一种或多种甲基纤维素、海藻酸盐、琼脂、果胶、明胶、角叉菜胶、纤维素/结冷胶/瓜尔胶/塔拉胶/豆胶/其他胶)、蛋白(例如多肽、肽、糖蛋白和氨基酸;例如,各种淀粉(玉米/马铃薯/大米/小麦/高粱)、植物分离物(例如,大豆蛋白/玉米醇溶蛋白/酪蛋白/小麦蛋白/绿豆蛋白)、脂质(例如游离脂肪酸、甘油三酯、天然蜡和磷脂)、醇(例如多元醇)、碳水化合物和其他天然物质诸如海藻酸盐。此外,考虑了可将其他材料添加至中空纤维中或涂布在中空纤维上以帮助细胞附着和细胞生长。例如,考虑了中空纤维添加剂或涂料是蛋白、水凝胶或本领域技术人员已知的其他涂料中的一种或多种,包括细胞外基质(ECM)组分和提取物、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、胶原(例如,胶原I和胶原IV)、明胶、纤连蛋白、基于植物的ECM材料,本领域普通技术人员已知的分离自植物或由更简单物质合成的胶原样、纤连蛋白样和层粘连蛋白样材料。总的结果是,本发明的纤维赋予肉和肉产品质构和结构,从而赋予通过本发明生产的结构化清洁肉产品类似于真肉的质构、外观、可处理性和口感。
本发明的发明人注意到,大豆和绿豆蛋白分离物赋予通过本发明方法生产的膜若干所需特性。本发明人还注意到,大豆(Glycine max)和绿豆(Vigna radiata)二者都来自与豆科植物(即,豌豆或菜豆)豆科(Fabaceae)相关的同一分类家族,Doyle,J.J.,Leguminosae,Encyclopedia of Genetics,2001,1081-1085。尽管本发明不受理论限制,但相信该家族的其他成员,尤其是包括Glycine和Vigna属的Millettioids(崖豆藤分支)和Phaseoloids(榼藤分支),也将起到基本上类似于大豆和绿豆蛋白分离物的作用。参见图39。
更具体地,本发明的中空纤维可以包含纤维素、壳聚糖、胶原、玉米醇溶蛋白、海藻酸盐、琼脂、菊粉、谷蛋白、果胶、豆类蛋白、一种或多种甲基纤维素、明胶、木薯淀粉、黄原胶/瓜尔胶/塔拉胶/豆胶/其他胶、蛋白(例如多肽、肽、糖蛋白和氨基酸,包括但不限于各种形式的玉米/马铃薯/大米/小麦/高粱淀粉、植物分离物和大豆蛋白/玉米醇溶蛋白/酪蛋白/小麦蛋白,所有这些都是本领域技术人员已知的)、脂质(例如游离脂肪酸、甘油三酯、天然蜡和磷脂)中的一种或多种。纤维素聚合物可以包括乙酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、硝化纤维素等。更具体地,本发明的中空纤维可以包含一种或多种豆类蛋白和水胶体的混合物。
在一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维是可食用、可溶解、或可食用且可溶解的。换句话说,所述纤维可以是可食用的或可溶解的或两者兼而有之。此外,对于可溶解的纤维,可以有不同程度的可溶解性。例如,一些纤维在暴露于合适的溶剂(例如,被食品和药物管理局(FDA)或被认为有资格评估可消耗物质的安全性的其他组织公认是安全的无毒溶剂)时可能容易溶解。其他纤维可能不太容易溶解。在这方面,在正被培养的细胞已达到所需的汇合水平后,可以将不太容易溶解的纤维部分溶解,从而留下足够的纤维为本发明的结构化清洁肉提供所需的口感和质构,但是不是过量的可能会使本发明的结构化清洁肉产品显得坚韧或难嚼的纤维。可溶解的中空纤维成分是本领域技术人员已知的。例如,海藻酸盐在暴露于Ca2+螯合剂时可溶解。在本发明的一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维包含一定量的海藻酸盐以使纤维部分可溶解,和/或在包含本发明中空纤维的器件中,一定百分比的纤维包含海藻酸盐。
在本发明的一个实施方案中,考虑了将一种或多种交联剂用于本发明的中空纤维中。交联剂,顾名思义,将中空纤维的一种或多种其他成分结合起来以增强纤维。在本发明的一个实施方案中,交联剂可以是本发明的中空纤维的可溶解组分或可溶解组分之一。本发明所考虑的示例性交联剂和交联机制包括但不限于共价键合的酯交联(美国专利第7,247,191号)和紫外交联(美国专利第8,337,598号),两者均通过引用整体并入本文。此外,在中空纤维的生产中使用交联剂是本领域技术人员已知的。参见例如美国专利号第9,718,031;8,337,598;7,247,191;6,932,859和6,755,900号;所有均通过引用整体并入本文。
本发明的膜和纤维由一种或多种蛋白和一种或多种多糖的共混物生产。蛋白与多糖的比率考虑了为约1:99至约99:1、约1:10至10:1、约2:5至5:2、约3:7至7:3、约4:6至6:4或约1:1,或在所描述范围内的任何比率。在一个优选的实施方案中,混合物的蛋白含量高于多糖含量。在一个优选的实施方案中,蛋白含量为约90%、95%、98%、99%或更高。
还考虑了将本发明的膜进一步强化,即,赋予增加的完整性和强度,但是将其并入使膜中的蛋白交联的制备工艺步骤中。本发明人发现,在形成本发明的膜后,如果在适当的能量水平下将膜暴露于能源持续适当的时间,则蛋白将至少部分交联,从而赋予本发明的膜相对于现有技术的膜增加的完整性。下面的示例章节提供了经过或未经过加热或辐射处理的若干膜(即,中空纤维膜)的实例。与额外地暴露于能源而生产的那些中空纤维相比,未额外地暴露于所述能源而生产的中空纤维缺乏完整性。
热量可以通过干热或湿热来供应。本发明的一种方法采用约60℃至约100℃的温度、0psi(环境压力)至20psi或更大的压力、约50%至100%的相对湿度并且持续约2至约60分钟。此外,可通过在大气条件下将本发明的膜或纤维浸入约60℃至约100℃的水浴中来供应热量。
还可以通过任何形式的辐射(例如电子束、γ射线、紫外光等)将本发明的膜和纤维暴露于能量。本发明的膜和纤维可以经受约1至约100kGy、约5kGy至约75kGy或约10kGy至约50kGy的辐射。本发明的膜和纤维可暴露于所述辐射持续约0.1分钟至约60分钟、约1分钟至约50分钟、约2分钟至约40分钟、以及约2分钟至约30分钟,以及落入所述值内的任何值。
一般而言,中空纤维制备技术、特别是膜制备技术对于本领域技术人员来说是已知的。(例如参见Vandekar,V.D.,Manufacturing of Hollow Fiber Membrane,Int’l JSci&Res,2015,4:9,pp.1990-1994,以及其中引用的参考文献)。与扁平膜片一样,已知的中空纤维制备方法通常包括一些相分离技术。常见的非溶剂诱导的相分离方法包括热诱导的相分离、蒸气诱导的相分离、热诱导的相分离(参见例如MilliporeSigma的美国专利第5,444,097号,其通过引用并入本文)或其组合。然而,其他技术如热挤出和拉伸也可用于形成中空纤维和膜。通常,人们会通过非溶剂、热去稳定或除去溶剂来使溶液中的聚合物去稳定。如本文所述,聚合物(在这种情况下为多糖和蛋白)的溶解后接着通过多个交联过程进行凝胶化或固化。可进一步拉伸纤维以生产直径小于100μm且壁厚薄至10μm的纤维。
可以使用类似的相反转(其中液体聚合物溶液在进入骤冷溶液时固化并且将溶剂抽出)以及本领域普通技术人员已知的其他技术来制备膜片(参见例如MilliporeSigma的美国专利公开第2020/0368696号),诸如但不限于溶剂蒸发。参见例如Gas SeparationMembranes,Polymeric and Inorganic,第4章,Ismail等人,Springer,2015和MilliporeSigma的美国专利公开第2007/0084788号。
在本发明的一些方面,pH诱导的相分离(“pH Induced Phase Separation(pH诱导的相分离)”或“Proton Induced Phase Separation(质子诱导的相分离)”,SatoruTokutomi,Kazuo Ohki,Shun-ichi,Ohnishi,Proton-induced phase separation inphosphatidylserine/phosphatidylcholine membranes,Biochimica et BiophysicaActa(BBA),Biomembranes,第596卷,第2期,1980年2月28日,192-200页)用于制备本发明的膜(即,中空纤维和膜片)。pH诱导的相分离在下文的实施例章节中举例说明。尽管在细胞生理学中研究了受pH控制的大分子的液相分离(Adame-Arana,O.等人,Liquid PhaseSeparation Controlled by pH,2020年10月20日;119(8):1590-1605;2020年9月16日以电子形式出版),但是相信本发明人是首次在中空纤维和膜片的生产中、尤其在适合于生产清洁肉或结构化清洁肉产品的膜的生产中利用pH诱导的相分离的。pH诱导的相分离的使用为本发明的膜带来了预料不到且令人意外的益处。即,与传统工艺相比,机械完整性、孔径和孔隙率得到改进。
干纺涉及将聚合物溶解在非常挥发性的溶剂中。在挤出后加热溶剂/聚合物混合物,溶剂蒸发,聚合物固化。
湿纺是更加多样的,因为该工艺涉及大量可以变化的参数。将聚合物和溶剂混合物挤出到非溶剂浴中,在此由于溶剂和非溶剂的交换而发生分层和/或相分离。在挤出和非溶剂浴之间存在气隙,从这开始中空纤维膜的形成。
一种可以消除或最大限度减少溶剂使用的技术是冷拉伸熔融纺丝(MeltSpinning with Cold Stretching,MSCS)。这种方法可以实现成本有效的生产,但可能会牺牲食品材料的结构控制和潜在降解。在该技术中,将材料加热以进行挤出,然后在冷却时将其拉伸,从而在中空纤维壁中机械地形成孔。对所有这三种技术都已经进行了广泛研究,并且这三种技术在本领域中是已知的并且对其做过很好的总结(参见Tan,XM.和Rodrigue,D.,Polymers(Basel),2019年8月5日:11(8))。
