KR20240016352A - 약물-내성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
테모졸로미드(TMZ)-내성 암 환자를 치료하기 위한 조합물 및 방법으로서, TMZ와, β-카테닌/c-Myc/SOX2 신호전달 경로의 하향조절 및 WT-p53 매개된 MGMT 억제의 상향조절에 의해서 TMZ-매개된 사포독성 효과를 향상시켜 TMZ 내성을 극복하기게 효과적인 상대적 비율의 이소폼-선택적 HDAC8 억제제, 예컨대 BMX의 조합물을 포함하는, 조합물 및 방법이 제공된다.
Description
본 비가출원은 2021년 5월 28일자 출원된 미국 가특허출원 제63/194,585호에 대한 35 U.S.C. §119 (a) 하의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에서 참조로 통합된다.
본 발명은 약물-내성 암, 특히 TMZ-내성 암을 치료하기 위한 새로운 조성물 및 방법에 관한 것이다.
다형 교모세포종(GBM)은 가장 악성 종양 중 하나이며 공격적인 패턴과 높은 재발률을 가지고 있고; 이는 세계보건기구(WHO) 등급 IV 성상세포종이다[1]. 수술과 방사선 및 화학요법을 병용하는 복합 치료에도 불구하고, GBM을 앓고 있는 환자는 평균 생존 기간이 15개월 미만으로 치료 내성을 나타내 여전히 예후가 좋지 않다[2-4].
결장암 또는 결장직장암(CRC)은 가장 널리 퍼진 악성 종양의 종류 중 하나이며 전 세계적으로 암 사망의 세 번째 주요 원인이다. 비록 결장암이나 CRC 표준 치료법은 이미 잘 연구되고 확립되었지만, 여전히 높은 사망률과 임상적 과제가 남아 있다. 환자가 흔히 초기 평가에서 진행성 암으로 진단되는 되기 때문에 질환은 증상이 덜하고, 그에 따른 5년 생존율은 약 10%이다[5-6]. CRC의 표준 치료법은 수술, 방사선 및/또는 화학요법이며, 여기서, 옥살리플라틴(Oxaliplatin: Oxp) 및 이의 전구약물 카페시타빈은 임상 실습에서 널리 사용된다[7-8]. 불행하게도, 이러한 종류의 DNA 가교제 치료 하에서 재발은 전체 주기를 완료한 후에도 처음 몇 년 이내에 여전히 흔하다[9].
테모졸로미드(TMZ)는 혈액-뇌 장벽에 잘 침투하는 알킬화제 다카르바진(dacarbazine)의 이미다조테트라진 친지성 전구약물이다. TMZ는 생리학적 pH에서 반응성 화합물 5- (3-메틸트리아젠-1-일)-이미다졸-4-카르복사미드 (MTIC)로 자발적인 비효소적 전환을 통해 생성된다[10]. MTIC의 세포독성은 주로 구아닌의 O6 및 N7 위치에서 발생하는 DNA의 알킬화(메틸화)로 인해 발생하는 것으로 생각된다. TMZ는 2005년 FDA의 최초 승인 이후로 새로 진단된 다형 교모세포종(GBM)에 대한 표준 화학요법으로 널리 사용되어 왔다. GBM 외에도, TMZ는 다카르바진과 동일한 효능을 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, 그것은 표준 치료 후의 악성 흑색종 환자에게 "오프 라벨off-label)"로 사용되기도 한다. 또한, 많은 임상 연구가 뇌 전이, 림프종, 신경내분비 종양, 뇌하수체 종양, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 원시 신경외배엽 종양(primitive neuroectodermal tumor), 난치성 백혈병, 폐암 및 기타 종양과 같은 다른 적응증에서 TMZ의 효과를 입증하기 위해서 진행중에 있다[11]. TMZ는 임상에서 노인, 소아, 또는 완화 환자를 위한 관용성이 좋은 치료제이며, 이는 단일제 또는 보조제(방사선요법 또는 화학요법) 1차 또는 X선 치료제로 사용할 수 있다. 그러나, TMZ-치료 환자의 약물 내성이 O6-메틸구아닌 메틸트랜스퍼라제(MGMT)의 과발현으로 인해 발생한다. 따라서, 이는 GBM을 성공적으로 치료하기 위해 극복해야 하는 임상적으로 의미 있고 실질적인 장애물이다.
그러나, 구아닌의 O6 위치의 메틸화를 역전시켜 GBM 세포의 DNA를 복구하고 화학요법 효과에 저항하는 O6-메틸구아닌 메틸트랜스퍼라제(MGMT)의 과발현으로 인해 환자의 50% 미만이 TMZ에 반응한다[12-14]. 새로 진단된 CRC 환자와 TMZ 치료를 받은 재발 CRC 환자 간의 MGMT 단백질 수준을 비교하면 MGMT 감소가 TMZ 치료의 효능을 촉진할 수 있음을 지지하였다[15-17]. 프로모터 메틸화 외에도, MGMT는 p53, Sp1, NF-κB, CEBP 및 AP-18과 같은 다양한 전사 인자에 의해 조절된다. 이 중 p53은 MGMT 프로모터와 직접 상호작용하여 MGMT 전사를 하향조절한다[18, 19]. 따라서, MGMT 프로모터 메틸화 외에도, p53은 MGMT 발현을 조절하고 TMZ 내성을 유발시킬 수 있다. 따라서, TMZ 내성을 극복하기 위해서 MGMT를 조절하는 추가 메커니즘이 확인되어야 한다.
따라서, 약물-내성 암, 특히 TMB-내성 GBM 또는 CRC에 대한 새롭고 더 우수한 요법 또는 치료법을 개발하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 약물-내성 암, 예컨대, TMZ-내성 GBM 또는 CRC의 치료를 위한 새로운 방법을 제공한다.
예상치 못하게, 화합물 X, 예컨대, BMX가 GBM-R 세포주 및 CRC 세포주 HT29, HCT116 및 RKO에 대한 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킬 수 있음이 발견되었다. 따라서, 본 발명은 환자에서의 약물-내성 암, 특히 TMZ-내성 GBM 또는 CRC를 치료하는 새로운 방법으로서, 상기 환자에게 BMX와 TMZ의 조합물을 투여함을 포함하는 새로운 방법을 제공한다.
본 발명에서, 히스톤 데아세틸라제 8 억제제(HDAC8i)인 BMX(NBM-T-L-BMX-OS01)은 직장결장암 세포, 인간 제대 내피 세포, 폐암 세포 및 교모 세포종 세포에서 유의힘한 항-세포 증식 효과를 나타내며, 이는 또한 동물 제노그래프 모델(animal xenograph model)에서 종양 억제 능력을 나타낸다[20, 21]. 그러나, 예상치 못하게, BMX가 암세포의 약물-내성을 극복할 수 있다는 것이 본 발명에서 발견되었다. 본 발명의 한 예에서, BMX는 β-카테닌/c-Myc/SOX2 신호 전달 경로를 하향 조절하고 p53-매개된 MGMT 억제를 상향 조절함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜 GBM-R 세포를 극복할 수 있다. 인간 GBM 조직 및 GBM-R 세포주에서의 높은 HDAC8 발현이 MGMT 수준과 상관관계가 있고, BMX와 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포주에서 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 통해 WT(야생형)-p53 매개된 아폽토시스를 유도함이 확인되었다. 더욱이, BMX와 TMZ의 조합물은 GBM-R 세포주에서 β-카테닌/c-Myc/사이클린 D1/SOX2 신호 전달 경로를 통해 세포 증식과 GSC 표현형 활성을 억제하였다.
본 발명의 일 예에서, p53/p21/Puma/Bax의 상향 조절을 통해 CRC 세포의 세포 주기 정지, 노화, 자가포식 및 아폽토시스에서 촉발된 BMX와 TMZ의 조합물은 하향 조절 Wnt/β-카테닌/사이클린 D1/c-Myc/p62 경로의 혼선으로 인해 손상됨이 입증되었다. 따라서, BMX는 TMZ 내성 GBM 환자 또는 WT-p53이 있는 CRC 환자의 정밀한 개인 치료를 위한 유망한 전략이 될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 TMZ와 화학식 A의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 입체이성질체, 거울상이성질체, 전구약물 또는 용매화물을 포함하는 TMZ-내성 암을 치료하기 위한 조합물을 제공한다:
화학식 A
상기 식에서,
R1은 수소, 알킬, 알케닐, C5-C6 사이클로알킬, 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 5-원 또는 6-원 헤테로사이클, 또는 (CH2)mR4이고;
X는 C, -O-, -N- 또는 -S-이고;
Y는 -O-, -NH 또는 -O-C1-C4 알킬이고;
n은 0 내지 10의 정수이고;
m은 0 내지 5의 정수이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-C6 알킬이고;
R4는 할로겐, -CF3, -OR7 또는 -NR7R8로 치환될 수 있는 C5-C6 사이클로알킬 또는 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 헤테로사이클이고, 여기서, R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
R5는 OH, NH2 또는 C5-C6 사이클로알킬, 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 헤테로사이클이고, 여기서, 사이클로알킬, 카르보사이클 및 헤테로사이클은 할로겐, NH2, NO2, C1-C6 알콕시, C1-6 알킬티오, OR7", NR7R8 또는 CF3로 임의로 치환될 수 있고;
R6은 H, 또는 하이드록시 또는 C2-C10 알케닐에 의해서 치환될 수 있는 C1-C10 알킬이거나, R1와 함께 -C2H2-이고;
여기서, TMZ와 화합물 A는 TMZ 내성을 효과적으로 극복하도록 상대적인 비율로 조합된다.
본 발명의 일 구체예에서, 화합물 A는 이하 구조를 갖는 화합물 BMX이다:
본 발명에 따르면, TMZ 내성은 β-카테닌/c-Myc/SOX2 신호전달 경로를 하향조절하고 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 상향조절함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과의 향상에 의해서 극복된다.
본 발명에서, TMZ와 화합물 A, 예를 들어, BMX는 별도로 또는 순차적으로 투여된다.
본 발명의 일 예에서, 암은 다형 교모세포종(GBM) 또는 직장결장암(CRC)이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에서의 TMZ-내성 암을 치료하는 방법으로서, 환자에게 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 조합물을 투여함을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 암은 GBM 또는 CRC이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 환자에서의 약물-내성 암에 대한 정밀한 개인적인 치료를 위한 방법으로서, 환자에서의 WT-p53의 발현을 측정하고, 환자에게서 WT-p53의 발현이 존재하는 경우에, 치료학적 유효량의 BMX 또는 이의 조합물을 상기 약물과 함께 투여함을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 약물은 TMZ이다.
본 발명의 한 가지 특정의 구체예에서, 약물-내성 암은 TMZ-내성 암, 특히 GMB 또는 CRC이다.
본 발명에서, BMX는 WT-p53 암 세포의 억제를 향상시키기에 효과적인 것으로 확인된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제를 제조하기 위한 BMX와 TMZ의 조합물의 사용 또는 TMZ-내성 암을 치료하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 이하 예에 의해서 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이하 예는 단지 예시의 목적으로 의도된 것이며 실제로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 이하 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 현재 바람직한 구체예가 도면에 도시되어 있다.
도면에서,
도 1은 생물정보학 도구(bioinformatics tool)에 의해서 HDAC8과 잠재적으로 연관되어 있는 유전자에 대한 경로 분석을 제공하고; 여기서, shRNA HDAC8가 CLUE 데이터베이스에 입력되었으며, 점수가 >90인 CP 및 PCL이 선택되었다(A). 표적 유전자를 추가 실험을 위해 CPDB 경로 분석 데이터베이스(B)에 입력하였다. (C) shRNA HDAC8에 대한 CP 및 PCL(점수 > 90)을 선택하기 위한 상위 10개 경로는 이하와 같다: VEGF; PI3K-Akt 신호전달 경로; JAK STAT 경로 및 조절; 신호전달 경로; MAPK 신호전달 경로-호모사피엔스(인간); 아폽토시스; 자가포식; HIF-1 신호전달 경로; 아폽토시스 신호전달 경로의 TNF 관련된 약한 유도인자(TWEAK); Wnt 신호전달 경로. VEGF; PI3K-Akt 신호전달 경로; JAK STAT 경로 및 조절; 신호전달 경로; MAPK 신호전달 경로-호모사피엔스(인간); 아폽토시스; 자가포식; HIF-1 신호전달 경로; 아폽토시스 신호전달 경로의 TNF 관련된 약한 유도인자(TWEAK); Wnt 신호전달 경로.
도 2는 BMX가 GBM 세포의 성장 및 증식을 억제하고(U87MG 및 A172), BMX 및 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서의 성장 및 증식을 억제함((U87MG-R 및 A172-R)을 나타내고 있다. (A) BMX의 화학적 구조. (B) 0.5, 10, 15, 30, 또는 50 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (C) 0.25, 50, 100, 200, 400, 또는 800 μM TMZ에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (D) TMZ와 함께 또는 그것 없이 다양한 농도 (0.25, 50, 100, 200, 400, 또는 800 μM)에서 24 시간 동안 10 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포 생존율. (E) BMX와 함께 또는 그것 없이 다양한 농도 (0.5, 10, 15, 30, 또는 50 μM)에서 24 시간 동안 50μM TMZ에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포 생존율. (F) 10 μM BMX와 함께 또는 그것 없이 24, 48, 및 72 시간 동안 50 μM TMZ에 의한 처리 후의 GBM-R 세포 생존율. (G) TMZ (50 μM)와 함께 또는 그것 없이 14 일 동안의 BMX (0, 5, 또는 10 μM)에 의한 GBM 및 GBM-R 세포주의 콜로니 형성 분석. 데이터는 3개의 실험으로부터의 평균 ± SEM으로서 표현된다. *p < 0.05 vs. 대조군 (A172 및 U87MG); #p < 0.05 vs. (A172-R 및 U87MG-R) .
