KR20240034671A - 항-ptk7 항체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-PTK7 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-PTK7 항체의 혈관신생, 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cell)의 성장, 이동 및 침윤 억제 효과를 나타냄을 확인하였는 바, 혈관신생 질환의 치료제로 이용될 수 있고, PTK7 양성의 다양한 암종에 적용할 수 있으며, 나아가 난치성 암의 표적 치료제로써 개발되어 이에 대한 핵심적인 글로벌 치료제로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 항체는 인간화 항체로 전환하여 임상에 사용할 수 있는 신약으로 개발하는데 필수적인 재료로 이용될 수 있으며, 단독뿐만 아니라 효과가 규명된 기존 항암제 등의 약물과 병용하여 항암 치료 효과를 극대화시키는데 활용될 수 있다.
Description
항-PTK7 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
Receptor protein tyrosine kinase(RPTK)는 인간에서 총 58종이 알려져 있으며, 리간드(ligand)가 결합하는 세포외 도메인(extracellular domain), 막통과 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 티로신 인산화효소 도메인(intracellular tyrosine kinase domain)으로 구성되어 있다. 일반적으로 RPTK는 리간드가 결합하면 이합체화(dimerization) 되고, 세포질 도메인(cytoplasmic domain)이 인산화 및 활성화되어 신호전달을 유도하게 된다.
Defective RPTK들은 인산화를 촉매하는 티로신 인산화효소 도메인에 돌연변이(mutation)가 일어나 불활성 상태가 된 RPTK의 서브 그룹으로, 인간에서는 ErbB3, PTK7, EphA10, EphB6, RYK 등의 defective RPTK가 보고되어 있다. 이러한 defective RPTK는 비활성 상태이지만 그럼에도 불구하고 발암 등 생리학적 기능이 제시되고 있다. 예컨대, ErbB3는 다른 ErbB family member와 결합하여 발암 신호전달 과정을 유발함이 규명되었고, ErbB3 중화 인간 항체(KTN3379)가 저항성 없는 표적 항암 치료제로 개발되어 임상 시험 중에 있다.
PTK7(Protein Tyrosine Kinase 7)은 7개의 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 루프를 갖는 세포외 영역, 막횡단 도메인 및 비활성 티로신 키나제 촉매 도메인을 함유하는 세포질 영역을 포함한다. 다양한 악성종양에서 상향조절되는 PTK7의 발현은 암을 갖는 환자에서 무질환 생존 및/또는 전체 생존과 부정적으로 상관관계가 있다. PTK7은 활성 RPTK, 예컨대 FGFR1에 대한 보조-수용체로서 기능함으로써 종양원성 신호전달을 강화시킨다. 또한, PTK7의 발현은 내피 세포에서, 특히 관 형성 동안 상향조절되며, PTK7이 혈관신생에 중요한 역할을 수행함을 발견하였다. PTK7은 대장암 등 여러 종류의 암에서 발현 증가가 관찰되었으며, 발암 및 암의 전이에도 관여함이 규명되었다. 그러나 PTK7은 티로신 인산화효소의 활성부위가 변형되어 있으므로 활성 저해제의 개발이 용이하지 않은 바, PTK7의 기능을 억제하기 위한 다른 접근이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 PTK7 기능을 억제하여 혈관신생, 발암 및 암 전이를 제어하기 위해, 항-PTK7 항체를 개발하였다.
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 PTK7의 기능을 억제하여 혈관신생 억제 및 다양한 암종의 치료에 이용될 수 있는 중화 항체를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, PTK7의 세포외 영역에 특이적으로 결합함으로써 PTK7의 활성을 억제하여 결과적으로 암세포의 성장, 이동, 침윤 및 혈관신생 효과가 억제되는 것을 확인하였는 바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편으로서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 6, 11 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2, 7, 12 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH, 서열번호 3, 8, 13 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 4, 9, 14 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VL, WAS(Trp-Ala-Ser) 또는 AAS(Ala-Ala-Ser)을 포함하는 CDR2-VL, 서열번호 5, 10, 15 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VL을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및
상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편의 생산방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 혈관신생 억제제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 혈관신생 억제제를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편으로서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 6, 11 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2, 7, 12 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH, 서열번호 3, 8, 13 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 4, 9, 14 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VL, WAS(Trp-Ala-Ser) 또는 AAS(Ala-Ala-Ser)을 포함하는 CDR2-VL, 서열번호 5, 10, 15 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VL을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 예를 들어, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 PTK7 단백질의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며, 상기 기능적 단편은 디아바디, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dsFv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 부착(adhesion), 상처 치유(wound healing), 주화성 이동(chemotactic migration) 및 침윤(invasion)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 조직 내 헤모글로빈(Hb: hemoglobin) 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
상기 '조직'은 혈관이 생성될 수 있는 조직을 의미하고, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편이 상기 조직 내 혈관 생성을 감소시킴으로써 상기 조직 내 헤모글로빈이 감소되는 것일 수 있다.
상기 조직은 예를 들어, 간, 췌장, 심장, 혈관, 신장, 피부, 폐, 뇌, 위, 대장, 소장, 십이지장, 직장, 난소, 유방, 림프절, 담도, 췌도, 각막, 자궁, 식도, 전립선, 음경, 항문으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 KDR(Kinase Insert Domain Receptor), ERK(extracellular-signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase), FAK(Focal adhesion kinase) 및 Src(tyrosine kinase Src)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신호전달 분자의 인산화(phosphorylation)를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 단백질 티로신 키나아제 7 (PTK7: Protein Tyrosine Kinase 7) 및 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR: Kinase Insert Domain Receptor)의 상호작용을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 기능적 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혈관신생 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 자궁내막증, 비만, 관절염, 동맥경화증, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 혈관유착, 부종성 경화증, 당뇨병성 망막증, 황반변성, 혈관신생성 녹내장, 혈관신생에 의한 각막 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 및 알츠하이머병으로 이루어진 군에서 선택 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 암은 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 항-PTK7 항체의 혈관신생, 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cell)의 성장, 이동 및 침윤 억제 효과를 나타냄을 확인하였는 바, 혈관신생 질환의 치료제로 이용될 수 있고, PTK7 양성의 다양한 암종에 적용할 수 있으며, 나아가 난치성 암의 표적 치료제로써 개발되어 이에 대한 핵심적인 글로벌 치료제로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 항체는 인간화 항체로 전환하여 임상에 이용할 수 있는 신약으로 개발하는데 필수적인 재료로 이용될 수 있으며, 단독뿐만 아니라 효과가 규명된 기존 항암제 등의 약물과 병용하여 항암 치료 효과를 극대화시키는데 활용될 수 있다.
도 1은 항-PTK7 mAb의 PTK7-결합 도메인을 분석한 결과를 나타내는 도로서, 도 1A는 PTK7 및 그 결실 돌연변이체를 나타내는 도이고, 도 1B는 mAb-32, mAb-43, mAb-50 및 mAb-52의 PTK7 결합 도메인을 결정하기 위한 풀 다운(pull-down) 분석 결과를 나타내는 도이다(SP; 신호 펩티드, Ext; 7개의 Ig 도메인을 포함하는 세포외 영역, TM; 막횡단 도메인, Cyt; 촉매적 결함이 있는 티로신 키나제 촉매 도메인(결함 TK로 표시됨) 및 히스 태그(6개의 히스티딘으로 구성되어 H6로 표기)를 함유하는 세포질 영역).
도 2는 PTK7 중화 단일 클론 항체의 전체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 대한 아미노산 서열정보를 나타내는 도이다(mAb 32와 mAb 50의 서열이 매우 유사하고, mAb 43과 mAb 52의 서열이 매우 유사하고, mAb 32와 mAb 50은 CDR 영역에서 총 9개의 아미노산이 상이하고, 이중 CDR 가변 영역에는 6개(청색)의 아미노산이 상이하고, mAb 43과 mAb 52는 CDR 영역에서 총 11개의 아미노산이 상이하며, 이중 CDR 가변 영역에서 5개(적색)의 아미노산이 상이함).
