KR20240009445A - 나노입자 매핑 - Google Patents

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nanoparticulate
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벤자민 티에리
멜라니 루스 마리아 넬슨
발렌티나 밀라노바
니콜 디모초스카
티 한 응우옌 팜
브라이언 스탠리 호케트
라메쉬 무카말라
필립 스튜어트 로우
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페로노바 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 피험자에 투여하기에 적합한 나노미립자 물질에 관한 것으로서, 나노미립자 물질은 그 표면에 결합되는 다음: 즉, (a) 액체에서 나노미립자 물질의 분산을 촉진하는 공중합 입체 안정화제 - 공중합 입체 안정화제는 (i) 공중합 입체 안정화제를 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화 고분자 절편, 및 (ii) 고정화 고분자 절편과 다른 입체 안정화 고분자 절편을 포함함 -, 및 (b) 공중합 매핑 모이어티 - 공중합 매핑 모이어티는 (i) 공중합 매핑 모이어티를 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화 고분자 절편, (ii) 섬유아세포활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 하나 이상의 매핑기, 및 (iii) 고정화 고분자 절편과 다른 결합 고분자 절편을 포함함 -를 가지며, 여기서 결합 고분자 절편은 고정화 고분자 절편을 하나 이상의 매핑기에 결합시킨다.

Description

나노입자 매핑
본 출원은 일반적으로 나노입자, 이를 포함하는 조성물 및 매핑, 진단 및 치료 적용에서 그들의 용도에 관한 것이다.
수술적 종양 절제는 많은 암, 특히 질병이 단일 고형 종양에 국한될 때 치료의 표준이다. 그러나, 수술은 침습적이고 잔여 신생물 조직을 정확히 찾아내지 못함은 양의 수술 마진(positive surgical margin)을 야기하며, 이는 국소 재발 및 불량한 환자 결과와 상관된다. 또한, 종양 마진의 정확한 식별은 비-수술적 치료 양식, 예컨대 외부 빔 방사선 요법, 근접 요법 및 초점 요법의 효능에 매우 중요하며, 그 각각은 종양의 위치 및 범위(예를 들어, 부피)의 최선의 가능한 특성화(characterisation)를 필요로 한다.
예를 들어, 근치적 전립선 절제술은 공격성 및 중기성 전립선암에 대한 표준 치료이다. 그러나, 이러한 수술적 개입 후에 대략 20%의 환자는 요실금을 나타내고 대략 70%의 환자는 발기 부전을 나타낼 것이다. 이러한 심각한 부작용으로 인해, 제한된 기대 수명 및 느린-성장, 저-위험 질병을 갖는 남성은 종종 수술을 받기 전에 "주시 및 대기(watch and wait)" 하도록 권장된다. 대안적으로, 일부 환자는 근치적 전립선 절제술에 앞서 외부 빔 방사선 요법, 근접 요법, 및 초점 요법과 같은 요법을 제공받는다. 그러한 요법은 감소된 부작용과 연관되지만, 그들은 부분적 또는 완전한 수술적 종양 절제만큼 효과적이지 않다. 이러한 대체 치료 양식의 감소된 효능에 대한 기여 인자는 원발성 종양(primary tumour)의 경계 및 마진을 식별하기 위한 적절한 공간 해상도를 제공하지 않는 기존 의료 영상의 한계이다. 예를 들어, 전립선 특이 막항원 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영기(PET-PSMA)는 9-15%만큼 종양 부피를 과소평가할 수 있고 다중-파라메트릭 자기 공명 영상(mpMRI)은 11-20%만큼 종양 부피를 과소평가할 수 있다. 영상 결함으로 인해, 초점 요법 지침은 식별된 병변(lesion)을 둘러싸는 절제 영역의 마진이 최대 10mm까지 확장되어야 한다고 요구한다. 그러나, 절제 부위가 확장된 경우에도, 20-40%의 마진 재발률이 보고되었다. 유사한 쟁점은, 예를 들어 교모세포종 및 췌장암을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 장기 보존 및 정상 조직 독성 제한이 매우 중요한 다른 암에서 발생한다.
따라서, 개선된 수술 전 및/또는 수술 중 지침을 제공함으로써, 또는 덜 침습적인 치료 양식, 예컨대 냉동 절제술, 초점 레이저 절제술 및 고주파 초음파 절제술을 포함하는 초점 요법, 광역학 요법, 고선량률 및 저선량률 근접 요법, 입자 방사선 요법 예컨대 양성자 및 탄소 이온 치료, 및 강도 변조 방사선 요법(IMRT), 화상-안내 방사선 요법(IGRT), 저분할(hypo-fractionated) 및 초고선량률 방사선 요법을 포함하는 외부 빔 방사선 요법이 종양의 전체 부피를 정확하게 표적화하고 비-표적 조직의 노출을 감소시키도록 수술적 절제를 개선하기 위해 고형 종양의 마진을 정확하게 식별하는 새로운 물질 및 조성물을 개발하기 위한 필요성이 남아 있다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질이 종양 미세환경에 선택적으로 축적되며, 그것에 의해 고형 종양의 마진을 매핑한다는 점이 놀랍게도 발견되었다. 이론에 얽매이지 않고, 공중합(copolymeric) 입체 안정화제 및 공중합 매핑 모이어티의 결합된 기능은 적어도 부분적으로 본원에 설명되는 나노미립자 물질이 종양 미세환경 내의 세포, 예를 들어, 종양 연관 간질 세포에 의해 발현되는 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein; FAP)에 선택적으로 결합하게 할 수 있다.
따라서, 본원에 설명되는 일 양태에서, 피험자에게 투여하기에 적합한 나노미립자 물질이 제공되며, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 다음: 즉, (a) 액체에서 나노미립자 물질의 분산을 촉진하는 공중합 입체 안정화제 - 공중합 입체 안정화제는 (i) 공중합 입체 안정화제를 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화(anchoring) 고분자 절편, 및 (ii) 고정화 고분자 절편과 다른 입체 안정화 고분자 절편을 포함함 -, 및 (b) 공중합 매핑 모이어티 - 공중합 매핑 모이어티는 (i) 공중합 매핑 모이어티를 나노미립자 물질에 결합시키기 위한 하나 이상의 결합기(binding group)를 갖는 고정화 고분자 절편, (ii) 섬유아세포활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제제(agent)를 포함하는 하나 이상의 매핑기(mapping group), 및 (iii) 고정화 고분자 절편과 다른 결합(coupling) 고분자 절편을 포함함 -를 가지며, 여기서 결합 고분자 절편은 고정화 고분자 절편을 하나 이상의 매핑기에 결합시킨다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질은 유리하게는 전신(systemic) 주사를 지원하기 위해 개선된 혈액 반감기 순환을 나타내고/내거나 in-vivo에서 실질적으로 분해되지 않는다.
