CN117642159A - 用于治疗抗药性癌症的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗抗药性癌症的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117642159A CN117642159A CN202280038525.7A CN202280038525A CN117642159A CN 117642159 A CN117642159 A CN 117642159A CN 202280038525 A CN202280038525 A CN 202280038525A CN 117642159 A CN117642159 A CN 117642159A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tmz
- bmx
- combination
- cells
- gbm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 4
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 304
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 claims abstract description 303
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 62
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 30
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 15
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 151
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 claims description 80
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 63
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 60
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 52
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 17
- -1 NH 2 Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 6
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 5
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 125000006700 (C1-C6) alkylthio group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000006374 C2-C10 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L pentamethonium bromide Chemical compound [Br-].[Br-].C[N+](C)(C)CCCCC[N+](C)(C)C GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012453 solvate Substances 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 102100038715 Histone deacetylase 8 Human genes 0.000 abstract description 39
- 101001032118 Homo sapiens Histone deacetylase 8 Proteins 0.000 abstract description 38
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 27
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 27
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 13
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100027907 Cytoplasmic tyrosine-protein kinase BMX Human genes 0.000 description 271
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 230
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 65
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 33
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 24
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 21
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 21
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 19
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 19
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 16
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 16
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 15
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 15
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 15
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 14
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 14
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 13
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 13
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 101710180313 Protease 3 Proteins 0.000 description 11
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 11
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 11
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 11
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 10
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 10
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 10
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 10
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 10
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 9
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 9
- 101000666405 Homo sapiens General transcription factor IIH subunit 1 Proteins 0.000 description 9
- 101000599779 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2 Proteins 0.000 description 9
- 102100037919 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2 Human genes 0.000 description 9
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 102100033270 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 8
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 7
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 7
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100020814 Sequestosome-1 Human genes 0.000 description 6
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 5
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 5
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 5
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 5
- 101000904150 Homo sapiens Transcription factor E2F3 Proteins 0.000 description 5
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 5
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 102100024027 Transcription factor E2F3 Human genes 0.000 description 5
- MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F Chemical compound COC(=O)C[C@@H](C(=O)CF)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 MIFGOLAMNLSLGH-QOKNQOGYSA-N 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 4
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 4
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 3
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000904152 Homo sapiens Transcription factor E2F1 Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102100024026 Transcription factor E2F1 Human genes 0.000 description 3
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 3
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 3
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 3
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- SOWOYQPLOHLYEY-NTEUORMPSA-N (e)-n-hydroxy-3-[4-methoxy-2-[(4-methoxyphenyl)methoxy]-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1COC1=C(CC=C(C)C)C(OC)=CC=C1\C=C\C(=O)NO SOWOYQPLOHLYEY-NTEUORMPSA-N 0.000 description 2
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- YPSXFMHXRZAGTG-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-2-[2-(5-methoxy-2-nitrosophenyl)ethyl]-1-nitrosobenzene Chemical compound COC1=CC=C(N=O)C(CCC=2C(=CC=C(OC)C=2)N=O)=C1 YPSXFMHXRZAGTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 6-O-methylguanine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1NC=N2 BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 230000006370 G0 arrest Effects 0.000 description 2
- 230000037057 G1 phase arrest Effects 0.000 description 2
- 230000037059 G2/M phase arrest Effects 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032742 Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Human genes 0.000 description 2
- 101000654725 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Proteins 0.000 description 2
