KR20240016350A - Rna에 작용하는 내인성 아데노신 데아미나아제(adar)에 의한 효율적이고 정확한 rna 편집을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드(aso) - Google Patents

Rna에 작용하는 내인성 아데노신 데아미나아제(adar)에 의한 효율적이고 정확한 rna 편집을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드(aso) Download PDF

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토비아스 메르클레
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Abstract

본 발명은 내인성 ADAR을 갖는 세포 내부에서 표적 RNA의 부위 지정 A의 I로의 편집에 사용하기 위한 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드로서, 이노신으로 편집될 표적 RNA의 표적 아데노신에 반대되는 중앙 뉴클레오티드를 갖는 3개의 뉴클레오티드의 중심 염기 트리플렛(central base triplet)을 포함하는 표적 RNA의 서열 중 표적 서열에 결합할 수 있는 25 내지 80개 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함하고, a) 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드의 90% 이상은 당 모이어티의 2' 위치에서 화학적으로 변형되거나 또는 데옥시리보뉴클레오시드이거나, 또는 이들의 조합이거나, b) 6개 이하의 연속 뉴클레오시드가 당 모이어티의 2' 위치에서 2'-O-메틸로 화학적으로 변형되거나, c) 중심 염기 트리플렛의 3개 뉴클레오시드 중 적어도 2개는 당 모이어티의 2' 위치에서 화학적으로 변형되거나 데옥시리보뉴클레오시드인 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드에 관한 것이다.

Description

RNA에 작용하는 내인성 아데노신 데아미나아제(ADAR)에 의한 효율적이고 정확한 RNA 편집을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)
본 발명은 표적 RNA의 부위 지정 편집의 용도를 위한 방법 및 화학적으로 변형된 핵산에 관한 것이다.
분자 생물학의 엄청난 발전으로 인해, 세포의 유전 정보를 바꾸는 것이 가능하다. DNA 편집은 일반적으로 세포의 유전 정보의 안정적인 변형으로 이어지지만 때로는 DNA를 변경하는 것이 아니라 (m)RNA의 유전 정보를 변경하는 것이 관심을 끈다. DNA에 비해 (m)RNA 편집의 주요 장점은 한편으로는 편집 수율의 용량 의존성과 다른 한편으로는 치료의 가역성이다. 표적 RNA가 편집될 세포에서 화학적으로 변형된 핵산의 농도를 조절함으로써 편집 수율 및 표적 RNA의 번역 후 변형된 단백질의 양에 대한 의존성을 달성할 수 있다. 반면, 화학적으로 변형된 핵산이 해당 세포에 더 이상 존재하지 않으면 표적 RNA의 편집이 중단되고, 편집된 RNA가 새로 전사된 편집되지 않은 RNA로 대체되므로 치료는 가역적이다.
본 발명에 따른 RNA 분자의 편집은 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase action on RNA: ADAR)의 패밀리에 속하는 효소에 의해 매개된다. ADAR은 이중 가닥 RNA에서 아데노신(A)의 이노신(I)으로의 탈아미노화(A-to-I RNA 편집)를 촉매하는 효소 패밀리의 구성원이다. 이러한 효소 촉매 반응 과정에서 아데노신은 수화된 중간체를 통해 이노신으로 변화된다. 구아노신은 상보적 염기인 시티딘에 대해 3개의 수소 결합을 형성할 수 있는 반면, 이노신은 시티딘에 대해 단지 2개의 수소 결합을 형성할 수 있다. 번역 기구(translational machinery)는 이노신을 구아노신으로 판독한다. 따라서, ADAR은 RNA 수준에서 기능성 아데노신의 구아노신으로의 돌연변이를 도입하는 효과가 있다.
ADAR 패밀리에 속하는 데아미나아제가 RNA, 특히 mRNA에 작용할 수 있다는 요건은 이중 가닥이 형성된다는 것이다. 따라서, ADAR이 작용할 수 있는 이중 가닥 분자를 형성할 수 있는 상보적 핵산(이하에서: 올리고뉴클레오티드 또는 올리고리보뉴클레오티드)의 제공이 요구된다.
본 발명은 아데노신(A)에서 구아노신(G)으로 기능적 변화를 유발할 수 있는 화학적으로 변형된 핵산을 개시한다. RNA의 서열에 따라, 이러한 돌연변이는 놀라운 효과를 가져올 수 있다. 돌연변이는 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 해로운 효과를 갖는 점 돌연변이를 치료할 수 있거나 다른 아미노산이 치환에 의해 번역된 단백질에 포함될 수 있다. 그러나 정지 코돈(UAA, UAG, UGA)을 편집하거나 부위들을 스플라이싱하는 경우, 강력한 효과가 관찰될 수 있다.
본 발명의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 실질적인 이점은 이러한 오프타겟(off-target) 편집이 가역적이며 파괴적인 부작용의 위험이 더 낮다는 것이다. 또한, 필요한 경우 치료를 중단하고 되돌릴 수 있다. 더 우수한 안전성 프로파일로 인해, RNA 수준에서 인간 유전 정보의 일시적이고 제한된 조작이 광범위하게 적용될 수 있으며, DNA 수준의 게놈 편집이 예측할 수 없고 불가역적인 부작용으로 인해 위험할 수 있는 의학적 적응증으로 확장될 수 있다.
아데노신을 이노신으로 전환시킬 수 있는 여러 ADAR 효소가 인간 조직 전반에 걸쳐 발현되며, 이노신은 그 후, 번역에서 구아노신으로 생화학적으로 판독된다. 여러 ADAR이 당해 분야에 알려져 있다. ADAR은 제노푸스 레비스(Xenopus levis)뿐만 아니라 인간 및 마우스 세포에서도 발견되었다. 3종의 인간 ADAR은 모두 공통 C-말단 데아미나아제 도메인을 공유하나, ADAR 1과 ADAR 2만이 촉매 활성을 갖는 것으로 나타났다. ADAR은 이중 가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)인 공통 기능성 도메인(common functional domain)을 공유한다. ADAR 1은 3개의 dsRBD를 포함하나, ADAR 2 및 ADAR 3은 2개의 dsRBD만 공유한다. ADAR 1에 대해, 2개의 이소형이 알려져 있다. 항시적으로(constitutively) 발현되는 짧은 110 kDa ADAR 1은 p110 이소형인 반면, 보다 긴 150 kDa ADAR 1은 p150 이소형이고, 대안적인 인터페론 유도성 프로모터로부터 발현된다. 현재 지식에 따르면, ADAR 2는 주로 뇌의 코딩 부위를 편집한다. ADAR 1은 비-코딩 부위를 편집하는 주요 효소이다.
RNA의 효율적인 편집을 위해서, ADAR이 mRNA 전사체의 특정 표적 부위로 향하는 것이 필요한다. 선행 기술의 이전 시도는 ADAR의 데아미나아제 활성을 특정 부위로 유도하여 ADAR의 데아미나아제 활성을 편집될 mRNA 분자 상의 올바른 위치로 가져오기 위해 천연의 시스-작용 ADAR 동원 서열로부터 유래된 특정 루프-헤어핀 구조의 ADAR 동원 모이어티(recruiting moiety)를 활용했다. 부위 지정 RNA 편집을 위한 이러한 인공 핵산이 WO 2020/001793에 개시되어 있다. 선행 기술에 개시된 인공 핵산은 표적화 서열을 포함하고, 이는 표적 RNA의 표적 서열에 상보적이거나 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열 및 데아미나아제를 동원하기 위한 동원 모이어티를 포함한다.
특이적으로 데아미나아제를 동원하기 위한 루프-헤어핀(loop-hairpin) 구조의 동원 모이어티를 갖지 않는다는 점에서 본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산은 그에 개시된 핵산 올리고뉴클레오티드와 다르다. 본 발명의 화학적으로 변형된 핵산은 선행 기술로부터 공지된 구조체와 다른 전략을 이용한다. 다양한 RNA 분해 효소(RNA digesting enzyme), 특히 RNase A 및 H가 어디에나 존재하기 때문에 RNA가 매우 불안정하다는 것이 잘 알려져 있다. 선행 기술의 구조체를 사용한 RNA 편집은 동원 모이어티의 도움으로 데아미나아제를 동원하는 것에 의해서만 달성된다. 동원 모이어티는 데아미나아제를 원하는 작용 부위, 즉 이노신으로 그러나, 기능적으로는 구아노신으로 전환되는 표적 아데노신으로 가이드한다.
이와 반대로, 본 발명의 화학적으로 변형된 핵산은 데아미나아제에 대한 루프-헤어핀 구조의 동원 모이어티를 반드시 갖는 것은 아니다. 대신에, 본 발명의 화학적으로 변형된 핵산은 ADAR 효소가 부착하는 RNA 이중체(duplex)를 형성하고, 그에 의해 편집 효율이 증가된다. 후자는 전체 길이에 걸쳐 특정한 최적의 화학적 변형 패턴을 갖는 화학적으로 변형된 핵산을 사용하여 달성된다. ASO의 화학적 변형이 중심 트리플렛에 한정되지 않고, 중심 트리플렛에 인접한 측접부(flank)로 확장된다는 것이 본 발명의 중요한 양태이다.
표적 RNA 서열의 중심 트리플렛은 양측에 하나의 뉴클레오티드가 측접된(flanked) 아데노신을 포함하고, 중심 염기 트리플렛(Central Base Triplet)으로 또한 지칭될 것이다. 본 발명의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 중심 염기 트리플렛에 상보적인 서열은 그의 특이적 화학적 변형과 관련하여 중요하다. mRNA의 번역 수준에서 기능적 변화(편집)를 가능하게 하기 위해서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 mRNA의 편집을 허용하는 것이 요구된다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 한편으로는 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형, 특히 올리고뉴클레오티드의 당 모이어티의 변형에 의해 달성될 수 있는 분해(예를 들어 RNase에 의해 유발됨)에 대해 충분히 안정화되는 것이 필수적이다.
반면에, 화학적 변형은 RNA 분자의 편집을 허용해야 한다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형이 너무 광범위하면 편집의 효능이 허용할 수 없는 수준으로 감소된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 변형은 최적의 편집 효능을 수득하기 위해 본원에 기술된 가이드라인을 따라야 한다.
EP 3 507 366에는 3개의 순차적 뉴클레오티드의 중심 염기 트리플렛이 당 변형 및/또는 염기 변형을 포함하는 것인 ADAR 효소에 의한 표적 아데노신의 탈아민화를 위한 화학적으로 변형된 단일 가닥 RNA 편집 올리고뉴클레오티드가 개시된다. 모든 구체예(상기 선행 기술의 도 2)에서 측접(flanking) 영역은 리보오스 유닛의 2'-O-메틸화 블록과 소수의 추가적인 말단 포스포로티오에이트 결합으로 균일하게 변형된다.
그러나, 상기 선행 기술에서 사용된 바와 같은 핵산의 이러한 균일하고 블록별(block-wise) 2'-O-메틸 변형은 그들의 내인성 발현 수준에서 천연 ADAR 효소에 의한 편집 활성의 강한 손실을 초래한다는 것이 밝혀졌다. 이는 이중 가닥 RNA 결합 도메인의 dsRNA 기질로의 결합에 대한 부피가 큰(bulky) 2' 변형의 부정적인 영향에 따른 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 본 발명에서, 핵산의 모든 피리미딘 염기에 배치될 때 2'-F 및 2'-F와 2'-OMe의 혼합물이 특히 잘 받아들여지고, 뉴클레아제 분해에 대해 여전히 우수한 안정화 효과를 갖는다고 기술한다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분자당 적어도 하나의 2'-F, 바람직하게는 적어도 5개, 더 바람직하게는 적어도 8개의 2'-F 변형을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 모든 피리미딘 염기에서의 2'-F 변형은 20% 내지 60%, 바람직하게는 45% 내지 55% 범위이다.
그러나, 중심 염기 트리플렛(Central Base Triplet)에서, 2'-F 및 특히, 2'-O-메틸화는 문헌에 따르면 편집 수율에 매우 부정적인 영향을 미쳤다. 그러나, 본 발명자들은 중심 염기 트리플렛의 3개의 위치 모두에서 데옥시리보오스가 잘 수용되고(tolerated) 뉴클레아제 분해(nuclease digestion)에 대해 상당한 안정화를 제공한다는 것을 발견했다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 대조 트리플렛(control triplet)에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 3개의 당 유닛은 데옥시리보오스 유닛이다.
화학적으로 변형된 핵산은 표적 mRNA의 부위 지정 편집(site-directed editing)에 사용하기에 적합하다는 점을 추가로 특징으로 한다. 화학적으로 변형된 핵산은 표적 아데노신의 반대편인 중심 염기 트리플렛의 중심 뉴클레오티드를 제외하고, 표적 mRNA의 표적 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 중심 염기 트리플렛의 중심 뉴클레오티드는 일반적으로 시토신 또는 그의 유도체이나, 일반적으로 N-헤테로고리 화합물을 기반으로 하는 핵염기 유사체(nucleobase analogue)일 수도 있으며, 정상적으로, 보통 상보적인 티미딘 또는 우라실을 대체하고, 일반적으로 ADAR에 의한 편집 부위 인식을 향상시킨다. 아데노신 데아미나아제의 작용에 의해, 표적 아데노신은 전사 후 기능적으로 구아노신으로 변경된다. 따라서, 뉴클레오티드의 서열은 투여된 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA와 혼성화할 때 형성된 dsRNA 내에서 ADAR에 의한 표적화된 아데노신의 인식을 개선하기 위해 이전에 기술된 하나의 예외를 제외하고 항상 mRNA의 표적 영역에 상보적이다. 더욱이 중요한 것은 올리고뉴클레오티드, 특히 당 모이어티 및 그들 사이의 결합(linkage)의 변형 패턴이다.
본 발명의 원리는 mRNA의 편집을 허용하기 위해서 화학적으로 변형된 핵산이 충분한 기간 동안 안정해야 한다는 사실에 기초한다. 일반적으로, RNA 분자는 세포에서 매우 빠르게 분해된다. 따라서, 핵산은 화학적으로 변형되고, 그에 의해 변형은, 화학적으로 변형된 핵산이 세포에서 충분한 시간 동안 생존하고, 동시에 ADAR에 의한 인식을 방해하지 않는 정도로 일어나야 한다. 올리고뉴클레오티드의 변형은 뉴클레오티드의 당 모이어티와 관련된다. RNA 염기는 변형되지 않은 모이어티이다. 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 바람직한 변형은 데옥시-리보오스 모이어티, 또는 리보오스 모이어티에 2'-O-메틸 및/또는 2'-F 변형을 갖는 RNA 염기이다. 또 다른 변형은 당 모이어티 사이의 포스페이트 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 대체하는 것이다.