도 3은 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)의 부착에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군. + p < 0.05 및 ++ p < 0.01 대 mAb-32 처리군).
도 4는 HUVEC 단층에서 상처 치유에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 5은 HUVEC의 주화성 이동에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(*** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 6은 HUVEC의 주화성 침윤에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 7은 HUVEC의 세포 독성에 대한 항-PTK7 단일클론 항체(mAb)의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(*** p < 0.001 대 1% FBS 배지에서 배양된 대조군).
도 8는 시험관 내에서 VEGF-유도된 HUVEC의 관 형성에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 9은 생체외에서 VEGF-유도된 혈관신생에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다. 도 9a는 PTK7 mAb #32 및 #43, 도 9b는 PTK7 mAb #52의 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 생체내에서 VEGF-유도된 혈관신생에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 매트리겔 플러그 분석(matrigel plug assay)을 수행한 결과 (상단) 및 Drabkin's Reagent Kit 525를 이용하여 플러그의 헤모글로빈(Hb: hemoglobin) 함량을 측정하여 혈관신생 정도를 정량화한 결과를 확인하였다 (하단) (*** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군). 도 10a는 PTK7 mAb #32 및 #43, 도 10b는 PTK7 mAb #52의 효과를 확인한 결과이다.
도 11는 HUVEC에서 KDR(Kinase Insert Domain Receptor) 및 다운스트림(downstream) 신호 전달 단백질의 VEGF 유도 활성화에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 12는 PTK7-KDR 상호작용에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 생체내에서 종양 생장에 PTK7 mAb #52의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 13a는 삼중음성유방암 세포인 MDA-MB-231 세포를 쥐에 이종이식하고 도 13b는 식도편평세포암 세포인 KYSE-30 세포를 쥐에 이종이식 한 후에 PTK7 mAb 52 투여 후에 종양의 생장 곡선, 분리된 종양의 크기와 무게를 측정하여 정량한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 PTK7 중화 단일 클론 항체의 전체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 대한 아미노산 서열정보를 나타내는 도이다(mAb 32와 mAb 50의 서열이 매우 유사하고, mAb 43과 mAb 52의 서열이 매우 유사하고, mAb 32와 mAb 50은 CDR 영역에서 총 9개의 아미노산이 상이하고, 이중 CDR 가변 영역에는 6개(청색)의 아미노산이 상이하고, mAb 43과 mAb 52는 CDR 영역에서 총 11개의 아미노산이 상이하며, 이중 CDR 가변 영역에서 5개(적색)의 아미노산이 상이함).
도 3은 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)의 부착에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(* p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군. + p < 0.05 및 ++ p < 0.01 대 mAb-32 처리군).
도 4는 HUVEC 단층에서 상처 치유에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 5은 HUVEC의 주화성 이동에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(*** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 6은 HUVEC의 주화성 침윤에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 7은 HUVEC의 세포 독성에 대한 항-PTK7 단일클론 항체(mAb)의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(*** p < 0.001 대 1% FBS 배지에서 배양된 대조군).
도 8는 시험관 내에서 VEGF-유도된 HUVEC의 관 형성에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다(** p < 0.01 및 *** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군).
도 9은 생체외에서 VEGF-유도된 혈관신생에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다. 도 9a는 PTK7 mAb #32 및 #43, 도 9b는 PTK7 mAb #52의 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 생체내에서 VEGF-유도된 혈관신생에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 매트리겔 플러그 분석(matrigel plug assay)을 수행한 결과 (상단) 및 Drabkin's Reagent Kit 525를 이용하여 플러그의 헤모글로빈(Hb: hemoglobin) 함량을 측정하여 혈관신생 정도를 정량화한 결과를 확인하였다 (하단) (*** p < 0.001 대 VEGF 처리 대조군). 도 10a는 PTK7 mAb #32 및 #43, 도 10b는 PTK7 mAb #52의 효과를 확인한 결과이다.
도 11는 HUVEC에서 KDR(Kinase Insert Domain Receptor) 및 다운스트림(downstream) 신호 전달 단백질의 VEGF 유도 활성화에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 12는 PTK7-KDR 상호작용에 대한 PTK7 mAb의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 생체내에서 종양 생장에 PTK7 mAb #52의 효과를 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 13a는 삼중음성유방암 세포인 MDA-MB-231 세포를 쥐에 이종이식하고 도 13b는 식도편평세포암 세포인 KYSE-30 세포를 쥐에 이종이식 한 후에 PTK7 mAb 52 투여 후에 종양의 생장 곡선, 분리된 종양의 크기와 무게를 측정하여 정량한 결과를 나타내는 도이다.
본 발명자들은 티로신 인산화효소의 활성부위가 변형되어 있어 활성 저해제 개발이 용이하지 않은 PTK7의 기능을 효과적으로 억제하기 위하여 인간 PTK7 중화 단일클론 항체 4종을 개발하였으며, 이의 발암, 전이 및 혈관신생에 대한 억제 효과를 확인하였는 바 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편으로서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 6, 11 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2, 7, 12 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH, 서열번호 3, 8, 13 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 4, 9, 14 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VL, WAS(Trp-Ala-Ser) 또는 AAS(Ala-Ala-Ser)을 포함하는 CDR2-VL, 서열번호 5, 10, 15 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VL을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체(Antibody)”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 폴리클로날(polyclonal) 항체 및 모노클로날(monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체), 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체), 이중 특이적(bispecific) 항체와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 본 발명에 있어서 항체는 예를 들어, 단일클론 항체이다.
본 발명의 ‘항체’ 및 ‘항-PTK7 항체'는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 PTK7에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다.
본 발명에 따른 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편은 PTK7에 특이적으로 결합하며, 특히 PTK7의 세포외 도메인에 매우 높은 친화도로 특이적으로 부착할 수 있다.
상기 PTK7은 당업계에 PTK7으로 알려진 것이라면 그 구체적 생물기원이 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 생쥐(mouse), 인간, 쥐(rat), 닭, 개 또는 원숭이를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있고, 인간 유래의 것을 의미하는 것일 수 있다.
전형적으로 항체는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변영역 및 가변영역(상기 부위는 “도메인”으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일 특이성을 갖게 된다.
항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 “상보성 결정 영역”(complementarity-determining region, 이하, ‘CDR’)이라고 불리는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 “구조영역”(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 그러나 모든 CDR 단기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.
본 발명에 있어서, 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 경쇄 가변영역 중 CDR2-VL은 WAS(Trp-Ala-Ser) 또는 AAS(Ala-Ala-Ser)일 수 있고, 예를 들어, 상기 WAS(Trp-Ala-Ser) 또는 AAS(Ala-Ala-Ser)는 본원 실시예 2.(2)에 나타난 항-PTK7 항체들(#32, #43, #50 및 #52)로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 각각 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어, IgG일 수 있다. 상기 IgG 형태의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입 형태를 모두 포함한다.