对这些技术的修改也是本领域技术人员已知的。参见例如WO 2011/108929(通过全文引用并入本文),其中公开了用于生产由多个聚合物和聚合物层构成的中空纤维的改进的湿纺挤出工艺。由非合成材料制备中空纤维也是本领域技术人员已知的。参见例如Suzuki的美国专利第4,824,569号,其全部内容并入本文。
用于生产结构化肉产品的本发明的中空纤维膜
在一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维的宏观结构促进细胞沿纤维的取向。在这方面,本发明期望构成中空纤维的组分分子的取向平行于、基本上平行于或主要平行于中空纤维的长度来取向。还考虑了组分分子至少在中空纤维的外表面上产生表面质构,所述表面质构有助于细胞附着并有助于细胞取向。因此,在一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维的表面质构产生用于细胞附着的附着点。在另一个实施方案中,还考虑了在本发明的中空纤维上生长的细胞(特别是肌细胞、肌细胞样细胞或具有肌细胞特性的细胞)类似于和像体内肌细胞沿着中空纤维的长度取向和延伸。
因此,支架的表面结构的取向与形成期间肌管的对齐直接相关。可以认为骨骼肌想要沿着预先存在的结构形成。可以想象,一束纤维密切模仿骨骼肌肉结构以形成对齐的肌管。因此,中空纤维生物反应器不仅能够实现类似组织的细胞密度,而且还能够实现其他技术无法实现的肌管对齐,从而产生所有讨论技术中最真的口感。通过回顾以下文献可以更好地理解对齐现象:My mistake:Decellularized Apium graveolens Scaffold forCell Culture and Guided Alignment of C2C12 Murine Myoblast-SantiagoCampuzano,2020,博士论文,渥太华大学,58-59页。
关于生产结构化清洁肉产品,考虑了本发明的中空纤维具有将适合于本发明的尺寸范围。还考虑了本发明的中空纤维被间隔开,使得在中空纤维上生长的细胞达到与真肉相似的密度并且细胞之间的空隙空间最小。在一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维具有约0.1mm至约3.0mm的外径、约0%孔隙率(使其基于扩散)至约75%的孔隙率、以及约0.008至约0.5mm或约0.01mm至约0.2mm的壁厚或0.008mm至0.5mm之间的上文未具体重复叙述的任何厚度。本发明人发现,该尺寸适合于通过纤维内腔输送培养基并允许培养基充分流动通过中空纤维壁,同时具有足够的刚性以支持细胞生长并且还提供所需最终产品结构、质构、可处理性和口感。然而,取决于所需结构化清洁肉产品(例如,牛肉、家禽、鱼、猪肉等),可以考虑了下文所讨论的关于纤维的直径、壁厚和孔隙率的变化的其他实施方案。
纤维孔隙率。本发明的中空纤维需要具有允许培养基充分流过纤维壁同时确保适合细胞生长和细胞支撑的表面的孔隙率。中空纤维的孔隙率部分地与中空纤维壁的厚度以及与中空纤维的组成有关。如果壁足够薄,则约0%的孔隙率可能足以允许培养基扩散通过中空纤维壁。本发明的中空纤维的孔隙率可以高达75%或90%。因此,本发明的中空纤维的孔隙率范围为0%至约90%、约10%至约75%、约30%至约60%、或0%至75%之间的上文未具体重复叙述的任何百分比值。
本发明的中空纤维还可以经历成孔步骤。成孔机制将是成膜领域中众所周知的以下技术之一:TIPS=热诱导的相分离,NIPS=非溶剂诱导的相分离,VIPS=蒸气诱导的相分离,pH诱导的相分离,MSCS=熔融纺丝并结合拉伸,(参见Review on Porous PolymericMembrane Preparation.第II部分:Production Techniques with Polyethylene,Polydimethylsiloxane,Polypropylene,Polyimide,and Polytetrafluoroethylene,XueMei Tan,1,2,2019)。在所有情况下,聚合物都将通过热熔化或化学溶解而处于液相。从那里开始,将聚合物挤出成圆柱形,并牵伸到锭(spindle)上。在挤出步骤期间,芯液可用于防止中空纤维形式本身坍塌。在挤出喷嘴和退绕锭之间还可以有成孔室,诸如水浴或大气环境室。
本发明还考虑了在生物反应器中构造本发明的中空纤维。纤维构造可以包括纤维定位和间隔中的一者或两者。可以将纤维构造成允许细胞群(cell population)生长且在汇合时细胞之间的空隙空间最小的任何构造。例如,纤维可以正方形/矩形(行和列)或三角形/六边形(蜂窝)填充模式取向。因此,在一个实施方案中,考虑了将纤维布置成使得当从端部观察时纤维形成行和列的有序图案。在另一个实施方案中,考虑了当在端部观察时纤维形成蜂窝图案。在另一个实施方案中,考虑了本发明的纤维随机或半随机布置。在另一个实施方案中,考虑了中空纤维以不同密度的有序或半有序图案布置。
中空纤维的外径范围可以为约0.1mm至约3.0mm、约0.5mm至约2.0mm和约0.8mm至约1.3mm,以及所提到的值之间的任何值。1.0mm的中空纤维假设围绕该外径有约0.3mm至约0.5mm的肉生长。约1.1mm的端部直径可产生具有约85根中空纤维/cm2的肉。
在另一个实施方案中,考虑了所述纤维具有不同程度或不同量的纤维之间的空间。例如,具有散布在较低密度的纤维之间的较高密度的纤维行可用于在最终结构化清洁肉产品的质构方面产生变化,诸如在天然鱼肉中常见的那样。更进一步地,考虑了具有不同直径、孔隙率和壁厚的纤维可以再次用于相同的中空纤维柱筒中以模拟天然肉的外观、质构、可处理性和口感。
在任何构造中,将纤维间隔开,使得纤维之间的间隔距离允许培养基(以及其中包含的营养物质、生长因子等)充分流动以到达所有细胞团(cell mass)。当然,这将至少部分地与培养基的流速以及中空纤维壁的孔隙率相关,但是更大程度地与从中空纤维外壁表面到细胞的物理距离相关。换句话说,培养基和营养物质只能通过细胞团移动或扩散有限的距离。目前认为氧气和营养物质扩散的最大值为200μm。Rouwkema,J.等人,(2009)Supplyof Nutrients to Cells in Engineered Tissues,Biotechnology and GeneticEngineering Reviews,26:1,163-178。因此,从一根纤维的外壁到相邻纤维的外壁,纤维之间的间距应为约400μm。在培养基既流过中空纤维又流过中空纤维之间的间隔的培养条件下,间隔可以更大。例如,从一根纤维的外壁到相邻纤维的外壁的间距可以是800μm。这些数字针对的是培养过程仅依赖于扩散的情况。然而,(例如)使用泵将产生从中空纤维通过中空纤维之间的细胞培养空间并到达外壳出口的培养基流(而不是仅依靠扩散),允许纤维间隔更远。例如,在一些实施方案中,考虑了纤维之间的最大距离为约0.05mm(50μm)至约5.0mm;约0.1mm至约3.0mm;约0.1mm至约2.0mm;约0.1mm至约1.0mm、;或约0.2mm至约0.5mm;或所述值之间的任何距离。虽然优选的实施方案是培养基从中空纤维的中心通过培养物到达外壳出口,但还考虑了培养基流可以根据需要沿相反方向或者可以从一个方向改变到另一个方向。认为改变培养基的流向有助于确保所有细胞都有足够的培养基供应。
本发明的一个实施方案是,本发明的中空纤维的间距固有地具有一定程度的随机性。上一段落中给出的数字是针对给定组件的纤维到纤维的平均距离。在本发明的一个实施方案中,间隔物和/或组装技术可用于确保、标准化或控制纤维之间的距离。例如参见HanG,Wang P,Chung TS.,Highly robust thin-film composite pressure retardedosmosis(PRO)hollow fiber membranes with high power densities for renewablesalinity-gradient energy generation,Environ Sci Technol.2013年7月16日;47(14):8070-7.电子出版日2013年6月28日,或Chun Feng Wana,Bofan Li a,Tianshi Yang a,Tai-Shung Chung,Design and fabrication of inner-selective thin-film composite(TFC)hollow fiber modules for pressure retarded osmosis(PRO),Separation andPurification Technology,172:32-42,2017。
一旦细胞密度变得太密或细胞团的厚度变得太厚,则培养基就很难到达距中空纤维最远的细胞。这些细胞缺乏培养基可能会导致反应器中细胞死亡和/或细胞无法生长的死区。推论是培养基需要流过中空纤维柱筒以到达外壳出口。也就是说,至少需要维持培养基的流动,直至实现汇合并且收获结构化清洁肉产品。基于本说明书的教导,本领域技术人员将能够针对给定的所需结构化清洁肉产品来计算本发明的纤维的正确间距和孔隙率。
可以将本发明的中空纤维布置并固定在本文所称的“中空纤维柱筒”中。在一个实施方案中,考虑了中空纤维柱筒通过将中空纤维的端部以期望的布置固定在端件中来制成。例如,每根纤维具有第一端和第二端。每个端部固定在一个端件中,即,第一端件和第二端件。端件例如可以是本领域已知对细胞呈惰性且无毒的树脂或塑料。中空纤维的第一或第二端中的至少一个定位在端件中,使得中空纤维的内腔与外部环境流体连通。因此,通过将中空纤维定位在端件中,可以使培养基从中空纤维的外部环境(即,中空纤维的外部但在例如无菌生物反应器的内部)流动到中空纤维的内腔。
