KR20240020403A - 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 및 이의 용도 - Google Patents
세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간세포 유래 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체, 상기 지질나노구조물 복합체에 약물이 봉입(encapsulation)된 약물 전달체, 상기 약물 전달체를 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 지질나노구조물 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 지질나노구조물 복합체는 지질나노구조물의 표면 지질층에 HEK293T 세포 유래의 막단백질을 포함하여 면역세포의 식작용(phagocytosis) 억제효과를 가지며 외부물질의 반응에 의한 면역세포 활성화도 유발하지 않으므로 생체적합성을 높여 우수한 약물전달 효과를 갖는다. 특히, 본 발명의 지질나노구조물 복합체는 특정 암세포에 특이적으로 결합하는 리간드(ligand)를 결합할 경우, 암 표적성능이 매우 우수한 약물 전달 효과를 가짐을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험에서 입증 및 확인하였다. 따라서, 본 발명의 지질나노구조물 복합체는 다양한 종류의 암치료를 위한 약학 조성물의 활성성분으로 개발될 수 있다.
Description
본 발명은 지질나노구조물 복합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 지질나노구조물 및 상기 지질나노구조물의 표면 지질층(lipid layer)에 인간세포 유래 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체, 상기 지질나노구조물 복합체에 약물이 봉입(encapsulation)된 약물 전달체, 상기 약물 전달체를 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 지질나노구조물 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
약물 전달 나노입자는 약물을 전달하고자 하는 세포/조직에 대한 선택성 및 투여 약물 대비 높은 치료효율, 약물 및 나노입자의 안정성, 약물 전달과정 및 전달 후 표적 세포/조직을 제외한 생체에 대한 안전성이 필요하다.
종래 나노입자는 크게 비생체유래 나노입자와 생체유래 나노입자로 나눌 수 있으며, 비생체유래 나노입자는 무기나노입자, 유기나노입자 및 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle)등이 있고 이들 자체로는 나노입자 크기에 따른 수동 표적화(passive targeting)되어 일부 질병부위 약물의 축적이 일어나지만 그 표적률이 높지 않고 이로인해 표적 세포/조직 외 전신에 대한 생체 독성이 나타날 수 있다. 또한, 나노입자를 능동 표적화(active targeting)되도록 제조하더라도 비 생체유래 나노입자가 생체 내 분해되지 않아 나타나는 독성 또는, 생체 내 분해되어 발생되는 부수물에 의한 예상되지 않았거나 추가적인 생체 내 독성으로 실사용에 대한 제한이 있다.
또한, 약물을 봉입(encapsulation)한 나노구조물은 외층(outer layer)이 인공적인 지질층(lipid layer)으로 구성되는데 생체에 투여될 경우 면역계등의 공격을 받아 일정부분이 파괴되는 위험이 있어 약물전달효과가 감소된다.
반면에, 엑소좀(exosome)등의 생체유래 나노입자는 생체 유래되어 생체 내 분해 되더라도 상대적으로 낮은 독성으로 생체적합성(biocompability)이 높다. 그러나, 생체 내 순환 및 대사 과정에서 간, 폐, 비장 등의 일부 장기에 불특정하게 축적되는 현상으로 원하는 질병부위 표적률이 낮아 이에 대한 개선이 필요하다.
이처럼 인체/생체에 대한 높은 생체적합성, 전달 약물 및 나노입자 자체의 우수한 안정성 그리고 표적 세포/조직에 대한 선택성으로, 높은 치료효율을 갖는 나노입자를 연구개발하기 위한 바람직한 방향으로는 생체적합성을 높이고 약물 전달력을 개선시키는 것이 상당히 중요하다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명자들은 약물 전달력과 관련된, 생체적합성(biocompability)이 우수한 약물 전달체를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 지질나노구조물의 표면 지질층에 HEK293T 세포 유래의 막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체가 우수한 생체적합성을 가지므로, 약물 전달력이 매우 향상됨을 실험적으로 입증 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 지질나노구조물 및 상기 지질나노구조물의 표면 지질층(lipid layer)에 인간세포 유래 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지질나노구조물 복합체에 약물이 봉입(encapsulation)된 약물 전달체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약물 전달체의 치료학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암치료용 약학 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지질나노구조물 복합체의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 지질나노구조물; 및 (ii) 상기 지질나노구조물의 표면 지질층(lipid layer)에 인간세포 유래 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체를 제공한다.
상기 세포막단백질은 GPCRs, 이온채널(Ion channels), 수송체(transporters), 막 효소(membrane enzymes) 및 막 융합 단백질(membrane fusion proteins)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인간세포는 HEK293T 세포일 수 있다.
상기 인간세포는 인간 백혈구(leucocyte) 또는 인간 지방유래 줄기세포(adipose derived stem cell)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다,
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지질나노구조물은 세포외소포체(extracellular vesicles), 리포좀(liposome) 또는 지질나노입자(lipid nanoparticle)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는 상기 지질나노구조물은 지질(lipid)에 의해 인공적으로 제조되는 지질나노구조 모사체일 수 있으며, 이와 같이 지질(lipid)에 의해 제조되는 지질나노구조 모사체의 경우 생체유래 지질나노구조물 대비 대량생산의 장점을 가진다. 상기 지질(lipid)에 의해 제조되는 인공 지질나노구조 모사체는 내부에 약물을 담지할 수 있도록 빈 공간을 형성하며, 그 공간 내부에 세포소기관 등을 포함하지 않는다는 점에서 생체유래 지질나노구조물과 차이를 가진다.
본 발명에서 용어 “세포외소포체”는 대부분의 진핵세포(세균, 고세균 또는 진핵생물 등)에서 생성되는 인지질 이중층 형태의 작은 소낭(Exosomes 30~100nm; Microvisicles 100~1,000nm)으로, 분비되는 기작과 그 크기에 따라 다양한 명칭(Exosomes, Microvesicles, Ectosomes, Membrane vesicles, Nanovesicles 또는 Outer membrane vesicle 등)으로 불린다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지질나노구조물 복합체는 세포막단백질 : 지질 = 1 : 10 - 2000의 중량비일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지질나노구조물의 표면 지질층은 표적세포에 특이적으로 결합하는 리간드(ligand)를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “리간드”는 표적세포 표면에 있는 수용체와 결합 가능한 구조물을 의미한다.
본 발명에서 용어 “결합”은 생리 조건 하에서 예를 들어, 파이 겹침(pi-stacking), 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 이온성 상호작용 및/또는 수소 결합 상호작용 등으로 인한, 두 분자 간의 회합(association)을 의미한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 리간드는 소분자(small molecule) 화합물, 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide), 단백질 및 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다,
본 발명에서 용어 “압타머(aptamer)”는 오직 하나의 표적에 대한 특이적인 결합 친화성을 가지는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 지질나노구조물 복합체에 약물이 봉입(encapsulation)된 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (i) 상기 약물 전달체의 치료학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 용어“치료학적 유효량”은 상기 약물 전달체를 환자에게 투여하여 생체 내에서 암치료에 충분하고 적합한 양을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분인“약물 전달체”이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 멘톨 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 당업자는 공지된 다양한 투여 방식 중에서 적합하고 효과적인 방식을 선택할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 유효성분인 약물 전달체의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암치료는 자궁경부암, 자궁암, 췌장암, 유방암, 담도암, 담낭암, 대장암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 두경부암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암, 골암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 요도암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 암을 치료하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 상기 지질나노구조물 복합체의 제조방법을 제공한다: (a) 지질(lipid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylen glycol)을 유기용매에 용해시켜 리포좀(liposome)을 준비하는 단계; (b) 인간세포로부터 세포막단백질을 분리하여 세포막단백질을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 준비된 리포좀과 세포막단백질을 혼합한 후 압출(extrusion)하여 지질나노구조물 복합체를 제조하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 약물 봉입(encapsulation)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 약물 봉입은 미세 유체(microfluidics) 방법으로 리포좀 제조시 이루어질 수 있으며 소수성 약물은 유기용매에 녹여 봉입을 하고 친수성 약물은 액상에 녹여 봉입을 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 인간세포는 HEK293T 세포일 수 있다.
본 발명의 지질나노구조물 복합체의 제조방법에서 지질나노구조물 복합체에 대한 내용은 상기 설명된 본 발명의 다른 일 양태인 “지질나노구조물 복합체”에서 설명된 내용과 동일하므로 이들을 원용하며 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명의 효과 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명은 인간세포 유래 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체, 상기 지질나노구조물 복합체에 약물이 봉입(encapsulation)된 약물 전달체, 상기 약물 전달체를 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 지질나노구조물 복합체의 제조방법에 관한 것으로서,
(i) 본 발명의 지질나노구조물 복합체는 지질나노구조물의 표면 지질층에 HEK293T 세포 유래의 막단백질을 포함하여 면역세포의 식작용(phagocytosis) 억제효과를 가지며 외부물질의 반응에 의한 면역세포 활성화도 유발하지 않으므로 생체적합성을 높여 우수한 약물전달 효과를 갖는다.
(ii) 특히, 본 발명의 지질나노구조물 복합체는 특정 암세포에 특이적으로 결합하는 리간드(ligand)를 결합할 경우, 암 표적성능이 매우 우수한 약물 전달 효과를 가짐을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험에서 입증 및 확인하였다.
(iii) 따라서, 본 발명의 지질나노구조물 복합체는 다양한 종류의 암치료를 위한 약학 조성물의 활성성분으로 개발될 수 있다.
도 1은 리포좀과 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자의 제조에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자의 크기를 보여 주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자의 입자표면 전하를 보여 주는 그래프이다.
도 4는 세포막단백질과 지질의 혼합비율이 1 : 300인 지질나노구조물 복합체 나노입자(300)의 표면에서 발현되는 활성화 단백질 비율을 보여주는 글리코실화율(glycosylation rate) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 식작용 분석 (phagocytosis assay) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 외부물질의 반응에 의한 면역세포 활성화 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 혈액순환율 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 폴레이트(folate)에 의해 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(F-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 시험관 내(in vitro) 결과이다.
도 9는 폴레이트(folate)에 의해 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(F-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 생체 내(in vivo) 결과이다.
도 10은 NTSR-1에 의해 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(N-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 시험관 내(in vitro) 결과이다.
도 11은 NTSR-1에 의해 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(N-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 생체 내(in vivo) 결과이다.
도 2는 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자의 크기를 보여 주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자의 입자표면 전하를 보여 주는 그래프이다.
도 4는 세포막단백질과 지질의 혼합비율이 1 : 300인 지질나노구조물 복합체 나노입자(300)의 표면에서 발현되는 활성화 단백질 비율을 보여주는 글리코실화율(glycosylation rate) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 식작용 분석 (phagocytosis assay) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 외부물질의 반응에 의한 면역세포 활성화 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 혈액순환율 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 폴레이트(folate)에 의해 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(F-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 시험관 내(in vitro) 결과이다.
도 9는 폴레이트(folate)에 의해 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(F-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 생체 내(in vivo) 결과이다.
도 10은 NTSR-1에 의해 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(N-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 시험관 내(in vitro) 결과이다.
도 11은 NTSR-1에 의해 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(N-SURGIsome)의 암 표적성능을 보여주는 생체 내(in vivo) 결과이다.
실시예 1: 리포좀과 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자의 제조
1.1 리포좀의 제조
리포좀을 구성하는 지질(lipid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylen glycol, PEG)을 유기용매에 용해시키고 증류수와 1:3 비율로 12 mL/min의 유속(flow rate)으로 이그나이트(ignite)를 이용해 미세 유체(microfluidics) 방법으로 리포좀을 제조하고 버퍼(buffer)를 교체하여 유기용매를 제거하였다.
1.2 HEK293T 세포 유래 세포막단백질의 준비
5 x 106 세포 수의 HEK293T 세포를 원심분리로 얻은 다음 PBS로 2회 세척하고 상층액을 제거하여 수득한 세포 펠렛(cell pellet)에 투과 버퍼(permeabilization buffer)를 첨가하고 4℃에서 10분간 균일하게 혼합하여 세포를 투과하였다. 상기 투과된 세포를 원심분리한 후 상층액을 제거하여 수득한 세포 펠렛에 가용화 버퍼(solubilization buffer)를 첨가하고 4℃에서 30분간 균일하게 혼합하였다. 상기 가용화된 세포 혼합액을 원심분리하여 세포 펠렛으로부터 세포막단백질을 분리한 후, 분리된 세포막단백질은 bradford assay로 단백질 농도를 측정하였고, 측정된 세포막단백질의 농도는 0.8 μg/mL로 확인되었다.
1.3 리포좀과 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자의 제조
지질나노구조물 복합체 나노입자를 제조하기 위해, HEK293T 세포 유래 세포막단백질과 실시예 1.1에서 제조된 리포좀의 지질이 1 : 100 - 1000의 중량비로 포함되도록 리포좀과 세포막단백질을 혼합하였다. 상기 혼합물을 42℃에서 3분간 배양하고 3분간 볼텍싱(vortexing)하며 이를 3회 반복한 다음 15회 압출(extrusion)하여 제조하였다.
실시예 2: 지질나노구조물 복합체 나노입자의 특성 분석
2.1 분석방법
입자크기 및 입자표면 전하를 측정하기 위해 동적 광산란기(DLS, 제타뷰)를 이용하였고 현탁액 내의 나노입자의 개수를 50 - 200개 사이로 희석하여 실온에서 수행하였으며 대조군은 리포좀(liposome)과 엑소좀(exosome)으로 하였다.
상기 제조된 지질나노구조물 복합체 나노입자의 표면에 존재하는 활성화 막단백질을 확인하기 위하여 Wheat Germ Agglutinin conjugate Alexa Fluor 488 Conjugate를 이용해 글리코실화(glycosylation)된 단백질의 함량을 형광으로 측정하였으며 대조군은 리포좀(Liposome)과 엑소좀(Exosome)으로 하였다.
2.2 지질나노구조물 복합체 나노입자의 특성
본 발명의 리포좀과 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자와 대조군의 입자크기를 도 2에, 입자표면 전하를 도 3에 나타내었다.
리포좀과 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자가 만들어지면 지질과 세포막단백질의 혼합 중량비에 무관하게 상기 지질나노구조물 복합체 나노입자의 크기가 리포좀에 비해 커지는 것으로 나타났다(도 2).
또한, DLS에 의한 입자표면 전하의 양이 세포막단백질과 지질의 혼합비율에 따라 다르게 나타났으며, 그 혼합비율이 1 : 300일때 엑소좀에 가장 근접한 것으로 나타났다(도 3).
또한, 글리코실화율(glycosylation rate)을 확인한 결과, 세포막단백질과 지질의 혼합비율이 1 : 300인 지질나노구조물 복합체 나노입자(300)의 표면에서 발현되는 활성화 단백질 비율은 엑소좀의 70%로 나타났다(도 4).
실시예 3: 지질나노구조물 복합체 나노입자의 면역세포 활성화 분석
3.1 분석 방법
면역세포인 RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트에 105 세포 수로 분주하고 24시간 배양한 후, 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자를 상기 세포에 1시간 처리한 다음 식작용 분석 키트(phagocytosis assay kit, abchem, ab234053) 를 이용하여 형광 강도(fluorescence intensity)를 대조군(Control, Liposome, Exosome)과 함께 관찰하였다.
또한, 면역세포인 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 105 세포 수로 분주하고 24시간 배양한 후, 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자를 107개로 상기 세포에 48시간 처리한 다음 MTT 시약을 처리하여 세포의 활성화 비율을 대조군(Control, Liposome)과 함께 확인하였다.
3.2 분석 결과
식작용 분석(phagocytosis assay) 결과, 면역세포인 RAW 264.7 세포에서 리포좀에 대한 식작용 억제효과가 없지만, 엑소좀과 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자에 대한 식작용 억제효과가 확인되어 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자가 생체에서 추출한 엑소좀과 유사한 면역억제효과가 있는 것으로 확인되었다(도 5). 또한, 세포막단백질과 리포좀을 구성하는 지질의 혼합비율에 따라 그 효과가 다르게 나타났으며, 세포막단백질과 리포좀을 구성하는 지질의 적정 혼합비율인 1 : 300에서 그 효과가 가장 큰 것으로 나타났다(도 5).
또한, 외부물질의 반응에 의한 면역세포 활성화 분석에서, 리포좀은 대조군(Control)에 비해 면역세포 활성화 수치가 높게 나타났고, 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자(300)는 세포막단백질을 포함하여 면역세포 활성화 수치가 대조군(Control)과 유사하여 면역세포에서의 면역반응이 나타나지 않은 것으로 확인되었다(도 6).
요약하면, 본 발명의 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체 나노입자는 면역세포의 식작용(phagocytosis) 억제효과를 가지며 외부물질의 반응에 의한 면역세포 활성화도 유발하지 않으므로 생체적합성이 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 4: 지질나노구조물 복합체 나노입자의 혈액 순환율 분석
4.1 분석 방법
본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자 108개를 친유성(lipophilic) 형광 물질인 DiR로 염색하였다. 상기 염색된 복합체 나노입자 108개(100 uL)를 마우스에 정맥주사하여 체내에서 순환하는 시간을 대조군(Control, Liposome, Exosome)과 함께 확인하였다.
4.2 분석 결과
PEG 효과에 의해 리포좀(liposome)의 혈액에서 순환하는 비율이 가장 높고 엑소좀(exosome)이 가장 낮으며, 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자(300)의 혈액 순환율이 리포좀과 엑소좀사이에 있는것으로 나타났다. 또한 시간이 지남에 따라 세가지 물질의 혈액에서의 농도는 감소하는 것으로 나타났다(도 7).
실시예 5: 지질나노구조물 복합체 나노입자의 표적성능 분석
5.1 지질나노구조물 복합체 나노입자의 소분자(small molecule) 화합물을 이용한 표적성능 분석
5.1.1 분석 방법
폴레이트(folate)는 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 소분자(small molecule) 화합물 형태의 리간드(ligand)이다. 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자 표면에 폴레이트를 미세 유체(microfluidics) 방법으로 결합시켜 암 표적성능을 부여한 복합체 나노입자(F-SURGIsome)를 제조하였다. 상기 제조된 암 표적성능을 부여한 복합체 나노입자 107개에 친유성(lipophilic) 형광 물질인 DiR로 염색하였다. 자궁경부암세포인 HeLa 세포를 플레이팅(plating)하고 GFP를 트랜스펙션(transfection)시킨 다음 상기 DiR로 염색된 복합체 나노입자를 10 uL로 밤새 처리하고 형광 발현을 시험관 내(in vitro)에서 확인하였다. 대조군은 리포좀(Liposome), 폴레이트로 표적성능을 부여한 리포좀(F-liposome) 및 본 발명의 복합체 나노입자(SURGIsome)으로 하였다.
5 x 106개/100 uL로 HeLa 세포를 누드 마우스(nude mouse)에 피하 주사(subcutaneous injection)하고 3일간 사육(breeding)하여 자궁경부암 이종이식 마우스 모델(xenograft mouse model)을 제작하였다. 108개/100 uL의 폴레이트가 결합된 복합체 나노입자를 친유성(lipophilic) 형광 물질인 DiR로 염색하고 이종이식 마우스에 정맥주사로 투여 후 2시간 또는 4시간째에 형광 발현을 생체 내(in vivo)에서 확인하였다. 대조군은 Control, 리포좀(Liposome) 및 폴레이트로 표적성능을 부여한 리포좀(F-liposome)으로 하였다.
5.1.2 분석 결과
자궁경부암세포에서, 폴레이트(folate)에 의해 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(F-SURGIsome)의 암 표적성능이 대조군(Liposome, F-liposome)의 암 표적성능에 비해 월등히 높은 것으로 확인되었다(도 8).
또한, 폴레이트에 의해 자궁경부암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(F-SURGIsome)의 암 표적성능이 자궁경부암세포로 만들어진 자궁경부암 이종이식 마우스 모델에서 투여 후 4시간째에 대조군(Control, Liposome, F-liposome)의 암 표적성능에 비해 우수한 것으로 나타났으며, 특히 자궁경부암세포에서 특이적으로 많이 형광 발현되는 것으로 확인되었다(도 9).
5.2 지질나노구조물 복합체 나노입자의 펩타이드(peptide)를 이용한 표적성능 분석
5.2.1 분석 방법
NTSR-1는 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드(peptide) 형태의 리간드(ligand)이다. 본 발명의 지질나노구조물 복합체 나노입자 표면에 NTSR-1을 미세 유체(microfluidics) 방법으로 결합시켜 암 표적성능을 부여한 복합체 나노입자(N-SURGIsome)를 제조하였다. 상기 제조된 암 표적성능을 부여한 복합체 나노입자 107개에 친유성(lipophilic) 형광 물질인 DiR로 염색하였다. 췌장암세포인 ASPC1 세포를 플레이팅(plating)하고 GFP를 트랜스펙션(transfection)시킨 다음 상기 DiR로 염색된 복합체 나노입자를 10 uL로 밤새 처리하고 형광 발현을 시험관 내(in vitro)에서 확인하였다. 대조군은 리포좀(Liposome), NTSR-1으로 표적성능을 부여한 리포좀(N-liposome) 및 본 발명의 복합체 나노입자(SURGIsome)로 하였다.
5 x 106개/100 uL로 ASPC1 세포를 누드 마우스(nude mouse)에 피하 주사(subcutaneous injection)하고 3일간 사육(breeding)하여 췌장암 이종이식 마우스 모델(xenograft mouse model)을 제작하였다. 108개/100 uL의 NTSR-1이 결합된 복합체 나노입자(N-SURGIsome)를 친유성(lipophilic) 형광 물질인 DiR로 염색하고 이종이식 마우스에 정맥주사로 투여 후 2시간 또는 4시간째에 형광 발현을 생체 내(in vivo)에서 확인하였다. 대조군은 Control, 리포좀(Liposome), 본 발명의 복합체 나노입자(SURGIsome) 및 NTSR-1으로 표적성능을 부여한 리포좀(N-liposome)으로 하였다.
5.2.2 분석 결과
췌장암세포에서, NTSR-1에 의해 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(N-SURGIsome)의 암 표적성능이 대조군의 암 표적성능에 비해 월등히 높은 것으로 확인되었다(도 10).
또한, NTSR-1에 의해 췌장암세포에 특이적으로 결합하는 복합체 나노입자(N-SURGIsome)의 암 표적성능이 췌장암세포로 만들어진 췌장암 이종이식 마우스 모델에서 투여 후 4시간째에 대조군의 암 표적성능에 비해 현저하게 높은 것으로 나타났으며, 특히 췌장암세포에서 특이적으로 많이 형광 발현되는것으로 확인되었다(도 11).
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
Claims (11)
- (i) 지질나노구조물; 및 (ii) 상기 지질나노구조물의 표면 지질층(lipid layer)에 인간세포 유래 세포막단백질을 포함하는 지질나노구조물 복합체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 인간세포는 HEK293T 세포인 것을 특징으로 하는 지질나노구조물 복합체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 지질나노구조물은 세포외소포체(extracellular vesicles), 리포좀 (liposome) 또는 지질나노입자(lipid nanoparticle)인 것을 특징으로 하는 지질나노구조물 복합체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 지질나노구조물 복합체는 세포막단백질 : 지질 = 1 : 10 - 2000의 중량비인 것을 특징으로 하는 지질나노구조물 복합체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 지질나노구조물의 표면 지질층은 표적세포에 특이적으로 결합하는 리간드(ligand)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지질나노구조물 복합체.
- 제 5 항에 있어서,
상기 리간드는 소분자(small molecule) 화합물, 압타머(aptamer), 펩타이드(peptide), 단백질 및 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질나노구조물 복합체.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 지질나노구조물 복합체에 약물이 봉입(encapsulation)된 약물 전달체.
- (i) 제 7 항에 따른 약물 전달체의 치료학적 유효량; 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암치료용 약학 조성물.
- 제 8 항에 있어서,
상기 암치료는 자궁경부암, 자궁암, 췌장암, 유방암, 담도암, 담낭암, 대장암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 두경부암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암, 골암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 요도암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 암을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물
- 다음의 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 지질나노구조물 복합체의 제조방법:
(a) 지질(lipid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylen glycol)을 유기용매에 용해시켜 리포좀(liposome)을 준비하는 단계;
(b) 인간세포로부터 세포막단백질을 분리하여 세포막단백질을 준비하는 단계; 및
(c) 상기 준비된 리포좀과 세포막단백질을 혼합한 후 압출(extrusion)하여 지질나노구조물 복합체를 제조하는 단계.
- 제 10 항에 있어서,
상기 단계 (a)는 약물 봉입(encapsulation)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지질나노구조물 복합체의 제조방법.
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