본 발명의 상기 기능적 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 상기 단편은 모항체의 PTK7 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 바람직하게는 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로, 상기 단편은 디아바디, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dsFv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 부착(adhesion), 상처 치유(wound healing), 주화성 이동(chemotactic migration) 및 침윤(invasion)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 조직 내 헤모글로빈(Hb: hemoglobin) 수준을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 KDR(Kinase Insert Domain Receptor), ERK(extracellular-signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase), FAK(Focal adhesion kinase) 및 Src(tyrosine kinase Src)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신호전달 분자의 인산화(phosphorylation)를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 단백질 티로신 키나아제 7 (PTK7: Protein Tyrosine Kinase 7) 및 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR: Kinase Insert Domain Receptor)의 상호작용을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편은 암 성장을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예에서 상기 항-PTK7 항체를 제조하고 이의 PTK7 기능 억제에 따른 항암 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 항-PTK7 mAb의 PTK7-결합 도메인을 분석하기 위해 항-PTK7 mAb를 사용하여 풀 다운(pull down) 검정을 수행하였다. 그 결과, mAb-32 및 mAb-50은 PTK7-Ig1-7-His에 결합하였으나 다른 결실 돌연변이체에는 결합하지 않았으므로, PTK7-Ig6-7 도메인을 인식함을 알 수 있고, mAb-43 및 mAb-52는 PTK7-Ig1-7-His, PTK7-Ig1-5-His, PTK-7-Ig1-4-His, PTK7-Ig1-3-His 및 PTK7-Ig2-4-His에 결합하였으나, PTK7-Ig3-4-His에는 결합하지 않았으므로, PTK7 Ig2 도메인을 인식함을 알 수 있었다(실시예 2.(1) 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cell)에서 혈관신생 표현형 (부착(adhesion), 상처 치유(wound healing), 주화성 이동(chemotactic migration) 및 침윤(invasion))에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 분석하였다. 그 결과, mAb-32, mAb-43, mAb-50, mAb-52 및 sPTK7은 HUVEC의 VEGF-유도된 부착을 감소시킴을 확인하였다. 또한, mAb-32, mAb-43, mAb-50, mAb-52 및 sPTK7은 HUVEC 단일층에서 VEGF-유도된 상처 치유를 감소시킴을 확인하였다. 나아가, mAb-32, mAb-43 및 mAb-52는 HUVEC에서 VEGF-유도된 주화성 이동을 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다. 또한, mAb-32, mAb-43 및 mAb-52는 HUVEC의 VEGF-유도된 침윤을 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다(실시예 2.(3) 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 시험관내(in vitro) 혈관신생에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하기 위해, 모세관-유사 관 형성(capillary-like tube formation) 검정을 수행하였다. 10 μg/ml의 mAb-32, mAb-43 또는 mAb-52는 시험관 내에서 VEGF-유도된 모세관-유사 관 형성을 억제함을 확인하였다(실시예 2.(4) 참조). 또한, 생체외(ex vivo) 혈관신생에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하기 위해, 마우스 대동맥 고리(aortic ring) 분석을 수행하였다. 10 μg/ml의 mAb-32, mAb-43 또는 mAb-52는 생체 외에서 VEGF-유도된 혈관의 생성을 억제함을 확인하였다(실시예 2.(4) 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 생체내(in vivo) 혈관신생에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하기 위해 매트리겔 플러그 분석을 수행하였다. 3 μg/ml의 mAb-32, mAb-43 또는 mAb-52와 VEGF를 함께 처리한 결과, 주황색 또는 담적색을 갖는 플러그를 생성함을 확인하였고, 10 μg/ml의 mAb-32, mAb-43 또는 mAb-52와 VEGF를 함께 처리한 결과, 흰색 또는 노란색을 갖는 플러그를 생성함을 확인하였다. 또한, 플러그 내의 헤모글로빈(Hb) 함량을 측정함으로써 생체내 혈관신생의 정도를 정량화하였다. 그 결과, mAb-32, mAb-43 및 mAb-52가 VEGF에 의하여 증가된 헤모글로빈 수준을 감소시킴을 확인하였다(실시예 2.(5) 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, HUVEC에서 VEGF-유도된 신호전달 단백질의 활성화에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하였다. 그 결과, mAb-32 및 mAb-43은 KDR, ERK, JNK, FAK 및 Src의 인산화를 하향 조절함을 확인하였다(실시예 2.(6) 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 생체내에서 종양 생장에 PTK7 mAb 52의 효과를 확인하였다. 삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231 세포 또는 식도편평세포암 세포주 KYSE-30 세포를 마우스에 이종이식 한 후, 항-PTK7 mAb-52의 항 종양 효과를 분석하였다. 10 mg/kg의 항-PTK7-mAb-52를 3주간 6차례 복강 내 주사한 마우스는 대조군 마우스에 비하여 종양의 생장이 감소되었고, 마우스에서 분리한 종양의 크기와 무게가 감소됨을 확인하였다(실시예 2.(8) 참조).
상기 실시예 결과들로부터, 본 발명에 따른 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편은 PTK7의 기능을 효과적으로 차단하여 다양한 암종에서 PTK7의 발현 또는 활성에 의한 발암, 전이 및 혈관신생을 우수한 효과로 억제함으로써 항암효과를 달성할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 ‘폴리뉴클레오티드’는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것이다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당해 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, ‘벡터(vector)’는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그널 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있으나, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주입, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있으나, 형질전환 방법이 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편의 생산방법을 제공한다.
상기 세포 배양은 세포의 종류에 따라 배지 조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며 이는 해당 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 PTK7의 특이적 검출 방법을 제공한다.
통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고, 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 암 또는 암전이 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 등일 수도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색(immunohistochemistry), 효소면역분석(ELISA), 방사능면역검정법(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석, 면역침전 등이 있다.
상기 항체 또는 그 단편은 이의 '검출'을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있고, 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제와 같은 루시퍼라제, 루시페린(luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제(urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴(biotin)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘(avidin)에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혈관신생 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 “혈관신생 관련 질환”은 비정상적이거나 과도한 혈관신생(angiogenesis)이 지속적으로 일어남으로써 유도될 수 있는 질환으로, 구체적으로는 암, 자궁내막증, 비만, 관절염, 동맥경화증, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 혈관유착, 부종성 경화증, 당뇨병성 망막증, 황반변성, 혈관신생성 녹내장, 혈관신생에 의한 각막 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 및 알츠하이머병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 유효성분으로 포함하는 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 PTK7의 발현 또는 기능이 증가되어 있는 것이 바람직하며, 구체적으로는 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물들은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 혈관신생 억제제 또는 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 기존에 공지된 혈관신생 관련 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 제제와 병용 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 기존에 공지된 혈관신생 관련 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 제제와 병용 투여될 경우, 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 그 기능적 단편; 및 약물;이 결합된, 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 부착(adhesion), 상처 치유(wound healing), 주화성 이동(chemotactic migration) 및 침윤(invasion)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 조직 내 헤모글로빈(Hb: hemoglobin) 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 KDR(Kinase Insert Domain Receptor), ERK(extracellular-signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase), FAK(Focal adhesion kinase) 및 Src(tyrosine kinase Src)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신호전달 분자의 인산화(phosphorylation)를 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 단백질 티로신 키나아제 7 (PTK7: Protein Tyrosine Kinase 7) 및 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR: Kinase Insert Domain Receptor)의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 암 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 치료제 또는 백신 등 그 종류에 국한되지 않으며, 제한 없이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 암의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 재료 및 방법
(1) 세포 배양
인간 배아 신장 293 (HEK293: Human embryonic kidney 293) 세포를 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank) (Soul, Korea)로부터 얻었고, 10% 소 혈청(Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL 페니실린(penicillin) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (streptomycin)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Hyclone, South Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)를 Zenbio (Durham, NC, USA)로부터 구입하고, 20% 소 태아 혈청 (FBS; Hyclone), 5 U/mL 헤파린(heparin) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 3 ng/mL 인간 기본 섬유아세포 성장인자 (human bFGF: human basic fibroblast growth factor) (Prospec, Ness-Ziona, Israel)가 보충된 199 배지 (Gibco)에서 배양하였다. HUVEC은 5 계대 내지 10 계대에서 실험에 사용하였다. 모든 세포를 5% CO2 및 95% 공기가 존재하는 37℃에서 배양하였다.