本领域技术人员了解如何将中空纤维组装成模块或柱筒。这些技术适用于本发明的中空纤维。简言之,在纺丝之后,将中空纤维切割成一定长度并将纤维的端部包封(即,封装(potted))在树脂中,该树脂将在纤维端部周围流动并固化。有时,可将该纤维节段包封在一种物质(例如,熟石膏或本领域技术人员已知的其他容易去除的材料)中以封闭纤维孔,使得“封装溶液”即液体树脂不会进入或堵塞纤维中的孔隙。例如参见Vandekar,V.D.,Manufacturing of Hollow Fiber Membrane,Int’l J Sci&Res,2015,4:9,1990-1994页,以及其中引用的参考文献。在本发明中,对“封装”束的一个或两个端部进行修整或切割以暴露纤维的开口端,从而一旦将束插入外壳中时允许培养基流动以用于生产本发明的结构化清洁肉。
此外,在一些实施方案中,考虑了本发明的中空纤维柱筒具有固定装置以保持第一端件与第二端件之间的期望距离。例如,为了更容易地将本发明的中空纤维柱筒插入例如生物反应器外壳中,这可能是必要的或优选的。
因此,在一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维柱筒包含大量以所需布置方式布置的中空纤维。本发明的中空纤维具有第一端和第二端。通过将中空纤维的第一端和第二端固定在第一端件和第二端件中来维持该布置。一旦如上所述将中空纤维固定,则将中空纤维定位为彼此平行、基本上平行或根本上平行。此外,第一端件和第二端件定位成彼此平行、基本上平行或根本上平行。更进一步地,将本发明的中空纤维柱筒的中空纤维定位成垂直于、基本上垂直或根本垂直于本发明的中空纤维柱筒的端件。中空纤维柱筒的直径和长度将取决于所生产的所需结构化清洁肉产品和生物反应器构造。
在本发明的一个实施例中,考虑了本发明的中空纤维柱筒的中空纤维的平均密度为约40-约120/cm2,平均密度为约60-约100/cm2,平均密度为约70-约90/cm2,或在以上给出值之间但未具体重复叙述的任何值。
在本发明的一个实施方案中,考虑了本发明的中空纤维柱筒中的中空纤维在添加细胞之前在中空纤维之间具有空隙空间,并且中空纤维之间的空隙空间为中空纤维柱筒总面积的25%-约75%,或中空纤维柱筒总面积的约40%-约60%,或在以上给出值之间但未具体重复叙述的任何值。
在本发明的一个实施方案中,考虑了将本发明的中空纤维柱筒设计成可移除地插入到外壳中。也就是说,可在生产运行开始时将柱筒插入外壳中,并在生产运行结束时将其取出,即收获,以用于本发明的结构化清洁肉产品的任何进一步所需的加工。在收获结构化清洁肉产品之后,可以将本发明的新中空纤维柱筒插入外壳中并重复该过程。在这方面,本发明的中空纤维柱筒的外壳是生物反应器或生物反应器系统的一部分。
反应器构造。本发明不限于任何特定的反应器构造或反应器系统构造,只要可以保持足够的培养基流通过培养物并去除废物即可。中空纤维反应器的形状通常为管状,但是它们可以是椭圆形、扁平的(片状)、矩形或任何其他形状。在一个优选的实施方案中,反应器包括可插入/可移除的插入件,所述插入件包含本发明的中空纤维。在实现汇合细胞生长(如本文所定义)后,可以移除插入物并通过移除插入物端部和任何所需的进一步加工来最终确定产品。进一步加工可以采取例如切片、表面质构化、添加调味剂等形式。替代地,可以在收获和拆卸该器件之前进行进一步的肉强化。例如,可以将培养基从中空纤维器件中冲出,然后将添加剂直接泵入纤维中或纤维周围。
合适的反应器系统的非限制性实例。最合适的反应器系统类型是分批进料系统,但是考虑了任何可用的反应器都将适合与本发明的中空纤维和中空纤维柱筒一起使用。例如,系统(MilliporeSigma,Bedford,MA)是可以容易地对其进行转换以与本发明一起使用的商业系统的实例。可以用在另一个生物反应器中生长的细胞接种在其中生产结构化清洁肉产品的生物反应器(即,包含本发明的中空纤维的反应器)。接种中空纤维器件的生物反应器(适合细胞生长(增殖)和细胞扩增的反应器)可以是现有的市售反应器,例如搅拌槽或波式反应器。考虑了增殖/扩增生物反应器例如是搅拌槽或波式反应器(如本领域普通技术人员已知的)并且是悬浮液、附聚生物质、微载体培养物或本领域普通技术人员已知的其他合适的反应器。考虑了生产生物反应器(即,包含本发明的中空纤维的反应器)例如可以是单次使用、多次使用、半连续或连续的。本发明还考虑了包含本发明的中空纤维的多个反应器的歧管。
因此,考虑了本发明的一个示例性反应器系统包括一个或多个本发明的中空纤维柱筒、尺寸设定为容纳所述中空纤维柱筒的外壳;流体连接至所述外壳中的一个或多个入口的培养基源;所述外壳内的一个或多个培养基出口;以及通过所述一个或多个培养基入口和/或出口向所述中空纤维柱筒供应培养基和/或从所述中空纤维柱筒移除废弃培养基的一个或多个泵。此外,入口流体连接至中空纤维的内部。更进一步,中空纤维生物反应器可以包括自动控制器或自动控制系统。
本发明还涉及一种用于生产肉产品的方法,其包括:在本发明的中空纤维反应器中的中空纤维之间的空隙空间中以例如100,000至100,000,000(105-108)个细胞的密度接种一种或多种肌细胞、肌细胞样细胞或表达一种或多种肌细胞样特性的工程化细胞(Radisic等人,Biotechnol Bioeng,2003年5月20日:82(4):403-414)并培养细胞直至达到约80%-约99%的汇合度、85%-99%的汇合度、约90%-约99%的汇合度、约95%-约99%的汇合度、约98%-约99%的汇合度或约100%的汇合度(或所陈述的百分比值之间的任何值),分别从所述中空纤维的第一端和第二端去除所述第一保持装置和第二保持装置。
接种后,中空纤维柱筒具有通过中空纤维的第一端和第二端之一或两者进入中空纤维内部、通过中空纤维壁进入中空纤维之间的空隙空间供应至细胞的培养基,其中将所述细胞接种并通过所述外壳中所述出口中的一个或多个。在另一个实施方案中,考虑了培养基还可以在来自器件的一个或多个入口和一个或多个出口两者的纤维之间流动。例如,一个流体路径通过纤维壁,而第二流体路径围绕纤维。考虑了器件可以具有多个入口和出口。细胞实现汇合后,冲洗掉任何残留的培养基和废物,并向中空纤维的内部和/或细胞之间的任何剩余空隙空间输注脂肪、香料、色素、盐和防腐剂中的一种或多种。
适合添加到本发明的结构化清洁肉产品中的脂肪包括但不限于:饱和脂肪、单不饱和脂肪、多不饱和脂肪,诸如玉米油、菜籽油、向日葵油和红花油、橄榄油、花生油、大豆油、亚麻籽油、芝麻油、菜籽油、鳄梨油、种子油、坚果油、红花油和向日葵油、棕榈油、椰子油、Ω-3、一种或多种鱼油、猪油、黄油、加工动物脂肪、脂肪组织或细胞农业衍生的脂肪或其组合。也可以使用合成脂肪诸如油树脂。事实上,食品和药物管理局(FDA)认可的任何脂肪都适合用于本发明并且考虑用于本发明的结构化清洁肉产品中。FDA的食品添加剂清单中包括天然物质和提取物(NAT)、营养物质(NUTR)、精油和/或油树脂(无溶剂)(ESO)。
适用于本发明的结构化清洁肉产品的调味剂包括但不限于FDA的食品添加剂清单上记录的任何调味剂。这些调味剂可能被记录为天然调味剂(FLAV)、精油和/或油树脂(无溶剂)(ESO)、酶(ENZ)、天然物质和提取物(NAT)、非营养性甜味剂(NNS)、营养性甜味剂(NUTRS)、香辛料、其他天然调味品和调味剂(SP)、合成香料(SY/FL)、熏蒸剂(FUM)、人工甜味剂(包括阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精和乙酰磺胺酸钾)和酵母提取物或其组合,考虑将以上物质用于本发明的结构化清洁肉产品中。
适用于本发明的结构化清洁肉产品的质构增强剂包括但不限于植物材料泥、瓜尔豆胶、纤维素、半纤维素、木质素、β-葡聚糖、大豆、小麦、玉米或大米分离物和甜菜纤维、豌豆纤维、竹纤维、植物衍生的纤维、植物衍生的谷蛋白、卡拉胶、黄原胶、卵磷脂、果胶、琼脂、海藻酸盐和其他天然多糖、谷壳、柠檬酸钙、磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁及盐、或其任何组合,考虑了将以上物质用于本发明的结构化清洁肉产品中。这些可能在FDA的食品添加剂清单中记录为增溶剂和分散剂(SDA)以及天然物质和提取物(NAT)。
适用于本发明的结构化清洁肉产品的营养添加剂包括但不限于维生素、微量元素、生物活性化合物、内源性抗氧化剂诸如A,B-复合物、维生素C、D、E、锌、硫胺、核黄素、硒、铁、烟酸、钾、磷、Ω-3、Ω-6、脂肪酸、镁、蛋白和蛋白提取物、氨基酸盐、肌酸、牛磺酸、肉碱、肌肽、泛醌、谷胱甘肽、胆碱、谷胱甘肽、硫辛酸、精胺、鹅肌肽、亚油酸、泛酸、胆固醇、视黄醇、叶酸、膳食纤维、氨基酸及其组合,考虑了将以上物质用于本发明的结构化清洁肉产品中。考虑了是公认安全的(GRAS)或经FDA批准的任何食品添加剂用于本发明的结构化清洁肉产品中并并入本文。例如,参见www.fda.gov/food/food-additives-petitions/food-additive-status-list。
考虑了是公认安全的(GRAS)或经FDA批准的任何一种或多种天然或人造食品色素用于本发明的结构化清洁肉产品中。例如,参见:www.fda.gov/industry/color-additive-inventories/color-additive-status-list。
预言性细胞类型。将本发明的中空纤维设计成用于生长特定类型的细胞,这些类型的细胞适合生产体外或实验室生长的肉和肉产品,即本发明的结构化清洁肉。因此,虽然许多不同类型的细胞可以在中空纤维上生长(并且如果需要的话,在本发明的中空纤维柱筒中生长),但是研发所述纤维用于生长肌肉细胞(即肌细胞)或具有肌肉细胞特性的细胞或经工程化以具有肌肉细胞特性的细胞(本文统称为肌肉细胞或肌细胞),以汇合并模仿肌肉(即,肉)的天然结构。优选地,肌肉是骨骼肌。也就是说,发明人将本发明的中空纤维设计为适合于生长肌细胞以获得肌纤维或肌原纤维。此外,其他类型的细胞可以在本发明的中空纤维上以及在包含本发明的中空纤维的反应器中生长。这些细胞可以独立地生长或与肌肉细胞组合生长。例如,脂肪细胞或具有脂肪细胞特性的细胞或经工程化以具有脂肪细胞特性的细胞(本文统称为脂肪细胞)可以与肌肉细胞一起培养以获得类似于天然肌肉或肉的最终产品。本发明的中空纤维还适合于包含与本发明的肌细胞共培养的其他细胞,例如成纤维细胞、具有成纤维细胞特性的细胞或经工程化以具有成纤维细胞特性的细胞。