도 3은 BMX가 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 표적화하여 GBM-R 세포에서의 세포 증식을 억제함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킴을 나타내고 있다. (A) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM-R 세포의 GSK-3β 및 β-카테닌 활성화 상태. (B) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM-R 세포의 c-Myc 및 사이클린 D1 단백질 수준. (C) β-카테닌 (Ser33/37/41) 포스포릴화 상태 및 10 μM MG132와 함께 또는 그것 없이 10 μM BMX 및 50 μm TMZ에 의한 처리 후의 GBM-R 세포 내의 c-Myc 및 사이클린 D1 단백질 발현에서의 변화.
도 4는 BMX 및 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서 TMZ-매개된 아폽토시스를 촉진시킴으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시키고 있음을 나타낸다. (A) TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX로 48 시간 동안 처리된 GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R) 세포의 세포 주기 분포. (B) G0/G1, S 및 G2/M 기에서의 세포 백분율은 히스토그램(histogram)으로 나타내어져 있다. (C) sub-G1의 백분율의 막대 그래프. (D) TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R) 세포의 아넥신 V/PI 아폽토시스 분석. (E) 아폽프토틱 세포(apoptotic cell)의 백분율을 예시하고 있는 히스토그램.
도 5는 BMX와 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서의 WT-p53 매개된 MGMT 억제에 의한 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킴을 나타내고 있다. (A) GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R) 세포주 상의 WT-p53 및 MGMT의 발현 패턴. (B) U87MG-R 및 A172-R 세포에 대해서 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 처리 후 WT-p53, MGMT, P21, Bax, Bcl-2, Puma, 및 분열된 카스파제-3(cleaved caspase-3)의 단백질 변경. (C) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R)의 처리는 MGMT 수준을 감소시키고 WT-p53 및 포스포-WT-p53 수준(ser 15)을 증가시킨다. β-액틴을 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 6은 BMX와 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서의 GSC 형성을 감소시킴을 나타내고 있다. (A) 모체 세포주와 내성 딸 세포주 사이의 CSC-관련된 유전자(CD133, CD44, 및 SOX2) 발현의 상태. (B) U87MG-R 및 A172-R 세포에 대한 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 및 10 μM BMX를 가한 후의 CD133, CD44, 및 SOX2 단백질 수준에서의 변화. (C) 수술적 생검을 통해서 얻은 인간 일차 GBM(동시 방사선 및 화학요법 전의 동일한 환자) 및 재발 GBM 종양 조직(동시 방사선 및 화학요법 후)에서의 HDAC8 및 CSC-관련된 유전자CD133 및 CD44)에 대한 면역조직화학적 염색.
도 7은 GBM-R 세포에서의 TMZ 내성을 극복하기 위한 TMZ와의 BMX의 조합물의 메커니즘의 작용 모델을 제공한다.
도 8은 GBM 세포주의 유전적 특성을 나타내고 있다. (A) 웨스턴 블롯(western blot)에 의한 GBM 세포에서의 Abcam 회사로부터의 HDAC8의 발현.
도 9는 BMX가 효능적인 반합성 HDAC8 억제제임을 나타내고 있다. (B) 빅 데이터 분석을 통한 MGMT 메틸화 쌍 GBM의 검사. 야생형과 돌연변이는 각각 파란색과 빨간색으로 표시된다(일방적 t 테스트(one-sided t test), *: p<0.05). (A) TMZ(50μM)의 존재 또는 부재 하에 상이한 용량의 BMX(0-10μM)로 자극된 HDAC8 발현 수준을 qRT-PCR 분석을 사용하여 측정하였다. (B) TMZ (50 μM)와 함께 또는 그것 없이 BMX(0-10 μM)로 자극된 HDAC8 발현 수준을 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 사용하여 측정하였다.
도 10은 BMX 및 TMZ와 함께 한 BMX가 U87MG, U87MG-R, A172 및 A172-R의 성장 및 증식을 억제함을 나타내고 있다. (A) 지시된 농도의 BMX(0.5, 10, 15, 30 또는 50 μM)로 24, 48 및 72 시간 동안 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (B) 지시된 농도의 TMZ(0.25, 50, 100, 200, 400 또는 800 μM)로 24, 48 및 72 시간 동안 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (C) TMZ와 함께 또는 그것 없이 상이한 농도(0.25, 50, 100, 200, 400 또는 800 μM)에서 24, 48 및 72 시간 동안 10 μM BMX로 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (D) BMX와 함께 또는 그것 없이 상이한 농도(0.5, 10, 15, 30 또는 50 μM)에서 24, 48 및 72 시간 동안 50μM TMZ로 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (E) 10 μM BMX와 함께 또는 그것 없이 24, 48 및 72 시간 동안 50 μM TMZ로 처리된 후의 GBM-R 세포주의 세포 생존율.
도 11은 GBM 세포에서의 BMX의 시험관내 세포독성을 나타내고 있다. (A) U87 및 U87R 세포 및 (B) A172 및 A172R 세포를 TMZ(50 및 100 μM)로 처리하였다. GBM 세포에 대한 TMZ의 이러한 억제 효과는 클론원성 분석을 사용하여 측정하였다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 12는 야생형 p53(WT-p53)인 두 개의 모 GBM 세포주(A172 및 U87MG)와 두 개의 TMZ-내성 GBM 세포주의 HDAC8 발현 수준을 포함하는 교모 세포종에서의 약물 및 유전자 정보를 나타내고 있다.
도 13은 BMX, TMZ, 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 독소루비신(doxorubicin) 조합물이 CRC 세포에서의 세포 증식을 억제함을 나타내고 있다. (A) 다양한 약물 농도 및 처리 기간에 의한 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 BMX, TMZ, Oxp, Dox, BMX plus TMZ, BMX plus Oxp 또는 BMX plus Dox의 증식을 CCK-8 방법을 이용하여 분석하였다. (B) HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 BMX, TMZ, Oxp, BMX + TMZ, BMX + Oxp의 상이한 처리에 의한 콜로니 형성 능력 분석을 수행하여 클론을 정량화하고 통계 수치로 제시하였다. (C) HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 상이한 농도의 BMX 또는 TMZ와 조합된 BMX에 의한 48시간 처리 후 세포 주기 분석 및 각각의 세포 주기 단계에서의 세포의 비율. (D) 상이한 농도의 BMX 또는 TMZ와 조합된 BMX에 의한 48 시간 처리 후의 아폽토시스 분석 및 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 세포의 아폽토틱 속도(apoptotic rate). 모든 결과는 세 개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± s.d.로서 나타내어져 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 대조군 (HT29 세포) ; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. 대조군 (HCT116 세포) ; vs. 대조군 (RKO 세포) .
도 14는 p53 매개된 MGMT 억제에 의해서 매개된 BMX, BMX 및 TMZ의 조합물-유도된 아폽토시스 및 자가포식의 효과를 나타낸다. (A) 다양한 농도 BMX (5 및 10 μM) 및 TMZ와 조합된 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 P53, p53 Lys382 아세틸화, p53 Ser15 포스포릴화, p21, p16, MGMT, γH2AX, E2F1 및 E2F3 발현의 웨스턴 블롯 분석. (B) 다양한 농도 BMX(5 및 10 uM) 및 TMZ와 조합된 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 분열된 카스파제-3, -7, -8, -9 및 분열된 PARP 단백질의 발현. (C) 다양한 농도 BMX (5 및 10 uM) 및 TMZ와 조합된 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 Bax, Bcl-2, BID, Bim, Bak 및 Puna 단백질의 발현. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 15는 BMX, BMX 및 TMZ의 조합물이 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 세포 노화를 유도함을 나타내고 있다. BMX 및 TMZ의 조합물의 노화-연관된 β-갈락토시다제 (SAβ-gal) 염색. 세포를 10 μM의 BMX plus TMZ(50 μM)로 48 시간 동안 처리하였고, 세포를 SAβ-gal(청색 세포질 염색)으로 염색시켰다. 스케일 바(Scale bar), 50 μm. SAβ-gal 활성의 정량화. 모든 결과는 세 개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± s.d.로서 나타내어져 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 대조군 (HT29 세포) ; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. 대조군 (HCT116 세포) ; vs. 대조군 (RKO 세포) .
도 16은 BMX 및 TMZ의 조합물이 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 CSC 형성을 감소시킴을 나타내고 있다. HT29, HCT116 및 RKO 세포에 대한 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 5 및 10 μM BMX로 48 시간 동안 처리도니 후의 CD133, CD44, 및 SOX2 단백질 수준에서의 변화. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 17은 BMX가 CRC 세포 내의 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 표적화함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킴을 나타내고 있다. (A) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 5 또는 10 μM BMX에 의한 48 시간 동안의 처리 후의 HT29, HCT116 및 RKO 세포의 GSK--3β, β--카테닌 활성화 상태, c-Myc 및 사이클린 D1. (B) GSK-3β, β-카테닌 활성화 상태, c-Myc 및 사이클린 D1 발현은 T29, HCT116 및 RKO 세포에서 50 μM TMZ 및 MG132와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 상향 조절된다. (C) P53 및 MGMT 발현은 T29, HCT116 및 RKO 세포에서 50 μM TMZ 및 MG132와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 상향 조절된다. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 18은 자가포식이 BMX와, BMX 및 TMZ의 조합물 유도된 세포 사망의 원인임을 나타내고 있다. (A) 웨스턴 블롯에 의해서 평가된 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX(5 및 10 μM)에 의해서 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 LC3 및 P62/SQSTM1 발현. (B) p62/SQSTM1 발현은 T29, HCT116 및 RKO 세포에서 50 μM TMZ 및 MG132와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 하향 조절된다. (C) BAF 및 VAD에 의한 전처리는 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 BMX(5 및 10 μM)에 노출된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 세포 아폽토시스를 감소시켰다. (D) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX(5 및 10 μM)에 대한 VAD 및 BAF의 효과는 분열된 카스파제-3, 분열된 PARP, P62 및 LC3 발현을 유도하였다. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도면에서,
도 1은 생물정보학 도구(bioinformatics tool)에 의해서 HDAC8과 잠재적으로 연관되어 있는 유전자에 대한 경로 분석을 제공하고; 여기서, shRNA HDAC8가 CLUE 데이터베이스에 입력되었으며, 점수가 >90인 CP 및 PCL이 선택되었다(A). 표적 유전자를 추가 실험을 위해 CPDB 경로 분석 데이터베이스(B)에 입력하였다. (C) shRNA HDAC8에 대한 CP 및 PCL(점수 > 90)을 선택하기 위한 상위 10개 경로는 이하와 같다: VEGF; PI3K-Akt 신호전달 경로; JAK STAT 경로 및 조절; 신호전달 경로; MAPK 신호전달 경로-호모사피엔스(인간); 아폽토시스; 자가포식; HIF-1 신호전달 경로; 아폽토시스 신호전달 경로의 TNF 관련된 약한 유도인자(TWEAK); Wnt 신호전달 경로. VEGF; PI3K-Akt 신호전달 경로; JAK STAT 경로 및 조절; 신호전달 경로; MAPK 신호전달 경로-호모사피엔스(인간); 아폽토시스; 자가포식; HIF-1 신호전달 경로; 아폽토시스 신호전달 경로의 TNF 관련된 약한 유도인자(TWEAK); Wnt 신호전달 경로.
도 2는 BMX가 GBM 세포의 성장 및 증식을 억제하고(U87MG 및 A172), BMX 및 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서의 성장 및 증식을 억제함((U87MG-R 및 A172-R)을 나타내고 있다. (A) BMX의 화학적 구조. (B) 0.5, 10, 15, 30, 또는 50 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (C) 0.25, 50, 100, 200, 400, 또는 800 μM TMZ에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (D) TMZ와 함께 또는 그것 없이 다양한 농도 (0.25, 50, 100, 200, 400, 또는 800 μM)에서 24 시간 동안 10 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포 생존율. (E) BMX와 함께 또는 그것 없이 다양한 농도 (0.5, 10, 15, 30, 또는 50 μM)에서 24 시간 동안 50μM TMZ에 의한 처리 후의 GBM 및 GBM-R 세포 생존율. (F) 10 μM BMX와 함께 또는 그것 없이 24, 48, 및 72 시간 동안 50 μM TMZ에 의한 처리 후의 GBM-R 세포 생존율. (G) TMZ (50 μM)와 함께 또는 그것 없이 14 일 동안의 BMX (0, 5, 또는 10 μM)에 의한 GBM 및 GBM-R 세포주의 콜로니 형성 분석. 데이터는 3개의 실험으로부터의 평균 ± SEM으로서 표현된다. *p < 0.05 vs. 대조군 (A172 및 U87MG); #p < 0.05 vs. (A172-R 및 U87MG-R) .
도 3은 BMX가 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 표적화하여 GBM-R 세포에서의 세포 증식을 억제함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킴을 나타내고 있다. (A) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM-R 세포의 GSK-3β 및 β-카테닌 활성화 상태. (B) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 처리 후의 GBM-R 세포의 c-Myc 및 사이클린 D1 단백질 수준. (C) β-카테닌 (Ser33/37/41) 포스포릴화 상태 및 10 μM MG132와 함께 또는 그것 없이 10 μM BMX 및 50 μm TMZ에 의한 처리 후의 GBM-R 세포 내의 c-Myc 및 사이클린 D1 단백질 발현에서의 변화.