(2) 항체 준비
항체는 하기 판매업체로부터 구입하였다: Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), 항-포스포-ERK (sc-7383), 항-FAK (sc-557) 항체; Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), 항-포스포-KDR (Tyr1175; 2478S), 항-KDR (2479S), 항-포스포(phospho)-Src 계열 (Tr416; 2101S), 항-SrC(2109S), 항-포스포-JNK (Thr183/Tyyr185; 4668S) 및 항-JNK (9252S) 항체; Merck Millipore (Burlington, MA, USA), 항-포스포-FAK 항체 (TYr396; abt135); Bioss (Boston, MA, USA), 항-ERK2 항체 (bms-52068R); 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 항-FLAG-M2 항체(F1804); Bio-Legend (San Diego, CA, USA), 항-HA 항체 (902302); Qiagen (Cambridge, MA, USA), 항-펜타-His 항체; AbClone (Seoul, Korea), 항-GAPDH 항체 (abc2003); KOMA Biotech (Seoul, Korea), 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스-IgG (horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse-IgG) 및 항-토끼-lgG 항체. 토끼 항-PTK7 항-혈청 (anti-PTK7 anti-serum)의 제작은 Shin, W.S.; Maeng, Y.S.; Jung, J.W.; Min, J.K.; Kwon, Y.G.; Lee, S.T. Soluble PTK7 inhibits tube formation, migration, and invasion of endothelial cells and angiogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 793-798, doi:10.1016/j.bbrc.2008.04.168.에 기재되어 있다.
(3) sPTK7 및 sPTK7 도메인을 발현하는 벡터
인간 sPTK7 (인간 PTK7 Ig1-7-His에 해당)을 코딩하는 pcDNA3-hPTK7-Ext-His 벡터는 Shin, W.S.; Maeng, Y.S.; Jung, J.W.; Min, J.K.; Kwon, Y.G.; Lee, S.T. Soluble PTK7 inhibits tube formation, migration, and invasion of endothelial cells and angiogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 793-798, doi:10.1016/j.bbrc.2008.04.168.에 기재되어 있다. 인간 PTK7-Ig1-5-His, PTK 7-Ig1-4.2-His 및 PTK-7-Ig1-3-His를 각각 코딩하는 상보성 DNA (cDNA) 단편을 pcDNA3.1 내로 서브클로닝함으로써, pcDNA3.1-hPTK7-lg1-5-His, pcDNA3.1-hPTK7-lg1-4.2-His 및 pcDNA3.1-hPTK7-Ig1-3-His를 생성하였다. 상기 cDNA 단편은 다음과 같은 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR: polymerase chain reaction)을 사용하여 생성되었다: Ig1-F 및 Ig5-His-R; Ig1-F 및 Ig4.2-His(His)-R; Ig1-F 및 Ig3-His-R (표 1). 그 후, cDNA 단편을 EcoRI 및 XbaI로 절단하고, EcoRI 및 XbaI으로 절단한 pcDNA3.1 벡터에 접합시켰다. 인간 PTK7-Ig1-4-His를 코딩하는 pcDNA3.1-hPTK7-1g1-4-His 벡터는 pcDNA3.1-hPT K7-lg1-4.2-His 벡터를 주형으로 프라이머 쌍 Ig1-4-His-F, Ig1-4-His-R (표 2)을 사용하고, DpnI-매개 결실 돌연변이 유발 (DpnI-mediated deletion mutagenesis)을 사용하여 생성하였다. 인간 PTK7-Ig2-4-His 및 인간 STK7-lg3-4-His를 코딩하는 pcDNA3.1-hPTK7-2-4-His 및 pcDNA3.1-hPTK7-Ig3-4-His 벡터는 각각 hPTK7-Ig1-4-His 구축물을 주형으로 프라이머 쌍 Ig2-4 His-F/Ig2-4 His-R, Ig3-4-His-F/lg3-4-His-R (표 2)를 사용하고, DpnI-매개 결실 돌연변이 유발을 사용하여 생성하였다. 모든 구성물은 서열분석 (sequence)하여 PCR 오차가 없음을 확인하였다.
1 F: forward primer (정방향 프라이머) 및 R: reverse primer (역방향 프라이머)
2 pcDNA3.1(+) 및 인간 PTK7 cDNA에서 파생된 서열은 각각 파란색과 빨간색으로 표시. XbaI 제한 부위 (TCTAGA), 정지 코돈 (TGA) 및 His 태그에 해당하는 서열은 각각 기울임꼴, 굵게 및 밑줄 형식으로 표시.
3 MN996867 및 U40271은 각각 pcDNA3.1 (+) 및 인간 PTK7 cDNA에 대한 GenBank 수탁 번호를 나타냄.
1 F: forward primer (정방향 프라이머) 및 R: reverse primer (역방향 프라이머)
2 인간 PTK7 cDNA 및 pcDNA3.1 (+)에서 파생된 서열은 각각 빨간색과 파란색으로 표시. XbaI 제한 부위 (TCTAGA), 정지 코돈 (TGA) 및 His-tag에 해당하는 서열은 각각 기울임꼴, 굵게 및 밑줄 형식으로 표시.
3 U40271 및 MN996867은 각각 인간 PTK7 cDNA 및 pcDNA3.1 (+)에 대한 GenBank 수탁 번호를 나타냄.
(4) HEK293 세포에서 sPTK7 및 sPTK7 도메인의 발현 및 정제
His-tagged sPTK7 및 sPTK7 도메인에 대한 발현 벡터를 인산칼슘 방법을 사용하여, Shin, W.S.; Shim, H.J.; Lee, Y.H.; Pyo, M.; Park, J.S.; Ahn, S.Y.; Lee, S.-T. PTK6 Localized at the Plasma Membrane Promotes Cell Proliferation and MigratiOn Through Phosphorylation of Eps8. J. Cell. Biochem. 2017, 118, 2887-2895, doi:10.1002/jcb.25939.에 기재된 프로토콜에 따라 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 선별하기 위해, 세포를 1.2 mg/mL G418 (AG Scientific, CA, USA)의 존재 하에 2주 동안 배양하였다. His-tagged 단백질을 발현하는 안정한 단일 세포 클론 또는 혼합 세포 집단을 0.6 mg/mL G418을 갖는 배지에서 배양하였다. His-tagged 단백질을 안정하게 발현하는 세포의 무혈청 조건 배지 (Serum-free conditioned medium) (4 내지 5일 동안)를 황산암모늄 (ammonium sulfate)을 가하여 70%까지 포화시켜 단백질들을 침전시켰다. 첨전물을 1 mM 페닐메틸-술포닐 플루오라이드 (PMSF: phenylmethyl-sulfonyl fluoride) 및 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid)을 함유하는 인산완충식염수 (PBS: phosphate-buffered saline) (137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl 및 2 mM KH2PO4; pH 7.4)로 용해시켜, 인산완충식염수 (PBS)로 투석하였다. 그 후, His-tagged 단백질은 Ni2+-NTA 아가로스 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다.
(5) 항-PTK7 mAb
정제된 인간 sPTK7을 항원 (AbFrontier, Seoul, Korea)으로 사용하여 마우스 항-PTK7 하이브리도마 세포주 (hybridoma cell line)를 제작하였다. 항-PTK7 mAb는 하이브리도마를 마우스 (AbClone)에 복강내 주사 (intraperitoneal injection)하여 얻은 복수 (ascites)로부터 정제되었다.
