KR20240028332A - 다층 양막 조직 이식편 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복수의 세포외 바탕질의 적층된 층을 포함하는 조직 이식편 생성물로서, 여기서 세포외 바탕질이 양막으로부터 유래하고, 세포외 바탕질 층의 간질 측이 조직 이식편 생성물의 상부 표면 및 하부 표면 둘 다 위에 존재하는 조직 이식편 생성물을 제공한다. 조직 이식편 생성물의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.
Description
이 출원은 2021년 4월 13일에 출원된 미국 가 특허 출원 번호 63/174,280 및 2022년 2월 10일에 출원된 63/267,820에 대한 우선권을 주장하며, 이것들의 내용 전체는 본원에 참고로 편입된다.
분야
본 발명은 부분적으로, 다층 형성된(multi-layered) 양막 조직 이식편, 및 안구 적용에서 이것들의 용도에 관한 것이다.
인간 양막(amniotic membrane)(양막(amnion))은 양막 액과 직접 접촉하는 양막 낭의 가장 안쪽 층이다. 이는 입방형의 상피 세포, 기저 막, 및 융모막에 느슨하게 부착된 무혈관 간질(stromal) 바탕질(matrix)로 된 단일 층으로 구성된다. 인간 양막의 주요 성분은 콜라겐 및 엘라스틴인 것으로 보고되어 있다. 라미닌 및 프로테오글리칸과 같은 기타 생화학적 성분도 소량 존재한다.
BIOVANCE는 인간의 양막으로 제조된다. 원료 양막은 천연(native) 콜라겐 기반 구조를 변경시키지 않고 혈액 성분 오염을 깨끗하게 하고 막에서 세포를 제거하도록 설계되는 헹굼 및 탈세포화 과정을 거친다. 깨끗해지고 탈세포화된 양막은 50℃의 온화한 온도에서 탈수되므로, 최종 생성물은 보관, 운반이 용이하고 더 긴 유통기한을 가질 것이다. 상기 생성물은 전자빔 방사선을 사용하여 최종적으로 멸균된다.
양막(AM)은 윤부 줄기 세포 결핍이 있거나 없는 각막 표면 장애, 윤부 상피 세포의 체외 확장을 위한 운반체로, 결막 표면 재건, (예를 들어, 익상편 제거, 익상편 이외의 큰 병변의 제거 후, 심눈꺼풀 용해 후), 녹내장, 신생물, 익상편 뿐만 아니라, 공막 융해 및 천공을 포함한 다양한 안구 병리를 치료하기 위한 안구 표면 재건에 사용된다(Walkden, 2020; Elhassan, 2019; Malhotra & Jain, 2014, Mamede 등 2012).
AM은 패치 또는 이식편으로 사용될 수 있다. AM 상피 세포가 위를 향하게 배치함으로써, AM은 상피 세포 성장을 위한 기질(substrate) 및 스캐폴드(scaffold) 역할을 한다(Malhotra & Jain, 2014). 패치로서, AM은 임시 생물학적 붕대 또는 콘택트 렌즈 역할을 하여, 패치 아래 숙주 조직의 재상피화를 촉진한다(Walden, 2020, Malhotra & Jain, 2014). 패치로서의 AM을 간질 측이 아래로 향하게 배치하는 것은, 염증 세포를 포획하여 세포자멸사를 유도함으로써 염증 반응을 하향 조절하는 것으로 생각된다(Dua 등 2004). 따라서, AM은 급성 염증이 있는 경우, 특히 상피 결손과 관련된 경우, 염증 세포 및 매개체로부터 안구 표면을 보호하기 위해 간질 측이 아래로 향하게 배치된다(Malhotra & Jain, 2014; Mamede 등 2012).
표 1 안구 병리에 기반한 이식편 또는 패치로서 AM의 사용(Safa Elhassan, 2019; Understanding Amniotic Membrane Grafts).
AM 배향(orientation) 및 적용 방법: 적용 방법의 선택은 사용 적응증, 원하는 결과, 및 상처의 깊이 및 크기에 따라 달라진다(Walkden, 2020; Elhassan, 2019; Malhotra & Jain, 2014).
세 가지 적용 방법이 문헌 전체에 걸쳐 일관되게 보고된다.
인레이(inlay) 기법(영구 이식편);
온레이(onlay) 기법(임시 생물학적 붕대 또는 콘택트 렌즈); 및
조합된 인레이-온레이 기법(영구 이식편 및 임시 생물학적 붕대).
인레이 기법(영구 이식편): AM은 상피/기저 막 측을 위를 향하게 배치하여 숙주 세포를 이것들이 성장할 수 있는 기질에 제공한다. 시간이 지남에 따라, AM 바탕질은 숙주 각막으로 리모델링된다. 그러므로, 이것은 영구적인 이식편의 역할을 한다.
AM은 결손에 맞도록 손질되고, 상피 측이 위를 향하게 배치하고, 보통 각막에 봉합된다. 숙주 각막 상피의 대략 2 mm가 괴사조직 제거된다. 이를 통해 재생되는 상피가 AM의 상피/기저 막 위로 성장할 수 있다. 결손의 크기에 따라, 단일 층 또는 다층 기법이 사용될 수 있다. 다층 기법을 사용하면, AM은 여러 조각으로 잘려지거나 담요처럼 접혀질 수 있다.
온레이 기법(임시 생물학적 붕대 또는 콘택트 렌즈): AM은 숙주의 상피가 막 아래에서 자라도록 되어 있기 때문에 상피/기저 막 측이 위를 향하거나 간질 측이 위를 향하게 배치될 수 있다. AM은 일정 기간이 지나면 떨어지고, 제거되거나 자체 분해될 것으로 예상된다. 따라서, AM은 임시 생물학적 붕대 또는 콘택트 렌즈 역할을 하여, 물리적 장벽을 제공한다. 이는 숙주 조직에 통합되도록 의도되지 않는다.
AM의 크기가 결손보다 크기 때문에, 막 아래에 숙주 상피가 존재한다. 이는 제자리에 봉합되거나 접착제로 접착된다.
조합된 인레이-온레이 기법: 이것은 인레이 기법과 온레이 기법 둘 다를 조합한다. 위에서 설명된 바와 같이, AM은 결손에서 상피 측이 위를 향하게 배치되고, 숙주 조직에 통합될 것으로 예상된다. 단일 층 또는 다중 층 기법이 사용될 수 있다. 이것은, 이식편이 상피/기저 막 측이 위를 향하게 또는 간질 측이 위를 향하게 배치되어, 결손 주변을 넘어 확장되는 온레이 기법과 조합된다. 이 기법을 사용하면, 상피가 패치 아래에서 그러나 최상층 인레이 이식편 위로 성장할 것으로 예상된다.
요약
본 발명은, 함께 적층된 복수의 세포외 바탕질 층을 포함하는 조직 이식편 생성물로서, 여기서 세포외 바탕질이 양막으로부터 유래하고, 세포외 바탕질 층의 간질 측이 상기 조직 이식편 생성물의 상부 표면 및 하부 면 둘 다 위에 존재하는 조직 이식편 생성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조직 이식편 생성물을 포함하는 안구 조직 이식편을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에서 눈의 질환 또는 손상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체의 눈을 본 발명의 조직 이식편 생성물 또는 안구 조직 이식편과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
도 1에는 측면 및 양막에 의한 세포 접착을 도시한다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다. 형광 강도(AU)로 측정된 세포 접착.
도 2에는 세포 증식을 도시한다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다.
도 3에는 상대적 증식 속도가 도시되어 있다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다.
도 4에는 양막에 의한 이동 면적을 도시한다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다. 이동 면적은 px2으로 기록되어 있다.
도 5에는 7일에 걸친 AM의 E & S 측 위에서의 세포 생존력을 도시한다. *p ≤ 0.05, DDHAM-S와 비교함.
도 6에는 4일 후, AM의 S 측 위의 세포를 CalceinAM으로 염색하여 생존가능한 세포(a)를 시각화하고, 팔로이딘으로 염색하여 액틴(b)을 시각화했음을 도시한다.
도 7에는 24시간, 48시간 및 72시간 동안 AM 위에서 배양된 HCEC에서 TNFα의 유전자 발현을 도시한다. *p ≤ 0.05.
도 8a 및 8b에는 양막의 면역형광 및 H & E 염색을 도시한다. DDHAM, DHAM 및 CHAM의 면역형광 염색을 도시한다(a). 막의 단면을 Hoechst 염료(청색의 DNA), 팔로이딘(녹색의 액틴) 및 항인간 유형 I 콜라겐 항체(적색의 Col1)로 염색하였다. 대표적인 이미지가 도시되어 있고, 눈금 막대는 50 um이다. DDHAM, DHAM 및 CHAM의 H & E 염색(청색의 핵, 적색의 세포질)을 도시한다(b). 대표적인 이미지가 도시되어 있고, 눈금 막대는 20 um이다.
도 9에는 세포 접착을 도시한다. 인간 각막 상피 세포를 양막의 상피 측 및 간질 측 위로 접종하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각 양막의 상피 측과 간질 측 간의 비교가 도시되어 있고, 각 측에 대한 양막 간의 비교가 도시되어 있다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다. 형광 강도는 임의 단위(AU)로 표시된다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤ 0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 10에는 4일 차에 AM 위의 인간 각막 상피 세포의 염색을 도시한다. 인간 각막 상피 세포를 3개의 AM의 간질 측 위로 접종하고, 배양하고, Calcein AM을 사용하여 염색하여, 4일 차에 생존 가능한 세포를 시각화하였다(a). AM의 인간 각막 상피 세포의 형태를 4일 차의 액틴 염색 및 유사색(pseudo-colored) 적색으로 모니터링하였다(b). 에피형광(epi-fluorescent) 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다. 눈금 막대 = 100 μm. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 11a 및 11b에는 시간이 지남에 따른 세포 생존력을 도시한다. 인간 각막 상피 세포를 양막의 상피 측 및 간질 측 위에 접종하고, 1, 4 및 7일 동안 인큐베이션하였다. 양막 위의 세포 생존력을 각 시점에서 alamarBlue 검정으로 측정하였다. 형광 강도는 임의 단위(AU)로 표시된다. 양막의 각 측에 대한 평균 및 표준 편차가 시간이 지남에 따라 플롯팅되어 있다(a). 1일의 백분율로 표시된 상대적 세포 생존력, 및 표준 편차가 각 양막에 대해 시간이 지남에 따라 표시된다. 각 양막의 상피 측과 간질 측 간의 비교가 도시되어 있고, 각 측에 대한 양막 간의 비교가 도시되어 있다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p≤ 0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 12a 및 12b에는 이동의 정량화가 도시되어 있다. 0시간 및 24시간에 인간 각막 상피 세포의 이동에 대한 조절된 배지(conditioned media)의 효과를 입증하기 위해 대표적인 스크래치 상처 이미지를 도시한다(a). 인간 각막 상피 세포의 이동에 대한 AM 단독의 효과를 평가하기 위해 (세포가 있거나 없는) 상이한 양막으로부터의 조절된 배지를 시험하였다(b). 상처 면적을 Image J를 사용하여 측정하였고, 픽셀 제곱(px2)으로 표시하였다. 이동된 면적 = 면적0시간 - 면적24시간. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막; 대조 배지, 대조군.
도 13a 내지 13d에는 24시간에서의 mRNA 발현을 도시한다. 24시간에서의 GM-CSF(a), IL-6(b), Il-8(c), 및 TNF-α(d)의 상대적 mRNA 발현을 도시한다. 24시간에서의 상대적 mRNA 발현은 휴지 조건에서 TCP로 정규화된다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막; GM-CSF, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; IL-6, 인터루킨-6; IL-8, 인터루킨-8; TNF-α, 종양 괴사 인자 알파.
도 14a 내지 14d에는 시간이 지남에 따른 mRNA 발현을 도시한다. 자극된 조건(+TNF-α)에서 시간이 지남에 따른 GM-CSF(a), IL-6(b), IL-8(c) 및 TNF-α(d)의 상대적 mRNA 발현을 도시한다. 시간이 지남에 따른 상대적 mRNA 발현은 24시간에서의 발현으로 정규화된다. 자극된 조건에서 각 양막에 대한 시점 간에 통계적으로 비교되어 있다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막; GM-CSF, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; IL-6, 인터루킨-6; IL-8, 인터루킨-8; TNF-α, 종양 괴사 인자 알파.
도 15a 내지 15f에는 임상 사례 연구가 도시되어 있다. 임상 과정을 예시하기 위해 상피 표면의 이미지를 촬영하였다: 상피의 불량한 불규칙한 표면을 도시하는 수술 전(a), 전방 기저 막 이영양증으로부터, 눈에 보이는 상피하 파편을 갖는 불량한 상피의 제거 후(b), 모든 상피하 흉터 및 전방 기저 막 이영양증 파편의 버링 후(post burring)(c), DDHAM 배치(d), DDHAM 위에 붕대 콘택트 렌즈 배치(e), 및 깨끗한 표면을 보여주는, 수술 후 1개월.
도 16a 내지 16c에는 안구 AM 제조가 도시되어 있다. DDHAM은 10 mm 디스크로 포장된다(a). 연구를 위해, DHAM(b) 및 CHAM(c)를 10 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 10 mm 디스크로 만들었다. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 17에는 Biovance 3L ocular를 곡선 형상으로 건조시킬 수 있는 3D 프린팅된 주형(mold) 모델을 도시한다.
도 18에는 곡선 형상으로 건조된 Biovance 3L ocular가 도시되어 있다.
도 2에는 세포 증식을 도시한다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다.
도 3에는 상대적 증식 속도가 도시되어 있다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다.
도 4에는 양막에 의한 이동 면적을 도시한다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다. 이동 면적은 px2으로 기록되어 있다.
도 5에는 7일에 걸친 AM의 E & S 측 위에서의 세포 생존력을 도시한다. *p ≤ 0.05, DDHAM-S와 비교함.
도 6에는 4일 후, AM의 S 측 위의 세포를 CalceinAM으로 염색하여 생존가능한 세포(a)를 시각화하고, 팔로이딘으로 염색하여 액틴(b)을 시각화했음을 도시한다.
도 7에는 24시간, 48시간 및 72시간 동안 AM 위에서 배양된 HCEC에서 TNFα의 유전자 발현을 도시한다. *p ≤ 0.05.
도 8a 및 8b에는 양막의 면역형광 및 H & E 염색을 도시한다. DDHAM, DHAM 및 CHAM의 면역형광 염색을 도시한다(a). 막의 단면을 Hoechst 염료(청색의 DNA), 팔로이딘(녹색의 액틴) 및 항인간 유형 I 콜라겐 항체(적색의 Col1)로 염색하였다. 대표적인 이미지가 도시되어 있고, 눈금 막대는 50 um이다. DDHAM, DHAM 및 CHAM의 H & E 염색(청색의 핵, 적색의 세포질)을 도시한다(b). 대표적인 이미지가 도시되어 있고, 눈금 막대는 20 um이다.
도 9에는 세포 접착을 도시한다. 인간 각막 상피 세포를 양막의 상피 측 및 간질 측 위로 접종하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각 양막의 상피 측과 간질 측 간의 비교가 도시되어 있고, 각 측에 대한 양막 간의 비교가 도시되어 있다. 평균 및 표준 편차가 플롯팅된다. 형광 강도는 임의 단위(AU)로 표시된다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤ 0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 10에는 4일 차에 AM 위의 인간 각막 상피 세포의 염색을 도시한다. 인간 각막 상피 세포를 3개의 AM의 간질 측 위로 접종하고, 배양하고, Calcein AM을 사용하여 염색하여, 4일 차에 생존 가능한 세포를 시각화하였다(a). AM의 인간 각막 상피 세포의 형태를 4일 차의 액틴 염색 및 유사색(pseudo-colored) 적색으로 모니터링하였다(b). 에피형광(epi-fluorescent) 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐하였다. 눈금 막대 = 100 μm. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 11a 및 11b에는 시간이 지남에 따른 세포 생존력을 도시한다. 인간 각막 상피 세포를 양막의 상피 측 및 간질 측 위에 접종하고, 1, 4 및 7일 동안 인큐베이션하였다. 양막 위의 세포 생존력을 각 시점에서 alamarBlue 검정으로 측정하였다. 형광 강도는 임의 단위(AU)로 표시된다. 양막의 각 측에 대한 평균 및 표준 편차가 시간이 지남에 따라 플롯팅되어 있다(a). 1일의 백분율로 표시된 상대적 세포 생존력, 및 표준 편차가 각 양막에 대해 시간이 지남에 따라 표시된다. 각 양막의 상피 측과 간질 측 간의 비교가 도시되어 있고, 각 측에 대한 양막 간의 비교가 도시되어 있다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p≤ 0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 12a 및 12b에는 이동의 정량화가 도시되어 있다. 0시간 및 24시간에 인간 각막 상피 세포의 이동에 대한 조절된 배지(conditioned media)의 효과를 입증하기 위해 대표적인 스크래치 상처 이미지를 도시한다(a). 인간 각막 상피 세포의 이동에 대한 AM 단독의 효과를 평가하기 위해 (세포가 있거나 없는) 상이한 양막으로부터의 조절된 배지를 시험하였다(b). 상처 면적을 Image J를 사용하여 측정하였고, 픽셀 제곱(px2)으로 표시하였다. 이동된 면적 = 면적0시간 - 면적24시간. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막; 대조 배지, 대조군.