본 발명의 과정에서, 인공 핵산(올리고뉴클레오티드)은 15개 내지 80개 뉴클레오티드, 바람직하게는 25개 내지 65개 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 30개 내지 60개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 길이의 핵산은 본 출원에서 올리고뉴클레오티드로 지칭된다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산(올리고뉴클레오티드)은 거의 100%의 상보성으로 표적 mRNA의 상응하는 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 mRNA의 상응하는 서열에 대한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 상보성은 적어도 85% 상보성이다. 완전한 상보성이 혼성화 과정에 최적이지만, 천연 ADAR 기질은 종종 소수의 미스매치(mismatch) 및/또는 벌지(bulge)를 포함하고, 이는 이중 가닥 기질의 구조적 교란(perturbation)을 허용하여 이중 가닥 RNA 결합 도메인에 의한 또는 데아미나아제 활성 부위 내부에서 기질 인식을 향상시켜 편집을 돕는다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산(올리고뉴클레오티드)에서, 피리미딘 뉴클레오시드의 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 훨씬 더 바람직하게는 100%가 2' 위치에서 화학적으로 변형된다. 중심 염기 트리플렛 외부에서, 변형은 바람직하게는 2'-알킬, 더 바람직하게는 2'-O-메틸, 또는 2'-O-에틸, 2'-아미노 또는 2'-할로, 더 바람직하게는 2'-O-에틸이다. '-플루오로 변형이다. 중앙 염기 프리플렛 내에서, 적어도 2개, 더 바람직하게는 모든 핵염기, 피리미딘 및 퓨린이 2'-OMe 또는 2'-F로 변형되거나 더 바람직하게는 2'-데옥시로 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 양 말단(5'/3') 모두에 말단 블록(terminal block)이 존재하고, 바람직하게는 각 말단에 3개의 2'-OMe/PS 뉴클레오티드 또는 2'-MOE/PS가 존재한다.
특히 바람직한 구체예에서, 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드는 임의의 화학량론(stoichiometry), 바람직하게는 20:80-80:20, 더욱 바람직하게는 70:30-30:70, 더욱 바람직하게는 60:40-40:60의 2'-플루오로 및 2'-O-메틸 치환기의 혼합물로 변형된다. 2'-F 및 2'-O-메틸 변형이 혼합된 경우, 6개 이하, 바람직하게는 5개 이하, 훨씬 더 바람직하게는 4개 이하의 2'-O-메틸 변형이 하나의 블록에 통합되어야 한다. 이러한 혼합물에서, 적어도 하나의 피리미딘 뉴클레오시드, 바람직하게는 적어도 5개, 더욱 바람직하게는 적어도 8개의 피리미딘 뉴클레오시드가 2'-플루오로 치환기로 변형된다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화학적으로 변형된 핵산의 중심 염기 트리플렛에서, 표적 (m)RNA의 표적 아데노신의 맞은편에 N-헤테로고리 염기, 피리딘 또는 피리미딘 유도체, 더 바람직하게는 시토신 뉴클레오시드 또는 이의 유도체를 운반하는 뉴클레오시드가 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 이 뉴클레오시드와 5' 및 3'-단일 인접 뉴클레오티드는 2' 탄소 원자에 치환기를 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드, 더 바람직하게는 2개의 변형된 뉴클레오시드, 훨씬 더 바람직하게는 3개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하며, 상기 치환기는 는 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이거나, 더욱 바람직하게는 2'-데옥시이다.
5'-CAN 코돈(표적화된 A는 밑줄로 표시됨, N = 임의의 핵염기)이 표적 (m)RNA에서 표적화되는 경우, 본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산의 중심 염기 트리플렛은 2'-데옥시-이노신, 또는 표적화된 아데노신에 5'-인접한 시토신 염기와 쌍을 이루는 하이포잔틴 핵염기 또는 그의 유도체를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 2'-데옥시-이노신은 2개, 더욱 바람직하게는 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함하는 중심 염기 트리플렛에 위치한다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산은 분해에 대한 증가된 안정성 및 ADAR에 결합하기 위한 최적의 화학적 변형 패턴을 보이므로, 본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 데아미나아제를 유인하는 특이적 루프-헤어핀 구조의 동원 모이어티를 갖지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 화학적으로 변형된 핵산은 대칭적이며, 이는 중심 염기 트리플렛에 인접한 2개의 뉴클레오티드 서열이 동일한 길이를 갖는다는 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드가 예를 들어 59개의 뉴클레오티드를 갖는 경우, 중심 염기 트리플렛의 각 측면에 28개의 뉴클레오티드가 있다. 본 발명의 대칭적 구체예의 개략적인 구조가 도 1B에 도시된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산은 대칭적이지 않으며, 이는 중심 염기 트리플렛에 측접한(flanking) 2개의 서열이 상이한 길이를 갖는다는 것을 의미한다. 비대칭 디자인은 표적 주변의 서열 공간을 보다 유연하게 사용할 수 있게 한다. 또한, 비대칭 디자인은 핵산이 올바른 말단에서 단축된다며, 대칭 디자인에 비해, 핵산의 짧은 서열, 예를 들어 45nt의 편집 수율을 증진시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 바람직하게는, 중심 염기 트리플렛에 대한 5' 측접 서열(flanking sequence)은 비대칭 구체예에서 3' 측접 서열보다 더 길다. 바람직한 구체예는 3' 측접 서열에 적어도 4 nt, 더 바람직하게는 적어도 9 nt를 포함하고, 5' 측접 서열에 적어도 19 nt, 더 바람직하게는 적어도 28 nt, 가장 바람직하게는 적어도 33 nt를 포함한다. 본 발명의 비대칭 구체예의 개략적인 구조가 도 1A에 도시된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산은 포스포로티오에이트 결합을 통해 적어도 30%, 더 바람직하게는 40%, 훨씬 더 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 60% 초과의 비율까지 연결된다. 바람직하게는, 적어도 10개, 더 바람직하게는 적어도 15개, 가장 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오시드 결합이 핵산의 말단(5' 또는 3')에서 시작하여 불연속성이 거의 없이, 더욱 바람직하게는 어떠한 불연속성 없이 배치된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 바람직하게는 연속적인 포스포로티오에이트 결합의 상기 블록은 양 말단(5' 및 3')에서 시작하여 핵산의 양쪽 측접부(flank)에 배치된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 당 모이어티의 변형은 포스포로티오에이트 결합과 조합된다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산은 일반적으로 RNase에 의해 일어나는 분해에 대해 실질적으로 더 안정하며, 이는 결과적으로 (m)RNA가 편집되어야 하는 세포에 더 오랫동안 존재할 수 있게 한다. 이론에 의해 구속되기를 원치 않으면서, 화학적으로 변형된 핵산의 수명이 세포의 환경에서 증가하므로, ADAR이 이중 가닥의 더 긴 안정성으로 인해 mRNA에 작용할 수 있기 때문에, 데아미나아제를 동원하기 위한 동원 모이어티가 요구되지 않은 것으로 추정된다.
생물학적 반응은 종종 시간-의존적이다. 척추동물의 세포에는 영구적이고 빠른 전환(turnover)이 일어나는 매우 다양한 RNA 분자가 있다. RNA 분자는 종종 상이한 RNase에 의해 분해된다. 따라서, 치료 목적을 위한 RNA 분자의 사용은 RNA 분자의 급속한 분해로 인해 제한되는 경우가 많다. 생체 내 상황은 일반적으로 세포 배양물을 이용한 테스트 시스템이 사용되는 인 비트로 상황과 다르기 때문에, 치료 목적으로 사용되는 분자의 안정성이 치료의 성공에 결정적일 수 있다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산 분자는 세포에서 편집 능력과 충분한 안정성의 우수한 균형을 제공하여, 엔도솜의 조건도 견딜 수 있다. 본 발명에 따른 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 자연 흡수(gymnotic uptake)가 가능하고 허용 가능한 편집 효율을 보인다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산을 이용한 최상의 결과는 하기 특징 중 바람직하게는 여러 개, 적어도 2개, 더 바람직하게는 적어도 3개가 올리고뉴클레오티드에서 실현될 때 달성될 수 있다:
·중심 염기 트리플렛에 측접하는 영역에 배치된 높은 포스포로티오에이트 함량(적어도 30%);
·탈아민화될 아데노신의 반대편에 있는 중심 염기 트리플렛 중 적어도 하나의 DNA 당 뉴클레오시드;
·대략 동일한 화학양론으로 뉴클레오시드 리보스 모이어티의 2'-F 또는 2'-OMe 변형에 의한 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 염기의 안정화로서, 2'-OMe 모이어티의 블록을 피하는 패턴이 바람직한 것인 안정화;
·이중 변형(dual modification), 즉 당 모이어티의 2'-OMe 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 갖는 3개 뉴클레오티드의 블록에 의해 양 말단의 안정화.
본 발명의 화학적으로 변형된 핵산 분자(올리고뉴클레오티드)는 분자가 척추동물 유기체에서 충분히 안정하여 원하는 효과가 달성될 수 있다는 이점을 갖는다. 본 발명에 따른 분자는 효과가 나타날 수 있도록 충분한 기간 동안 다양한 RNase의 분해에 대해 안정하다.
본 발명의 화학적으로 변형된 핵산의 또 다른 장점은 특정 벡터나 특정 형질감염 방법과 같은 다른 보조 메커니즘 없이 표적 세포에 직접적으로 전달될 수 있다는 것이다. 본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산은 자연적 흡수(gymnosis)를 통해 작용할 수 있으며, 이는 그들이 벡터나 다른 운반체(carrier)와 같은 보조 수단을 사용하지 않고 표적 세포에 직접 적용될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산의 또 다른 장점은 임상적으로 관련된 표적에서 높은 편집 효율을 갖는다는 것이다. 변형된 핵산은 자연적 흡수(gymnosis)를 통해 표적 세포에 도입될 수 있으며 표적 세포의 번역 수준에 대한 비교적 높은 효과가 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 화학적으로 변형된 핵산의 또 다른 이점은 A에서 I로의 편집이 5'UAG와 같은 비교적 쉽게 편집 가능한 표적뿐만 아니라 5'CAA와 같은 더 어려운 트리플렛에 대해서도 수행될 수 있다는 것이다.
본 발명 및 그의 바람직한 실시양태는 실시예 및 도면에 의해 예시되지만 이는 제한적이지 않다.
도면은 구체적으로, 본 발명의 바람직한 구체예를 예시한다.
도 1은 본 발명의 2개의 바람직한 구체예의 기본 구조 및 용어를 보여준다. 도 1A)는 비대칭 변형 올리고뉴클레오티드를 보여주고 도 1B)는 대칭 디자인을 보여준다.
도 1의 A는 표적화된 RNA에 결합하는, 중심 염기 트리플렛(NNN)의 3'-인접한 4개 이상의 뉴클레오티드 및 5'-인접한 19개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 본 발명의 비대칭 구체예이다. 표적화된 아데노신(A*)은 중심 염기 트리플렛의 중앙 뉴클레오티드 반대편에 있다.
도 1의 B는 표적화된 RNA에 결합하는 중심 염기 트리플렛의 5'- 및 3'-인접한 11개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 본 발명의 대칭적 구현예이다. 표적화된 아데노신은 중심 염기 트리플렛의 중앙 뉴클레오티드 반대편에 있다.
도 2는 실시예 1에서 수행된 실험 결과를 보여준다. GAPDH ORF(open reading frame)의 편집 정도가 다양한 올리고뉴클레오티드에 대해 퍼센트로 표시되며, 그들의 서열은 표에 제공된다. 실험은 인터페론-α의 존재(+IFN) 및 부재하에 수행되었다.
도 2의 E는 가이드 RNA의 길이가 편집 효능에 미칠 수 있는 영향을 보여준다. 편집 효능은 적어도 25개 뉴클레오티드의 길이까지 적어도 허용가능하다는 것을 알 수 있다. 바람직하게는, 하한은 30개 뉴클레오티드인데, 그 이유는 편집 효능이 그러한 길이에 대해 약 50% 이상이기 때문이다.
도 3은 리드(lead) 올리고뉴클레오티드 V120.2 및 V117.19와 GAPDH의 편집을 보여주며 실험은 실시예 2에 더 자세히 기술된다. 2개의 변형된 올리고뉴클레오티드가 도 3의 A)(비대칭) 및 도 3의 B)(대칭)에 도식적으로 표시된다. 편집은 HeLa, U2OS, SH-SY5Y, SK-N-BE, Huh7, HepG2, A549, THP-1와 같은 다양한 세포주에서 테스트되었다. 실험은 인터페론-α의 존재(+IFN) 및 부재하에 수행되었다.
도 4는 바람직한 GADPH 구조로의 추가적인 화학적 변형의 도입을 보여준다. 도 4의 A) 및 B)에 대한 더 자세한 설명 및 세부 사항은 실시예 3에서 확인할 수 있다. 도 4의 C)는 안정성을 나타내고, 도 4의 D)는 실시예 4에 개시된 바와 같은 편집 효능을 보여준다.
도 4의 D) 및 E)에 표시된 그래프에 대한 자세한 내용은 실시예 5에서 확인할 수 있다.
도 4의 F는 중심 염기 트리플렛의 외부 피리미딘 뉴클레오시드의 2'-플루오로 및 2'-O-메틸 치환기의 조합을 갖는 "V120.21" 및 "V120.23"으로 지칭된 본 발명에 따른 2개의 올리고뉴클레오티드의 편집 효능의 비교이다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 WO 2019/158475에 개시된 구조체와 도 3의 C(ADAR 102-2), 도 7(ADAR 103-8) 및 도 7(ADAR 102-7)에서 비교하였다. 본 발명에 따른 구조체의 탁월한 편집 효능은 도 4의 F에서 명확하게 볼 수 있다.
도 5는 HeLa 세포에서 안정한 화학적으로 변형된 GADPH-표적화 구조체에 의한 자연적 흡수(gymnosis)를 보여준다. 실험 개요는 실시예 6에 더 상세하게 기술된다.
도 6은 실시예 7(도 6의 A)) 및 실시예 8(도 6의 B)에서 얻은 결과를 보여준다. 데이터는 STAT1 Y701 편집 및 안정성 데이터와 관련된다.
도 7은 MeCP2 W104X 편집 및 안정성 데이터와 관련된다. 도 7의 A)에 표시된 결과의 세부사항은 실시예 9에서 찾을 수 있고, 도 7의 B)에 대해, 더 자세한 설명은 실시예 10에서 찾을 수 있으며, 도 7의 C)에 대해, 더 자세한 설명은 실시예 11에서 찾을 수 있다.
도 8은 실험 세부 사항에 대한 hIDUA W402X 편집, α-L-이두로니다아제(iduronidase) 분석 및 안정성 데이터를 보여준다. 도 8의 A)에 대해서는 실시예 12를, 도 8의 B)에 대해서는 실시예 13, 도 8의 C)에 대해서는 실시예 14를 참조한다.