도 4는 BMX 및 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서 TMZ-매개된 아폽토시스를 촉진시킴으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시키고 있음을 나타낸다. (A) TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX로 48 시간 동안 처리된 GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R) 세포의 세포 주기 분포. (B) G0/G1, S 및 G2/M 기에서의 세포 백분율은 히스토그램(histogram)으로 나타내어져 있다. (C) sub-G1의 백분율의 막대 그래프. (D) TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R) 세포의 아넥신 V/PI 아폽토시스 분석. (E) 아폽프토틱 세포(apoptotic cell)의 백분율을 예시하고 있는 히스토그램.
도 5는 BMX와 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서의 WT-p53 매개된 MGMT 억제에 의한 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킴을 나타내고 있다. (A) GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R) 세포주 상의 WT-p53 및 MGMT의 발현 패턴. (B) U87MG-R 및 A172-R 세포에 대해서 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 처리 후 WT-p53, MGMT, P21, Bax, Bcl-2, Puma, 및 분열된 카스파제-3(cleaved caspase-3)의 단백질 변경. (C) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 또는 10 μM BMX에 의한 GBM (U87MG 및 A172) 및 GBM-R (U87MG-R 및 A172-R)의 처리는 MGMT 수준을 감소시키고 WT-p53 및 포스포-WT-p53 수준(ser 15)을 증가시킨다. β-액틴을 내부 대조군으로서 사용하였다.
도 6은 BMX와 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서의 GSC 형성을 감소시킴을 나타내고 있다. (A) 모체 세포주와 내성 딸 세포주 사이의 CSC-관련된 유전자(CD133, CD44, 및 SOX2) 발현의 상태. (B) U87MG-R 및 A172-R 세포에 대한 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 5 및 10 μM BMX를 가한 후의 CD133, CD44, 및 SOX2 단백질 수준에서의 변화. (C) 수술적 생검을 통해서 얻은 인간 일차 GBM(동시 방사선 및 화학요법 전의 동일한 환자) 및 재발 GBM 종양 조직(동시 방사선 및 화학요법 후)에서의 HDAC8 및 CSC-관련된 유전자CD133 및 CD44)에 대한 면역조직화학적 염색.
도 7은 GBM-R 세포에서의 TMZ 내성을 극복하기 위한 TMZ와의 BMX의 조합물의 메커니즘의 작용 모델을 제공한다.
도 8은 GBM 세포주의 유전적 특성을 나타내고 있다. (A) 웨스턴 블롯(western blot)에 의한 GBM 세포에서의 Abcam 회사로부터의 HDAC8의 발현.
도 9는 BMX가 효능적인 반합성 HDAC8 억제제임을 나타내고 있다. (B) 빅 데이터 분석을 통한 MGMT 메틸화 쌍 GBM의 검사. 야생형과 돌연변이는 각각 파란색과 빨간색으로 표시된다(일방적 t 테스트(one-sided t test), *: p<0.05). (A) TMZ(50μM)의 존재 또는 부재 하에 상이한 용량의 BMX(0-10μM)로 자극된 HDAC8 발현 수준을 qRT-PCR 분석을 사용하여 측정하였다. (B) TMZ (50 μM)와 함께 또는 그것 없이 BMX(0-10 μM)로 자극된 HDAC8 발현 수준을 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 사용하여 측정하였다.
도 10은 BMX 및 TMZ와 함께 한 BMX가 U87MG, U87MG-R, A172 및 A172-R의 성장 및 증식을 억제함을 나타내고 있다. (A) 지시된 농도의 BMX(0.5, 10, 15, 30 또는 50 μM)로 24, 48 및 72 시간 동안 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (B) 지시된 농도의 TMZ(0.25, 50, 100, 200, 400 또는 800 μM)로 24, 48 및 72 시간 동안 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (C) TMZ와 함께 또는 그것 없이 상이한 농도(0.25, 50, 100, 200, 400 또는 800 μM)에서 24, 48 및 72 시간 동안 10 μM BMX로 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (D) BMX와 함께 또는 그것 없이 상이한 농도(0.5, 10, 15, 30 또는 50 μM)에서 24, 48 및 72 시간 동안 50μM TMZ로 처리된 후의 GBM 및 GBM-R 세포주의 세포 생존율. (E) 10 μM BMX와 함께 또는 그것 없이 24, 48 및 72 시간 동안 50 μM TMZ로 처리된 후의 GBM-R 세포주의 세포 생존율.
도 11은 GBM 세포에서의 BMX의 시험관내 세포독성을 나타내고 있다. (A) U87 및 U87R 세포 및 (B) A172 및 A172R 세포를 TMZ(50 및 100 μM)로 처리하였다. GBM 세포에 대한 TMZ의 이러한 억제 효과는 클론원성 분석을 사용하여 측정하였다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 12는 야생형 p53(WT-p53)인 두 개의 모 GBM 세포주(A172 및 U87MG)와 두 개의 TMZ-내성 GBM 세포주의 HDAC8 발현 수준을 포함하는 교모 세포종에서의 약물 및 유전자 정보를 나타내고 있다.
도 13은 BMX, TMZ, 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 독소루비신(doxorubicin) 조합물이 CRC 세포에서의 세포 증식을 억제함을 나타내고 있다. (A) 다양한 약물 농도 및 처리 기간에 의한 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 BMX, TMZ, Oxp, Dox, BMX plus TMZ, BMX plus Oxp 또는 BMX plus Dox의 증식을 CCK-8 방법을 이용하여 분석하였다. (B) HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 BMX, TMZ, Oxp, BMX + TMZ, BMX + Oxp의 상이한 처리에 의한 콜로니 형성 능력 분석을 수행하여 클론을 정량화하고 통계 수치로 제시하였다. (C) HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 상이한 농도의 BMX 또는 TMZ와 조합된 BMX에 의한 48시간 처리 후 세포 주기 분석 및 각각의 세포 주기 단계에서의 세포의 비율. (D) 상이한 농도의 BMX 또는 TMZ와 조합된 BMX에 의한 48 시간 처리 후의 아폽토시스 분석 및 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 세포의 아폽토틱 속도(apoptotic rate). 모든 결과는 세 개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± s.d.로서 나타내어져 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 대조군 (HT29 세포) ; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. 대조군 (HCT116 세포) ; vs. 대조군 (RKO 세포) .
도 14는 p53 매개된 MGMT 억제에 의해서 매개된 BMX, BMX 및 TMZ의 조합물-유도된 아폽토시스 및 자가포식의 효과를 나타낸다. (A) 다양한 농도 BMX (5 및 10 μM) 및 TMZ와 조합된 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 P53, p53 Lys382 아세틸화, p53 Ser15 포스포릴화, p21, p16, MGMT, γH2AX, E2F1 및 E2F3 발현의 웨스턴 블롯 분석. (B) 다양한 농도 BMX(5 및 10 uM) 및 TMZ와 조합된 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 분열된 카스파제-3, -7, -8, -9 및 분열된 PARP 단백질의 발현. (C) 다양한 농도 BMX (5 및 10 uM) 및 TMZ와 조합된 BMX에 의해서 48 시간 동안 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 Bax, Bcl-2, BID, Bim, Bak 및 Puna 단백질의 발현. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 15는 BMX, BMX 및 TMZ의 조합물이 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 세포 노화를 유도함을 나타내고 있다. BMX 및 TMZ의 조합물의 노화-연관된 β-갈락토시다제 (SAβ-gal) 염색. 세포를 10 μM의 BMX plus TMZ(50 μM)로 48 시간 동안 처리하였고, 세포를 SAβ-gal(청색 세포질 염색)으로 염색시켰다. 스케일 바(Scale bar), 50 μm. SAβ-gal 활성의 정량화. 모든 결과는 세 개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± s.d.로서 나타내어져 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 대조군 (HT29 세포) ; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. 대조군 (HCT116 세포) ; vs. 대조군 (RKO 세포) .
도 16은 BMX 및 TMZ의 조합물이 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 CSC 형성을 감소시킴을 나타내고 있다. HT29, HCT116 및 RKO 세포에 대한 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 5 및 10 μM BMX로 48 시간 동안 처리도니 후의 CD133, CD44, 및 SOX2 단백질 수준에서의 변화. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 17은 BMX가 CRC 세포 내의 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 표적화함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킴을 나타내고 있다. (A) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 5 또는 10 μM BMX에 의한 48 시간 동안의 처리 후의 HT29, HCT116 및 RKO 세포의 GSK--3β, β--카테닌 활성화 상태, c-Myc 및 사이클린 D1. (B) GSK-3β, β-카테닌 활성화 상태, c-Myc 및 사이클린 D1 발현은 T29, HCT116 및 RKO 세포에서 50 μM TMZ 및 MG132와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 상향 조절된다. (C) P53 및 MGMT 발현은 T29, HCT116 및 RKO 세포에서 50 μM TMZ 및 MG132와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 상향 조절된다. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 18은 자가포식이 BMX와, BMX 및 TMZ의 조합물 유도된 세포 사망의 원인임을 나타내고 있다. (A) 웨스턴 블롯에 의해서 평가된 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX(5 및 10 μM)에 의해서 처리된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 LC3 및 P62/SQSTM1 발현. (B) p62/SQSTM1 발현은 T29, HCT116 및 RKO 세포에서 50 μM TMZ 및 MG132와 함께 또는 그것 없이 BMX에 의해서 하향 조절된다. (C) BAF 및 VAD에 의한 전처리는 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 48 시간 동안 BMX(5 및 10 μM)에 노출된 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서의 세포 아폽토시스를 감소시켰다. (D) 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX(5 및 10 μM)에 대한 VAD 및 BAF의 효과는 분열된 카스파제-3, 분열된 PARP, P62 및 LC3 발현을 유도하였다. GAPDH가 로딩 대조군으로서 사용되었다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 TMZ-내성 암(예, GBM 및 CRC) 환자를 치료하는 새로운 방법으로서 TMZ 및 화합물 A의 조합물을 사용함을 포함하는 새로운 방법을 제공한다.
화합물 A는 신규한 소분자 이소폼-선택적 HDAC8 억제제이다. 화합물 A는 미국특허 제7,994,357호에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에서 참고로 통합된다. 화합물 A는 화학식 A의 구조, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 입체이성질체, 거울상이성질체, 전구약물 또는 용매화물을 갖는다.
화학식 A
상기 식에서,
R1은 수소, 알킬, 알케닐, C5-C6 사이클로알킬, 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 5-원 또는 6-원 헤테로사이클, 또는 (CH2)mR4이고;
X는 C, -O-, -N- 또는 -S-이고;
Y는 -O-, -NH 또는 -O-C1-C4 알킬이고;
n은 0 내지 10의 정수이고;
m은 0 내지 5의 정수이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-C6 알킬이고;
R4는 할로겐, -CF3, -OR7 또는 -NR7R8로 치환될 수 있는 C5-C6 사이클로알킬 또는 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 헤테로사이클이고, 여기서, R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
R5는 OH, NH2 또는 C5-C6 사이클로알킬, 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 헤테로사이클이고, 여기서, 사이클로알킬, 카르보사이클 및 헤테로사이클은 할로겐, NH2, NO2, C1-C6 알콕시, C1-6 알킬티오, OR7", NR7R8 또는 CF3로 임의로 치환될 수 있고;
R6은 H, 또는 하이드록시 또는 C2-C10 알케닐에 의해서 치환될 수 있는 C1-C10 알킬이거나, R1와 함께 -C2H2-이다.
본 발명의 한 특정 구체예에서, 화합물 A는 BMX이며, 이는 오스톨(osthole)의 반-합성으로부터 유래되고 Yang YC et al.에 보고된 바와 같이 학습 및 기억에서 신규한 역할을 한다[22]:
BMX는 이소폼-선택적e HDAC8 억제제로 독성이 가장 낮고 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 가로지르는 능력을 갖는 것으로 알려져 있다[22].
본원에서 사용된 용어, 특히 "테모다르(Temodar)"라는 상품명으로 판매되는 "테모졸로미드(Temozolomide)" 또는 "TMZ"라는 용어는 다형 교모세포종 또는 역형성 별아교 세포종(anaplastic astrocytoma)과 같은 일부 뇌종양을 치료하는데 사용되는 약물을 의미한다. TMZ는 이하 구조를 가지고 있다:
테모졸로미드(TMZ)는 성상세포종(astrocytoma)에 대한 2차 치료제, 및 다형 교모세포종에 대한 1차 치료제와 같은 일부 암의 치료에 사용되는 알킬화제이다. 또한, 테모졸로미드와 함께 올라파립(Olaparib)이 재발성 소세포폐암에 대해 상당한 임상 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 사용된 용어 "다형 교모세포종", "교모세포종" 또는 "GBM"은 정상 뇌 세포에서 시작되거나 기존의 저-등급 성상세포종에서 발생할 수 있는 뇌암을 의미한다. GBM을 예방하는 알려진 방법은 없다. 치료는 대개 수술이 포함되며, 그 후에, 화학요법과 방사선 요법이 사용된다. 약물 테모졸로미드(TMZ)는 화학요법의 일부로 자주 사용된다.
본원에서 사용된 용어로서 장암 또는 직장암으로도 알려져 있는 "결장암, " "직장결장암" 또는 "CRC"는 결장이나 직장(대장의 일부)에서 발생한 암을 의미한다. 그 징후와 증상은 대변 내 혈액, 장 운동에서의 변화, 체중 감소 및 피로를 포함할 수 있다. CRC의 표준 치료법은 수술, 방사선요법 및/또는 화학요법이며, 여기서, 옥살리플라틴(Oxp)과 그 전구약물 카페시타빈은 임상 실시에서 널리 사용된다. 불행하게도, 이러한 종류의 DNA 가교제 치료 하의 재발은 전체 주기를 완료한 후에도 처음 몇 년 이내에 여전히 흔하다.