具体对于肌肉细胞和脂肪细胞的共培养物,肌肉细胞与脂肪细胞的比率可以是99:1、95:5、92:8、90:10、88:12、85:15、82:18、80:20、75:25、或100:0至75:25(包含端点)的任何比率。
适合用于本发明的细胞可以获自或衍生自现在从其获得食物的任何动物。突出的实例是牛、猪、绵羊、鱼(piscine)(例如,鱼(fish)如金枪鱼、鲑鱼、鳕鱼、黑线鳕、鲨鱼等)、贝类、禽类(例如鸡、火鸡、鸭等)。还可以使用更奇特的细胞来源,诸如来自传统上狩猎而非养殖的动物(例如鹿、麋鹿、驼鹿、熊、兔、鹌鹑、野生火鸡等)或其组合。
本发明中使用的细胞可以通过适合产生具有所需特性的分化细胞的任何方式衍生,例如,适合于衍生具有分化的肌细胞样特性、脂肪细胞样特性等的细胞的任何程序。肌细胞的此类特性包括例如但不一定限于具有长的管状细胞的外观并且具有肌球蛋白和肌动蛋白的大量补充物。肌细胞还具有与其他肌细胞融合以形成肌原纤维的能力,肌原纤维是有助于赋予肌肉(即肉)其独特质构的肌肉单位。脂肪细胞(adipocyte)(在本领域中也称为脂细胞和脂肪细胞(fat cell))的此类特征包括例如但不一定限于具有可占细胞体积的多达90%或更多的大脂质液泡。本发明的中空纤维至少部分地替代了通常存在于骨骼肌中的结缔组织(在本领域中称为“筋膜”)。
可用于本发明的细胞包括但不限于衍生自间充质干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)的细胞。iPSC是经工程化可回到多能状态的细胞,从其可以衍生出多种细胞类型。换句话说,iPSC是可以直接从体细胞产生的多能干细胞。该技术于2006年首次报道(Takahashi K,Yamanaka S,2006年8月25日,"Induction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors"Cell,126(4):663-76),从此有所进展(参见例如Li等人,2014年4月30日,“Generation ofpluripotent stem cells via protein transduction”Int.J.Dev.Biol.,58:21-27),包括生成肌肉细胞(参见例如:Rao等人,2018年1月9日,“Engineering human pluripotentstem cells into a functional skeletal muscle tissue”Nat Commun.,9(1):1-12),并且为本领域技术人员所公知。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
当介绍本公开的要素或其优选的实施方案时,表述“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个该要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的并且意味着可以存在除了所列出的要素之外的额外要素。
过渡性短语“包括”、“基本上由......组成”和“由......构成”具有MPEP 2111.03(Manual of Patent Examining Procedure,第9版,2019年第10次修订;美国专利商标局)中给出的含义。使用过渡性短语"基本上由......组成"的任何权利要求将被理解为仅陈述了本发明的必要要素,而从属权利要求中陈述的任何其他要素将被理解为对在其所从属的权利要求中陈述的本发明而言是非必要要素。
本文所陈述的所有范围包括在所提到范围内的所有值,包括所有整数、分数和小数值(含端点)。
实施例
通用材料和方法:
除非另有说明,否则所有试剂均可商购且无需进一步纯化即可使用。玉米醇溶蛋白、氢氧化钠、尿素、羟丙基纤维素、K-卡拉胶、乙酸钠、三聚磷酸盐(TPP)、氢胆酸(hydrocholeretic acid)37%、Antibiotic Antimycotic Solution(100×)和小麦谷蛋白、来自牛血清的纤连蛋白购自MilliporeSigma(Burlington MA)。牛胶原购自Corning(Corning,NY);大豆蛋白分离物(SPI)购自BulkSupplements(Henderson,NV);壳聚糖(来自蘑菇)购自Modernist Panty(Elliot,ME,USA);豌豆和花生酱蛋白分离物购自NorCalOrganic(Crescent City,CA);绿豆、蚕豆和鹰嘴豆蛋白分离物购自Green Boy(RedondoBeach,CA);琼脂糖购自Hispanagar(Burgos,Spain);糙米蛋白分离物购自Zen Principle(Incline Village,NV);海海藻酸钠和MooGlooTMRM转谷氨酰胺酶购自Modernist Pantry(Eliot,ME)。
细胞培养基稳定性测试:
将膜切成1×3.5英寸的方形样品并在37℃下在含有Antibiotic AntimycoticSolution(2×)(为本领域技术人员已知)的细胞培养基中温育长达21或30天,这取决于实验。对于每种膜类型,在温育期间的每个时间点对三个样品进行机械测试。
粘度:
使用S64转子在Brookfield(Middleboro,MA)的粘度计DV-II+Pro上对所制备的纺液溶液进行粘度测定。
机械测试:
使用Zwick Roell(Kennesaw,GA)的TestControl II装置对1×3.5或0.5×3.5寸的方形样品进行膜拉伸测试,并使用Zwick Roell的testXpert II V3.71软件分析数据。
冷冻干燥:
在闪烁瓶内的样品在液氮下在水中冷冻1小时。然后,使用Labconco(KansasCity,MO)的冷冻干燥机(2.5L)在-80℃下干燥经冷冻的样品。
扫描电子显微镜:
将样品安装在涂有3nm铱的桩子上并使用ThermoScientific(Waltham,MA)Quanta200F或JOEL(Peabody,MA)JCM 6000扫描电子显微镜(Tokyo,Japan)成像。
统计分析:
误差条计算为平均值的标准误差。
流变学:
使用圆锥形固定装置在TA Ares流变仪(New Castle,DE)上对配制的纺液和膜进行流变学分析。
实施例1-生产可食用中空纤维的方法
结合示意性地给出了用于生产本发明的膜的示例性生产方法的图1和2。
1.生成纺液溶液
a.制备纺液溶液需要多步混合过程
i.首先制备蛋白溶液。这需要将14%重量的植物蛋白浓缩物溶解在弱碱性缓冲溶液中。将混合物在20,000rpm下均质化几分钟。具体而言,使用微粉化植物蛋白粉。
ii.第二溶液含有载体聚合物,所述载体聚合物包含溶解在与蛋白共混物相同缓冲液中的2%海藻酸盐、2%羟丙基纤维素。将其通过混杂器在35℃下溶解48小时。
iii.以1:1的比率将蛋白溶液和载体聚合物溶液混合。用顶置搅拌装置完成混合,接着在混杂器中在35℃下混合12小时。
iv.最终混合物的浓度为2%多糖和7%植物蛋白,并且称为纺液溶液。
b.通过将15g/L氯化钙溶解在含有0-1g/L转谷氨酰胺酶的反渗透(RO)水中来完成芯液的制备。
2.牵伸(drawing)和固化
a.使用加压容器和齿轮泵,将纺液溶液推过同轴孔口。喷丝头和浴之间有特定的距离,该距离可以基于纺液溶液的流变性能进行调整。
b.固化浴(本文中也称为形成浴)也是15g/L氯化钙并且通过离子交联海藻酸盐锁定在纤维的3D结构中。
3.交联步骤
a.对于该应用,海藻酸盐的离子交联可能不足以通过细胞培养基中的钠盐提供的一价键来解离二价键。期望酶促转谷氨酰胺酶交联和海藻酸盐-钙交联之外的交联。
b.然后将纤维暴露于接近100℃的加热下,使纤维内的蛋白发生热交联。概念验证已通过在121℃下高压灭菌(cutoclave)60分钟进行了证明。
c.替代地或额外地,将纤维暴露于约50kGy(千戈瑞)的电子束或γ辐射,以物理交联混合物的纤维素部分,即交联蛋白。最终剂量可以是约5kGy至约100kGy,取决于材料通过电子束的停留时间和材料的等级,这可以由本领域技术人员利用本说明书的教导来确定。
4.涂布步骤
a.纤维连续地通过等离子体室,然后浸入15%二醇(glycol)/山梨醇(1:1)混合物的水溶液中(根据用途,二醇/山梨醇的比率可以为1:14至14:1)。设计该步骤来通过增塑剂最大限度地减少所造成的中空纤维的多孔结构的坍塌。
图3A和B示出了用实施例1的工艺(方法)制备的中空纤维膜的显微照片。图4A-C示出了用该实施例的工艺制备的中空纤维膜的扫描电子显微照片。图5A示出了用该实施例的方法制备的一根中空纤维的长度。图5B展示了其中一根中空纤维的拉伸强度。
实施例2-在不进行二次交联步骤的情况下纤维的预言性实施例
a.使用如上面在实施例1中所定义那样产生的中空纤维纺液溶液。在该实施例中,针对三种目标条件。所有条件均由相同的纺液溶液形成。该纺液溶液为1份羟丙基纤维素、1份海藻酸钠盐(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)和7份豌豆蛋白分离物。
b.在第一种条件下,将纤维直接挤出到15g/L氯化钙浴中,立即固化。在浴中浸泡10分钟后,用MilliQTM水(MilliporeSigma,Bedford,MA)冲洗纤维,然后浸没在DMEM F12培养基中持续72小时。从细胞培养基中取出纤维后,纤维就无法进行处理了。纤维在溶液之外不再能够支撑其自身重量。大多数离子交联位点已解离。