도 9는 mIDUA W392X 편집 및 안정성 데이터와 관련된다. 도 9의 A)는 실시예 15의 결과를 나타내고, 도 9의 B)는 실시예 16의 결과를 나타내며, 도 9의 C)는 실시예 17의 결과를 나타낸다.
도 10은 PDE6A V685M 편집 및 상응하는 안정성 데이터와 관련된다. 실시예 18의 결과가 도 10의 A)에 표시되고, 실시예 19의 결과가 도 10의 B)에 표시되며, 실시예 20의 결과가 도 10의 C)에 표시된다.
도 11은 SERPINA1 PiZZ 편집 및 A1AT ELISA 및 안정성 데이터에 관한 결과를 보여준다. 도 11의 A)의 세부사항은 실시예 21을 참조하고, 도 11의 B)의 세부사항은 실시예 22를 참조하며, 도 11의 C)의 세부사항은 실시예 23을 참조한다.
도 12는 LRRK2 G2019S 표적에 대해 실시예 24에서 얻은 결과를 보여준다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드(V117.19 및 V120.2)는 매우 높은 편집 수율을 보인다. 선행 기술의 교시에 따라 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오티드를 도입함으로써(V117.20 및 V120.3), 구조체의 편집 활성이 약 절반으로 감소한다.
실시예 1: ORF의 L157 부위 및 3'UTR 부위에서 인간 하우스키핑 GAPDH 유전자에 대한 구조체의 RNA 편집 활성 최적화(도 2 참조).
실시예 1의 결과가 도 2에 표시된다. 2x5 내지 2x25개 결합(linkage) 범위의 포스포로티오에이트(PS) 결합의 긴 블록이 편집 성능을 향상시키는 것으로 나타났다. 도 2의 B)는 포스포로티오에이트 결합이 없으면 편집이 달성될 수 없다는 것을 보여준다(구조채 V117.1). 도 2의 C) 및 D)는 올리고뉴클레오티드의 길이의 영향을 보여준다. 비대칭 디자인이 선택된 경우, 길이를 40개 뉴클레오티드까지 줄일 수 있다. 도 2의 E에 도시된 바와 같이, ORF(open reading frame)의 외부, 예를 들어 3'UTR 영역의 부위를 편집하기 위해, 비대칭 디자인의 경우, 올리고뉴클레오티드 길이를 25nt까지 줄일 수 있다. 또한, 인터페론-α의 첨가가 편집 효능의 개선을 가져오지 않는다는 것이 흥미롭게 주목된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 포스포로티오에이트 결합의 도입, 및 가장 바람직한 구조체의 길이 및 중심 염기 트리플렛 위치의 효과를 연구하였다. 본 발명에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드는 내인성 ADAR을 동원하는 것에 의해 ORF(open reading frame)의 5'UAG 배경(context)에서 아데노신을 편집하기 위해 내인성 하우스키핑 전사체(GAPDH)를 표적화하는데 사용되었다. 일반적으로 실험 설정에 "IFN"으로 표시된 인터페론을 첨가하는 것은 구조체의 편집 활성에 유의한 영향을 미치지 않았다. 상세한 구조체 서열이 표 1A 및 1B에 열거된다.
결과를 얻기 위해, HeLa 세포(Cat.No.: ATCC CCL-2)를 DMEM + 10% FBS + P/S(100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)에서 배양했다. 100 ㎕ DMEM 및 10% FBS(+ 600 유닛 IFN-α, Merck, 카탈로그 번호 IF007, 로트 번호 2937858) 중 5× 104개 세포를 96-웰 포맷 중 0.5 ㎕ Lipofectamine 2000 및 5 pmol 구조체/웰의 형질감염 믹스(transfection mix)에 첨가했다. 24시간 후, RNA 분리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다. 실험을 통해 다음과 같은 결론이 도출되었다:
A) 도입된 포스포로티오에이트(PS) 결합의 양이 증가함에 따라 구조체의 편집 활성이 향상된다. 중심 염기 트리플렛의 각 측면에 단지 5개의 포스포티오에이트 결합이 있는 구조체 V117.16(서열번호 2)은 양쪽에 25개의 PS 결합을 갖는 구조체 V117.19(서열번호 5)에 비해 현저하게 감소된 편집 활성을 나타낸다.
B) 포스포로티오에이트 결합을 포함하지 않는 구조체는 연속 블록으로 배열된, PS 결합을 추가로 포함하는 구체예(V117.19, 서열번호 5 및 V119.4, 서열번호 8)와 대조적으로 검출가능한 편집 활성을 보이지 않는다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 사이의 연속적인 포스포로티오에이트 결합의 뉴클레오티드 블록을 하나 이상 포함한다. 구조체에 포스포로티오에이트 결합의 부재 (V117.1, 서열번호 1 및 V119.1, 서열번호 7)는 편집 활성에 치명적이다.
C) 본 발명의 바람직한 구체예의 편집 활성은 올리고리보뉴클레오티드의 길이에 따라 달라진다. 최소 길이는 편집 부위가 ORF의 내부인지 외부인지에 따라 달라질 수 있다. 중심 염기 트리플렛을 측접하는 올리고리보뉴클레오티드 암(oliggoribonucleotide arm)을 단축하는 것, 예를 들어, 59 nt의 총 길이에서 47 nt로 단축하는 것은 대칭적 구체예에 대한 편집 활성에 유해하다(V117.19, 서열번호 5 및 V118.3, 서열번호 6). 비대칭 구체예(V119.4, 서열번호 8; V120.2, 서열번호 9; V121.1, 서열번호 10 및 V122.1, 서열번호 11)의 경우, 더 짧은 전체 올리고리보뉴클레오티드가 대칭적 구체예와 비교하여 높은 편집 효능에 여전히 충분하며, 예를 들어 40nt(V121.1, 서열번호 10)까지 단축시키는 것이 가능하나, 35nt로 단축시키면 ORF 내 편집 부위에 대한 편집 활성을 제거한다(V122.1, 서열번호 11). ORF 외부의 부위를 편집하기 위한 올리고뉴클레오티드 길이와 관련하여, 하기 구조체를 조사했다: 45개의 뉴클레오티드를 갖는 V120.2(서열번호 63); 40개의 뉴클레오티드를 갖는 V121.2(서열번호 64); 35개 뉴클레오티드를 갖는 V121.3(서열번호 65), 30개 뉴클레오티드를 갖는 V121.4(서열번호 66) 및 25개 뉴클레오티드를 갖는 V121.5(서열번호 67)를 편집 효능과 관련하여 조사하였다. 구조체 V121.2(서열번호 64)는 또한 비대칭 구조체의 3' 말단이 4개의 뉴클레오티드로 단축될 수 있다는 것을 보여준다. 결과가 도 2의 E에 표시된다. 모든 특징에 따라, 본 발명에 따른 총 올리고뉴클레오티드 길이의 하한은 25개 뉴클레오티드인 것으로 보인다.
D) 동일한 올리고리보뉴클레오티드 길이를 갖는 구조체에서 중심 염기 트리플렛의 선호되는 위치가 중요하다. 예를 들어, 현재의 예(V117.19, 서열번호 5 및 V119.4, 서열번호 8)에서 59개 뉴클레오티드를 갖는, 더 긴 구조체는 중심 염기 트리플렛의 명확하게 선호되는 위치를 보이지 않는다. 예를 들어 47개 뉴클레오티드(V118.3, 서열번호 6) 또는 45개 뉴클레오티드 길이(V120.2, 서열번호 9)를 갖는 더 짧은 구조체는 V120.2(서열번호 9)에 관한 것과 같이 구조체의 3' 말단을 향해 중심 염기 트리플렛을 위치시키는 강한 선호도를 보여, 중심 염기 트리플렛에 5'-인접한 긴 뉴클레오티드를 갖는 본 발명의 비대칭 구체예를 초래한다.
실시예 2: 다양한 종양 세포주에서 내인성 ADAR에 의한 인간 GAPDH 전사체의 L157 부위의 편집.
다양한 조직으로부터 유래된 세포주에서 본 발명의 구조체의 적용 가능성을 조사하기 위해, 본 발명의 2개의 특히 바람직한 구체예, 즉 길고 대칭적 디자인(V117.19, 서열번호 5, 도 3의 B) 및 짧고 비대칭 디자인(V120.2, 서열번호 9, 도 3의 A)를 이용하여 세포주 스크린(cell line screen)을 수행했다. 변형을 보여주는 구조체의 목록이 표 2에 제공된다.
RPMI + 10% FBS에서 배양된 THP-1을 제외하고, 상이한 종양 세포주를 DMEM + 10% FBS + P/S에서 배양했다. 1× 105개 세포/웰(HeLa 세포(카탈로그 번호 ATCC CCL-2)의 경우, U2OS-Flp-In T-REx32(Elmar Schiebel의 기증), Huh7(CLS GmbH, Heidelberg, cat. no. 300156), HepG2(DSMZ, 독일 브라운슈바이크, cat. no. ACC180) 및 A549(European Collection of Authenticated Cell Cultures ECACC 86012804))를 24-웰 플레이트에 접종했다. SK-NBE(2)(카탈로그 번호 ATCC CRL-2271) 및 SH-SY5Y(카탈로그 번호 ATCC CRL-2266) 세포주의 경우, 24웰당 2.5×105개 세포를 접종했다. 24시간 후 배지를 교체하고(IFN 처리된 세포의 경우 3,000U/웰 IFN-α 보충) 세포를 50㎕ OptiMEM 및 50㎕ OptiMEM 중 1.5㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher)에 25pmol ASO/웰의 형질감염 믹스로 전향적(forward) 형질감염시켰다. Scientific)을 50㎕ OptiMEM에 담았다. 두 용액을 5분간 인큐베이션한 후 조합하고 추가로 20분간 인큐베이션하고, 형질감염 믹스를 하나의 웰에 고르게 분배시켰다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
24-웰 플레이트의 3×105 세포/웰을 RPMI + 10% FBS + PMA(200nM)에서 3일 동안 분화시킨 후 THP-1을 동일한 방법으로 형질감염시키고, 이후 RPMI + 10% FBS에서 5일 동안 배양하였다.
도 C에 도시된 바와 같이, 두 구조체 모두 테스트된 모든 세포주에서 편집 활성을 보였다. 특히, 선행 기술(WO 2020/001793에 개시됨)의 경우와 같이 인터페론("+IFN")을 첨가해도 편집 활성이 크게 향상될 수 없었다.
실시예 3: 내인성 ADAR에 의한 내인성 인간 GAPDH 전사체의 L157 부위를 표적화하는 구조물에 화학적 변형 패턴의 도입.
본 실시예의 결과는 도 4의 A) 및 B)에 도시된다. 예를 들어 구조체 V120.7(서열번호 13)에 사용된 큰 2'-O-메틸 블록의 이용은 편집의 실질적인 감소를 가져온다(도 4의 A). 도 4의 B)는 피리미딘 뉴클레오시드의 변형과 관련하여, 2'F 변형은 잘 허용되고, 2'-O-메틸 변형은 어느 정도 허용되나, 2'-MOE [2'-O-(2-메톡시에틸)]은 허용되지 않는다는 것을 보여준다.
비-자기(non-self)올리고뉴클레오티드에 대한 방어의 여러 라인이 있는 치료 환경에서 합성 올리고뉴클레오티드가 온전하게(intact) 유지되기 위해서는 변형이 필수적인 것으로 입증되었다. 이러한 변형은 2'-히드록시기(2'OH) 대신 2'-O-메틸, 2'-플루오로(2'F), 2'-MOE 또는 2'-데옥시(2'H)와 같은 뉴클레오시드의 당 모이이티일 수 있지만 이에 한정되지 않다. 다양한 유형의 변형 외에도, 구조체 중 변형된 뉴클레오시드의 위치도 중요한 양태이다. 변형의 유형 및 변형된 뉴클레오시드의 위치 모두 구조체의 편집 활성에 대해 강한 효과를 갖는다. 테스트된 서열 및 그들의 변형의 목록이 표 3A 및 3B에 제공된다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 HeLa 세포를 배양하고 전향적 형질감염시켰다. 요약하면, 24-웰당 1×105개 세포를 접종하고 24시간 후에 각각의 구조체 25pmol로 전향적 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, RNA 단리 및 Sanger 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
도 4의 A에 도시된 바와 같이, 선행 기술의 특징(예: EP 3 507 366)인 2'-O-메틸 변형의 긴 블록(V120.7, 서열번호 13)은 편집 활성에 치명적인(devastating) 효과를 갖는다. 그러나, 변형의 다른 반복적인 패턴, 예를 들면, 2'F/2'F/ribo(V120.13, 서열번호 14), 2'-O-메틸/2'F(V120.14, 서열번호 15), 2'-O-메틸/2'F/2'F(V120.15, 서열번호 16) 또는 2'-데옥시/2'F/2'F(V120.16, 서열번호 17)은 편집 효율성에 다소 강한 영향을 미쳤다. 대조적으로, 구조체에서 다수의 선택된 뉴클레오티드의 화학적 변형은 잘 수용되었다(도 4의 B). 이러한 구체예에서, 중심 염기 트리플렛 내부의 피리미딘 염기는 2'데옥시(2'desoxy)로 변형되었고, 중심 염기 트리플렛 외부의 모든 피리미딘 뉴클레오시드에서의 다른 변형과 조합되었다. 특히, 2'-F 변형이 매우 잘 수용되었고(V120.17, 서열번호 18 및 V117.28, 서열번호 23), 반면에 2'-O-메틸 변형 단독은 구조체의 설계에 따라 편집 수율을 감소시켰다(V120.18, 서열번호 19 및 V117.27, 서열번호 22). 잘 알려진 변형 2'-MOE는 모든 피리미딘에 배치될 때, 잘 수용되지 않았다(V120.19, 서열번호 20).
또한, 본 발명에 따른 구조체의 비교를 선행 기술로부터 공지된 유사한 구조와 함께 수행하였다. WO 2019/158475는 염기 편집을 위한 화학적으로 변형된 가이드 RNA를 개시한다. 도 3의 C에, W392X 돌연변이된 마우스 IDUA 부위를 표적화하는 2'-MOE 변형된 가이드 RNA가 "ADAR 102-2"라는 명칭을 갖는 것으로 개시된다. 이 구조체는 39개의 뉴클레오티드를 갖는다. 도 7에, "ADAR 103-8" 및 "ADAR 102-7"로 지정된 W392X 쥐 IDUA 부위를 표적으로 하는 다른 2'-MOE 변형 가이드 RNA가 또한 도시된다.
전술한 바와 같이, 선행 기술로부터 공지된 3개의 구조체, ADAR 102-2(서열번호 68), ADAR 103-8(서열번호 69) 및 ADAR 102-7(서열번호 70)에 의한 편집 효능을 측정하는 비교예를 본 발명의 구조체: V120.21(서열번호 41) 및 V120.23(서열번호 42)과 비교하여 수행하였다. 대조군으로서, 올리고뉴클레오티드를 첨가하지 않았다(no ASO).