이론에 얽매이지 않고, 나노미립자 물질은 적어도 그것의 표면에 결합되는 공중합 성분을 통해 그러한 유리한 특성을 나타내는 것으로 믿어진다. 그러한 공중합 성분은 공중합 매핑 모이어티와 조합으로 공중합 입체 안정화제를 포함한다. 공중합 입체 안정화제 및 공중합 매핑 모이어티 둘 다는 각각의 엔티티(entity)를 나노미립자 물질에 결합시키는 고정화 고분자 절편을 포함한다. 고정화 고분자 절편은, 예를 들어, in vivo 액체 환경에 위치될 때, 공중합 입체 안정화제 및 공중합 매핑 모이어티 둘 다를 나노미립자 물질에 고정시키는 데 매우 효과적인 것으로 유리하게 발견되었다. 이는 차례로 그러한 in-vivo 액체 환경 내에서 나노미립자 물질을 분산된 형태로 유지시키는 것을 용이하게 한다. 당업자는 in-vivo 액체 환경에서 나노미립자 물질의 응집이 진단 및 치료 적용에 해로울 수 있다는 점을 인식할 것이다.
예를 들어, in-vivo 액체 환경 내에서 개선된 분산의 부여된 효과와 시너지로 작동하여, 다시 이론에 얽매이지 않고, 공중합 매핑 모이어티는 종양 미세환경에서 미립자 물질의 향상된 축적을 가능하게 하는 것으로 믿어진다. 의도된 적용에 따라, 공중합 매핑 모이어티에 결합됨으로써 또한 종양 미세환경에 본질적으로 축적되는 나노미립자 물질은 주어진 작업을 수행하기 위해 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 나노미립자 물질은 로우 필드 MRI, MRI 유도 외부 빔 방사선 요법, MRI 유도 초점 절제, MRI/초음파 융합 초점 절제, MRI 유도 생검, MRI/초음파 융합 유도 생검, MRI 유도 수술, MRI 유도 근접 요법, MRI 유도 적외선 카메라 유도 생검 또는 요법, 및 광음향 유도 생검 또는 요법을 포함하는 자성 입자 이미징(MPI) 및 자기 공명 이미징(MRI)과 같은 적용에 사용하기 위한 자성 나노미립자 물질의 형태로 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 나노미립자 물질은 피험자에서 종양 마진(들)을 매핑하고 종양 병변의 위치 및 범위(예를 들어, 부피)와 치료 적용을 결정하기 위한 종래의 방법을 향상시키는 데 특히 효과적인 것으로 발견되었다.
당업자는 in-vivo 표적화된 나노미립자 물질의 적용이 소위 단백질 코로나를 일으키고 표적 부위에서 결합 효율의 손실을 초래할 수 있는 바람직하지 않은 단백질 흡착에 의해 악영향을 받을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러한 단백질 흡착은 결합 효율을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그것은 또한 결과적으로 표적 부위에서 나노미립자 물질의 축적을 감소시킬 수 있다. 놀랍게도, 공중합 입체 안정화제 및 공중합 매핑의 겸용(combined use)이 또한 불리한 단백질 흡착의 효과를 유리하게 감소시켜 그것에 의해 종양 미세환경에서 나노미립자 물질의 축적 효율을 개선할 수 있다는 것이 발견되었다.
일 실시예에서, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 다음: 즉, (c) 공중합 발광 모이어티를 가지며, 공중합 발광 모이어티는 (i) 고분자 발광 모이어티를 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화 고분자 절편, (ii) 나노미립자 물질의 in-vivo 위치 시각화를 가능하게 하는 광에 응답하여 광 또는 음향 신호를 방출하기 위한 하나 이상의 발광기(luminescent group), 및(iii) 고정화 고분자 절편과 다른 결합 고분자 절편을 포함하며, 여기서 결합 고분자 절편은 고정화 고분자 절편을 하나 이상의 발광기에 결합시킨다.
일 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 폴리아크리아미드-코-폴리아킬렌 산화물 블록 공중합체를 포함한다.
다른 구현예에서, 결합 고분자 절편은 폴리아크릴아미드로 구성된다.
추가 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 폴리아크리아미드-코-폴리아킬렌 산화물 블록 공중합체를 포함하고, 결합 고분자 절편은 폴리아크릴아미드로 구성된다.
일 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 10개 내지 70개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는다.
다른 구현예에서, 결합 고분자 절편은 15개 내지 100개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는다.
추가 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 10개 내지 70개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖고 결합 고분자 절편은 15개 내지 100개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는다.
일 구현예에서, 나노미립자 물질은 자성 나노미립자 물질이다.
본원의 다른 곳에서 설명되는 바와 같이, 나노미립자 물질은 종양 미세환경 내의 세포에 의해 발현되는 섬유아세포활성화 단백질(fibroblast activation protein; FAP)에 선택적으로 결합한다.
구현예에서, 종양 미세환경 내의 세포는 종양 연관 간질(stromal) 세포이다.
추가 구현예에서, 종양 연관 간질 세포는 섬유아세포, 혈관주위세포, 지방세포, 중간엽 간질 세포(mesenchymal stromal cell; MSC), 내피 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 종양 연관 간질 세포는 혈관주위세포, 내피 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
구현예에서, FAP에 특이적으로 결합하는 제제(agent)는 소분자 억제제 및 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편(fragment)으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 소분자 억제제는 FAP 억제제이다.
추가 구현예에서, 하나 이상의 발광기는 화학발광, 전계발광, 광발광, 방사선발광 및 열발광 기(group)로부터 선택된다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, 피험자에 투여하기에 적합한 조성물이 제공되며, 조성물은 본 발명에 따른 나노미립자 물질을 포함한다.
구현예에서, 조성물은 약리학적으로 허용가능한 액체 담체(carrier)를 포함한다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, 피험자에 대한 치료 및 진단 적용을 수행할 시 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물의 용도가 제공된다.
적합한 치료 및 진단 적용의 예는 자성 입자 영상(MPI), 자기 공명 영상(MRI), MRI 유도 외부 빔 방사선 요법, MRI 유도 초점 절제, MRI/초음파 융합 초점 절제, MRI 유도 생검, MRI/초음파 융합 유도 생검, MRI 유도 수술, MRI 유도 근접 요법, MRI 유도 적외선 카메라 유도 생검 또는 요법, 및 광음향 유도 생검 또는 요법을 포함한다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물은 초음파, MRI/초음파, X-레이, 광학 이미징, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 및 자기 공명 영상(MRI)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 in-vivo 이미징 기술과 함께 사용될 수 있다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, in-vivo 이미징을 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, in-vivo 이미징에 사용하기 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물이 제공된다
본원에 개시되는 다른 양태에서, 암의 검출을 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, 암의 검출에 사용하기 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물이 제공된다.