도 13a 내지 13d에는 24시간에서의 mRNA 발현을 도시한다. 24시간에서의 GM-CSF(a), IL-6(b), Il-8(c), 및 TNF-α(d)의 상대적 mRNA 발현을 도시한다. 24시간에서의 상대적 mRNA 발현은 휴지 조건에서 TCP로 정규화된다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막; GM-CSF, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; IL-6, 인터루킨-6; IL-8, 인터루킨-8; TNF-α, 종양 괴사 인자 알파.
도 14a 내지 14d에는 시간이 지남에 따른 mRNA 발현을 도시한다. 자극된 조건(+TNF-α)에서 시간이 지남에 따른 GM-CSF(a), IL-6(b), IL-8(c) 및 TNF-α(d)의 상대적 mRNA 발현을 도시한다. 시간이 지남에 따른 상대적 mRNA 발현은 24시간에서의 발현으로 정규화된다. 자극된 조건에서 각 양막에 대한 시점 간에 통계적으로 비교되어 있다. 도시된 데이터는 평균 ± SD이다. *p ≤0.05. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막; GM-CSF, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; IL-6, 인터루킨-6; IL-8, 인터루킨-8; TNF-α, 종양 괴사 인자 알파.
도 15a 내지 15f에는 임상 사례 연구가 도시되어 있다. 임상 과정을 예시하기 위해 상피 표면의 이미지를 촬영하였다: 상피의 불량한 불규칙한 표면을 도시하는 수술 전(a), 전방 기저 막 이영양증으로부터, 눈에 보이는 상피하 파편을 갖는 불량한 상피의 제거 후(b), 모든 상피하 흉터 및 전방 기저 막 이영양증 파편의 버링 후(post burring)(c), DDHAM 배치(d), DDHAM 위에 붕대 콘택트 렌즈 배치(e), 및 깨끗한 표면을 보여주는, 수술 후 1개월.
도 16a 내지 16c에는 안구 AM 제조가 도시되어 있다. DDHAM은 10 mm 디스크로 포장된다(a). 연구를 위해, DHAM(b) 및 CHAM(c)를 10 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 10 mm 디스크로 만들었다. 약어: CHAM, 냉동보존된 인간 양막; DDHAM, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막; DHAM, 탈수된 인간 양막.
도 17에는 Biovance 3L ocular를 곡선 형상으로 건조시킬 수 있는 3D 프린팅된 주형(mold) 모델을 도시한다.
도 18에는 곡선 형상으로 건조된 Biovance 3L ocular가 도시되어 있다.
본 발명은, 함께 적층된 복수의 세포외 바탕질 층을 포함하는 조직 이식편 생성물로서, 여기서 세포외 바탕질이 양막으로부터 유래하고, 세포외 바탕질 층의 간질 측이 상기 조직 이식편 생성물의 상부 표면 및 하부 면 둘 다 위에 존재하는 조직 이식편 생성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 생성물은 3개 이상의 세포외 바탕질 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생성물은 정확히 3개의 세포외 바탕질 층을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 양막은 탈세포화된다. 일부 실시양태에서, 상기 양막은 세제 및 또는 기계적 파괴를 사용하여 탈세포화된다. 일부 실시양태에서, 상기 세제는 데옥시콜산이다.
일부 실시양태에서, 상기 복수 세포외 바탕질 층은 건조에 의해 함께 적층된다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 열 및 또는 진공에 의해 건조된다.
일부 실시양태에서, 상기 조직 이식편 생성물은 탈수된다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 20% 미만의 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 15% 미만의 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 10%의 물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 40% 내지 약 70%의 총 콜라겐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 45% 내지 약 60%의 총 콜라겐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 50% 내지 약 55%의 총 콜라겐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 주로 콜라겐 유형 I 및 콜라겐 유형 III이다.
일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 8% 내지 약 24%의 엘라스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 12% 내지 약 20%의 엘라스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 15% 내지 약 20%의 엘라스틴을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 1% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 0.5% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 1% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 0.5% 미만의 피브로넥틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 1% 미만의 라미닌을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 생성물은 건조 중량을 기준으로 약 0.5% 미만의 라미닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 양막은 인간 양막이다. 일부 실시양태에서, 상기 양막은 만기 임신으로부터 유래한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조직 이식편 생성물을 포함하는 안구 조직 이식편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 안구 조직 이식편은 대략 원형이다. 일부 실시양태에서, 상기 안구 조직 이식편은 구의 일부 형상의 곡선 모양의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 형상은 상기 조직 이식편 생성물을 주형 위로 건조함으로써 부여된다.
본 발명은 또한 대상체에서 눈의 질환 또는 손상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체의 눈을 본 발명의 조직 이식편 생성물 또는 안구 조직 이식편과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 눈 손상은 찰과상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 눈 손상은 화학적 노출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 눈 손상은 베인 상처 또는 열상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 눈의 질환 또는 손상은 각막의 질환 또는 손상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 치료는 손상된 조직의 복구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 치료되지 않은 눈에 비해 흉터 조직에서의 감소 또는 흉터 조직 형성에서의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 이동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 접착을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 증식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 적용범위(coverage)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다.
실시예
실시예 1: Biovance의 생화학적 조성
BIOVANCE는 주로 콜라겐 및 엘라스틴으로 구성된다. 글리코사미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌도 소량 존재한다.
표 2: 생화학적 조성.
* "기타"로 나열된 단백질은 콜라겐 유형 V, VI 및 VII, 인테그린, 및 피브로넥틴 전구체를 포함하지만, 이것들로 제한되지 않는다.
표 3: 콜라겐 하위유형 조성
실시예 2: 인간 안구 상피 세포에 대한 안구 스캐폴드의 효과에 대한 비교 연구
양막 스캐폴드는 이것들의 독특한 생물학적 특성으로 인해 다양한 안구 질환의 치료에 사용되어 왔다. 벤치 탑(bench top) 데이터는, 스캐폴드의 재생 특성이 내재적(innate) 치유 메커니즘에 영향을 미칠 수 있음을 입증하였다. 양막 스캐폴드는 자연 치유 속도를 높이고 주관적 통증 및 수술 합병증을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 양막 스캐폴드의 고유한 재생 능력을 입증한 광범위한 연구에도 불구하고, 상기 조직의 획득 및 처리는 지속적으로 발전되고 있다. 어느 처리 방법론이 안과적 적용에 이상적인 스캐폴드를 생성하는지를 밝히기 위해서는 추가적인 노력이 필요하다.
목적: 인간 안구 상피 세포 접착 및 증식에 대한 3개의 양막 스캐폴드(Biovance3L Ocular, AMBIO2®, AmnioGraft®)의 효과를 결정하기 위한 것이다.
방법: 인간 각막 상피 세포(HCEC) 및 인간 결막 상피 세포(HConEpiC)를 웰에 접종하였다. 스캐폴드 위에서 1, 4, 및 7일에 접착 및 증식을 측정하였다. 조절된 배지를 웰에서 추출하고, 성장 검정에 사용하였다.
결과: 다른 2개의 스캐폴드와 비교하여 Biovance3L Ocular가 유의하게 더 큰 상피 세포 생존력(P < 0.001)을 보였고, 유의하게 더 큰 상피 세포 접착(P ≤ 0.011)을 보였다. 또한, 상피 세포 증식 속도는 AmnioGraft®보다 Biovance3L 위에서 유의하게 더 컸다(P < 0.001). 조절된 배지가 있는 경우에 Biovance3L Ocular 및 AMBIO2® 위에서 배양된 세포로부터 HCEC 이동은 비슷했고(P = 0.885), AmnioGraft® 위에서 성장한 세포보다 유의하게 더 컸다(P ≤ 0.006). 안구 스캐폴드 위에서 배양된 세포로부터, 조절된 배지가 있는 경우 HCEC의 이동은, 조직 배양 플라스틱 위에서 성장한 세포로부터의 대조군인 조절된 배지보다 유의하게 더 컸다(P < 0.001). 상이한 스캐폴드로부터의 조절된 배지는 HConEpiC의 이동에는 영향을 미치지 않았다.
결론: Biovance3L Ocular는 다른 스캐폴드와 비교했을 때 HCEC 및 HConEpiC 둘 다의 더 큰 생존력, 접착, 및 증식을 지원함으로써 인간 상피 세포에 대해 유의한 영향을 미쳤다. 이들 발견의 임상적 영향을 평가하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.
요약: Biovance3L Ocular를 다양한 검정에서 세포 성장 차이를 결정하기 위해 시장 경쟁사인 AMBIO2® 및 AmnioGraft®에 대하여 비교하였다. Biovance3L은 다른 스캐폴드와 비교했을 때 HCEC 및 HConEpiC의 우수한 생존력, 접착, 및 증식을 나타냈다. 잔여 세포, DNA, 성장 인자 및 사이토카인이 없는 Biovance3L Ocular는, 자연적 복구 및 재생을 성취하는 데 중요한, 안구 상피 세포에 대한 우수한 성장 측정치를 나타냈다.
실시예 3: Biovance 3L
배경: 양막은 광범위한 임상 용도를 갖는다. 전형적으로, 단일 층 막은 임상 적용 전체에 걸쳐 활용된다.
각막 상피 세포 재상피화를 위해 선호되는 배향은, 간질 측과 비교하여 재상피화를 지원하는 양막의 상피 측임이 입증되었다.
예를 들어, D.J Hu(Investigative Ophthalmology & Visual Science May 2003, Vol.44, 3151)는 2개의 배향: AM 기저 막 전방(BMA) 및 AM 기저 막 후방(BMP) 측으로 각막 결손에서 봉합된 양막(AM) 위에서의 각막 재상피화를 비교하였다. 그의 결론은, 각막 재상피화 속도가 AM의 배향에 의해 영향받지 않는다는 것이었다. 각막 상피는, 배향에 관계없이 AM의 기저 막(상피 측)에 대해 더 큰 친화력을 갖는다. 임상의는 이 발견을 고려하고, 상피가 양막의 양측 위에서 성장할 수 있지만 대부분의 재상피화는 기저 막 표면 위에서 일어남을 실감해야 한다.
발명자들의 연구 질문/가설: 양막(AM)의 측면성(즉, 상피, 간질) 및 상이한 막 처리 방법론(즉, DDHAM, DHAM, 및 CHAM)이 HCEC의 접착, 증식, 및 이동에 어떻게 영향을 미치나?
또한, 발명자들의 가설은, 잔여 세포 구성요소, 세포, 세포 파편, DNA, 성장 인자, 및 사이토카인의 완전한 제거 뿐만 아니라, 천연 3차원 형태의 필수적인 세포외 바탕질 분자가 있는 온전한 선천적 콜라겐 프레임워크의 보존을 목표로 하는 발명자들의 독점적인 탈세포화 과정이, 잔여 세포, 세포 파편, DNA, 및 성장 인자 및 사이토카인을 함유하는 다른 양막 유래 생성물과 비교하여 우수한 생체 적합성 및 세포 분화 기능을 지원하는 능력을 제공한다는 것이다.
발명자들은 함께 건조되어 새로운 재료 구성을 형성하는 그러한 3개 층에서 단일 층 형성된 막과 상이한, 3L이라 불리는 3층 형성된 막을 생각해 냈다. 막 건조 과정 전에 새로운 층 형성 단계를 추가하여, 예상치 못한 새로운 특성 및 임상 용도를 갖는 생성물을 만들었다. 이 신규한 조성의 일부로, 양막은 상부 및 하부 위에서 간질 측이 바깥 측(outward)을 향하게 3층 두께이도록 층 형성된다. 이 막을 그 자체 위에 층 형성하고 건조시켜서, 동일한 양막으로부터 3개 층의 막을 만든다.
발명자들의 새로운 생성물은, 태반에서 벗겨내어 침지(soaking)를 위해 중성 세제인 1% 데옥시콜산에 담가두는 양막으로 구성된다. 양막 표면에서 양수세포 및 융모막 세포를 거의 100% 제거하고 조직의 물질로부터 대부분의 섬유아세포를 제거하기 위해 양막은 기계적 긁기작업(scraping)을 거친다.
최종 생성물은 콜라겐 및 기타 바탕질 성분에 결합하는 엘라스틴 및 피브로넥틴을 포함한 양막의 천연 콜라겐 구조를 보유하는 세포외 바탕질로 구성된 3층의 양막 구조 조직이다.
막 건조 과정 전에 새로운 층 형성 단계를 추가하여, 예상치 못한 새로운 특성 및 임상 용도를 갖는 생성물을 만들었다.
이 신규한 조성의 일부로, 양막은 상부 및 하부 위에서 간질 측이 바깥 측을 향하게 3층 두께이도록 층 형성된다. 일단 건조되면 양막을 원하는 크기로 자르고, 각 개별 조각을 내부 파우치에 넣고, 라벨을 붙이고, 밀봉하고, 멸균시킨다.
Biovance 3L의 예상치 못한 결과는, 3L BIOVANCE Ocular의 상피 측에 대한 간질 측의 인간 각막 상피 및 인간 결막 세포 부착, 증식, 및 이동에서의 차이와 관련이 있다. 또한, 탈세포화 과정이 양막 성능에 영향을 미친다.
통계 분석: 독립 변수는 AM(DDHAM, DHAM, CHAM), 측면(상피, 간질) 및 시간(1일, 4일, 및 7일)이다. 종속 변수는 세포 접착, 증식 및 이동이다. 하기 결과는 3개의 양막(AM): Biovance3L Ocular(DDHAM), AMBIO2(DHAM), 및 AmnioGraft(CHAM)의 상피 측 및 간질 측 둘 다 위의 인간 각막 상피 세포에 대한 것이다.
데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시된다. 데이터를 시험하였고, 대략적으로 정규 분포를 따르는 것으로 밝혀졌다. Tukey 사후 시험을 사용한 양방향 분산 분석(ANOVA)으로 세포 접착 및 이동을 분석하였다. 세포 증식은 Tukey 사후 시험을 사용한 3원 ANOVA로 분석하였다. ANOVA 결과는 F-통계량 및 이것의 관련 자유도로 기록된다. 짝지어지지 않은 t-검정은 표시된 경우 사후 시험으로 수행하였다. p-값 < 0.05가 유의한 것으로 간주되었다. 모든 분석은 IBM SPSS(Build 1.0.0.1444)를 사용하여 수행하였다.
Biovance® Tri-layer는 자연 상피 기저 막이 보존되어 있고 생화학적 성분을 갖는 온전한 세포외 바탕질 구조를 갖는 3층 형성된 탈세포화되고 탈수된 인간 양막(DDHAM)이다. 이 동종이식편의 상피 기저 막 및 세포외 바탕질은 세포 부착 또는 침투 및 성장 인자 보관을 허용하는 천연 스캐폴드를 제공한다. Biovance® Tri-layer는 보호 덮개(cover)를 제공하고 신체의 상처 치유 과정을 지원한다. Biovance® Tri-layer는 현재 3L Biovance® 및 Biovance® 3L Ocular로 판매되고 있다.