편집 효능이 도 4의 F에 표시된다. 명확하게, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 선행 기술에 개시된 구조체의 편집 효능보다 약 20배 더 높은 우수한 편집 효능을 보였다. 이러한 향상된 편집 효능은 주로 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드의 2'-플루오로 치환기와 2'-O-메틸 치환기의 조합에 기인하는 것으로 추정된다.
전체적으로, 데이터는 화학적 변형의 특성과 올리고리보뉴클레오티드 내의 배치의 부위가 RNA 편집 수율에 뚜렷한 영향을 미친다는 것을 보여준다.
실시예 4: 내인성 ADAR에 의한 내인성 L157 GAPDH 유전자를 표적으로 하는 구조체의 안정화
도 4의 C) 및 도 4의 D)는 10% FBS에서 뉴클레아제에 대한 안정성과 관련된 변형의 효과를 보여주고(도 4의 C), 도 4의 D)는 개선된 올리고뉴클레오티드가 충분히 안정하고, 비교적 짧으며, 그럼에도 불구하고 높은 효능을 갖는다는 것을 보여준다.
본 발명의 치료 가능성을 평가하기 위해, RNase와 같은, 비-자기 올리고뉴클레오티드에 대한 내인성 방어 메커니즘에 대한 본 발명의 구조체의 안정성을 결정하는 것이 매우 중요하다. 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 구조체에 도입하면 RNase에 대한 안정성을 향상시킬 수 있다. 이를 결정하기 위해, 본 발명의 4개의 바람직한 구체예 - 당 모이어티의 2' 히드록실기에서 화학적 변형을 갖는 2개의 구체예 (V117.29, 서열번호 24 및 V120.20, 서열번호 21) 및 화학적 변형이 없는 2개의 구체예 (V117.19, 서열번호 5 및 V120.2, 서열번호 9)를 7일 동안 소 태아 혈청에서의 안정성을 테스트했다. 서열 및 변형이 표 4에 표시된다.
구조체를 10% 소태아혈청(FBS)에서 인큐베이션했다. 변성(denaturing) 우레아 PAGE에 의해 올리고뉴클레오티드의 분해는 시각화했다. 실험에서, 각각의 ASO 15pmol을 PBS + 10% FBS 10㎕에 희석했다. Mock 샘플은 PBS에 희석된 15 pmol ASO만 포함했다. 모든 샘플을 주어진 시점 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 액체 N2로 동결시키고, 즉시 -80℃ 보관했다. 샘플의 변성은 각각 7㎕의 RNA 로딩 염료(Rotiphorese® 시퀀싱 겔 희석제 중 Rotiphorese® 시퀀싱 겔 완충액 농축물을 1:10 희석, Carl Roth)를 첨가하고, 70℃에서 2분 동안 인큐베이션하여 수행하였다. 그 후, 변성된 샘플을 요소(7M) 폴리아크릴아미드(15%) 전기 영동(PAGE) 겔에 로딩하고 1 x TBE 완충액에서 1200V에서 4-6시간 동안 전개시켰다. 제조업체의 설명서에 따라 SYBR™ Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Fisher Scientific)을 통해 밴드를 시각화하고 Fujifilm FLA-5100 형광 이미지 분석기를 사용하여 여기 파장 λex = 473 nm에서 스캔했다.
구조체의 설계, 예를 들어 올리고리보뉴클레오티드의 길이 또는 중심 염기 트리플렛의 위치와 관계없이, 뉴클레오시드 당 모이어티의 2'-히드록실기에서 화학적 변형이 결여된 두 구조체(즉, V117.19, 서열번호 5 및 V120.2, 서열번호 9)는 즉시 분해되었다. 대조적으로, 피리미딘 뉴클레오시드의 2'-히드록실기에 화학적 변형을 갖는 두 구조체(V117.29, 서열번호 24 및 V120.20, 서열번호 21)는 7일보다 긴 기간 동안 10% 소태아혈청을 견딜 수 있었다. 따라서, 선택된 뉴클레오시드에서 구조체의 당 모이어티에 화학적 변형을 포함시키면 혈청 RNase 분해에 대한 내구성이 증가하고, 따라서, 혈청에서 구조체의 수명이 증가한다.
또한, 본 발명자들은 내인성 HeLa ADAR을 동원한 내인성 GAPDH 전사체의 편집에 대해 화학적으로 안정화된 구체예(V120.17, 서열번호 18 및 V117.29, 서열번호 24)를 선행 기술의 올리고리보뉴클레오티드 디자인(V25.1, 서열번호 12, WO 2020/001793에 공개됨)와 나란히 벤치마킹하였다(도 4의 D). 구체적으로, 본 발명자들은 두개의 화학적으로 안정화된 구체예가 편집 효율성에 의해 선행 기술의 올리고뉴클레오티드 V25.1(서열번호 12)를 명확하게 능가한다는 것을 밝혔다. 이는 선행 기술의 올리고리보뉴클레오티드를 사용한 편집 효율성이 IFN-α 처리("+ IFN")에 의해 강화된 경우에도 마찬가지였다.
실시예 5: 다양한 세포 유형에서 내인성 ADAR에 의한 L157 부위에서 인간 GAPDH 전사체의 편집(도 5의 D 및 E 참조).
도 4의 E)는 인간 일차 세포(primary cell)에서 실험을 수행한 실시예 5의 결과를 보여준다. 이러한 실험은 본 발명이 이후의 상업적 사용과 직접적 연관을 갖는 세포주에서 작용한다는 것을 보여주기 때문에 매우 중요하다.
HeLa 세포(도 4의 D) 및 다양한 조직으로부터의 일차 세포(도 4의 E)에서 본 발명의 구조체의 적용 가능성을 조사하기 위해, 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드가 없는(V117.19, 서열번호 5 및 V120.2, 서열번호 9) 또는 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드를 갖는(V117.29, 서열번호 24 및 V120.17, 서열번호 18) 본 발명의 총 4개의 특히 바람직한 구체예를 이용하여 세포 스크린을 수행하였다. 이용된 구조체 및 그들의 상응하는 서열의 목록이 하기 표(표 5)에 기재된다.
정상 인간 성상교세포(NHA, Lonza cat. no. CC-2565)를 AGM SingleQuot Kit Supplementary and Growth Factors(Lonza 카탈로그 번호 CC-4123)를 포함하는 ABM 기초 배지(Lonza 카탈로그 번호 CC-3187)에서 배양하고, 인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE, Lonza ca. no. 00194987)는 FBS 없이 RtEGM 망막 상피 세포 성장 배지 SingleQuots 보충제 및 성장 인자(Lonza ca. no. 00195407)가 보충된 RtEBM 기초 배지(Lonza ca. no. 00195406)에서 배양하고(접종을 위해 FBS를 첨가하고, 24시간 후에 배지를 FBS-불포함 배지로 교체함), 정상 인간 기관지 상피 세포(NHBE, Lonza cat. no. CC-2540)를 BEGM 기관지 상피 세포 성장 배지 SingleQuots 보충제 및 성장 인자(CC-4175)가 보충된 BEGM 기관지 상피 세포 성장 기초 배지(Lonza ca. no. CC-3171)에서 배양했다. 형질감염 절차는 HeLa 세포에 대해 실시예 3에 기술된 바와 같이 1×105개 세포/웰을 접종하고 25pmol ASO를 형질감염시켜 수행하였다. IFN 처리된 세포("+ IFN")에 구조체의 형질감염 전에 15,000U/웰 IFN-α를 보충했다. 24시간 후에 RNA 단리 및 Sanger 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
실시예 3에 이미 설명된 대로 1 x 105개 세포/웰로 접종하고 25pmol ASO로 형질감염시키고, 상응하는 웰을 일차 세포에 대해 기술된 바와 같이, IFN으로 처리하여, HeLa 세포를 처리하고 전향적 형질감염시켰다.
도 D 및 E에 도시된 바와 같이, 두 구조체 모두 테스트된 모든 세포 유형(HeLa, NHA, NHBE 및 RPE 세포)에서 효율적인 편집 활성을 보였다. 피리미딘 뉴클레오시드에 추가적인 화학적 변형을 포함시키는 것은 대부분의 경우 잘 수용되었다. 그러나, 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 갖는 구조체(V117.29, 서열번호 24 및 V120.17, 서열번호 18)은 화학적으로 변형된 뉴클레오시드가 없는 대응 구조체(V117.19, 서열번호 5 및 V120.2, 서열번호 9)에 비해 편집 활성의 감소를 보였다. 특히, 본 발명의 모든 구체예의 편집 활성은 WO 2020/001793에 개시된 선행 기술(V25.1, 서열번호 12)에 비해 크게 개선되었다. 이는 인터페론-α("+ IFN")를 추가하여 V25.1 올리고리보뉴클레오티드에 의한 편집을 강화한 후에도 마찬가지였다.
실시예 6: 내인성 ADAR에 의해 L157 부위에서 내인성 인간 GAPDH 전사체를 편집하기 위한 구조체의 자연적 흡수(gymnotic uptake)
본 실시예의 결과는 도 5에 도시된다. 본 발명에 따른 구조체는 올리고뉴클레오티드가 보조 수단 없이 암 세포주 및 인간 일차 세포의 표적 부위에 도달한다는 것을 의미하는 소위 "네이키드 흡수(naked uptake)"를 허용하는 것으로 나타났다. 피리미딘 뉴클레오시드에 변형이 없으면, 네이키드 흡수는 덜 효과적이라는 것에 유의해야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예를 또한 형질감염제의 보조 없이 인간 하우스키핑 유전자(GAPDH)를 편집하는 능력(자연적 흡수(gymnosis))에 대해 테스트하였다. 이 실시예에 이용된 구조체가 표 6에 열거된다.
HeLa 세포를 DMEM + 3% FBS에서 배양했다. 이를 위해, 24-웰당 104개의 HeLa 세포를 500㎕ 배지/웰에 접종하고, 24시간 동안 인큐베이션했다. 24시간 후, 배지를 5 μM, 1 μM, 0.2 μM 및 0 μM ASO를 포함하는 배지로 교체했다. 각 웰은 구조체 함유 배지 300㎕를 포함했고, 5일 후에 교체되었다. HeLa 세포를 5일 후에 추가로 탈착(detach)시키고, 50%씩 분리했다. 3일, 5일, 7일 및 10일 후에 RNA 단리 및 Sanger 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
일차 세포의 경우, 104개 세포/웰 RPE, NBE 및 NHA를 각 배지에 24-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후 배지를 250㎕ 배지로 교체하고 OptiMEM 중 ASO 50㎕를 5μM의 최종 ASO 농도로 첨가했다. 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후 3 또는 5일 후에 RNA 단리를 위해 세포를 수확했다.
도 5의 A에 도시된 바와 같이, 구조체 v117.29(서열번호 24)는 처리된 HeLa 세포에 쉽게 흡수되고, 형질감염제의 첨가 없이, 높은 편집 활성을 나타낸다. HeLa 세포를 1μM 구조체로 10일 동안 처리했을 때 최상의 결과를 얻었다. 편집 효과는 배지 중 V117.29(5μM 또는 0.2μM) 농도의 변화에서 볼 수 있듯이 용량 의존적이었다. 특히, V117.29에 비해 추가적인 안정화 화학적 변형이 없고 혈청에서 빠르게 분해되는 구조체 V117.19(서열번호 5) 1 μM의 첨가(실시예 4 참조)는 7일 및 10일의 처리 후에 HeLa에서 편집 활성을 거의 보이지 않으나, V117.29는 이러한 조건에서 가장 잘 작동한다. 이는 본 발명에 개시된 화학적 변형 패턴이 올리고뉴클레오티드의 자연적 흡수 하에서 편집을 달성할 수 있고 그를 위해 요구된다는 것을 명확하게 보여준다.
처리된 일차 세포(도 5의 B에 표시된, RPE, NHA 및 NHBE 세포)도 충분한 양의 구조체 V117.29가 편집을 달성하기 위해 형질감염 시약의 보조 없이 흡수된다는 것을 보여준다. HeLa 세포의 1 μM 조건과 마찬가지로, 편집 효과는 처리 3일 대비 5일 후에 증가된다. 결론적으로, 안정화된 구조체의 자연적 흡수는 세포주 및 일차 세포 모두에서 가능하며, 내인성 ADAR을 이용하여 내인성 전사체의 편집을 달성하기에 충분히 효율적이다.
실시예 7: 내인성 ADAR에 의한 Y701 부위에서 내인성 인간 STAT1 전사체의 편집.
실시예 7의 결과가 도 6에 도시된다. 선행 기술(v25.1)에 비해 뚜렷한 안정화 및 편집 수율의 큰 개선을 확인할 수 있다. 일차 세포에서, 편집 수율은 약 10배 향상된다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 안정화가 잘 수용되어, 높은 편집 수율이 수득된다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 2에서 내인성 인간 GAPDH L157 부위를 표적화하는 구조체에 대해 이전에 수행된 바와 같이, 인산화 부위 Y701에서 내인성 인간 STAT1 전사체를 표적화하는 본 발명의 바람직한 구조체 3개를 2개의 상이한 세포주(Huh7 및 HeLa 세포) 및 3개의 상이한 일차 세포(NHA, NHBE 및 RPE 세포)에서 테스트했다. 구조체는 2개의 버전, 화학적으로 안정화된 버전(V117.28, 서열번호 27)과 화학적으로 안정화되지 않은 버전(V120.2, 서열번호 25 및 V117.19, 서열번호 26)이었다. 본 실시예에 이용된 구조체의 서열이 표 7에 열거된다.
종양 세포주는 실시예 2에 기술된 바와 같이 처리하고, 일차 세포는 실시예 5에 기술된 바와 같이 처리했다. 요약하면, 24-웰당 1x105개 세포를 25 pmol 구조체로 전향적 형질감염시키고, Sanger 시퀀싱을 위해 24시간 후에 RNA를 단리했다.
도 6의 A에 도시된 바와 같이, V117.19는 테스트된 모든 세포 유형에서 높은 편집 활성을 보여주었다. 구조체 V117.28의 피리미딘 뉴클레오시드에 추가적인 안정화 화학적 변형을 포함시키는 것은 상응하는 덜 안정한 구조체 V117.19에 비해 편집 활성을 손상시키지 않았다(도 6의 B 참조). V117.19가 더 짧고 보다 화학적으로 안정되나, 두 대칭적 구조체 모두의 편집 활성은 HeLa 세포에서 선행 기술 V25.1(서열번호 28)에 비해 거의 3배 개선되었고, RPE 세포에서는 8배 이상 개선되었다. 비대칭적 구체예, V120.2도 편집 활성을 보였으나, V117.19 및 V117.28에 비해 더 낮았다. 신규한 구조체 중 어느 것에서도, 편집 활성은 선행 기술 V25.1(WO 2020/001793에 개시됨)의 경우와 마찬가지로, 인터페론-α의 첨가("+ IFN")를 통해 강화될 수 없었다. 종합적으로, 본 발명은 IFN 처리와 관계없이, 선행 기술 솔루션보다 더 짧은 구조체에 의해, 명확하게 더 우수한 편집 수율을 제공했다.