c.在第二种条件下,将纤维直接挤出到15g/L氯化钙浴中,立即固化。在浴中浸泡10分钟后,用MilliQTM水冲洗纤维并且然后在121℃下高压灭菌30分钟。一旦冷却至室温,然后将纤维浸没在DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12;ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)培养基中持续72小时。从细胞培养基中取出纤维后,纤维就失去了一定程度的完整性。可以将纤维移除,但只能自支撑约5英寸的其自身重量。大多数离子交联位点已解离,但是已热交联的蛋白仍然能够增加纤维完整性。
d.在第三种条件下,将纤维直接挤出到15g/L氯化钙浴中,立即固化。在浴中浸泡10分钟后,用MilliQTM冲洗纤维并且然后在台式电子束改性设备中在50kGy下单程暴露,浸没在DMEM/F12培养基中持续72小时。从细胞培养基中取出纤维后,纤维保持完整性并可以支撑其自身重量。尽管离子交联位点在细胞培养基中容易解离,并且海藻酸盐和纤维素二者的骨架可能存在一些断链,但蛋白聚合物网络的物理交联能够抵抗培养基中的解离。
这些实施例表明,用热和/或辐射使蛋白交联导致本发明的中空纤维增强的完整性,使得它们适用于例如细胞培养装置或过滤装置。
实施例3-纺液溶液的制备
1.1.蛋白溶液
1.1.2.基于尿素的方法:
玉米醇溶蛋白(Zein):通过在0℃和机械搅拌下将57g玉米醇溶蛋白粉末添加到300mL MilliQTM水中来制备玉米醇溶蛋白溶液(15%w/v)。30分钟后,将11.25g尿素添加到悬浮液中,接着添加83mL NaOH溶液(0.4N)(图12)。然后,让反应升温至室温(23℃)并搅拌18小时,然后进一步使用。
玉米醇溶蛋白:通过在0℃和机械搅拌下将72g玉米醇溶蛋白粉末添加到300mLMilliQTM水中来制备玉米醇溶蛋白溶液(19%w/v)。30分钟后,将14.30g尿素添加到悬浮液中,接着添加83mL NaOH溶液(0.6N)(图12)。然后,让反应升温至室温(23℃)并搅拌18小时,然后进一步使用。
玉米醇溶蛋白-羟丙基纤维素共混物:通过在MilliQTM水中添加1.75g HPC并通过机械搅拌混合18小时来制备0.5%w/v羟丙基纤维素(HPC)溶液(0.5%w/v)。然后,使用冰浴将溶液冷却至0℃,并向其中添加玉米醇溶蛋白(72g)。将悬浮液在0℃下再搅拌20分钟,然后添加14.30g尿素和83mL NaOH溶液(0.6N)。让反应升温至室温(23℃)并再搅拌18小时,然后进一步使用。
大豆蛋白分离物:通过在机械搅拌下将76g大豆蛋白分离物(SPI)粉末添加到300mL MilliQTM水中来制备SPI溶液(20%w/v)。30分钟后,将11.25g尿素添加到悬浮液中,然后添加83mL NaOH溶液(0.4N)。然后,将反应物搅拌18小时,然后进一步使用。
豌豆蛋白分离物:通过在机械搅拌下将76g(PPI)粉末添加到300mL MilliQTM水中来制备豌豆蛋白分离物PPI溶液(20%w/v)。30分钟后,将11.25g尿素添加到悬浮液中,然后添加83mL NaOH溶液(0.4N)。然后,将反应物搅拌18小时,然后进一步使用。
绿豆:通过在机械搅拌下将57g PPI粉末添加到300mL MilliQTM水中来制备绿豆溶液(15%w/v)。30分钟后,将11.25g尿素添加到悬浮液中,接着添加83mL NaOH溶液(0.4N)。然后,将反应物搅拌18小时,然后进一步使用。参见图6。
小麦谷蛋白:通过在机械搅拌下将56g谷蛋白粉添加到300mL MilliQTM水中来制备谷蛋白溶液(15%w/v)。30分钟后,将11.25g尿素添加到悬浮液中,然后添加83mL NaOH溶液(0.4N)。然后,将反应物搅拌16小时,然后进一步使用。
1.1.3.基于混杂仪的方法:
绿豆海藻酸盐共混物:
配制绿豆蛋白分离物(Green Boy)和海藻酸盐(Modernist Pantry)共混物,做法是称取45g绿豆蛋白分离物放入252g水中,并以25000rpm均质化5分钟。然后添加3mL 10NNaOH(和任选存在的6g尿素),并再均质化5分钟。然后,在40℃下将凝胶溶液放入均化器中过夜。
1.2.海藻酸盐-蛋白共混物溶液
替代性绿豆和海藻酸盐的纺液制剂:
因此,已经进行了一系列研究来寻找蛋白分离物与海藻酸盐的多种可能的制剂。一种示例性制剂和混合方法以重量表示为:0.2%海藻酸盐、15%绿豆蛋白分离物、1%10NNaOH、2%尿素(任选存在的)、81.8% MilliQTM水。
第一步是将蛋白分离物润湿(即悬浮)并分散在溶液中。称取蛋白分离物并添加MilliQTM水。将高剪切混合器(诸如均质器(IKA,Staufen,Germany))设置为25,000rpm并混合5-10分钟,或直到浆料恢复到流体样行为。分散后,将NaOH(如果需要,还可添加尿素)添加到蛋白和水中,然后将溶液再均质化5分钟,直至形成粘稠的凝胶。自此,将装配有螺旋桨的顶置混合器设置为100-500rpm以搅拌溶解的蛋白。经15分钟将海藻酸盐缓慢地添加到混合溶液中。海藻酸盐均匀地分散在整个混合物中并部分溶解后,将溶液放入广口瓶中、加盖并放入混杂仪持续24小时。参见图7。
i.1.2.1.基于尿素的方法
玉米醇溶蛋白-海藻酸盐:具有不同生物聚合物比率的玉米醇溶蛋白-海藻酸盐共混物通过在机械搅拌下将根据尿素法制备的玉米醇溶蛋白溶液(15%w/v)与预先制备的不同浓度(2%w/v、4%w/v、6%w/v和8%w/v)的海藻酸盐水溶液混合20分钟来制备。
SPI-海藻酸盐:具有不同生物聚合物比率的SPI-海藻酸盐共混物通过在机械搅拌下将根据尿素法制备的SPI溶液(20%w/v)与预先制备的不同浓度(2%w/v、4%w/v、6%w/v和8%w/v)的海藻酸盐水溶液混合20分钟来制备。
PPI-海藻酸盐:具有不同生物聚合物比率的SPI-海藻酸盐共混物通过在机械搅拌下将根据尿素法制备的PPI溶液(20%w/v)与预先制备的不同浓度(2%w/v、4%w/v、6%w/v和8%w/v)的海藻酸盐水溶液混合20分钟来制备。
绿豆-海藻酸盐:具有不同生物聚合物比率的绿豆-海藻酸盐共混物通过在机械搅拌下将根据尿素法制备的绿豆溶液(15%w/v)与预先制备的不同浓度(2%w/v、4%w/v、6%w/v和8%w/v)的海藻酸盐水溶液混合20分钟来制备。
谷蛋白-海藻酸盐:具有不同生物聚合物比率的谷蛋白-海藻酸盐共混物通过在机械搅拌下将根据尿素法制备的谷蛋白溶液(15%w/v)与预先制备的不同浓度(2%w/v、4%w/v、6%w/v和8%w/v)的海藻酸盐水溶液混合1小时来制备。
1.3.蛋白-琼脂糖共混物溶液
1.3.1.基于尿素的方法
玉米醇溶蛋白-琼脂糖:
具有不同生物聚合物比率的玉米醇溶蛋白-琼脂糖共混物通过将根据尿素法制备的玉米醇溶蛋白溶液(15%w/v)与预先制备的不同浓度(1%w/v、2%w/v和4%w/v)的琼脂糖水溶液混合来制备。琼脂糖溶液通过在60℃下将相应量的琼脂糖加入300mL MilliQTM水中并将其搅拌2小时直至完全溶解来制备。为了获得均匀的共混物并避免琼脂糖在流延前固化,将新制备的琼脂糖溶液添加到40℃的经预热的玉米醇溶蛋白溶液中并搅拌20分钟。流延前将溶液保持在40℃。
尽管使用玉米醇溶蛋白-琼脂糖进行了探究,但是预期采用其他基于植物的蛋白的制剂结果和方法具有相似的结果。配制琼脂糖和玉米蛋白(玉米醇溶蛋白)并不是一项简单的任务,因为这两种聚合物不使用常见溶剂或溶解温度。同时实现了在高于40℃下使玉米醇溶蛋白稳定以及将所需的所需乙醇百分比降低至低于约20%的水平二者的组合。使用针对制剂的Minitab(State College,Pennsylvania)实验设计,含有0.04N氢氧化钠、尿素和乙醇的溶剂系统以按w/v百分比来探究。
发现乙醇、尿素和0.04N NaOH的组合能够溶解玉米醇溶蛋白。令人意外的是,在0.04N NaOH和尿素存在下,玉米醇溶蛋白能够在乙醇含量为10%时溶解。单纯形设计图(Simplex Design Plot)如图8所示。然而,不存在乙醇的玉米醇溶蛋白在低于约40℃的温度下不稳定。温度-扫描流变学数据支持了这一观察结果。参见图9。
此外,发现由约5%尿素、19%乙醇和76%0.04N NaOH构成的溶剂系统会降低琼脂糖的胶凝性能。参见图10。
此外,当我们将琼脂糖和玉米醇溶蛋白在该溶剂系统中混合在一起时,我们看到的流变性能表明在一个系统中将两种聚合物混合在一起的可行性,参见图11。
绿豆-琼脂糖:具有不同生物聚合物比率的绿豆-琼脂糖共混物通过将根据尿素法制备的绿豆溶液(15%w/v)与预先制备的不同浓度(1%w/v、2%w/v和4%w/v)的琼脂糖水溶液混合来制备。琼脂糖溶液通过在60℃下将相应量的琼脂糖加入300mL MilliQTM水中并将其搅拌2小时直至完全溶解来制备。为了获得均匀的混合物并避免琼脂糖在流延前固化,将新制备的琼脂糖溶液添加到40℃的经预热的绿豆溶液中并搅拌20分钟。流延前将溶液保持在40℃。
谷蛋白-琼脂糖:具有不同生物聚合物比率的谷蛋白-琼脂糖共混物通过将根据尿素法制备的谷蛋白溶液(15%w/v)与预先制备的不同浓度(1%w/v、2%w/v和4%w/v)的琼脂糖水溶液混合来制备。琼脂糖溶液的制备方法是在60℃下将相应量的琼脂糖加入300mLMilliQTM水中并将其搅拌2小时直至完全溶解来制备。为了获得均匀的混合物并避免琼脂糖在流延前固化,将新制备的琼脂糖溶液添加到40℃的预热的玉米醇溶蛋白溶液中并搅拌20分钟。流延前将溶液保持在40℃。
1.4基于植物的壳聚糖
基于蘑菇的壳聚糖:购自Modernist Pantry。通过35℃的混杂仪将不同浓度(5%w/v和7%w/v)的壳聚糖溶解在5%乙酸中过夜。使用含有10g/L磷酸三苯酯的形成浴进行固化/交联。将壳聚糖膜交联过夜,然后进行处理。
1.5K-卡拉胶