구현예에서, 암은 전립선암, 다형성 교아종, 신경교종, 췌장암, 결장암, 유방암, 두경부암, 위암, 식도암, 난소암, 육종 및 폐암으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 암은 전립선암이다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, 종양 미세환경을 매핑하기 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물의 용도가 제공된다
본원에 개시되는 다른 양태에서, 종양 미세환경을 매핑 시 사용하기 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물이 제공된다.
본원에 개시되는 양태에서, 피험자에서 종양 마진을 매핑하기 위한 방법이 제공되며, 방법은:
a. 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및
b. 나노미립자 물질을 검출하는 단계를 포함하며,
여기서 나노미립자 물질은 종양 미세환경에 축적되며, 그것에 의해 종양 마진을 매핑한다.
구현예에서, 종양 마진은 in situ 매핑된다. 종양은 종양 조직 절제 전에 또는 후에 in situ 매핑될 수 있다.
구현예에서, 방법은 치료제의 투여 전에 임상 표적 부피(clinical target volume; CTV) 및/또는 총 표적 부피(gross target volume; GTV)를 결정하는 단계를 더 포함한다.
본원에 개시되는 양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 피험자에서 암의 치료를 위한 방법이 제공되며, 방법은:
a. 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계;
b. 나노미립자 물질이 축적되는 부위를 검출하는 단계;
c. 단계(b)에서의 나노미립자 물질 검출 부위에 상기 암에 대한 치료를 위한 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 치료는 수술, 방사선요법, 근접요법, 광역학 요법, 광열 요법, 냉동 절제술, 초점 레이저 절제술 및 고주파 초음파 절제술을 포함하는 초점 절제 요법, 화학요법, 면역요법 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
구현예에서, 나노미립자 물질은 자기 공명 이미징(MRI), 초음파, X-레이, 광학 이미징, 형광 이미징, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 형광 공명 에너지 전달(FRET)로부터 선택되는 이미징 기술을 사용하여 검출된다.
구현예에서, 방법은 단계(c)에 따라 치료제의 투여 이전에 임상 표적 부피(CTV) 및/또는 총 표적 부피(GTV)를 결정하는 단계를 더 포함한다.
본원에 개시되는 양태에서, 암을 진단하기 위한 방법이 제공되며, 방법은:
a. 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및
b. 나노미립자 물질을 검출하는 단계를 포함하며;
여기서 피험자의 조직(예컨대 혈관 조직)에서 축적된 나노미립자 물질의 검출은 피험자가 암을 갖고 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 추가 양태는 아래에서 보다 상세히 개설되고 논의된다.
본 개시의 구현예는 첨부된 비-제한적 도면을 참조하여 논의될 것이며 여기서:
도 1은 본 발명에 따른 나노미립자 물질을 예시하는 개략도이고;
도 2는 본 발명에 따른 "긴(long)" 공중합 입체 안정화제의 화학적 구조를 도시하고;
도 3은 그 표면에 결합되는 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen; PSMA) 표적화기를 갖는 분산된 나노미립자 물질의 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS) 측정의 결과를 도시하고;
도 4는 본 발명에 따른 "긴" 공중합 매핑 모이어티의 화학적 구조를 도시하고;
도 5는 그 표면에 결합되는 섬유아세포활성화 단백질 억제제(fibroblast activation protein inhibitor; FAPI) 표적화기를 갖는 분산된 나노미립자 물질의 동적 광 산란(DLS) 측정의 결과를 도시하고;
도 6은 도 5에 도시된 비교 나노미립자 물질로부터의 약한 MRI 반응과 대비해서, 강한 MRI 반응을 갖는 본 발명에 따른 나노미립자 물질을 입증하는 절제된 정위 전립선 종양 표본(specimens)의 3T MRI 반응을 도시하고;
도 7 은 종양 표면 상에 강한 프러시안(Prussian) 블루 철 얼룩을 갖는 본 발명에 따른 나노미립자 물질 대비 본 발명에 따른 나노미립자 물질보다 종양 표면에서 상당히 더 적은 나노입자를 도시하는 철 블루 얼룩을 갖는 도 5에 도시된 비교 나노미립자 물질을 입증하는 절제된 정위 종양 표본으로부터의 병리학 슬라이드를 도시하고;
도 8은 정위 전립선 모델의 표면에서 본 발명에 따른 나노미립자 물질의 역상 대비를 갖는 전신 마우스 14.7T MRI를 도시하고;
도 9는 본 발명에 따른 "짧은(short)" 공중합 매핑 모이어티의 화학적 구조를 도시하고;
도 10은 본 발명에 따른 "짧은" 공중합 입체 안정화제의 화학적 구조를 도시하고;
도 11은 FAP 발현 세포주에서 소형 FAP-매핑 자성 나노입자(maghemite) 대 비-표적화된 소형 자성 나노입자의 세포 섭취(cellular uptake)의 비교를 도시하고;
도 12는 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)의 존재 및 부재에서의 FAP 발현 세포주에서 소형 공중합체 FAP-매핑 자성 나노입자(maghemite) 대 단일 고분자 FAP-매핑 자성 나노입자의 세포 섭취의 비교를 도시하고;
도 13은 FAP 발현 세포주에서 소형 FAP-매핑 자성 나노입자(magnetite) 대 비-표적화된 소형 자성 나노입자(magnetite)의 세포 섭취의 비교를 도시한다.
본 명세서에서 당업자에게 잘 알려진 다수의 용어가 사용된다. 그럼에도 불구하고 명확성을 위해 다수의 용어가 정의될 것이다.
"피험자"는 동물 또는 인간 피험자를 의미한다. "동물"은 영장류, 가축 동물(소, 말, 양, 돼지 및 염소를 포함함), 반려 동물(개, 고양이, 토끼 및 기니피그를 포함함), 및 포획된 야생 동물(동물원 환경에서 통상 발견되는 것들을 포함함)을 의미한다. 실험실 동물 예컨대 토끼, 마우스, 랫트, 기니피그 및 햄스터는 또한 그들이 편리한 테스트 시스템을 제공할 수 있음에 따라 고려된다. 일부 구현예에서, 피험자는 인간 피험자이다.
피험자에 투여하기에 "적합한" 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물은 피험자에 대한 조성물의 투여가 알레르기 반응 및 질병 상태를 포함하는 허용할 수 없는 독성을 야기하지 않는다는 것을 의미한다.