실시예 8: 내인성 ADAR에 의한 인간 STAT1 유전자의 내인성 Y701 부위를 표적으로 하는 구조체의 안정화(도 6의 B 참조).
실시예 4에서 앞서 검토된 바와 같이, RNase와 같은 내인성 환경에서 방어 메커니즘에 대한 구조체의 안정화가 본 발명에 대한 치료적 전망을 가능하게 하는 데 필수적이다. 이를 위해, (V117.28, 서열번호 27)의 존재 및 (V117.19, 서열번호 26)의 부재 하에 본 발명의 바람직한 구체예를 7일 동안 10% 소 태아 혈청에서 안정성에 대해 테스트했다. 서열 및 변형은 표 7에서 확인된다. 결과는 실시예 4에 이미 기술된 바와 같이 수득했다.
도 6의 B에 도시된 바와 같이, 변형된 피리미딘 뉴클레오시드를 구조체(V117.28)에 포함시키면 화학적으로 변형된 뉴클레오시드가 결여된 구조체(V117.19)에 비해 10% FBS에서 수명이 크게 개선된다. V25.1(서열번호 28, WO 2020/001793에 개시됨)과 비교하여 실시예 7의 구조체의 탁월한 편집 활성을 고려할 때, 이러한 구조체는 선행 기술에 비해 명백한 개선이다.
실시예 9: 내인성 ADAR에 의한 마우스 MECP2 전사체의 질병-유발 W104X 돌연변이의 편집
도 7은 질병-관련 모델 시스템(disease-relevant model system)에서 높은 편집 효능을 보여준다. 도 7은 특히 FBS 분석(도 7의 C)에서 표시된 것처럼 안정화 후 우수한 수율을 보여준다. 도 7의 B)는 V120.2 대 V120.22의 비교에 의해 나타난 바와 같이 비대칭 구체예에서도, 바람직한 비대칭 구조가 있다는 것을 보여준다.
질병을 유발하는 마우스 MECP2 유전자의 W104X 돌연변이를 표적으로 하는 구조체를 두 가지 상이한 접근법을 통해 테스트하였다: 플라스미드 상의 표적 cDNA로 형질감염된 HeLa 세포 또는 piggyBac 트랜스포사아제(transposase) 시스템을 통해 질병을 유발하는 MECP2 W104X 돌연변이 cDNA가 게놈에 안정적으로 통합된 HeLa 세포. 구조체는 불안정하거나(V120.2, 서열번호 29) 또는 변형에 의해 추가로 화학적으로 안정화되었다(V120.21, 서열번호 30). 본 실시예에서 이용된 구조체의 서열이 표 8에 열거된다.
플라스미드-형질감염 접근법("플라스미드")의 경우, 5 x 104개 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, 마우스 MECP2 W104X cDNA 유전자를 함유한 플라스미드로 세포를 전향적 형질감염시켰다. 300 ng 플라스미드 및 0.9 ㎕ FuGENE® 6(Promega)을 각각 50㎕ Opti-MEM에 희석하고 5분간 인큐베이션하고, 합쳐서 추가로 20분간 인큐베이션했다. 배지를 교체하고(IFN 처리된 세포의 경우 15,000U/웰 IFN-α로 보충) 형질감염 믹스(transfection mix)를 하나의 웰에 고르게 분포시켰다. 플라스미드 형질감염 24시간 후, 세포를 25 pmol 구조체/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)으로 전향적 형질감염시켰다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
piggyBac 접근법("PiggyBac")의 경우, piggyBac 트랜스포사아제 시스템을 통해 게놈에 안정적으로 통합된 마우스 MECP2 W104X cDNA 유전자를 포함하는 HeLa 세포 1 x 105 개를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, 25 pmol 구조물/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 플라스미드 접근법에 대해 설명한 대로 세포를 전향적 형질감염시켰다. 구조체의 형질감염 전에, IFN-처리된 세포에 3,000U/웰 IFN-α를 보충했다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
도 7의 A에 도시된 바와 같이, 불안정한 구조체 V120.2 및 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드로 안정화된 구조체 V120.21 모두에서 비슷한 수준까지 효율적인 편집 활성이 가능했다. 두 구조체 모두 플라스미드 기반 접근법에서 동일하게 잘 수행되었지만, piggyBac 접근 방식에서 V120.2에 비해 V120.21의 작은 감소를 볼 수 있다. 이전 실시예에서도 이미 볼 수 있듯이, 인터페론 첨가("+IFN") 후 구조체 중 어느 것도 편집 활성에서 큰 차이를 보이지 않는다.
("+ IFN").
실시예 10: 내인성 ADAR에 의한 마우스 MECP2 전사체의 질병 유발 W104X 돌연변이의 편집 수율에 대한 비대칭 일반 구조체 설계의 역위(inversion)의 효과(도 7의 B 참조).
비대칭 구조의 경우, 짧은 구조체의 3'-말단을 향한 중심 염기 트리플렛의 배치는 동일한 길이의 대칭적 구조체에 비해 편집 활성을 개선시킨다는 것이 이미 확인되었다. 특히 실시예 3A의 V120.2(서열번호 29)에 대한 비대칭 구조체의 기본 설계가 역위되어, 일반적으로 구조체의 3'-말단에 위치하는 중심 염기 트리플렛이 구조체의 5'-말단에서 발견된다(V120.22, 서열번호 31). 본 실시예에서 이용된 구조체의 서열이 표 8에 열거된다. HeLa 세포는 실시예 9의 플라스미드-형질감염 접근법에 대해 이전에 설명한 바와 같이 처리했다.
도 7의 B에 도시된 바와 같이, 중심 염기 트리플렛의 통상적 위치(V120.2, 서열번호 29)를 반대편으로의 역위(V120.22, 서열번호 31)는 편집 활성에 유해한 영향을 미쳐, 편집 활성을 거의 절반으로 감소시킨다. 따라서, 비대칭 구체예를 위한 중심 염기 트리플렛의 배치는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단을 향하는 것이 바람직하다는 것이 분명하다.
실시예 11: 내인성 ADAR에 의한 마우스 MECP2 전사체의 질병 유발 W104X 돌연변이를 표적으로 하는 구조체의 안정화(도 7의 C 참조).
실시예 4에서 이전에 논의된 바와 같이, RNase와 같은 내인성 환경에서 방어 메커니즘에 대한 구조체의 안정화는 본 발명에 대한 치료적 전망을 가능하게 하는 데 필수적이다. 이를 위해, 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드를 갖는 본 발명의 바람직한 구체예 (V120.21, 서열번호 30) 및 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드를 갖지 않는 본 발명의 바람직한 구체예(V120.2, 서열번호 29)를 7일 동안 10% 소 태아 혈청에서 안정성에 대해 테스트했다. 서열 및 변형은 표 8에서 확인할 수 있다. 결과는 실시예 4에서 앞서 기술된 바와 같이 얻어졌다.
도 7의 C에 도시된 바와 같이, 변형된 피리미딘 뉴클레오시드를 구조체에 포함하면(V120.21) 구조체가 10% FBS에서 7일 이상 견딜 수 있는 반면, 불안정한 구조체(V120.2)은 거의 즉시 분해된다.
실시예 12: 내인성 ADAR에 의한 헐러(Hurler) 증후군 환자 섬유아세포의 인간 IDUA 전사체에서 질병 유발 W402X 돌연변이의 편집(도 8의 A).
도 8은 질병 관련 테스트 시스템의 결과를 보여준다. 표적 RNA는 환자의 섬유아세포에서 내인적으로 발현된다. 안정화는 달성되나, 편집 효능의 측면에서는 불리하다.
IDUA 유전자의 생식 계열 돌연변이(germline mutation)는 IDUA 유전자의 코딩된 효소인 α-L-이두로니다아제(α-L-iduronidase)가 결함이 있어 다당류 분해에 참여할 수 없는 것인 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease)인 I형 뮤코다당증의 빈번한 원인이다. 이는 리소좀에 글리코사미노글리칸(GAG)의 축적을 초래하고, 환자가 경미한 건강 문제와 정상적인 수명을 갖는 경증 샤이에 증후군(milder Scheie syndrome)부터 환자가 아동기 동안 치사(lethality)까지 주요한 건강 문제를 겪는 것인 보다 중증의 헐러 증후군(Hurler syndrome)에 이르기까지 다양한 정도의 중증도를 보인다. IDUA 유전자의 동형접합성 W402X 돌연변이는 중증 헐러 증후군의 근본 원인 중 하나이며, 질병 RNA(diseased RNA)를 편집하고 효소 기능을 회복시키려는 시도에서 이 실시예에서 해당 구조체의 원하는 표적이다(실시예 13 참조). 해당 구조체 서열은 표 9에서 찾을 수 있다.
경증 샤이에 증후군("Scheie", GM01323), 중증 헐러 증후군(GM06214) 환자 및 건강한 기증자("healthy", GM05659)의 섬유아세포는 미국 Coriell Institute for Medical Research(미국)에서 구입했다. 섬유아세포는 15% FBS를 함유한 DMEM에서 배양했다. 2.5ml DMEM 및 15% FBS 중 2.5 x 105개 세포/웰을 6-웰 플레이트에 접종했다. 접종 후 24시간 경과 시에 각각 250㎕ Opti-MEM에 희석된 125 pmol 구조체 및 7.5㎕ Lipofectamine RNAiMAX 시약을 이용하여 전향적 형질감염(forward transfection)을 수행했다. 두 용액을 5분간 인큐베이션한 후 조합하고 추가로 20분간 인큐베이션한 후 형질감염 믹스를 하나의 웰에 고르게 분포시켰다. 샤이에 증후군과 건강한 섬유아세포를 어떠한 구조체도 첨가하지 않은 형질감염 믹스로 처리했다. 형질감염 후 24시간에 배지를 교체했다. 형질감염 후 48시간에, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 섬유아세포를 수확했다.
도 8의 A에 도시된 바와 같이, 표적 아데노신을 둘러싼 인트론 서열을 표적화하는 대칭적 구체예(V117.19 인트론, 서열번호 35 및 V117.28 인트론, 서열번호 36)는 낮은 편집 활성만을 보였다. 대조적으로, 표적 아데노신 주위의 성숙 mRNA 서열을 표적화하는 구조체(V117.19 엑손, 서열번호 32)는 샤이에 증후군 섬유아세포에서 발견된 것과 비교하여 교정된(corrected) mRNA 비율을 능가하는 매우 높은 편집 활성을 보인다. 그러나, 구조체에 안정화 변형의 첨가시(V117.20 엑손, 서열번호 33 및 V117.21 엑손, 서열번호 34), 편집 수율은 덜 안정한 대응물인 v117.19 엑손에 비해 저하되었다. 최종적으로, 비대칭 구체예 V120.2(서열번호 37)도 샤이에 증후군 섬유아세포에서 발견되는 수준에 가까운 수준에 도달하는 우수한 편집 활성을 나타낸다. 비대칭 구체예의 경우, 구조체에 피리미딘 뉴클레오시드의 안정화 변형을 추가하면(V120.17, 서열번호 38), 편집 효율성이 어느 정도 감소한다.
실시예 13: 인간 IDUA 전사체에서 질병을 유발하는 W402X 돌연변이를 표적화하는 구조체로 처리된 헐러 증후군 환자 섬유아세포로부터의 세포 용해물의 α-L-이두로니다아제 분석(도 8의 B).
구조체(실시예 12에 기술됨)에 의한 RNA 편집을 통해 W402X 돌연변이된 α-L-이두로니다아제의 단백질 기능을 회복시키려는 시도로, 다양한 구조체로 처리된 섬유아세포의 용해물을 사용하여 α-L-이두로니다아제 분석을 수행했다. 상응하는 구조물 서열은 표 9에서 찾을 수 있다.
환자 섬유아세포를 실시예 12에 기재된 바와 같이 처리하고, 접종하고, 형질감염시켰다. 테스트된 각 구조체에 대해, 2개의 6-웰이 사용되었다. 형질감염 후 48시간에, 섬유아세포를 탈착시키고, PBS로 1회 세척했다. PBS 중 0.5% Triton X-100 40 ㎕를 세포 펠렛에 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하고, α-L-이두로니다아제 효소 분석을 수행했다. 4-메틸움벨리페론(methylumbelliferone)의 표준 희석 시리즈를 준비했다(0 - 160 μM). 표준 희석 계열의 각 농도에 대해, 표준 용액 25 ㎕를 96-웰 플레이트의 0.4M 포름산나트륨 완충액(pH 3.5) 25㎕에 첨가했다. 섬유아세포 샘플의 경우, 각 용액 25㎕를 96-웰에 첨가하고 기질 용액(0.4M 포름산나트륨 완충액, pH 3.5 중 180 μM 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로니드(α-L-iduronide) 25㎕와 혼합했다. 반응물을 37℃서 90분 동안 인큐베이션하고, 200 ㎕의 글리신 카르보네이트 버터(glycine carbonate butter)(pH 10.4)를 웰에 첨가하여 효소 활성을 중단시켰다. 4-메틸움벨리페론의 형광은 Tecan Spark 10M 플레이트 리더를 사용하여 λem = 460nm의 방출 파장에서 λex = 355nm의 여기 파장으로 측정되었다. 계산된 효소 활성은 단백질 양(BCA 분석으로 측정)을 참조하고 샤이에 용해물의 효소 활성으로 표준화시켰다.
도 8의 B에서 볼 수 있듯이, 결과는 샤이에 증후군 섬유아세포의 용해물에서 α-L-이두로니다아제의 효소 활성(100%로 설정)으로 표준화되었으며, 이는 또한 단백질 회복(restoration)에 필요한 최저 치료 역치를 결정한다. 기준(reference)으로서, 미처리(untreated) 헐러 증후군 섬유아세포("no ASO")는 샤이에 증후군 섬유아세포에서 관찰된 것보다 약 3배 더 낮은 α-L-이두로니다아제 활성을 나타낸 반면, 건강한 섬유아세포("healthy")는 약 700배 더 높은 α-L-이두로니다아제 활성을 나타냈다.
인트론 IDUA mRNA(V117.19 인트론, 서열번호 35 및 V117.28 인트론, 서열번호 36)를 표적화하는 구조체 2개 모두는 매우 효율적인 단백질 회복을 달성하지 목하고, 샤이에 증후군 섬유아세포에서의 양의 절반과 3/4 사이의 α-L-이두로니다아제 활성 수준에 도달했다.
