KR20240034303A - 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 싸리나무 (Lespedeza bicolor) 뿌리 추출물로부터 분리된 신규한 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II)을 유효성분으로 포함하고, 상기 조성물이 간세포에서 AMPK 활성화 및 AKT 억제를 통해 올레산(oleic acid; OA) 유도 지질 축적 및 염증을 감소시키는 효과를 가짐을 확인함으로써 비알코올성 지방간 질환에 대한 다중 타깃 선도 화합물을 제공하고 비알코올성 지방간 질환의 새로운 치료 전략으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating non-alcoholic fatty liver disease}
본 발명은 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 간세포에서 AMPK 활성화 및 AKT 억제를 통해 올레산 (oleic acid; OA) 유도 지질 축적 및 염증을 감소시키는 조성물에 관한 것이다.
비알코올성 지방간 질환 (nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 알코올 섭취와 관련없이 간세포에 지방의 과도한 축적만 있는 단순 지방증 (simple steatosis), 간세포 손상과 염증 및 섬유화를 동반하는 비알코올성 지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis; NASH) 및 더 진행된 형태인 간경변증 (cirrhosis)을 포함하는 일련의 질환군을 의미한다.
비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)은 비만 유병률의 증가와 함께 전세계적으로 유병률이 증가하고 있다. 우리나라를 포함하는 아시아에서 비알코올성 지방간 질환의 유병률은 2000년 초 25%에서 최근 34%로 증가하여, 유럽 및 북미 등 서구와 같은 수준이다.
비알코올성 지방간염 (NASH)은 NAFLD에서 보다 진행된 염증 단계로서 비만 (obesity), 당뇨병 (diabetes mellitus), 이상지질혈증 (dyslipidemia) 및 기타 대사성 동반질환 (metabolic comorbidity)을 포함한 여러 대사성 질환과 밀접한 관련이 있다. 더 심각하게는, NASH는 궁극적으로 간경변 및 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma; HCC)으로 진행될 수 있으며, 이는 전세계적으로 3번째로 높은 암관련 사망을 초래한다.
NASH 치료법으로는, 식이요법 및 신체운동의 생활방식 수정을 통한 체중감량 외 다른 치료법은 간이식이지만, 적절한 기증자의 부족으로 인해 NASH 치료를 위한 새로운 방법으로서 약물요법에 대하여 관심이 높아지고 있다.
NASH 치료의 잠재적 타깃 (target)으로 여겨지는 AMP-활성 키나아제 (AMP-activated kinase; AMPK)는 지질 대사와 염증을 조절하는 중심 조절자이다. 활성화된 AMPK는 스테롤 조절인자-결합 단백질-1c (sterol regulatory element-binding proteins-1c; SREBP1c) 및 과산화소체 증식제-활성화 수용체-α (peroxisome proliferator activated receptor alpha; PPARα)와 같은 지질 대사에 관여하는 여러 타깃 단백질을 추가로 조절하는 라파마이신의 포유류 타깃 (mammalian target of rapamycin; mTOR)을 하향 조절한다.
한편, AMPK는 아세틸-CoA 카복실레이스 (acetyl-CoA carboxylase; ACC)의 조절을 통해 지방 생성을 매개하기도 한다. 반면, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor; TNF) 및 인터류킨 (interleukin; IL)과 같은 염증성 사이토카인은 주로 NF-κB 경로의 활성화를 통해 유전자들의 신속한 전사를 자극한다. 그리고, 활성화된 AMPK는 NF-κB의 억제를 통해 염증 반응을 완화시킨다.
반대로, 지질 대사 과정에서 활성화된 단백질 키나아제 B (activated protein kinase B; AKT)는 후속적으로 mTOR의 활성화를 유도하고, 이는 SREBP1 및 ACC와 같은 여러 단백질을 활성화하여 지질 축적을 유도한다.