피험자에 대한 나노미립자 물질 또는 조성물의 "투여"는 나노미립자 물질이 피험자에게 전달될 수 있도록 나노미립자 물질 또는 조성물이 제시된다는 것을 의미한다. 투여 모드에 대한 특별한 제한은 없지만, 이것은 일반적으로 경구, 비경구(피하, 피내, 근육내, 정맥내, 뇌내, 비강내, 척수강내, 및 척수내를 포함함), 흡입(분무화 포함), 국소, 직장 및 질 모드의 방식일 것이다. 나노미립자 물질 또는 조성물은 또한 종양으로 및/또는 종양의 하나 이상의 절편에 근접한 조직으로 직접 투여되거나 혈관으로 직접 투여될 수 있다.
"약리학적으로 허용가능한"은 피험자에 투여하기에 적합하다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 피험자에 대한 관련 물질의 투여는 알레르기 반응 및 질병 상태를 포함하는 허용할 수 없는 독성을 야기하지 않아야 한다.
단지 지침으로서, 당업자는 "약리학적으로 허용가능한"을 동물, 및 보다 구체적으로 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전(pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열되는 엔티티(entity)로서 고려할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 당업자는 피험자에 투여하기 위한 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물의 적합성 및 그것 또는 그것의 구성 성분이 약리학적으로 허용가능한 것으로 간주되는지 여부가 선택되는 투여 모드에 어느 정도 의존할 것이라는 점을 인식할 것이다. 따라서, 투여 모드는 조성물 또는 조성물의 구성 성분이 피험자에 투여하기에 적합한지 또는 그것이 약리학적으로 허용가능한지 여부를 평가할 때 고려될 필요가 있을 수 있다.
액체 담체 "전체에 걸쳐 분산되는" 나노미립자 물질은 나노미립자 물질이 미립자 물질에 대해 그 자체가 연속적인 액체 매질 또는 상(phase)으로서 존재하는 액체 담체 전체에 걸쳐 분산된 상(phase)으로서 존재한다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 조성물은 액체 담체 전체에 걸쳐 나노미립자 물질의 현탁액 또는 분산액을 포함하는 것으로 설명될 수도 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 액체 담체의 맥락에서 용어 "액체"는 나노미립자 물질이 전체에 걸쳐 분산되고 본 발명에 따른 조성물의 의도된 용도의 온도에서 적어도 액체 상태인 비히클(vehicle)을 의미하도록 의도된다. 전형적으로, 액체 담체는, 안정화제의 부재에서, 담체 전체에 걸쳐 미립자 물질이 담체로부터 엉기거나 침전되어 침전물(sediment)을 형성할 수 있는 경우 "액체" 상태인 것으로 간주될 것이다. 다시 말해서, 미립자 물질이 비히클에서 상대적으로 자유롭게 이동할 수 있는 경우, 그렇다면, 그것은 "액체"로서 간주된다.
본 발명에 따라 사용되는 액체 담체는 하나 이상의 상이한 액체로 구성될 수 있다. 적합한 약리학적으로 허용가능한 액체 담체는 Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA,(1990)에 설명되고, 땅콩 기름, 콩기름, 광유, 참기름 등과 같은, 석유, 동물, 식물, 광물 또는 합성 원천의 것들을 포함하는, 물 및 오일과 같은 살균될 수 있는 액체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 액체 담체는 메틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소프로필 알코올, 벤질 알코올을 포함한다. 물 또는 가용성 식염수 및 수성 포도당 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 액체 담체로서, 특히 주사 용액(injectable solution)을 위해 이용된다.
본 발명에 따른 조성물은 당업자에게 공지된 하나 이상의 약리학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 액체 담체는 습윤제, 소포제, 계면활성제, 완충액, 전해질, 방부제, 착색제, 향미제, 및 감미제와 같은 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.
액체 담체 및 임의의 첨가제(존재하는 경우)의 특정 특징(nature)은 부분적으로 조성물의 의도된 적용에 의존할 것이다. 당업자는 조성물의 의도된 적용을 위해 적합한 액체 담체 및 첨가제(존재하는 경우)를 선택할 수 있을 것이다.
나노미립자 물질은 적절하게 치료 또는 진단 유효량으로 투여될 수 있다. 치료 또는 진단 유효량은, 원하는 투여 요법(regimen)에 따라 투여될 때, 다음 중 하나 이상: 즉, 치료되고/되거나 평가되는 특정 상태(condition)의 증상을 완화시키는 것, 개시(onset)를 예방 또는 지연시키는 것, 진행을 억제 또는 둔화시키는 것, 개시 또는 진행을 진단하는 것, 또는 완전히 중단 또는 역전시키는 것을 포함하는 원하는 치료 또는 진단 효과를 달성하는 양을 포함하도록 의도된다.
이것을 달성하기 위한 적합한 투여량 및 투여 요법은 담당의에 의해 결정될 수 있고 피험자의 일반적인 연령, 건강 및 체중 뿐만 아니라 치료되거나 진단되는 특정 상태, 상태의 중증도에 의존할 수 있다.
투여는 분, 시간, 일, 주, 월 또는 년의 간격으로 또는 이들 기간 중 임의의 하나에 걸쳐 연속적으로 발생할 수 있다. 미립자 물질 자체의(per se)의 적합한 투여량은 투여량에 대하여 kg의 체중 당 약 0.1 ng 내지 kg의 체중 당 1 g의 범위 내에 있을 수 있다. 투여량은 투여량에 대하여 kg의 체중 당 1 μg 내지 1 g의 범위에 있을 수 있으며, 예컨대 투여량에 대하여 kg의 체중 당 1 mg 내지 1 g의 범위에 있다. 일 구현예에서, 투여량은 투여량에 대하여 kg의 체중 당 1 mg 내지 500 mg의 범위에 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 투여량은 투여량에 대하여 kg의 체중 당 1 mg 내지 250 mg의 범위에 있을 수 있다. 더 다른 구현예에서, 투여량은 투여량에 대하여 kg의 체중 당 1 mg 내지 100 mg의 범위에 있을 수 있으며, 예컨대 투여량에 대하여 kg의 체중 당 최대 50 mg일 수 있다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물은 단일 용량(dose) 또는 일련의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물이 비경구 투여에 대해 적합한 경우, 그들은 일반적으로 항산화제, 완충액, 살균제 또는 조성물을 의도된 피험자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질(solute) 중 하나 이상을 함유할 수 있는 수성 또는 비-수성 등장성 멸균 주사 용액의 형태일 것이다. 그러한 조성물은 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알로 제공될 수 있다.