- 101000644537 Homo sapiens Sequestosome-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- MVBPAIHFZZKRGD-UHFFFAOYSA-N MTIC Chemical compound CNN=NC=1NC=NC=1C(N)=O MVBPAIHFZZKRGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 101150090422 gsk-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010842 high-capacity cDNA reverse transcription kit Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 2
- FAQDUNYVKQKNLD-UHFFFAOYSA-N olaparib Chemical compound FC1=CC=C(CC2=C3[CH]C=CC=C3C(=O)N=N2)C=C1C(=O)N(CC1)CCN1C(=O)C1CC1 FAQDUNYVKQKNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000572 olaparib Drugs 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- BGJSXRVXTHVRSN-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trioxane Chemical group C1OCOCO1 BGJSXRVXTHVRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 108010082399 Autophagy-Related Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003954 Autophagy-Related Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150003242 Bbc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102100028914 Catenin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031048 Coiled-coil domain-containing protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 244000046038 Ehretia acuminata Species 0.000 description 1
- 235000009300 Ehretia acuminata Nutrition 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101710177327 Histone deacetylase 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000945515 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000916173 Homo sapiens Catenin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000596404 Homo sapiens Neuronal vesicle trafficking-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000911513 Homo sapiens Uncharacterized protein FAM215A Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 206010059282 Metastases to central nervous system Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100024178 Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A Human genes 0.000 description 1
- BRGMHAYQAZFZDJ-UOLFYFMNSA-N N-acetyl-alpha-D-mannosamine 6-phosphate Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BRGMHAYQAZFZDJ-UOLFYFMNSA-N 0.000 description 1
- AJRGHIGYPXNABY-UHFFFAOYSA-N N-hydroxy-1-[(4-methoxyphenyl)methyl]-6-indolecarboxamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CN1C2=CC(C(=O)NO)=CC=C2C=C1 AJRGHIGYPXNABY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPUXDMUGCAWDFW-UHFFFAOYSA-N Osthole Natural products COc1ccc2CCC(=O)Oc2c1C=CC(=O)C HPUXDMUGCAWDFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 101710203930 RNA polymerase-associated transcription-specificity factor RAP94 Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102100026728 Uncharacterized protein FAM215A Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000005735 apoptotic response Effects 0.000 description 1
- 230000004642 autophagic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000010094 cellular senescence Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 208000029664 classic familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000009096 combination chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000004547 gene signature Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011228 multimodal treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- MBRLOUHOWLUMFF-UHFFFAOYSA-N osthole Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C(CC=C(C)C)C(OC)=CC=C21 MBRLOUHOWLUMFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 208000029340 primitive neuroectodermal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000011519 second-line treatment Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000011255 standard chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 229940061353 temodar Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/075—Ethers or acetals
- A61K31/085—Ethers or acetals having an ether linkage to aromatic ring nuclear carbon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开一种治疗替莫唑胺(TMZ)抗性癌症患者的组合及方法，其包含有效相对比率的TMZ及同功型选择性HDAC8抑制剂(诸如BMX)的组合，以藉由负调控β‑连环蛋白/c‑Myc/SOX2讯号传递路径及正调控WT‑p53媒介的MGMT抑制来增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而克服TMZ抗性。
Description
技术领域
相关申请的交叉引用。本申请依据35U.S.C.§119(a)主张在2021年5月28日提出申请的美国临时申请案第63/194,585号的权益，该临时申请案的全部内容藉由引用并入本文。
本发明涉及一种用于治疗抗药性癌症，具体而言为TMZ抗性癌症的新颖组合物及方法。
背景技术
多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)为其中一种最恶性的肿瘤，且其具有侵袭性模式及高复发率；其为世界卫生组织第4级的星状细胞瘤[1]。尽管采用手术及伴随的放射及化学疗法进行多重模式治疗，然而GBM患者的预后仍然很差，平均存活期小于15个月，这表明存在有疗法抗性[2-4]。
大肠癌或大肠直肠癌(CRC)为其中一种最普遍的恶性肿瘤，且为全球癌症死亡的第三大主因。尽管大肠癌或CRC标准治疗已得到充分研究及确立，然而其仍存在高死亡率及临床挑战问题。该疾病的症状较少，这是因为患者在初期评估时经常被诊断为晚期癌症，且随后五年存活率约为10％[5-6]。CRC的标准治疗为手术、放射及/或化学疗法，其中奥沙利铂(Oxaliplatin，Oxp)及其前驱药卡培他滨(capecitabine)广泛用于临床实践[7-8]。遗憾的是，在这种DNA交联剂治疗下的复发在最初几年内仍为常见，甚至在完成整个周期后也是如此[9]。
替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)为烷基化剂达喀尔巴仁(dacarbazine)的咪唑四亲脂性前驱药，其具有良好的血脑屏障穿透性。尽管TMZ在生理pH下自发非酵素型转化为反应性化合物5-(3-甲基三/>-1-基)-咪唑-4-羧酰胺(MTIC)[10]。MTIC的细胞毒性被认为主要归因于DNA的烷基化(甲基化)，其主要发生在鸟嘌呤的O6及N7位置。自2005年获得首次FDA批准以来，TMZ已广泛用作新诊断的多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)的标准化学疗法。除GBM以外，TMZ已被证明与达喀尔巴仁具有相等效用。因此，其也在标准治疗后用于恶性黑色素瘤患者的“标签外(off-label)”。另外，许多临床研究正在进行中，以证明TMZ在其他适应症中的有效性，诸如脑转移瘤、淋巴瘤、神经内分泌肿瘤、垂体瘤、尤文氏(Ewing’s)肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、顽抗性白血病、肺癌、及其他肿瘤[11]。TMZ是一种临床上对老年人、儿童或安宁患者耐受性良好的治疗方法，其可作为单一药剂或作为辅助性(放射治疗或化学疗法)第一线或第X线治疗。然而，由于O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)的过度表现，因此经TMZ治疗的患者会出现抗药性。因此，这是成功治疗GBM必须克服的临床上有意义及实质性的障碍。
然而，由于O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)的过度表现，因此不到50％的患者对TMZ有反应，这会反转鸟嘌呤O6位的甲基化，从而修复GBM细胞中的DNA并抵抗化学疗法作用[12-14]。对接受TMZ治疗的新诊断及复发CRC患者的间的MGMT蛋白浓度进行比较，证实MGMT降低可能会促进TMZ治疗的效用[15-17]。除了启动子甲基化的外，MGMT也受各种转录因子，诸如p53、Sp1、NF-κB、CEBP及AP-18的调节。当中，p53藉由直接与MGMT启动子相互作用来负调控MGMT转录[18、19]。因此，除了MGMT启动子甲基化的外，p53也可调控MGMT表现并引起TMZ抗性。因此，必须鉴定调控MGMT的其他机转以克服TMZ抗性。
因此，希望开发一种新颖且更好的用于抗药性癌症，具体而言TMB抗性GBM或CRC的疗法或治疗。
发明内容
因此，本发明提供一种治疗抗药性癌症，诸如TMZ抗性GBM或CRC的新颖方法。
本发明出乎意料地发现，化合物X，诸如BMX，可增强TMZ媒介的对GBM-R细胞株及CRC细胞株HT29、HCT116及RKO的细胞毒性作用。因此，本发明提供一种治疗患者的抗药性癌症，具体而言TMZ抗性GBM或CRC的新颖方法，其包含向该患者施用BMX及TMZ的组合。
在本发明中，BMX(NBM-T-L-BMX-OS01)为一种组织蛋白去乙酰酶8抑制剂(HDAC8i)，其在大肠直肠癌细胞、人类脐内皮细胞、肺癌细胞及神经胶质母细胞瘤细胞中表现出显著的抗细胞增殖作用，且其在动物异种移植模型中也表现出肿瘤抑制能力[20、21]。然而，本发明出乎意料地发现BMX可克服癌细胞的抗药性。在本发明的一个实例中，BMX可藉由负调控β-连环蛋白/c-Myc/SOX2讯号传递路径及正调控p53媒介的MGMT抑制来增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而克服GBM-R细胞。已证实在人类GBM组织及GBM-R细胞株中，高HDAC8表现与MGMT浓度相关，且BMX及TMZ的组合在GBM-R细胞株中藉由WT-p53媒介的MGMT抑制而诱导WT(野生型)-p53媒介的细胞凋亡。另外，BMX及TMZ的组合经由GBM-R细胞株中的β-连环蛋白/c-Myc/周期蛋白D1/SOX2讯号传递路径来抑制细胞增殖及GSC表现型活性。
在本发明的一个实例中，已证明经由正调控p53/p21/Puma/Bax在CRC细胞中引发的细胞周期停滞、衰老、自噬及细胞凋亡的BMX及TMZ的组合受到负调控Wnt/β-连环蛋白/周期蛋白D1/c-Myc/p62路径的串扰所破坏。因此，BMX可能是一种有望的策略，用于精准个人治疗具有WT-p53的TMZ抗性GBM患者或CRC患者。
因此，在一方面，本发明提供一种治疗TMZ抗性癌症的组合，其包含TMZ及具有式A结构的化合物A，或其医药上可接受的盐、立体异构体、镜像异构体、前驱药或溶剂合物：
其中
R1为氢、烷基、烯基、C5-C6环烷基、5-员或6-员不饱和碳环或5-员或6-员杂环、或(CH2)mR4；
X为C、-O-、-N-或-S-；