본 발명에서, BMX는 β-카테닌/c-Myc/SOX2 신호전달 경로를 하향 조절하고 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 상향 조절함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜 TMZ 내성을 극복하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 결과는 BMX 또는 TMZ와의 이의 조합물이 TMZ-내성 WT-p53 GBM 또는 CRC 세포의 정밀한 개인 치료에 유망하다는 것을 나타낸다.
본 발명은 제한보다는 설명의 목적으로 제공되는 이하 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1
1.1 재료 및 방법
1.1.1 세포 배양 및 시약
4개의 GBM 세포주 U87, U87R, A172 및 A172R을 본 연구에서 사용하였다. American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA, USA)은 인간 GBM 세포주 U87-MG(ATCC HTB-14; 출처를 알 수 없는 GBM) 및 A172(ATCC CRL-1620; ATCC)를 제공했다. U87R 및 A172R 세포는 Tsung-I Hsu 박사 및 Jian-Ying Chung 박사(The Ph. D. Program for Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science 및 Technology, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan)로부터 얻었다. 이들 세포를 10% 소태아혈청(FBS) 및 50μM TMZ를 함유한 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM)에서 최소 60일 동안 유지시켰다. U87R 및 A172R 세포에서의 TMZ 내성은 콜로니 형성 분석을 사용하여 확인되었다(도 11). 세포를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신(모두 Gibco 제품, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 보충된 DMEM에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 유지시켰다. NBM-BMX(BMX), (E)-2-(4-메톡시벤질옥시)-3-프레닐-4-메톡시-N-하이드록시신아미드는 NatureWise Biotech &Medicals Corporation(Taipei, Taiwan)에서 제공되었다.
1.1.2 세포 증식 및 콜로니 형성 분석
96-웰 플레이트에 웰당 3000 GBM 세포를 플레이팅하고, 이들을 밤새 유착되도록 하였다. BMX 및 TMZ 단독요법에 대한 세포주의 민감성을 검증하기 위해서, 세포를 24, 48 및 72시간 동안 다양한 용량의 BMX 또는 TMZ로 처리하였다. BMX-TMZ 조합물에 대한 세포 민감성을 확인하기 위해서, 세포를 24시간, 48시간 및 72시간 동안 BMX(10μM)와 함께 또는 그것 없이 상이한 용량의 TMZ(0-800μg/mL), 또는 24시간, 48시간 및 72시간 동안 TMZ(50μM)와 함께 또는 그것 없이 상이한 용량의 BMX(0-50μM)로 처리하였다. 처리 후, 표시된 시점에서 CCK8 키트(Targetmol, Shanghai, China)를 사용하여 흡수 값을 측정하였다. 결과는 최소 3회 반복 실험의 평균 ± 표준 편차로 보고된다.
A172, A172-R, U87MG 및 U87MG-R 세포를 6cm 배양 접시에 씨딩하고(1000개 세포/접시) 14일 동안 배양하였다. 세포를 포스페이트-완충 식염수로 3회 세척하고, 이어서, 4% 파라포름알데히드에 30분 동안 고정시키고 0.1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 25℃에서 20분간 염색하였다. 콜로니를 수돗물로 조심스럽게 세척하고, 이어서, 적어도 50개의 세포로 정의된 콜로니 수를 계수하여 분석하였다. 결과는 3회의 독립적인 실험에서 얻은 평균 콜로니 수 ±SE로 표시된다.
1.1.3 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)
7700 서열 검출 시스템(7700 Sequence Detection System)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 mRNA 발현의 정량 분석에서 사용하였다. 세포(2×105)를 6-웰 플레이트에 씨딩하고, 전체 RNA를 Tissue Total RNA Mini Kit(Geneaid, Taiwan, Taiwan)을 사용하여 추출하였다. 10ng의 전체 RNA 샘플을 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA로 전사시켰다. 유전자 발현은 제조자에 의해서 제공된 절차에 따라 Fast SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 내부 참조로 18s을 사용하여 정량화되었다. 모든 절차는 제조자의 원안에 따라 수행되었다. 열순환 조건은 50℃ 2분, 95℃ 10분, 및 95℃ 15초, 60℃ 1초의 40 사이클이었다. 각각의 샘플을 3중으로 분석하였다. 임계주기(threshold cycle: Ct) 값은 StepOnePlus(Applied Biosystems) 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 각각의 mRNA의 상대적 발현은 2-(ΔCt) 방법을 사용하여 계산되었다. HDAC8의 프라이머 서열은 이하와 같다:
HDAC8 정방향 5′-GCGTGATTTCCAGCACATAA-3′ (SEQ ID NO: 1) ;
HDAC8 역방향 5′-ATACTTGACCGGGGTCATCC-3′ (SEQ ID NO: 2) .
18s 정방향 5′-TCAAGTGCAGTGCAACAACTC-3′ (SEQ ID NO: 3) ;
18s 역방향 5′-AGAGGACAGGGTGGAGTAATCA-3′ (SEQ ID NO: 4) .
1.1.4 DNA 세포 주기의 유세포 분석
DNA 세포 주기의 경우에, 48시간 동안 TMZ(50 μM) 존재 또는 부재 하에 상이한 용량의 BMX(0 내지 10 μM)로 처리한 후, 세포를 트립신화를 통해 수확하고 포스페이트-완충된 식염수로 두 번 세척하고, 메탄올에 고정시켰다. 이어서, 세포를 다시 세척하고, 최종 농도 0.05 mg/mL의 RNase A(Sigma-Aldrich, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)에 적용시키고, 10 μg/mL 프로피듐 아이오다이드(PI; Sigma-Aldrich; Merck Millipore)과 함께 4℃에서 15분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 세포 주기 분석은 형광-활성화된 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 유세포 분석기(Attune NxT 유세포 분석기, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었다.
1.1.5 아폽토시스의 유세포 분석
TMZ(50μM) 존재 또는 부재 하에 상이한 용량의 BMX(0~10μM)에서 세포 아폽토시스를 분석하기 위해서, FITC-표지된 아넥신 V/PI 염색을 제조자의 지시에 ㄸ따따라서 Annexin V and PI Apoptosis Kit((Fremont, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. PI 및 아넥신의 유세포 분석에 의한 분석은 처리 후 48시간에 수행되었다. 총 10,000개의 핵을 FACS 유세포 분석기(Attune NxT 유세포 분석기, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였다.
1.1.6 면역조직화학적 염색
면역조직화학적 염색을 4μm-두께의 파라핀 절편 상에서 수행하였다. 절편을 탈랍하고, 수화시키고, 밤새 4℃에 두었다. CD133(AP1802a, Abgent, San Diego, CA, USA), P62(ab56416, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 LC3II(AP1802a, Abgent)에 대한 항체의 경우에, 표준 아비딘-비오틴 복합체 절차를 사용하였다. 절편을 실온으로 되돌린 후에, 비오티닐화된 2차 항체와 양 고추 냉이-표지된 스트렙타비딘을 첨가하였다. 이어서, 샘플을 37℃ 오븐에서 인큐베이션하였다. 후속하여, DAB 발색, 헤마톡실린 대조염색, 구배 알코올 탈수, 자일렌 투명화를 수행하였다. 이어서, 모든 샘플을 중성 검으로 밀봉하였다. 인간 뇌 조직: 본 연구에서의 윤리 선언문은 Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Hospital (No. KMUHIRB-F (I)-20200024)의 승인을 받았다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 사전 동의를 얻었다.
1.1.7 웨스턴 블롯 분석
세포를 수집하고 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 용해 완충액(EMD Millipore Billerica, MA, USA, 10× RIPA 완충액)에 용해시켰다. 단백질 농도는 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. SDS 로딩 완충액을 단백질 샘플과 혼합하였다. 단백질(20 μg/lane)을 8% 내지 12% SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼으며, 이는 트리스-완충된 식염수(TBS)-Tween 20(0.5%; TBS-T)에서 5% 소 혈청 알부민으로 실온에서 1시간 동안 차단되었고, 일차 항체와 44℃에서 밤새 인큐베이션되고, 이어서, HRP(horseradish peroxydase)-결합된 이차 항체와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. TBS-T로 철저히 세척한 후, HRP 신호를 화학적 HRP 기질을 사용하여 검출하였다. 사용한 항체는 표 3에 나열되어 있다. 각각의 표적 단백질의 신호는 향상된 화학 발광 시약과 함께 한 인큐베이션 및 X-선 필름에의 노출에 의해서 가시화되었다.
1.1.8 통계학적 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 통계학적 분석은 단방향 분산 분석(one-way analysis of variance)을 사용하여 수행되었다. 데이터를 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 사용하여 비교하였다. 통계학적 유의성의 수준은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001로 설정되었다.
표 3. 실험 항체
1.1.9 다중 데이터베이스 플랫폼을 통해 HDAC8 억제제의 잠재적 메커니즘의 예측
간접 프로세스: CLUE는 이들의 백만 개의 프로필 중에서 shRNA HDAC8의 연결성 점수를 계산하고 반대 화합물과의 유사성뿐만 아니라 유전자 교란을 정렬하였다. 기준은 90개의 긍정적인 점수 초과에서 필터링되었으며 생물학적 기능에서 shRNA HDAC8 조절자로서 각각의 인스턴스의 표적된-유전자를 수집하였다. 명확한 경로 정보를 얻기 위한 농축 분석을 위해 CPDB 플랫폼에 이 유전자 목록을 입력한다. 직접 프로세스: BMX-L1000 유전자 발현 데이터를 기반으로 하여, HepG2 세포의 약물 생물학적 기능에 반응하는 상향 조절 및 하향 조절 유전자 목록 둘 모두. BMX(1μM)를 DMSO 대조군과 비교하여 ±1.5배 변화, p값 < 0.05에 따라 유의미한 차등 발현 유전자(DEG)를 정의하였다. 따라서, DEG는 경로 분석을 위해 CPDB를 쿼리(query)하기 위한 입력으로 사용되었다. 우선순위가 지정된 경로를 좁히기 위해서, 두 가지 결과에 관심을 갖고 공통 요소를 선택하였다.
1.2 결과:
1.2.1. 생물정보학 도구를 통한 HDAC8 억제제의 잠재적 발현 프로파일에 대한 경로 분석
DAC8 억제제와 유전자 관련의 가능한 메커니즘을 탐색하기 위해서, 포괄적인 메커니즘 분석을 위해 Connectivity map(C-Map) 및 Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures Unified Environment(CLUE) systemic database (https: //clue. io/) 및 ConsensusPathDB (CPDB) platform (http: //cpdb. molgen. mpg. de/)을 사용했다. 각각의 직접 분석과 간접 분석이라는 두 가지 생물정보학 프로세스를 활용하였다(도 1A). 직접적인 분석을 위해서, HepG2 세포를 L1000 플레이트에서 BMX로 처리했는데, 이는 BMX의 생물학적 기능에 반응하였다(도 1A, 오른쪽). 1.5배 변화를 갖는 유의미하게 차등적으로 발현된 유전자(1583개 상향 조절 및 900개 하향 조절)를 사용하여 CPDB 플랫폼에 질의하여 잠재적인 경로(p-값 < 0.05)를 밝혀냈다. 다음으로, CLUE 플랫폼의 패턴 매칭 알고리즘인 간접 접근 방식을 통해 HDAC8 억제 기능을 분석하였다. 이어서, BMX 치료(HDAC8 억제제)의 시뮬레이션으로 shRNA HDAC8 시그니처를 사용하여, CLUE에 액세스하여 19,811개의 소분자 화합물 또는 유전자 섭동(예: 18,493개의 shRNA, 3,462개의 과발현 구성물)의 유사한 시그니처 패턴과 일치하는 100만 개가 넘는 프로필을 계산하고, 이어서, 연결성 점수(connectivity score)를 얻었다. 긍정적인 점수는 쿼리와 인스턴스 서명 간의 유사한 메커니즘을 나타내는 반면에, 부정적인 점수는 반대 기능을 의미한다. 본 발명자들의 기준은 화합물(CP), 녹다운 유전자(KD), 과발현 유전자(OE) 및 퍼투르바겐 클래스(perturbagen class: PCL)의 90개 연결성 점수 초과로 선택되었다. CLUE는 유사한 기능을 하는 화합물이나 동일한 계열 유전자를 작용 메커니즘으로 가정할 수 있는 특정 그룹으로 묶었다. 그러나, 이러한 빅 데이터 시스템은 상세한 경로 정보를 제공하지 못했다. 따라서, shHDAC8 및 BMX 처리 세포의 보완적인 분석을 위해 CPDB 플랫폼을 결합시켰다(도 1A, 왼쪽). 이들 상이한 생물정보학 파이프라인(bioinformatics pipeline)은 여러 메커니즘/경로를 얻을 수 있으며, 본 발명의 발명자들은 이들 두 데이터 세트를 교차시켜 가능한 잠재적 경로를 필터링하였다. Wnt 신호 전달 경로는 본 발명의 발명자들의 다중-데이터베이스 플랫폼을 통해 밝혀진 최상위 메커니즘 중 하나이다(도 1B).