Biovance® Tri-layer, 탈세포화되고 탈수된 인간 양막(DDHAM)은 태반에서 벗겨내어 침지를 위해 중성 세제인 1% 데옥시콜산에 담궈두는 양막으로 구성된다. 양막 표면에서 양수세포 및 융모막 세포를 거의 100% 제거하기 위해 양막은 기계적긁기작업을 거친다. 대부분의 섬유아세포도 조직의 물질로부터 제거한다. 이 막은 그 자체 위로 층 형성되고 건조되어, Biovance®의 3층 형성된 생성물 버전을 만든다. 최종 생성물은 콜라겐 및 기타 바탕질 성분에 결합하는 피브로넥틴을 포함한 양막의 천연 콜라겐 구조를 보유하는 세포외 바탕질로 구성된 구조 조직이다. 최종 생성물은 세포, 호르몬, 성장 인자, 및 사이토카인이 없는 3층 양막이다.
Biovance® Tri-layer의 제조 과정을 간소화하고 최적화하기 위해, 과정 개발 팀은 Biovance® 과정에 대한 모든 처리 단계를 활용했다. 막을 건조하기 전에 층 형성 단계를 추가하였다. 멸균 단계 및 출하 기준도 Biovance® 과정에서 Biovance® Tri-layer 과정으로 이어졌다.
양막은 1% 데옥시콜산 용액 내로 채취되며, 2 내지 8℃에서 최대 14일 동안 보관될 수 있다. 일단 허용 가능한 산모 혈액 결과가 접수되면, 양막은 보관 장소에서 제거되고 처리가 시작된다. 양막은 층 형성되기 전에 일련의 수동적인 긁기작업 및 세척을 거친다. 양막은, 이것이 상부 및 하부 위에서 간질 측이 바깥 측을 향하게 3층 두께이도록 층 형성된다. 일단 건조되면 양막을 원하는 크기로 자르고, 각 개별 조각을 내부 파우치에 넣고, 라벨을 붙이고, 밀봉한 후, 육안 검사를 위해 제출한다. 육안 검사 동안, 조직의 크기, 형상, 구멍, 찢어짐(rip)/찢김(tear), 파편 및 얼룩을 검사한다. 육안 검사 후, 내부 파우치의 각 조각을 라벨이 붙은 외부 파우치에 넣고, 밀봉하고, 멸균시킨다.
결과:
세포 접착:
세포 접착은 AM의 상피 측 위에서(9,788.50 ± 5,704.17 AU)보다 간질 측 위에서(12,342.42 ± 4,536.60 AU)에서 더 컸고(측면 주 효과, F(1,18) = 6.714, p = 0.018), 이는 DHAM의 간질 측(13,100.25 ± 4,675.24 AU, p = 0.017), DDHAM의 상피 측(16,725.25 ± 1,453.62 AU, p < 0.001), CHAM의 상피 측(8,392.50 ± 1,425.86 AU, p < 0.001), DDHAM의 간질 측(16,334.75 ± 591.85 AU, p = 0.002), 및 CHAM의 간질 측(7,592.25 ± 1,073.22 AU), p < 0.001)(측면 x AM, p = 0.001)과 비교하여, DHAM의 상피 측(4,247.75 ± 2,732.87 AU)의 더 낮은 세포 접착에 기인할 수 있다.
또한, AM 간의 세포 접착에서 유의한 차이가 있었는데(AM 주 효과, F(2,18) = 30.896, p < 0.001), 이때 DHAM(8,674.00 ± 5,912.61 AU, p < 0.001) 및 CHAM 위에서(7,992.38 ± 1,244.16 AU, p < 0.001)보다 DDHAM 위에서(16,530.00 ± 1,048.46 AU) 세포 접착이 유의하게 더 컸다. 그러나, 위에서 표시된 바와 같이, 세포 접착은 측면 및 AM에 따라 달라졌다. 세포 접착은 DDHAM의 상피 측과 DDHAM의 간질 측 간에서(p = 0.645) 그리고 CHAM의 상피 측과 CHAM의 간질 측 간에서(p = 0.404) 유사하였다. 그러나, 세포 접착은 DHAM의 상피 측보다 DHAM의 간질 측 위에서 유의하게 더 컸다(p = 0.017). 따라서, DHAM의 상피 측(p ≤ 0.002), CHAM의 상피 측(사후 시험, p < 0.001), 및 CHAM의 간질 측(사후 시험, p < 0.001)보다 DDHAM의 간질 측 및 상피 측 위에서 세포 접착이 유의하게 더 컸던 한편, DDHAM의 간질 측과 DHAM의 간질 측 간에서(p = 0.219) 세포 접착은 유사하였다.
표 4. 측면 및 양막에 의한 세포 접착. 평균 및 표준 편차가 제공된다.
*상피 측과 간질 측 간에 통계적으로 유의한 차이.
세포 증식:
7일의 배양에 걸쳐 생존 가능한 세포의 수는 유의하게 감소했지만(시간 주 효과; (F(2,54) = 44.880, p < 0.001), 세포 수는 측면, AM, 및 시간에 따라 유의하게 달라졌다(측면 x AM x 시간 상호작용; (F(4,54) = 3.633, p = 0.011). 가장 주목할 만한 점은, 4일 차에 DDHAM의 간질 측을 제외하고, 시간이 지남에 따라 모든 변수에 대해 세포 수가 감소했다는 것이다. 4일 차에, 상대 증식 속도는 DDHAM의 상피 측(52.27 ± 14.41%, p < 0.001), DHAM의 상피 측(12.54 ± 16.79%, p = 0.012), 및 CHAM의 간질 측(15.00 ± 6.73%, p < 0.001) 위에서보다 DDHAM 간질 측(115.29 ± 15.54%) 위에서 유의하게 더 컸다. DDHAM의 간질 측과 CHAM의 상피 측 간에(46.83 ± 25.69%, p = 0.731) 또는 DDHAM의 간질 측과 DHAM의 간질 측 간에(95.54 ± 44.25%, p = 0.430) 상대 증식 속도에서는 유의한 차이가 없었다. 그러나, DHAM의 간질 측은 CHAM의 간질 측보다 유의하게 더 컸다(p = 0.012). 4일 차부터 세포 수에서 감소가 있었음에도 불구하고, 7일 차에 상대 증식 속도는 CHAM의 간질 측(6.87±1.77%, p = 0.035) 및 DHAM의 상피 측(7.54 ± 5.84%, p = 0.017) 위에서보다 DDHAM의 간질 측(59.47 ± 28.48%) 위에서 유의하게 더 컸다.
세포 수도 AM의 상피 측(5,648.00 ± 5,312.56 AU, 측면 주 효과; F(1,54) = 39.545, p < 0.001)보다 간질 측(9,383.33 ± 6,469.15 AU) 위에서 유의하게 더 컸는데, 이는 주로 DDHAM 및 DHAM의 상피 측보다 간질 측 위에서의 유의하게 더 많은 세포에 의해 얻어진다(측면 x AM 상호작용; p < 0.001); DDHAM 간질: 14,972.00 ± 4,973.00 AU 대 DDHAM 상피: 10,438.50 ± 5,555.98 AU, p = 0.047; DHAM 간질: 10,103.33 ± 4,336.49 AU 대 DHAM 상피: 1,590.42 ± 2,431.25 AU, t(22) = 5.932, p < 0.001). 반대로, CHAM은 상피 측(4,915.08 ± 3,072.42 AU) 및 간질 측(3,074.67 ± 3,401.09 AU, p = 0.178) 위에서 세포 수가 유사하였다.
세포 수 또한 AM 간에 유의하게 달랐는데(AM 주 효과; F(2,54) = 79.570, p < 0.001), 이때 CHAM(3,994.88 ± 3,306.13 AU, p < 0.001) 위에서보다 DDHAM(12,705.25 ± 5,652.67 AU) 위에서 유의하게 더 많은 세포가 있었다. DDHAM과 DHAM 간에(5,846.88 ± 5,543.10, P = 0.065) 또는 DHAM과 CHAM 간에(p = 0.085) 세포 수에서는 유의한 차이가 없었다. DHAM 및 CHAM에 대해 유사한 세포 총수(cell count)는 DHAM의 상피 측(1,590.42 ± 2,431.25 AU) 위의 적은 세포 총수로 설명될 수 있으며, 이는 DHAM의 간질 측(10,103.33 ± 4,336.49 AU, p < 0.001), DDHAM의 간질 측(14,972.00 ± 4,973.00 AU, p < 0.001), DDHAM의 상피 측(10,438.50 ± 5,555.98 AU, p < 0.001) 및 CHAM의 상피 측(4,915.08 ± 3,072.42 AU, p = 0.008)보다 유의하게 더 적었다. DHAM의 상피 측 및 CHAM의 간질 측 위에서의 세포 총수는 유사하였다(3,074.67 ± 3,401.09 AU, p = 0.117).
표 5. 측면, 양막, 및 시간에 의한 세포 증식. 평균 및 표준 편차가 제공된다. 형광 강도(AU)로 측정된 세포 증식.
세포 이동:
세포 이동은 AM 간에 유의하게 상이하였는데(AM 주 효과; F(2,49) = 6.819, p = 0.002), 이때 CHAM(344,471.06 ± 106,094.18 px2, p = 0.003)보다 DDHAM(466,085.13 ± 98,339.52 px2) 위에서 세포 이동이 유의하게 더 컸다. 또한, 세포 이동은 DDHAM(p < 0.001), DHAM(420,349.88 ± 95,109.86 px2, p < 0.001), 및 CHAM(p < 0.001)보다 대조군 배지 위에서 유의하게 더 낮았다. 측면의 주 효과는 없었는데, 이는 세포 이동이 AM의 상피 측(421,669.96 ± 113,435.95 px2) 및 간질 측(389,934.08 ± 107,979.51 px2, F(1,49) = 0.701, P = 0.407) 위에서 유사하였음을 나타낸다. 세포 이동은 양막 및 측면 전체에서 통계적으로 상이하지 않았다(p = 0.159).
표 6. 이동 면적. 총수, 평균, 및 표준 편차가 제공된다. 이동 면적은 px2으로 기록된다.
* DDHAM과 비교하여 통계적으로 유의한 차이.
대조군 배지와 비교하여 통계적으로 유의한 차이.
실시예 4: 탈세포화되고 탈수된 인간 양막 유래 생체재료는 인간 각막 상피 세포 기능 및 염증 반응을 지원한다
목적 설명: 상처 치유를 위해 탈세포화된 조직 기반 생체재료를 성공적으로 적용하려면 세포 기능 및 분화를 지원하는 바탕질 성분이 필요하다. 양막(AM)은 안구 치유에 사용하기에 적합하게 하는 독특한 생물학적 특성 및 기계적 특성을 갖는, 인간 태반 조직에서 자연적으로 유래한 생체재료이다(1,2). 이 연구의 목적은 시험관 내에서 인간 각막 상피 세포(HCEC) 기능에 대한 측면성 및 AM 처리 방법론의 효과를 평가하는 것이다. 실험 변수는 AM 측면성(상피 [E] 및 간질 [S]) 및 AM 처리 방법론(탈세포화되고 탈수됨[DDHAM], 탈수됨[DHAM], 및 냉동보존됨[CHAM])을 포함한다. 종속 변수는 HCEC 생존력, 이동, 및 염증 반응을 포함한다.
방법: 하기 3개의 상이하게 처리되고 상업적으로 입수 가능한 안구 AM을 선택하였다: Biovance3L Ocular(DDHAM), Ambio2®(DHAM), 및 AmnioGraft®(CHAM). HCEC를 AM의 E 및 S 측 위에 접종하고, 1, 4 및 7일 동안 인큐베이션하였다. 각 시점에서 alamarBlue 검정을 사용하여 AM 위에서 세포 생존력을 측정하였다. AM 위에서 배양된 HCEC로부터 조절된 배지를 수집하고, 스크래치 상처 검정을 사용하여 HCEC의 이동에 대한 조절된 배지의 효과를 평가하였다. TNFα 처리로 염증 반응을 유도하였다. HCEC에서 전염증성 유전자의 발현에 대한 AM의 효과를 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 비교하였다. 모든 통계 검정의 유의 수준은 p = 0.05에서 설정하였다. 세포 생존력은 양방향 분산 분석(ANOVA)으로, 세포 증식은 3원 ANOVA로, mRNA 발현은 단방향 ANOVA로 분석하였다. 사후 분석을 위해 Tukey 및 짝지어지지 않은 t-검정을 사용하였다.
결과: 1일 차에, 세포 생존력은 CHAM-E & S(p < 0.001) 및 DHAM-E(p ≤ 0.002)보다 DDHAM-E & S 위에서 유의하게 더 높았다. 4일 차에, 세포 생존력은 다른 모든 변수보다 DDHAM-S 위에서 유의하게 더 높았다(p ≤ 0.004, 도 1). 또한, 4일 차에, 세포 생존력은 DDHAM-E와 DHAM-S 간에 비슷했고(p = 0.147), DHAM-E(p ≤ 0.004), CHAM-S & E(p ≤ 0.017)보다 유의하게 더 높았다. 7일 차에, 세포 생존력은 DHAM-E(p = 0.028) 및 CHAM-S & E(p ≤ 0.049)보다 DDHAM-S 위에서 유의하게 더 높았다. 세포 생존력은 DDHAM-E와 다른 모든 변수 간에 유사하였다(p ≥0.097). DDHAM 및 DHAM 위에서 배양된 세포로부터 조절된 배지가 있는 경우 HCEC 이동은 비슷했고(p = 0.885), CHAM 위에서 성장한 세포보다 유의하게 더 컸다(p ≤ 0.005). 흥미롭게도, DDHAM 위에서 배양된 HCEC는 조약돌 형태였고(도 2), 이는 제자리에서 안구 상피 세포의 형태를 모방한다(3). 안구 스캐폴드 위에서 배양된 세포로부터 조절된 배지가 있는 경우 HCEC의 이동은 조직 배양 플라스틱 위에서 성장시킨 세포로부터의 대조군인 조절된 배지보다 유의하게 더 컸다(p< 0.001). 더욱이, TNFα에 의한 염증 자극에 반응하여, DDHAM 위의 HCEC에서 전염증성 사이토카인(IL-6, IL-8 및 TNFα)의 유전자 발현은 초기 증가에 이어, 시간이 지남에 따라 감소를 보였다(도 3).
결론: 이 시험관 내 연구에서, DDHAM-S가 HCEC 생존력 및 이동을 가장 잘 지원하였다. DDHAM의 존재는 또한 시간이 지남에 따라 HCEC의 염증 반응을 약화시켰다.
참고문헌:
1. Walkden A. Clin Ophthalmol. 2020;14:2057-2072.
2. Malhotra C. World J Transplant. 2014;4(2):111-121.
3. M. Br J Ophthalmol. 2007;91(3):372-378.
실시예 5: 상이하게 설계된 안구 양막에 대한 인간 각막 상피 세포 활동 및 염증 반응의 시험관 내 비교, 및 임상 사례 연구
양막(AM)은 안과학에 중요한 생물학적 특성 및 기계적 특성을 갖는 자연적으로 유래한 생체재료이다. AM의 상피 측은 상피화를 촉진하는 반면, 간질 측은 염증을 조절한다. 그러나, 모든 AM이 동일한 것은 아니다. AM은 상이한 처리를 거쳐서 세포 내용물 및 구조에서 변화가 얻어진다. 이 연구는, 인간 각막 상피 세포(HCEC) 활동에 대한 측면성 및 처리의 효과, 및 HCEC 염증 반응에 대한 처리의 효과를 평가한 다음, 사례 연구를 제시한다. 하기 3개의 상이하게 처리되고 상업적으로 입수 가능한 안구 AM을 선택하였다: (1) Biovance3L Ocular, 탈세포화되고 탈수된 인간 AM(DDHAM), (2) AMBIO2®, 탈수된 인간 AM(DHAM), 및 (3) AmnioGraft®, 냉동보존된 인간 AM(CHAM). HCEC를 AM 위에 접종하고, 1, 4 및 7일 동안 인큐베이션하였다. alamarBlue 검정을 사용하여 세포 접착 및 생존력을 평가하였다. HCEC 이동은 스크래치 상처 검정을 사용하여 평가하였다. TNFα 처리로 염증 반응을 유도하였다. HCEC에서 전염증성 유전자의 발현에 대한 AM의 효과를 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 비교하였다. 염색을 통해 DDHAM에서 완전한 탈세포화 및 핵의 부재를 확증하였다. HCEC 활동은 DDHAM의 간질 측 위에서 가장 잘 지원되었다. 염증 자극 하에서, DDHAM은 시간이 지남에 따라 감소하는 경향을 가지면서 더 높은 초기 염증 반응을 촉진하였다. 임상적으로, DDHAM을 사용하여 전방 기저 막 이영양증을 성공적으로 치료하였다. DHAM 및 CHAM과 비교하여, DDHAM은 시험관 내에서 HCEC의 세포 활동에 유의한 긍정적인 효과를 미쳤으며, 이는 생체 내에서 더 큰 안구 세포 친화성(compatibility)을 시사할 수 있다.