Y为-O-、-NH或-O-C1-C4烷基；
n为0到10的整数；
m为0到5的整数；
R2及R3独立地为C1-C6烷基；
R4为C5-C6环烷基或可被卤素、-CF3、-OR7或-NR7R8取代的5-员或6-员不饱和碳环或杂环，其中R7及R8独立地为氢或C1-C6烷基；
R5为OH、NH2或C5-C6环烷基、5-员或6-员不饱和碳环或杂环，其中环烷基、碳环及杂环可任选地被卤素、NH2、NO2、C1-C6烷氧基、C1-6烷硫基、OR7”、NR7R8或CF3取代；以及
R6为H、可被羟基取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基，或与R1一同为-C2H2-；以及
其中TMZ及化合物A以相对比率组合来有效克服TMZ抗性。
在本发明的一个具体实施例中，化合物A为具有以下结构的化合物BMX：
根据本发明，藉由负调控β-连环蛋白/c-Myc/SOX2讯号传递路径及正调控WT-p53媒介的MGMT抑制来增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而克服TMZ抗性。
在本发明中，TMZ及化合物A，例如BMX，分别或依序施用。
在本发明的一个实例中，癌症为多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)或大肠直肠癌(CRC)。
在另一个方面，本发明提供一种治疗患者的TMZ抗性癌症的方法，该方法向患者施用治疗有效量的根据本发明的组合。
在本发明的一个实例中，癌症为GBM或CRC。
在另一方面，本发明提供一种治疗患者的抗药性癌症的精准个人治疗的方法，其包含判定患者中WT-p53的表现，且若患者中WT-p53的表现存在，则向患者施用治疗有效量的BMX或其与该药物的组合。
在本发明的一个具体实施例中，药物为TMZ。
在本发明的一个具体实施例中，抗药性癌症为TMZ抗药性癌症，具体而言为GMB或CRC。
在本发明中，已证实BMX有效增强WT-p53癌细胞的抑制。
在另一方面，本发明提供一种BMX及TMZ的组合的用途，其用于制造用于治疗TMZ抗性癌症的药物或试剂盒。
本发明的其他目的及优点一部分记载于下述说明中，或者可透过本发明的实施例而理解。应了解前文的发明内容及下文的实施方式仅为例示性及阐释性的说明，而非如权利要求般限定本发明。
附图说明
配合附图阅读将能更佳地理解本发明如上的概述以及如后的详细描述在。为了说明本发明，在附图中显示现有较佳的具体实施例。
在附图中：
图1提供藉由生物信息学工具对潜在与HDAC8相关的基因进行的路径分析；其中shRNA HDAC8被输入CLUE数据库，且选择得分>90的CP及PCL(A)。使标靶基因输入CPDB路径分析数据库(B)以用于进一步实验。(C)选择shRNA HDAC8的CP及PCL(得分>90)的前10条路径。10条路径如下：VEGF；PI3K-Akt讯号传递路径；JAK STAT路径及调控；讯号传递路径；MAPK讯号传递路径-智人(人类)；细胞凋亡；自噬；HIF-1讯号传递路径；TNF相关的细胞凋亡弱诱导剂(TWEAK)讯号传递路径；Wnt讯号传递路径。VEGF；PI3K-Akt讯号传递路径；JAKSTAT路径及调控；讯号传递路径；MAPK讯号传递路径-智人(人类)；细胞凋亡；自噬；HIF-1讯号传递路径；TNF相关的细胞凋亡弱诱导剂(TWEAK)讯号传递路径；Wnt讯号传递路径。
图2示出BMX抑制GBM细胞(U87MG及A172)的生长及增殖，且BMX及TMZ的组合抑制GBM-R细胞(U87MG-R及A172-R)的生长及增殖。(A)BMX的化学结构。(B)以0.5、10、15、30或50μM BMX治疗后GBM及GBM-R细胞株的细胞存活力。(C)以0.25、50、100、200、400或800μM TMZ治疗后GBM及GBM-R细胞株的细胞存活力。(D)以10μM BMX，在存在或不存在不同浓度(0.25、50、100、200、400或800μM)的TMZ下治疗24小时后的GBM及GBM-R细胞存活力。(E)以50μMTMZ，在存在或不存在各种浓度(0.5、10、15、30或50μM)的BMX下治疗24小时后的GBM及GBM-R细胞存活力。(F)以50μM TMZ，在存在或不存在10μM BMX下治疗24、48及72小时后的GBM-R细胞存活力。(G)以BMX(0、5或10μM)，在存在或不存在TMZ(50μM)下，进行14天的GBM及GBM-R细胞株的群落形成试验。数据表示为来自三次实验的平均值±SEM。*p<0.05相对于对照组(A172及U87MG)；#p<0.05相对于(A172-R及U87MG-R)。
图3示出BMX藉由靶向Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径来抑制GBM-R细胞中的细胞增殖而增强TMZ媒介的细胞毒性作用。(A)以5或10μM BMX，在存在或不存在50μM TMZ下治疗48小时后，GBM-R细胞的GSK-3β及β-连环蛋白活化状态。(B)以5或10μMBMX，在存在或不存在50μMTMZ下治疗48小时后GBM-R细胞的c-Myc及周期蛋白D1蛋白浓度。(C)以10μM BMX及50μMTMZ，在存在或不存在10μM MG132下治疗后，GBM-R细胞中β-连环蛋白(Ser33/37/41)磷酸化状态以及c-Myc与周期蛋白D1蛋白表现的变化。
图4示出BMX及TMZ的组合藉由促进GBM-R细胞中TMZ媒介的细胞凋亡而增强TMZ媒介的细胞毒性作用。(A)在存在或不存在TMZ下，以BMX治疗48小时后，GBM(U87MG及A172)及GBM-R(U87MG-R及A172-R)细胞的细胞周期分布。(B)G0/G1、S及G2/M阶段的细胞百分比以直方图表示。(C)亚G1的百分比的直方图。(D)在存在或不存在TMZ下，以BMX治疗48小时后，GBM(U87MG及A172)及GBM-R(U87MG-R及A172-R)细胞的膜联蛋白V/PI细胞凋亡试验。(E)直方图显示细胞凋亡细胞的百分比。
图5示出BMX及TMZ的组合藉由在GBM-R细胞中的WT-p53媒介的MGMT抑制而增强TMZ媒介的细胞毒性作用。(A)WT-p53及MGMT在GBM(U87MG及A172)及GBM-R(U87MG-R及A172-R)细胞株上的表现模式。(B)在U87MG-R及A172-R上，以5或10μMBMX，在存在或不存在50μM TMZ下治疗48小时后，WT-p53、MGMT、P21、Bax、Bcl-2、Puma及裂解的凋亡蛋白酶-3的蛋白变异。(C)以5或10μM BMX，在存在或不存在50μM TMZ下治疗GBM(U87MG及A172)及GBM-R(U87MG-R及A172-R)细胞48小时，降低MGMT浓度，并增加WT-p53及磷酸-WT-p53浓度(ser 15)。β-肌动蛋白用作内部对照组。
图6示出BMX及TMZ的组合降低GBM-R细胞中GSC的形成。(A)在亲代和抗性子细胞株的间CSC相关基因(CD133、CD44及SOX2)表现的状态。(B)U87MG-R及A172-R细胞在接受5及10μMBMX、存在或不存在50μM TMZ下，48小时后CD133、CD44及SOX2蛋白浓度的变化。(C)藉由手术生检获得的人类原发性GBM(伴随放疗及化学疗法前同一患者)及复发性GBM肿瘤组织(伴随放疗及化学疗法后)中HDAC8及CSC相关基因(CD133及CD44)的免疫组织化学染色。
图7提供BMX与TMZ的组合以克服GBM-R细胞中TMZ抗性的机转的工作模型。
图8示出GBM细胞株的基因特征(A)藉由西方墨点法在GBM细胞中表现HDAC8(来自Abcam公司)。
图9示出BMX是一种有效的半合成HDAC8抑制剂。(B)藉由大数据分析对MGMT甲基化对GBM进行检测。分别以蓝色及红色标记野生型及突变型(单边t检定，*p<0.05)。(A)使用qRT-PCR试验，测定在存在或不存在TMZ(50μM)下，以不同剂量的BMX(0-10μM)刺激的HDAC8表现浓度。(B)使用西方墨点法，测定在存在或不存在TMZ(50μM)下，以BMX(0-10μM)刺激的HDAC8表现浓度。
图10示出BMX及BMX与TMZ一同抑制U87MG、U87MG-R、A172及A172-R的生长及增殖。(A)以指定浓度的BMX(0.5、10、15、30或50μM)治疗24、48及72小时后，GBM及GBM-R细胞株的细胞存活力。(B)以指定浓度的TMZ(0.25、50、100、200、400或800μM)治疗24、48及72小时后，GBM及GBM-R细胞株的细胞存活力。(C)以10μM BMX，在存在或不存在不同浓度TMZ(0.25、50、100、200、400或800μM)下治疗24、48及72小时后，GBM及GBM-R细胞株的细胞存活力。(D)以50μM TMZ，在存在或不存在不同浓度(0.5、10、15、30或50μM)的BMX下治疗24、48及72小时后，GBM及GBM-R细胞株的细胞存活力。(E)以50μM TMZ，在存在或不存在10μM BMX下治疗24、48及72小时后，GBM-R细胞株的细胞存活力。
图11示出BMX在GBM细胞中的活体外细胞毒性。(A)以TMZ(50及100μM)治疗U87及U87R细胞以及(B)A172及A172R细胞。使用成株试验判定TMZ对GBM细胞的抑制作用。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图12示出神经胶质母细胞瘤中的药物及基因信息，包括有两个亲代GBM细胞株(A172及U87MG)的HDAC8表现浓度，其为野生型p53(WT-p53)及两种TMZ抗性GBM细胞株。
图13示出BMX、TMZ、奥沙利铂及阿霉素(doxorubicin)组合会抑制CRC细胞中的细胞增殖。(A)使用CCK-8方法试验具有不同药物浓度及治疗持续时间的BMX、TMZ、Oxp、Dox、BMX加TMZ、BMX加Oxp或BMX加Dox在HT29、HCT116及RKO细胞中的增殖。(B)在HT29、HCT116及RKO细胞中，以不同的BMX、TMZ、Oxp、BMX加TMZ以及BMX加Oxp治疗，进行群落形成试验，对殖株定量并以统计数字表示。(C)在HT29、HCT116及RKO细胞中以不同浓度的BMX或BMX与TMZ的组合治疗48小时后的细胞周期分析，以及在每个细胞周期阶段中的细胞比例。(D)以不同浓度的BMX或BMX与TMZ的组合治疗48小时后的细胞凋亡分析，以及在HT29、HCT116及RKO细胞中的细胞凋亡率。所有结果均显示为来自三次独立实验的平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001相对于对照组(HT29细胞)；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001相对于对照组(HCT116细胞)；相对于对照组(RKO细胞)。
图14示出BMX、BMX及TMZ的组合诱导的细胞凋亡及自噬的作用是由p53媒介的MGMT抑制所媒介。(A)在以各种浓度的BMX(5及10μM)及BMX与TMZ的组合治疗48小时的HT29、HCT116及RKO细胞中，P53、p53 Lys382乙酰化、p53 Ser15磷酸化、p21、p16、MGMT、γH2AX、E2F1及E2F3表现的西方墨点法分析。(B)在HT29、HCT116及RKO细胞中表现裂解的凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-7、凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-9及裂解的PARP蛋白，这些细胞以不同浓度的BMX(5及10μM)及BMX与TMZ的组合治疗48小时。(C)在以各种浓度的BMX(5及10μM)及BMX与TMZ的组合治疗48小时的HT29、HCT116及RKO细胞中，Bax、Bcl-2、BID、Bim、Bak及Puna蛋白的表现。GAPDH用作上样对照组。
图15示出BMX、BMX及TMZ的组合诱导HT29、HCT116及RKO细胞的细胞衰老。BMX及TMZ的组合的衰老相关β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)染色。以10μM BMX加TMZ(50μM)治疗细胞48小时，以SAβ-gal(蓝色细胞质染色剂)对细胞染色。比例尺：50μm。SAβ-gal活性的定量。所有结果均显示为来自三次独立实验的平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001相对于对照组(HT29细胞)；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001相对于对照组(HCT116细胞)；相对于对照组(RKO细胞)。
图16示出BMX及TMZ的组合降低HT29、HCT116及RKO细胞中CSC的形成。HT29、HCT116及RKO细胞在接受5及10μM BMX、存在或不存在50μM TMZ下，48小时后CD133、CD44及SOX2蛋白浓度的变化。GAPDH用作上样对照组。
图17示出BMX藉由靶向CRC细胞中的Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径而增强TMZ媒介的细胞毒性作用。(A)在以5或10μM BMX，存在或不存在50μM TMZ下治疗48小时后，HT29、HCT116及RKO细胞的GSK-3β、β-连环蛋白活化状态、c-Myc及周期蛋白D1。(B)在T29、HCT116及RKO细胞中，以BMX，在存在或不存在50μM TMZ及MG132下正调控GSK-3β、β-连环蛋白活化状态、c-Myc及周期蛋白D1表现。(C)在T29、HCT116及RKO细胞中，以BMX，在存在或不存在50μM TMZ及MG132下正调控P53及MGMT表现。GAPDH用作上样对照组。
图18示出自噬是BMX单独、BMX及TMZ的组合诱导细胞死亡的原因。(A)藉由西方墨点法评估以BMX(5及10μM)，在存在或不存在50μM TMZ下治疗的HT29、HCT116及RKO细胞中，LC3及P62/SQSTM1表现。(B)在T29、HCT116及RKO细胞中，以BMX，在存在或不存在50μM TMZ及MG132下负调控p62/SQSTM1表现。(C)以BAF及VAD预治疗减少HT29、HCT116及RKO细胞中的细胞凋亡，其中这些细胞暴露于BMX(5及10μM)，在存在或不存在50μM TMZ下48小时。(D)VAD及BAF对BMX(5及10μM)的作用，在存在或不存在50μM TMZ下，诱导裂解的凋亡蛋白酶-3、裂解的PARP、P62及LC3表现。GAPDH用作上样对照组。
具体实施方式
除非另有定义，所有本文所用的技术性及科学性术语，对于属于本发明领域的技术人员而言，皆具有与其所习知者相同意义。
上述发明内容将参考下列实例的具体实施例而进一步说明。然而，其不应理解为本发明的内容仅局限于下列具体实施例，且基于本发明上述内容的所有发明皆属于本发明的范畴。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
如本文中所用，单数形式“一”、“一者”及“该”包括多个参考物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一样本”包括多个此类样本及本领域技术人员已知的其等同物。
本发明提供一种使用TMZ及化合物A的组合治疗TMZ抗性癌症(例如GBM及CRC)患者的新颖方法。
化合物A为一种新颖的小分子同功型选择性HDAC8抑制剂。化合物A揭示于美国专利号第7,994,357中，其内容藉由引用整体并入本文。化合物A具有式A的结构，或其医药上可接受的盐、立体异构体、镜像异构体、前驱药或溶剂合物：
其中
R1为氢、烷基、烯基、C5-C6环烷基、5-员或6-员不饱和碳环或5-员或6-员杂环、或(CH2)mR4；