K-卡拉胶:将K-卡拉胶以不同浓度(2%w/v、4%w/v和10%w/v)在MilliQTM水中加热至90℃。在升高的温度下,将溶液流延在经预热的板上并浸没到含有15g/L氯化钙的形成浴中。在另一种情况下,K-卡拉胶与溶液中的氯化钙一起加热。冷却后,溶液固化成膜。
a.膜制备/形成
使用配备有间隙为524微米的棒的自动膜流延机(BYK Drive 6膜流延机,Leominster,MA)或间隙为600微米的手动流延机来流延膜。在这两种情况下,每个膜使用40mL纺液溶液并且产生尺寸为约25×15cm2(面积)的膜。取决于膜制剂,采用不同的凝结条件。
对于中空纤维,通过购自Ramé-hart instrument,Co.(Succasunna,NJ)的同轴针来挤出纺液溶液。替代地,使用定制的实验室规模中空纤维纺丝机,该纺丝机允许在高得多的粘度下加工(最高达100,000厘泊:cP)。
2.1.蛋白膜
无论是通过尿素法还是混杂仪法获得,均将扁平片状蛋白膜流延在乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中(参见图12A和B)并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,用HEPES(0.1M,pH 7.4)对膜进行洗涤并储存在70/30%w/v的乙醇/水溶液中。
不同的是,玉米醇溶蛋白膜储存在含有2X抗生素抗真菌溶液的HEPES缓冲溶液(0.1M,pH 7.4)中。
2.2.蛋白-海藻酸盐共混物膜
无论是通过尿素法还是混杂仪法获得,均将扁平片状蛋白-海藻酸盐共混物膜流延在含有CaCl2(15g/L)的乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,用含有CaCl2(15g/L)的HEPES(0.1M,pH 7.4)对膜进行洗涤并储存在70/30%w/v的乙醇/水溶液中。
使用刮刀技术(如本领域普通技术人员已知的)将海藻酸盐-绿豆蛋白共混物涂布到PTFE片材上。然后将片材放入含有15g/L氯化钙的pH为4.5的乙酸盐缓冲液中。pH值从11偏移为4.5导致蛋白凝结并且氯化钙使海藻酸盐交联。在工作台上,将膜置于缓冲溶液中持续10分钟。一旦成膜并变白(灰白色),将膜取出并放入摇动的99.5%甘油浴中持续10分钟。
2.3.蛋白-琼脂糖共混物膜
无论是通过尿素法还是混杂仪方法获得,均将蛋白-琼脂糖共混物膜从保持在40℃的热溶液流延在乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,用含有CaCl2(15g/L)的HEPES(0.1M,pH 7.4)对膜进行洗涤并储存在70/30%w/v的乙醇/水溶液中。
3.膜交联:
3.1用转谷氨酰胺酶(TG)交联的蛋白-海藻酸盐
玉米醇溶蛋白-海藻酸盐-TG:于4℃下将如上所述制备的玉米醇溶蛋白-海藻酸盐膜在含有HEPES(0.1M,pH 7.4)和CaCl2(15g/L)的购自Modernist Pantry(Eliot,ME)的MooGlooTM溶液(TG)(25%w/v)中温育24小时。每个膜使用125mL MooGlooTM溶液。然后每个膜用250mL含有CaCl2(15g/L)的HEPES(0.1M,pH 7.4)洗涤2次。最后,将膜储存在含有CaCl2(15g/L)和2X浓青霉素-链霉亲和素和抗真菌剂(penicillin-streptavidin andantimycotic)的HEPES(0.1M,pH7.4)中。
PPI-海藻酸盐-TG:于4℃下将如上所述制备的PPI-海藻酸盐膜在含有HEPES(0.1M,pH 7.4)和CaCl2(15g/L)的MooGlooTM(TG)溶液(25%w/v)中温育24小时。每个膜使用125mL MooGlooTM溶液。然后每个膜用250mL含有CaCl2(15g/L)的HEPES(0.1M,pH 7.4)洗涤2次。最后,将膜储存在70/30%w/v的乙醇/水溶液中。
糙米-海藻酸盐-TG:于4℃下将如上所述制备的糙米-海藻酸盐膜在含有HEPES(0.1M,pH 7.4)和CaCl2(15g/L)的MooGlooTM(TG)溶液(25%w/v)中温育24小时。每个膜使用125mL MooGlooTM溶液。然后每个膜用250mL含有CaCl2(15g/L)的HEPES(0.1M,pH 7.4)洗涤2次。最后,将膜储存在70/30%w/v的乙醇/水溶液中。
绿豆-海藻酸盐-TG:于4℃下将如上所述制备的绿豆-海藻酸盐膜在含有HEPES(0.1M,pH 7.4)和CaCl2(15g/L)的MooGlooTM(TG)溶液(25%w/v)中温育24小时。每个膜使用125mL MooGlooTM溶液。然后每个膜用250mL含有CaCl2(15g/L)的HEPES(0.1M,pH 7.4)洗涤2次。最后,将膜储存在70/30%w/v的乙醇/水溶液中。
3.2用甘油热交联
3.2.1蛋白膜
当水在整个多孔结构中交换时,膜从半透明变为透明。然后,将膜取出并放入设置为130℃的第三浴中持续10分钟。蛋白交联后,将膜置于含有pH值为7.4的HEPES缓冲液的最终浴中以确保支架处于生理学pH值以实现生物学性能。
SPI:使用PTFE支撑片将SPI扁平膜片流延在乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中,并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,将PTFE支撑的膜转移到甘油浴中并在10分钟至3小时内将水溶液与甘油交换。然后,通过热甘油浴或通过使用烘箱对膜进行热交联。在第一种情况下,将膜转移到100℃的搅拌的甘油浴中并温育10分钟。然后,通过改变甘油浴的最终温度(110℃至140℃之间)和温度增量来研究不同的温度攀升。在烘箱处理的情况下,膜在不同温度(100℃至140℃)下温育并持续不同的持续时间(10至24小时)。
绿豆:使用PTFE支撑片将绿豆扁平膜片流延在乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中,并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,将PTFE支撑的膜转移到甘油浴中并在10分钟至3小时内将水溶液与甘油交换。然后,通过热甘油浴或通过使用烘箱对膜进行热交联。在第一种情况下,将膜转移到100℃的搅拌的甘油浴中并温育10分钟。然后,通过改变甘油浴的最终温度(110℃至140℃之间)和温度增量来研究不同的温度攀升。在烘箱处理的情况下,膜在不同温度(100℃至140℃)下温育并持续不同的持续时间(10至24小时)。
小麦谷蛋白:使用PTFE支撑片将小麦谷蛋白扁平膜片流延在乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中,并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,将PTFE支撑的膜转移到甘油浴中并在10分钟至3小时内将水溶液与甘油交换。然后,通过热甘油浴或通过使用烘箱对膜进行热交联。在第一种情况下,将膜转移到100℃的搅拌的甘油浴中并温育10分钟。通过改变甘油浴的最终温度(100℃至140℃之间)来研究不同的温度攀升。在烘箱处理的情况下,膜在不同温度(100℃至140℃)下温育并持续不同的持续时间(10至24小时)。
3.2.2蛋白-海藻酸盐膜
绿豆-海藻酸盐:使用PTFE支撑片将绿豆-海藻酸盐扁平膜片流延在含有CaCl2(15g/L)的乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中,并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,将PTFE支撑的膜转移到甘油浴中并在10分钟至3小时内将水溶液与甘油交换。然后,通过热甘油浴或通过使用烘箱对膜进行热交联。在第一种情况下,将膜转移到100℃的搅拌的甘油浴中并温育10分钟。然后,通过改变甘油浴的最终温度(110℃至140℃之间)和温度增量来研究不同的温度攀升。在烘箱处理的情况下,膜在不同温度(100℃至140℃)下温育并持续不同的持续时间(10至24小时)。参见图13。
小麦谷蛋白-海藻酸盐:使用PTFE支撑片将小麦谷蛋白-海藻酸盐扁平膜片流延在含有CaCl2(15g/L)的乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中,并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,将PTFE支撑的膜转移到甘油浴中并在10分钟至3小时内将水溶液与甘油交换。然后,通过热甘油浴或通过使用烘箱对膜进行热交联。在第一种情况下,将膜转移到100℃的搅拌的甘油浴中并温育10分钟。然后,通过改变甘油浴的最终温度(110℃至140℃之间)和温度增量来研究不同的温度攀升。在烘箱处理的情况下,膜在不同温度(100℃至140℃)下温育,并持续不同的持续时间(10至24小时)。
玉米醇溶蛋白-海藻酸盐:使用PTFE支撑片将玉米醇溶蛋白-海藻酸盐扁平膜片流延在含有CaCl2(15g/L)的乙酸钠缓冲液(0.2M,pH 4.5)中,并在相同缓冲液中平衡10分钟至3小时。然后,将PTFE支撑的膜转移到甘油浴中并在10分钟至3小时内将水溶液与甘油交换。然后,通过热甘油浴或通过使用烘箱对膜进行热交联。在第一种情况下,将膜转移到100℃的搅拌的甘油浴中并温育10分钟。然后,通过改变甘油浴的最终温度(100℃至110℃与100℃至140℃之间)来研究不同的温度攀升。在烘箱处理的情况下,膜在不同温度(100℃至140℃)下温育,并持续不同的持续时间(10至24小时)。
4.膜涂层
4.1.牛胶原涂布(方法1)