투여 시, 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물은 in-vivo 희석될 수 있다. 예를 들어, 희석은 그들이 경구 또는 비경구 투여될 때 발생할 수 있다. 그러한 경우, 조성물의 액체 담체는 in-vivo에서 너무 희석되어 미립자 물질이 전체에 걸쳐 분산되는 주위 액체 환경이 원래의 액체 담체보다 in-vivo 액체(즉, 피험자 내의 생물학적 액체/유체)를 더 잘 나타내게 될 수 있다. 예를 들어, 일단 비경구 투여되면, 나노미립자 물질은 조성물의 원래의 액체 담체보다 혈액 전체에 걸쳐 분산되는 것으로서 더 적절하게 설명될 수도 있다. 이러한 조건 하에서, 나노미립자 물질을 in-vivo 액체 담체(즉, 피험자 내의 생물학적 액체/유체) 전체에 걸쳐 분산되는 것으로 언급하는 것이 편리할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 액체 담체와 in-vivo 액체 담체 사이의 임의의 조성 차이를 제외하고, 조성물의 액체 담체와 관련하여 본원에 설명되는 사항(matter)은 또한 일반적으로 in-vivo 담체에 적용될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "종양 미세환경"이라는 표현은 종양의 기능, 생리 및 전이에 필수적인 종양을 둘러싸고/싸거나 침윤하는 비암성(non-cancerous) 세포의 이질적인 집단(population)을 지칭한다. 당업자는 종양 미세환경이 종양의 크기, 위치, 유형 및 단계에 기초하여 다를 수 있는 상이한 세포 유형의 범위를 포함한다는 것을 인식할 것이며, 그 예시적 예는 섬유아세포, 혈관주위세포, 지방세포, 중간엽 간질 세포(MSC), 암 세포 및 내피 세포를 포함한다. 종양 미세환경의 세포는 비암성이지만, 종양은 암 성장을 촉진하는 호의적인 환경을 제공하기 위해 그러한 세포를 모집하고/하거나 조절한다. 따라서, 종양 미세환경 내에 포함되는 세포는 "암-연관" 또는 "종양-연관"으로서 지칭될 수 있다.
구현예에서, 본원에 개시되는 나노미립자 물질은 종양 미세환경 내의 세포에 의해 발현되는 섬유아세포활성화 단백질(fibroblast activation protein; FAP)에 선택적으로 결합한다.
구현예에서, 종양 미세환경 내의 세포는 종양 연관 간질 세포이다.
구현예에서, 종양 연관 간질 세포는 섬유아세포, 혈관주위세포, 지방세포, 중간엽 간질 세포(mesenchymal stromal cell; MSC), 암 세포, 내피 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 종양 연관 간질 세포는 혈관주위세포, 내피 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약(about)"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 보다 바람직하게는 최대 5%, 및 더욱 더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 용어는 값의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 '약(about)'은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 이내, 예컨대 ±1-20%, 바람직하게는 ±1-10% 및 보다 바람직하게는 ±1-5%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그러한 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값 및 임의의 다른 언급된 값 또는 그러한 언급된 범위의 중간 값이 본 개시에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 본 개시 내에 망라되어, 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계의 영향을 받는다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계의 둘 중 하나를 배제하는 범위가 또한 본 개시에 포함된다.
항목 리스트 중 "적어도 하나"를 지칭하는 구(phrase)는 단일 멤버를 포함하는 그러한 항목의 임의의 조합을 지칭한다. 예로서, "다음: 즉, a, b, 또는 c 중 적어도 하나"는 다음을 커버하도록 의도된다: a, b, c, a-b, a-c, b-c, 및 a-b-c.
본 발명에 따른 나노미립자 물질을 설명하는 것을 돕기 위해, 도 1을 참조한다. 도 1은 본 발명에 따른 나노미립자 물질(10)의 개략도를 예시한다. 나노미립자 물질 자체(20)는 산화철 나노미립자 물질로 표현된다. 나노미립자 물질(20)의 표면에는 (i) 피처(feature)(30), (40) 및 (50)에 의해 집합적으로 표현되는 공중합 매핑 모이어티(moiety), 및 (ii) 피처 (30) 및 (60)에 의해 집합적으로 표현되는 공중합 입체 안정화제가 결합된다. 공중합 매핑 모이어티는 고정화 고분자 절편(segment)(30) 및 결합 고분자 절편(40)을 포함하며, 여기서 고정화 고분자 절편 및 결합 고분자 절편은 상이하다. 결합 고분자 절편(40)은 그것에 결합되는 하나 이상의 매핑기(50)를 갖는다. 공중합 입체 안정화제는 입체 안정화 고분자 절편(60)에 결합되는 고정화 고분자 절편(30)을 포함하며, 여기서 고정화 고분자 절편(30)은 입체 안정화 고분자 절편(60)과 상이하다. 결합 고분자 절편(40)은 입체 안정화 고분자 절편(60)보다 더 많은 중합된 단량체 잔기 단위를 함유하며 그것에 의해 하나 이상의 매핑기(50)가 입체 안정화 고분자 절편(60)에 비해 나노미립자 물질(20)의 표면으로부터 더 먼 거리로 연장될 수 있게 한다.
"나노(nano)" 미립자 물질인 미립자 물질은 그것의 치수 중 적어도 하나가 100 nm 미만, 또는 약 75 nm 미만, 또는 약 50 nm 미만, 또는 약 30 nm인 것을 의미한다. 일 구현예에서, 나노미립자 물질의 모든 치수는 100 nm 미만, 또는 약 75 nm 미만, 또는 약 50 nm 미만, 또는 약 30 nm 미만이다.
나노미립자 물질은 일차(primary) 입자의 형태, 또는 일차 입자의 형태 또는 응집체(aggregation)일 수 있다. 일 구현예에서, 그들은 일차 입자의 형태이다.
임의의 여지를 회피하기 위해, 나노미립자 물질의 "크기(size)에 대한 본원에서의 언급은 주어진 입자의 최대 치수에 기초하여 입자의 평균 크기(적어도 약 50 넘버 %)를 나타내도록 의도된다.
나노미립자 물질 자체의 크기는 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)에 의해 본원에서 결정된다.
임의의 여지를 회피하기 위해, 나노미립자 물질이 일차 입자의 응집체의 형태일 때, 그러한 물질의 크기에 대한 언급은 응집체를 형성하는 일차 입자가 아닌 응집체의 가장 큰 치수에 대한 언급인 것으로 의도된다.
특정 구현예에서, 나노미립자 물질은 적어도 하나 또는 모든 치수에서 약 50 nm 미만의 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 나노미립자 물질은 적어도 하나 또는 모든 치수에서 범위가 약 5 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 20 nm, 또는 약 8 nm 내지 약 15 nm에 이르는 크기를 갖는다.
일 구현예에서, 나노미립자 물질은 약 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 nm인 크기를 갖는다.
나노미립자 물질은 전형적으로 그것의 의도된 적용에서 전형적으로 경험되는 온도에서 고체인 외부 표면을 적어도 가질 것이다. 그들의 의도된 적용에서 사용 및 사용 전 보관 동안 나노미립자 물질 또는 조성물에 의해 경험될 수 있는 온도를 고려하면, 나노미립자 물질의 적어도 외부 표면은 일반적으로 적어도 약 40℃, 바람직하게는 약 50℃까지 고체 상태일 것이다. 나노미립자 물질은 물론 전체에 걸쳐 그러한 고체 상태 조성물을 가질 수 있고, 일부 구현예에서 그러할 수 있다(즉, 고체 나노미립자 물질임).
의학적 또는 진단적 유용성을 갖는 것을 제외하고, 나노미립자 물질의 조성에 대한 특별한 제한은 없다. 나노미립자 물질은 유기 조성물 또는 무기 조성물 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 나노미립자 물질은 약학적 활성 화합물(예를 들어, 약물), 금속, 금속 합금, 금속 염, 금속 착물, 금속 산화물, 방사성 동위원소, 발광 화합물 또는 기(group) 및/또는 이들의 조합으로부터 선택되거나 이를 포함할 수 있다.
적합한 나노미립자 물질은 금, 은 및 이들의 염, 착물 또는 산화물, 탄산칼슘, 황산바륨, 황화비스무트, 철, 산화철, 산화크롬, 산화코발트, 산화망간, 옥시수산화철, 옥시수산화크롬, 옥시수산화코발트, 옥시수산화망간, 이산화크롬, 다른 전이 금속 산화물, 오제(Auger)-전자 방출제, 알파 방출제, 양전자 방출제 및 베타 방출제로부터 선택되는 방사성 동위원소, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
오제(Auger)-전자 방출제의 예는 51Cr, 67Ga, 71Ge, 75Se, 77Br, 80mBr, 99mTc, 103Pd, 103mRh, 111In, 113mIn, 115mIn, 117mSn, 119Sb, 123I, 125I, 131Cs, 161Ho, 165Er, 193mPt, 195mPt, 201Tl 및 203Pb를 포함한다.
알파 방출제의 예는 211At 및 213Bi를 포함한다.
베타 방출제의 예는 다음을 포함한다: 저에너지 β 방출제 예컨대 191Os, 35S, 33P, 45Ca, 199Au, 169Er, 67Cu, 47Sc, 177Lu, 161Tb, 및 105Rh; 중간 에너지 β 방출제 예컨대 131I, 153Sm, 77As, 143Pr, 198Au, 159Gd, 109Pd, 186Re, 111Ag, 및 149Pm; 및 고에너지 β 방출제 예컨대 165Dy, 89Sr, 32P, 166Ho, 188Re, 114mIn, 142Pr, 90Y, 및 76As.
방사선 요법에서 사용될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 32P, 153mS, 90Y, 125I, 192Ir, 103Pd, 111In, 166Ho 및 213Bi를 포함한다.
진단제로서 사용될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 99m Tc, 67Ga, 64Cu, 89Zr 및 18F를 포함한다.
진단제로서 사용될 수 있는 양전자-방출제의 예는 갈륨-68, 구리-64, 지르코늄-89, 이트륨-86, 루비듐-82, 스칸듐-44, 다중 동위원소 of 구리, 테르븀-182, 갈륨-66, 및 코발트-55를 포함한다.
방사성 동위원소가 사용되는 경우, 방사성핵종(들)은 나노미립자 물질 자체(per se)로서 사용될 수 있거나 하나 이상의 다른 적합한 나노미립자 물질과 결합될 수 있다. 다시 말해서, 나노미립자 물질은 하나 이상의 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 67Ga는 그것이 산화철 미립자 물질과 결합되는 형태로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 나노미립자 물질은 자성(magnetic)이다. 그러한 자성 나노미립자 물질은 강자성(ferromagnetic), 페리자성(ferrimagnetic) 또는 초상자성(superparamagnetic) 특성을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 나노미립자 물질은 초상자성이다.
나노미립자 물질은 자성 물질로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.
적합한 자성 물질의 예는 철, 니켈, 크롬, 코발트, 가돌리늄, 망간, 전술한 것 중 임의의 것의 산화물 또는 옥시수산화물, 및 전술한 것 중 임의의 것의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 자성 나노입자는 철 및/또는 이것의 산화물 또는 옥시수산화물을 포함한다. 적합한 산화철 자성 물질은 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 및 마그네타이트(Fe3O4)를 포함한다.
일 구현예에서, 자성 나노미립자 물질은 철, 니켈, 크롬, 코발트, 가돌리늄, 망간 및 이들의 산화물 또는 옥시수산화물 중 하나 이상을 포함한다.
다른 구현예에서, 자성 나노미립자 물질은 철(Fe), 마그헤마이트(γ-Fe2O3), 마그네타이트(Fe3O4) 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 자성 나노미립자 물질은 약 30 nm 미만, 예를 들어 약 1 nm 내지 20 nm 사이의 입자 크기를 갖는 마그네타이트(magnetite)(Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite)(γ-Fe2O3)이거나 이를 포함한다.
자성 나노미립자 물질은 코어 물질 주위의 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 쉘과 같은 자성 금속 산화물 쉘(shell)에 의해 둘러싸이는 철과 같은 금속의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 자성 나노미립자 물질은 일반식 MO.Fe2O3의 페라이트이거나 이를 포함하며 여기서 M은 2가 금속 예컨대 Fe, Co, Ni, Mn, Be, Mg, Ca, Ba, Sr, Cu, Zn, Pt, Gd 또는 이들의 혼합물이거나, 일반식 MO.6Fe2O3의 마그네토플럼바이트 유형 산화물이며 여기서 M은 큰 2가 이온, 금속 철, 코발트 또는 니켈이다. 자성 나노미립자 물질은 Fe, Zn, Ni, Cr,Co 또는 Gd 또는 이들의 산화물 또는 옥시수산화물로 구성될 수 있다. 대안적으로, 자성 나노미립자 물질은 그들 중 임의의 것의 혼합물일 수도 있다.
일부 적용에서, 초상자성인 자성 나노미립자 물질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "초상자성"은 다음 특성을 갖지 않는 자성 물질을 의미하도록 의도된다; (i) 보자력, (ii) 잔류자기, 또는 (iii) 인가된 자기장의 변화율이 준-정적일 때 히스테리시스 루프.
일부 구현예에서, 나노미립자 물질은 발광 물질이거나 이를 포함한다.
그러한 발광 물질은 화학발광(예를 들어, 생물발광, 전기화학발광, 칸돌발광, 리오발광), 전계발광, 광발광(예를 들어, 형광 또는 인광), 방사선발광 또는 열발광일 수 있다. 그러한 발광 물질의 예는 본원에 설명되는 발광기(luminescent group)를 포함한다.
발광 물질은 나노 특정 물질의 전부 또는 일부를 형성할 수 있다. 예를 들어, 발광 물질은 나노미립자 물질을 형성하기 위해 다른 물질 내에 캡슐화될 수 있다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질은 액체에서 나노미립자 물질의 분산을 촉진하는 그것의 표면에 결합되는 공중합 입체 안정화제를 갖는다. 그러한 액체는 본원에 설명되는 바와 같이 담체 액체 또는 in-vivo 액체일 수 있다. 그러한 맥락에서 "촉진하다(promotes)"는 공중합 입체 안정화제의 부재에서 나노미립자 물질이 침전물로서 액체로부터 달리 엉기거나, 응집되거나 침전되는 것을 의미한다. 다시 말해서, 공중합 입체 안정화제는 나노미립자 물질을 액체 내에서 분산된 상태로 유지하도록 기능한다.
공중합 "입체" 안정화제인 것은 액체 내 나노미립자 물질의 분산이 입체 반발력의 결과로서 발생한다는 것을 의미한다. 그렇긴 해도, 공중합 입체 안정화제는 또한 나노미립자 물질의 안정화를 돕는 정전기적 반발력을 나타낼 수 있다. 그러나, 당업자는 그러한 정전기력이 상대적으로 높은 이온 강도를 갖는 액체에서 있어도 극히 적은 안정화 기능을 제공할 것임을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 공중합 입체 안정화제의 입체 안정화 기능은 나노미립자 물질이 그러한 액체에서 분산된 상태로 유지되게 하거나 안정된 상태로 남아 있게 할 수 있는 데 중요한 역할을 한다.
본 발명에 따라 사용되는 공중합 입체 안정화제는 in-vivo 액체 환경에서 나노미립자 물질의 분산을 촉진하는 데 특히 효과적인 것으로 발견되었다.
본원에 사용되는 바와 같이, "고분자(polymeric)" 또는 "고분자 절편(polymer segment)"과 같은 용어는 단량체의 중합으로부터 유도되는 고분자 사슬에 대한 언급인 것으로 의도된다. 따라서, 고분자 성분 또는 고분자 절편은 중합된 단량체 잔기 단위를 포함하거나 이로 이루어질 것이다. 그러한 고분자 성분 또는 고분자 절편은 임의의 적합한 중합 기술에 의해 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 설명되는 고분자 절편(예를 들어, 고정화, 입체 안정화 및 결합)은 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 중합에 의해 제조된다. 고분자 사슬은 그들에 공유적으로 부착되는 비-고분자 성분, 예를 들어 매핑기 또는 발광기를 가질 수 있다(그리고 일부는 그렇함). 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "공중합체(copolymeric)"는 상이한 조성의 2개의 고분자 절편을 포함하는 고분자 사슬을 의미하도록 의도된다.
본 발명에 따라 사용되는 공중합 입체 안정화제는 입체 안정화 고분자 절편을 포함한다.
당업자는, 중합되어 그러한 고분자를 형성할 수 있는 단량체에 관하여, 입체 안정화 고분자 절편으로서 이용될 수 있는 다양한 고분자를 인식할 것이다. 입체 안정화 고분자 절편은 폴리아크릴아미드(PA), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리아킬렌 산화물(예를 들어, 폴리에틸렌 산화물(PEO), 폴리프로필렌 산화물(PPO)), 폴리옥사머, 폴리히드록실에틸아크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리디메틸아미노-에틸메타크릴레이트, 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 폴리아크릴산(PAA), 폴리메타크릴아미드, 폴리 비닐 에스테르, 폴리 비닐 아미드, 폴리술폰화디비닐벤젠, 폴리-L-리신, 폴리아스파르테이트, 폴리 락틱산, 폴리에틸렌이민, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아스파르테이트, 폴리말릭 무수물, 폴리말릭산, 또는 전술한 것 중 2개 이상의 공중합체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 따라서, 입체 안정화 고분자 절편을 형성하기 위해 사용될 수 있는 적합한 단량체는 아크릴아미드, 비닐알코올, 알킬렌 산화물(예를 들어, 에틸렌 산화물, 프롤필렌 산화물), 하이드록시에틸아크릴레이트, N-이소프로필아크릴아미드, 디메틸아미노-에틸메타크릴레이트, 비닐 피롤리돈, 아크릴산, 메타크릴아미드, 비닐 에스테르, 비닐 아미드, 술폰화비닐벤젠, L-라이신, 아스파르테이트, 젖산, 에틸렌이민, 알킬시아노아크릴레이트, 아스파르테이트, 말레산 무수물, 말레산, 또는 전술한 것 중 2개 이상의 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
입체 안정화 고분자 절편이 폴리아킬렌 산화물을 포함하는 경우, 폴리아킬렌 산화물은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다. 폴리아킬렌 산화물 고분자는 알킬기로 말단 캡핑될 수 있다. 알킬기는 C1 내지 C6 알킬기, 예컨대 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 이소프로필기일 수 있다.
입체 안정화 고분자 절편이, 그것의 수평균 분자량의 관점에서 입체 안정화 고분자 절편을 정의하기 보다는, 공중합 입체 안정화제의 단지 일부를 형성한다는 것을 고려해 볼 때, 그것은 대신에 절편을 집합적으로 형성하는 중합된 단량체 단위의 수를 언급하는 것이 유용할 수 있다. 입체 안정화 고분자 절편을 집합적으로 형성할 수 있는 그러한 단위의 수에 대한 특별한 제한은 없지만, 본 발명의 일부 구현예에서 입체 안정화 고분자 절편이 약 70개 미만의 중합된 단량체 잔기 단위를 포함하고, 특정 구현예에서, 약 40개 내지 약 60개의 중합된 단량체 잔기 단위, 예컨대 전체 고분자 절편을 구성하는 약 50개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 약 10개 내지 약 70개의 중합된 단량체 잔기 단위를 포함한다.
입체 안정화 고분자 절편은 호모폴리머(homopolymer) 또는 공중합체일 수 있다.