도입: 양막(AM)은, 안과학에 사용하기에 특히 적합하게 하는 독특한 생물학적 특성 및 기계적 특성을 갖는 자연적으로 유래한 생체재료이다(Leal-Marin 등 2021; Walden, 2020; Liu 등 2019; Malhotra & Jain, 2014; Fernandes 등 2005). 양막 조직은 상피화 촉진(Shayan 등 2019; Meller 등 2002; Meller 등 1999), 염증 감소(Sharma 등 2016; Tabatabaei 등 2017; Tandon 등 2011), 흉터 조직 형성 억제(Niknejad 등 2008, Tseng 등 1999 Lee 등 2000), 새로운 혈관 차단(Hao 등 2000), 및 항균제로 작용하는 능력(Mamede & Botelho, 2015; Tehrani 등 2013; Sangwan 등 2011; Kjaergaard 등 2001; Kjaergaard 등 1999, Inge 등 1991)을 통해 안구 표면의 치유 및 재건을 촉진하는 것으로 생각된다. 안과학에서, AM은 다양한 안구 병태를 치료하는 데 널리 사용된다. 임상적으로, AM은 수술용 패치로, 손상된 안구 조직을 대체하는 기질로, 또는 패치 및 기질 둘 다로 조합하여 사용될 수 있다.
패치로서, AM은 임시 생물학적 붕대 또는 콘택트 렌즈 역할을 하여, 패치 아래 숙주 조직의 재상피화를 촉진하고(Walden, 2020, Malhotra & Jain, 2014), 간질 측이 아래로 향하게 배치하여 염증 세포를 포획하고 세포자멸사를 유도함으로써 염증 반응을 하향 조절한다(Dua 등 2004; Shimmura 등 2001). AM을 상피 측이 위로 향하게 배치함으로써, AM은 상피 세포 이동 및 성장을 위한 기질 및 스캐폴드 역할을 한다(Malhotra & Jain, 2014). 재상피화를 촉진하기 위해 AM을 상피 측이 위로 향하게 배치해야 함(Hu 등 2003)이 널리 받아들여지고 있지만, 막의 간질 측은 상피 세포 성장을 지원하는 것으로 밝혀졌다(Seitz 등 2006). 특히, 기존 연구의 대부분은 냉동보존된 AM으로 제한되며, 이들 발견이 상이한 처리 방법론을 거쳤던 다른 AM에도 적용되는지 여부는 불분명하게 남아있다.
임상 적용에 앞서, AM을 멸균시키고, 세포 내용물 및 구조에서 변화가 얻어지도록 처리한다(Leal-Marin 등 2021; 등 2004; Lim 등 2010). 이 조직은 직접 사용될 수 있거나, 추가적인 탈세포화 과정을 거칠 수 있다(Tehrani 등 2021). 탈세포화는, 세포외 바탕질(ECM)의 자연적인 구조적 및 화학적 요소를 보유하면서, 면역 반응을 방지하도록 내인성 세포, 세포 파편, 및 DNA 잔여물을 제거하는 과정이다(Gholipourmalekabadi 등 2015). 이전 연구는, ECM 생성물 내 잔여 DNA 양과 숙주 염증 반응 간의 상관관계를 입증하였다(Keane 등 2012; Seif-Naraghi 등 2013). 조직의 보존과 마찬가지로, 탈세포화도 ECM 내의 구조 및 실재에 영향을 미칠 수 있다(Aamodt & Grainger, 2016). 따라서, 성공적인 보존-탈세포화 프로토콜은 세포 물질의 제거와 ECM의 선천적 특성 및 기능적 특성 유지를 섬세하게 균형 맞춰야 한다(Gholipourmalekabadi 등 2015; Aamodt & Grainger, 2016; Balestrini 등 2015). 우리가 아는 한, 상이한 보존-탈세포화 프로토콜이 인간 각막 상피 세포(HCEC)의 세포 활동 및 염증 반응에 어떻게 영향을 미치는지를 평가한 연구는 없다.
이 프로젝트는 처음으로, 하기를 평가하는 것을 목표로 한다:
HCEC의 세포 활동(즉, 접착, 생존력, 및 이동)에 대한 양막 측면성(즉, 상피 대 간질) 및 처리 방법론의 효과,
HCEC의 염증 반응(즉, 전염증성 사이토카인의 발현)에 대한 상이한 처리 방법론의 효과.
그러므로, 하기 3개의 상이하게 처리된, 상업적으로 입수 가능한 안구 AM을 비교를 위해 사용하였다:
Biovance3L Ocular(Celularity, Florham Park, NJ), 탈세포화되고 탈수된 인간 양막(DDHAM),
AMBIO2®(Katena, Parsippany, NJ), 탈수된 인간 양막(DHAM),
AmnioGraft®(Biotissue, Miami, FL), 냉동보존된 인간 양막(CHAM).
Biovance®3L Ocular는 3층 DDHAM이다. 이는 간질 측이 바깥 측을 향하도록 독특하게 설계되어 있다. 따라서, 간질 측은 이것의 배향에 관계없이 안구 표면과 인터페이스된다. 또한, 3개의 층을 사용하면 이것의 취급 특성이 향상된다. AM을 적격 기간의 태반에서 절제하고, 세척하고, 긁어내어 외부 조직 및 세포를 제거한다. 그런 다음, 삼투압 충격을 사용하여 조직을 탈세포화한 다음, 중성 세제 처리, 건조 및 멸균시킨다. 이전 연구는, 이 독점적인 탈세포화 과정이 잔여 세포, 세포 파편, 성장 인자, 및 사이토카인을 제거하는 한편, 높은 콜라겐 함량 및 주요 생체활성 분자, 예컨대 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 및 엘라스틴을 갖는 ECM 구조를 보존함을 확인하였다(Bhatia 등 2007).
AMBIO2®는 무균 처리된 단일 층 DHAM이다. 탈수 과정은 수분을 제거하는 한편, 구조적 바탕질, 및 성장 인자 및 사이토카인을 포함한 조직의 생물학적 성분은 보존한다(Instructions for Use, 2021).
AmnioGraft®는 단일 층 CHAM이다. AM은 독점적인 냉동보존 방법인 CRYOTEK®를 사용하여 보존된다. 냉동보존 보존 과정은 양수 상피 세포를 생존 불가능하게 만드는 한편, 세포 구조를 온전하게 유지하고 성장 인자 및 사이토카인을 보존한다(Rodriguez-Ares 등 2009).
DDHAM은 이것의 천연 ECM을 보유하며, 모든 세포 구성요소, DNA, 성장 인자 및 사이토카인은 없다. 따라서, 저자는 DDHAM이 잔여 DNA 및 기타 세포 구성요소를 함유하는 다른 2개의 안구 AM과 비교하여 HCEC의 세포 활동 및 염증 반응을 지원하는 더욱 세포 친화적인 바탕질을 제공할 것임을 가정한다. 이 시험관 내 연구로부터의 결과는, 양막 조직의 보존 및 탈세포화가 인간 안구 상피 세포의 활동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 기본적인 이해를 더욱 심화시킬 것이다. 이는 또한 각막 및 결막 관련 손상 또는 결손, 예컨대 각막 상피 결손 치유, 익상편 복구, 원개 재건, 및 기타 안구 시술을 지원하기 위해 DDHAM의 임상 적용을 명료하게 하는 가능성을 갖는다.
재료 & 방법: 시험 재료는 상업적으로 입수 가능한 제품이며 이 연구는 인간 대상체(기증자)와의 직접적인 상호작용을 필요로 하지 않았기 때문에, 기관 검토 위원회의 승인이 필요하지 않았다.
안구 AM: 하기 3개의 안구 AM을 이 연구에 사용하였다: DDHAM, DHAM, 및 CHAM. DDHAM(로트 번호 OCLR0010) 및 DHAM 샘플을 실온에서 보관하였다. CHAM 샘플은 -80℃에서 보관하였다. 모든 AM은 제조업체의 지침에 따라 다루었다. DDHAM 샘플은 개별 포장된 10 mm 디스크로 제공되었다. 따라서, 10 mm 생검 펀치(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 DHAM 시트로부터 10 mm 디스크를 만들었다. CHAM의 각 조각(5 cm x 10 cm)을 해동하고, 10분(min) 동안 페트리 접시에 있는 20 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 동결보호제를 제거하고, 10 mm 생검 펀치를 사용하여 세척된 AM으로부터 10 mm 디스크를 만들었다. DDHAM은 양면 위에서 AM의 간질 측이 바깥 측을 향하고 있는 다층(3층)이다. DDHAM의 측면성을 평가하기 위해, 양면 위에서 AM의 상피 측이 바깥 측을 향하도록 상이하게 설계된 버전 DDHAM(E)을 제조하였다(3개 층). 각 AM 샘플의 10 mm 디스크를, AM의 간질 측 또는 상피 측이 세포와 접촉하게 하여 48웰 플레이트(1 디스크/웰)(Cell-Repellent 48-Well Microplate, Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA)의 웰에 배치하였다. AM을 제자리에 고정하기 위해 폭 2 mm, 내부 직경 7 mm로 측정되는 멸균 O-링(McMaster-Carr, Robbinsville, NJ, USA)을 각 AM의 상단 위에 배치하였다. 양막을 세포로 접종하기 전에 37℃에서 2시간(h) 동안 양막을 성장 배지(0.4 mL/웰)로 사전 조절하였다. 각 유형의 AM에 대해 적어도 2개의 로트(공여체)를 이 연구에 사용하였다. 각각의 독립적인 실험에서, 각 AM으로부터의 4개 샘플(n=4)을 사용하였는데, 이 중 2개 샘플은 한 로트에서, 2개 샘플은 다른 로트에서 가져왔다. 각 개별 검정에 대해 적어도 2회의 독립적인 실험을 수행하였다.
1차 세포: 인간 각막 상피 세포(HCEC, 카탈로그 번호 PCS-700-010 로트 번호 80915170), 각막 상피 세포 기저 막, 및 각막 상피 세포 성장 키트를 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. HCEC에 대한 완전 성장 배지를 제조업체의 지침에 따라 제조하였다.
AM으로의 세포 접착의 평가: 통로 4(P4)에서의 HCEC를 제조업체의 지침에 따라 10 cm 세포 배양 접시에서 80% 합류점까지 배양하였다. 세포를 5 mL 인산염 완충 식염수(PBS)/접시로 1회 헹구었다. 0.25% 트립신(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 1 ml를 각 접시에 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 10% FBS를 함유하는 최소 필수 배지-알파(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 배지 2 ml를 상기 접시에 첨가하여 트립신을 중화시켰다. 세포를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 1000 RPM(Revolutions Per Minute: 분당 회전수)에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 완전 성장 배지에 재현탁시키고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다.
HCEC(2 x 104/웰)를 사전 조절된 AM을 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 인큐베이션하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 접착된 세포의 생존력을 alamarBlue 검정을 사용하여 검출하였다. 간단히 말해, 완전 성장 배지 + 10% alamarBlue 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 구성되는 0.2 mL/웰의 alamarBlue 용액을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 0.1 mL/웰의 상청액을 96웰 플레이트로 옮겼다. 여기/방출(Ex/Em) = 540 nm/590 nm에서 다중모드 마이크로플레이트 판독기(Spark®, TECAN, 스위스)를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 형광 강도는 임의 단위(AU)로 표시되었다.
AM 및 세포의 염색: AM의 구조적 특징을 시각화하기 위해, 3개의 다양한 AM을 재수화하고 세척하고, Tissue-Tek O.C.T. 화합물(Sakura, Torrance, CA, USA)에 수직으로 삽입하였다(embededed). Leica CM1850 저온유지장치(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA)를 사용하여 5개의 마이크론/슬라이스 냉동절편을 만들었다. 현미경 슬라이드 위의 냉동절편을 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 1시간 동안 고정시키고, PBS 중의 0.5% Triton X100에서 1시간 동안 침투시켰다. 고정되고 침투된 샘플을 항인간 I형 항체(ab34710, Abcam, Cambridge, MA, USA)로 밤새 염색하였다. 그런 다음, 샘플을 Alexa Fluor 555-항토끼 IgG, Alexa 488-팔로이딘(Life Technology, Carlsbad, CA, USA) 및 Hoechst 염료 33258(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 60분 동안 염색하였다. 염색 후, ProLong Gold Antifade Mountant(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 있는 경우에 각 샘플 위에 커버슬립을 장착하였다.
상이한 AM 위의 생존 가능한 세포를 시각화하기 위해, "양막으로의 세포 접착의 평가"에서 설명된 대로 1일 또는 4일 동안 HCEC를 상이한 AM 위에서 배양하였다. 각 시점에서, 각 웰에서 배지를 제거하고, 50 nM Calcein AM(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 함유하는 새로운 완전 성장 배지 0.2 mL/웰을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 영상화할 준비를 했다.
세포 형태를 시각화하기 위해, 4일 동안 상이한 AM 위에서 배양한 HCEC 세포를 4% 파라포름알데하이드로 1시간 동안 고정시키고, PBS 중의 0.5% Triton X100에서 1시간 동안 침투시켰다. 고정되고 침투된 세포를 Alexa 488-팔로이딘(Life Technology, Carlsbad, CA, USA)으로 30분 동안 염색하고, 에피-형광 현미경(Zeiss Observer D1, Jena, Germany) 하에서 관찰하였다.
AM의 H & E 염색: AM의 냉동절편을 60℃에서 밤새 구운 다음, 4% 파라포름알데하이드에서 30분 동안 고정시키고, PBS로 3회 헹구었다. 샘플을 Harris Hematoxylin Solution(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)에서 10분 동안 염색하고, 흐르는 수돗물에서 1분 동안 헹구었다. 그런 다음, 슬라이드를 분화 용액(진한 염산 0.25 mL 내지 70% 알코올 100 mL)에 2회 액침시켰다. 그 후, 슬라이드를 흐르는 수돗물에서 1분 동안 헹군 다음, Scott's Tap Water Substitute(1% 황산마그네슘(MgSO4) 및 0.06% 중탄산나트륨)에 60초 동안 액침시켰다. 95% 시약 알코올로 30초간 세척한 후, 샘플을 알코올성 에오신 Y 용액(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 68178)에서 10분 동안 대조염색하였다. 염색이 완료되면, 슬라이드를 100% 무수 에탄올로 3회 세척한 후, Histoclear II로 3회 세척하여 탈수시켰다. Permount 장착 매체(Fisher Scientific Inc.)를 사용하여 슬라이드를 장착시키고, Zeiss Axio Observer A1 현미경을 사용하여 영상화하였다.
시간이 지남에 따른 AM 위의 세포 생존력의 평가: 사전 조절된 AM을 함유하는 48웰 플레이트의 각 웰에 HCEC(1 x 104/웰)를 첨가하였다. 각 세포 유형에 대해 3개 세트의 플레이트를 준비하고, 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 1일, 4일 및 7일 동안 인큐베이션하였다. 제1 시점에서, 모든 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 제1 플레이트 세트에서의 세포 생존력을 alamarBlue 검정을 사용하여 측정하였다. 제2 및 제3 플레이트 세트는 37℃에서 배양하였다. 제2 시점에서, 제2 플레이트 세트에서의 세포 생존력을 측정하였다. 제3 플레이트 세트를 37℃의 새로운 배지에서 배양하였다. 제3 플레이트 세트에서의 세포 생존력을 제3 시점에서 alamarBlue 검정을 사용하여 측정하였다.
이동 검정을 위한 조절된 배지: 시험 조건에서, 사전 조절된 AM을 함유하는 48웰 플레이트의 각 웰에 HCEC(2 x 104/웰)를 첨가하였다. 대조 조건에서는, 사전 조절된 AM에 HCEC를 첨가하지 않았다. 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하였다. 0.4 mL/웰의 새로운 성장 배지를 세포가 있거나 없는 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상청액(24시간 동안 조절된 배지)을 각 웰에서 수집하고, 이동 검정을 위해 즉시 사용하였다. AM의 간질 측을 이 실험에 사용하였다.