用牛胶原涂布绿豆膜以增加其与细胞的亲和力,从而促进细胞粘附和增殖。在室温下将干燥的直径为14mm的绿豆膜圆片在3mg/mL的胶原溶液中(每20mL胶原溶液20个圆片)浸泡2小时。然后,去除胶原溶液,将圆片放入100%乙醇溶液中并在使用前在4℃下储存。
4.2牛胶原涂布(方法2)
用牛胶原涂布绿豆膜以增加其与细胞的亲和力,从而促进细胞粘附和增殖。在室温下将干燥的直径为14mm的绿豆膜圆片在3mg/mL的胶原溶液中(每20mL胶原溶液20个圆片)浸泡2小时。然后,去除胶原溶液,并于37℃下将圆片在HEPES溶液(0.1M,pH 7.4)中温育1小时。然后,去除HEPES溶液,并在使用前将圆片在4℃下储存在70/30w/v的乙醇水溶液中。
4.3牛纤连蛋白涂布(方法1)
用牛纤连蛋白涂布绿豆膜以增加其与细胞的亲和力,从而促进细胞粘附和增殖。在室温下将干燥的直径为14mm的绿豆膜圆片在2.5mg/mL的纤连蛋白溶液中(每20mL纤连蛋白溶液20个圆片)浸泡2小时。然后,去除纤连蛋白溶液,将圆片放入100%乙醇溶液中并在使用前在4℃下储存。
4.4壳聚糖涂布
用壳聚糖涂布绿豆膜以增加其与细胞的亲和力,从而促进细胞粘附和增殖。在室温下将干燥的直径为14mm的绿豆膜圆片在1%w/v的壳聚糖乙酸溶液(0.2M,pH 4.5,每20mL壳聚糖溶液20个圆片)中浸泡1小时。然后,去除壳聚糖溶液,将圆片放入10%TPP溶液中并搅拌3小时。然后,用MilliQTM水洗涤圆片2次并在4℃下储存在70/30w/v中。
储存:
可以将膜储存在70/30w/v的乙醇/MilliQTM中或含有抗生素/抗真菌剂的HEPES中。或者如果可以将其干燥,但必须注意孔坍塌的问题。干燥可以通过冷冻干燥设备来完成。如果使用另一种由水和20-40%甘油组成的交换浴来交换出HEPES,则可以干燥更具规模化和柔性的膜。如果膜的孔填充有20-40%的甘油,则可以干燥多孔结构。参见图38。
5.膜的机械研究
使用ZwickRoel测试仪以拉伸模式表征膜的机械性能。如图14所示,膜的弹性模量涵盖了宽范围的值,确保我们的材料组合(material portfolio)能够全面满足对中空纤维的不同设计规格。例如,基于K-卡拉胶的膜的弹性模量低于100kPa,因此适合作为肌肉细胞生长和分化的基底(参见图15)。随着中空纤维成为最终培养肉产品的一部分,也需要将真肉的质构特征视为我们材料的设计规格。为此,我们设计了弹性模量范围为100-300kPa的受热威胁的大豆-琼脂糖共混物和一些海藻酸盐共混物,该弹性模量范围是众所周知的肉(特别是整切肉排)的特征。用纯蛋白(如绿豆和玉米醇溶蛋白)或海藻酸盐-蛋白共混物可实现弹性模量和断裂应变方面的最高机械性能。这些最后的材料可用作结构部件,使中空纤维能够经历各种制备工艺并最终在安装到生物反应器中时维持工作条件。
结果
5.1甘油方法的优化
如表1所示通过测试每个步骤的效果来验证用于甘油交联的最终方法,所述方法包括依次进行的凝结(1)、中和(2)、甘油-水交换(3)和甘油热处理(4)步骤。在乙酸盐中凝结并在HEPES中中和后,不进行甘油热处理(样品1,AC-H-0-0)会导致机械不稳定的膜并具有糊状稠度(参见图16)。同样,用高压灭菌(121℃)代替甘油处理会导致不稳定且易碎的膜(样品4AC-0-0-HW)。当去除最初的乙酸盐凝结和中和步骤并且仅施加了甘油热处理时,也获得粉末状且机械不稳定的膜(样品3 0-0-G-HG)(参见图16)。这强调了具有凝结的蛋白网络对于膜稳定性是至关重要的。而且,如果不在酸性条件下而是在中性条件下发生凝结(HEPES),则会获得非常脆的膜(样品4 0-H-G-HG)。最后,在热处理之前在室温下用水与甘油交换有助于避免在与经加热的甘油浴接触时由于水突然膨胀而形成大气泡(样品5AC-0-0-HG)。结果,通过使用乙酸盐浴使纺液溶液凝结,在室温下用水与甘油交换,并最后使用经加热的甘油浴使蛋白网络热交联来获得最好的膜(样品6 AC-0-G-HG)。与其他膜样品相比,根据AC-0-G-HG获得的膜是最稳定的膜,具有最高的杨氏模量和最低应变,表明蛋白交联程度较高(参见图17)。
表1:甘油交联方法优化的实验条件。AC代表“乙酸盐浴0.2 M,pH 4.5”,H代表“HEPES浴,0.1 M,pH 7.4”,G代表“甘油浴”,HG代表“热甘油浴”,HW代表“热水处理”(121℃高压灭菌);0代表“未执行步骤”;Y代表“是”;且N代表“否”。
将基于甘油的热处理的每个步骤进一步优化以改善膜的形态和机械性能。通过改变乙酸盐浴的持续时间并保持水-甘油交换的条件(10分钟)和基于甘油的热处理的条件(温度攀升:在100℃下持续10分钟,攀升至120℃,在120℃下持续30分钟)二者,恒定研究了乙酸盐凝结步骤的效果。图18示出了凝结10分钟至3小时的膜的机械性能。随着凝结时间的增加,没有观察到弹性模量、最终应变和最终应力的统计学差异,表明凝结在探究的10分钟窗口内完成。这些结果表明10分钟足以中和膜的pH值,从而完成成功的凝结过程。接下来,通过保持凝结浴的持续时间(10分钟)和水-甘油交换的持续时间(10分钟)二者恒定并改变在达到120℃的最终温度后的热处理持续时间,来研究基于甘油的热处理。如图19所示,随着热处理时间的增加,获得了更强更韧的膜,最终应变和应力值分别变为两倍和三倍。还值得注意的是,30分钟后,膜的机械性能开始趋于稳定,30分钟的样品和60分钟的样品之间的最终应力几乎没有差异。由于热处理似乎对膜的机械性能有更大的影响,因此进行了进一步的研究以评估该攀升的最终温度的影响。这次,使用流变分析来监测膜的物理性能的变化。热处理直接在流变仪室中在首先被凝结(10分钟)并经历水-甘油交换(10分钟)的膜上进行。如图20和21所示,膜从20℃开始经受每分钟4度的升温,并让其在100℃、120℃和140℃三个不同的最终温度下达到平衡。在50-60℃下,tan(δ)开始下降,因此表明蛋白退火过程开始,从而导致膜凝结。认为热驱动的蛋白去折叠和链间物理交联的形成是固化过程的机制。令人感兴趣的是,随着等温攀升最终温度变化,观察到tan(δ)的趋势。随着攀升最终温度的增加,获得了较低的tan(δ)值,因此表明膜在退火温度增加时经历了强化过程。这一趋势由对从流变实验获得的样品进行的拉伸测试证实。如图20所示,随着最终等温温度增加,观察到弹性模量、最终应力和应变的增加。
膜结构的形成在50-60℃左右开始并以相同的速率继续形成,而无论其最终等温温度如何。然而,最终产生的膜结构强度似乎受到最终等温条件的影响。等温温度越高,则膜弹性越大(tan(δ)越低)。
6.细胞培养基中的稳定性测试
为了对材料在细胞培养条件下的稳定性进行测试,将膜在细胞培养基中于37℃下温育长达30天,并在不同时间点进行机械测试以研究其完整性。发现K-卡拉胶及其豌豆蛋白分离物共混物在细胞培养基中高度不稳定,在温育1天后就已完全溶解。不同的是,海藻酸盐和琼脂糖的共混物在较长的温育时间内更加稳定。在后一情况下,认为膜的性能主要受海藻酸盐和琼脂糖多糖组分的稳定性的影响。这一观察结果得到了取决于多糖的性质存在两种不同的稳定性趋势的支持。海藻酸盐共混物的弹性模量和应变均急剧下降,其中玉米醇溶蛋白共混物的弹性模量下降了高于10倍。相比之下,琼脂糖共混物在整个21天的培养期内几乎完全地保持其机械性能。参见图22、23、24和25。
在海藻酸盐共混物的情况下,认为机械稳定性的逐渐下降是由钙-戊二酸交联聚合物网络的解络引起的。这一假设得到了膜在温育时间后明显膨胀行为的支持,该膨胀行为被量化为膜表面积的增加(图22)。相比之下,基于琼脂糖共混物的膜没有观察到溶胀。溶胀和机械稳定性趋势之间的相关性表明多糖网络是膜的主要结构组分,在海藻酸盐的情况下,其在培养条件下容易破坏。
为了提高海藻酸盐-蛋白共混物在细胞培养条件下的稳定性,对蛋白组分的交联进行了研究。选择转谷氨酰胺酶作为第一个待测试的交联候选物,因为它通常在食品工业中用于制备加工肉。如针对糙米-海藻酸盐共混物所示,同样在这种情况下,随着温育时间的增加,观察到弹性模量和应变均下降。参见图26。
选择热退火作为替代方法来诱导蛋白聚合物网络的物理交联并最终在细胞培养期间使膜稳定。为了避免通过相逆转变形成的膜多孔结构的坍塌,甘油既用作水交换介质,又用作退火过程的传热载体。与海藻酸盐共混物相比,在37℃下在细胞培养基中温育时,经热退火的大豆和绿豆二者的弹性模量均未出现下降。21天后,大豆膜的弹性模量几乎翻番。断裂应变(断裂伸长率)不受影响,而对于大豆来说,表面积略有减少,这表明随着时间的推移可能会发生进一步的交联过程。温育30天后,观察到绿豆断裂所需的力略有下降。与海藻酸盐-蛋白共混物相比更高的在细胞培养条件下的机械稳定性,以及与琼脂糖-蛋白共混物相比跟高的断裂应变,使得这些经热处理的纯蛋白材料成为开发生物反应器应用的膜的优选候选材料。参见图27。
7.成像孔隙率
7.1扁平膜片
通过扫描电子显微镜法来研究所生产的膜的孔隙率。分别如图28和29所示,经热处理的大豆和绿豆蛋白膜呈现出不均匀的孔隙率,其特征是表面上亚微米范围内的较小孔和位于横截面中20-50微米范围内的较大孔。据信,在凝结过程期间在膜-浴溶液界面处发生的快速凝结过程是位于表面上的较稀孔隙率的根源。相比之下,在膜核心中发生的较慢凝结过程允许更大的相分离,从而导致更大的孔。在玉米醇溶蛋白和琼脂糖-玉米醇溶蛋白的情况下观察到不同的情况,其中在整个膜中观察到均匀的孔隙率。图30示出了,在后一情况下,相分离过程是原纤化过程的结果,从而导致非常均匀的孔径分布。虽然本发明不受理论限制,但假设已知琼脂糖和玉米醇溶蛋白二者均通过蛋白自组装来原纤维化。在海藻酸盐-玉米醇溶蛋白和豌豆-K-卡拉胶膜的情况下观察到类似的结果(参见图31),其中生物聚合物原纤化也是膜形成的主要过程。相比之下,绿豆-琼脂糖和大豆-海藻酸盐膜观察到结皮效应。参见图32。
7.2中空纤维膜
使用扫描电子显微镜来研究中空纤维的孔隙率。图33示出了绿豆-海藻酸盐(15%-0.2%)中空纤维的横截面(上)和表面(下)。该纤维在整个横截面上呈现出50微米及以下范围内的孔,但没有观察到结皮效应。纤维壁厚度在100微米范围内,这已是考虑到在厚度大于200微米的组织中通常观察到的理论扩散来优化外部营养物扩散的目标值。