1.2.2 BMX는 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜 GBM-R 세포의 성장과 증식을 억제했다
HDAC8이 치료-내성 GBM과 상관관계가 있는지를 조사하기 위해서, 두 개의 모 GBM 세포주(A172 및 U87MG, A172 및 U87MG는 야생형 p53(WT-p53)임, 도 12) 및 2개의 TMZ-내성 GBM 세포주(A172-R 및 U87MG-R, WT-p53의 변종)의 HDAC8 발현 수준을 조사하였다. HDAC8 과발현이 GBM-R 세포주 둘 모두에서 검출되었다(도 8A 및 8B).
실시예에서, NBM-BMX(Nature Wise Biotech &Medicals Corporation 제공, 본원에서는 BMX가 사용됨)를 HDAC8 억제제로 사용하여 추가 실험을 위한 shRNA HDAC8의 효과를 모방했하였다. BMX(397.46 Da)의 구조는 도 2A에 도시되어 있다. 4개의 세포주를 BMX로 처리하고 BMX에 의한 HDAC8 mRNA 및 단백질 발현의 BMX-유도된 억제를 검출함으로써 BMX가 HDAC8 억제제임을 확인하였다(도 9A 및 9B).
BMX는 GBM 및 GBM-R 세포 둘 모두에서 TMZ-매개된 세포독성 효과의 민감도를 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 본 실시예에서는, A172/A172-R 및 U87MG/U87MG-R 세포에서 GBM 및 GBM-R을 치료할 때 BMX와 TMZ 사이에 조합 효과가 존재한다는 것이 밝혀졌다. BMX 단독, TMZ 단독 및 조합 그룹에 대한 세포 증식 및 세포 생존율을 상이한 농도에서 24, 48 및 72시간에 평가하기 위해서 MTT 분석을 수행하였다. 각각의 단독 처리군에서, 각각의 군에서의 세포독성 효과가 시간-의존적 방식으로 증가하는 것으로 나타났다(도 10A). 결과는 BMX 단독의 IC50 값이 A172/A172-R 세포에서 21.00±2.34μM/>52.64±3.62μM이고 U87MG/U87MG-R 세포에서 29.84±2.32μM/>68.13±4.69μM인 것으로 나타났으며(도 2B), 이는 BMX 단독이 GBM 세포 증식을 억제할 수 있지만, GBM-R 세포 증식을 억제할 수 없음을 시사한다. 또한, TMZ 단독의 IC50 값은 A172/U87MG 세포에서 73.48±3.65 μM/80.99±1.68 μM이었고, A172-R/U87MG-R 세포에서 595.07±23.42 μM/302.51±15.24 μM이어서, GBM-R 세포의 신뢰성을 확인시키고 있다(도 2C). 병용 치료군에서, BMX 10 μM를 상이한 용량의 TMZ(도 2D)와 조합되어 사용되고, TMZ 50 μM(GBM-R 세포주의 유지 농도와 동일)은 상이한 농도의 BMX(도 2E)와 조합되어 사용되어, GBM-R 세포에서 TMZ-매개된 세포독성 효과를 가장 향상시킬 수 있는 BMX 및 TMZ의 용량을 측정하였다. 데이터는 10μM BMX를 포함하는 50μM TMZ가 두 GBM-R 세포주 모두에서 가장 높은 세포 독성 효과를 나타냄을 보여주었다. 이러한 조합물을 시간-의존적 방식으로 사용했으며, 48시간 내에 세포독성 효과를 확인하였다(도 2F, 48시간 내 BMX10 μM: 0.88x, 0.77x, 0.63x; BMX 및 TMZ: 0.74x, 0.56x, 0.47x). 클론원성 분석이 또한 BMX 단독이 아닌 50μM TMZ를 포함하는 10μM BMX가 GBM-R 세포를 억제함을 보여주었다(도 2G). 상기 내용을 볼 때, 데이터는 조합 치료가 GBM 세포(U87MG 및 A172)와 GBM-R 세포(U87MG-R 및 A172-R)의 성장과 증식을 억제하고, 0μM BMX와 50μM TMZ의 조합물은 GBM-R 세포에 대해 가장 높은 세포독성 효과(세포 증식 및 세포 생존율의 억제)를 발휘한다는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고, BMX 단독의 세포 생존율은, 억제 효과가 없는 TMZ 단독과 비교하여, 여전히 적당히 감소하여, A172R/U87R에서 약리학적 세포독성 효과의 부분적인 능력을 나타냈다. 따라서, BMX와 TMZ의 조합 치료를 추가 실험에서 BMX 단독 치료와 비교하였다.
1.2.3 BMX는 GBM-R 세포에서 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 표적으로 하여 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켰다
메커니즘을 GBM-R 세포에서 TMZ-매개된 세포독성 효과의 향상에 의해서 조사하였다. 경로 분석에 기초하여, 표준 Wnt 신호 전달(Wnt/β-카테닌으로도 알려짐) 경로가 GBM-R 세포의 증식에 관여한다고 가정되었다. 각각의 세포의 유전적 배경은 선종성 용종증 대장균 및 β-카테닌(CTNNB1)과 같은 Wnt 유전자에 돌연변이가 없음을 나타냈다. β-카테닌 상태를 검출하기 위한 β-카테닌 활성 형태로서의 포스포-β-카테닌(Ser33/Ser37/Thr41). GSK3β(S9)는 β-카테닌을 분해하기 위한 β-카테닌 포스포릴화를 위해서 사용되었다. 결과는 50μM TMZ를 포함하는 10μM BMX가 β-카테닌의 단백질 수준을 직접 감소시키고 U87R 및 A172R 세포에서 GSK3β에 의한 포스포릴화를 통해서 포스포-β-카테닌(Ser33/Ser37/Thr41)의 단백질 수준을 감소시키는 반면에, BMX 단독은 이들 수준을 약간만 감소시키는 것으로 것으로 나타났다. 더욱이 GSK3β(S9)의 포스포릴화 수준이 감소되었고, 이는 GSK3β 활성이 증가하고 β-카테닌이 포스포릴화되었음을 나타낸다(도 3A). 증식 마커인 c-Myc 및 cyclin D1에 대한 BMX의 효과를 조사하기 위해서, TMZ와 함께 또는 거것 없이 BMX가 그 수준을 감소시킬 수 있다는 것이 주목되었다(도 3B).
GBM-R 세포를 프로테아좀 억제제 MG132로 처리하여 β-카테닌 단백질 수준이 단백질 분해로 인해 감소하는 것을 확인하였다. 결과는 MG132 적용이 10μM BMX 및 50μM TMZ 하에서 β-카테닌 분해를 역전시키고 c-Myc 및 사이클린 D1 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 3C). 이러한 결과는 BMX가 Ser9 포스포릴화 하향조절을 통해 GSK3β 활성을 향상시키고, 이는 Ser33/Ser37/Thr41에서 β-카테닌 포스포릴화를 향상시켜 단백질 분해를 촉발한다는 것을 입증하였다. 종합해 보면, 이들 데이터는 10μM BMX와 50μM TMZ가, 부분적으로는 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 통해서, TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜서, GBM-R 세포 증식을 감소시키는 것으로 나타났다.
1.2.4 BMX는 GBM-R 세포에서 TMZ-매개된 아폽토시스를 촉진하여 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켰다
BMX가 세포 주기 정지를 유도할 수 있는지 조사하기 위해서, 세포 주기에 대한 A172-R 및 U87MG-R 세포주에서의 BMX(5μM 및 10μM) 단독 및 50μM TMZ와 결합된 것의 효과를 분석하였다. 결과는 10μM BMX 단독이 A172-R 세포(70.34%) 및 U87MG-R 세포(77.95%)에서 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유도한 것으로 나타났다. 다음으로, 50μM TMZ를 포함하는 5 및 10μM BMX는 G0/G1에서 세포 주기 정지의 양을 증가시켰을 뿐만 아니라 둘 모두의 GBM-R 세포주에서 서브-G1 단계(아폽토시스)에서 정지를 유발시켰다(도 4A-C).
유세포 분석은 TMZ와 결합된 BMX가 용량 의존 방식으로 A172-R/U87MG-R 세포주(21.7%/25.95%)에서 높은 비율의 아폽토틱 세포를 생성시켰다(도 4D). 더욱이, 10μM BMX 및 50μM TMZ로 처리한 후에도 후기 아폽토시스가 우세하였다(도 4E). 따라서, BMX 단독은 세포 주기 정지를 유도하고 세포 증식을 억제할 수 있지만, 아폽토시스를 유도하지는 못하는 반면에, BMX와 TMZ의 조합물은 GBM-R 세포에서 TMZ-매개된 아폽토시스를 촉진하여 세포 독성을 향상시킬 수 있다.
1.2.5 BMX는 GBM-R 세포에서 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 통해 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켰다.
BMX와 TMZ의 조합물은 TMZ-매개된 아폽토시스를 촉진할 수 있기 때문에, BMX가 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 통해 TMZ-매개된 아폽토시스를 향상시킬 수 있다고 추측했다. 먼저, A172/A172-R 및 U87MG/U87MG-R 세포에서 WT-p53 및 MGMT 수준을 조사하여, TMZ 내성이 WT-p53 및 MGMT와 관련이 있음을 확인하였다(도 5A). 생물정보학 분석은 또한 33%의 환자만이 p53 돌연변이를 갖고 있고 다른 환자는 p53 WT를 갖고 있음을 시사하였다(표 2). 다음으로, TCGA 및 드라이버DB 데이터베이스를 p53 돌연변이와 p53 WT 사이의 전체 생존율을 확인하기 위해 평가했다. 콜로니 형성 분석(도 11)에 의해서, p53 WT 사례는 돌연변이 사례와 비교하여 GBM 환자에서 불량한 예후를 나타냄이 명백히 밝혀졌다.
WT-p53 매개된 아폽토시스에서 프로아폽토틱 신호 시스템(proapoptotic signaling system)을 조사하였다. MGMT은 또한 TMZ 복구 능력에 대해서 조사되었다. 결과는 P21, Bax/Bcl2 및 Puma와 같은 proapoptoticmakers의 수준이 증가하고 50 μM TMZ와 함께 또는 그것 없는 경우의 둘 모두의 BMX에 의한 처리한 후에 MGMT의 수준이 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 절단된 카스파제-3은 10μM BMX와 50μM TMZ의 조합물에서만 나타났다(도 5B). 아폽토시스가 BMX 단독, TMZ 단독 또는 이들의 조합물에 의해서 WT-p53 매개된 MGMT 억제에서 유도되는지 확인하기 위해서, A172-R 및 U87MG-R 세포를 5 및 10 μM BMX와 함께 또는 그것 없이 50 μM TMZ로 처리하였다. TMZ 단독은 WT-p53 및 DNA 손상 마커(WT-p53-ser15)를 증가시키지 않으면서 MGMT 발현을 적당히 억제할 수 있는 것으로 확인되었다. 그러나, MGMT 발현은 10μM BMX와 50μM TMZ의 조합물에 의해서 분명히 감소되었다. 더욱이, WT-p53 및 DNA 손상 마커(WT-p53-ser15) 발현 수준이 또한 증가하였고, 이는 MGMT가 WT-p53 매개된 아폽토시스에 의해 부정적으로 조절되었음을 의미한다(도 5C).
더욱이, p53 WT 및 돌연변이 세포에 대한 산점도(scatter plot)를 평가함으로써(도 8B), GBM p53 WT 세포가 MGMT 과메틸화되었으며 MGMT mRNA 및 단백질 발현도 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, TMZ 단독은 GBM-R 세포에서 WT-p53 매개된 아폽토시스를 유도할 수 없다. 그러나, 이들 데이터는 BMX와 TMZ의 조합물이 GBM-R 세포에서 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 통해 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킬 수 있음을 시사했다. BMX 단독은 MGMT 수준을 적당히 감소시킬 수 있지만, GBM-R 세포에서 WT-p53 매개된 아폽토시스를 유도하지는 않는다.
표 2. CCLE p53 유전 특성
1.2.6 BMX와 TMZ의 조합물은 GBM-R 세포에서 GSC 형성을 감소시켰다
GSC 마커는 GBM 내성의 핵심이기 때문에, 모든 세포주에서 GSC 마커의 수준을 조사했으며; D133, CD44 및 SOX2의 높은 발현 수준이 A172-R 및 U87MG-R 세포에서 검출되었고, 이는 TMZ 내성이 GSC 마커와 부분적으로 관련되어 있음을 암시한다(도 6A). 더욱이, 10μM BMX와 50μM TMZ에 의한 처리는 GBM-R 세포주 둘 모두에서 CD133, CD44 및 SOX2의 발현 수준을 명확하게 감소시켰다(도 6B). 따라서, BMX와 TMZ의 조합물은 GBM-R 세포에서 줄기성 표현형을 변환하기 위해 GSC 마커를 약화시킴으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킬 수 있다.
또한, 면역조직화학을 통해 TMZ-내성 GBM 인간 조직에서 HDAC8 및 GSC 마커를 검사하였다(도 6C). 결과는 HDAC8과 GSC가 GBM에서의 TMZ 내성과 밀접한 관련이 있음을 나타냈다.