X为C、-O-、-N-或-S-；
Y为-O-、-NH或-O-C1-C4烷基；
n为0到10的整数；
m为0到5的整数；
R2及R3独立地为C1-C6烷基；
R4为C5-C6环烷基或可被卤素、-CF3、-OR7或-NR7R8取代的5-员或6-员不饱和碳环或杂环，其中R7及R8独立地为氢或C1-C6烷基；
R5为OH、NH2或C5-C6环烷基、5-员或6-员不饱和碳环或杂环，其中环烷基、碳环及杂环可任选地被卤素、NH2、NO2、C1-C6烷氧基、C1-6烷硫基、OR7”、NR7R8或CF3取代；以及
R6为H、可被羟基取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基，或与R1一同为-C2H2-。
在本发明的一个具体实施例中，化合物A为BMX，其衍生自王草脑(osthole)的半合成，并在学习及记忆中扮演新颖角色，如Yang YC等人所报导的[22]：
已知BMX为一种同功型选择性HDAC8抑制剂，其具有最低的毒性及穿过血脑屏障的能力[22]。
如本文所用，“替莫唑胺”或“TMZ”等词，以商品名“Temodar”等出售，其涉及用于治疗一些脑肿瘤，诸如多形性神经胶质母细胞瘤或未分化性星状细胞瘤的药物。TMZ具有以下结构：
替莫唑胺(TMZ)为一种用于治疗某些癌症的烷化剂，诸如用于例如星状细胞瘤的第二线治疗及用于多形性神经胶质母细胞瘤的第一线治疗。也发现奥拉帕尼(Olaparib)与替莫唑胺组合在复发性小细胞肺癌中表现出显著的临床活性。
如本文所用，“多形性神经胶质母细胞瘤“、“神经胶质母细胞瘤”或“GBM”等词涉及一种脑癌，其可从正常脑细胞起始或从现有低度分化的星状细胞瘤发展。尚无已知预防GBM的方法。治疗通常涉及手术，接着使用化学疗法及放射治疗。药物替莫唑胺(TMZ)经常用作化学疗法的一部分。如本文所用，“大肠癌”、“大肠直肠癌”或“CRC”等词也称作肠癌或直肠癌，其涉及从结肠或直肠(大肠的部分)发展的癌症。其征象及症状可能包括便血、排便变化、体重减轻及疲劳。CRC的标准治疗为手术、放射及/或化学疗法，其中奥沙利铂(Oxp)及其前驱药卡培他滨广泛用于临床实践。遗憾的是，在这种DNA交联剂治疗下的复发在最初几年内仍为常见，甚至在完成整个周期后也是如此。
在本发明中，发现BMX藉由负调控β-连环蛋白/c-Myc/SOX2讯号传递路径及正调控WT-p53媒介的MGMT抑制来增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而克服TMZ抗性。本发明的结果表明，BMX或其与TMZ的组合有望用于TMZ抗性WT-p53 GBM或CRC细胞的精准个人治疗。
藉由以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了说明而非限制。
实施例1
1.1材料及方法
1.1.1细胞培养物及试剂
本研究使用四种GBM细胞株：U87、U87R、A172及A172R。美国典型培养物保存中心(ATCC；Manassas，VA，美国)提供人类GBM细胞株U87-MG(ATCC HTB-14；未知来源的GBM)及A172(ATCC CRL-1620；ATCC)。U87R及A172R细胞获自Tsung-I Hsu博士及Jian-Ying Chung博士(神经再生医学博士学位学程，医学科技学院，台北医学大学，中国台湾)。使这些细胞在含有10％胎牛血清(FBS)及50μM TMZ的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’smodified Eagle medium，DMEM)中维持至少60天。使用群落形成试验证实U87R及A172R细胞中的TMZ抗性(图11)。在补充有10％ FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素(全部来自Gibco；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)的DMEM中培养细胞，并使其维持在37℃及5％CO2的加湿培养箱中。NBM-BMX(BMX)：(E)-2-(4-甲氧基苄氧基)-3-异戊二烯基-4-甲氧基-N-羟基酰胺，由彦臣生技药品股份有限公司(中国台湾)所提供。
1.1.2细胞增殖及群落形成试验
吾人在96孔盘中，以每孔接种3000个GBM细胞，并使其附着隔夜。为了验证细胞株对BMX及TMZ单一疗法的反应性，以不同剂量的BMX或TMZ治疗细胞24、48及72小时。为了证实细胞对BMX-TMZ组合的反应性，在存在或不存在BMX(10μM)下，以不同剂量的TMZ(0-800μg/mL)治疗细胞24、48及72小时；或在存在或不存在TMZ(50μM)下，以不同剂量的BMX(0-50μM)治疗细胞24、48及72小时。治疗后，在指定时间点使用CCK8试剂盒(Targetmol，Shanghai，中国)测量吸收值。结果报导为至少三次重复的平均值±标准偏差。
使A172、A172-R、U87MG及U87MG-R细胞接种(1000个细胞/培养皿)到6公分培养皿中，并培养14天。以磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，在4％三聚甲醛中固定30分钟，并在25℃下以0.1％结晶紫染色20分钟。以自来水小心洗涤群落，接着对群落数(定义为至少50个细胞)进行计数及分析。结果表示为三次独立实验的平均群落数±标准误差。
1.1.3反转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
ABI7700序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)用于mRNA表现的定量分析。使细胞(2×105)接种在6孔盘中，使用组织总RNA微型试剂盒(Geneaid，中国台湾)提取总RNA。藉由使用高容量cDNA反转录试剂盒(AppliedBiosystems)，使10ng的总RNA样品转录成cDNA。根据制造商提供的程序，使用Fast SYBRGreen Master Mix(Applied Biosystems)定量基因表现，以18秒作为内部参考。所有程序均根据制造商的方案进行。热循环条件如下：50℃2分钟，95℃10分钟，且循环95℃15秒、及60℃1秒共40次。以三重复分析每个样品。使用StepOnePlus(Applied Biosystems)软件计算循环阈值(Ct)。使用2-(ΔCt)方法计算每种mRNA的相对表现。HDAC8的引子序列如下：
HDAC8前置5’-GCGTGATTTCCAGCACATAA-3’(SEQ ID NO:1)；
HDAC8反置5’-ATACTTGACCGGGGTCATCC-3’(SEQ ID NO:2)。
18s前置5’-TCAAGTGCAGTGCAACAACTC-3’(SEQ ID NO:3)；
18s反置5’-AGAGGACAGGGTGGAGTAATCA-3’(SEQ ID NO:4)。
1.1.4DNA细胞周期的流式细胞术分析
对于DNA细胞周期，在存在或不存在TMZ(50μM)下，以不同剂量的BMX(0-10μM)治疗48小时后，藉由胰蛋白酶消化来收集细胞，以磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并在甲醇中固定。接着再次洗涤细胞，以0.05mg/mL的最终浓度(Sigma-Aldrich；Merck Millipore，Darmstadt，德国)经受RNaseA，并与10μg/mL碘化丙啶(PI；Sigma-Aldrich；MerckMillipore)在4℃下在黑暗中一同培养15分钟。使用荧光活化细胞分选(FACS)流式细胞术(Attune NxT流式细胞术，Thermo Fisher Scientific)进行细胞周期分析。
1.1.5细胞凋亡的流式细胞术分析
为了分析在TMZ(50μM)存在或不存在下，不同剂量BMX(0-10μM)中的细胞凋亡，使用488A膜联蛋白V及PI细胞凋亡试剂盒(Fremont，CA，美国)，根据制造商的使用说明进行FITC标记的膜联蛋白V/PI染色。PI及膜联蛋白的流式细胞术分析在治疗后48小时进行。使用FACS流式细胞术(Attune NxT流式细胞术，Thermo Fisher Scientific)测量总共10,000个细胞核。
1.1.6免疫组织化学染色
在4微米厚的石蜡切片上进行免疫组织化学染色。使切片脱蜡、水合，并在4℃下放置隔夜。对于抗CD133(AP1802a，Abgent，San Diego，CA，美国)、P62(ab56416，Abcam，Cambridge，MA，美国)及LC3II(AP1802a，Abgent)的抗体，使用标准抗生物素蛋白-生物素复合物方法。在切片回到室温后，加入生物素化的二级抗体及辣根(horseradish)标记的链霉亲和素。接着使样品在37℃的烘箱中培养。随后进行DAB显色、苏木精对比染色、梯度酒精脱水、以及二甲苯透明。的后以中性胶密封所有样品。人脑组织：本研究中的伦理声明得到高雄医学大学医院机构审查委员会的批准(编号KMUHIRB-F(I)-20200024)。从参与研究的所有个体获得知情同意。
1.1.7西方墨点法分析
收集细胞，并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(EMD MilliporeBillerica，MA，美国，10×RIPA缓冲液)中裂解。使用蛋白试验试剂盒(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，美国)测定蛋白浓度。使SDS上样缓冲液与蛋白样品混合。使用8％-12％ SDS-PAGE分离蛋白(20μg/泳道)，并转移到PVDF膜上，以5％牛血清白蛋白在Tris-缓冲盐水(TBS)-Tween 20(0.5％；TBS-T)中在室温下封闭1小时，与一级抗体在44℃下培养隔夜，接着与辣根过氧化物酶(HRP)共轭的二级抗体在室温下培养1小时。在以TBS-T彻底洗涤后，以化学HRP受质检测HRP讯号。吾人使用的抗体列于表3。藉由与增强的化学发光试剂一同培养并暴露到X射线胶片来观察每种标靶蛋白的讯号。
1.1.8统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。使用单因子变异数分析来进行统计分析。使用学生t检定来比较数据。统计显著性程度设定为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表3：实验抗体
/>
1.1.9藉由多数据库平台预测HDAC8抑制剂的潜在机转
间接方法：CLUE在其一百万个图形中计算shRNA HDAC8的连接得分，并对与相反化合物的相似性及基因扰动进行排序。过滤标准超过90个正得分，并收集每个实施例的靶向基因作为生物学功能中的shRNA HDAC8调控剂。使此基因列表输入CPDB平台进行富集分析，从而获得清晰的路径信息。直接方法：根据BMX-L1000基因表现数据，确定对HepG2细胞中药物生物学功能有反应的正调控及负调控基因列表。BMX(1μM)与DMSO对照组相比，根据±1.5倍变化定义显著差异表现基因(DEG)，p值<0.05。因此，DEG用作查询CPDB的输入以进行路径分析。为了缩小优先路径，吾人使两个结果交集并选择共同元素。
1.2结果：
1.2.1.藉由生物信息学工具对HDAC8抑制剂的潜在表现图形的路径分析
为了探索HDAC8抑制剂及基因参与的可能机转，吾人使用连接图谱(C-Map)及基于整合网络的细胞标记统一环境库(CLUE)系统数据库(https://clue.io/)及ConsensusPathDB(CPDB)平台(http://cpdb.molgen.mpg.de/)的基因库进行综合机转分析。吾人使用两个生物信息学方法，分别为直接及间接分析(图1A)。对于直接分析，以BMX在L1000盘中治疗HepG2细胞，其对BMX的生物学功能有反应(图1A，右)。使用具有1.5倍变化的显著差异表现基因(1583个正调控及900个负调控)来查询CPDB平台，以揭示潜在路径(p值<0.05)。接着，吾人利用间接方法，CLUE平台的模式匹配算法，分析HDAC8抑制功能。使用shRNA HDAC8标记作为BMX治疗(HDAC8抑制剂)的模拟，接着吾人使用CLUE，其计算超过100万个图形以匹配来自19,811个小分子化合物或基因扰动(例如18,493个shRNA、3,462个过度表现构筑)的相似标记模式，接着获得连接得分。正得分表示查询及实例标记的间的相似机转；而负得分意思为相反功能。吾人的标准为选择高于90个连接得分的化合物(CP)、敲低基因(KD)、过度表现基因(OE)及干扰素类(PCL)。CLUE使相似功能的化合物或相同家族基因聚集到一个具体的组中，该组可假定为作用机转。然而，此大数据系统并无提供详细的路径信息。因此，吾人组合CPDB平台对shHDAC8及经BMX治疗的细胞进行互补分析(图1A，左)。这些不同的生物信息学管道将获得若干机转/路径，且吾人使这两个数据集交集以筛选可能潜在的路径。Wnt讯号传递路径为一种经由吾人的多数据库平台所揭示的一流机转(图1B)。
1.2.2BMX增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而抑制GBM-R细胞的生长及增殖
为了研究HDAC8是否与治疗抗性GBM相关，吾人检验两种亲代GBM细胞株(A172及U87MG，A172及U87MG为野生型p53(WT-p53)，图12)以及两种TMZ抗性GBM细胞株(A172-R及U87MG-R，WT-p53的变体)的HDAC8表现浓度。在两种GBM-R细胞株中均检测到HDAC8过度表现(图8A及8B)。
在实施例中，NBM-BMX(由Nature Wise Biotech&Medicals公司所提供；本稿中使用BMX)作为HDAC8抑制剂来模拟shRNA HDAC8的作用以进行进一步的实验。BMX(397.46Da)的结构如图2A所示。藉由以BMX治疗四种细胞株并检测BMX诱导的HDAC8 mRNA及蛋白表现的抑制，证实BMX为一种HDAC8抑制剂(图9A及9B)。
据信，BMX可能会增强在GBM及GBM-R细胞中TMZ媒介的细胞毒性作用的敏感性。在此实施例中，发现BMX及TMZ在治疗GBM及GBM-R、A172/A172-R及U87MG/U87MG-R细胞方面存在组合作用。在24、48及72小时内，在不同浓度下，对BMX单独组、TMZ单独组及组合组进行MTT试验，以评估细胞增殖及细胞存活力。在每个单独治疗组中，结果表明每组中的细胞毒性作用以时间相依方式增加(图10A)。结果表明，BMX单独的IC50值在A172/A172-R细胞中为21.00±2.34μM/>52.64±3.62μM，在U87MG/U87MG-R细胞中为29.84±2.32μM/>68.13±4.69μM(图2B)，这表明BMX单独可抑制GBM细胞增殖，但不能抑制GBM-R细胞增殖。另外，TMZ单独的IC50值在A172/U87MG细胞中为73.48±3.65μM/80.99±1.68μM，在A172-R/U87MG-R细胞中为595.07±23.42μM/302.51±15.24μM，这证实GBM-R细胞的可靠性(图2C)。在组合治疗组中，BMX 10μM用于与不同剂量的TMZ组合(图2D)，且TMZ 50μM(与GBM-R细胞株中的维持浓度相同)用于与不同浓度的BMX组合(图2E)，以判定何种剂量的BMX及TMZ最能增强在GBM-R细胞中TMZ媒介的细胞毒性作用。数据显示，50μM TMZ及10μM BMX在两种GBM-R细胞株中均发挥最高的细胞毒性作用。吾人以时间相依方式使用这种组合，并在48小时内注意到细胞毒性作用(图2F，在48小时内，BMX 10μM：0.88x、0.77x、0.63x；BMX及TMZ：0.74x、0.56x、0.47x)。成株试验也显示，10μMBMX及50μM TMZ能抑制GBM-R细胞(图2G)，而BMX单独无法。综上所述，数据表明组合可治疗抑制GBM细胞(U87MG及A172)及GBM-R细胞(U87MG-R及A172-R)的生长及增殖，且10μM BMX及50μM TMZ的组合对GBM-R细胞发挥最高的细胞毒性作用(抑制细胞增殖及细胞存活力)。尽管如此，与没有抑制作用的TMZ单独相比，BMX单独的细胞存活力仍适度降低，显示出对A172R/U87R药理细胞毒性作用的部分能力。因此，在进一步的实验中，对BMX及TMZ的组合治疗与BMX单独进行比较。