8.细胞粘附和增殖研究
使用C2C12(参见图34、35和36)和QM7(参见图37)细胞系来测试产生的膜的细胞粘附和增殖。一般来说,在纯蛋白膜的情况下,获得更高程度的粘附和增殖,这一观察结果得到了在C2C12和QM7这两种情况下存在具有更细长形态的细胞的支持。当蛋白膜涂有细胞-粘附蛋白诸如胶原和纤连蛋白时,获得了最佳结果。不同的是,在蛋白-多糖共混物的情况下发现了更加球形和簇状的经组装细胞,表明该材料对C2C12和QM7细胞系二者的亲和力较低。
Claims (37)
1.一种用于制备交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片的方法,其包括:
a)提供:i)一种或多种可食用蛋白,ii)一种或多种溶剂,iii)形成浴;其中所述一种或多种溶剂或所述形成浴还包含一种或多种多价阳离子或阴离子或缓冲溶液;
b)将所述一种或多种可食用蛋白在所述一种或多种溶剂中共混合以形成混合物;
c)将所述混合物挤出到所述形成浴中以形成挤出中空纤维,或将所述混合物流延到所述形成浴中以形成膜片;和
d)将所述挤出中空纤维或膜片暴露于能源,所述能源选自热和辐射中的一种或多种,并且足以使所述一种或多种蛋白至少部分地交联以形成交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片。
2.根据权利要求1所述的方法,其还提供一种或多种可食用多糖,并且在步骤b)中,将所述一种或多种多糖与所述一种或多种可食用蛋白在所述一种或多种溶剂中共混合。
3.根据权利要求1所述的方法,其还提供增塑剂,并且在步骤b)中将所述增塑剂与所述一种或多种可食用蛋白在所述一种或多种溶剂中共混合。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种蛋白选自豌豆、大豆、小麦、南瓜、大米、糙米、向日葵、油菜籽、鹰嘴豆、小扁豆、绿豆、菜豆、玉米、燕麦、马铃薯、藜麦、高粱和花生。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述一种或多种多糖选自琼脂、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、海藻酸钠、纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、结冷胶、黄原胶、果胶、木薯淀粉、瓜尔胶和豆胶。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种溶剂选自水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸、氢氧化钠、乙醇、甘油和丙二醇。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述形成浴包含钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种,与以下物质的组合:1)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或2)氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、三聚磷酸盐和柠檬酸三钠,并且其中选出的所述离子至少能使所述一种或多种多糖部分交联。
9.根据权利要求1所述的方法,其中步骤d)中的所述热为约70℃至约140℃,在约0psi至约20psi表压的压力下、在约50%至约100%的相对湿度下施加约2至约60分钟,或在大气条件下将所述中空纤维或膜片浸入约60℃至约100℃的水浴中。
10.根据权利要求1所述的方法,其中将步骤b)的所述混合物加热。
11.根据权利要求1所述的方法,其中步骤b)的所述共混合在约0℃至约90℃进行。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述混合物的pH为约10至约13,并且所述形成浴的pH为约3至约5。
13.根据权利要求12所述的方法,其中在成形后将所述膜中和至约6.8至约7.8的pH。
14.根据权利要求12所述的方法,其中在成形后将所述膜中和至约7.3至约7.5的pH。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述辐射选自电子束、紫外线和γ辐射。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述辐射在处理中或处理后施加。
17.根据权利要求15所述的方法,其中所述辐射为约1至约100kGy或约10至约50kGy。
18.根据权利要求1所述的方法,其中所述孔隙率为约1%至约90%。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述孔隙率为约50%至约80%。
20.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括用涂料涂布所述交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片以增强细胞粘附。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述涂料选自纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、胶原、明胶或从这些蛋白分离的短肽序列中的一种或多种。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述短肽序列选自RGD、YIGSR、IKVAV、DGEA、PHRSN和PRARI中的一种或多种。
23.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括将所述交联、可食用、多孔的中空纤维的外表面改性以增强细胞粘附。
24.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括用增塑剂涂布所述交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述表面改性选自等离子体、电晕、磨蚀、蚀刻、烧蚀或溅射涂布中的一种或多种。
26.根据权利要求1所述的方法,其中在将所述蛋白溶解在所述溶剂中之前,将所述蛋白粉末化或精细研磨。
27.根据权利要求1所述的方法,其中所述蛋白的纯度至少为70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%。
28.根据权利要求1所述的方法,其中所述多糖的纯度至少为70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%。
29.根据权利要求1所述的方法,其中所述混合物中蛋白与多糖的比率为约10:1至约1:10或约1:99至约99:1。
30.根据权利要求1所述的方法,其中所述混合物中蛋白与多糖的比率为约4:1至约1:4。
31.根据权利要求1所述的方法,其中所述混合物中蛋白与多糖的比率为约1:1或约7:1。
32.根据权利要求1所述的方法,其中所述形成浴包含钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种,与以下物质的组合:i)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或ii)氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
33.一种中空纤维或膜片,其通过根据权利要求1至32中任一项所述的方法制备。
34.一种用于制备交联、可食用、多孔的中空纤维或膜片的方法,其包括:
a)提供:i)一种或多种可食用蛋白,ii)一种或多种可食用多糖,iii)一种或多种溶剂和iv)形成浴,其中所述形成浴包含钙、锌、镁、铁和钾中的一种或多种,与以下物质的组合:1)水、乙酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、苹果酸、酒石酸中的一种或多种,或2)氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种;
b)将所述一种或多种可食用蛋白和所述一种或多种可食用多糖在所述一种或多种溶剂中共混合以形成混合物;
c)将所述混合物挤出到所述形成浴中以形成挤出中空纤维,或将所述混合物流延以形成膜片;和
d)将所述挤出中空纤维或膜片暴露于能源,所述能源选自热和辐射中的一种或多种,并且足以使所述一种或多种蛋白至少部分地交联以形成交联、可食用、多孔的中空纤维。
35.一种中空纤维或膜片,其通过根据权利要求34所述的方法制备。
36.根据权利要求1至35中的任一项,其中所述一种或多种蛋白、一种或多种多糖、一种或多种溶剂、增塑剂和/或所述形成浴的一种或多种成分是美国食品药品监督管理局(FDA)公认安全的(GRAS)。
37.根据权利要求1至36中的任一项,其中所得膜片或中空纤维经历10-50%甘油与水的交换以便干燥,没有发生孔坍塌。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US63/234,796 | 2021-08-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118119697A true CN118119697A (zh) | 2024-05-31 |
Family
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