(6) 항-PTK7 mAb의 결합 도메인의 분석
정제된 sPTK7-His 및 그의 결실 도메인을 4℃에서 2시간 동안 1:1 몰비로 항-PTK7 mAb와 함께 인큐베이션하고, Ni2+-NTA 아가로스 수지 (Qiagen, Cambridge, MA, USA)와 함께 풀 다운 (pull down)시켰다. 단백질-결합 수지 (Protein-bound resin)를 0.1% Tween 20을 함유하는 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 분쇄된 단백질을 소듐 도데실 설페이트 (SDS: sodium dodecyl sulfate) 샘플 완충액에 재현탁시키고, 웨스턴 블롯팅 (western blotting)하였다.
(7) 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
웨스턴 블롯팅은 Choi, Y.E.; Song, M.J.; Hara, M.; Imanaka-Yoshida, K.; Lee, D.H.; Chung, J.H.; Lee, S.-T. Effects of Tenascin C on the Integrity of Extracellular Matrix and Skin Aging. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, doi:10.3390/ijms21228693.에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 세포 용해물 또는 풀 다운 단백질을 SDS 샘플 완충액에 재현탁시키고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE: SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에 적용하였다. 분해된 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (polyvinylidene difluoride membrane) (Millipore, Bedford, MA, USA)에 블롯팅하였다. 막은 지시된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 면역반응성 신호 (Immunoreactive signal)는 Immobilon western chemiluminescent HRP substrate (Millipore, Bedford, MA, USA) 및 AMERSHAM ImageQuant 800 (Cytiva, Marlborough, MA, USA)을 사용하여 탐지하였다.
(8) 부착(Adhesion) 분석
HUVEC를 1% FBS를 함유하는 M199 배지에서 6시간 동안 굶긴 후 (starved), 세포를 동일한 배지 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 (1 x 104 cell/100 μL)을 25℃에서 30분 동안 항-PTK7 mAb (10 μg/mL) 또는 인간 sPTK7 (4 μg/mL)로 전처리하고, 젤라틴-코팅된(gelatin-coated) 96-웰 플레이트에 로딩하였다. 이어서, 세포를 최종 10 ng/mL 인간 VEGF (vascular endothelial growth factor) (KOMA Biotech)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 1% SDS로 용해시키고, 600 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하였다.
(9) 상처 치유 검정
12-웰 플레이트에서 성장된 HUVEC의 단층 (monolayer)을 1% FBS를 함유하는 M199 배지에서 6시간 동안 굶기고, 마이크로파이펫 팁 (Micropipette tip)을 사용하여 단층에 상처를 주었다. 세포를 세척하여 파편을 제거하고, 1% FBS를 함유하는 M199 배지 중 항-PTK7 mAb (10 μg/mL) 또는 인간 sPTK7 (4 μg/mL)로 전처리하였다. 이어서, 세포를 최종 10 ng/mL 인간 VEGF와 함께 14시간 동안 인큐베이션하고, 광학 현미경 (light microscope)으로 관찰하였다.
(10) 주화성(Chemotactic) 이동 및 침윤(invasion) 검정
HUVEC를 1% FBS를 함유하는 M199 배지에서 6시간 동안 굶겼다. 주화성 (Chemotactic) 이동 및 침윤 (invasion) 검정은 Shin, W.S.; Maeng, Y.S.; Jung, J.W.; Min, J.K.; Kwon, Y.G.; Lee, S.T. Soluble PTK7 inhibits tube formation, migration, and invasion of endothelial cells and angiogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 793-798, doi:10.1016/j.bbrc.2008.04.168.에서 일부 수정하여 수행하였다. HUVEC를 25℃에서 30분 동안 항-PTK7 mAb (3 및 10 μg/mL) 또는 인간 sPTK 7 (4 μg/mL)로 전처리한 후, 세포를 트랜스웰 (trnaswell)의 상부 구획에 로딩하였다. 필터의 바닥 표면으로 이동한 세포를 인산완충식염수(PBS) 중 3.7% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정시키고, 0.02% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하고, 광학 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 염색된 세포를 1% SDS로 용해시키고, 혼합물을 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(11) 모세관-유사 관(Capillary-like tube) 형성 검정
모세관-유사 관 (Capillary-like tube) 형성 검정은 Lee, Y.H.; Park, J.H.; Cheon, D.H.; Kim, T.; Park, Y.E.; Oh, E.S.; Lee, J.E.; Lee, S.-T. Processing of syndecan-2 by matrix metalloproteinase-14 and effect of its cleavage on VEGF-induced tube formation of HUVECs. Biochem. J. 2017, 474, 3719-3732, doi:10.1042/bcj20170340.에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, HUVEC를 1% FBS를 함유하는 M199 배지에서 6시간 동안 굶기고, 트립신 (trypsin)을 사용하여 수확하고, 동일한 배지에서 재현탁하였다. 세포 (24-웰 플레이트의 2 x 105 cell/well)를 항-PTK7 mAb (10 μg/mL) 또는 sPTK7 (4 μg/mL)로 30분 동안 전처리하고, 300 μL의 성장 인자-감소 매트리겔 (growth factor-reduced Matrigel) (Corning, Bedford, MA, USA)로 사전-코팅된 24-웰 플레이트에 로딩하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 16시간 동안 최종 20 ng/mL 인간 VEGF와 함께 인큐베이션하고, 광학 현미경을 사용하여 분석하였다. 모세관-유사 관의 수를 ImageJ 혈관신생 분석기 (ImageJ angiogenesis analyzer)를 사용하여 정량화하였다.
(12) 마우스 대동맥 고리(aortic ring) 검정
대동맥 고리 (aortic ring) 검정은 Bellacen, K.; Lewis, E.C. Aortic ring assay. J. Vis. Exp. 2009, doi:10.3791/1564.에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 마우스의 흉부 대동맥 (thoracic aorta) (6 내지 7주령)을 차가운 인산완충식염수(PBS)로 채워진 페트리 디쉬 (petri dish)로 옮기고, 주변 지방 조직을 제거하였다. 대동맥을 외과적 블레이드 (surgical blade)를 사용하여 슬라이스하고 (sliced), 응고된 성장 인자-감소된 매트리겔 (150 μL)의 중심에 두었다. 샘플을 48-well dish에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 추가 매트리겔 (150 μL)을 각각의 고리의 상부에 첨가하고, 샘플을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 항-PTK7 mAb (10 μg/mL) 또는 sPTK7 (4 μg/mL)을 포함하거나 포함하지 않는 20 ng/mL 마우스 VEGF (KOMA Biotech)를 함유하는 1% FBS (200 μL)를 포함하는 M199 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 배지는 5일마다 1회 교체하였다. 12일 후, 대동맥으로부터의 세포의 증식을 위상차 현미경 (phase-contrast microscope)으로 분석하였다.
(13) 매트리겔 플러그(Matrigel plug) 검정
매트리겔 플러그 (Matrigel plug) 검정은 Shin, W.S.; Na, H.W.; Lee, S.-T. Biphasic effect of PTK7 on KDR activity in endothelial cells and angiogenesis. Biochim. Biophys. Acta 2015, 1853, 2251-2260, doi:10.1016/j.bbamcr.2015.05.015.에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 32 U 헤파린 (heparin) 및 250 ng의 마우스 VEGF 또는 마우스 VEGF plus 항-PTK7 mAb (3 및 10 μg/mL)를 함유하는 성장 인자-감소된 매트리겔 (0.5 mL)을 4주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 피하 주사 (subcutaneously injection)하였다. 12일 후, 마우스를 희생시키고, 플러그를 회수하였다. 혈관 형성을 정량화하기 위해 Drabkin's 시약 키트 525 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 플러그 내의 헤모글로빈 (Hb: hemoglobin) 함량을 측정하였다.