1.2.3BMX藉由靶向GBM-R细胞中的Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径而增强TMZ媒介的细胞毒性作用
藉由增强在GBM-R细胞中TMZ媒介的细胞毒性作用来研究该机转。根据路径分析，推测标准的Wnt讯号传递(也称作Wnt/β-连环蛋白)路径参与GBM-R细胞的增殖。每个细胞的基因背景表明Wnt基因，诸如腺瘤性息肉大肠杆菌及β-连环蛋白(CTNNB1)并无突变。磷酸-β-连环蛋白(Ser33/Ser37/Thr41)作为β-连环蛋白活性形式，用于检测β-连环蛋白状态。GSK3β(S9)用于β-连环蛋白磷酸化以降解β-连环蛋白。结果表明，10μM BMX及50μM TMZ藉由GSK3β在U87R及A172R细胞中的磷酸化而直接降低β-连环蛋白的蛋白浓度，并降低磷酸-β-连环蛋白(Ser33/Ser37/Thr41)的蛋白浓度，而BMX单独仅略微降低这些浓度。另外，GSK3β(S9)的磷酸化程度也降低，这表明GSK3β活性增加且β-连环蛋白被磷酸化(图3A)。为了检验BMX对增殖标记c-Myc及周期蛋白D1的作用，注意到在存在及不存在TMZ下的BMX都可降低其程度/浓度(图3B)。
用蛋白酶体抑制剂MG132治疗GBM-R细胞，以证明β-连环蛋白浓度随蛋白降解而降低。结果显示，在10μM BMX及50μM TMZ下，MG132应用反转β-连环蛋白降解并增加c-Myc及周期蛋白D1表现(图3C)。这些结果表明，BMX藉由Ser9磷酸化负调控而增强GSK3β活性，其反过来增强β-连环蛋白在Ser33/Ser37/Thr41处的磷酸化，从而引发蛋白降解。总的，这些数据显示，10μM BMX及50μM TMZ增强TMZ媒介的细胞毒性作用，部分是经由Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径，从而减少GBM-R细胞增殖。
1.2.4BMX藉由在GBM-R细胞中促进TMZ媒介的细胞凋亡而增强TMZ媒介的细胞毒性作用
为了研究BMX是否可诱导细胞周期停滞，分析了BMX(5μM及10μM)单独及与50μMTMZ组合对A172-R及U87MG-R细胞株的细胞周期的作用。结果显示，10μM BMX单独诱导A172-R细胞(70.34％)及U87MG-R细胞(77.95％)中G0/G1阶段的细胞周期停滞。接着，5及10μMBMX与50μM TMZ不仅增加G0/G1细胞周期停滞的量，且也在两种GBM-R细胞株中导致亚G1阶段停滞(细胞凋亡)(图4A-C)。
流式细胞术显示，BMX与TMZ的组合在A172-R/U87MG-R细胞株中以剂量相依方式产生高百分比的细胞凋亡细胞(21.7％/25.95％)(图4D)。另外，在以10μM BMX及50μM TMZ治疗后，晚期细胞凋亡也占主导地位(图4E)。因此，BMX单独仅能诱导细胞周期停滞及抑制细胞增殖，但不能诱导细胞凋亡，而BMX及TMZ的组合在GBM-R细胞中也可促进TMZ媒介的细胞凋亡，从而导致细胞毒性增强。
1.2.5BMX在GBM-R细胞中藉由WT-p53媒介的MGMT抑制而增强TMZ媒介的细胞毒性作用
因为BMX及TMZ的组合可促进TMZ媒介的细胞凋亡，因此吾人推测BMX可能藉由WT-p53媒介的MGMT抑制而增强TMZ媒介的细胞凋亡。首先，吾人检验A172/A172-R及U87MG/U87MG-R细胞中的WT-p53及MGMT浓度，证实TMZ抗性与WT-p53及MGMT相关(图5A)。生物信息学分析也表明，仅有33％的患者具有p53突变，其他为p53 WT(表2)。接着，评估TCGA及driverDB数据库以检查p53突变和p53 WT的间的总体存活率。藉由群落形成试验(图11)，清楚地显示，与突变病例相比，p53 WT病例在GBM患者中示出较差的预后。
吾人检验WT-p53媒介的细胞凋亡中的促细胞凋亡讯号系统。也检验MGMT的TMZ修复能力。结果显示，在不存在及存在50μM TMZ下，以BMX治疗后，促凋亡标记(诸如P21、Bax/Bcl2及Puma)的浓度增加，而MGMT的浓度降低。然而，仅在10μM BMX及50μM TMZ的组合下才注意到裂解的凋亡蛋白酶-3(图5B)。为了阐明WT-p53媒介的MGMT抑制中细胞凋亡是否由BMX单独、TMZ单独或其组合诱导，在存在或不存在5及10μM BMX下，以50μM TMZ治疗A172-R及U87MG-R细胞。发现TMZ单独仅能适度抑制MGMT表现而不增加WT-p53及DNA损伤标记(WT-p53-ser15)。然而，MGMT表现明显随着10μM BMX及50μM TMZ的组合而降低。另外，WT-p53及DNA损伤标记(WT-p53-ser15)的表现浓度也增加，这意味着MGMT受到WT-p53媒介的细胞凋亡的负调控(图5C)。
另外，藉由评估p53 WT及突变细胞的散布图(图8B)，发现GBM p53 WT细胞是MGMT超甲基化的，且降低MGMT mRNA及蛋白表现。另外，TMZ单独不能在GBM-R细胞中诱导WT-p53媒介的细胞凋亡。然而，这些数据表明BMX及TMZ的组合可藉由WT-p53媒介的GBM-R细胞中的MGMT抑制来增强TMZ媒介的细胞毒性作用。BMX单独可适度降低MGMT浓度，但不诱导GBM-R细胞中WT-p53媒介的细胞凋亡。
表2：CCLE p53基因特征
1.2.6BMX及TMZ的组合减少GBM-R细胞中GSC的形成。
由于GSC标记为GBM抗性的核心，因此吾人检验GSC标记在所有细胞株中的浓度；在A172-R及U87MG-R细胞中检测到CD133、CD44及SOX2的高度表现浓度，这暗示TMZ抗性与GSC标记部分相关(图6A)。另外，以10μM BMX及50μM TMZ治疗明显降低两种GBM-R细胞株中CD133、CD44及SOX2的表现浓度(图6B)。因此，BMX及TMZ的组合可藉由减弱GSC标记以转换GBM-R细胞中的干性表现型来增强TMZ媒介的细胞毒性作用。
吾人也藉由免疫组织化学检验TMZ抗性GBM人类组织中的HDAC8及GSC标记(图6C)。结果显示，HDAC8及GSC与GBM中的TMZ抗性密切相关。
1.3.结论
尽管临床前研究已表明HDAC在神经胶质瘤中具有抗肿瘤作用，但先前的研究均未提及或预期化学疗法抗性GBM的治疗。在本发明中首次发现，BMX(一种新颖的等选择性HDAC8抑制剂)不仅可藉由负调控β-连环蛋白/c-Myc/SOX2路径抑制干性，且也可藉由正调控WT-p53媒介的MGMT抑制以诱导TMZ抗性的GBM细胞凋亡，从而增强TMZ媒介的细胞毒性作用。另外，也揭示WT-p53/MGMT回复与Wnt/β-连环蛋白/GSKβ讯号传递路径的负相关，可能涉及GBM及具有TMZ抗性的GBM的致癌作用。
基于上述结果，提出以下工作模型(请参见图7)：
首先，在TMZ抗性GBM中的β-连环蛋白/c-Myc/周期蛋白D1/SOX2讯号传递路径(右侧路径)。根据吾人先前研究及本研究中的生物信息学分析，Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径可影响GBM的治疗选择[17]。在本发明中证明，在不存在及存在TMZ(细线及粗线)下，BMX都可藉由负调控Ser9磷酸化来增强GSK3β活性，其反过来增强在Ser33/Ser37/Thr41处的β-连环蛋白磷酸化，从而触发β-连环蛋白降解。以MG132作为蛋白酶体抑制剂证实β-连环蛋白降解。未降解的β-连环蛋白易位进入细胞核而与TCL4结合并活化下光标靶基因，诸如c-Myc及周期蛋白D1，从而诱导细胞增殖并延续细胞周期。BMX单独(细线)及具有TMZ的BMX(粗线)均抑制c-Myc及周期蛋白D1表现，并诱导细胞周期停滞。然而，BMX单独不能诱导亚G1阶段的细胞周期停滞。仅有BMX及TMZ的组合可诱导深度的细胞周期停滞并进入亚G1阶段，这意味着其诱导GBM-R细胞中的晚期细胞凋亡(图7右下部分中的虚线)。
另外，GSC在GBM的治疗抗性中扮演重要的角色。其特征为藉由神经元干细胞标记(诸如CD133及CD44)以及转录因子(诸如SOX2)的高度表现，而在活体外及活体内具有自我更新能力[23]。本发明揭示，在不存在及存在TMZ下，BMX藉由负调控GSC表现型以抑制干性，不仅减弱CD133及CD44，且也减弱SOX2。如先前所报导的，c-Myc也是维持神经胶质瘤CSC所必需的[24]。可得出以下结论：BMX单独及具有TMZ的BMX藉由在GBM-R细胞中经由β-连环蛋白/c-Myc/周期蛋白D1/SOX2讯号传递路径增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而抑制细胞增殖。
另外，WT-p53在TMZ抗性GBM中媒介MGMT抑制(图7左侧的路径)。GBM中TMZ的作用机转为使O6位甲基化为鸟嘌呤以使DNA损伤。MGMT反转甲基化以修复GBM细胞中的DNA并发挥GBM抗性。虽然MGMT非相依性路径在TMZ抗性中也扮演关键角色[25-27]，但MGMT相依性路径仍被认为是TMZ抗性的主要路径。在本发明中，GBM-R细胞株(A172-R及U87MG-R)表现高浓度的MGMT蛋白，因此验证MGMT相依性路径确实是这些细胞株中TMZ抗性的主要机转。可推测BMX抑制MGMT在MGMT相依性GBM-R细胞株中的表现，从而减弱MGMT修复DNA损伤的能力。在GBM-R细胞株中，BMX单独适度降低MGMT表现，而TMZ单独没有(图5B及图5C)，但其组合明显降低MGMT蛋白浓度，并以MGMT相依性方式增强TMZ媒介的细胞凋亡。
如图7所示，该模型包括两个主要的讯号传递路径。右侧路径：β-连环蛋白/c-Myc/周期蛋白D1/SOX2讯号传递路径。当GBM-R细胞株以BMX单独(细线)或以具有TMZ的BMX(粗线)治疗时，GSK3β(S9)及活性β-连环蛋白减少。以下c-Myc及周期蛋白D1也减少以诱导细胞周期停滞及减弱干性活性，然而仅有具有TMZ的BMX(虚线)可能诱导细胞凋亡。左侧路径：WT-p53媒介MGMT抑制。当以BMX单独或以具有TMZ的BMX治疗GBM-R细胞株时，WT-p53在BMX单独(细线)及具有TMZ的BMX(粗线)中均增加及负调控MGMT浓度、细胞周期停滞及干性。然而，WT-p53及DNA损伤标记(WT-p53-ser15，未示出)仅在具有TMZ的BMX(粗线)中增加细胞周期停滞标记(P21)及促细胞凋亡标记(BAX/Bcl2及Puma)的活化以诱导细胞凋亡及细胞死亡，这表明为深度的DNA损伤。红色表明为正调控。绿色表明为负调控。
在实施例中发现，BMX经由WT-p53恢复提供增强抑制HDAC的作用以减少MGMT(图5A-C中所有的P53泳道)。在本发明中证明BMX单独(左侧细线)适度增加WT-p53浓度到适度负调控MGMT表现，这导致仍然维持DNA修复的能力(图5B)。也推测HDAC抑制可能藉由WT-p53再活化而降低MGMT表现。已证明BMX单独适度增加WT-p53浓度并适度负调控MGMT表现，这导致得以维持DNA修复。另外，BMX单独也可诱导细胞周期停滞标记(P21)。在本发明中，BMX及TMZ(左侧粗线)的组合藉由WT-p53(及ser15)过度表现及负调控MGMT表现来诱导广泛的DNA损伤，这最终导致WT-p53媒介的细胞凋亡(图5C)。这种组合(与BMX单独相比)也可增加细胞周期停滞标记(P21)、促细胞凋亡蛋白(Bax/Bcl2及Puma)的表现，并诱导WT-p53媒介的细胞凋亡的裂解的细胞凋亡蛋白酶-3表现。总的，这些结果暗示BMX单独(图7左侧的细线)仅部分诱导WT-p53媒介的MGMT抑制，但BMX及TMZ的组合(图7左侧的粗线)增强GBM-R细胞株中的TMZ细胞毒性作用，从而克服TMZ抗性。
总的，本发明出乎意料地发现，BMX藉由负调控β-连环蛋白/c-Myc/SOX2讯号传递路径及正调控WT-p53媒介的MGMT抑制来增强TMZ媒介的细胞毒性作用，从而克服TMZ抗性。这些发现表明，BMX及TMZ的组合有望用于精确个人治疗TMZ抗性WT-p53 GBM细胞。
实施例2
2.1.材料及方法
2.1.1细胞株及细胞培养物
在此研究中使用三种CRC细胞株：HT29、HCT116及RKO。美国典型培养物保存中心(ATCC；Manassas，VA，美国)提供人类CRC细胞株HT29(ATCC HTB-38；突变TP53，p.R273H；APC框移突变，p.E1554fs；野生型β-连环蛋白)，HCT116(ATCC CCL-247；野生型TP53；野生型APC；缺失β-连环蛋白，p.S45del)、以及RKO(ATCC CRL-2577；野生型TP53；野生型APC；野生型β-连环蛋白)。在贴壁培养条件下培养如上所列的三种CRC细胞株，并在含有5％ CO2的细胞培养箱中维持在37℃。HCT-116及HT-29细胞的两种细胞株在补充有10％胎牛血清(Gibco；Thermo Fischer Scientific，Grand Island，NY，美国)、1％青霉素及1％链霉素的McCoy 5A培养基中培养。在补充有10％ FBS、1％青霉素、1％链霉素及1％丙酮酸钠的MEM培养基中培养RKO细胞。每三天藉由胰蛋白酶消化对细胞培养物进行传代。BM-BMX(BMX)：(E)-2-(4-甲氧基苄氧基)-3-异戊二烯基-4-甲氧基-N-羟基酰胺，由Nature Wise Biotech&Medicals Corporation(中国台湾)所提供。
2.1.2细胞增殖试验
吾人在96孔盘中，以每孔接种4000个CRC细胞，并使其附着隔夜。为了验证细胞株对BMX及TMZ单一疗法的反应性，以不同剂量的BMX或TMZ治疗细胞24、48及72小时。为了证实细胞对BMX-TMZ组合的反应性，在存在或不存在BMX(5μM)下以不同剂量的TMZ(0-1000μg/mL)治疗细胞24、48及72小时，或在存在或不存在TMZ(50μM)下以不同剂量的BMX(0-10μg/mL)治疗细胞24、48及72小时。治疗后，在指定时间点使用CCK8试剂盒(Targetmol，Shanghai，中国)测量吸收值。结果报导为至少三次重复的平均值±标准偏差。
2.1.3DNA细胞周期的流式细胞术分析
在存在或不存在TMZ(50μM)下，以不同剂量的BMX(0-10μM)治疗细胞48小时。未经治疗的细胞用作阴性对照组。所有样品在至少三次独立实验中以一式三份运转。进行碘化丙啶(PI)的流式细胞术分析。对于DNA细胞周期，使细胞胰蛋白酶消化、离心、以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，并在甲醇中固定。接着再次洗涤细胞，并与PI工作溶液(10μg/mL PI及20mg/mL RNase A)在37℃下在黑暗中一同培养15分钟。使用流式细胞术(Attune NxT流式细胞术，Thermo Fisher Scientific)计算10,000个单个细胞核的PI荧光。使用Attune NxT流式细胞术软件分析G0/G1、S、G2/M及亚G0/G1阶段的细胞级分，并对每个直方图判定平均峰值荧光强度。
2.1.4细胞凋亡的流式细胞术分析
在TMZ存在或不存在(50μM)下，根据制造商的使用说明[16]，藉由使用488A膜联蛋白V及PI细胞凋亡试剂盒(Fremont，CA，美国)检测磷脂酰丝胺酸的膜外化，从而试验不同剂量BMX(0-10μM)中的细胞凋亡诱导。接着立即藉由流式细胞术分析所有样品。