비대칭 구조체(V120.2, 서열번호 37 및 V120.17, 서열번호 38), 및 안정화된 대칭 구조체(V117.20 엑손, 서열번호 33 및 V117.21 엑손, 서열번호 34) 모두는 샤이에 증후군 섬유아세포에서 발견된 것과 유사하거나 약간 높은 α-L-이두로니다아제 활성 수준을 나타낸다. 마지막으로, 성숙한 mRNA인 V117.19 엑손(서열번호 32)을 표적으로 하는 불안정한 대칭 구조체는 샤이에 증후군 섬유아세포 수준에 비해 6배 높은 α-L-이두로니다아제 활성 수준을 보인다. 전반적으로, 이는 본 발명이 치료 효과를 약속하는 수준까지 단백질 기능을 회복시킬 수 있음을 나타낸다. 이는 또한 편집 효율성에 영향을 주었음에도 불구하고 완전한 안정화 화학적 변형 패턴을 갖는 일부 구체예의 경우에도 마찬가지였다.
실시예 14: 내인성 ADAR에 의한 인간 IDUA 전사체의 질병 유발 W402X 돌연변이를 표적화하는 구조체의 안정화(도 8C 참조).
실시예 4에서 논의된 바와 같이, RNase와 같은 내인성 환경에서 방어 메커니즘에 대한 구조체의 안정화는 본 발명에 대한 치료 전망을 가능하게 하는 데 필수적이다. 이를 위해, 피리미딘 뉴클레오티드에서의 화학적 변형의 도입에 의한 안정화를 갖는 본 발명의 바람직한 구체예(V120.17, 서열번호 38; V117.20 엑손, 서열번호 33; V117.21 엑손, 서열번호 34 및 V117.28 인트론, 서열번호 36) 및 피리미딘 뉴클레오티드에서의 화학적 변형의 도입에 의한 안정화를 갖지 않는 본 발명의 바람직한 구체예(V120.2, 서열번호 37; V117.19 인트론, 서열번호 35 및 V117.19 엑손, 서열번호 32)를 7일에 걸쳐 10% 소 태아 혈청에서 안정성에 대해 테스트했다. 서열 및 변형은 표 9에서 확인된다. 결과는 실시예 4에서 앞서 기술된 바와 같이 얻었다.
도 8의 C에 도시된 바와 같이, 변형된 피리미딘 뉴클레오시드의 구조체로의 포함(V120.17, 서열번호 38; V117.20 엑손, 서열번호 33; V117.21 엑손, 서열번호 34 및 V117.28 인트론, 서열번호 36)은 구조체가 10% FBS에서 7일 이상 견딜 수 있게 하나, 불안정한 구조체(V120.2, 서열번호 37; V117.19 인트론, 서열번호 35 및 V117.19 엑손, 서열번호 32)은 거의 즉시 분해된다. 전반적으로, 이는 도입된 화학적 변형의 안정화 효과를 명확하게 보여준다.
실시예 15: 내인성 ADAR에 의한 마우스 IDUA 전사체에서 질병 유발 W392X 돌연변이의 편집.
도 9는 실시예 15(도 9의 A), 실시예 16(도 9의 B) 및 실시예 17(도 9의 C)의 결과를 보여준다.
마우스 IDUA 전사체의 W392X 돌연변이는 실시예 12에 간략하게 기술된, 인간 IDUA 유전자의 W402X 돌연변이와 동등하다. 마우스의 질병 유발 돌연변이를 표적으로 하는 구조체를 편집 활성 및 단백질 회복에 대해 테스트했다(실시예 16 참조). 구조체 서열이 표 10에 표시된다.
5x104 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, 마우스 W392X 돌연변이 IDUA cDNA를 함유한 플라스미드로 세포를 전향적 형질감염시켰다. 300 ng 플라스미드 및 0.9 ㎕ FuGENE® 6(Promega)을 각각 50 ㎕ Opti-MEM에 희석하고 5분간 인큐베이션하고, 그 후, 조합하고, 추가로 20분간 배양했다. 배지를 교체하고, 형질감염 믹스를 하나의 웰에 고르게 분포시켰다. 플라스미드 형질감염 후 24시간 에, 세포를 25 pmol ASO/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)으로 전향적 형질감염시켰다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
도 9의 A에 도시된 바와 같이, 불안정한 구조체, V120.2(서열번호 40)를 사용하여 상대적으로 우수한 편집 활성이 달성된다. 안정화 변형을 포함하는 2개의 구조체 (V120.21, 서열번호 41 및 V120.23, 서열번호 42) 모두는 V120.2에 비해 편집 활성의 일부를 잃는다. 피리미딘 뉴클레오시드의 당 모이어티에 2'-플루오로 및 2'O-메틸 변형의 교대 혼합물(alternating mixture)을 보유하는 구조체 V120.23은 2'-플루오로 변형만을 보유하는 V120.21에 비해 약간 더 높은 편집 활성을 보여서, 2'-F와 2'O-메틸을 혼합하면 편집 효율성을 지원할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 16: 마우스 IDUA 전사체에서 질병을 유발하는 W392X 돌연변이를 표적화하는 구조체로 처리된 HeLa 세포로부터의 세포 용해물의 α-L-이두로니다아제 분석(도 9의 B).
편집된 IDUA RNA의 회복된 α-L-이두로니다아제 단백질로의 전달을 결정하기 위해, α-L-이두로니다아제 효소 분석을 수행했다. 절대적 활성 결과는 마우스 IDUA 야생형 cDNA를 포함하는 플라스미드로 형질감염된 HeLa 세포의 α-L-이두로니다아제 활성 대비 상대화(relativize)되었다. 구조체 서열은 표 10에 제공된다.
HeLa 세포를 실시예 15에 기술된 대로 24-웰 당 5x104 세포, 300 ng 플라스미드 및 25 pmol 구조체로 처리하고, 접종하고, 형질감염시켰다. 야생형 기준 데이터를 제공하기 위해, HeLa 세포를 마우스 IDUA 야생형 cDNA를 포함하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 각 설정에 대해, 하나의 24-웰을 사용하였다. 구조체의 형질감염 후 24시간에, α-L-이두로니다아제 효소 분석을 위해 세포를 100 ㎕ M-PER 완충액(Thermo Scientific)에서 용해시켰다. Bradford 분석을 통해 달성된 단백질 양의 결정을 제외하고, 실시예 13에 기술된 바와 같이 샘플의 추가 처리를 수행하였다.
도 9의 B에서 볼 수 있듯이, α-L-이두로니다아제 분석 결과는 도 9의 A(실시예 15)로부터의 편집 데이터에서 이미 명백한 것을 도시한다. 안정화 변형을 포함하는 두 구조체 모두(V120.21, 서열번호 41 및 V120.23, 서열번호 42)는 V120.2(서열번호 40)에 비해 α-L-이두로니다아제 활성을 부분적으로 저하시켰다. 그러나, 편집 결과와 비교하여, 피리미딘 뉴클레오시드에서 2'-플루오로 및 2'O-메틸 변형의 교대 패턴을 갖는 구조체 V120.23은 피리미딘 뉴클레오시드에서 2'-플루오로 변형만 갖는 V120.21에 비해 분명히 더 높은 편집 활성을 보여서, 2'-F와 2'O-메틸을 혼합하면 편집 효율성을 지원할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 17: 내인성 ADAR에 의한 마우스 IDUA 전사체의 질병 유발 W392X 돌연변이를 표적화하는 구조체의 안정화(도 9의 C).
실시예 4에서 논의된 바와 같이, 혈청에서 발견되는 것과 같은 RNase에 대한 구조체 안정화는 본 발명에 대한 치료 전망을 가능하게 하는 데 필수적이다. 이를 위해, 피리미딘 뉴클레오티드에서의 화학적 변형의 도입에 의한 안정화를 갖는 본 발명의 바람직한 구체예(V120.21, 서열번호 41) 및 피리미딘 뉴클레오티드에서의 화학적 변형의 도입에 의한 안정화를 갖지 않는 본 발명의 바람직한 구체예(V120.2, 서열번호 40)를 7일에 걸쳐 10% 소 태아 혈청에서 안정성에 대해 테스트했다. 구조체 서열이 표 10에 제공된다. 결과는 실시예 4에서 앞서 기술된 바와 같이 얻었다.
도 9의 C에 도시된 바와 같이, 변형된 피리미딘 뉴클레오시드의 구조체로의 포함(V120.21)은 구조체가 10% FBS에서 7일 이상 견딜 수 있게 하나, 불안정한 구조체(V120.2)는 거의 즉시 분해되어, 다시, 수득된 안정화 효과를 보여준다.
실시예 18: 내인성 ADAR에 의한 마우스 PDE6A 전사체에서 질병 유발 V685M 돌연변이의 편집(도 10의 A).
두 가지 바람직한 구체예 V117.19 및 V120.2는 여러 다른 표적에 대해 앞서 테스트되었다(도 3의 A 및 B에 도시된 방식). 색소성 망막염을 통해 점진적인 실명을 유발하고 5'-UAU-3' 맥락에서 아데노신에 의해 유발되는, 마우스 PDE6A 유전자의 질병 유발 V685M 돌연변이 부위에 대해 설계된 구조체의 편집 활성을 조사했다. 구조체의 목록이 표 11에 제공된다.
5x104 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, 마우스 PDE6A V685M cDNA를 포함하는 플라스미드로 세포를 전향적 형질감염시켰다. 300 ng 플라스미드 및 0.9 ㎕ FuGENE® 6(Promega)을 각각 50 ㎕ Opti-MEM에 희석하고 5분간 인큐베이션하고, 그 후, 조합하고, 추가로 20분간 배양했다. 배지를 교체하고, 형질감염 믹스를 하나의 웰에 고르게 분포시켰다. 플라스미드 형질감염 후 24시간 에, 세포를 25 pmol ASO/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)으로 전향적 형질감염시켰다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
도 10의 A에 도시된 바와 같이, 불안정한, 대칭 구조체 (V117.19, 서열번호 43)는 가장 높은 편집 활성을 보인다. 구조체 (V117.20, 서열번호 44 및 V117.21, 서열번호 45)가 안정화 변형을 포함하면, 인간 IDUA 유전자의 W402X 부위를 표적화하는 대칭적 구조체(서열번호 32-36)에 대해 실시예 12에서 관찰된 바와 유사하게, 구조체의 편집 활성이 떨어진다.
비대칭 구조체의 경우, 그 반대가 관찰될 수 있다. 불안정한 구조체 V120.2(서열번호 46)는 안정화된 구조체, V120.3(서열번호 47)에 비해 약간 더 낮은 편집 활성을 갖는다. 대칭 구조체의 경우 안정화 시 편집 활성의 감소는 관찰되지 않는다.
실시예 19: 내인성 ADAR에 의한 인간 PDE6A 전사체에서 질병 유발 V685M 돌연변이의 편집(도 10의 B).
구체예 V117.19 및 V120.2는 이미 제시된 수많은 다른 표적에 대해 매우 선호된다. 실시예 18에 대해 앞서 기술된 바와 같이, PDE6A 유전자- 이번에는 인간 -의 V685M 돌연변이는 본 발명이 적용될 수 있는 또 다른 잠재적 부위이다. 마우스 유전자와 달리, 인간 유전자의 표적 아데노신은 5'-CAU-3' 맥락의 일부이다. 구조체의 목록이 표 12에 제공된다.
결과는 실시예 18에 기술된 바와 같이 얻었다. 그러나 HeLa 세포를 마우스 PDE6A 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질감염시키는 대신, 돌연변이된 인간 PDE6A V685M cDNA를 포함하는 플라스미드로 형질감염시켰다.
전체 편집 수율이 실시예 18에서 마우스 상황에 대한 경우만큼 높지 않다는 것이 분명하나, 도 10의 B에 제시된 구조체 편집 활성도 선택된 설정 및 유전자에 대한 본 발명의 적용 가능성을 증명하는 것이 명확하다. 전반적으로 낮은 편집 활성은 마우스 유전자(5'-UAU)에서 더 선호되는 상황(context)과 비교하여 ADAR이 인간 유전자(5'-CAU)에서 표적 아데노신을 검출하는 덜 선호되는 편집 상황에 의해 유발될 수 있다.
V117.19(서열번호 48)는 가장 높은 전체 편집 활성을 보인다. 흥미롭게도, 실시예 18에서 마우스 유전자에 대해 이미 본 바와 같이, 안정한 비대칭 구조체 V120.17(서열번호 50)는 상응하는 불안정한 구조체 V120.2(서열번호 49)보다 약간 더 높은 편집 활성을 보인다.
실시예 20: 내인성 ADAR에 의한 마우스 PDE6A 전사체의 질병 유발 V685M 돌연변이를 표적화하는 구조체의 안정화(도 10의 C).
실시예 4에서 논의된 바와 같이, 혈청에서 발견되는 RNase와 같은 내인성 방어 메커니즘에 대해 안정한 구조체가 본 발명의 치료 전망을 위해 바람직하다. 이를 위해, 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형 도입에 의한 안정화를 갖는 (V117.20, 서열번호 44) 및 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형 도입에 의한 안정화를 갖지 않는 (V117.19, 서열번호 43) 실시예 18에서 이용된 바람직한 구체예를 7일에 걸쳐 10% 소 태아 혈청에서 안정성에 대해 테스트했다. 구조체 서열은 표 11에 제공된다. 결과는 실시예 4에 기술된 바와 같이 얻어졌다.
도 10의 C에 도시된 바와 같이, 변형된 피리미딘 뉴클레오시드의 구조체 내로의 포함(V117.20, 서열번호 44)은 구조체가 10% FBS에서 7일 이상 견딜 수 있게 하나, 불안정한 구조체(V117.19, 서열번호 43)는 거의 즉시 분해된다.
실시예 21: 내인성 ADAR에 의한 인간 SERPINA1 전사체에서 질병 유발 E342K 돌연변이의 편집(도 11의 A).
SERPINA1 유전자는 자가-분해(self-digestion)로부터 특히 얇은 조직을 보호하는 간에서 합성되는 중요한 프로테아제 억제제인 α-1-항트립신(A1AT) 단백질을 코딩한다. 간으로부터, 결국 혈류로 분비되고, 전신으로 퍼진다. SERPINA1 유전자의 생식 계열 돌연변이는 다양한 중증도의 A1AT 기능 장애를 유발할 수 있다. 심각한 E342K 돌연변이는 A1AT 단백질의 미스폴딩(misfolding)을 유발하여, A1AT 단백질이 더 이상 혈류로 적절하게 분비되지 않다. 이는 A1AT의 과잉 축적으로 인한 간질환 및 A1AT 부족으로 인한 폐질환을 유발한다. E342K 돌연변이의 근원적인 표적 아데노신은 5'-CAA-3' 상황에 있다.