(14) HUVEC에서 신호전달 단백질의 분석
서브컨플루언트 HUVEC (Subconfluent HUVEC)를 1% FBS로 보충된 M199 배지에서 6시간 동안 굶겼다. 세포를 30분 동안 항-PTK7 mAb (10 μg/mL) 또는 sPTK7 (4 μg/mL)과 함께 사전 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 10 ng/mL 인간 VEGF로 2분 동안 자극하여 수용체 인산화 (receptor phosphorylation)를 분석하거나, 1시간 동안 자극하여 FAK의 인산화를 분석하거나 10분 동안 자극시켜 다른 신호전달 분자의 인산화를 평가하였다. 이어서, 세포를 1 mM Na3VO4 및 5 mM NaF를 함유하는 방사성면역침전 (radioimmunoprecipitation) 검정 용해 완충제로 용해시켰다.
(15) HEK293 세포에서 PTK7 및 KDR(Kinase Insert Domain Receptor)의 공동-발현(Co-expression)
C-말단 FLAG 태그를 갖는 인간 PTK7을 코딩하는 렌티바이러스 전달 벡터(lentiviral transfer vector) pHRST-hPTK7-FLAG-IRES-eGFP는 Shin, W.S.; Park, M.K.; Kim, J.H.; Oh, S.W.; Jang, J.Y.; Lee, H.; Lee, S.-T. PTK7, a Catalytically Inactive Receptor Tyrosine Kinase, Increases Oncogenic Phenotypes in Xenograft Tumors of Esophageal Squamous Cell Carcinoma KYSE-30 Cells. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, doi:10.3390/ijms23042391.에 기재되어 있다. HEK293T 세포에 pHRST-hPTK7-FLAG-IRES-eGFP, 패키징 벡터(packaging vector) psPAX2 및 엔벨로프 벡터(envelope vector) pMD2.G (Addgene, Cambridge, MA, USA)의 공동-형질감염(co-transfection)에 의해 PTK7-FLAG를 발현하는 렌티바이러스를 증식시켰다. 서브컨플루언트 HEK293 세포는 PTK7-FLAG 렌티바이러스를 사용하여 감염시켰다. PTK7-FLAG를 발현하는 HEK293 세포를 인산칼슘 방법을 사용하여 C-말단 HA 태그를 갖는 인간 KDR을 코딩하는 pcDNA3.1-Kozak-KDR로 형질감염시켰다.
(16) 풀 다운(Pull down) 검정
PTK7-FLAG 및 KDR-HA를 공동-발현하는 서브컨플루언트 HEK293 세포를 2시간 동안 항-PTK7 mAb (10 μg/mL) 또는 sPTK7 (4 μg/mL)과 함께 인큐베이션하였다. 세포는 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4 및 프로테아제 억제제 칵테일 III(protease inhibitor cocktail III) (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 포함하는 NP-40 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl 및 1% NP-40)으로 용해하였다. 용해물을 마우스 항-FLAG M2 항체 (Sigma-Aldrich)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 단백질 결합 수지 (protein-bound resin)를 NP-40 용해 완충액으로 세척하였다. 분쇄된 단백질을 SDS 샘플 완충제에 재현탁시키고, 웨스턴 블롯팅하였다.
(17) 마우스에 종양의 이종이식(xenograft) 검정
삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231 세포(1×106 cell)를 인산완충식염수과 매트리겔(PBS-matrigel)의 1:1 혼합액 0.2 ml에 재현탁시킨 후 마우스 등에 피하 주사로 이식하였다. 접종한 후 약 2주 경과 후, 종양의 부피가 100 ㎣ 정도에 도달하면, 인산완충식염수(PBS) 또는 항-PTK7 mAb-52를 10 mg/kg로 3주간 주 2회 복강 내 주사로 투여하였다. 시험물질 투여 후 총 5주간 종양의 생장을 관찰, 크기 측정하고, 실험종료 후 종양을 적출하여 크기 및 무게를 측정하였다.
식도편평세포암 세포주 KYSE-30 세포(1×106 cell)를 1:1로 섞은 인산완충식염수과 매트리겔(PBS-matrigel)의 1:1 혼합액 0.2 ml에 재현탁시킨 후 마우스 등에 피하 주사로 이식하였다. 접종한 후 약 1주 경과 후 종양의 부피가 100 ㎣ 정도에 도달하면, 인산완충식염수(PBS) 또는 항-PTK7 mAb-52를 10 mg/kg로 3주간 주 2회 복강 내 주사로 투여하였다. 시험물질 투여 후 총 4주간 종양의 생장을 관찰, 크기 측정하고, 실험종료 후 종양을 적출하여 크기 및 무게를 측정하였다.
(18) 통계 분석
두 그룹 사이의 평균을 Student's t-test를 사용하여 비교하였다. 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 얻은 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 차이는 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주하였다.
2. 실험 결과
(1) 항-PTK7 mAb의 PTK7-결합 도메인의 분석
항-PTK7 mAb의 PTK7-결합 도메인을 분석하기 위해, 풀 다운(pull down) 검정을 항-PTK7 mAb를 사용하여 수행하였다. PTK7의 세포외 영역 결실 돌연변이체 (sPTK7, 비교를 위해 PTK7-Ig1-7-His로 명명)를 분석에 사용하였다: PTK7-Ig1-5-His, PTK7-Ig1-4-His, PTK7-Ig1-3-His, PTK7-Ig2-4-His 및 PTK7-Ig3-4-His(도 1A). mAb-32 및 mAb-50은 PTK7-Ig1-7-His에 결합하였으나 다른 결실 돌연변이체에는 결합하지 않았으므로, PTK7-Ig6-7 도메인을 인식함을 알 수 있고, mAb-43 및 mAb-52는 PTK7-Ig1-7-His, PTK7-Ig1-5-His, PTK-7-Ig1-4His, PTK7-Ig1-3-His 및 PTK7-Ig2-4-His에 결합하였으나, PTK7-Ig3-4-His에는 결합하지 않았으므로, PTK7 Ig2 도메인을 인식함을 알 수 있었다(도 1B).
(2) 항-PTK7 mAb의 상보성 결정 영역(CDR: complementary determining region)에 대한 서열 분석
항체 즉, 면역글로불린 (Ig: Immunoglobulin)의 중쇄 (heavy chain)와 경쇄 (light chain)의 초가변영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 상보성 결정 영역 (CDR: complementary determining region)이라고 한다. Ig의 CDR 서열은 항체가 항원에 결합하는 데 중요한 접촉 잔기를 제공하며, 중쇄와 경쇄에는 각각 3개의 CDR이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 PTK7 중화 단일클론 항체(mAb-32, mAb-43, mAb-50 및 mAb-52)의 CDR 서열을 조사하기 위해, 상기 항체를 분비하는 하이브리도마 세포에서 total RNA을 분리하고, oligo-dT15와 random hexamer로 cDNA를 합성한 후, Ig의 초가변영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트로 증폭시키고, PCR 산물을 클로닝하여 각 클론에 대한 서열을 확인하고, IGBLAST Tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 사용하여 CDR 염기서열과 아미노산 서열을 분석하였다. 상기 분석을 통해 도출된 4종의 PTK7 중화 단일클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타내었으며, 전체 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 대한 아미노산 서열정보는 도 2에 나타내었다.
| PTK7 mAb | Part | 아미노산 서열(N-C) | 서열번호 |
| #32 | CDR1_VH | GFDFSRYW | 1 |
| CDR2_VH | INPDSSTI | 2 | |
| CDR3_VH | ARAYYIYYFDY | 3 | |
| CDR1_VL | QSLLYSSNQKNY | 4 | |
| CDR2_VL | WAS | - | |
| CDR3_VL | QQYYSYPWT | 5 | |
| #43 | CDR1_VH | GFNIKDTY | 6 |
| CDR2_VH | IDPANGNT | 7 | |
| CDR3_VH | ARGDANYGAY | 8 | |
| CDR1_VL | ESVDNYGISF | 9 | |
| CDR2_VL | AAS | - | |
| CDR3_VL | QQSKEVPLT | 10 | |
| #50 | CDR1_VH | GFDFSRYW | 11 |
| CDR2_VH | INPDSSTI | 12 | |
| CDR3_VH | ARMELLWYFDV | 13 | |
| CDR1_VL | QSLLYSSNQKNY | 14 | |
| CDR2_VL | WAS | - | |
| CDR3_VL | QQYYSYPWT | 15 | |
| #52 | CDR1_VH | GFNIEDTY | 16 |
| CDR2_VH | IDPANGND | 17 | |
| CDR3_VH | ARGDANYGSY | 18 | |
| CDR1_VL | ESVDHFGVSF | 19 | |
| CDR2_VL | AAS | - | |
| CDR3_VL | QQSKEVPLT | 20 |
(3) HUVEC에서 혈관신생 표현형에 대한 항-PTK7 mAb의 효과
HUVEC에서 혈관신생 표현형 [부착(adhesion), 상처 치유(wound healing), 주화성 이동(chemotactic migration) 및 침윤(invasion)]에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 분석하였다. 고농도의 sPTK7가 혈관신생 표현형을 억제하기 때문에, sPTK7 (4 μg/mL)을 PTK7 기능을 억제하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. 그 결과, mAb-32, mAb-43, mAb-50, mAb-52 (각각 10 μg/mL) 및 sPTK7은 HUVEC의 VEGF-유도된 부착을 각각 78.2% ± 2.5%, 85.5% ± 3.1%, 83.2% ± 4.0%, 87.3% ± 5.5% 및 85.3 ± 5.0%로 감소시킴을 확인하였다(도 3). 또한, mAb-32, mAb-43, mAb-50, mAb-52 (각각 10 μg/mL) 및 sPTK7은 HUVEC 단일층에서 VEGF-유도된 상처 치유를 각각 62.1% ± 9.9%, 49.0% ± 8.8%, 62.2% ± 5.4%, 49,1% ± 3.8% 및 42.0% ± 3.0%까지 감소시킴을 확인하였다(도 4). 나아가, mAb-32, mAb-43 및 mAb-52는 HUVEC에서 VEGF-유도된 주화성 이동을 용량 의존적으로 억제하였고, 10 μg/mL의 농도에서 mAb-32, mAb-43, mAb-52 및 sPTK7은 HUVEC의 VEGF-유도된 주화성 이동을 각각 53.8% ± 10.1%, 55.1% ± 10.2%, 54.5% ± 11.9% 및 50.8% ± 12.4%로 감소시킴을 확인하였다(도 5). 또한, mAb-32, mAb-43 및 mAb-52는 HUVEC의 VEGF-유도된 침윤을 용량 의존적으로 억제하였고, 10 μg/mL의 농도에서 mAb-32, mAb-43, mAb-52 및 sPTK7은 HUVEC의 VEGF-유도된 침윤을 각각 58.6% ± 6.2%, 59.7% ± 3.5%, 65.2% ± 7.2% 및 57.8% ± 5.9%로 감소시킴을 확인하였다(도 6). 상처 치유, 주화성 이동 및 침윤을 억제하는 다양한 항-PTK7 mAb의 능력은 크게 상이하지 않았으나, mAb-32-처리군의 부착은 mAb-43-처리군 및 mAb-52-처리군보다 유의하게 낮음을 확인하였다(도 3). 또한 mAb-32, mAb-43, mAb-50, mAb-52(10 μg/mL) 및 sPTK7(4 μg/ml)은 HUVEC에 대한 세포독성 효과를 나타내지 않음을 확인하였다(도 7). 따라서, 본 발명자들이 시험한 항-PTK7 mAb는 HUVEC에서 VEGF-유도된 혈관신생 표현형을 유의하게 억제하였다.
(4) 시험관내(in vitro) 및 생체외(ex vivo)의 혈관신생(angiogenesis)에 대한 항-PTK7 mAb의 효과
시험관내(in vitro) 혈관신생(angiogenesis)에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 모세관-유사 관 형성(capillary-like tube formation) 검정을 사용하여 분석하였다. VEGF (20 ng/mL)는 매트리겔 상에서 배양된 HUVEC에서 모세관-유사 관 형성을 유도하였다. 그러나, mAb-32, mAb-43, mAb-52 (10 μg/mL) 및 sPTK7 (4 μg/mL)은 VEGF-유도된 모세관-유사 관 형성을 각각 55.2% ± 9.3%, 49.4% ± 3.8%, 49.4% ± 1.3% 및 45.2 % ± 5.0%로 감소시킴을 확인하였다(도 8).
또한, 생체외(ex vivo) 혈관신생에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 마우스 대동맥 고리 검정을 사용하여 평가하였다. 20 ng/mL VEGF의 처리는 대동맥으로부터 내피 세포(endothelial cell)의 발아(sprouting) 및 성장을 유도하였다. 그러나, mAb-32 (10 μg/mL)-처리군, mAb-43 (10 μg/ml)-처리군의 내피 세포 증식의 억제는 sPTK7 (4 μg/mL)-치료군과 유사하였고, mAb-52 (10 μg/mL)-처리군의 내피 세포 증식의 억제도 mAb-32 및 mAb-43-처리군과 유사함을 확인하였다(도 9).
(5) 생체내(in vivo) 혈관신생(angiogenesis)에 대한 항-PTK7 mAb의 효과
생체내(in vivo) 혈관신생에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하기 위해 매트리겔 플러그 분석을 수행하였다. 그 결과, 마우스 VEGF의 처리는 진한 적색을 갖는 플러그를 나타냈으며, 이는 혈관신생을 유도함을 나타낸다. 3 μg/mL의 mAb-32, mAb-43 또는 mAb-52와 VEGF를 함께 처리한 결과, 주황색 또는 담적색을 갖는 플러그를 생성함을 확인하였고, 10 μg/mL의 mAb-32, mAb-43 또는 mAb-52와 VEGF를 함께 처리한 결과, 흰색 또는 노란색을 갖는 플러그를 생성함을 확인하였다(도 10). 또한, 플러그 내의 헤모글로빈(Hb) 함량을 측정함으로써 생체내 혈관신생의 정도를 정량화하였다. 그 결과, VEGF로 처리된 마우스로부터 회수된 플러그 내의 헤모글로빈 함량은 7.48 ± 1.33 g/dL였으나, 3 또는 10 μg/mL mAb-32 및 VEGF로 공동-처리 시에는 헤모글로빈 수준을 각각 1.73 ± 0.36 또는 1.15 ± 0.49 g/dL로 감소시켰고, 3 또는 10 μg/mL mAb-43 및 VEGF로 공동-처리 시에는 헤모글로빈 수준을 각각 1.44 ± 0.19 또는 1.13 ± 0.06 g/dL로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 독립적으로 수행한 분석에서, VEGF로 처리된 마우스로부터 회수된 플러그 내의 헤모글로빈 함량은 13.34 ± 2.46 g/dL였으나, 3 또는 10 μg/mL mAb-52 및 VEGF로 공동-처리 시에는 헤모글로빈 수준을 각각 6.08 ± 2.43 또는 1.22 ± 0.32 g/dL로 감소시킴을 확인하였다(도 10). 따라서, mAb-32, mAb-43 및 mAb-52는 생체내에서 VEGF-유도된 혈관신생을 농도-의존적으로 억제함을 확인하였다.
(6) HUVEC에서 VEGF-유도된 KDR 신호전달에 대한 항-PTK7 mAb의 효과
혈관신생은 세포 증식 및 분화에 관여하는 ERK 및 JNK 신호전달 경로 및 세포 부착 및 이동에 관여하는 FAK 및 Src 신호전달 경로를 비롯한 다양한 신호전달 경로에 의해 매개된다. 따라서, HUVEC에서 신호전달 단백질의 VEGF-유도된 활성화에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하였다. 그 결과, mAb-32 및 mAb-43 (각각 10 μg/mL)은 KDR, ERK, JNK, FAK 및 Src의 인산화를 하향 조절함을 확인하였다(도 11). 상기 결과는 항-PTK7 mAb가 VEGF-유도된 KDR의 활성화 및 혈관신생에 관여하는 하류 신호전달 경로를 하향 조절한다는 것을 나타낸다.
(7) PTK7-KDR 상호작용에 대한 항-PTK7 mAb의 효과
PTK7-KDR 상호작용에 대한 항-PTK7 mAb의 효과를 조사하였다. PTK7 및 KDR을 발현하는 HEK293 세포에서 PTK7-KDR 상호작용은 mAb-32 또는 mAb-43으로 처리한 후에 PTK7-His를 Ni2+-NTA 수지로 침전시켜 KDR의 결합 여부를 분석하였다. 그 결과, bovine IgG (10 μg/mL)와 비교하여, sPTK7은 KDR에 대한 PTK7의 결합을 억제하였다. 따라서, sPTK7 (4 μg/mL)은 PTK7과 경쟁함으로써 PTK7-KDR 상호작용을 감소시켰음을 확인하였다. 상기 조건 하에, mAb-32 및 mAb-43 (10 μg/mL)은 PTK7의 KDR에 대한 결합을 감소시킴을 확인하였다(도 12). 상기 결과는 항-PTK7 mAb가 PTK7-KDR 상호작용을 억제함으로써, VEGF-유도된 KDR 활성화 및 그의 하류 신호전달 경로를 하향 조절한다는 것을 나타낸다.
(8) 삼중음성유방암 및 식도편평세포암 세포를 이종이식한 마우스 모델에서 항-PTK7 mAb의 효과
항-PTK7 mAb의 생체 내 항암 효과를 분석하기 위하여, 항-PTK7 mAb-52를 대상으로 삼중음성유방암 MDA-MB-231 세포 및 식도편평세포암 KYSE-30 세포를 이종이식한 마우스에서 항암 효능을 분석하였다. 삼중음성유방암 MDA-MB-231 세포의 이종이식 모델에서는 mAb-52를 10 mg/kg로 3주간 6회 복강 내 주사하고 2주일 경과한 후 종양의 크기를 비교하였을 때, 대조군 대비 60.1%로, 식도편평세포암 KYSE-30 세포의 이종이식 모델에서는 복강 내 주사하고 1주일 경과 후 종양의 크기를 비교하였을 때, 대조군 대비 50.6%로 종양 성장을 억제함을 관찰하였다. 삼중음성유방암 MDA-MB-231 세포의 이종이식 모델에서, 적출된 종양의 무게는 0.54 ± 0.26 g, 크기는 0.97 ± 0.58 cm3 이였으나, mAb-52를 투여한 종양의 무게는 0.20 ± 0.08 g, 크기는 0.34 ± 0.19 cm3로 감소하였다. 또한, 식도편평세포암 KYSE-30 세포의 이종이식 모델에서 적출된 종양의 무게는 1.33 ± 0.15 g, 크기는 1.72 ± 0.12 cm3 이였으나, mAb-52를 투여한 종양의 무게는 0.50 ± 0.098 g, 크기는 0.80 ± 0.21 cm3로 감소하였다. 상기 결과는 항-PTK7 mAb-52가 생체내 종양의 성장을 억제함을 나타낸다.
[서열목록 프리텍스트]
서열번호 1: #32_CDR1_VH
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
서열번호 2: #32_CDR2_VH
Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
서열번호 3: #32_CDR3_VH
Ala Arg Ala Tyr Tyr Ile Tyr Tyr Phe Asp Tyr
서열번호 4: #32_CDR1_VL
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
서열번호 5: #32_CDR3_VL
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
서열번호 6: #43_CDR1_VH
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
서열번호 7: #43_CDR2_VH
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
서열번호 8: #43_CDR3_VH
Ala Arg Gly Asp Ala Asn Tyr Gly Ala Tyr
서열번호 9: #43_CDR1_VL
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
서열번호 10: #43_CDR3_VL
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Leu Thr
서열번호 11: #50_CDR1_VH
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
서열번호 12: #50_CDR2_VH
Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
서열번호 13: #50_CDR3_VH
Ala Arg Met Glu Leu Leu Trp Tyr Phe Asp Val
서열번호 14: #50_CDR1_VL
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
서열번호 15: #50_CDR3_VL
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
서열번호 16: #52_CDR1_VH
Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr Tyr
서열번호 17: #52_CDR2_VH
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Asp
서열번호 18: #52_CDR3_VH
Ala Arg Gly Asp Ala Asn Tyr Gly Ser Tyr
서열번호 19: #52_CDR1_VL
Glu Ser Val Asp His Phe Gly Val Ser Phe
서열번호 20: #52_CDR3_VL
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Leu Thr
서열번호 21: #52-VH의 아미노산
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIEDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNDKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGDANYGSYWGQGTLVTVSA
서열번호 22: #52-VK의 아미노산
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDHFGVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQRSGVPARFSGSG SGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPLTFGAGTKLELK
서열번호 23: #52-VH의 DNA
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTGAAGACACCTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATGATAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACTTCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGGGATGCTAACTACGGTTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG
서열번호 24: #52-VK의 DNA
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATCATTTTGGCGTTAGTTTTATGAACTGGTTCCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAAAGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
Claims (20)
- PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편으로서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 6, 11 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VH, 서열번호 2, 7, 12 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2-VH, 서열번호 3, 8, 13 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VH를 포함하며,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 4, 9, 14 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1-VL, WAS(Trp-Ala-Ser) 또는 AAS(Ala-Ala-Ser)을 포함하는 CDR2-VL, 서열번호 5, 10, 15 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3-VL을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 PTK7 단백질의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며, 상기 기능적 단편은 디아바디, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dsFv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 부착(adhesion), 상처 치유(wound healing), 주화성 이동(chemotactic migration) 및 침윤(invasion)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 조직 내 헤모글로빈(Hb: hemoglobin) 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 KDR(Kinase Insert Domain Receptor), ERK(extracellular-signal-regulated kinase), JNK(c-Jun N-terminal kinase), FAK(Focal adhesion kinase) 및 Src(tyrosine kinase Src)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신호전달 분자의 인산화(phosphorylation)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 단백질 티로신 키나아제 7 (PTK7: Protein Tyrosine Kinase 7) 및 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR: Kinase Insert Domain Receptor)의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 암 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편.
- 청구항 1의 항체 또는 그 기능적 단편을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 10의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
- 청구항 11의 벡터로 형질전환된, 세포.
- 청구항 12의 세포를 배양하여 경쇄 및 중쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및
상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, PTK7(protein tyrosine kinase 7)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편의 생산방법.
- 청구항 1의 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 혈관신생 억제제.
- 청구항 14의 혈관신생 억제제를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 자궁내막증, 비만, 관절염, 동맥경화증, 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 혈관유착, 부종성 경화증, 당뇨병성 망막증, 황반변성, 혈관신생성 녹내장, 혈관신생에 의한 각막 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 및 알츠하이머병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 청구항 1의 항-PTK7 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제.
- 청구항 17의 종양세포의 성장, 이동 또는 침윤 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 18에 있어서, 상기 암은 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문암, 신암, 수뇨관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소암, 자궁암, 난소암, 외음암, 질암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1의 항체 또는 그 기능적 단편; 및 약물;이 결합된, 항체-약물 접합체.
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| PCT/KR2023/013326 WO2024054030A1 (ko) | 2022-09-06 | 2023-09-06 | 항-ptk7 항체 및 이의 용도 |
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