스크래치 상처 이동 검정: 5 x104/웰 HCEC를 조직 배양 처리된 폴리스티렌 48웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 2일 동안 배양하였다. 멸균시킨 금속 막대의 끝을 사용하여 융합성 단층 위에 스크래치 상처를 만들었다. 배지를 제거하고, AM 위에서 배양된 세포로부터 수집한 조절된 배지를 상기 상처에 첨가하였다. 상처 면적의 이미지를 0시간에 포착하였다. 각 시험 군에 대해 최소 4개의 면적을 모니터링하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 정확히 동일한 상처 면적(참조 마커가 있음)를 24시간에 영상화하였다. ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 임의 단위(픽셀 제곱, px2)로 상처 면적을 측정하였다. 이동 면적 =면적0시간-면적24시간.
HCEC의 염증 반응의 자극: 2 x104/웰 HCEC를 접종하고, 상이한 AM 위에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 새로운 배지 "-종양 괴사 인자-알파(TNF-α)" 또는 10 ng/mL의 인간 TNF-α(카탈로그 번호 300-01A, PeproTech Cranbury, NJ) "+TNF-α"를 함유하는 새로운 배지를 세포에 첨가하고, 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 인큐베이션하였다. 각 시점에서, 다중 분석을 위해 상청액을 수집하고, 아래에 설명된 대로 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 세포를 0.2 mL의 RNA 용해 완충액(Promega, Durham, NC)에 용해하였다.
qPCR에 의한 상대적 mRNA 발현의 평가: qPCR에 의한 사이토카인의 상대적 유전자 발현의 정량화를 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다(Mao 등 2021). 간단히 말해, 세포 용해물로부터의 총 RNA를 SV 96 Total RNA Isolation System(Promega)을 사용하여 정제하였다. RNA 농도 및 순도를 TECAN Spark Nano plate(TECAN, Morrisville, NC)를 사용하여 측정하였다. cDNA 제조 및 qPCR은 설명된 대로 수행하였다(Mao 등 2017). 이 연구에 사용된 하기 qPCR용 프라이머를 QuantiTect(Qiagen, Germantown, MD)에서 구입하였다: 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: QT00000896), 인터루킨 6(IL-6: QT00083720), 인터루킨-8(IL-8: QT00000322), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α: QT01079561), 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH: QT01192646). 각 샘플은 이중으로 실행하였다. 실행이 완료된 후, 원시 데이터를 사용하여 2차 미분 분석을 수행하여 각 샘플의 평균 Cp(교차점-PCR-주기)를 결정하였다. 각 유전자 발현에 대해, GAPDH의 발현이 내부 통제(internal control) 역할을 했다. 상대적 mRNA 발현을 Pfaffl 분석(EΔCp 표적/EΔCp 참조)으로 결정하였고, 여기서 프라이머 효율 E= 10^(-1/기울기) 및 ΔCp= 샘플의 평균 Cp - 대조군의 평균 Cp. 조직 배양 폴리스티렌(TCP) 위에서의 세포 발현 또는 24시간째 세포의 발현을 분석을 위한 "대조군"으로 사용하였고, 이는 "결과"에서의 특정 분석에서 정의되었다.
통계적 방법: HCEC 활동의 평가에서, 독립 변수는 AM(DDHAM, DHAM, CHAM), 측면(상피, 간질), 및 시간(1일, 4일, 및 7일)이었다. 종속 변수는 세포 접착, 세포 생존력, 및 이동이었다. mRNA 발현에 의한 HCEC 염증 반응의 평가에서, 독립 변수는 양막(DDHAM, DHAM, CHAM, 대조군[TCP]), 조건(휴지, 자극), 및 시간(24시간, 48시간, 및 72시간)이었다. 단백질 수준에 의한 HCEC 염증 반응의 평가에서, 독립 변수는 양막(DDHAM, DHAM, CHAM, 대조군[TCP]) 및 조건(휴지, 자극, AM만)이었다. 종속 변수는 사이토카인(GM-CSF, IL-6, IL-8 및 TNF-α)의 상대적 mRNA 발현, 및 사이토카인 및 케모카인(GM-CSF, IL-1β, IL-1RA, IL-6, IL-8, TGFβ2, 및 VEGF)의 단백질 수준이었다.
모든 분석을 IBM SPSS(Build 1.0.0.1444)를 사용하여 수행하였다. 모든 통계 검정의 유의 수준은 p = 0.05에서 설정하였다. 데이터를 시험하였고, 정규 분포를 따르는 것으로 밝혀졌다. Tukey 사후 시험을 사용한 양방향 분산 분석(ANOVA)으로 세포 접착 및 이동을 분석하였다. 세포 증식은 Tukey 사후 시험을 사용한 3원 ANOVA로 분석하였다. 24시간에서의 상대적 mRNA 발현을 Tukey 사후 시험을 사용한 양방향 ANOVA로 분석하여, 각 시험 조건에서 각 종속 변수를 평가하였다. 시간이 지남에 따른 상대적 mRNA 발현을 Tukey 사후 시험을 사용한 일원 ANOVA로 분석하여, 각 시험 조건에서 각 종속 변수를 평가하였다. 다중 비교를 위해 Sidak 보정을 사용한 간단한 주 효과 분석으로 유의한 상호작용을 평가하였다. 데이터는 본문 및 도면 내에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 기록되어 있다.
결과:
AM의 구조: 이들 3개의 AM의 구조를 평가하기 위해, AM의 단면을 세포 구성요소(DNA 및 액틴) 및 ECM(I형 콜라겐)에 대해 염색하였다(도 8a). DHAM 및 CHAM에서 강한 핵 염색 및 액틴 염색이 검출되었던 한편, DDHAM에서는 액틴 염색도 핵 염색도 검출되지 않았다. 유형 I 콜라겐의 존재는 3개의 모든 AM에서 검출되었다. 3개의 AM의 H & E 염색(도 8b)은, DHAM 및 CHAM과 비교하여 DDHAM에서 완전한 탈세포화 및 핵의 부재를 확증하였다. DHAM은 어두운 청색의 핵 잔여물의 빈약한 염색을 보였던 한편, CHAM은 핵에 대한 온전한 어두운 청색 염색을 보였는데 이는 세포의 존재를 나타낸다.
상이한 AM 위에서 HCEC의 접착: 상이한 AM 및 AM의 상이한 측면 상의 세포 접착을 24시간에서의 세포 생존력(접착된 세포의 양을 반영함)을 비교하여 평가하였다. 형광 강도는 임의 단위(AU)로 표시되었다.
측면성의 효과. 세포 접착은 AM의 상피 측 위에서보다 간질 측 위에서 더 컸고(측면 주 효과, p = 0.018), 이는 DHAM의 간질 측과 비교하여 DHAM의 상피 측 위의 더 낮은 세포 접착으로 설명될 수 있다(p < 0.001, 측면 x AM, p = 0.001; 도 9). DDHAM의 상피 측과 간질 측 간에(p = 0.822) 또는 CHAM의 상피 측과 간질 측 간에(p = 0.645) 유의한 차이가 없었다.
AM의 효과. 또한, AM 간에 세포 접착에서는 유의한 차이가 있었는데(AM 주 효과, p < 0.001), 이때 DHAM(p < 0.001) 및 CHAM(p < 0.001) 위에서보다 DDHAM 위에서 세포 접착이 유의하게 더 컸다. 그러나, 이전에 표시된 바와 같이, 세포 접착은 측면 및 AM에 따라 달라졌다(p = 0.001; 도 9). 상피 측 위에서는, DHAM(p < 0.001) 및 CHAM(p < 0.001) 위에서보다 DDHAM 위에서 세포 접착이 유의하게 더 컸고, CHAM과 DHAM 간에는(p = 0.076) 유의한 차이가 없었다. 간질 측 위에서는, DDHAM(p < 0.001) 및 DHAM(p = 0.014) 위에서보다 CHAM 위에서 세포 접착이 유의하게 더 낮았고, DDHAM과 DHAM 간에는(p = 0.207) 유의한 차이가 없었다. 이들 결과는, 이들 3개의 AM 중에서 DDHAM의 상피 측 및 간질 측이 세포 접착을 가장 잘 지원하였음을 나타낸다.
4일 차에 상이한 AM 위에서 HCEC의 생존력 및 형태: 상피 세포의 라이브 염색(Live Staining). 상이한 AM(DDHAM, CHAM, DHAM)의 간질 측 위에서 HCEC의 생존력을 세포 접종 후 4일에 관찰하였다(도 10). 정량적 결과와 일치되게, DDHAM 및 DHAM 위의 HCEC는 세포 접종 후 4일 차에 접착되고 확산되었던 것으로 보였던 반면, CHAM 위의 HCEC는 무질서하고 이질적인 형태를 채택한 것으로 보였다. AM 위의 HCEC의 형태를 4일 차에 액틴 염색으로 모니터링하였다(도 10). DDHAM 위의 HCEC는 조밀한 액틴 링 구조를 갖는 조약돌 형태를 채택하였다.
시간이 지남에 따른 상이한 AM 위에서 세포 생존력: 상이한 AM 위에서 세포의 생존력을 7일까지 모니터링하였다. 7일의 배양에 걸쳐 생존 가능한 세포의 수는 유의하게 감소했지만(시간 주 효과, p < 0.001), 세포 생존력은 측면, AM, 및 시간에 따라 유의하게 달라졌다(측면 x AM x 시간 상호작용, p = 0.011). 가장 주목할 만한 점은, 4일 차에 DDHAM의 간질 측을 제외하고, 시간이 지남에 따라 모든 변수에 대해 세포 생존력이 감소했다는 것이다(도 11a).
측면성의 효과. 세포 생존력은 또한 AM의 상피 측 위에서보다 간질 측 위에서 유의하게 더 컸으며(측면 주 효과, p < 0.001), 이는 4일 및 7일 차에 측면 간에 상대적 세포 생존력에서의 차이로 설명될 수 있다(도 11b). 4일 차에, 상대적 세포 생존력은 DDHAM의 상피 측보다 DDHAM의 간질 측 위에서 유의하게 더 높았고(p < 0.001), 상대적 세포 생존력은 DHAM의 상피 측보다 DHAM의 간질 측 위에서 유의하게 더 컸다(p < 0.001). 반대로, 상대적 세포 생존력은 CHAM의 간질 측보다 CHAM의 상피 측 위에서 유의하게 더 컸다(p = 0.039). 7일 차에, DDHAM(p = 0.102) 또는 CHAM(p = 0.157)의 상피 측과 간질 측 간에 상대적 세포 생존력에서는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 상대적 세포 생존력은 DHAM의 상피 측보다 DHAM의 간질 측 위에서 유의하게 더 컸다(p < 0.001).
AM의 효과. 세포 수는 또한 AM 간에 유의하게 상이하였는데(AM 주 효과, p < 0.001), 이때 DHAM(p < 0.001) 및 CHAM(p < 0.001) 위에서보다 DDHAM 위에서 유의하게 더 많은 생존 가능한 세포가 있었고, CHAM(p = 0.036)보다 DHAM 위에서 유의하게 더 많은 생존 가능한 세포가 있었다. AM의 주 효과는 4일 및 7일 차에 상대적 세포 생존력에서의 유의한 차이로 주로 설명된다(도 11b).
4일 차에 상피 측 위에서, 상대적 세포 생존력은 DHAM(p = 0.032) 위에서보다 DDHAM 위에서 유의하게 더 컸던 한편, 상대적 세포 생존력은 DDHAM과 CHAM 간에(p = 0.978) 그리고 CHAM과 DHAM 간에(p = 0.077) 유사하였다. 7일 차에 상피 측 위에서, 3개의 양막 간에는 유의한 차이가 없었다(p ≥ 0.219).
4일 차에 간질 측 위에서, 상대적 세포 생존력은 CHAM(p < 0.001) 위에서보다 DDHAM 위에서 유의하게 더 컸고, 상대적 세포 생존력은 CHAM(p < 0.001) 위에서보다 DHAM 위에서 유의하게 더 컸다. 4일 차에 DDHAM과 DHAM 간에(p = 0.477) 간질 측 위에서 상대적 세포 생존력에서는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 7일 차에 간질 측 위에서, 상대적 세포 생존력은 DDHAM(p = 0.003) 및 DHAM(p = 0.002) 위에서보다 CHAM 위에서 유의하게 더 낮았다. 상피 측과 마찬가지로, 7일 차에 간질 측 위에서는 DDHAM과 DHAM 간에(p = 0.999) 상대적 세포 생존력에서는 유의한 차이가 없었다.
AM의 간질 측 위에서 세포 생존력이 더 높다는 것과 DHAM 및 CHAM과 비교하여 DDHAM 위에서 생존력이 더 잘 유지된다는 발견은, 세포 생존력이 DDHAM의 간질 측 위에서 가장 잘 유지되었음을 시사한다.
상이한 AM 위에서 HCEC의 이동: HCEC가 없는 상이한 AM으로부터의 조절된 배지를 시험하여, HCEC의 이동에 대한 AM 단독의 효과를 평가하였다. 또한, 상이한 AM 위에서 배양된 HCEC에 의해 방출된 인자(factor)가 세포 이동에 영향을 미치는 지 결정하기 위해, 세포가 있는 경우에 AM 간에 이동에서의 차이를 비교하였다. AM 위에서 배양된 세포를 24시간 동안 조절하였다. 상이한 AM으로부터의 조절된 배지가 있는 경우에 HCEC의 이동을 스크래치 상처 검정을 사용하여 평가하였다. 상처 봉합(wound closure)을 24시간 동안 모니터링하였다(도 12a 및 12b).
양막의 효과와 세포의 존재 간에는 유의한 상호작용이 있었다(p = 0.006; 도 12a 및 12b). 이동은 DDHAM(p = 0.009) 및 DHAM(p < 0.001) 위에서 세포가 없는 경우보다 세포가 있는 경우가 유의하게 더 높았다. 세포 유무에 관계없이 CHAM(p = 0.291) 위에서 또는 대조군(p = 0.265) 위에서의 이동은 유의하게 상이하지 않았다.
AM의 효과. 또한, 세포가 있는 경우에 수집된 조절된 배지(CM) 중에서, DDHAM(p = 0.004) 및 DHAM(p = 0.002) 위에서보다 CHAM 위에서 세포로부터 CM에서의 이동은 유의하게 더 낮았다. DDHAM과 DHAM 간에서(p = 1.000) 이동에서는 유의한 차이가 없었다. 세포가 있는 경우의 대조군과 비교하여, DDHAM(p < 0.001), DHAM(p < 0.001), 및 CHAM(p = 0.005) 위에서 세포로부터 CM에서의 이동은 유의하게 더 높았다.
HCEC에서 염증성 사이토카인의 유전자 발현: AM의 간질 측이 염증 반응을 조절하는 것으로 보고되었기 때문에(Dua 등 2004; Shimmura 등 2001), HCEC의 염증 반응에 대한 이들 3개의 AM의 간질 측의 효과를 평가하였다. GM-CSF, IL-6, IL-8 또는 TNF-α를 포함하여 상처 치유에서 이전에 입증된 역할을 갖는 사이토카인을 선택하였다(Rho 등 2015; Arranz-Valsero 등 2014; Ebihara 등 2011; Nishida 등 1992; Hafezi 등 2018; Strieter 등 1992; Koch 등 1992; Wang 등 2020; Yang 등 2019). 이를 위해, 시험관 내 염증 조건 하에서 HCEC의 염증 반응을 24시간 동안 TNF-α로 자극함으로써 모방하였다. 상이한 AM 위에서의 HCEC에서 GM-CSF, IL-6, IL-8, 또는 TNF-α의 유전자 발현(상대적 mRNA 수준)을 표준 세포 배양 표면, TCP 위에서 배양된 세포에서의 유전자 발현과 비교하여 qPCR로 평가하였다.
GM-CSF. 24시간에 GM-CSF의 발현은 자극 조건(±TNFα) 및 AM(p = 0.049)에 의해 유의하게 달라졌다(도 13a). 자극을 사용하는 경우, GM-CSF의 발현은 DDHAM(p = 0.226), CHAM(p = 0.664), 또는 TCP(p = 0.827)가 아니라 DHAM(p < 0.001) 위에서 유의하게 증가하였다. 휴지 조건에서 양막 간에 GM-CSF의 발현을 비교한 결과 DDHAM, DHAM, CHAM, 및 TCP(p≥0.134) 위에서 GM-CSF이 유사한 발현을 보였다. 자극된 조건에서 양막 간에 GM-CSF의 발현을 비교한 결과 DDHAM(p = 0.001), CHAM(p < 0.001), 및 TCP(p < 0.001) 위에서보다 DHAM 위에서 유의하게 더 큰 발현을 보였다.