인간 SERPINA1 유전자의 질병 유발 E342K 돌연변이를 표적화하는 구조체는 두 가지 상이한 접근법을 통해 테스트되었다: 플라스미드 상의 표적 cDNA로 형질감염된 HeLa 세포에서 또는 piggyBac 트랜스포사아제 시스템을 통해 게놈 내에 안정하게 통합된 질병 유발 E342K SERPINA1 돌연변이 cDNA를 갖는 HeLa 세포. 구조체는 불안정하거나(V117.19, 서열번호 51 및 V120.2, 서열번호 55) 또는 변형된 피리미딘 뉴클레오시드에 의해 화학적으로 안정화되었다(V117.24, 서열번호 52; V117.25, 서열번호 53, V117.26, 서열번호 54, 및 V120.10, 서열번호 56). 본 실시예에 이용된 구조체의 서열이 표 13에 열거된다.
플라스미드 형질감염 접근법("플라스미드")의 경우, 2.5x104 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, 인간 SERPINA1 E342K 돌연변이 cDNA 또는 SERPINA1 건강한 cDNA("야생형(wildtype)")를 함유하는 플라스미드로 세포를 전향적 형질감염시켰다. 300 ng 플라스미드 및 0.9 ㎕ FuGENE® 6(Promega)을 각각 50㎕ Opti-MEM에 희석하고 5분간 인큐베이션하고, 그 후, 조합하고, 추가로 20분간 인큐베이션했다. 배지를 교체하고, 형질감염 믹스를 하나의 웰에 고르게 분포시켰다. 플라스미드 형질감염 후 24시간에, 세포를 5 pmol 구조체/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)으로 전향적 형질감염시켰다. 24시간 후, 배지를 교체했다. 형질감염 후 48시간에, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확하였다.
piggyBac 트랜스포사아제 접근법("PiggyBac")의 경우, piggyBac 트랜스포사아제 시스템을 통해 게놈에 안정적으로 통합된 인간 SERPINA1 E342K 돌연변이 cDNA 유전자 또는 SERPINA1 야생형 유전자("야생형")를 포함하는 1 x 105 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, 세포를 25 pmol 구조체/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)으로 전향적 형질감염시켰다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
도 11의 A에 도시된 바와 같이, 불안정한 대칭 구조체 V117.19(서열번호 51) 및 V117.24(서열번호 52) 및 안정하고 불안정한 비대칭 구조체 V120.2(서열번호 55) 및 V120.10(서열번호 56)의 편집 활성은 piggyBac 및 플라스미드 접근법 모두에서 중간 수준(moderate)이다. 그러나, 구아노신 염기 대신 중심 염기 트리플렛의 가장 먼 3' 위치에 이노신 염기를 도입하면, 구조체(V117.25, 서열번호 53, 특히 V117.26, 서열번호 54)의 편집 활성은 두 구조체 모두 일반적으로, 상응하는 불안정한 구조체에 비해 편집 활성의 감소를 초래하는 안정화 변형을 포함하나, 강한 증가를 보인다. 다시, 실시예 16(도 9)에서 이미 알 수 있듯이, 피리미딘 뉴클레오시드에서 단지 2'-F 대신 2'-F와 2'-O-메틸의 혼합물은 편집 수율을 개선시켰다(V117.25 대 117.26).
실시예 22: 인간 SERPINA1 전사체의 E342K 돌연변이 부위를 표적화하는 구조체로 처리된 세포의 세포 상층액을 사용하여 샌드위치 ELISA로 측정한 α-1-항 트립신 의 회복(도 11의 B).
A1AT는 분비 단백질이기 때문에, 단백질 회복에 대한 성공적인 RNA 편집의 효과는 미처리 세포 대비 편집 구조체로 처리된 세포로부터 분비된 A1AT의 양을 측정하여 테스트할 수 있다. 이는 플라스미드 형질감염 접근법으로 수행되었다. 본 실시예에 사용된 구조체의 서열이 표 13에 열거된다.
HeLa 세포를 24-웰당 2.5 x 104개 세포, 300 ng 플라스미드 및 5 pmol 구조체를 사용하여 플라스미드 형질감염 접근법에 대해 기술된 바와 같이, 처리하였다. 구조체 형질감염 후 48시간에, 300 ㎕의 세포 상등액을 세포로부터 제거하고 300 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 희석 완충액(1 x PBS + 0.05% Tween-20 + 2% 소 혈청 알부민(BSA))에 1:30으로 희석하고 100 ㎕를 토끼 항-인간 α-1-항트립신 항체(A0012, Dako 덴마크 ApS)로 코팅된 Greiner Microlon® High Binding 96-웰 플레이트의 96-웰에 적용하고, 세척 완충액(1 x PBS + 0.05% Tween-20)으로 세척하고 1 x PBS 중 5% 우유로 1시간 동안 블록킹시켰다. 샘플을 3개의 반복물(triplicatE)로 측정하고, 인간 A1AT 표준(SRP6312, Sigma-Aldrich)과 함께 로딩하고 실온에서 80분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)(Biomol, A56-122P)에 접합된 염소 항-인간 A1AT 항체 100 ㎕를 1 x PBS에 1:10,000으로 희석하여 각 웰에 적용하고 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 세척 완충액으로 세척하고, OPD 기질(9 ml Millipore water, 1 ml Stable Peroxy Substrate Buffer 10x(34062, Thermo Scientific) 및 1 x OPD Tablet(34006, Thermo Scientific)) 100 ㎕를 각 플레이트에 적용하고, 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 50 ㎕의 2.5M H2SO4를 사용하여 반응을 중단시키고, Tecan Spark® 10M Plate Reader를 사용하여 λ = 490nm에서 OD 값을 즉시 판독했다. 표준으로부터 단백질 농도를 계산하고, 그 값을 야생형 세포 상층액 및 비표적화 음성 대조 구조체("GAPDH V117.19", 서열번호 5)로 형질감염된 돌연변이 세포로부터의 상등액으로 정규화시켰다.
도 11의 B에 도시된 바와 같이, 처리된 세포에 의해 분비된 A1AT 양은 실시예 21에서 확인된 편집 활성을 반영한다. 낮은 편집 활성을 보인 불안정한 구조체, V117.24(서열번호 52)도 대조군 대비 A1AT 분비를 보이지 않는다. 그러나, 중심 염기 트리플렛 중 이노신 뉴클레오시드를 갖는 안정한 버전(V117.25, 서열번호 53 및 V117.26, 서열번호 54)은 야생형 양성 대조군의 절반에 가까운 분비된 A1AT 수준을 보여준다. 다시, 실시예 15/16(도 9) 및 실시예 21에서 이미 알 수 있듯이, 피리미딘 뉴클레오시드에서 단지 2'-F 대신 2'-F와 2'-O-메틸의 혼합물은 단백질 회복을 개선시켰다(V117.25 대 117.26).
실시예 23: 내인성 ADAR에 의한 인간 SERPINA1 전사체의 질병 유발 E342K 돌연변이를 표적화하는 구조체의 안정화(도 11의 C).
실시예 4에서 논의된 바와 같이, 혈청에서 발견되는 RNase와 같은 내인성 방어 메커니즘에 대해 안정한 구조체가 본 발명의 치료 전망을 위해 바람직하다. 이를 위해 실시예 22에서 이용된, 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형의 도입에 의한 안정화를 갖는 바람직한 구체예 (V117.25, 서열번호 53 및 V117.26, 서열번호 54) 및 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형의 도입에 의한 안정화를 갖지 않는 바람직한 구체예(V117.24, 서열번호 52)를 7일에 걸쳐 10% 소 태아 혈청에서 안정성에 대해 테스트했다. 구조체 서열은 표 13에 제공된다. 결과는 실시예 4에 기술된 바와 같이 얻어졌다.
도 11의 C에 도시된 바와 같이, 및 이전 표적에 대해, V117.25 및 V117.26의 경우와 같이 구조체 내의 피리미딘 뉴클레오시드의 변형은 구조체가 7일 이상 동안 10% FBS에서 견딜 수 있게 하는 반면, 불안정한 구조체 V117.24는 즉시 분해된다. 전체적으로, 실시예 21 내지 23은 치료 적용과 관련하여 본 발명의 유망한 특성을 보여준다.
본 발명을 선행 기술과 구별하기 위해, WO 2018/041973에 개시된 2개의 올리고뉴클레오티드, ADAR60-6(본원에서, 서열번호 57) 및 ADAR60-10(본원에서, 서열번호 58)을 선택하여 동일한 조건 하에서 편집 활성 및 단백질 회복을 비교했다. 두 올리고뉴클레오티드는 모두 변형 유형, 밀도 및 배치(positioning)의 측면에서 그들의 상대적으로 가까운 유사성을 고려하여 선택되었다. 두 올리고뉴클레오티드는 모두 31개 뉴클레오티드로 구성되었으며, 여기서 중심 염기 트리플렛의 균등물은 본 발명의 바람직한 구체에인 v117.19(도 3의 B)에서와 마찬가지로 전체 구조 내에서 대칭적으로 배치되었다. 선행 기술의 올리고뉴클레오티드 백본은 양 말단 모두에서 4개의 연속 포스포로티오에이트 결합으로 구성되어, 각 말단에 25개의 연속된 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 본 실시예의 구체예 V117.25(서열번호 53) 및 V117.26(서열번호 54)에 제시된 것보다 더 적은 포스포로티오에이트 결합을 포함했다. 마지막으로, ADAR60-6은 DNA 뉴클레오시드로 완전히 구성된 중심 염기 트리플렛을 보유하나, ADAR60-10은 표적 아데노신의 반대쪽 염기에 3'-인접한 이노신 뉴클레오시드를 포함하는 중심 염기 트리플렛을 보유했다. 조합된 경우, 2개의 올리고뉴클레오티드 ADAR60-6(서열번호 57) 및 ADAR60-10(서열번호 58)은 본 발명에서 제시된 바람직한 구체예 V117.25(서열번호 53) 및 V117.26(서열번호 54)과 유사한 변형을 보였고, 따라서, 선행 기술과의 비교에 적합한 것으로 간주되었다. 그러나, 그들은 올리고뉴클레오티드의 길이, 낮은 포스포로티오에이트 함량 및 2'-O-메틸화 염기의 큰 블록 사용에 있어서 본 발명과 다르다. 그들의 정확한 서열은 표 13에 개시된다.
도 11의 A에 도시된 바와 같이, ADAR60-6 및 ADAR60-10은 이전 단락에 기술된 바와 같이 실시예 21-23에 제시된 구체예와 유사하나, 테스트된 조건 하에서 어느 올리고뉴클레오티드에 대해서도 추적 가능한 편집 활성이 검출되지 않았다(실시예 21 및 도 11의 A 참조). 더욱이, ADAR60-6 및 ADAR60-10은 A1AT 샌드위치 ELISA(실시예 22 및 도 11의 B 참조)를 통해 나타난 바와 같이, A1AT 단백질을 회복시킬 수 없었으나, 본 발명의 E342K 돌연변이된 SERPINA1 표적을 표적화하는 선도적인 구조체(leading construct), V117.26(서열번호 54)은 야생형 A1AT 대조군의 평균 42%를 회복시켰다. 선행 기술 솔루션은 내인성 ADAR를 사용하여 주목할만한 편집을 달성할 수 없었다. 이 데이터는 검출 가능한 편집을 달성하기 위해 ADAR2의 과발현 및 세포 용해물에서 편집 실험의 고도로 인위적인 수행(conduction)을 요구하는 원래의 특허 WO 2018/041973(도 3)에 제시된 데이터에 맞는다.
전반적으로, 데이터는 본 발명자들의 발명이 살아있는 세포 내부의 내인성 ADAR을 사용한 RNA 편집 수율 및 단백질 회복 측면에서 선행 기술보다 탁월하다는 것을 입증한다.
실시예 24: 내인성 ADAR에 의한 인간 LRRK2 전사체에서 질병 유발 G2019S 돌연변이의 편집(도 12).
신경계의 핵심 키나아제로서, LRRK2 유전자의 돌연변이는 신경퇴행성 질환과 관련된다. 병원성 돌연변이 중 하나인 G2019S는 파킨슨병 발병의 위험을 증가시킨다. G2019S 돌연변이의 근원적인 표적 아데노신은 5'-CAG 상황에 있다. 따라서, 이는 본 발명을 위한 적합한 표적이다. 구조체 서열이 표 14에 제공된다.
5x 104개의 HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 접종했다. 24시간 후, G2019S 돌연변이를 갖는 인간 LRRK2 cDNA를 함유하는 플라스미드로 세포를 전향적 형질감염시켰다. 300 ng 플라스미드 및 0.9 ㎕ FuGENE® 6(Promega)을 각각 50 ㎕ Opti-MEM에 희석하고 5분간 인큐베이션하고, 그 후, 조합하고, 추가로 20분간 인큐베이션했다. 배지를 교체하고, 형질감염 믹스를 하나의 웰에 고르게 분포시켰다. 플라스미드 형질감염 후 24시간에, 세포를 25 pmol ASO/웰 및 1.5 ㎕/웰 Lipofectamine RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific)으로 전향적 형질감염시켰다. 24시간 후, RNA 단리 및 시퀀싱을 위해 세포를 수확했다.
도 12에 도시된 바와 같이, 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드가 없는 구조체(V117.19, 서열번호 59 및 V120.2, 서열번호 61)에 의해 수득된 편집 수율은 60 내지 80% 범위로 매우 높다. 화학적으로 변형된 피리미딘 뉴클레오시드의 도입시, 즉, V117.20(서열번호 60) 및 V120.3(서열번호 62)에서, 구조체의 편집 활성은 약 절반으로 감소한다. 피리미딘 뉴클레오시드에 화학적 변형을 도입할 때 편집 활성의 이러한 감소는 이전 실시예에서 이미 주목된 경향이다. SERPINA1 표적과 함께, 이전 발명도 본원에서 보여진 5'-CAG에 대한 것과 같이, ADAR에 의해 덜 선호되는 상황(context)에서 아데노신을 표적화하는데 유용하다는 것이 입증될 수 있다.