2.1.5定量实时RT-PCR
根据制造商的使用说明，使用组织总RNA微型试剂盒(Geneaid，中国台湾)从细胞(2×105)中提取RNA。使用分光亮度计(Thermo Scientific，Waltham，MA，美国)在260-280nm处检查RNA浓度及纯度。接着，也遵循制造商的使用说明，使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)进行cDNA合成。根据制造商的建议，使用Power SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)中进行qPCR反应，以18秒作为内部参考。使用StepOnePlus(Applied Biosystems)软件计算循环阈值(Ct)。使用2-(ΔCt)方法计算每种mRNA的相对表现。HDAC8的引子序列如下：
HDAC8前置5’-GCGTGATTTCCAGCACATAA-3’(SEQ ID NO:1)；
HDAC8反置5’-ATACTTGACCGGGGTCATCC-3’(SEQ ID NO:2)。
18s前置5’-TCAAGTGCAGTGCAACAACTC-3’(SEQ ID NO:3)；
18s反置5’-AGAGGACAGGGTGGAGTAATCA-3’(SEQ ID NO:4)。
2.1.6群落形成试验
对于贴壁相依性生长试验，使1000个细胞重新悬浮在培养基中并接种在6孔盘中。在存在或不存在TMZ(50μM)下，每2-3天更换仅以各种浓度BMX(0-10μM)加入的培养基。14天后，除去培养基，且细胞经洗涤、以4％三聚甲醛固定30分钟，并以0.1％结晶紫在25℃下染色20分钟。以二甲基亚砜(DMSO)溶解经染色的细胞后，藉由570nm的吸亮度来定量结晶紫的强度。结果表示为三次独立实验的平均群落±标准误差。
2.1.7衰老相关(SA)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)分析
使用衰老检测试剂盒(CS0030-1KT；Sigma-Aldrich；Merck Millipore，Darmstadt，德国)进行β-gal活性的SA表现。简而言的，在存在或不存在TMZ(50μM)下，以不同剂量的BMX(0-10μM)治疗细胞48小时，以PBS洗涤并在室温下使用固定液固定半小时，接着在37℃下与SA-β-gal染色溶液一同培养隔夜。藉由在pH 6.0下X-gal(5-溴-4-氯-3-3吲哚基β-D-半乳糖苷)染色来检验SA-β-gal活性。对以蓝色染色的衰老细胞进行拍照。藉由光学显微镜分析随机选择的视野(n＝3)以定量衰老细胞的百分比。
2.1.8西方墨点法分析
在存在或不存在TMZ(50μM)或OXP(5μM)下，使用西方墨点法分析检验不同浓度BMX(0-10μM)及SAHA、VPA或PCI-34051下的测试细胞株中的指定蛋白表现浓度。对如先前所述制备的裂解物进行SDS-PAGE及西方墨点法分析[16]。使用针对以下的特异性一级抗体进行检测：乙酰-组织蛋白H3(Lys9/Lys14)、乙酰-组织蛋白H4(Lys8)、P53、乙酰-p53(Lys382)、磷酸-p53(Ser15)、P21、P16、MGMT、磷-H2AX(S139)、E2F1、E2F3、裂解的凋亡蛋白酶-3、裂解的凋亡蛋白酶-8、裂解的凋亡蛋白酶-7、裂解的凋亡蛋白酶-9、PARP、Bax、Bcl-2、Bid、Bim、Bak、Puma、β-连环蛋白、磷酸-β-连环蛋白(Ser/33/37/41)、GSK3β、磷酸-GSK3β(Ser9)、c-Myc、周期蛋白D1、P62、LC3B、CD133、CD44、SOX-2及HDAC8；并使用GAPDH、α-微管蛋白或β-肌动蛋白作为内部对照组。在与一级抗体一同培养并再与辣根过氧化物酶(HRP)共轭的二级抗体的二级抗体一同培养后，以化学HRP受质检测HRP讯号。吾人使用的抗体列于表4。藉由与增强的化学发光试剂一同培养并暴露到X射线胶片，观察每种标靶蛋白的讯号。
表4：关键资源
/>
/>
/>
2.1.9统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。使用单因子变异数分析来进行统计分析。使用学生t检定来比较数据。统计显著性程度设定为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2.2.结果
2.2.1使在三个CRC细胞株中BMX及TMZ的组合优化
为了研究BMX或TMZ对CRC细胞生长的影响，使用三种人类大肠直肠癌细胞株：HT29(p53突变)、HCT116(p53野生型)及RKO(p53野生型)。其分别以BMX(0.313、0.625、1.25、2.5、5及10μM)或TMZ(25、50、100、200、400、800及1000μM)治疗24、48及72小时。结果示出，CRC细胞存活力以剂量相依性方式受到显著抑制。得到HT-29、HCT-116及RKO细胞中BMX单独或TMZ单独的半最大抑制浓度(IC50)值(表5)。对于代表体内致瘤性的成株试验，TMZ在HT29、HCT116及RKO细胞的成株试验中有效对抗肿瘤球的形成，TMZ的IC50值分别为359.45±50.43、137.66±22.73及244.01±29.42μM。结果示出，在3个培养时间下，BMX及TMZ对三种大肠直肠癌细胞(包括HT-29、HCT-116及RKO)的基本细胞增殖抑制率。
表5：BMX及TMZ的组合抑制CRC细胞中的细胞增殖
为了评估BMX是否提高TMZ的化学敏感性，使BMX及TMZ一同施用于HT-29、HCT-116及RKO细胞。BMX(5μM)及TMZ(25、50、100、200及400μM)的组合表现出比BMX单独及TMZ单独对细胞生长更大的抑制作用。BMX(5μM)及TMZ(25、50、100、200及400μM)的组合表现出比BMX单独及TMZ单独对细胞生长更大的抑制作用。随后，选择与不同浓度的BMX(0.313、0.625、1.25、2.5、5及10μM)组合的TMZ 50μM，来验证TMZ及BMX是以时间相依性方式抑制细胞增殖。值得注意的是，BMX降低在HT-29、HCT-116及RKO细胞中TMZ的IC50(表5)。这些发现表明，BMX抑制CRC细胞增殖并提高TMZ的化学敏感性。50μM TMZ加上5μM BMX在HT-29、HCT-116及RKO细胞中发挥最高的细胞毒性作用。吾人以时间相依性方式使用这种组合，并注意到在48小时内的细胞毒性作用。这一发现表明，BMX提高TMZ的化学敏感性。BMX与TMZ的组合以时间相依性方式抑制细胞增殖。因此，所有后续实验均是使用TMZ 50μM与不同浓度的BMX(2.5、5及10μM)组合48小时所进行。
吾人接着检验BMX单独或BMX与TMZ的组合存在下的群落形成。吾人发现，当BMX与50μM TMZ组合时，这种抑制作用以规则连续的方式增加。若增加到TMZ(150μM)，BMX可降低到1-2μM而非5-10μM。总的，这些结果表明BMX及TMZ的组合使用可增效抑制CRC癌细胞的增殖及群落形成。因此，所有后续实验均是使用TMZ 50μM与不同浓度的BMX(2.5、5及10μM)组合48小时所进行。
2.2.2BMX及TMZ的组合与常规药物对CRC的作用
细胞周期停滞为一种抑制细胞增殖的主要原因。为了评估BMX或组合治疗抑制细胞生长的可能机转，使用流式细胞术试验细胞周期图形。如图13所示，组合治疗显著诱导G2/M阶段停滞，且在HT29及HCT116细胞中对G2/M阶段停滞的作用比任何其他单一药物强得多。2.5、5及10μM BMX与50μM TMZ不仅增加G0/G1细胞周期停滞的量，且也在RKO细胞株中导致亚G1阶段停滞(细胞凋亡)。
藉由在三个CRC细胞中的膜联蛋白V组合来测量在48小时治疗后具有TMZ的BMX的增效作用。与每种试剂单独相比，以BMX及TMZ治疗诱导凋亡细胞百分比的显著增加。BMX在HT29、HCT116及RKO细胞中使早期细胞凋亡细胞增加到23.78％、49.34％及59.18％，对晚期细胞凋亡细胞的增加也是如此。而组合治疗中，在培养48小时后，晚期细胞凋亡的族群在HT29、HCT116及RKO细胞中从1.08％增加到10.36％、3.67％增加到19.37％、以及0.32％增加到16.48％。
2.2.3BMX以及BMX及TMZ的组合诱导的细胞凋亡是由p53媒介的MGMT抑制所媒介
据报导，p53路径涉及由化学治疗药物诱导的各种癌细胞的细胞凋亡[28]。已表明BMX可活化p53、导致细胞死亡，并由β-连环蛋白路径所媒介[16]。为了阐明BMX及TMZ的抗癌作用是否由DNA损伤所引起，吾人在具有不同p53表现型的三种CRC细胞株中DNA损伤及相应的p53路径标记。考虑到标记包括p53、乙酰-p53(Lyx382)、p53(Ser15)、p21、p16、MGMT、γ-H2AX、E2F1、E2F3、GAPDH在HT29、HCT116及RKO细胞中的基本蛋白表现情况，BMX单独不仅增强p53表现，且也可能调控其他干扰细胞生长的重要基因。以BMX单独或BMX与TMZ的组合治疗剂量相依性地增加HT29、HCT116及RKO细胞中p53磷酸化(Ser15)及γ-H2AX磷酸化(Ser139)的浓度。在HT29、HCT116及RKO细胞中，p53在Lys382的乙酰化以时间相依性方式增加，p53下游靶p21及p16的表现增强。如p53野生型及突变细胞的西方墨点法结果所示，CRCp53野生型细胞是MGMT超甲基化的，且也降低MGMT蛋白表现。另外，BMX与TMZ的组合显著降低E2F3表现(图14A)。有趣的是，BMX或具有TMZ的BMX也增加组织蛋白H3的乙酰化。这表明BMX会影响细胞中组织蛋白乙酰转移酶及/或HDAC的活性，从而导致蛋白(包括p53)的乙酰化。BMX与TMZ的组合可藉由增强p53表现及活化p53功能媒介的MGMT抑制来增加P21、P16表现及γ-H2AX磷酸化(图14A)。
促细胞凋亡(压力或死亡)讯号和抗细胞凋亡分子(包括Bcl-2及Bid、Bax或poma)的间的平衡为主要原因，其藉由凋亡蛋白酶相依性路径引起细胞凋亡反应[29]。图14B中显示的凋亡蛋白酶的裂解表明，凋亡蛋白酶-7、凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-9及凋亡蛋白酶-3活性在较低浓度下BMX没有显著变化，而在HT29细胞中BMX与TMZ组合时，上述凋亡蛋白酶以剂量相依性方式高度正调控，最终导致PARP裂解及细胞凋亡。发现在BMX 10μM治疗后，在HCT116及RKO细胞株中裂解的凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶9及凋亡蛋白酶PARP的细胞凋亡蛋白表现浓度，以浓度相依性方式显著增加。另外，吾人检验p53野生型细胞媒介的细胞凋亡中的促细胞凋亡讯号系统。结果显示，BMX治疗降低抗细胞凋亡蛋白Bcl-2的浓度，并增加促细胞凋亡蛋白Bax、Bim及Puma。然而，BMX治疗并未导致促细胞凋亡Bcl-2家族蛋白Bak及Bid的正调控。另外，BMX及TMZ的增效作用优于BMX单独(图14C)。TMZ加BMX的组合比每种单独治疗产生更多的衰老细胞，尤其是在p53野生型细胞，诸如HCT116及RKO中(图15)。由于CD133、CD44及SOX2与CSC的抗药性高度相关，并用作CSC(包括CRC)的表现型标记，因此以BMX及TMZ治疗会以剂量相依性方式明显降低在HT29、HCT116及RKO中CD133、CD44及SOX2的表现浓度(图16)。因此，BMX及TMZ的组合可藉由减弱cSC标记以转换CRC细胞中的干性表现型来增强TMZ媒介的细胞毒性作用。因此，上述结果表明，在CRC细胞中藉由BMX及TMZ的组合治疗活化凋亡蛋白酶相依性讯号传递路径，从而诱导细胞凋亡。
2.4BMX藉由靶向CRC细胞中的Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径而增强TMZ媒介的细胞毒性作用
接着，在三种CRC细胞中研究BMX增强TMZ媒介的对Wnt/β-连环蛋白活性的细胞毒性作用的机转。如图3A所示，在三种CRC细胞中藉由BMX治疗，β-连环蛋白、磷酸-β-连环蛋白(Ser33/Ser37/Thr41)及磷酸-GSK-3β(Ser9)蛋白表现浓度增加，而磷酸-β-连环蛋白(Ser33/Ser37/Thr41)及磷酸化GSK-3β(Ser9)浓度降低。在三种细胞株中，以5μM BMX及TMZ的组合治疗可直接降低β-连环蛋白的蛋白浓度，并藉由GSK3β的磷酸化降低磷酸β-连环蛋白(S33/S37/T41)的蛋白浓度。另外，吾人进一步检验BMX对增殖标记c-Myc及周期蛋白D1的作用，并注意到BMX在存在及不存在TMZ下都可降低增殖标记c-Myc及周期蛋白D1(图17A)。这些结果表明，以5μM BMX及TMZ的组合治疗藉由Ser9磷酸化负调控而增强GSK3β活性，其反过来增强β-连环蛋白在Ser33/Ser37/Thr41处的磷酸化，从而引发蛋白降解(图17B)。另外，在5μM BMX及50μM TMZ下，MG132应用可反转β-连环蛋白降解并增加MGMT表现(图17C)。总的，这些数据显示，BMX及TMZ增强TMZ媒介的细胞毒性作用，部分是经由Wnt/β-连环蛋白/GSK3β路径，从而减少CRC细胞增殖。
2.5自噬作为BMX、BMX及TMZ的组合诱导的细胞死亡中的关键调控因子
脂质化LC3及自噬受质p62经常用作评估自噬小体及自噬的标记[17]。以BMX治疗或以BMX及TMZ的组合治疗也使P62及LC3-II的表现浓度相依性增加，这是LC3的加工形式(图18A)。β-连环蛋白负调控P62表现[17、30]。为了验证P62降低的蛋白浓度是由β-连环蛋白降解所引起，使蛋白酶体抑制剂MG132应用到经BMX或经BMX及TMZ的组合治疗的细胞。如所预期的，当应用MG132时，BMX诱导的β连环蛋白降解受到反转，且P62表现也受到抑制(图18B)。由于组合治疗下β-连环蛋白降解，因此P62不再受到抑制，接着触发下游自噬路径(图18B)。为了判定自噬在BMX或BMX及TMZ的组合诱导的细胞死亡中的作用，吾人使用BAF(一种抑制自噬晚期的蛋白生物合成抑制剂)以及Z-VAD-FMK(苄氧羰基-缬胺酰基-丙胺酰基-天冬胺酰基-[O-甲基]-氟甲基酮，一种受抑制的细胞渗透泛凋亡蛋白酶)，在加入BMX或BMX及TMZ的组合的前治疗细胞，且吾人发现Z-VAD-FMK在三种细胞株中抑制由BMX加TMZ治疗诱导的早期细胞凋亡。另外，以BAF A1预治疗减少经由流式细胞术获得的BMX或BMX及TMZ的组合诱导的细胞死亡，这与由BMX或BMX与TMZ的组合诱导的裂解的凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-7、凋亡蛋白酶-8及凋亡蛋白酶-9表现减少的结果一致。已鉴定不同的自噬/细胞凋亡相关蛋白与相应的讯号传递路径的间的相互作用，这暗示着两种路径的间存在串扰。为了测试细胞凋亡在6c诱导的自噬中的作用，吾人在加入BMX或BMX及TMZ的组合的前以BAF或Z-VAD-FMK治疗细胞。如图18D所示，尽管Z-VAD-FMK及BAF显示早期细胞凋亡抑制，但BAF抑制BMX及TMZ的组合诱导的凋亡蛋白酶-3的活化，而不干扰所有细胞中的LC3I/II。然而，Z-VAD-FMK在p53突变细胞株中抑制BMX及TMZ的组合诱导的凋亡蛋白酶-3活化，并干扰LC3I/II。总的，这些结果强调在细胞死亡期间刺激自噬的重要性。
2.3.结论
使用传统放射-化学疗法的CRC治疗有时是无效率的，部分原因是CRC患者对这种治疗方案没有反应及/或遭受严重的药物毒性。本发明证明，BMX及TMZ的组合在HCC细胞中，尤其是在HCT116及RKO中，表现出特异性及有效、增效的抗增殖及细胞凋亡作用。总的，BMX及TMZ提供最佳的增效效用，且其机转为目前最重要的环节。