1.3. 결론
비록, 전임상 연구는 HDACis가 신경교종에 항종양 효과가 있는 것으로 나타났지만, 이전 연구 중 어느 것도 화학요법-내성 GBM의 치료를 언급하거나 예상하지 못했다. 먼저, 새로운 이소-선택성 HDAC8 억제제인 BMX가 줄기성(stemness)을 억제하기 위해 β-카테닌/c-Myc/SOX2 경로를 하향조절함으로써 뿐만 아니라, TMZ-내성 GBM 세포에서 아폽토시스를 유도하기 위해 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 상향 조절함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킬 수 있음이 본 발명에서 발견되었다. 더욱이, 또한, WT-p53/MGMT 복귀와 Wnt/β-카테닌/GSKβ 신호전달 경로의 역상관관계가 TMZ 내성을 갖는 GBM 및 GBM의 발암성 역할에 관여할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
상기 언급된 결과를 기반으로 하여, 이하 작업 모델을 제안한다(도 7):
먼저, MZ-내성 GBM에서의 β-카테닌/c-Myc/사이클린 D1/SOX2 신호 전달 경로(오른쪽 경로). 이전 연구와 본 연구의 생물정보학 분석에 따르면, Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로는 GBM에 대한 치료법 선택에 영향을 미칠 수 있다[17]. TMZ가 없이 및 그것과 함께 하는 BMX의 둘 모두(얇은 선과 굵은 선)는 Ser9 포스포릴화를 하향 조절하여 GSK3β 활성을 향상시킬 수 있으며, 이는 결국 Ser33/Ser37/Thr41에서 β-카테닌 포스포릴화를 향상시켜서, β-카테닌 단백질 분해를 촉발시킬 수 있다는 것이 본 발명에서 입증되었다. β-카테닌 분해는 프로테아좀 억제제로서의 MG132를 사용하여 확인되었다. 분해되지 않은 β-카테닌은 핵으로 이동하여 TCL4에 결합하고 c-Myc 및 사이클린 D1과 같은 하류 표적 유전자를 활성화하여 세포 증식을 유도하고 세포 주기를 계속되게 한다. BMX 단독(가는 선)과 TMZ를 포함한 BMX(굵은 선) 모두가 c-Myc 및 사이클린 D1 발현을 억제하고 세포 주기 정지를 유도하였다. 그러나, BMX 단독은 서브-G1 단계에서 세포 주기 정지를 유도할 수 없다. BMX와 TMZ의 조합물만이 심각한 세포 주기 정지를 유도하고 서브-G1 단계로 진행했으며, 이는 이것이 GBM-R 세포에서 후기-아폽토시스를 유도했음을 의미한다(도 7의 오른쪽 하단 부분에 있는 점선).
또한, GSC는 GBM의 치료학적 내성에 중요한 역할을 한다. 이들은 CD133 및 CD44와 같은 신경 줄기 세포 마커 뿐만 아니라 SOX2와 같은 전사 인자의 높은 발현을 통해 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 이들의 자가 재생 능력을 특징으로 한다[23]. TMZ 없이 및 그것과 함께 BMX는 줄기성을 억제하기 위해 GSC 표현형을 하향 조절함으로써 CD133 및 CD44뿐만 아니라 SOX2도 약화시키는 것으로 본 발명에서 밝혀졌다. 앞서 보고된 바와 같이, c-Myc는 또한 신경교종 CSC를 유지시키는 데 필요하다[24]. BMX 단독 및 TMZ를 포함한 BMX는 GBM-R 세포에서 β-카테닌/c-Myc/사이클린 D1/SOX2 신호 전달 경로를 통해 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜 세포 증식을 억제한다는 결론을 내릴 수 있다.
더욱이, TMZ-내성 GBM에서 WT-p53 매개된 MGMT 억제(도 7의 왼쪽 경로). GBM에서 TMZ의 작용 메커니즘은 O6 위치가 구아닌으로 메틸화되어 DNA를 손상시키는 것이다. MGMT는 메틸화를 역전시켜 GBM 세포에서의 DNA를 복구하고 GBM 내성을 발휘한다. 비록, MGMT-독립적 경로가 또한 TMZ 내성에 중요한 역할을 하지만[25-27], MGMT-의존적 경로가 여전히 TMZ 내성의 주요 경로로 여겨진다. 본 발명에서는, GBM-R 세포주(A172-R 및 U87MG-R)가 높은 수준의 MGMT 단백질을 발현하고, 그에 따라서, MGMT-의존적 경로가 실제로 이들 세포주에서 TMZ 내성에 대한 주요 메커니즘임을 확인하였다. BMX는 MGMT-의존적 GBM-R 세포주에서 MGMT 발현을 억제하여 MGMT의 DNA 손상 복구 능력을 약화시키는 것으로 추측될 수 있다. GBM-R 세포주에서, BMX 단독은 MGMT 발현을 적당히 감소시켰고, TMZ 단독은 그렇지 않았지만(도 5B 및 도 5C), 이들의 조합물은 분명히 MGMT 단백질 수준을 감소시키고 MGMT-의존적 방식으로 TMZ-매개된 아폽토시스를 향상시켰다.
도 7에 도시된 바와 같이, 모델은 두 가지 주요 신호 전달 경로를 포함한다. 오른쪽 경로: β-카테닌/c-Myc/사이클린 D1/Sox2 신호 전달 경로. GBM-R 세포주를 BMX 단독(가는 선) 또는 TMZ를 포함한 BMX(굵은 선)으로 처리한 경우에, GSK3β(S9) 및 활성 β-카테닌이 감소하였다. 이하 c-Myc 및 사이클린 D1가 또한 감소하여 세포 주기 정지를 유도하고 줄기성 활성을 약화시켰다. 그러나, TMZ를 포함한 BMX(점선)만이 아폽토시스를 유도할 수 있다. 왼쪽 경로: WT-p53 매개된 MGMT 억제. GBM-R 세포주가 BMX 단독 또는 TMZ를 포함한 BMX로 처리되는 경우에, WT-p53은 BMX 단독(가는 선) 및 TMZ를 포함한 BMX(굵은 선) 모두에서 MGMT 수준, 세포 주기 정지 및 줄기성을 증가시키고 하향조절하였다. 그러나, WT-p53 및 DNA 손상 마커(WT-p53-ser15, 도시되지 않음)는 세포 주기 정지 마커(P21) 및 프로아폽토틱 마커(BAX/Bcl2 및 Puma)의 다음 활성화를 증가시켜서 TMZ를 포함한 BMX에서만 아폽토시스와 세포 사망을 유도하여, 심각한 DNA 손상을 나타냈다. 빨간색은 상향 조절을 나타낸다. 녹색은 하향 조절을 나타낸다.
BMX는 WT-p53 복원(도 5A-C의 모든 P53 레인)을 통해 MGMT를 감소시키기 위해 HDAC 억제에 향상된 효과를 제공한다는 것이 실시예에서 발견되었다. 본 발명에서는 BMX 단독(왼쪽 부분의 가는 선)이 WT-p53 수준을 적당히 증가시켜 MGMT 발현을 적당히 하향 조절하여 여전히 DNA 복구 능력을 유지한다는 것이 입증되었다(도 5B). 또한, HDAC 억제는 WT-p53 재활성화를 통해 MGMT 발현을 감소시킬 수 있는 것으로 추측되었다. BMX 단독은 WT-p53 수준을 적당히 증가시키고 MGMT 발현을 적당히 하향 조절하여 DNA 복구를 유지하는 것으로 입증되었다. 더욱이, BMX 단독은 세포 주기 정지 마커(P21)를 유도했다. 본 발명에서, BMX와 TMZ의 조합물(왼쪽 부분의 굵은 선)은 WT-p53(및 ser15) 과발현 및 하향조절된 MGMT 발현을 통해 광범위한 DNA 손상을 유도하여 결국 WT-p53 매개된 아폽토시스를 유도하였다(도 5C). 이러한 조합물(BMX 단독과 비교하여)은 또한 세포 주기 정지 마커(P21), 프로아폽토틱 단백질(Bax/Bcl2 및 Puma)의 발현을 증가시키고 WT-p53 매개된 아폽토시스에 대한 절단된 카스파제-3 발현을 유도할 수 있다. 종합해 보면, 이들 결과는 BMX(도 7의 왼쪽 부분의 가는 선) 단독이 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 부분적으로만 유도하였지만, BMX와 TMZ의 조합물(도 7의 왼쪽 부분의 굵은 선)은 GBM-R 세포주에서 TMZ 세포독성 효과를 향상시켜 TMZ 내성을 극복하였음을 암시하였다.
결론적으로, 예상치 못하게, 본 발명에서, BMX가 β-카테닌/c-Myc/SOX2 신호 전달 경로를 하향 조절하고 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 상향 조절함으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜 TMZ 내성을 극복한다는 것이 발견되었다. 이러한 발견은 BMX와 TMZ의 조합물이 TMZ 내성 WT-p53 GBM 세포의 정밀한 개인 치료에 유망하다는 것을 나타낸다.
실시예 2
2.1. 재료 및 방법
2.1.1 세포주 및 세포 배양
3개의 CRC 세포주 HT29, HCT116 및 RKO을 본 연구에서 사용하였다. American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA, USA)은 인간 CRC 세포주 HT29(ATCC HTB-38; 돌연변이 TP53, p. R273H; APC 프레임 쉬프트(frame shift), p. E1554fs; 야생형 β-카테닌) , HCT116 (ATCC CCL-247; 야생형 TP53; 야생형 APC; 삭제 β-카테닌, p. S45del) 및 RKO (ATCC CRL-2577; 야생형 TP53; 야생형 APC; 야생형 β-카테닌)를 제공했다. 상기 열거된 세 가지 CRC 세포주를 유착 배양 조건에서 배양하고, 5% CO2를 함유한 세포 인큐베이션의 내부에서 37℃로 유지시켰다. HCT-116 및 HT-29 세포의 두 세포주를 10% 태아 소 혈청(Gibco; Thermo Fischer Scientific, Grand Island, NY, USA), 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신으로 보충된 McCoy's 5A 배지에서 배양하였다. RKO 세포를 10% FBS, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 1% 피루브산 나트륨으로 보충된 MEM 배지에서 배양하였다. 세포 배양물을 3일마다 트립신화시킴으로써 계대배양하였다. BM-BMX(BMX), (E)-2-(4-메톡시벤질옥시)-3-프레닐-4-메톡시-N-하이드록시신아미드는 Nature Wise Biotech &Medicals Corporation(대만 타이페이)에 의해서 제공되었다.
2.1.2 세포 증식 분석
96-웰 플레이트에 웰당 4000개의 CRC 세포를 플레이팅하고, 이들을 밤새 유착되도록 하였다. BMX 및 TMZ 단독요법에 대한 세포주 반응성을 검증하기 위해서, 세포를 24, 48 및 72시간 동안 상이한 용량의 BMX 또는 TMZ로 처리하였다. BMX-TMZ 조합물에 대한 세포 만감성을 확인하기 위해서, 세포를 24시간, 48시간 및 72시간 동안 BMX(5μM)와 함께 또는 그것 없이 상이한 용량의 TMZ(0-1000μg/mL)로 처리하거나, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 TMZ(50μM)와 함께 또는 그것 없이 상이한 용량의 BMX(0-10μM)로 처리하였다. 처리 후에, 흡수 값을 표시된 시점에서 CCK8 키트(Targetmol, Shanghai, China)를 사용하여 측정했습니다. 결과는 최소 3회 반복 실험의 평균 ± 표준 편차로서 보고된다.
2.1.3 DNA 세포 주기의 유세포 분석
세포를 48시간 동안 TMZ(50 μM) 존재 또는 부재 하에 상이한 용량의 BMX(0 내지 10 μM)로 처리하였다. 미반응된 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 샘플은 적어도 3회의 독립적인 실험으로 3회 반복 수행되었다. 프로피듐 아이오다이드(PI)에 대한 유세포 분석을 수행하였다. DNA 세포 주기의 경우에, 세포를 트립신화시키고, 원심분리하고, 포스페이트-완충된 식염수(PBS)로 세척하고, 메탄올에 고정시켰다. 이어서, 세포를 다시 세척하고 PI-작업 용액(10 μg/mL PI 및 20 mg/mL RNase A)과 함께 암실에서 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 유세포 분석기(Attune NxT 유세포 분석기, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여, 10,000개 개별 핵의 PI 형광을 계산하였다. G0/G1, S, G2/M 및 서브-G0/G1 단계에서의 세포 분획을 Attune NxT 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 각각의 히스토그램에 대해 평균 피크 형광 강도로 측정하였다.
2.1.4 아폽토시스의 유세포 분석
TMZ(50μM)의 존재 또는 부재 하에 상이한 용량에서의 BMX(0-10μM)에서 아폽토시스 유도를 제조자의 지침을 따라 Annexin V 및 PI Apoptosis Kit(Fremont, CA, USA)를 사용하여 포스파티딜세린의 막 외부화의 검출에 의해서 분석하였다{16]. 이어서, 모든 샘플을 즉시 유세포 분석으로 분석하였다.
2.1.5 정량적인 실시간 RT-PCR
RNA를 제조자의 지시에 따라 Tissue Total RNA Mini Kit(Geneaid, Taiwan, Taiwan)을 사용하여 세포(2×105)로부터 추출하였다. RNA 농도와 순도는 분광광도계(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 260 내지 280nm에서 검사하였다. 이어서, cDNA 합성을 제조자의 지시에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. qPCR 반응은 제조자의 권장 사항에 따라 18s를 내부 참조로 사용하여 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 7500 Real-time PCR System(Applied Biosystems)에서 수행되었다. 임계 주기(Ct) 값은 StepOnePlus(Applied Biosystems) 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 각각의 mRNA의 상대적 발현은 2-(ΔCt) 방법을 사용하여 계산되었다. HDAC8의 프라이머 서열은 이하와 같다:
HDAC8 정방향 5’-GCGTGATTTCCAGCACATAA-3’ (SEQ ID NO: 1) ;
HDAC8 역방향 5’-ATACTTGACCGGGGTCATCC-3’ (SEQ ID NO: 2) .
18s 정방향 5’-TCAAGTGCAGTGCAACAACTC-3’ (SEQ ID NO: 3) ;
18s 역방향 5’-AGAGGACAGGGTGGAGTAATCA-3’ (SEQ ID NO: 4) .