본 출원에 기술된 뉴클레오티드 서열은 첨부된 서열 프로토콜에도 요약된다. 그러나, 서열 프로토콜은 변형의 복잡성으로 인해 서열의 변형이 서열 프로토콜에 반영되지 않은 것인 뉴클레오티드의 서열을 보여준다. 변형은 명세서에 명확하게 표시되며, 변형 패턴은 본 발명에 중요하고, 반면에, 뉴클레오티드 서열은 표적 서열과 일치해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Eberhart Karls Universit? T?ingen <120> Antisense Oligonucleotides (ASO) for Efficient and Precise RNA Editing with Endogenous Adenosine Deaminase Acting on RNA (ADAR) <130> PWO00361UNI <150> EP21177135.7 <151> 2021-06-01 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.1 <400> 1 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gccaagcagu ugguggugca ggaggcauum 60 gmcmu 65 <210> 2 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V116.16 <400> 2 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gccaagcagu ugguggugca ggaggcauum 60 gmcmu 65 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.17 <400> 3 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gccaagcagu ugguggugca ggaggcauum 60 gmcmu 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.18 <400> 4 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gccaagcagu ugguggugca ggaggcauum 60 gmcmu 65 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.19 <400> 5 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gccaagcagu ugguggugca ggaggcauum 60 gmcmu 65 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V118.3 <400> 6 mumgmgauga ccuuggccag gggugccaag caguuggugg ugcaggamgm gmc 53 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V119.1 <400> 7 mumcmcuucc acgauaccaa aguugucaug gaugaccuug gccaggggug ccaagcagum 60 umgmg 65 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V119.4 <400> 8 mumcmcuucc acgauaccaa aguugucaug gaugaccuug gccaggggug ccaagcagum 60 umgmg 65 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 9 mcmamaaguu gucauggaug accuuggcca ggggugccaa gcagumumgm g 51 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V121.1 <400> 10 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gccaagcagu mumgmg 46 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V122.1 <400> 11 mamumggaug accuuggcca ggggugccaa gcagumumgm g 41 <210> 12 <211> 135 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V25.1, comparison <400> 12 mgmgmugmum cgagaagagg agaamcaamu amugmcmuaa amugmumugm umumcmumcg 60 mumcmumcmc mumcgamcam cmcuugucau ggaugaccuu ggccamggmg mgmumgccam 120 amgmcmagmu mugmg 135 <210> 13 <211> 87 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.7 <400> 13 mcmamamamg mumumgmumc mamumgmgma mumgmamcmc mumumgmgmc mcmamgmgmg 60 mgmumgccam amgmcmamgm umumgmg 87 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.13 <400> 14 mcmamaaguu gucauggaug accuuggcca ggggugccaa gcagumumgm g 51 <210> 15 <211> 62 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.15 <400> 15 mcamaamgum ugmucmaumg gmaumgamcc muumggmccm aggggugcca agcagumumg 60 mg 62 <210> 16 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.15 <400> 16 mcaamagumu gumcaumgga mugamccumu ggmccagggg ugccaagcag umumgmg 57 <210> 17 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.16 <400> 17 dcaadagudt gudcaudgga dtgadccudt ggdccagggg ugccaagcag umumgmg 57 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.17 <400> 18 mcmamaaguu gucauggaug accuuggcca ggggugdcdc aagcagumum gmg 53 <210> 19 <211> 68 <212> DNA <213> artifi1ial0seq enc0 (<220> <223g V120.18 <400> 19 mcmamaagmu mugmumcamu ggamugamcm cmumuggmcm caggggmugd cdcaagmcag 60 mumumgmg 68 <210> 20 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.19 <400> 20 caaaguuguc auggaugacc uuggccaggg gugdcdcaag caguugg 47 <210> 21 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.20 <400> 21 mcmamaaguu gucauggaug accuuggcca ggggugdcdc aagcagumum gmg 53 <210> 22 <211> 87 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.27 <400> 22 mumumgmumc amuggamuga mcmcmumugg mcmcaggggm ugdcdcaagm cagmumuggm 60 uggmugmcag gaggmcamum umgmcmu 87 <210> 23 <211> 67 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.28 <400> 23 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gdcdcaagca guugguggug caggaggcau 60 umgmcmu 67 <210> 24 <211> 67 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.29 <400> 24 mumumgucau ggaugaccuu ggccaggggu gdcdcaagca guugguggug caggaggcau 60 umgmcmu 67 <210> 25 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 25 mamamcuuca gacacagaaa ucaacucagu cuugauacau ccagumumcm c 51 <210> 26 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.19 <400> 26 mcmamgacac agaaaucaac ucagucuuga uacauccagu uccuuuaggg ccaucaagum 60 umcmc 65 <210> 27 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.28 <400> 27 mcmamgacac agaaaucaac ucagucuuga udadcdaucc aguuccuuua gggccaucaa 60 gumumcmc 68 <210> 28 <211> 132 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V25.1, comparison <400> 28 mgmgmugmum cgagaagagg agaamcaamu amugmcmuaa amugmumugm umumcmumcg 60 mumcmumcmc mumcgacacc cagacacaga aaucaacuca gumctmumgm amuacamumc 120 mcmagmumuc mc 132 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 29 mumcmggcca gacuuccuuu guuuaagcuu ucguguccaa ccuucmamgm g 51 <210> 30 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.21 <400> 30 mumcmggcca gacuuccuuu guuuaagcuu ucgugudcdc aaccuucmam gmg 53 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.22 <400> 31 mcmumuucgu guccaaccuu caggcaaggu ggggucauca uacaumamgm g 51 <210> 32 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.1 9 exon <400> 32 mgmgmacggu cccggccugc gacacuucgg cccagagcug cuccucaucc agcagcgccm 60 amgmc 65 <210> 33 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.20 exon <400> 33 mgmgmacggu cccggccugc gacacuucgg cdcdcdagag cugcuccuca uccagcagcg 60 ccmamgmc 68 <210> 34 <211> 83 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V 117.21 exon <400> 34 mgmgmacggm ucmccggmcc mugcgamcac muumcggcdc dcdagagmcu gmcumccmuc 60 amucmcagca gmcgcmcmam gmc 83 <210> 35 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.19 intron <400> 35 mgmgmacggu cccggccugc gacacuucgg cccagagcug cuccucaucu gcggggcggm 60 gmgmg 65 <210> 36 <211> 66 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.28 intron <400> 36 mgmgmacggu cccggccgcg acacuucggc dcdcagagcu gcuccucauc ugcggggcgg 60 mgmgmg 66 <210> 37 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 37 mgmumccagg acggucccgg ccugcgacac uucggcccag agcugmcmum c 51 <210> 38 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.1 7 <400> 38 mgmumccagg acggucccgg ccugcgacac uucggcdcdc agagcugmcm umc 53 <210> 39 <211> 100 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ADAR 6 5- 30 comparison <400> 39 mcmumgmumc mcmamamcma mcmamgmcmc mcmcmamgmc mcmumumumg mamgmamcmc 60 mumcmumgmu dcdcdamgma mgmumumgmu mumcmumcmc 100 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 40 mgmumccaac acagccccag ccuuugagac cucugcccag aguugmumum c 51 <210> 41 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V121.21 <400> 41 mgmumccaac acagccccag ccuuugagac cucugcdcdc agaguugmum umc 53 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.23 <400> 42 mgmumcmcaa camcagcmcc mcagcmcumu ugagamccmu cmugcdcdca gagmuugmum 60 umc 63 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117-19 <400> 43 mgmgmuacuc ucauaugucu uugacugauc cacaaucuuc uggaacaugg uccuuuucum 60 umgma 65 <210> 44 <211> 68 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.20 <400> 44 mgmgmuacuc ucauaugucu uugacugauc cdadcdaauc uucuggaaca ugguccuuuu 60 cumumgma 68 <210> 45 <211> 85 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.21 <400> 45 mgmgmuacmu cmucamuaug mucmuumuga cmugaumccd adcdaamucm uumcuggaam 60 cauggmucmc umuumucmum umgma 85 <210> 46 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 46 mumcmcuggg uacucucaua ugucuuugac ugauccacaa ucuucmumgm g 51 <210> 47 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.3 <400> 47 mumcmcuggg uacucucaua ugucuuugac ugauccdadc daaucuucmu mgmg 54 <210> 48 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.19 <400> 48 mumumcacuc ucauaugucu uagacugauc cacgaucuuu uggaacaucg uccucuucum 60 umgma 65 <210> 49 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 49 mumcmcuguu cacucucaua ugucuuagac ugauccacga ucuuumumgm g 51 <210> 50 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.17 <400> 50 mumcmcuguu cacucucaua ugucuuagac ugauccdadc dgaucuuumu mgmg 54 <210> 51 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.19 <400> 51 mcmamuggcc ccagcagcuu cagucccuuu cucgucgaug gucagcacag ccuuaugcam 60 cmgmg 65 <210> 52 <211> 67 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.24 <400> 52 mgmamugguc agcacagccu uaugcacggc mcmucggaga gcuucagggg ugccuccucu 60 gmumgma 67 <210> 53 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V117.25 <400> 53 mcmamuggcc ccagcagcuu cagucccuuc dtdcducgau ggucagcaca gccuuaugca 60 mcmgmg 66 <210> 54 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.26 <400> 54 mcmamuggcm ccmcagcagm cumucagmuc mccmuumucd tdcdmucgam uggumcagca 60 mcagcmcumu augcamcmgm g 81 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 55 mamamaaaca uggccccagc agcuucaguc ccuuucucgu cgaugmgmum c 51 <210> 56 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.10 <400> 56 mamamaaaca uggccccagc agcuucaguc ccugucmucg ucgaugmgmu mc 52 <210> 57 <211> 62 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ADAR60-6 comparison <400> 57 mumcmamgmu mcmcmcmumu mumcdtdcdg mumcmgmamu mgmgmumcma mgmcmamcma 60 mg ( 62 <210> 58 <211> 58 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ADAR60-10 comparison <400> 58 mumcmamgmu mcmcmcmumu mumcucmumc mgmamumgmg mumcmamgmc mamcmamg 58 <210> 59 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.19 <400> 59 mcmcmccauu cuacagcagu acugagcaau gccduaguca gcaaucuuug caaugauggm 60 cmamg 65 <210> 60 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V117.20 <400> 60 mcmcmccamu umcuamcagc agmuacmuga gcaamugdcd cduagmucag mcaaumcumu 60 ugmcaaugam uggmcmamg 79 <210> 61 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.2 <400> 61 mumumuaucc ccauucuaca gcaguacuga gcaaugccdu agucamgmcm a 51 <210> 62 <211> 62 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> V120.3 <400> 62 mumumuaumc cmccamuumc uamcagcagm uacmugagca amugdcdcdu agmucamgmc 60 ma 62

Claims (18)

  1. 세포 내부에서 내인성 ADAR에 의한 표적 RNA의 부위 지정 A의 I로의 편집(A-to-I editing)에 사용하기 위한 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드로서, 25 내지 80개의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 표적 RNA의 표적 서열에 결합할 수 있는 서열을 포함하고, 상기 표적 RNA에서 이노신으로 편집될 표적 아데노신의 반대편에 있는 중심 뉴클레오티드를 갖는 3개의 뉴클레오티드로 구성된 중심 염기 트리플렛(Central Base Triplet)을 포함하며,
    a) 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드 중 적어도 90%는 당 모이어티의 2' 위치에서 화학적으로 변형되거나, 데옥시리보뉴클레오시드이거나, 또는 이들의 조합이고,
    b) 6개 이하의 연속 뉴클레오시드가 당 모이어티의 2' 위치에서 2'-O-메틸로 화학적으로 변형되며,
    c) 중심 염기 트리플렛의 3개 뉴클레오시드 중 적어도 2개는 당 모이어티의 2' 위치에서 화학적으로 변형되거나, 데옥시리보뉴클레오시드이거나, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것인 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 RNA에서 편집될 표적 아데노신의 반대편에 있는 뉴클레오시드는 N-헤테로고리 염기, 더 바람직하게는 피리딘 또는 피리미딘 염기, 바람직하게는 시토신, 우라실, 티민 또는 5-메틸시토신으로부터 선택된 피리딘 또는 피리미딘 염기, 가장 바람직하게는 시토신을 갖는 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  3. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오시드간 결합의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 60%가 포스포로티오에이트 결합인 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  4. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고리보뉴클레오티드는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 10개, 더 바람직하게는 적어도 15개, 가장 바람직하게는 적어도 20개의 포스포로티오에이트 결합을 갖는, 뉴클레오시드간 연속된 포스포로티오에이트 결합의 적어도 하나의 뉴클레오티드 블록을 포함하는 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형은 2'-플루오로 치환기 및 2'-O-메틸 치환기의 조합을 구성하여, 상기 화학적 변형의 적어도 20%, 바람직하게는 30-70%, 더 바람직하게는 40-60%가 2'-O-메틸 치환기인 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  6. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 6개 이하, 더 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 4개 이하의 연속 뉴클레오시드가 2'-O-메틸 변형을 포함하는 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 피리미딘의 100%가 당 모이어티의 2' 위치에서 변형되거나, 데옥시리보뉴클레오시드이거나, 또는 이들의 조합인 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  8. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중심 염기 트리플렛의 3개의 뉴클레오시드 각각이 데옥시리보뉴클레오티드인 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  9. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-CAN 서열(sequence context)(N = G, A, U 또는 C) 중 아데노신을 표적화할 때, 상기 중심 염기 트리플렛의 3' 위치에 있는 뉴클레오시드가 이노신 또는 이의 유도체로 구성되어, 올리고리보뉴클레오티드의 이노신이 표적 (m)RNA의 시토신 염기의 반대편에 위치하는 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  10. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀-루프 구조의 ADAR 동원 모이어티(recruiting moiety)가 없는 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  11. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중심 염기 트리플렛에 측접하는(flanking) 2개의 뉴클레오티드 서열은 동일한 길이를 포함하는 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  12. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중심 염기 트리플렛에 측접하는 2개의 뉴클레오티드 서열은 상이한 길이를 포함하여, 3' 말단의 서열이 4개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 9개 이상의 뉴클레오티드이고, 5' 말단의 서열은 19개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 28개 이상의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 33개 이상의 뉴클레오티드인 것인 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드.
  13. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 및 5' 말단이 각각 3개의 연속된 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 또는 3개의 2'-O-메톡시에틸(2' MOE) 포스포로티오에이트 뉴클레오티드의 블록으로 변형된 것인 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드.
  14. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 및 5' 말단의 두 말단이 모두 5개 이상의 연속된 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것인 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드.
  15. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중심 염기 트리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형은 적어도 1개, 특히 적어도 5개의 2'-플루오로 치환기를 포함하는 것인 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드.
  16. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중심 염기 프리플렛 외부의 피리미딘 뉴클레오시드의 화학적 변형은 2'-플루오로 치환기 및 2'-O-메틸 치환기의 조합을 구성하여, 상기 화학적 변형의 적어도 20%는 2'-F 치환기인 것인 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드.
  17. 인간의 질환 또는 질병, 바람직하게는 유전 질환 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제로서, 상기 약제는 선행하는 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화학적으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제.
  18. 인간 SERPINA1의 일반적인 E342K 돌연변이를 표적화하여 알파1-항트립신 결핍의 치료 또는 예방, 인간 LRRK2의 일반적인 S2019G 돌연변이를 표적화하여 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방, 인간 IDUA에서 일반적인 W402X 돌연변이를 표적화하여 점액다당증의 치료 또는 예방, 인간 PDE6A에서 V685M 돌연변이를 표적화하여 색소성 망막염의 치료 및 예방, 인간 PEX1 유전자의 G843D 돌연변이를 표적화하여 젤베거 스펙트럼 질환(Zellweger spectrum disorder)의 치료 및 예방, 인간 ABCA4의 G1961E 돌연변이를 표적화하여 스타가르트병(Stagardt disease) 또는 연령 관련 황반변성의 치료 또는 예방, 또는 인간 CRB1의 C948Y 돌연변이를 표적화하여 색소성 망막염이나 레버 선천성 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis)와 같은 망막 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드.
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