염증 과정의 진행에서, 이전 연구에서는 PPI3K/Akt 신호전달 경로가 IκB-kinase (IKK)/NF-κB 경로를 활성화하는 염증 유발 유전자 발현에 중요한 역할을 한다고 하였다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 치료를 위한 생리활성 천연물을 발견하고자 예의 연구한 결과, 싸리나무 (Lespedeza bicolor) 추출물이 올레산 (OA)에 의해 유도된 1차 간세포에 현저한 간보호 효과를 나타냄을 확인하고, 싸리나무 뿌리의 분획 및 화학적으로 분리한 신규한 화합물인 프테로카르판, 2-게라닐-1-메톡시에리트라비신 II (pterocarpan, 2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II; GMET)의 간보호 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 사료학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 제한되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다 (comprises)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 구성요소들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 비록 "제1", "제2" 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 1]
.
본 발명의 신규한 화합물 GMET은 싸리나무 (Lespedeza bicolor)의 주요 성분 중 하나로서, 싸리나무 뿌리 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 화합물 GMET은 바이오분석 유도 분획 (bioassay-guided fractionation)을 통해 분리할 수 있고, 상기 화합물 GMET을 분리하기 위해 싸리나무 뿌리의 에틸 아세테이트 분획을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 적용하고, CH2Cl2-MeOH 용매 혼합물 (100:1 내지 1:100; v/v)로 용출하여 5개의 분획 (E1 내지 E5)을 산출할 수 있으며, 5개의 하위 분획 (E1-1 내지 E1-5)은 H2O에 75% CH3CN이 포함된 반분취 고성능 액체 크로마토그래피 (semipreparative high-performance liquid chromatography; HPLC)를 사용하여 하위 분획 E1을 분리한 후 수득하고, 하위 분획 E1-5 (1.5 g)의 분리는 H2O 중 85% CH3CN을 사용하는 HPLC에 의한 GMET (순도>98%, HPLC 분석)을 산출할 수 있다.
본 발명의 싸리나무 (Lespedeza bicolor)는 콩과에 속하는 다년생 낙엽관목으로 잔가지는 능선이 있고 짙은 갈색이며, 목재는 연한 녹색을 띠고 골속은 흰 것이 특징이다. 높이는 1 내지 1.5 m이고, 가지를 많이 친다. 동아시아에 주로 분포하며, 기원적 형태학적 특성으로 19개의 표현형으로 분류된다. 싸리나무는 줄기 또는 잎을 약용으로 사용하는데 생약명을 호지자라고 하며, 맛은 달고 약성은 평범하며 백일해, 해수, 비출혈, 임병을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 GMET은 비알코올성 지방간 질환을 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 비알코올성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 과도한 알코올 섭취 이외의 다른 간 손상의 분명한 병인에 의해 유발된 간 실질 세포 손상 및 지방 축적을 특징으로 하는 일군의 임상 병리학적 증후군을 의미한다. 이는 인슐린 저항성 (IR) 및 유전적 감수성과 밀접하게 관련된 대사적으로 스트레스를 받는 간 손상이며, 그 병리학적 변화는 알코올성 간질환과 유사하지만, 환자는 과도한 음주력은 없는 것이 특징이다. 그 구성요소는 비알코올성 단순 지방간 (NAFL), 비알코올성 지방간염 (NASH), 비알코올성 지방간 섬유증, 비알코올성 지방간 간경변 및 관련된 간암을 포함할 수 있다.
본 발명의 예방은 비알코올성 지방간 질환을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 치료는 질환의 발생 또는 재발의 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다.
또한, 본 발명은 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II), 비알코올성 지방간 질환, 예방 및 치료는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 조성물은 싸리나무 뿌리의 분획으로부터 분리된 것일 수 있으며, 상기 분획은 에틸 아세테이트 분획일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 간세포 내 지질을 감소시킬 수 있으며, 상기 지질은 올레산 (OA) 유도된 지질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 간세포의 염증을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 AMPK 신호전달 경로의 활성화를 촉진하고, AKT 신호전달 경로를 억제할 수 있다. 또한, mTOR 및 그의 다운스트림 타깃 유전자를 억제할 수 있으며, 상기 다운스트림 타깃 유전자는 SREBP1, FASN 및 SCD1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 PPARα (peroxisome proliferator activated receptor alpha)의 발현을 증가시킬 수 있고, TNFα (tumor necrosis factor alpha), IL-1β (interleukin 1 beta), IL-6 (interleukin 6) 또는 iNOS의 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 조성물은 사용목적 내지 양상에 따라 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들면 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입 방식 등에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효하나 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어, 비알코올성 지방간 질환, 예방, 치료 및 약학 조성물은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 대상체는 질병의 치료를 필요로 하여 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유동물을 의미하며, 인간을 제외한 포유동물일 수 있다.
또한, 본 발명은 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II), 비알코올성 지방간 질환 및 예방은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 개선은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능성 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
또한, 본 발명은 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 사료학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II), 비알코올성 지방간 질환, 예방 및 개선은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 사료 조성물은 사료 첨가제 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 영양소 보충 및 체중 감소 예방, 사료내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식 장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다.
본 발명의 사료 첨가제는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선 효능을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 비알코올성 지방간 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 질환을 개선시킬 수 있다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다. 또한, 본 발명의 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II)을 첨가하여 제조 가능하다.
상기 첨가제는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체이면, 특별히 제한되지 않고 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물이나 조류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.
본 발명은 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 싸리나무 (Lespedeza bicolor) 뿌리 추출물로부터 분리된 신규한 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II)을 유효성분으로 포함하고, 상기 조성물이 간세포에서 AMPK 활성화 및 AKT 억제를 통해 올레산 (oleic acid; OA) 유도 지질 축적 및 염증을 감소시키는 효과를 가짐을 확인함으로써 비알코올성 지방간 질환에 대한 다중 타깃 선도 화합물을 제공하고 새로운 치료 전략으로서 유용하게 사용될 것이다.
도 1은 GMET의 화학 구조 및 세포 독성과 영향 분석을 나타낸 도이고, 도 1a는 싸리나무 (Lespedeza bicolor Turc) 뿌리 부분의 methylene dichloride (CH2Cl2) 분획에서 분리된 GMET의 화학 구조를 나타낸 도이고, 도 1b는 다양한 농도의 GMET으로 처리한 1차 간세포의 생존력 변화를 나타낸 도이고, 도 1c는 TG 함량을 TG 검출 분석을 사용하여 분석한 도이고, 도 1d 및 도 1e는 오일 레드 O 염색 이미지 (100x) 및 지질 방울을 포함하는 1차 간세포의 백분율을 나타내는 도이다.
도 2a는 GMET의 타깃과 NAFLD 타깃의 벤다이어그램을 나타내는 도이고, 도 2b는 GMET의 MCODE 타깃의 CytoHubba 타깃 및 PPI 네트워크를 나타내는 도이고, 도 2c는 GO 농축 분석을 나타내는 도이고, 도 2d는 NAFLD에서 GMET 잠재적 타깃 및 메커니즘의 KEGG 경로 농축 분석을 나타내는 도이다.
도 3은 GMET이 간세포에서 지질 대사 유전자와 단백질을 조절하는 것을 나타내는 도이고, 도 3a 내지 도 3h는 간세포에서 관련 단백질 수준의 웨스턴 블롯팅 분석 및 밀도계 스캐닝에 의한 정량화를 나타내는 도이고, 도 3i 내지 도 3j는 RT-qPCR을 이용하여 지질 대사와 관련된 유전자의 mRNA 수준을 검출한 것을 나타내는 도이다.
도 4는 GMET이 간세포에서 NF-κB 신호 경로를 통해 염증 유전자와 단백질을 조절하는 것을 나타내는 도이고, 도 4a는 간세포에서 TNFα 및 IL-6 단백질 수준의 웨스턴 블롯팅 분석 및 밀도계 스캐닝에 의한 정량화를 나타내는 도이고, 도 4b는 RT-qPCR을 이용하여 염증과 관련된 유전자의 mRNA 수준을 검출한 것을 나타내는 도이고, 도 4c 및 도 4d는 간세포의 관련 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 및 밀도계 스캐닝에 의한 정량화를 나타낸 도이고, 도 4e 및 도 4f는 세포질 및 핵에서 p65의 위치는 웨스턴 블롯팅 및 면역형광 염색으로 측정한 것으로, 청색 형광은 핵을 나타내고 녹색 형광은 p65를 나타내는 도이다.
도 5는 도르소모르핀 (dorsomorphin)이 1차 간세포에서 OA-유도 지질 축적 및 염증 반응에 대한 GMET의 효과를 약화시키는 것을 나타낸 도이고, 도 5a는 트리글리세리드 (triglyceride; TG) 수준은 TG 검출 분석을 사용하여 분석한 도이고, 도 5b는 TNFα 수준의 상청액은 TNFα ELISA 키트를 사용하여 분석한 도이고, 도 5c 및 도 5d는 오일 레드 O 염색 이미지 (200x) 및 지질 방울을 포함하는 간세포의 백분율을 나타내는 도이고, 도 5e 내지 도 5h는 간세포의 관련 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 및 밀도계 스캐닝에 의한 정량화를 나타내는 도이다.
도 6은 AMPK에 결합하는 GMET의 분자 도킹 모델을 나타내는 도이고, 도 6a는 결합 모드의 전체 및 로컬 구조를 나타내는 도이고, 도 6b는 아미노산 잔기와 GMET 사이의 소수성 상호작용의 2D 표현을 나타낸 도이다.
도 7은 GMET이 AMPK를 활성화하고, AKT 경로를 억제하여 지질 축적과 염증을 완화시키는 것을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기의 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1. 실험 재료 및 방법
1-1. 신규한 프테로카르판, 2-게라닐-1-메톡시에리트라비신 II (pterocarpan, 2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II; GMET)의 분리 및 동정
바이오분석 유도 분획 (bioassay-guided fractionation)을 통해 싸리나무 (Lespedeza bicolor)의 주요성분 중 하나인 GMET을 분리하였다. GMET을 분리하기 위해 싸리나무 (Lespedeza bicolor) 뿌리의 에틸 아세테이트 분획을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 적용하고, CH2Cl2-MeOH 용매 혼합물 (100:1 내지 1:100; v/v)로 용출하여 5개의 분획 (E1 내지 E5)을 산출하였다.
5개의 하위 분획 (E1-1 내지 E1-5)은 H2O에 75% CH3CN이 포함된 반분취 고성능 액체 크로마토그래피 (semipreparative high-performance liquid chromatography; HPLC)를 사용하여 하위 분획 E1을 분리한 후 수득하였다. 하위 분획 E1-5 (1.5 g)의 분리는 H2O 중 85% CH3CN을 사용하는 HPLC에 의한 하기 화학식 1의 GMET (순도>98%, HPLC 분석)을 산출하였다.
[화학식 1]
1-2. 1차 간세포의 분리 및 배양
생후 6 내지 8주 (week-old)된 C57BL/6J 수컷 마우스의 간에서 마우스 1차 간세포 (primary hepatocytes)를 분리하여 배양하였다. 이후, 세포 농도 및 생존력을 측정한 후, 수득한 간세포를 콜라겐 코팅 디쉬 (collagen-coated dish)에 시딩 (seeding)하고, 37℃의 5% CO2에서 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum (ThermoFisher)) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin (Solarbio, Beijing, China))이 보충된 DMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 성장시켰다.
1-3. 세포 생존율, TG 및 TNFα 분석
독성 스크리닝을 위해 간세포를 96웰 플레이트에 1×104 cells/well의 밀도로 시딩하였다. WST-8 시약 (10 μL; Beyotime, Shanghai, China)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 마지막으로, 마이크로플레이트 판독기 (microplate reader)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 간세포의 세포 내 TG 함량을 측정하기 위해 0.1% Triton X-100 (Solarbio)으로 세포를 용해시켰다.
생성된 세포 용해물은 제조사의 지침에 따라 키트 (Jiancheng, Nanjing, China)를 사용하여 TG 함량을 평가하는데 사용되었다. 배양 상청액의 TNFα 수준은 제조사의 지침에 따라 Novus (USA)에서 입수한 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트를 사용하여 결정하였다.
1-4. 오일 레드 O (oil red O) 염색 및 면역형광 분석
간세포를 6-웰 플레이트 (3× 105 cell/well )에 24시간 동안 시딩하였다. 이후, 각각 올레산으로 처리하기 전에 GMET 및 도르소모르핀 (dorsomorphin)과 함께 또는 없이 인큐베이션 하였다. 오일 레드 O (ORO) 염색 키트 (Solarbio)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 지질 방울을 시각화하였다.
간세포는 ORO 염색에 설명된 대로 처리하였다. 이후, 세포 투과성을 위해 0.1 % triton-X 100을 첨가하였다. 이어서, 염소 혈청 (goat serum)을 첨가하여 세포를 차단하고, 토끼 항-마우스 NF-κB p65 항체 (rabbit anti-mouse NF-κB p65 antibody (1:350))와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다.
이후, 세포를 FITC (fluorescein isothiocyanate)로 표지된 형광 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 마지막으로, DAPI가 포함된 마운팅 미디엄 (mounting medium) 1-2 방울을 추가하였다. 이미지는 Nikon 현미경으로 획득하였다.
1-5. NAFLD에 대한 GMET의 타깃 (target) 예측
약물특이분자단 (pharmacophore) 타깃은 Pharm Mapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)에 의해 예측되었다. GMET의 3D SDF 형식 파일이 Pharm Mapper 서버에 업로드 되었으며 매개변수는 문헌에 따라 설정되었다: 준수자 생성: 예; 최대 생성 형태: 300; 타깃 세트 선택: 인간 단백질 타깃 전용 (v2010, 2241); 예약된 일치 타깃 수: 500. 다음으로, “역 약물특이분자단 매칭법 (reverse pharmacophore matching method)”에 의해 처음 500개의 타깃 단백질을 수득하였다.
NAFLD와 관련된 유전자 및 단백질 타깃은 DisGeNET 데이터베이스 (http://www.disgenet.org/)에서 수집되었다. NAFLD의 971개의 병리학적 표적을 수득하였다. 이후, Draw Venn Diagram online (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)을 사용하여 GMET 타깃과 NAFLD 타깃의 교차점을 찾았으며, 이는 NAFLD에 대한 GMET의 추정 타깃으로 간주되어 후속 데이터 분석을 위해 사용되었다.
1-6. 단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction; PPI) 네트워크, 유전자 존재론 (gene ontology; GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)
GMET의 추정 타깃의 PPI 데이터 (신뢰점수 > 0.4)는 STRING 데이터베이스 (https://string-db.org/)에서 수득하였다. PPI 네트워크는 Cytoscape 3.7.2 소프트웨어를 사용하여 구성되었다. 또한, Cytoscape 플러그인 MCODE (Molecular Complex Detection) 및 CytoHubba를 적용하여 PPI 네트워크의 모든 노드의 허브 타깃을 분석하였다.
GMET 추정 타깃의 GO 및 KEGG 경로 분석은 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/, 2021 Update) 데이터베이스를 사용하여 수행되었다. 경로 및 네트워크는 상당히 풍부한 경로/네트워크에 대한 컷오프 값 (p < 0.05)으로 경로 및 네트워크의 분자 수에 따라 순위가 매겨졌다.
1-7. RT-qPCR 분석
총 RNA는 제조사의 지침에 따라 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 다른 처리로 간세포에서 분리되었다. 이후, RT 시약 키트 (Takara, Tokyo, Japan)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 각 샘플의 총 RNA의 역전사 산물을 준비하였다. 생성된 cDNA는 제조업체의 지침에 따라 특정 프라이머 (표 2) 및 iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)를 사용한 실시간 qPCR 증폭에 사용되었다.
증폭 반응은 LightCycler®480 기기 (Roche, Basel, Switzerland)에서 실행되었으며, 결과 값은 하우스키핑 유전자 (β-actin 또는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase [GAPDH])의 값으로 정규화되었다.
1-8. 웨스턴 블롯팅 분석
세포를 25 cm2 플라스크에 1 × 105 cell/mL의 밀도로 시딩하고 올레산 (OA)으로 24시간 유도하기 전에 간세포를 2시간 동안 5 μM 도르소모르핀 (MCE, Shanghai, China)을 포함하거나 포함하지 않고 전처리하고, 30분 동안 다른 농도의 GMET로 전처리하였다. 이후, 세포를 수득하고, 1x 프로테아제 억제제 (protease inhibitor) 및 포스파타아제 억제제 칵테일 (phosphatase inhibitor cocktail) (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland)을 함유하는 RIPA 용해 완충액 (RIPA lysis buffer) (Thermo Fisher Scientific)으로 용해시켰다.