也得出以下结论：BMX是一种特异性HDAC8i，其与替莫唑胺(TMZ)组合可抑制细胞增殖、诱导细胞周期停滞、细胞衰老、自噬及凋亡，从而导致细胞死亡。也发现BMX及TMZ的组合藉由凋亡蛋白酶-3裂解及PARP活化诱导增效的凋亡性细胞死亡。本发明证实，BMX及TMZ的组合诱导磷酸-p53(ser15)的增加以及DNA损伤，诸如增加的γ-H2AX病灶。磷酸-p53(ser15)表现的增加可能是由于总p53表现的增加，这在吾人先前的研究中有所报导[16、17]。另外，吾人的研究显示，BMX可能与TMZ一同对CRC细胞的存活力具有HDAC相依性增效作用。
鉴于上述，在人类GBM组织及GBM-R细胞株中的高HDAC8表现与MGMT浓度相关。BMX及TMZ的组合藉由WT-p53媒介的MGMT抑制作用在GBM-R细胞株中诱导WT-p53媒介的细胞凋亡。另外，BMX及TMZ的组合也经由GBM-R细胞株中的β-连环蛋白/c-Myc/周期蛋白D1/SOX2讯号传递路径来抑制细胞增殖及GSC表现型活性。因此，BMX可能是一种精准个人治疗WT-p53及TMZ抗性GBM患者的有望策略。
总的来说，作为增效机转的指示，在本发明中证明BMX及TMZ的组合藉由正调控p53/p21/E2F3/Bax及负调控Wnt/β-连环蛋白/周期蛋白D1/c-Myc/p62路径而有效诱导CRC的细胞死亡。因此，发现BMX及TMX的组合对细胞死亡提供潜在的作用，包括诱导细胞凋亡及自噬。实施例中的结果表明BMX及TMZ的组合的潜在作用，帮助吾人了解其对CRC细胞死亡的HDAC8相依性增效作用。这些发现表明一种对组合化学治疗方案产生抗性的高度临床相关的新颖机转。
虽然本说明书含有许多细节，但其不应被解释为对本发明的范围或可能要求保护的范围的限制，而应被解释为对本发明的具体实施例或实施例所特有的特征的描述。在本说明书中，在单独的具体实施例或实施例的上下文中所描述的某些特征也可在单一具体实施例中组合实施。
参考文献
1.Louis,D.N.；Perry,A.；Reifenberger,G.；von Deimling,A.；Figarella-Branger,D.；Cavenee,W.K.；Ohgaki,H.；Wiestler,O.D.；Kleihues,P.；Ellison,D.W.The2016World Health Organization Classification of Tumors of the Central NervousSystem:a summary.Acta Neuropathol 2016,131,803-820,doi:10.1007/s00401-016-1545-1.
2.Park,J.K.；Hodges,T.；Arko,L.；Shen,M.；Iacono,D.D.；McNabb,A.；Bailey,N.O.；Kreisl,T.N.；Iwamoto,F.M.；Sul,J.,et al.Scale to Predict Survival AfterSurgery for Recurrent Glioblastoma Multiforme.Journal of Clinical Oncology2010,28,3838-3843,doi:10.1200/jco.2010.30.0582.
3.Stupp,R.；Mason,W.P.；van den Bent,M.J.；Weller,M.；Fisher,B.；Taphoorn,M.J.；Belanger,K.；Brandes,A.A.；Marosi,C.；Bogdahn,U.,et al.Radiotherapy plusconcomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.N Engl J Med 2005,352,987-996,doi:10.1056/NEJMoa043330.
4.Stupp,R.；Hegi,M.E.；Mason,W.P.；van den Bent,M.J.；Taphoorn,M.J.；Janzer,R.C.；Ludwin,S.K.；Allgeier,A.；Fisher,B.；Belanger,K.,et al.Effects ofradiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapyalone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study:5-yearanalysis of the EORTC-NCIC trial.Lancet Oncol 2009,10,459-466,doi:10.1016/s1470-2045(09)70025-7.
5.Siegel,R.L.,Miller,K.D.,and Jemal,A.(2015)Cancer statistics,2015.CACancer J Clin 65,5-29
6.Vecchione,L.,Gambino,V.,Raaijmakers,J.,Schlicker,A.,Fumagalli,A.,Russo,M.,Villanueva,A.,Beerling,E.,Bartolini,A.,Mollevi,D.G.,El-Murr,N.,Chiron,M.,Calvet,L.,Nicolazzi,C.,Combeau,C.,Henry,C.,Simon,I.M.,Tian,S.,in'tVeld,S.,D'Ario,G.,Mainardi,S.,Beijersbergen,R.L.,Lieftink,C.,Linn,S.,Rumpf-Kienzl,C.,Delorenzi,M.,Wessels,L.,Salazar,R.,Di Nicolantonio,F.,Bardelli,A.,van Rheenen,J.,Medema,R.H.,Tejpar,S.,and Bernards,R.(2016)A Vulnerability ofa Subset of Colon Cancers with Potential Clinical Utility.Cell 165,317-3307.Xie,Y.-H.,Chen,Y.-X.,and Fang,J.-Y.(2020)Comprehensive review oftargeted therapy for colorectal cancer.Signal Transduction and TargetedTherapy 5,22
8.Floudas,C.S.,Brar,G.,Mabry-Hrones,D.,Duffy,A.G.,Wood,B.,Levy,E.,Krishnasamy,V.,Fioravanti,S.,Bonilla,C.M.,Walker,M.,Morelli,M.P.,Kleiner,D.E.,Steinberg,S.M.,Figg,W.D.,Greten,T.F.,and Xie,C.(2019)A Pilot Study ofthe PD-1Targeting Agent AMP-224 Used With Low-Dose Cyclophosphamide andStereotactic Body Radiation Therapy in Patients With Metastatic ColorectalCancer.Clin Colorectal Cancer18,e349-e360.
9.Martino-Echarri,E.,Henderson,B.R.,and Brocardo,M.G.(2014)Targetingthe DNA replication checkpoint by pharmacologic inhibition of Chk1 kinase:astrategy to sensitize APC mutant colon cancer cells to 5-fluorouracilchemotherapy.Oncotarget 5,9889-9900.
10.Temozolomide[US Prescribing Information].Whitehouse Station,NJ；Merck&Co.,Inc.；2019Newlands ES,Stevens MFG,Wedge SR et.al,Temozolomide:areview of its discovery,chemical properties,pre-clinical development andclinical trials.Cancer Treat Rev.1997；23(1):35-61.
11.Tatar Z,Thivat E,Planchat E Temozolomide and unusual indications:review of literature.Cancer Treat Rev.2013；39(2):125-35.
12.Alonso,M.M.；Gomez-Manzano,C.；Bekele,B.N.；Yung,W.K.；Fueyo,J.Adenovirus-based strategies overcome temozolomide resistance by silencingthe O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter.Cancer Res 2007,67,11499-11504,doi:10.1158/0008-5472.Can-07-5312.
13.Le Rhun,E.；Preusser,M.；Roth,P.；Reardon,D.A.；van den Bent,M.；Wen,P.；Reifenberger,G.；Weller,M.Molecular targeted therapy of glioblastoma.CancerTreat Rev 2019,80,101896,doi:10.1016/j.ctrv.2019.101896.
14.Cabrini,G.；Fabbri,E.；Lo Nigro,C.；Dechecchi,M.C.；Gambari,R.Regulation of expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase and thetreatment of glioblastoma(Review).Int J Oncol 2015,47,417-428,doi:10.3892/ijo.2015.3026.
15.Wiewrodt,D.,Nagel,G.,Dreimüller,N.,Hundsberger,T.,Perneczky,A.,andKaina,B.(2008)MGMT in primary and recurrent human glioblastomas afterradiation and chemotherapy and comparison with p53 status and clinicaloutcome.Int J Cancer 122,1391-1399
16.Tsai,C.Y.,Ko,H.J.,Chiou,S.J.,Lai,Y.L.,Hou,C.C.,Javaria,T.,Huang,Z.Y.,Cheng,T.S.,Hsu,T.I.,Chuang,J.Y.,Kwan,A.L.,Chuang,T.H.,Huang,C.F.,Loh,J.K.,and Hong,Y.R.(2021)NBM-BMX,an HDAC8 Inhibitor,Overcomes TemozolomideResistance in Glioblastoma Multiforme by Downregulating the beta-Catenin/c-Myc/SOX2 Pathway and Upregulating p53-Mediated MGMT Inhibition.Int J Mol Sci22
17.Chu,C.W.,Ko,H.J.,Chou,C.H.,Cheng,T.S.,Cheng,H.W.,Liang,Y.H.,Lai,Y.L.,Lin,C.Y.,Wang,C.,Loh,J.K.,Cheng,J.T.,Chiou,S.J.,Su,C.L.,Huang,C.F.,andHong,Y.R.(2019)Thioridazine Enhances P62-Mediated Autophagy and ApoptosisThrough Wnt/β-Catenin Signaling Pathway in Glioma Cells.Int J Mol Sci 2019,20,doi:10.3390/ijms20030473.
18.Bocangel,D.；Sengupta,S.；Mitra,S.；Bhakat,K.K.p53-Mediated down-regulation of the human DNA repair gene O6-methylguanine-DNAmethyltransferase(MGMT)via interaction with Sp1 transcriptionfactor.Anticancer Res 2009,29,3741-3750.
19.Natsume,A.；Ishii,D.；Wakabayashi,T.；Tsuno,T.；Hatano,H.；Mizuno,M.；Yoshida,J.IFN-beta down-regulates the expression of DNA repair gene MGMT andsensitizes resistant glioma cells to temozolomide.Cancer Res 2005,65,7573-7579,doi:10.1158/0008-5472.Can-05-0036.
20.Yang,H.-Y.,Hsu,Y.-F.,Chiu,P.-T.,Ho,S.-J.,Wang,C.-H.,Chi,C.-C.,Huang,Y.-H.,Lee,C.-F.,Li,Y.-S.,Ou,G.,and Hsu,M.-J.(2013)Anti-cancer activityof an osthole derivative,NBM-T-BMX-OS01:targeting vascular endothelial growthfactor receptor signaling and angiogenesis.PloS one 8,e81592-e81592.
21.Chen,T.J.,Zhou,Y.F.,Ning,J.J.,Yang,T.,Ren,H.,Li,Y.,Zhang,S.,andChen,M.W.(2015)NBM-T-BMX-OS01,an Osthole Derivative,Sensitizes Human LungCancer A549 Cells to Cisplatin through AMPK-Dependent Inhibition of ERK andAkt Pathway.Cellular Physiology and Biochemistry 36,893-906.
22.Yang,Y.C.；Chen,C.N.；Wu,C.I.；Huang,W.J.；Kuo,T.Y.；Kuan,M.C.；Tsai,T.H.；Huang,J.S.；Huang,C.Y.NBM-T-L-BMX-OS01,Semisynthesized from Osthole,Is aNovel Inhibitor of Histone Deacetylase and Enhances Learning and Memory inRats.Evid Based Complement Alternat Med 2013,2013,514908,doi:10.1155/2013/514908.