IL-6. 24시간에 IL-6의 발현은 자극 조건 및 양막에 의해 유의하게 달라졌다(p = 0.002)(도 13b). 자극을 사용하는 경우, IL-6의 발현은 DHAM(p = 0.128)이 아니라, DDHAM(p < 0.001), CHAM(p = 0.017), 및 TCP(p = 0.014) 위에서 유의하게 증가하였다. 휴지 조건에서 양막 간에 IL-6의 발현을 비교한 결과 DDHAM, DHAM, CHAM 및 TCP(p ≥ 0.717) 위에서 IL-6의 유사한 발현을 보였다. 자극된 조건에서, DHAM(p < 0.001), CHAM(p < 0.001), 및 TCP(p < 0.001) 위에서보다 DDHAM 위에서 IL-6의 유의하게 더 높은 발현이 있었다. 다른 유의한 차이점은 발견되지 않았다.
IL-8. 24시간에 IL-8의 발현은 자극 조건 및 AM에 의해 유의하게 달라지지 않았지만(p = 0.188), 자극 조건(p < 0.001) 및 AM(p = 0.002)에 대한 주 효과가 있었다. IL-8의 전체 발현은 자극과 함께 유의하게 증가하였다. 사후 분석은, 전체 IL-8 발현이 CHAM(p = 0.018) 및 TCP(p = 0.014)보다 DHAM 위에서 그리고 CHAM(p = 0.022) 및 TCP(p = 0.017)보다 DDHAM 위에서 유의하게 더 컸었음을 나타냈다. DHAM과 DDHAM 간에(p = 1.000) 또는 CHAM과 TCP 간에(p = 0.999) IL-8 발현에서는 유의한 차이가 없었다.
TNFα. 24시간에 TNFα의 발현은 자극 조건 및 AM에 의해 유의하게 달라지지 않았지만(p = 0.194), 자극 조건(p = 0.001) 및 AM(p < 0.001)에 대한 주 효과가 있었다(도 13d). TNFα의 전체 발현은 자극과 함께 유의하게 증가하였다. 사후 분석은, 전체 TNFα 발현이 CHAM(p < 0.001) 및 TCP(p < 0.001)보다 DDHAM 위에서, 그리고 CHAM(p = 0.022) 및 TCP(p = 0.024)보다 DHAM 위에서 유의하게 더 컸었음을 나타냈다. DDHAM과 DHAM 간에(p = 0.095) 또는 CHAM과 TCP 간에(p = 1.000) TNFα 발현에서는 유의한 차이가 없었다.
이들 결과는, 24시간에, DDHAM 및 DHAM의 존재가, CHAM 또는 TCP 위에서의 세포보다, HCEC에서 GM-CSF, IL-6, IL-8, 및 TNF-α의 발현을 더 많이 자극하였음을 나타낸다.
시간이 지남에 따른 HCEC에서 염증성 사이토카인의 유전자 발현: 염증 반응은 동적 과정이다. 상이한 시점에서 사이토카인의 발현은 상처 치유 과정에서의 단계를 나타낸다. 72시간의 시간 과정에 걸친 사이토카인의 발현을 평가하기 위해, 각 사이토카인의 발현을 24시간 간격으로 분석하였다(도 14a 내지 14d).
DDHAM(p = 0.206), DHAM(p = 0.078), 또는 CHAM(p = 0.215)에 대한 자극된 조건에서 GM-CSF의 발현에서는 시간이 지남에 따라 유의한 변화가 없었다(도 14a). TCP는 자극된 조건에서 GM-CSF의 발현이 시간이 지남에 따라 유의하게 변화한다는 예외적인 경우였다(p < 0.001). 시간이 지남에 따라 TCP 위에서 GM-CSF의 발현은 24시간에서 72시간까지(p < 0.001) 그리고 48시간에서 72시간까지(p < 0.001) 유의하게 증가하였다. TCP 위에서 GM-CSF 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.700) 유사하게 유지되었다.
IL-6. DDHAM(p = 0.007), DHAM(p < 0.001), CHAM(p < 0.001), 및 TCP(p = 0.002) 위에서 시간이 지남에 따라 자극된 조건에서 IL-6의 발현에서는 통계적으로 유의한 변화가 있었다(도 14b). DDHAM 위에서 IL-6의 발현을 비교한 결과 24시간에서 72시간까지(p = 0.007) 그리고 48시간에서 72시간까지(p = 0.021) 유의한 감소를 보였다. DDHAM 위에서 IL-6 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.623) 유사하게 유지되었다. 시간이 지남에 따라 DHAM 위에서 IL-6의 발현을 비교한 결과 24시간에서 48시간까지(p = 0.003) 유의한 증가를 보인 다음, 48시간에서 72시간까지(p < 0.001) 유의한 감소를 보였다. DHAM 위에서 IL-6 발현은 24시간에서 72시간까지(p = 0.321) 유사하게 유지되었다. 시간이 지남에 따라 CHAM 위에서 IL-6 발현을 비교한 결과 24시간에서 48시간까지(p < 0.001) 그리고 24시간에서 72시간까지(p < 0.001) 유의한 감소를 보였다. CHAM 위에서 IL-6 발현은 48시간과 72시간 둘 다에서 검출되지 않았다. 시간이 지남에 따라 TCP 위에서 IL-6의 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.008) 유의한 증가를 보였고, 48시간에서 72시간까지(p = 0.002) 유의한 감소를 보였다. TCP 위에서 IL-6 발현은 24시간에서 72시간까지(p = 0.407) 유사하게 유지되었다.
IL-8. CHAM(p = 0.024) 및 TCP(p < 0.001) 위에서 시간이 지남에 따라 자극된 조건에서 IL-8의 발현에서는 통계적으로 유의한 변화가 있었지만, IL-8 발현은 DDHAM(p = 0.179) 및 DHAM(p = 0.282) 위에서 시간이 지남에 따라 유사하게 유지되었다(도 14c). CHAM 위에서 IL-8의 발현은 24시간에서 72시간까지(p = 0.040) 그리고 48시간에서 72시간까지(p = 0.033) 유의하게 증가하였다. CHAM 위에서 IL-8 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.984) 유사하게 유지되었다. CHAM과 마찬가지로, TCP 위에서 IL-8의 발현은 24시간에서 72시간까지(p < 0.001) 그리고 48시간에서 72시간까지(p < 0.001) 유의하게 증가하였다. TCP 위에서 IL-8 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.071) 유사하게 유지되었다.
TNF-α. DHAM(p < 0.001) 및 TCP(p = 0.005) 위에서 시간이 지남에 따라 자극된 조건에서 TNF-α의 발현에서는 통계적으로 유의한 변화가 있었지만, TNF-α 발현은 DDHAM(p = 0.125) 및 CHAM(p=0.519) 위에서는 시간이 지남에 따라 유사하게 유지되었다(도 14d). 시간이 지남에 따라 DHAM 위에서 TNF-α의 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.009) 유의하게 증가하였고, 24시간에서 72시간까지(p = 0.048), 그리고 48시간에서 72시간까지(p < 0.001) 유의하게 감소하였다. 또한, 시간이 지남에 따라 TCP 위에서 TNF-α의 발현은 24시간에서 48시간까지(p = 0.035) 그리고 24시간에서 72시간까지(p = 0.004) 유의한 증가를 보였다. TCP 위에서 TNF-α 발현은 48시간에서 72시간까지(p = 0.201) 유사하게 유지되었다.
시간이 지남에 따라 상대적 mRNA 수준에서의 변화는 상이한 AM 및 사이토카인에 대해 상이한 경향을 보여 주었다. TCP 위에서 배양된 세포에서는 시간이 지남에 따라 발현 수준이 증가하였지만, DDHAM 위에서 배양된 세포에서는 이러한 사이토카인의 발현이 감소하는 경향을 보였다.
임상 사례 연구: 87세 여성에게는 지난 몇 달간 발생한 좌안 악화가 주요 불편사항으로 나타났다. 그녀는, 장시간 책을 읽을 때 불편함 및 이물감으로 인해, 작은 글씨를 볼 때의 어려움을 보고했다. 그녀의 병력은 안구 건조증, 원발 개방각 녹내장, 망막앞 막 및 양쪽 눈의 황반 드루젠(macular drusen)에 대하여 뚜렷하였다. 지원 치료에는 윤활제 점안액, 고삼투압제, 및 붕대 콘택트 렌즈가 포함되었다. 그녀의 안과 수술 이력은 양쪽 눈에서의 백내장 추출 및 양쪽 눈에서의 YAG 레이저 피막절개술로 구성되었다. 검사 후에, 지도/점(map/dot) 구성에서 상피 및 상피하 흉터가 확인되었다. 환자의 진술, 이력, 및 각막의 면밀한 검사에 기반하여, 환자는 전방 기저 막 이영양증(ABMD)으로 진단되었다. 환자의 동의를 받아, DDHAM을 기질로 사용하여 전방 각막 표면을 정상적인 보우만 막(즉, 상피 및 상피 기저 막)으로 다시 채우는 방식으로 전방 기저 막 이영양증을 외과적으로 치료하기로 결정하였다.
각막 상피 및 보우만 막의 괴사조직 제거, 및 AM 배치(봉합 없음)를 외래환자 절차로 수행하였다. 국소 마취제를 도포하였고, 불규칙한 표면 상피가 시각화되었다(도 15a). 모든 비정상적이고 느슨한 각막 상피(도 15b) 뿐만 아니라, 밑에 있는 상피하 흉터 및 ABMD 파편을 부드럽고 균일하게 제거하기 위해 다이아몬드 버(burr)를 사용하였다(도 15c). 그런 다음, 상피 표면을 균형잡힌 염 용액으로 헹구었다. DDHAM을 괴사조직 제거된 막 위에 조심스럽게 배치하고(도 15d), 불편함 및 치유를 돕기 위해 붕대 콘택트 렌즈로 덮었다(도 15e). 수술 후, 환자에게 스테로이드/항생제 점안액을 하루 4회씩 10일 동안 사용하도록 지시하였고, 이는 6주에 걸쳐 천천히 줄여 나갔다. 그녀를 수술 후 1주, 2주, 1개월 및 2개월에 관찰하였다. 환자는 일상 생활의 활동에서는 거의 즉시 편안함이 개선되었음을 보고하였다. 수술 후 1개월째의 방문 시, 이식편은 조직 내로 완전히 용해되었어서 잔여물이 보이지 않았다. 각막 표면은 매끄러웠고 정상인 것으로 확인할 수 있었다(도 15f).
논의
AM 기저 막의 구조는 안구 표면 위의 상피화를 촉진하는 것으로 가정된다. 콜라겐 조성은 결막 및 각막의 조성과 매우 유사하여, AM이 상피 세포의 성장에 적합한 기질이 된다. AM은 하기 4개의 제안된 메커니즘을 통해 각막 상피의 성장을 촉진한다(Malhotra & Jain, 2014; Walkden 등 2020): 1) 상피 세포 이동 촉진(Meller 등 2002; Meller 등 1999), 2) 기저 상피 세포 접착 강화(Keene 등 1987, Sonnenberg 등 1991, Terranova 등 1987), 3) 상피 세포 분화 촉진(Guo 등 1989; Streuli 등 1991; Kurpakus 등 1992), 및 4) 세포자멸사의 방지(Boudreau 등 1996; Boudreau 등 1995). 간질 표면이 상피 세포 성장을 지원할 수 있다는 증거가 있지만(Seitz 등 2006), 상피화는 기저 막 위에서 우선적으로 일어나는 것으로 생각된다(Hu 등 2003). 그러나, 기존 연구의 대부분은 냉동보존된 AM으로 제한되어서, 이들 발견이 상이하게 처리된 AM에 적용 가능한지 여부를 불분명하게 한다.
상이한 처리 방법론은 AM의 세포 내용물 및 구조를 변경하여 ECM의 기능적 특성에 영향을 미칠 가능성이 있다(Gholipourmalekabadi 등 2015). 이전 연구는 DDHAM과 CHAM 간의 조성 및 미세구조에서 유의한 차이를 입증하였다(Lim 등 2010). 냉동보존은 가장 널리 사용되는 보존 기법 중 하나이지만, 몇 가지 단점, 즉, 세포의 생존력 및 증식 능력에 영향을 미칠 뿐만 아니라, -80℃에서 운송 및 보관해야 한다는 필요성이 있다(Kruse 등 2000). 따라서, 본 연구는 측면성, 및 상이한 멸균, 보존, 및 탈세포화 방법이 HCEC 접착, 생존력, 및 이동에 어떻게 영향을 미치는지를 비교하려 노력했다. 이전 보고서(Bhatia 등 2007)에 표시된 대로, 저자는 이상적인 안구 AM에는 염증 반응을 방지하고 ECM과 숙주 세포 사이의 동적 상호작용을 촉진하기 위해 세포, DNA, 세포 파편, 잔여 성장 인자 및 사이토카인의 제거 뿐만 아니라, 천연 ECM 구조 및 생리활성 성분의 적절한 보존이 필요함을 가정한다. 본 연구 결과는, DDHAM이 완전히 탈세포화된 AM인 반면, DHAM 및 CHAM은 잔여 세포 및 DNA를 함유함을 입증함으로써 발명자들의 가설을 지지한다. 그런 다음, DDHAM은 HCEC의 세포 활동을 가장 잘 지원하는 것으로 밝혀졌다. 또한, DDHAM의 존재는 초기 염증 반응을 향상시키며, 시험관 내 염증 조건 하에서 HCEC에서 연장된 염증 반응을 방지한다.
염색은 DDHAM에 세포 및 핵이 없음을 확증한다. 이전 연구는, 안과학에서 AM의 생물학적 유효성이 AM에 보존된 세포가 아닌 이것의 ECM에 의해 촉진됨을 증명한다(Dua 등 2004; Kubo 등 2001; Kruse 등 2000). 탈세포화된 AM에서, ECM은 숙주 세포 및 ECM이 상호작용하여 치유 반응을 활성화하는 데 필수적인 생화학적 자극을 제공하는, 세포 침투를 위한 물리적 통로(physical conduit) 역할을 하는 것으로 추정된다(Bhatia 등 2007). 따라서, 예비 단계로, 세포 내용물 및 구조를 시각화하기 위해 3개의 AM 각각에 염색을 수행하였다. 면역형광법 및 H & E 염색 둘 다는 DDHAM에서 완전한 탈세포화 및 핵의 부재를 확증한 반면, DHAM 및 CHAM 둘 다는 핵 내용물, DHAM 내 잔여물 및 CHAM 내 세포의 존재를 보여 주었다.
DDHAM의 간질 측은 HCEC의 세포 활동을 가장 잘 지원한다. 이 시험관 내 조사로부터의 결과는, DDHAM의 간질 측이 HCEC 활동을 가장 잘 지원함을 시사한다. 측면성은 DDHAM 또는 CHAM 위에서 HCEC 접착에는 영향을 미치지 않았지만, HCEC 접착은 DHAM의 상피 측 위에서 유의하게 더 낮았다. 두 개의 탈수된 AM인 DDHAM과 DHAM 간에 세포 접착에서의 차이는, 세포 구성요소, DNA, 성장 인자 및 사이토카인의 제거가 HCEC의 부착을 지원하는 더욱 세포 친화적인 환경을 제공함을 시사한다.
시간이 지남에 따라 조사하였을 때, DDHAM의 간질 측을 제외하고 모든 측면성 및 AM 조합에 대해 세포 생존력이 감소하는 것으로 밝혀졌다. DDHAM의 간질 측 위에서, 세포 생존력은 1일에서 4일까지 증가하였다. 세포 생존력이 전반적으로 감소하는 구체적인 원인은 명확하지 않다. CHAM 또는 DHAM에 (냉동보존되거나 건조된) 양막 세포가 존재하면 각막 세포 증식을 지원하는 이들 AM의 능력이 억제될 수 있다. 탈세포화된 양막이 각막 상피 세포에 대해 새로운 양막보다 더 나은 기질임이 이전에 보고되었지만(Koizumi 등 2000), 이들 결과는 측면성이 또한 요인일 수 있음을 시사한다. 이 연구는, DDHAM의 간질 측이 HCEC의 성장에 가장 친화성인 기질인 반면, CHAM 및 DHAM의 상피 측도 간질 측도 이것들의 접착 및 성장을 지속적으로 지원하는 것으로 보이지 않음을 발견하였다.
이들 발견은 염색에 의해 추가로 지지된다. 4일 차에, DDHAM은 HCEC의 가장 균질한 성장 패턴을 나타냈다(도 10). 액틴 염색으로 표시되듯이, DDHAM 위의 세포의 형태 및 조직은 제자리에서 각막 상피 세포의 형태와 유사하다(도 11a 및 11b) ( 등 2007). 이들 관찰은 AM 위에서 질서 있는 성장을 시사한다. 반대로, DHAM 위의 성장 패턴은 무질서해 보이며, CHAM 위의 HCEC가 생존 가능한지 또는 존재하는지 여부는 불분명하게 남아있다. 세포가 스트레스를 받으면 이것들의 표현형이 변함이 잘 입증되었다(Kumar 등 2013). 고려해야 할 많은 인자가 있지만, 이들 결과는 탈수, 냉동보존, 및 탈세포화 과정에서의 차이가, 특히 세포 접착 및 세포 생존력의 측면에서 세포가 막과 상호작용하는 방법에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
상이하게 처리된 AM은 또한 AM 위에서 배양된 상피 세포로부터 인자의 방출에 영향을 미칠 수 있다. HCEC의 이동에 대해 AM이 단독으로 미치는 효과를 평가하기 위해, 본 연구는, 세포가 있거나 없는 3개의 상이한 AM으로부터의 조절된 배지를 시험하였고, HCEC가 DDHAM 및 DHAM 위에서 세포가 없는 경우보다 세포가 있는 조절된 배지가 있는 경우에 더 많이 이동하였음을 발견하였다. 그러나, CHAM 위에서 또는 대조군 위에서 세포가 있거나 없는 조절된 배지가 있는 경우에 HCEC 이동에서는 차이가 없었다. 이들 발견은, 세포에 의해 방출된 인자가 AM(즉, DDHAM 및 DHAM) 단독의 경우 이상으로 세포 이동을 촉진함을 시사한다. 또한, DDHAM 위의 세포로부터 그리고 DHAM 위의 세포로부터 조절된 배지가 있는 경우에 HCEC의 이동은 비슷했고, 둘 다는 CHAM 위의 세포보다 유의하게 더 컸다. 이 발견에 대한 한 가지 가능한 설명은, 조절된 배지를 수집했을 때 CHAM 위에 더 적은 세포가 있었다는 것이다. 세포 수가 더 적은 경우, 조절된 배지의 자극 효과는 더 적어질 수 있고, 이는 CHAM 위의 세포로부터의 조절된 배지가 있는 경우에 더 적은 이동을 초래한다. 또한, 세포가 있는 조절된 배지가 있는 경우에 HCEC의 이동은 대조군 배지보다 3개의 모든 AM 위에서 유의하게 더 컸다. 종합적으로, 이들 발견은, 세포 및 AM으로부터 방출된 인자가 세포 이동을 촉진하며 상기 방출된 인자는 AM에 따라 달라져서, CHAM보다 DDHAM 및 DHAM 위에서 더 많은 HCEC 이동이 초래됨을 시사한다. 이들 인자의 정체 및 출처를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.
측면성이 HCEC 이동에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 추가적인 독립적인 실험을 수행하였다. 상기 실험은 '이동 검정을 위한 조절된 배지' 및 '스크래치 상처 이동 검정' 부분에 설명된 것과 동일한 방법론을 따랐다. 그러나, 이 실험에서는, 조절된 배지가 있는 경우에 HCEC의 이동을 AM의 간질 측 및 상피 측 둘 다에 대하여 평가하였다. 이 실험으로부터의 결과는, AM의 상피 측 위에서 또는 간질 측 위에서의 세포로부터 조절된 배지가 있는 경우에 HCEC 이동에서는 차이가 없음을 확증하였다(p = 0.407, 데이터는 표시되지 않음).
전통적으로, AM을 결손 위에서의 상피화를 촉진하기 위해 상피 측이 위로 향하는 이식편으로 배치한다. DHAM 및 CHAM 둘 다는, 이것들의 측면성으로 인해 이 임상 적용 가능성을 갖는다. 그러나, DDHAM은 배향에 관계없이 안구 표면과 인터페이스하기 위해 간질 측이 바깥 측을 향하도록 제조된다. 이 시험관 내 연구로부터의 결과는, HCEC 활동이 DDHAM의 간질 측 위에서 가장 높았고, 따라서 이식편으로서의 이것의 임상 적용 가능성을 지원함을 입증하였다. 더욱이, 포함된 사례 연구는, 전방 기저 막 이영양증을 치료하는 데 DDHAM의 성공적인 적용을 입증하였다. 수술 후 1개월에, 각막 표면은 매끄러웠고 정상으로 확인될 수 있었는데, 이는 재상피화가 진행되고 있음을 나타낼 수 있다. 그러나, 각막 상피, 이것의 기저 막, 및 보우만 층의 재건 및 리모델링을 입증하기 위해서는 추가 시점에서의 조직학이 필요하다. 고무적이기는 하지만, DDHAM를 더욱 완전히 뿐만 아니라, 안구 표면 상의 상피화를 촉진하는 이것의 능력을 평가하기 위해서는 더 큰 샘플 크기를 사용한 추가적인 생체 내 조사가 필요하다.
DDHAM은 초기 염증 반응 후에 시간이 지남에 따라 감소하는 경향을 지원한다.
AM의 항염증 특성은 잘 증명되었다(Sharma 등 2016; Tabatabaei 등 2017; Tandon 등 2011). 시험관 내 연구에 기반하여, AM은 손상된 안구 조직으로부터 성장 인자 및 전염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 동시에(Solomon 등 2001), 또한 염증 세포를 포획하여 세포자멸사를 유도한다(Dua 등 2004; Shimmura 등 2001). 따라서, 이 조사의 두 번째 목표는 상이한 AM 위의 HCEC의 염증 반응을 평가하는 것이었다. 이것은 즉각적인 mRNA 발현 뿐만 아니라, 시간이 지남에 따른 경향을 조사함으로써 성취되었다. 각막 상처 치유에서 이것들의 알려진 역할을 고려하여, HCEC의 염증 반응을 평가하도록 전염증성 사이토카인, GM-CSF, IL-6, IL-8, 및 TNF-α를 선택하였다.
GM-CSF는 용량(dose) 및 상황에 따라 이의 효과가 달라지는 염증성 사이토카인(van Nieuwenhuijze 등 2013) 및 면역조절 사이토카인(Parmiani 등 2007) 둘 다로 인식된다(Bhattacharya 등 2015; Parmiani 등 2007; Shachar 및 Karin 2013). 이 다능성 사이토카인은 염증 및 상처 치유에서 중요한 역할을 하는 것으로 인식되었고, 보다 구체적으로는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 각막 상처 치유를 향상시키는 입증된 능력을 갖는다(Rho 등 2015). IL-6, IL-8, 및 TNF-α는 더욱 전통적인 전염증성 사이토카인이다. 염증 및 면역 반응을 조절하는 것 외에도, IL-6는 시험관 내 및 생체 내에서 각막 상처 치유를 촉진하는 것으로 나타났다(Arranz-Valsero 등 2014; Ebihara 등 2011; Nishida 등 1992; Hafezi 등 2018). IL-8은 혈관신생을 유도하고 상처 치유를 조절하는 것으로 생각되는 각막 인자이다(Strieter 등 1992; Koch 등 1992). 마지막으로, TNF-α는 각막 손상 후의 각막 염증 반응 및 상처 치유에 관여한다(Wang 등 2020; Yang 등 2019).
본 연구에서는, 처음 24시간에 DDHAM 위에서 배양된 세포에서 염증성 사이토카인(즉, IL-6, IL-8, TNF-α)의 발현이 더 높았고, 이후 시간이 지남에 따라 감소하는 경향이 있었다. 이들 관찰은, DDHAM의 존재가 HCEC 세포에서 초기 염증 반응을 촉진하고 연장된 염증 반응을 방지할 수 있으며, 이는 상처 치유 환경에서 유리할 수 있음을 시사한다. 그러나, 이들 발견을 더욱 완전히 평가하기 위해서는 추가적인 생체 내 연구가 필요하다.
AM은 특히 윤부 줄기 세포 결핍이 있거나 없는 각막 표면 장애(Maharajan 등 2007; Sangwan 등 2012), 결막 표면 재건(예를 들어, 익상편 제거[ 등 2019; Akbari 등 2017]), 윤부 상피 세포의 체외 확장을 위한 운반체로(Rama 등 2010; Shortt 등 2009), 녹내장(Sheha 등 2008), 신생물(Agraval 등 2017), 공막 융해 및 천공(Hanada 등 2001; Ma 등 2002)을 포함한 다양한 안구 병리를 치료하기 위한 안구 표면 재건에 사용된다. 치유를 향상시키고, 숙주 조직과 통합되고, 이물질 반응을 회피하는 이것의 가능성을 고려하여, 탈세포화된 AM은 최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 받고 있다(Gholipourmalekabadi 등 2015; Fenelon 등 2019; Lim 등 2010; Koizumi 등 2000; Salah 등 2018; Fransisco 등 2016; Gholipourmalekabadi 등 2016; Taghiabadi 등 2015). 탈세포화된 AM에서 ECM을 적절하게 보존하였더니, 세포 접착, 증식, 및 분화가 개선되었다는 증거와 함께 AM 내의 다양한 세포 유형의 상호작용이 개선되는 것으로 나타났다(Fenelon 등 2019; Koizumi 등 2000; Salah 등 2018; Fransisco 등 2016; Gholipourmalekabadi 등 2016; Taghiabadi 등 2015). 더욱이, 그리고 아마도 가장 중요하게는, 탈세포화된 AM이 면역원성이 낮은 생물학적 조직에 통합되는 것으로 나타났다(Fenelon 등 2019; Fransisco 등 2016; Gholipourmalekabadi 등 2016).
AmbioDryTM는 저선량 전자 빔으로 멸균시켰고 상피 층을 기계적으로 제거하면서 탈수를 통해 보존하였던 단일 층 AM이다(Hovanesian, 2012). 상기 생성물은 더 이상 사용할 수 없지만, 이 DDHAM 생성물에 대한 과학적 평가를 통해 많은 것을 얻을 수 있다(Memarzadeh 등 2008; Chuck 등 2004). Memarzadeh 등은 익상편 재발을 방지하는 데 효과적인 결막 자가이식편으로 작용하는 이것의 능력을 입증하였다(Memarzadeh 등 2008). 또한, 생체역학적 연구 조사는, 이 DDHAM이 재수화될 때 바람직한 탄성 특성을 유지하여, 안구 표면 재건을 위한 조직을 쉽게 조작할 수 있게 함을 확증하였다(Chuck 등 2004). AmbioDryTM와 Biovance®3L Ocular 간의 뚜렷한 차이점, 예컨대 Biovance®3L Ocular의 독특한 3층 디자인 뿐만 아니라, 세포 및 관련 성장 인자의 완전한 제거(Bhatia 등 2007)에도 불구하고, 이들 이전 간행물은 DDHAM 생성물에 대한 추가적인 통찰력 및 안과학에서 이것들의 임상 적용을 제공한다.
본 연구로부터의 결과는 고무적이지만, 몇 가지 한계가 있다. 무엇보다도, 시험관 내 조사로부터의 발견은 임상 적용에 직접적으로 적용되지 않는다. 안구 상피 세포와의 뛰어난 친화성이 반드시 안구 상처 치유에서의 임상적 개선과 동일하지는 않다. 이 시험관 내 연구와는 달리, 생체 내 조직에서는 많은 유형의 세포가 존재하며 서로 상호작용한다. 한 세포 유형의 세포 행동이 반드시 조직의 반응을 나타내지는 않는다. 그러나, 이들 한계에도 불구하고, 이 연구는 상업적으로 입수 가능한 3개의 AM에 대한 안구 세포 활동 및 염증 반응을 비교한다는 점에서 독특하다. 또한, 이 연구는 세포 활동에 대한 AM 측면성의 효과를 처음으로 입증한 것이다.
결론
전반적으로, DDHAM은 시험관 내에서 더 나은 HCEC 기능을 지원하는 것으로 나타났으며, 이는 생체 내에서 더 큰 안구 세포 친화성을 시사할 수 있다. DDHAM의 상처 치유 반응 뿐만 아니라, 이것의 임상 적용 및 결과를 평가하기 위한 추가 연구가 필요하다.
참고문헌
Leal-Marin S, Kern T, Hofmann N, Pogozhykh O, Framme C, M, Figueiredo C, Glasmacher B, Gryshkov O. Human Amniotic Membrane: A review on tissue engineering, application, and storage. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2021;109:1198-1215.
Walkden A. Amniotic membrane transplantation in Ophthalmology: an updated perspective. Clin Ophthalmol. 2020;14:2057-2072.
Liu J, Li L, Li X. Effectiveness of Cryopreserved Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulceration: A Meta-Analysis. Cornea. 2019 Apr;38:454-462.
Malhotra C, Jain AK. Human amniotic membrane transplantation: different modalities of its use in ophthalmology. World J Transplant. 2014;4:111-121.
Meller D, Pauklin M, Thomasen H, Westekemper H, Steuhl KP. Amniotic membrane transplantation in the human eye. Dtsch Arztebl Int. 2011;108:243-248.
Fernandes M, Sridhar MS, Sangwan VS, Rao GN. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. Cornea. 2005;24:643-653.
Shayan Asl N, Nejat F, Mohammadi P, Nekoukar A, Hesam S, Ebrahimi M, Jadidi K. Amniotic membrane extract eye drop promotes limbal stem cell proliferation and corneal epithelium healing. Cell J. 2019;20:459-468.
Meller D, Pires RT, Tseng SC. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 2002;86:463-471.
Meller D, Tseng SC. Conjunctival epithelial cell differentiation on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999;40:878-886.
Sharma N, Singh D, Maharana PK, Kriplani A, Velpandian T, Pandey RM, Vajpayee RB. Comparison of amniotic membrane transplantation and umbilical cord serum in acute ocular chemical burns: a randomized controlled trial. Am J Ophthalmol. 2016;168:157-163.
Tabatabaei SA, Soleimani M, Behrouz MJ, Torkashvand A, Anvari P, Yaseri M. A randomized clinical trial to evaluate the usefulness of amniotic membrane transplantation in bacterial keratitis healing. Ocul Surf. 2017;15:218-226.
Tandon R, Gupta N, Kalaivani M, Sharma N, Titiyal JS, Vajpayee RB. Amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy in acute ocular burns. Br J Ophthalmol. 2011;95:199-204.
Niknejad H, Peirovi H, Jorjani M, Ahmadiani A, Ghanavi J, Seifalian AM. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. Eur Cells Mater. 2008;15:88-99.
Tseng SC, Li DQ, Ma X. Suppression of transforming growth factor-beta isoforms, TGF-beta receptor type II, and myofibroblast differentiation in cultured human corneal and limbal fibroblasts by amniotic membrane matrix. J Cell Physiol. 1999;179:325-335.
Lee SB, Li DQ, Tan DT, Meller DC, Tseng SC. Suppression of TGF-beta signaling in both normal conjunctival fibroblasts and pterygial body fibroblasts by amniotic membrane. Curr Eye Res. 2000;20:325-334.
Hao Y, Ma DH, Hwang DG, Kim WS, Zhang F. Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea. 2000; 19:348-352.
Mamede AC, Botelho MF. Amniotic membrane: origin, characterization and medical applications. Mamede AC, Botelho MF, editors. New York, NY: Springer; 2015.
Tehrani FA, Peirovi H, Niknejad. Determination of antibacterial effect of the epithelial and mesenchymal surfaces of amniotic membrane on escherichia coli, staphylococcus aureus and pseudomonas aeruginosa. Qom Univ Med Sci J. 2013;7:12-22.
Sangwan VS, Basu S. Antimicrobial properties of amniotic membrane. Br J Ophthalmol. 2011;95:1.
Kjaergaard N, Hein M, Hyttel L, Helmig RB, Schønheyder HC, Uldbjerg N, Madsen H. Antibacterial properties of human amnion and chorion in vitro. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001;94:224-229.
Kjaergaard N, Helmig RB, Schonheyder HC, Uldbjerg N, Hansen ES, Madsen H. Chorioamniotic membranes constitute a competent barrier to group b streptococcus in vitro. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1999;83:165-169.
Inge E, Talmi YP, Sigler L, Finkelstein Y, Zohar Y. Antibacterial properties of human amniotic membranes. Placenta. 1991;12:285-288.
Dua HS, Gomes JA, King AJ, Maharajan VS. The amniotic membrane in ophthalmology. Surv Ophthalmol. 2004;49:51-77.
Shimmura S, Shimazaki J, Ohashi Y, Tsubota K. Antiinflammatory effects of amniotic membrane transplantation in ocular surface disorders. Cornea. 2001;20:408-413.
Hu DJ, Basti A, Wen A, Bryar PJ. Prospective comparison of corneal re-epithelialization over the stromal and basement membrane surfaces of preserved human amniotic membrane. ARVO Annual Meeting Abstract, 2003.
Seitz B, Resch MD, -Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE. Histopathology and ultrastructure of human corneas after amniotic membrane transplantation. Arch Ophthalmol; 2006;124:1487-1490.
The influence of different preservation and sterilisation steps on the histological properties of amnion allografts--light and scanning electron microscopic studies. Cell Tissue Bank. 2004;5:45-56.
Lim LS, Poh RW, Riau AK, Beuerman RW, Tan D, Mehta JS. Biological and ultrastructural properties of acelagraft, a freeze-dried γ-irradiated human amniotic membrane. Arch Ophthalmol. 2010;128:1303-1310.
Tehrani FD, Firouzeh A, Shabani I, Shabani A. A review on modifications of amniotic membrane for biomedical applications. Front Bioeng Biotechnol. 2021;13;8:606982.
Gholipourmalekabadi M, Mozafari M, Salehi M, 등 Development of a cost-effective and simple protocol for decellularization and preservation of human amniotic membrane as a soft tissue replacement and delivery system for bone marrow stromal cells. Adv Healthc Mater. 2015;4:918-926.
Keane TJ, Londono R, Turner NJ, Badylak SF. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 2012;33:1771-1781.
Seif-Naraghi SB, Singelyn JM, Salvatore MA, Osborn KG, Wang JJ, Sampat U, Kwan OL, Strachan GM, Wong J, Schup-Magoffin PJ, Braden RL, Bartels K, DeQuach JA, Preul M, Kinsey AM, DeMaria AN, Dib N, Christman KL. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Sci Transl Med. 2013;5:173ra25.
Aamodt JM, Grainger DW. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials. 2016;86:68-82.
Balestrini JL, Gard AL, Liu A, 등 Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integr Biol (Camb). 2015;7:1598-1610.
Bhatia M, Pereira M, Rana H, 등 The mechanism of cell interaction and response on decellularized human amniotic membrane: implications in wound healing. Wounds. 2007;19:207-217.
Vieites B, Gude F, Silva MT, Couceiro J. Effects of lyophilization on human amniotic membrane. Acta Ophthalmol. 2009;87:396-403.
Keene DR, Sakai LY, Lunstrum GP, Morris NP, Burgeson RE. Type VII collagen forms an extended network of anchoring fibrils. J Cell Biol. 1987;104:611-621.
Sonnenberg A, Calafat J, Janssen H, Daams H, van der Raaij-Helmer LM, Falcioni R, Kennel SJ, Aplin JD, Baker J, Loizidou M, 등 Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. J Cell Biol. 1991;113(4):907-917.
Terranova VP, Lyall RM. Chemotaxis of human gingival epithelial cells to laminin. A mechanism for epithelial cell apical migration. J Periodontol. 1986;57(5):311-317.
Guo M, Grinnell F. Basement membrane and human epidermal differentiation in vitro. J Invest Dermatol. 1989;93:372-378.
Kurpakus MA, Stock EL, Jones JC. The role of the basement membrane in differential expression of keratin proteins in epithelial cells. Dev Biol. 1992;150:243-255.
Streuli CH, Bailey N, Bissell MJ. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. J Cell Biol. 1991;115:1383-95.
Boudreau N, Werb Z, Bissell MJ. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three-dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93:3509-3513.
Boudreau N, Sympson CJ, Werb Z, Bissell MJ. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science. 1995;267:891-893.
Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthal Vis Sci. 2001; 42:1539-1546.
Kruse FE, Joussen AM, Rohrschneider K, 등 Cryopreserved human amniotic membrane for ocular surface reconstruction. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 2000;238: 68-75.
Koizumi N, Fullwood NJ, Bairaktaris G, Inatomi T, Kinoshita S, Quantock AJ. Cultivation of corneal epithelial cells on intact and denuded human amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:2506-2513.
Kuchynka P, Forrester JV. The suprabasal layer of corneal epithelial cells represents the major barrier site to the passive movement of small molecules and trafficking leukocytes. Br J Ophthalmol. 2007;91:372-378.
Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Cell Injury, Cell Death, and Adaptations. In: Kumar V, Abbas AK, Aster JC, ed. Robins Basic Pathology. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2013:1-28.
Solomon A, Rosenblatt M, Monroy D, Ji Z, Pflugfelder SC, Tseng SC. Suppression of Interleukin 1 alpha and Interleukin 1 beta in the human limbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix. Br J Ophthalmol. 2001;85: 444-449.
van Nieuwenhuijze A, Koenders M, Roeleveld D, Sleeman MA, van den Berg W, Wicks IP. GM-CSF as a therapeutic target in inflammatory diseases. Mol Immunol. 2013;56:675-682.
Parmiani G, Castelli C, Pilla L, Santinami M, Colombo MP, Rivoltini L. Opposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant in cancer patients. Ann Oncol. 2007;18:226-232.
Bhattacharya P, Budnick I, Singh M, Thiruppathi M, Alharshawi K, Elshabrawy H, Holterman MJ, Prabhakar BS. Dual Role of GM-CSF as a Pro-Inflammatory and a Regulatory Cytokine: Implications for Immune Therapy. J Interferon Cytokine Res. 2015;35:585-599.
Shachar I, Karin N. The dual roles of inflammatory cytokines and chemokines in the regulation of autoimmune diseases and their clinical implications. J Leukoc Biol. 2013;93:51-61.
Rho CR, Park MY, Kang S. Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating (GM-CSF) factor on corneal epithelial cells in corneal wound healing model. PLoS One. 2015;10:e0138020.
Hafezi F, Gatzioufas Z, Angunawela R, Ittner LM. Absence of IL-6 prevents corneal wound healing after deep excimer laser ablation in vivo. Eye (Lond). 2018;32:156-157.
Arranz-Valsero I, Diebold Y. IL-6 as a corneal wound healing mediator in an in vitro scratch assay. Exp Eye Res. 2014;125:183-192.
Ebihara N, Matsuda A, Nakamura S, Matsuda H, Murakami A. Role of the IL-6 classic- and trans-signaling pathways in corneal sterile inflammation and wound healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52:8549-8557.
Nishida T, Nakamura M, Mishima H, Otori T, Hikida M. Interleukin 6 facilitates corneal epithelial wound closure in vivo. Arch Ophthalmol. 1992;110:1292-1294.
Strieter RM, Kunkel SL, Elner VM, Martonyi CL, Koch AE, Polverini PJ, Elner SG. Interleukin-8. A corneal factor that induces neovascularization. Am J Pathol. 1992;141:1279-1284.
Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, Elner SG, Strieter RM. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science. 1992;258:1798-1801.
Wang X, Zhang S, Dong M, Li Y, Zhou Q, Yang L. The proinflammatory cytokines IL-1β and TNF-α modulate corneal epithelial wound healing through p16Ink4a suppressing STAT3 activity. J Cell Physiol. 2020;235:10081-10093.
Yang L, Zhang S, Duan H, Dong M, Hu X, Zhang Z, Wang Y, Zhang X, Shi W, Zhou Q. Different effects of pro-Inflammatory factors and hyperosmotic stress on corneal epithelial stem/progenitor cells and wound healing in mice. Stem Cells Transl Med. 2019;8:46-57.
Sangwan VS, Basu S, MacNeil S, Balasubramanian D. Simple limbal epithelial transplantation (SLET): a novel surgical technique for the treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol. 2012 Jul;96(7):931-934.
Maharajan VS, Shanmuganathan V, Currie A, Hopkinson A, Powell-Richards A, Dua HS. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction: indications and outcomes. Clin Exp Ophthalmol. 2007 Mar;35:140-147.
T, Bramkamp M, Bartz-Schmidt KU, D. A retrospective study to compare the recurrence rate after treatment of pterygium by conjunctival autograft, primary closure, and amniotic membrane transplantation. Med Sci Monit. 2019;25:7976-7981.
Akbari M, Soltani-Moghadam R, Elmi R, Kazemnejad E. Comparison of free conjunctival autograft versus amniotic membrane transplantation for pterygium surgery. J Curr Ophthalmol. 2017;29:282-286.
Rama P, Matuska S, Paganoni G, Spinelli A, De Luca M, Pellegrini G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 2010;363:147-155.
Shortt AJ, Secker GA, Lomas RJ, Wilshaw SP, Kearney JN, Tuft SJ, Daniels JT. The effect of amniotic membrane preparation method on its ability to serve as a substrate for the ex-vivo expansion of limbal epithelial cells. Biomaterials. 2009;30:1056-65.
Sheha H, Kheirkhah A, Taha H. Amniotic membrane transplantation in trabeculectomy with mitomycin C for refractory glaucoma. J Glaucoma. 2008;17:303-307.
Agraval U, Rundle P, Rennie IG, Salvi S. Fresh frozen amniotic membrane for conjunctival reconstruction after excision of neoplastic and presumed neoplastic conjunctival lesions. Eye (Lond). 2017;31:884-889.
Hanada K, Shimazaki J, Shimmura S, Tsubota K. Multilayered amniotic membrane transplantation for severe ulceration of the cornea and sclera. Am J Ophthalmol. 2001;131:324-331.
Ma DH, Wang SF, Su WY, Tsai RJ. Amniotic membrane graft for the management of scleral melting and corneal perforation in recalcitrant infectious scleral and corneoscleral ulcers. Cornea. 2002;21:275-283.
Fenelon M, Maurel DB, Siadous R, 등 Comparison of the impact of preservation methods on amniotic membrane properties for tissue engineering applications. Mat Sci Eng C. 2019;104: 109903.
Salah RA, Mohamed IK, El-Badri N. Development of decellularized amniotic membrane as a bioscaffold for bone marrow-derived mesenchymal stem cells: ultrastructural study. J Mol Histol. 2018;49:289-301.
Francisco JC, Correa Cunha R, Cardoso MA, Baggio Simeoni R, Mogharbel BF, Picharski GL, Silva Moreira Dziedzic D, Guarita-Souza LC, Carvalho KA. Decellularized Amniotic Membrane Scaffold as a Pericardial Substitute: An In Vivo Study. Transplant Proc. 2016;48:2845-2849.
Gholipourmalekabadi M, Sameni M, Radenkovic D, Mozafari M, Mossahebi-Mohammadi M, Seifalian A. Decellularized human amniotic membrane: how viable is it as a delivery system for human adipose tissue-derived stromal cells? Cell Prolif. 2016;49:115-121.
Taghiabadi E, Nasri S, Shafieyan S, Firoozinezhad SJ, Aghdami N. Fabrication and characterization of spongy denuded amniotic membrane based scaffold for tissue engineering. Cell J. 2015;16:476-487.
Memarzadeh F, Fahd AK, Shamie N, Chuck RS. Comparison of de-epithelialized amniotic membrane transplantation and conjunctival autograft after primary pterygium excision. Eye (Lond). 2008;22:107-112.
Chuck RS, Graff JM, Bryant MR, Sweet PM. Biomechanical characterization of human amniotic membrane preparations for ocular surface reconstruction. Ophthalmic Res. 2004;36:341-348.
Hovanesian JA. History of amniotic membranes in pterygium surgery. In: Hovanesian JA, editor. Pterygium: techniques and technologies for surgical success. Thorofare: SLACK Incorporated; 2012: 65-75.
실시예 6: 곡선 모양의 Biovance 3L Ocular
본 실시예에서는, Biovance 3L ocular를 각막 및 안구에 더 잘 맞도록 곡선 포맷으로 제작한다.
상이한 구면 반경, 높이, 및 직경을 갖는 3D 프린팅을 통해 주형을 제작하였다(도 17). 층 형태의 막을 건조시켜서 주형에 넣고, 조심스럽게 제거하였다. 건조시킨 생성물, 도 18은 곡선 모양 유닛 사이의 공간을 잘라낸 것이다.
표 7. 곡선 모양의 biovance 3L ocular
본 개시내용은 본원에 설명된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 참으로, 본원에 설명된 것들 이외의 본 발명의 다양한 수정은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 수정은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은, 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 편입되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼, 모든 목적을 위해 이것들 전체가 동일한 정도로 본원에 참고로 편입된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 이것의 개시를 위한 것이며, 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 간행물보다 우선할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
Claims (44)
- 함께 적층된 복수의 세포외 바탕질(matrix) 층을 포함하는 조직 이식편 생성물(tissue graft product)로서, 상기 세포외 바탕질이 양막(amniotic membrane)으로부터 유래하고, 세포외 바탕질 층의 간질 측(stromal side)이 조직 이식편 생성물의 상부 표면 및 하부 표면 둘 다 위에 존재하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생성물이 3개 이상의 세포외 바탕질 층을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생성물이 정확히 3개의 세포외 바탕질 층을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양막이 탈세포화되는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 양막이 세제 및 또는 기계적 파괴를 사용하여 탈세포화되는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 세제가 데옥시콜산인 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포외 바탕질 층이 건조에 의해 함께 적층되는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 생성물이 열 및 또는 진공에 의해 건조되는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 이식편 생성물이 탈수되는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 20% 미만의 물을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 15% 미만의 물을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 10%의 물을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 40% 내지 약 70%의 총 콜라겐을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 45% 내지 약 60%의 총 콜라겐을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 50% 내지 약 55%의 총 콜라겐을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐이 주로 콜라겐 유형 I 및 콜라겐 유형 III인 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 8% 내지 약 24%의 엘라스틴을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 17에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 12% 내지 약 20%의 엘라스틴을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 17에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 15% 내지 약 20%의 엘라스틴을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 1% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 20에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 0.5% 미만의 글리코사미노글리칸을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 1% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 22에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 0.5% 미만의 피브로넥틴을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 9 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 1% 미만의 라미닌을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 24에 있어서, 상기 생성물이 건조 중량을 기준으로 약 0.5% 미만의 라미닌을 포함하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양막이 인간 양막인 조직 이식편 생성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 양막이 만기 임신으로부터 유래하는 조직 이식편 생성물.
- 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항의 조직 이식편 생성물을 포함하는 안구 조직 이식편.
- 청구항 28에 있어서, 상기 안구 조직 이식편이 대략 원형인 안구 조직 이식편.
- 청구항 28에 있어서, 상기 안구 조직 이식편이 구의 일부 형상의 곡선 모양의(curved) 부분을 포함하는 안구 조직 이식편.
- 청구항 30에 있어서, 상기 형상이 조직 이식편 생성물을 주형 위에 건조시켜서 부여되는 안구 조직 이식편.
- 대상체에서 눈의 질환 또는 손상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 눈을 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항의 조직 이식편 생성물, 또는 청구항 28 내지 31 중 어느 한 항의 안구 조직 이식편과 접촉시켜서 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 32에 있어서, 상기 눈의 손상이 찰과상을 포함하는 방법.
- 청구항 32에 있어서, 상기 눈의 손상이 화학적 노출을 포함하는 방법.
- 청구항 32에 있어서, 상기 눈의 손상이 베인 상처(cut) 또는 열상(laceration)을 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 눈의 질환 또는 손상이 각막의 질환 또는 손상을 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 손상된 조직의 복구를 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 치료되지 않은 눈에 비해 흉터 조직에서의 감소 또는 흉터 조직 형성에서의 감소를 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 이동을 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 접착을 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 증식을 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 치료되지 않은 눈에 비해 증가된 상피 세포 적용범위(coverage)를 포함하는 방법.
- 청구항 32 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물인 방법.
- 청구항 43에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
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