2.1.6 콜로니 형성 분석
고정-의존적 성장 분석을 위해, 1000개의 세포를 배지에 재현탁시키고, 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. TMZ(50μM)의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도의 BMX(0-10μM)에만 첨가된 배양 배지를 2 내지 3일마다 교체하였다. 14일 후에, 배지를 제거하고, 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 30분간 고정시키고, 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 25℃에서 20분 동안 염색시켰다. 크리스탈 바이올렛의 세기는 염색된 세포를 디메틸설폭사이드(DMSO)로 용해시킨 후 570 nm의 흡광도에 의해서 정량화되었다. 결과는 3회의 독립적인 실험에서 얻은 평균 콜로니 ± SE로 표시된다.
2.1.7 노화-연관된(SA) β-갈락토시다제(SA-β-gal) 분석
β-gal 활성의 SA 발현을 노화 검출 키트(CS0030-1KT; Sigma-Aldrich; Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 수행하였다. 요약하면, 세포를 TMZ(50μM)의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 상이한 용량의 BMX(0 내지 10μM)로 처리하고, PBS로 세척하고, 고정액을 사용하여 실온에서 30분 동안 고정시키고, 이어서, SA-β-gal 염색액과 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. SA-β-gal 활성을 pH 6.0에서 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-3인돌릴 β-D-갈락토시드) 염색으로 검사하였다. 파란색으로 염색된 노화세포를 촬영하였다. 무작위로 선택된 필드(n=3)를 광학 현미경으로 분석하여 노화 세포의 백분율을 정량화하였다.
2.1.8 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 사용하여 시험된 세포주의 TMZ(50μM) 또는 OXP(5μM)의 존재 또는 부재 하에의 상이한 농도의 BMX(0-10μM) 및 SAHA, VPA 또는 PCI-34051 하에서 표시된 단백질 발현 수준을 조사하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 앞서 개괄된 바와 같이 제조된 용해물에 대해 수행하였다[16]. 아세틸-히스톤 H3 (Lys9/Lys14), 아세틸-히스톤 H4(Lys8), P53, 아세틸-p53(Lys382), 포스포-p53 (Ser15), P21, P16, MGMT, 포스포르-H2AX (S139), E2F1, E2F3, 절단된 카스파제-3, 절단된 카스파제-8, 절단된 카스파제-7, 절단된 카스파제-9, PARP, Bax, Bcl-2, Bid, Bim, Bak, Puma, β-카테닌, 포스포-β-카테닌(Ser/33/37/41), GSK3β, 포스포-GSK3β (Ser 9), c-Myc, 사이클린 D1, P62, LC3B, CD133, CD44, SOX-2 및 HDAC8에 대한 특이적 일차 항체를 검출에 사용하였고, GAPDH, α-투블린 또는 β-액틴을 내부 대조로서 사용하였다. 일차 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서, HRP(horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체와 함께 인큐베이션한 후에, HRP 신호를 화학적 HRP 기질을 사용하여 검출하였다. 사용된 항체는 표 4에 나열되어 있다. 각각 표적 단백질의 신호를 향상된 화학 발광 시약과 함께 인큐베이션하고 X-선 필름에 노출시켜 가시화하였다.
표 4. 주요 재료
2.1.9 통계학적 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 통계학적 분석을 단방향 분산 분석을 사용하여 수행하였다. 데이터는 스튜던트 t 테스트를 사용하여 비교되었다. 통계학적 유의성 수준은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001로 설정되었다.
2.2. 결과
2.2.1 세 가지 CRC 세포주에서 BMX와 TMZ의 조합물의 최적화
CRC 세포 성장에 대한 BMX 또는 TMZ의 영향을 조사하기 위해서, 세 가지 인간 직장결장암 세포주인 HT29(p53 돌연변이), HCT116(p53 야생형) 및 RKO(p53 야생형)를 사용하였다. 이들을 BMX(0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10μM) 또는 TMZ(25, 50, 100, 200, 400, 800 및 1000μM)로 24, 48 및 72시간 동안 별도로 처리하였다. 결과는 CRC 세포 생존율이 용량-의존적 방식으로 유의하게 억제된다는 것을 나타내고 있다. HT-29, HCT-116 및 RKO 세포에서 BMX 또는 TMZ 단독의 절반 최대 억제 농도(IC50) 값이 유도되었다(표 5). 생체내 종양원성을 나타내는 클론원성 분석에서, TMZ는 HT29, HCT116 및 RKO 세포의 클론원성 분석에서 종양 구체 형성에 대해 효과적이었고, TMZ의 IC50 값은 각각 359.45±50.43, 137.66±22.73 및 244.01±29.42μM이었다. 결과는 HT-29, HCT-116 및 RKO를 포함한 3가지 직장결장암 세포에 대해 3가지 인큐베이션 시간에 따른 BMX 및 TMZ의 기본 세포 증식 억제율을 나타냈다.
표 5. BMX 및 TMZ의 조합물이 CRC 세포에서 세포 증식을 억제하였다
BMX가 TMZ의 화학민감성을 개선하는지 평가하기 위해서, BMX와 TMZ를 HT-29, HCT-116 및 RKO 세포에 함께 투여하였다. BMX(5μM)와 TMZ(25, 50, 100, 200 및 400μM)의 조합물은 BMX와 TMZ를 개별적으로 사용한 것보다 세포 성장에 대해 더 큰 억제 효과를 나타냈다. BMX(5μM)와 TMZ(25, 50, 100, 200 및 400μM)의 조합물은 BMX와 TMZ를 개별적으로 사용한 것보다 세포 성장에 대해 더 큰 억제 효과를 나타냈다. 후속하여, 상이한 농도의 BMX(0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 μM)와 조합된 TMZ 50 μM을 선택하여 TMZ와 BMX가 시간-의존적 방식으로 세포 증식을 억제하는지 확인하였다. 특히, BMX는 HT-29, HCT-116 및 RKO 세포에서 TMZ의 IC50을 감소시켰다(표 5). 이러한 발견은 BMX가 CRC 세포 증식을 억제하고 TMZ의 화학민감성을 향상시킨다는 것을 시사한다. 5μM BMX를 포함한 50μM TMZ는 HT-29, HCT-116 및 RKO 세포에서 가장 높은 세포독성 효과를 나타냈다. 이러한 조합물을 시간 의존적 방식으로 사용했고 48시간 내에 세포독성 효과를 확인하였다. 이러한 발견은 BMX가 TMZ의 화학민감성을 개선했음을 시사했다. TMZ와 조합된 BMX는 시간-의존적 방식으로 세포 증식을 억제했다. 따라서, 모든 후속 실험은 상양한 농도의 BMX(2.5, 5 및 10μM)와 조합된 TMZ 50μM을 사용하여 48시간 동안 수행되었다.
다음으로, BMX 단독 또는 TMZ와 조합된 BMX의 존재 하에 콜로니 형성을 조사했다. 정기적인 연속 방식에서, BMX를 50μM TMZ와 조합하면 이 억제 효과가 증가한다는 것을 발견하였다. TMZ(150μM)로 증가하면, BMX는 5 내지 10μM 대신 1 내지 2μM까지 낮아질 수 있다. 종합해 보면, 이들 결과는 BMX와 TMZ의 조합 사용이 CRC 암세포의 증식과 콜로니 형성을 상승작용적으로 억제한다는 것을 입증했다. 따라서, 모든 후속 실험은 상이한 농도의 BMX(2.5, 5 및 10μM)와 조합된 TMZ 50μM을 사용하여 48시간 동안 수행되었다.
2.2.2 CRC에 대한 기존 약물과 비교한 BMX와 TMZ의 조합 효과
세포 주기 정지는 세포 증식을 억제하는 주요 원인 중 하나이다. BMX 또는 조합 처리가 세포 성장을 억제하는 가능한 메커니즘을 평가하기 위해서, 유세포 분석기를 사용하여 세포 주기 프로필을 분석하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 조합 처리는 HT29 및 HCT116 세포에서 다른 단일 약물보다 G2/M 단계 정지를 유의하게 유도하고 G2/M 단계 정지에 훨씬 더 강한 효과를 나타냈다. 50μM TMZ를 포함함 2.5, 5 및 10μM BMX는 G0/G1에서 세포 주기 정지의 양을 증가시켰을 뿐만 아니라 RKO 세포주에서 서브 G1 단계(아폽토시스)에서 정지를 유발시켰다.
48시간 처리 후 BMX와 TMZ의 시너지 효과는 3개의 CRC 세포에서 Annexin V 결합에 의해서 측정되었다. BMX 및 TMZ에 의한 처리는 각각의 제제에 비해 아폽토틱 세포 백분율에서의 현저한 증가를 유도하였다. BMX는 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 초기 아폽토틱 세포를 23.78%, 49.34% 및 59.18%까지 증가시켰으며 후기 아폽토시스도 그러하였다. 반면에, 조합 처리에서 후기 아폽토시스의 집단은 48시간 인큐베이션 후 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 1.08%에서 10.36%, 3.67%에서 19.37%, 0.32%에서 16.48%로 증가시켰다.
2.2.3 BMX 및 BMX와 TMZ의 조합으로 유도된 아폽토시스는 p53 매개된 MGMT 억제에 의해 매개되었다.
p53 경로는 화학요법 약물에 의해 유도된 다양한 암세포의 아폽토시스에 관여하는 것으로 보고되었다[28]. BMX는 p53을 활성화하여 β-카테닌 경로에 의해 매개되는 세포 사망을 유도하는 것으로 밝혀졌다[16]. DNA 손상으로 인하거나 그렇지 않은 BMX와 TMZ의 항암 효과를 밝히기 위해서, DNA 손상을 조사하고, 상이한 p53 표현형을 가진 세 가지 CRC 세포주에서 해당 p53 경로 마커를 조사했다. HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 p53, 아세틸-p53(Lyx382), p53(Ser 15), p21, p16, MGMT, γ-H2AX, E2F1, E2F3, GAPDH를 포함한 마커의 기본 단백질 발현 상태를 고려하여, BMX 단독은 p53 발현을 향상시켰을 뿐만 아니라, 가능하게는, 세포 성장을 방해하는 다른 중요한 유전자를 조절하였다. BMX 단독 또는 TMZ와의 BMX의 조합에 의한 처리는 HT29, HCT116 및 RKO 세포에서 p53 포스포릴화(Ser15) 및 γ-H2AX 포스포릴화(Ser139) 수준을 용량-의존적으로 증가시켰습니다. HT29, HCT116 및 RKO 세포에서, Lys382에서 p53의 아세틸화는 시간-의존적 방식으로 증가하고, p53 하류 표적 p21 및 p16의 발현을 향상시켰다. p53 야생형 및 돌연변이 세포에 대한 웨스턴 블롯팅의 결과에서 나타낸 바와 같이, CRC p53 야생형 세포는 MGMT 과메틸화되었고, MGMT 단백질 발현을 또한 감소시켰다. 또한, TMZ와의 BMX의 조합물은 E2F3 발현을 크게 감소시켰다(도 14A). 흥미롭게도, 히스톤 H3의 아세틸화는 또한 BMX 또는 TMZ를 포함한 BMX에 의해서 증가되었다. 이는 BMX가 세포 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 및/또는 HDAC의 활성에 영향을 주고, 이는 p53을 포함한 단백질의 아세틸화를 유도한다는 것을 시사한다. BMX와 TMZ의 조합물은 p53 발현을 향상시키고 p53 기능 매개된 MGMT 억제를 활성화시킴으로써 P21, P16 발현 및 H2AX 포스포릴화를 증가시킬 수 있다(도 14A).
프로-아폽토틱(스트레스 또는 사망) 신호와 Bcl-2 및 Bid, Bax 또는 poma를 포함하는 안티-아폽토틱 분자(anti-apoptotic molecule) 사이의 균형이 카스파제-의존적 경로를 통한 아폽토틱 반응을 일으키는 주요 원인이다[29]. 도 14B에 나타낸 카스파제의 절단은 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-3 활성이 낮은 농도 하에서 BMX에서의 유의미한 변화를 나타내지 않았지만, HT29 세포에서 TMZ와 조합되면, 이들은 용량-의존적 방식으로 고도로 상향 조절되어 결국 PARP 절단 및 아폽토시스에 기여함을 시사한다. 절단된 카스파제 3, 카스파제 7, 카스파제 9 및 카스파제 PARP의 아폽토시스 단백질 발현 수준은 HCT116 및 RKO 세포주에서 BMX 10 μM 처리 후에 농도 의존적 방식으로 유의하게 증가하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, p53 야생형 세포 매개된 아폽토시스에서 프로아폽토틱 신호전달 시스템을 조사하였다. 결과는 BMX 처리가 안티아폽토틱 단백질 Bcl-2의 수준을 감소시키고 프로아폽토틱 단백질 Bax, Bim 및 Puma를 증가시킴을 나타내고 있다. 그러나, BMX 처리는 프로아폽토틱 단백질 Bcl-2 계열 단백질 Bak 및 Bid의 상향 조절을 유도하지 않았다. 또한, BMX와 TMZ의 상승작용 효과는 BMX 단독에 비해 더 우수했다(도 14C). TMZ 플러스 BMX의 조합물은, 특히 HCT116 및 RKO와 같은 p53 야생형 세포에서, 각각의 처리 단독보다 더 많은 노화 세포를 생성시켰다(도 15). CD133, CD44, 및 SOX2는 CSC의 약물 내성과 크게 관련되어 있고 CRC를 포함한 CSC의 표현형 마커로 사용되기 때문에, BMX 및 TMZ에 의한 처리는 HT29, HCT116 및 RKO에서 용량 의존적 방식으로 CD133, CD44 및 SOX2의 발현 수준을 분명히 감소시켰다(도 16). 따라서, BMX와 TMZ의 조합물은 CSC 마커를 약화시켜 CRC 세포에서 줄기성 표현형을 변환시킴으로써 TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시킬 수 있다. 따라서, 상기 결과는 카스파제-의존적 신호전달 경로가 CRC 세포에서 BMX와 TMZ의 조합 처리에 의해 활성화되어 세포 아폽토시스를 유도한다는 것을 나타내고 있다.
2.4 BMX는 CRC 세포에서 Wnt/β 카테닌/GSK3β 경로를 표적으로 삼아 TMZ 매개된 세포독성 효과를 향상시켰다
다음으로, BMX가 Wnt/β-카테닌 활성에 대한 TMZ 매개된 세포독성 효과를 향상시키는 메커니즘을 세 개의 CRC 세포에서 조사하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, β-카테닌, 포스포-β-카테닌(Ser33/Ser37/Thr41) 및 포스포-GSK-3β(Ser9) 단백질 발현 수준은 증가한 반면에, 3개의 CRC 세포에서 BMX 처리에 의해서 포스포-β-카테닌(Ser33/Ser37/Thr41) 및 포스포-GSK-3β(Ser9) 수준이 감소하였다. 5M BMX와 TMZ의 조합 처리는 3개의 세포주에서 GSK3β에 의한 포스포릴화를 통해 β-카테닌의 단백질 수준을 직접적으로 감소시키고 포스포 β-카테닌(S33/S37/T41)의 단백질 수준을 감소시켰다. 더욱이, 증식성 마커 c-Myc 및 사이클린 D1에 대한 BMX의 효과를 추가로 조사하였고, TMZ와 함께 또는 그것 없이 BMX가 증식성 마커 c-Myc 및 사이클린 D1을 감소시킬 수 있음을 주지하였다(도 17A). 이들 결과는 5 μM BMX 및 TMZ에 의한 조합 처리가 Ser9 포스포릴화 하향조절을 통해 GSK3β 활성을 향상시켰고, 이는 결국 Ser33/Ser37/Thr41에서 β-카테닌 포스포릴화를 향상시켜 단백질 분해를 촉발시킨다는 것을 입증하였다(도 17B). 또한, MG132 적용은 β-카테닌 분해를 역전시켰고 5μM BMX 및 50μM TMZ 하에서 MGMT 발현을 증가시켰다(도 17C). 종합해 보면, 이들 데이터는 BMX와 TMZ가, 부분적으로는 Wnt/β-카테닌/GSK3β 경로를 통해서, TMZ-매개된 세포독성 효과를 향상시켜 CRC 세포 증식을 감소시킴을 나타내고 있다.
2.5 자가포식은 BMX, BMX 및 TMZ의 조합물 유도된 세포 사망의 핵심 조절자로서 역할을 하였다.
지질화된 LC3 및 자가포식 기질 p62는 자가포식소체 및 자가포식을 평가하기 위한 마커로 자주 사용된다[17]. BMX에 의한 처리 또는 BMX와 TMZ의 조합물에 의한 처리는 또한 P62 및 LC3의 처리된 형태인 LC3-II의 발현에서의 농도-의존적 증가를 생성시켰다(도 18A). β-카테닌은 P62 발현을 부정적으로 조절한다[17, 30]. P62의 감소된 단백질 수준이 β-카테닌 단백질 분해에 의해 유발되는지 확인하기 위해서, 프로테아좀 억제제 MG132를 BMX 또는 BMX와 TMZ의 조합물 처리된 세포에 적용하였다. 예상된 바와 같이, MG132를 적용한 경우에, BMX 유도된 β 카테닌 분해가 역전되었고 P62 발현이 또한 억제되었다(도 18B). 조합 처리에 의한 β-카테닌 단백질 분해로 인해서, P62는 더 이상 억제되지 않았고, 이어서, 하류 자가포식 경로를 촉발시켰다(도 18B). MX 또는 BMX와 TMZ의 조합물-유도된 세포 사망에서 자가포식의 역할을 확인하기 위해서, 자가포식의 후기 단계를 억제하는 단백질 생합성 억제제인 BAF와 세포-투과 팬 카스파제(cell-permeant pan caspase)를 억제하는 Z-VAD-FMK(카르보벤족시-발릴-알라닐-아스파르틸-[O-메틸]-플루오로메틸케톤)를 사용하여, BMX 또는 BMX 및 TMZ의 조합물 첨가 전에, 세포를 처리하였고, Z-VAD-FMK가 세 가지 세포주에서 BMX 플러스 TMZ 처리에 의해 유도된 초기 아폽토시스를 억제한다는 것을 발견하였다. 또한, BAF A1을 사용한 전처리는 유세포 분석을 통해 얻은 BMX 또는 BMX 및 TMZ의 조합물 유도된 세포 사망을 감소시켰고, 이는 BMX 또는 BMX와 TMZ의 조합물에 의해 유도된 절단된 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8 및 카스파제-9의 감소된 발현의 결과와 일치하였다. 상이한 자가포식/아폽토시스 관련된 단백질과 상응하는 신호전달 경로 사이의 상호 작용이 확인되었으며, 이는 두 경로 사이에 혼선이 존재함을 암시한다. 6c-유도된 자가포식에서 아폽토시스의 역할을 시험하기 위해서, BMX 또는 BMX와 TMZ의 조합물을 추가하기 전에 BAF 또는 Z-VAD-FMK로 세포를 처리하였다. 도 18D에 도시된 바와 같이, 비록, Z-VAD-FMK 및 BAF는 초기 아폽토시스 억제를 나타냈지만, BAF는 모든 세포에서 LC3I/II를 방해하지 않고 BMX 및 TMZ의 조합물 유도된 카스파제 3 활성화를 억제하였다. 그러나, Z-VAD-FMK는 p53 돌연변이 유형 세포주에서 LC3 I/II를 방해하면서 BMX와 TMZ의 조합물 유도된 카스파제 3 활성화를 억제하였다. 종합해 보면, 이들 결과는 세포 사망 동안에 자가포식 자극의 중요성을 강조한다.
2.3. 결론
통상의 방사선-화학요법을 사용하는 CRC 치료는 때때로 비효율적인데, 부분적으로는, 그 이유는 CRC 환자가 이러한 치료법에 반응하지 않고/거나 심각한 약물 독성을 겪기 때문이다. 본 발명에서, BMX와 TMZ의 조합물이 HCC 세포, 특히 HCT116 및 RKO에서 특이적이고 효율적이며 상승적인 항증식 및 아폽토틱 효과를 나타냄이 입증되었다. 결론적으로, BMX와 TMZ는 최고의 상승작용적 효과를 제공했으며 그 메커니즘은 현재 가장 중요한 연결고리이다. 또한, 특정 HDAC8i인 BMX가 테모졸로미드(TMZ)와의 조합으로 세포 증식을 억제하고, 세포 주기 정지, 세포 노화, 자가포식 및 아폽토시스를 유도하여 세포 사망을 초래한다고 결론지어진다.
또한, BMX와 TMZ의 조합물이 카스파제-3 절단 및 PARP 활성화를 통해 상승작용적인 아폽토틱 세포 사망을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서, BMX와 TMZ의 조합물이 포스포-p53(ser15)의 증가뿐만 아니라 증가된 γ-H2AX foci와 같은 DNA 손상을 유도한다는 것이 입증되었다. 포스포-p53(ser15)의 증가된 발현은 이전 연구에서 보고된 전체 p53 발현의 증가로부터 발생할 수 있다[16, 17]. 또한, 본 연구에서는 BMX가 CRC 세포의 생존 가능성에 대해 TMZ와의 HDAC 의존적 상승작용 효과를 가질 수 있음이 밝혀졌다.
상기 기재를 고려하면, 인간 GBM 조직 및 GBM-R 세포주에서의 높은 HDAC8 발현은 MGMT 수준과 상관 관계가 있다. BMX와 TMZ의 조합물은 GBM-R 세포주에서 WT-p53 매개된 MGMT 억제를 통해 WT-p53 매개된 아폽토시스를 유도하였다. 더욱이, BMX와 TMZ의 조합물은 GBM-R 세포주에서 β-카테닌/c-Myc/사이클린 D1/SOX2 신호전달 경로를 통해 세포 증식과 GSC 표현형 활성을 억제하였다. 따라서, BMX는 WT-p53 및 TMZ-내성 GBM 환자의 정밀한 개인 치료를 위한 유망한 전략일 수 있다.
종합하면, 본 발명에서, 시너지 메커니즘의 지표로서, BMX와 TMZ의 조합물이 p53/p21/E2F3/Bax의 상향 조절 및 Wnt/β-카테닌/사이클린 D1/c-Myc/p62 경로의 하향 조절을 통해 CRC의 세포 사망의 유도에 효과적이라는 것이 입증되었다. 따라서, BMX와 TMX의 조합물이 아폽토시스 및 자가포식의 유도를 포함한 세포 사망에 잠재적인 효과를 제공한다는 것이 밝혀졌다. 실시예에서의 결과는 CRC 세포 사망에 대한 이들의 HDAC8 의존적 상승작용 효과를 이해하는 데 도움을 줌으로써 BMX와 TMZ의 조합물의 잠재적인 역할을 나타낸다. 이들 발견은 조합된 화학-요법에 대한 내성을 발달시키는 임상적으로 매우 관련성이 높은 새로운 메커니즘을 제시한다.
본 명세서가 많은 특정사항을 함유하고 있지만, 이들은 본 발명의 범위 또는 청구될 수 있는 것에 대한 제한으로 해석되지 않아야 하며, 오히려, 본 발명의 특정 구체예 또는 실시예에 특정한 특징에 대한 설명으로 해석되어야 한다. 별도의 구체예 또는 실시예의 맥락에서 본 명세서에 기재된 특정의 특징은 또한 단일 구체예에서 조합으로 구현될 수 있다.
참고문헌
Claims (15)
- 테모졸로미드(TMZ)와 화학식 A의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 입체이성질체, 거울상이성질체, 전구약물 또는 용매화물을 포함하는, 환자에서의 TMZ-내성 암을 치료하기 위한 조합물:
화학식 A
상기 식에서,
R1은 수소, 알킬, 알케닐, C5-C6 사이클로알킬, 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 5-원 또는 6-원 헤테로사이클, 또는 (CH2)mR4이고;
X는 C, -O-, -N- 또는 -S-이고;
Y는 -O-, -NH 또는 -O-C1-C4 알킬이고;
n은 0 내지 10의 정수이고;
m은 0 내지 5의 정수이고;
R2 및 R3은 독립적으로 C1-C6 알킬이고;
R4는 할로겐, -CF3, -OR7 또는 -NR7R8로 치환될 수 있는 C5-C6 사이클로알킬 또는 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 헤테로사이클이고, 여기서, R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
R5는 OH, NH2 또는 C5-C6 사이클로알킬, 5-원 또는 6-원 불포화된 카르보사이클 또는 헤테로사이클이고, 여기서, 사이클로알킬, 카르보사이클 및 헤테로사이클은 할로겐, NH2, NO2, C1-C6 알콕시, C1-6 알킬티오, OR7", NR7R8 또는 CF3로 임의로 치환될 수 있고;
R6은 H, 또는 하이드록시 또는 C2-C10 알케닐에 의해서 치환될 수 있는 C1-C10 알킬이거나, R1와 함께 -C2H2-이고;
여기서, TMZ와 화합물 A는 TMZ 내성을 효과적으로 극복하도록 상대적인 비율로 조합된다. - 청구항 1에 있어서,
화합물 A가 BMX의 구조를 갖는 화합물 BMX인, 조합물. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
TMZ 내성이 TMZ-매개된 세포독성 효과의 향상에 의해서 극복되는, 조합물 - 청구항 3에 있어서,
TMZ-매개된 세포독성 효과의 향상이 β-카테닌/c-Myc/SOX2 신호전달 경로의 하향조절 및 WT-p53 매개된 MGMT 억제 내성의 상향조절에 의한 것인, 조합물. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
TMZ와 화합물 A가 별도로 또는 순차적으로 투여되는, 조합물. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
조합물 TMZ와 BMX를 포함하는, 조합물. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
암이 다형 교모세포종(glioblastoma multiforme: GBM) 또는 직장결장암(colorectal cancer: CRC)인, 조합물. - 치료학적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에서 정의된 조합물을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에게서 TMZ-내성 암을 치료하는 방법.
- 청구항 8에 있어서,
암이 GBM 또는 CRC인, 방법. - 환자에게서 약물-내성 암을 치료하기 위한 정밀한 개인 치료를 위한 방법으로서, 환자에게서 WT-p53의 발현을 측정하고, WT-p53의 발현이 환자에게서 존재하는 경우에, 치료학적 유효량의 청구항 1에 정의된 화합물 A 또는 상기 약물과의 이의 조합물을 환자에게 투여함을 포함하는, 방법.
- 청구항 10에 있어서,
약물이 TMZ인, 방법. - 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
약물-내성 암이 TMZ-내성 GMB 또는 CRC인, 방법. - TMZ-내성 암 환자를 위한 약제 또는 키트를 제조하기 위한 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 조합물의 용도.
- 청구항 11에 있어서,
암이 GBM 또는 CRC인, 용도. - TMZ-내성 암 환자 또는 CRC 환자를 위한 정밀한 개인 치료를 위한 약제 또는 키트를 제조하기 위한 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 조합물의 용도.
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