23.Lathia,J.D.；Mack,S.C.；Mulkearns-Hubert,E.E.；Valentim,C.L.；Rich,J.N.Cancer stem cells in glioblastoma.Genes Dev 2015,29,1203-1217,doi:10.1101/gad.261982.115.24.Wang,J.；Wang,H.；Li,Z.；Wu,Q.；Lathia,J.D.；McLendon,R.E.；Hjelmeland,A.B.；Rich,J.N.c-Myc is required for maintenance of gliomacancer stem cells.PLoS One 2008,3,e3769,doi:10.1371/journal.pone.0003769.
25.Gaspar,N.；Marshall,L.；Perryman,L.；Bax,D.A.；Little,S.E.；Viana-Pereira,M.；Sharp,S.Y.；Vassal,G.；Pearson,A.D.；Reis,R.M.,et al.MGMT-independenttemozolomide resistance in pediatric glioblastoma cells associated with aPI3-kinase-mediated HOX/stem cell gene signature.Cancer Res 2010,70,9243-9252,doi:10.1158/0008-5472.Can-10-1250.
26.Yi,G.Z.；Huang,G.；Guo,M.；Zhang,X.；Wang,H.；Deng,S.；Li,Y.；Xiang,W.；Chen,Z.；Pan,J.,et al.Acquired temozolomide resistance in MGMT-deficientglioblastoma cells is associated with regulation of DNA repair by DHC2.Brain2019,142,2352-2366,doi:10.1093/brain/awz202.
27.Yang,W.B.；Chuang,J.Y.；Ko,C.Y.；Chang,W.C.；Hsu,T.I.Dehydroepiandrosterone Induces Temozolomide Resistance Through ModulatingPhosphorylation and Acetylation of Sp1 in Glioblastoma.Mol Neurobiol 2019,56,2301-2313,doi:10.1007/s12035-018-1221-7.
28.S.,Af/>T.M.,Sankila,A.,Rantanen,V.,Koistinen,H.,Stenman,U.H.,Zhang,Z.,Yang,Z.,De Marzo,A.M.,Taari,K.,Ruutu,M.,Andersson,L.C.,and Laiho,M.(2010)DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway innonproliferating human prostate tissue.Cancer Res 70,8630-8641.29.Bogenberger,J.M.,Kornblau,S.M.,Pierceall,W.E.,Lena,R.,Chow,D.,Shi,C.X.,Mantei,J.,Ahmann,G.,Gonzales,I.M.,Choudhary,A.,Valdez,R.,Camoriano,J.,Fauble,V.,Tiedemann,R.E.,Qiu,Y.H.,Coombes,K.R.,Cardone,M.,Braggio,E.,Yin,H.,Azorsa,D.O.,Mesa,R.A.,Stewart,A.K.,and Tibes,R.(2014)BCL-2 family proteins as5-Azacytidine-sensitizing targets and determinants of response in myeloidmalignancies.Leukemia 28,1657-1665.
30.Aberle,H.,Bauer,A.,Stappert,J.,Kispert,A.,and Kemler,R.(1997)beta-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway.Emboj 16,3797-3804。
Claims (15)
1.一种用于在一患者中治疗一TMZ抗性癌症的组合，其包含替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)及具有式A结构的化合物A，或其医药上可接受的盐、立体异构体、镜像异构体、前驱药或溶剂合物：
其中
R1为氢、烷基、烯基、C5-C6环烷基、5-员或6-员不饱和碳环或5-员或6-员杂环、或(CH2)mR4；
X为C、-O-、-N-或-S-；
Y为-O-、-NH或-O-C1-C4烷基；
n为0到10的整数；
m为0到5的整数；
R2及R3独立地为C1-C6烷基；
R4为C5-C6环烷基或可被卤素、-CF3、-OR7或-NR7R8取代的5-员或6-员不饱和碳环或杂环，其中R7及R8独立地为氢或C1-C6烷基；
R5为OH、NH2或C5-C6环烷基、5-员或6-员不饱和碳环或杂环，其中该环烷基、碳环及杂环可任选地被卤素、NH2、NO2、C1-C6烷氧基、C1-6烷硫基、OR7”、NR7R8或CF3取代；以及
R6为H、可被羟基取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基，或与R1一同为-C2H2-；以及
其中TMZ及该化合物A以一相对比率组合来有效克服TMZ抗性。
2.如权利要求1所述的组合，其中该化合物A为具有以下结构的化合物BMX：
3.如权利要求1或2所述的组合，其中藉由增强TMZ媒介的细胞毒性作用来克服该TMZ抗性。
4.如权利要求3所述的组合，其中该增强TMZ媒介的细胞毒性作用是藉由负调控β-连环蛋白/c-Myc/SOX2讯号传递路径及正调控WT-p53媒介的MGMT来抑制该抗性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合，其中TMZ及该化合物A分别或依序施用。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合，其中该组合包含TMZ及BMX。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合，其中该癌症为多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)或大肠直肠癌(CRC)。
8.一种用于在一患者中治疗一TMZ抗性癌症的方法，其包含对该患者施用如权利要求1-6中任一项所定义的组合。
9.如权利要求8所述的方法，其中该癌症为GBM或CRC。
10.一种用于在一患者中对一抗药性癌症进行精准个人治疗的方法，其包含决定在该患者中WT-p53的表达，以及若在该患者中存在WT-p53的表达，对该患者施用有效量的如权利要求1所定义的化合物A，或其与该药的组合。
11.如权利要求10所述的方法，其中该药为TMZ。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中该抗药性癌症为TMZ抗性GMB或CRC。
13.一种如权利要求1-6中任一项所定义的组合在制备用于一TMZ抗性癌症患者的药剂或试剂盒的用途。
14.如权利要求11所述的用途，其中该癌症为TMZ抗性GBM或CRC。
15.一种如权利要求1-6中任一项所定义的组合在制备用于一TMZ抗性、WT-p53的GBM患者或CRC患者的精准个人治疗药剂或试剂盒的用途。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163194585P | 2021-05-28 | 2021-05-28 | |
| US63/194,585 | 2021-05-28 | ||
| PCT/CN2022/095983 WO2022247954A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-05-30 | Composition and method for treating a drug-resistant cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117642159A true CN117642159A (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=84229523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280038525.7A Pending CN117642159A (zh) | 2021-05-28 | 2022-05-30 | 用于治疗抗药性癌症的组合物和方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11980594B2 (zh) |
| EP (1) | EP4351551A1 (zh) |
| JP (1) | JP2024521192A (zh) |
| KR (1) | KR20240016352A (zh) |
| CN (1) | CN117642159A (zh) |
| AU (1) | AU2022283415A1 (zh) |
| BR (1) | BR112023024812A2 (zh) |
| CA (1) | CA3221779A1 (zh) |
| TW (1) | TW202320744A (zh) |
| WO (1) | WO2022247954A1 (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7994357B2 (en) * | 2009-04-03 | 2011-08-09 | Naturewise Biotech & Medicals Corporation | Cinamic compounds and derivatives therefrom for the inhibition of histone deacetylase |
| US20150045367A1 (en) * | 2011-12-29 | 2015-02-12 | Pharmacyclics, Inc. | Cinnamic acid hydroxyamides as inhibitors of histone deacetylase 8 |
| US10087149B2 (en) * | 2013-01-24 | 2018-10-02 | Trustees Of Boston University | Selective histone deacetylase 8 inhibitors |
-
2022
- 2022-05-30 AU AU2022283415A patent/AU2022283415A1/en active Pending
- 2022-05-30 KR KR1020237045382A patent/KR20240016352A/ko active Search and Examination
- 2022-05-30 EP EP22810677.9A patent/EP4351551A1/en active Pending
- 2022-05-30 CN CN202280038525.7A patent/CN117642159A/zh active Pending
- 2022-05-30 WO PCT/CN2022/095983 patent/WO2022247954A1/en active Application Filing
- 2022-05-30 BR BR112023024812A patent/BR112023024812A2/pt unknown
- 2022-05-30 JP JP2023573405A patent/JP2024521192A/ja active Pending
- 2022-05-30 TW TW111120133A patent/TW202320744A/zh unknown
- 2022-05-30 CA CA3221779A patent/CA3221779A1/en active Pending
- 2022-05-31 US US17/828,983 patent/US11980594B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20240016352A (ko) | 2024-02-06 |
| US20230038230A1 (en) | 2023-02-09 |
| BR112023024812A2 (pt) | 2024-02-20 |
| AU2022283415A1 (en) | 2024-01-04 |
| JP2024521192A (ja) | 2024-05-28 |
| US11980594B2 (en) | 2024-05-14 |
| TW202320744A (zh) | 2023-06-01 |
| WO2022247954A1 (en) | 2022-12-01 |
| EP4351551A1 (en) | 2024-04-17 |
| CA3221779A1 (en) | 2022-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wei et al. | Long noncoding RNA HAGLROS promotes cell proliferation, inhibits apoptosis and enhances autophagy via regulating miR-5095/ATG12 axis in hepatocellular carcinoma cells | |
| Zhang et al. | Resveratrol chemosensitizes adriamycin‐resistant breast cancer cells by modulating miR‐122‐5p | |
| Entezari et al. | Long non-coding RNAs and exosomal lncRNAs: Potential functions in lung cancer progression, drug resistance and tumor microenvironment remodeling | |
| Jiang et al. | Overexpression of SMYD3 in ovarian cancer is associated with ovarian cancer proliferation and apoptosis via methylating H3K4 and H4K20 | |
| Zhang et al. | miRNA‐192‐5p impacts the sensitivity of breast cancer cells to doxorubicin via targeting peptidylprolyl isomerase A | |
| Jiang et al. | Celecoxib reverts oxaliplatin-induced neuropathic pain through inhibiting PI3K/Akt2 pathway in the mouse dorsal root ganglion | |
| Chen et al. | Glutamine deprivation plus BPTES alters etoposide-and cisplatin-induced apoptosis in triple negative breast cancer cells | |
| Delen et al. | Inhibition of the invasion of human glioblastoma U87 cell line by ruxolitinib: a molecular player of miR-17 and miR-20a regulating JAK/STAT pathway | |
| Yuan et al. | TIPE3 is a regulator of cell apoptosis in glioblastoma | |
| Tian et al. | Fangchinoline targets PI3K and suppresses PI3K/AKT signaling pathway in SGC7901 cells Retraction in/10.3892/ijo. 2023.5547 | |
| Lai et al. | HAF mediates the evasive resistance of anti-angiogenesis TKI through disrupting HIF-1α and HIF-2α balance in renal cell carcinoma | |
| Alamdari-Palangi et al. | MiRNA-7 replacement effect on proliferation and tarceva-sensitivity in U373-MG cell line | |
| Luo et al. | Effects of MiR-107 on the chemo-drug sensitivity of breast cancer cells | |
| Monica et al. | Dasatinib modulates sensitivity to pemetrexed in malignant pleural mesothelioma cell lines | |
| Cai et al. | Knockdown of TRIM32 inhibits tumor growth and increases the therapeutic sensitivity to temozolomide in glioma in a p53-dependent and-independent manner | |
| Cheng et al. | LINC00160 mediates sunitinib resistance in renal cell carcinoma via SAA1 that is implicated in STAT3 activation and compound transportation | |
| Fan et al. | Phospholipase C-ε regulates bladder cancer cells via ATM/EXO1 | |
| Zhi et al. | hERG1 is involved in the pathophysiological process and inhibited by berberine in SKOV3 cells | |
| Ko et al. | BMX, a specific HDAC8 inhibitor, with TMZ for advanced CRC therapy: a novel synergic effect to elicit p53-, β-catenin-and MGMT-dependent apoptotic cell death | |
| Li et al. | Anthraquinone derivative C10 inhibits proliferation and cell cycle progression in colon cancer cells via the Jak2/Stat3 signaling pathway | |
| Hou et al. | Inhibition of protein PMP22 enhances etoposide-induced cell apoptosis by p53 signaling pathway in Gastric Cancer | |
| Li et al. | FKBP51 acts as a biomarker of early metastasis and is related to carmustine sensitivity in human glioma cells. | |
| Wu et al. | Curcumin suppresses lung cancer progression via circRUNX1 mediated miR‐760/RAB3D axis | |
| Jin et al. | Proteomic level changes on treatment in MCF-7/DDP breast cancer drug-resistant cells | |
| CN117017962A (zh) | 一种hdaci抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |