KR20240032213A - 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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hypercholesterolemia
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마진열
차민호
조원경
오유창
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한국 한의학 연구원
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Abstract

본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 세포 독성이 거의 없으며, 스타틴계 화합물(로바스타틴) 또는 과당에 의해 증가된 PCSK9의 발현을 억제할 뿐만 아니라, LDLR의 발현을 증가시키는 효과가 있으므로, 고콜레스테롤 혈증의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품, 의약품 또는 사료첨가제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating hypercholesterinemia comprising Acer palmatum Thunb leaf extract as effective component}
본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
콜레스테롤은 음식을 통해서도 흡수되지만 우리 몸에서 합성하기도 한다. 콜레스테롤은 간, 척수, 뇌와 같이 세포막이 많은 기관에서 높은 농도로 발견되며 혈전의 주요 구성 성분이기도 하다. 콜레스테롤은 많은 생리적, 생화학적 반응에 중요한 역할을 하며, 심혈관 질환에 밀접한 관련이 있다.
콜레스테롤은 주로 간에서 생성되며, 혈액 중에 존재하는 지질단백질(lipoprotein)이 콜레스테롤을 우리 몸의 곳곳으로 운반하는 역할을 한다. 상기 지질 단백질에는 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein, LDL)과 고밀도 지질단백질(고농도 density lipoprotein, HDL) 두 종류가 있으며, HDL은 다른 조직에서 간으로 콜레스테롤을 운반하기 때문에 HDL이 많으면, 혈관에서 콜레스테롤이 제거된다. LDL은 간에서 주로 생성되어 인체의 다른 조직으로 운반되므로 LDL이 많은 경우 혈관에 콜레스테롤이 많이 쌓이게 된다. 구체적으로, 상기 콜레스테롤은 인체의 기능을 정상적으로 유지시키는데 필수적인 구성성분이며, 생체막과 세포를 만드는데 꼭 필요한 영양소이고, 부신피질 호르몬이나 성호르몬 등 여러 가지 호르몬의 재료가 되는 성분이며, 담즙을 만드는 재료가 된다.
혈액 중의 콜레스테롤은 인종, 성별, 연령에 따라 다르다. 국내에서는 보통 혈액 1dL 당 콜레스테롤 240mg 미만일 때 정상으로 보고, 혈액 내에 콜레스테롤이 240mg/dL 이상이면 고콜레스테롤혈증이라고 부른다. 고콜레스테롤은 유전적 요인으로 생길 수 있으며, 육류 같은 식품을 통해 포화지방과 콜레스테롤을 섭취하는 경우에 발생한다. 체내에 콜레스테롤이 과도하게 축적되어 고콜레스테롤혈증 상태가 되면 심혈관계 질환뿐만 아니라 퇴행성 신경질환과 같은 치명적인 질병을 유발시킬 수 있다.
한편, 단풍나무(Acer palmatum Thunb.)는 낙엽 활목 교목으로, 높이는 10m에 달하고, 작은 가지는 털이 없으며 붉은빛을 띤 갈색이고, 잎은 마주나며 손바닥 모양으로 5∼7개로 깊게 갈라진다. 한방에서는 단풍나무의 뿌리껍질과 가지를 소염 작용과 해독 효과의 약재로 사용하는데, 무릎관절염으로 통증이 심할 때 물에 넣고 달여서 복용하고, 골절상을 입었을 때 오가피를 배합해서 사용한다. 하지만 아직까지는 본 발명의 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 세포 독성이 거의 없으며, 스타틴계 화합물(로바스타틴) 또는 과당(fructose)에 의해 증가된 PCSK9의 발현을 억제할 뿐만 아니라, LDLR의 발현을 증가시키는 효과를 통해 고콜레스테롤 혈증을 감소시킬 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 사료첨가제를 제공한다.
본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 세포 독성이 거의 없으며, 스타틴계 화합물(로바스타틴) 또는 과당에 의해 증가된 PCSK9의 발현을 억제할 뿐만 아니라, LDLR의 발현을 증가시키는 효과가 있으므로, 고콜레스테롤 혈증을 감소시킬 수 있다.
도 1은 단풍나무 잎 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과이다. (A) 5.5mM의 포도당(저농도 포도당) 처리 조건에서의 세포생존율을 확인한 것이고, (B)는 25mM의 포도당(고농도 포도당) 처리 조건에서의 세포생존율을 확인한 것이다.
도 2는 20mM의 과당(고농도 과당) 처리 조건에서의 세포 내 지방축적 정도 및 단풍나무 잎 추출물의 지방축적 억제 효과를 확인한 사진이다.
도 3은 고농도 과당 처리 조건에서의 세포 내 지방축적 정도 및 단풍나무 잎 추출물의 상대적 지방축적 억제 효과를 확인한 그래프이다. **은 정상군(C) 대비 과당 처리군의 지방 축적율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01이고, #, ##은 과당 처리군 대비 과당+단풍나무 잎 추출물 처리군의 지방 축적율이 감소하였다는 것으로, #은 p<0.05이고, ##은 p<0.01이다.
도 4는 지방 축적과 관련된 유전자의 발현량 증가 및 단풍나무 잎 추출물의 유전자 발현 억제 효과를 확인한 결과이다. (A) FASN, (B) SCD 및 (C) DGAT이고, **, ***은 정상군(C) 대비 20mM의 과당 처리군의 지방축적 관련 유전자의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다. #, ##, ###은 20mM 과당 처리군 대비 단풍나무 잎 추출물 처리군의 지방축적 관련 유전자의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, #은 p<0.05이고, ##은 p<0.01이며, ###은 p<0.001이다.
도 5는 고농도 과당(A) 또는 고농도 과당/5μM의 로바스타틴(lovastatin)(B) 조건에서 간세포 내 지방 축적 증가에 따른 LDL 흡수 억제율 및 단풍나무 잎 추출물의 처리에 따른 LDL 흡수 억제율을 확인한 결과이다. *은 정상군 대비 고농도 과당 또는 고농도 과당/5μM의 로바스타틴 처리군에서의 LDL 흡수 억제율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다. #은 고농도 과당 또는 고농도 과당/5μM의 로바스타틴 처리군 대비 단풍나무 잎 추출물의 처리군에서의 LDL 흡수 억제율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 6은 고농도 과당 또는 고농도 과당/5μM의 로바스타틴 처리 조건에서 증가된 PCSK9 및 감소한 LDLR의 유전자 발현이 단풍나무 잎 추출물에 의해 회복되는 것을 확인한 결과이다. **, ***은 정상군 대비 고농도 과당 또는 고농도 과당/로바스타틴 처리군에서의 PCSK9의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였거나, LDLR의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001다. ##, ###은 고농도 과당 또는 고농도 과당/로바스타틴 처리군 대비 단풍나무 잎 추출물 처리군에서의 PCSK9의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였거나, LDLR의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다.
도 7은 고농도 과당(A) 또는 고농도 과당/로바스타틴(B) 조건에서 증가된 PPARA 및 RXRA의 단백질 발현량이 단풍나무 잎 추출물에 의해 감소하는 것을 확인한 결과이다. **은 정상군(C) 대비 고농도 과당 또는 고농도 과당/로바스타틴군의 PPARA 및 RXRA 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01이고, #, ##, ###은 고농도 과당 또는 고농도 과당/로바스타틴군 대비 단풍나무 잎 추출물 처리군의 PARA 및 RXRA 유전자 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, #은 p<0.05이고, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다.
본 발명은 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 단풍나무 잎 추출물은 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)의 발현량을 감소시키고, LDLR(Low-density Lipoprotein Receptor)의 발현량을 증가시키는 것이 특징이고, 상기 고콜레스테롤혈증은 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증인 것이 특징이다.
상기 단풍나무 잎 추출물 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
1) 단풍나무 잎 추출물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물 추출물이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 단풍나무 잎 추출물의 추출은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 단계 3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 단풍나무 잎 추출물 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합체 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물을 건강 음료로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 텍스트린, 사이클로텐스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물은 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 고콜레스테롤혈증은 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 환제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량의 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 단풍나무 잎 추출물의 양을 기준으로 0.01~2,000mg/kg이고, 바람직하게는 30~500mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50~300mg/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 수의학적 조성물의 유효한 양은 동물의 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강상태 또는 성별에 따른 본 발명의 유효성분에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 수의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 사료첨가제에 관한 것이다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 단풍나무 잎 열수 추출물의 제조
단풍나무 잎을 믹서로 분쇄한 후, 시료 무게 대비 10배의 증류수를 넣고 100℃에서 2시간 환류추출을 2번 하고 추출액을 Whatman filter paper No. 2으로 여과한 후, 여과한 액을 40℃에서 감압농축하고 이를 동결건조한 다음 균질화하여 단풍나무 잎 열수 추출물을 획득하였다.
실시예 2. 세포배양
HepG2 hepatocarcinoma 세포는 ATCC(Seoul, Korea)에서 분양받았다. HepG2 세포는 2일마다 고농도 포도당 DMEM(25mM 포도당, 10% FBS, 1% 항생제 포함)을 이용하여 계대배양 하였으며, 6웰 플레이트에 1×106개의 세포를 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후, 저농도 포도당, 저농도 FBS DMEM(5.5mM 포도당, 1% FBS, 1% 항생제 포함)에서 2시간 전배양하였다. 이후 20mM 과당가 부과된 저농도 포도당, 저농도 FBS DMEM에, 단풍나무 잎 열수 추출물을 처리하여 효능을 확인하였다.
실시예 3. 세포생존율 확인
단풍나무 잎 열수 추출의 농도별 세포생존율에 대한 효과를 평가하기 위하여 단풍나무 잎 추출물을 low 포도당(5.5mM의 포도당), 고농도 포도당(25mM의 포도당) 및 과당이 부가된 DMEM의 배지에서 배양한 HepG2 세포에 단풍나무 잎 열수 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 CCK8 용액을 각 웰에 처리하여 미토콘드리아와의 반응을 유도하기 위하여 1시간 동안 더 배양한 후, ELISA 리더를 사용하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 1에 개시한 바와 같이, 저농도 포도당 및 고농도 포도당 처리 조건 둘다 400㎍/㎖의 농도까지에서 세포독성을 확인할 수 없었다.
또한 고농도의 과당 조건에서의 세포 내 지방축적 정도 및 단풍나푸 잎 추출물의 처리에 따른 지방 축적억제 효과를 확인하였고(도 2 및 3), 단풍나무 잎 추출물이 지방 축적과 관련된 유전자의 발현량을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 간세포에서의 LDL 흡수율 증가 효과 확인
단풍나무 잎 열수 추출의 농도별 LDL uptake(흡수) 억제율에 대한 효과를 평가하기 위하여 단풍나무 잎 추출물을 low 포도당(5.5mM의 포도당), low 포도당(5.5mM의 포도당) 및 과당 그리고 low 포도당(5.5mM의 포도당)와 과당 및 로바스타틴 (5uM의 lovastatin )이 부가된 DMEM의 배지에서 배양한 HepG2 세포에 단풍나무 잎 열수 추출물을 농도별로 처리한 후 2일시간 동안 배양하였다. 이후 LDL uptake assay kit (Abcam, USA)를 이용하여 제조사의 방침에 따라 LDL-DyLightTM 550 용액을 각 웰에 처리하여 세포내 LDL 흡수를 유도하기 위하여 3시간 동안 더 배양한 후, ELISA 리더를 사용하여 570nm/540mm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 5에 개시한 바와 같이, 고농도 과당 또는 고농도 과당/5μM의 로바스타틴 조건에서 간세포 내 지방 축적 증가에 따른 LDL uptake(흡수)가 감소하였고, 이에 대비하여 단풍나무 잎 추출물의 처리군에서 농도 의존적으로 LDL uptake(흡수)가 고농도 과당 또는 고농도 과당/5μM의 로바스타틴군에 비해 증가하였다.
실시예 5. PCSK9 및 LDLR의 발현량 분석
PCSK9의 발현 증가에 따른 LDL 수용체 분해의 증가(LDLR 감소)는 지방간 세포에서의 LDL 흡수가 감소되는 원인이다. 단풍나무 잎 추출물을 처리하여, 고농도 과당 및 로바스타틴 병용 처리시 증가되는 PCSK9 및 감소하는 LDLR의 발현량을 회복시키는 정도를 q-PCR 기법 및 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
(1) 유전자 발현량 분석
세포에서의 RNA 추출은 Easy spin RNA 추출키트(iNtRON, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. Nanodrop DS-11 스펙트로미터(DeNovix, Wilmington, DE USA)로 농도를 측정하여 정량한 다음 cDNA는 iScipt cDNA 합성키트(Bio-rad, USA)를 이용하여 합성하였으며, q-PCR은 SsoAdvanced™ Universal SYBR®Green Supermix (Bio-rad)를 이용하여 측정하였다. 증폭된 유전자의 발현정도를 정량화하기 위해 qPCR 반응은 Bio-rad real time PCR system(Bio-rad, USA)을 이용하여 수행하였다. Real time PCR의 조건은 40 사이클로 증폭시켜 반응을 진행하였다 (95℃, 30초; 59℃, 30초; 72℃에서 30초). 내부 표준물질로 GAPDH 또는 18S rRNA를 사용하여 타겟 유전자의 Quantitative PCR로 계산하여 RQ(relative quantitative)를 통해 정량화하였다. 사용된 프라이머 정보는 표 1에 표시하였다.
유전자의 프라이머 서열정보
유전자 방향성 서열(5'->3') 서열번호
PCSK9 정방향 AGTTGCCCCATGTCGACTAC 서열번호 1
역방향 CACATTCTCGAAGTCGGTGA 서열번호 2
LDLR 정방향 ACGGCGTCTCTTCCTATGACA 서열번호 3
역방향 CCCTTGGT-ATCCGCAACAGA 서열번호 4
SCD 정방향 GCCCCTCTACTTGGAAGACGA 서열번호 5
역방향 AAGTGATC-CCATACAGGGCTC 서열번호 6
DGAT 정방향 CGGCTGTGGTCTTACTGGTTG 서열번호 7
역방향 GGTCAGA-TTGTCCGGGTAGCT 서열번호 8
FASN 정방향 TCGGAGAACTTGCAGGAGTT 서열번호 9
역방향 CGGAGTGAATCTGGGTTGAT 서열번호 10
PPARα 정방향 GCTGGTGCAGATCATCAAGA 서열번호 11
역방향 CCCCCAGCATTTGAGTTCTA 서열번호 12
RXRRα 정방향 CAAGGACTGCCTGATTGACA 서열번호 13
역방향 TTTGCCTCCACGTAGGTCTC 서열번호 14
GAPDH 정방향 GTCAGTGGTGGACCTGACCT 서열번호 15
역방향 TGCTGTAGCCAAATTCGTTG 서열번호 16
그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 PCSK9 유전자의 발현량을 감소시키며, LDLR의 발현량을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
(2) 웨스턴 블랏
단풍나무 잎 열수 추출물의 PPARA 및 RXRA의 단백질 발현량 변화를 확인하기 위하여 HepG2 세포를 6웰 플레이트에 농도로 세포 배양에서 제시한 방법에 따라 시험물질과 20mM 과당, 5μM 로바스타틴(lovastatin) 등을 처리하였다. 72시간을 배양한 후 2번의 인산염 완충액(PBS) 세척 후에 세포를 수득하였다. 세포의 전단백질(whole cell lysate)은 RIPA lysis buffer를 이용해 수득하였고, SDS-PAGE 전기영동을 통해 단백질을 분리하고 각각의 1, 2차 항체 면역반응을 통해 각 단백질의 발현을 분석하였다. ChemiDocTM Touch Imaging System (Bio-Rad)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 7 개시한 바와 같이 본 발명의 단풍나무 잎 추출물은 PPARA 및 RXRA의 단백질 발현량을 감소시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
[통계처리]
실험 결과의 통계처리는 Excel 프로그램의 t-test를 이용하여 수행하였으며, p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단풍나무 잎 추출물은 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)의 발현량을 감소시키고, LDLR의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단풍나무 잎 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단풍나무 잎 추출물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 고콜레스테롤혈증은 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증인 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
  10. 단풍나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 사료첨가제.
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