세포 용해물의 단백질 농도는 BCA (bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트 (Beyotime, Haimen, China)로 측정하였고, 동량의 단백질은 sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE (10-12%; Beyotime)로 분리하였다. 이후, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride; PVDF) 막 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 옮기고, 부드럽게 흔들면서 4℃에서 밤새 특정 1차 항체 (표 3)로 면역 블롯팅 하였다.
Immobilon Western Chemiluminescent kit (Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. ImageQuant LAS 4000 mini (Fujifilm, Tokyo, Japan)로 이미지를 촬영하였다.
1-9. 통계 분석
GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 표시된 값은 평균 ± SEM (표준오차) 이다. 데이터는 one-way Student's t-test를 이용하여 분석하였으며, P값이 0.05 미만 (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 and **** P < 0.0001)을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 1. OA-유도 1차 간세포에서 세포 생존율 및 지질 축적에 대한 GMET의 효과
먼저, GMET이 24시간 동안 다른 농도로 배양된 마우스 1차 간세포에서 세포 독성인지 여부를 분석하였다. 세포 생존율은 CCK-8 분석으로 측정하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 40 μM 미만 용량의 GMET은 간세포에서 세포독성이 아니었다.
다음으로, OA-유도 간세포에서 지질 축적을 평가하였다. 세포 내 지질 함량은 세포 지질 방울을 오일 레드 O 염색 및 TG 함량으로 측정하였다. 도 1c 내지 도 1e에 나타낸 바와 같이, 10 μM의 용량이 가장 효과적인 농도로 간주되어 후속 실험을 위해 선택되었다.
실험예 2. 약물특이분자단 (pharmacophore)-기반 예측을 사용한 NAFLD에 대한 GMET의 추정 타깃
도 2a와 같이, NAFLD 치료에서 GMET의 메커니즘을 추가로 설명하기 위해 총 971개의 NAFLD 관련 유전자가 DisGeNET 데이터베이스에서 수집되었다. 이후, PharmMapper에서 GMET의 310개의 인간 단백질 타깃을 예측하였다. GMET의 타깃을 NAFLD 치료에 대한 GMET의 추정 치료 타깃으로 간주되는 NAFLD의 병리학적 유전자에 매핑하여 91개의 중복 유전자를 발견하였다.
이후, 이러한 추정 타깃의 PPI 데이터를 STRING 데이터베이스에서 얻은 다음 cytoscape에 도입하여 기능 관련 단백질 상호작용 네트워크를 구축하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 이 PPI 네트워크는 MCODE 및 CytoHubba로 분석되어 PPI 네트워크의 모든 노드 (예: ALB, CASP3, AKT1, MAPK8 등)의 허브 타깃을 찾는다 (도 2b).
실험예 3. GMET 추정 타깃의 GO 농축 분석 및 KEGG 경로 농축 분석
GMET의 추정 타깃의 기능을 이해하기 위해 DAVID 데이터베이스를 사용하여 생물학적 과정 (BP), 세포 성분 (CC) 및 분자 기능 (MF)을 예측하였다. 도 2c의 GO 농축 분석 결과에 따르면, 이러한 표적 단백질은 BP에서 유기물질에 대한 반응, 화학적 자극에 대한 세포 반응 및 대사과정의 상향 조절을 포함하여 NAFLD에서 다양한 효과를 나타냈다.
또한, 유기 고리 화합물 결합, 헤테로 고리 화합물 결합 및 이온 결합이 이들 중 가장 공통된 MF이었다. DAVID 데이터베이스는 또한 NAFLD에서 GMET의 치료 메커니즘에 대하여 가능한 경로를 예측하는데 사용되었다. 도 2d에서 KEGG 경로 농축 분석은 이러한 타깃과 84개의 신호 경로 (p < 0.05) 사이에 상당한 기능적 연관성을 보여주었으며, PI3K-Akt 신호전달 경로, mTOR 신호전달 경로 및 TNF 신호전달 경로를 포함한 상위 35개 경로가 NAFLD의 주요 경로였다.
실험예 4. OA-유도 간세포에서 GMET이 처리되어 지질 축적 감소에 관여하는 AMPK 및 AKT
세포 에너지 상태의 주요 센서로서, AMPK는 ACC의 인산화 및 비활성화를 통해 지질 대사에 직접적인 영향을 미친다. AMPK 및 ACC의 인산화 수준은 시험관 내 (in vitro)에서 간 지방증 치료에서 GMET의 분자 메커니즘을 탐색하기 위해 검출되었다.
OA는 AMPK (Thr172)의 인산화 하향 조절을 유도하는 반면에, GMET 처리는 p-AMPK(Thr172)/AMPK 및 p-ACC(Ser79)/ACC의 비율을 현저하게 증가시켰다. 지질 대사의 주요 조절자인 mTOR는 AMPK의 직접적인 다운스트림 이펙터 분자이다. mTOR는 또한 SREBP1 및 PPARα의 업스트림 중재자이다.
mTOR의 인산화된 형태 (Ser2448)는 면역블롯으로부터 명백한 바와 같이 단백질 수준에서 낮아졌으며, 이는 GMET 처리된 지방증 간세포에서 AMPK 매개 지질 개선에 mTOR의 가능한 관여를 확립하였다 (도 3a 내지 도 3h). GMET이 새로운 지방 생성의 주요 유도제이기 때문에 AKT/mTOR 경로에 대한 GMET의 영향도 평가하였다. FFA 축적에 대한 반응으로, 완전히 활성화된 AKT는 mTOR 의존 경로를 통한 새로운 지방 생성 활성화를 포함한 여러 대사과정을 조절한다. 도 3a에서 확인할 수 있듯이, GMET은 Ser473에서 인산화된 AKT의 극적인 감소를 유도하여 지질 축적의 억제를 강화하였다.
지질 대사에서 GMET의 잠재적 기전을 추가로 확인하기 위해 간 지질 대사 관련 단백질 및 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, OA 처리는 지방산 β산화 및 지방 분해에 관여하는 PPARα 및 HSL의 mRNA 발현 수준을 감소시킨 반면, GMET 처리는 PPARα의 단백질 수준과 함께 이들 유전자의 발현을 증가시켰다 (도 3i). 대조적으로, OA 그룹은 타깃 유전자 ACC, FAS 및 SCD1과 함께 SREBP1 단백질 및 유전자의 발현 수준을 현저하게 상향 조절하였다. 그러나, GMET 처리는 SREBP1 단백질을 현저하게 하향 조절하여 타깃 유전자 수준을 감소시켰다 (도 3j).
실험예 5. 염증을 완화시키고 OA 유도 간세포에서 p65의 핵전위를 차단하는 GMET
NASH의 유발 및 진행의 조정에 중추적인 염증에 대한 GMET의 영향을 평가하였다. 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, GMET은 간세포에서 자극된 OA에 의해 유도되는 iNOS 및 IL-1β의 mRNA 수준과 함께 TNF-α 및 IL-6의 유전자 및 단백질 수준을 감소시켰다. NF-κB가 염증 과정을 자극하고, 염증을 일으키는데 핵심적인 요소 중 하나라는 것은 잘 알려져 있다.
NF-κB-p65는 NF-κB 계열의 전사 인자에 필수적인 역할을 하며, 세포질에서 IκBα 및 p65/p50과의 복합체에서 중요한 부분이다. 따라서, 본 발명자들은 NF-κB 활성화와 관련된 단백질의 OA 유도 발현에 대한 GMET의 예방 효과를 측정하였다. 결과는 GMET이 IKK, IκBα 및 p65의 OA 유도 인산화를 약화시켰음을 확인하였다 (도 4c 및 도 4d).
또한, p65 핵 전위의 변화를 결정하기 위해 핵 p65를 추출하였다. OA에 의해 유도된 p65의 핵 국소화가 GMET 처리에 의해 차단되었음을 확인하였다. 면역형광 실험은 상기 결과를 확인시켜 주었다 (도 4e 및 도 4f).
실험예 6. OA-유도 1차 간세포에서 GMET의 효과를 약화시키는 도르소모르핀 (dorsomorphin)
AMPK가 지질 대사와 염증을 매개하는 GMET에서 핵심적인 역할을 하는지 살펴보았다. 도르소모르핀 (AMPK 억제제)은 GMET으로 인한 세포 내 지질 함량 및 TG 함량 감소를 역전시켰다. 한편, 상층액에서 방출된 TNF-α는 도르소모르핀 처리에 의해 증가되었다 (도 5a 내지 도 5d).
도 5e 내지 도 5h에 나타낸 바와 같이, 도르소모르핀은 GMET에 의해 유도된 mTOR, ACC, SREBP1, PPARα 및 p65의 효과를 차단하였지만, AKT 및 IKK는 차단하지 않았다. 이러한 결과는 부분적으로 AMPK를 활성화하여 GMET에 의한 지질 축적 및 염증 완화 효과를 나타내는 것이다.
실험예 7. AMPK에 결합하는 GMET의 분자 도킹 모델
AMPK에 대한 GMET의 가능한 결합 모드의 기초를 위해 본 발명자들은 Protein Data Bank에서 주형으로 AMPK의 결정 구조 (6E4U)를 얻었고, Autodock4를 사용하여 GMET의 활성을 합리화하기 위한 도킹 연구를 수행하였다.
결합 포켓 추정을 위해 AMPK의 타깃 결합 소분자 범활성화제로 알려진 “알로스테릭 약물 및 대사물 (Allosteric Drug and Metabolite; ADaM)” 부위를 선택하였다. 도 6a는 GMET이 -8.30 kcal/mol의 낮은 결합 에너지로 ADaM 부위에서 결합을 유지함을 보여준다.
991의 구조-활성 관계에 기초하여, Lys29, Arg83, Asn48 및 Asn111을 포함한 여러 아미노산 잔기가 AMPK의 ADaM 부위의 주요 상호작용에 기여하는 것으로 여겨진다. 991과 비교하여, 카르복실레이트 부분이 없기 때문에 α-서브유닛의 Lys29와의 수소 상호작용이 GMET와 함께 손실된다는 것을 확인하였다.
대신에, 도 6a의 결합 모드의 3D 표현에 따르면, 이 손실을 부분적으로 보상할 수 있는 Ile46 잔기와 함께 키나아제 모듈의 Asn48 잔기와 C-3의 페놀성 수산기 사이에 강한 수소 결합이 형성되었다. 또한, 도 6b에 도시된 바와 같이, 옥타디엔일 (octadieneyl) 측쇄 및 그의 그룹(group)을 갖는 벤젠 고리가 ADaM 부위 내부에 깊숙이 완전히 하강하여 Arg83, Val113, Val81, Leu18, Val11, Lys31, Phe90, Asn48, Lys29 및 Asp88과 유리한 소수성 상호작용을 형성하였다. CEM의 Asn110 및 Asn111은 각각 C-9의 페놀성 수산기와 C11a에 인접한 산소 원자와의 수소 상호작용을 나타낸다. 이는, GMET에 의한 AMPK의 탈인산화에 대한 보호를 시사한다.
이상, 첨부된 도면을 참조로 하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 제한적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 1]
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 싸리나무 (Lespedeza bicolor) 뿌리 유래인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]

  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 싸리나무 (Lespedeza bicolor) 뿌리의 분획으로 분리된 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분획은 에틸 아세테이트 분획인 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 간세포 내 지질을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 간세포의 염증을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 AMPK 신호전달 경로의 활성화를 촉진하고, AKT 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 mTOR 및 그의 다운스트림 타깃 유전자를 억제하는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 다운스트림 타깃 유전자는 SREBP1, FASN 및 SCD1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 PPARα (peroxisome proliferator activated receptor alpha)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 TNFα (tumor necrosis factor alpha), IL-1β (interleukin 1 beta), IL-6 (interleukin 6) 또는 iNOS의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제4항에 있어서,
    상기 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료방법.
  16. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]

  17. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 GMET (2-geranyl-1-methoxyerythrabyssin II) 또는 이의 사료학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물.
    [화학식 1]
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