일 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 폴리아크리아미드-코-폴리아킬렌 산화물 블록 공중합체를 포함하거나 이로 구성된다. 그러한 블록 공중합체는 약 8개 내지 약 60개의 중합된 아크릴아미드 단위 및 약 2개 내지 약 10개의 중합된 알킬렌 산화물 단위를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
다른 구현예에서, 입체 안정화 고분자 절편은 약 10개 내지 약 13개의 중합된 알킬렌 산화물 단위를 포함한다.
당업자는 중합된 알킬렌 산화물 단위가 폴리 알킬렌 산화물을 제공하다는 것을 인식할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 고분자 입체 안정화제, 고분자 매핑 모이어티 및 고분자 발광 모이어티는 각각 고정화 고분자 절편을 포함한다.
"고정화 고분자 절편"은 고분자 사슬이고, 나노미립자 물질의 표면에 대한 친화력을 갖고 주어진 엔티티를 하나 이상의 결합기를 통해 나노미립자 물질에 고정시키도록 기능하는 주어진 고분자 엔티티(예를 들어, 고분자 입체 안정화제, 고분자 매핑 모이어티 및 고분자 발광 모이어티)의 절편 또는 영역을 의미한다. 하나 이상의 결합기는 고분자 사슬 백본의 일부를 형성할 수 있거나 그들은 고분자 사슬 백본으로부터 펜던트로 존재할 수 있다. 결합기는 나노미립자 물질에 대해 결합 친화력을 갖는 임의의 요소 또는 분자일 수 있다. 예를 들어, 결합기는 철 또는 산화철에 대해 결합 친화력을 갖는 임의의 요소 또는 분자일 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 결합기는 하나 이상의 인(P) 원자를 포함하는 기(group), 하나 이상의 산소(O) 원자를 포함하는 기(group), 하나 이상의 황(S) 원자를 포함하는 기(group), 하나 이상의 질소(N) 원자를 포함하는 기(group) 및 전술한 원자 중 임의의 2개 이상을 포함하는 기(group)를 포함한다.
일 구현예에서, 고정화 고분자 절편은 포스페이트기, 포스포네이트기, 디머캅토숙신산(dimercaptosuccinic acid; DMSA)기, 설페이트기, 설포네이트기, 카테콜기, 카르복실레이트기, 아민기, 및 실란기로부터 선택되는 하나 이상의 결합기를 포함한다.
고분자 절편이 됨으로써, 고정화 고분자 절편이 중합된 단량체 잔기를 포함한다는 것이 인식될 것이다. 특히, 절편은 나노미립자 물질을 향하여 필요한 결합 친화력을 발생시키는 중합된 단량체 잔기를 포함할 것이다. 고정화 고분자 절편을 구성하는 중합된 단량체 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다.
나노미립자 물질과의 결합 상호작용을 위한 다수의 부위(site)를 제시하는 고정화 고분자 절편의 능력은 공중합 입체 안정화제에 의해 제공되는 탁월한 안정화 특성을 적어도 부분적으로 발생시키는 것으로 믿어진다.
고정화 고분자 절편은 자성 나노입자와의 결합을 위한 부위를 각각 제공하는 적어도 2개의 중합된 단량체 잔기, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 10개의 그러한 중합된 단량체 잔기를 가질 수 있다. 고정화 고분자 절편을 구성하는 중합된 단량체 잔기 모두가 나노미립자 물질과의 결합 상호작용을 발생시키기 위해 반드시 필요한 것은 아니지만, 고정화 고분자 절편을 구성하는 중합된 단량체 잔기 모두가 나노미립자 물질과의 결합 상호작용을 발생시키지 않더라도 대부분이 일반적으로 바람직하다.
따라서, 고정화 고분자 절편은 주어진 엔티티를 나노미립자 물질에 집합적으로 고정하거나 결합하는 다수의 부위를 갖는 것으로 설명될 수 있다.
원하는 고정화 효과를 제공하기 위해, 고정화 고분자 절편은 나노미립자 물질에 대한 결합 친화력을 가질 것이다. 고정화 고분자 절편이 나노미립자 물질에 결합하는 모드는 정전기력, 수소 결합, 이온 전하, 반 데르 발스 힘, 또는 임의의 이들의 조합으로 인한 것일 수도 있다. 고정화 고분자 절편에 의해 제공되는 특별한 이점은 그것이 나노미립자와의 결합 상호작용을 위한 다수의 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 따라서, 주어진 결합 부위가 단지 나노미립자 물질과의 상대적으로 약한 상호작용을 제공하는 경우라도, 절편 내의 다수의 그러한 부위의 존재는 그것이 전체적으로 나노미립자 물질과 단단히 결합하게 할 수 있다.
일 구현예에서, 고정화 고분자 절편은 나노미립자 물질에 공유적으로 결합되지 않는다.
필요한 고정화 고분자 절편은 일반적으로 그것이 결합할 나노미립자 물질의 특징(nature)에 의해 지시될 것이다. 당업자는 주어진 나노미립자 물질의 표면과 결합하는 적절한 고정화 고분자 절편을 선택할 수 있을 것이다.
나노미립자 물질과 고정화 고분자 절편의 상호작용을 설명할 때, 절편 및 미립자 물질의 친수성 및 소수성 특성(character)을 언급하는 것이 편리할 수 있다. 따라서, 일반적으로, 적합한 결합 상호작용은 절편 및 미립자 물질이 유사한 친수성 또는 소수성 특성을 가질 때 발생할 것이다. 예를 들어, 나노미립자 물질이 (예를 들어 그것의 표면이 수용액으로 습윤될 수 있는) 상대적으로 친수성 표면을 갖는 경우, 그 다음, 양호한 결합은 (예를 들어 그것의 분리된 형태에서 절편이 수성 매체에서 용해될 수도 있는) 친수성 특성을 갖는 고정화 고분자 절편을 사용하여 달성되어야 한다. 그러한 예는 미립자 물질이 그것의 표면 상에 전하를 형성할 수 있는 유형인 경우 실현될 수도 있다. 그러한 경우, 절편과 미립자 물질 사이의 이온 결합을 촉진하기 위해 절편이 또한 전하를 형성할 수 있는 단량체의 중합된 잔기(예를 들어 이온화가능한 단량체의 중합된 잔기)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 하전된 종의 형성을 촉진하는 것은 안정화제 및 미립자 물질이 존재하는 액체 담체의 pH를 조정함으로써 용이하게 될 수도 있다.
표현 "이온화가능한 단량체"는 단량체가 양이온성 또는 음이온성 기(group)를 형성하기 위해 용액에서 이온화될 수 있는 작용기를 포함한다는 것을 의미한다. 그러한 작용기는 일반적으로 양성자의 손실 또는 수용을 통해 산성 또는 염기성 조건 하에서 이온화될 수 있을 것이다. 일반적으로, 작용기는 산성기 또는 염기성기이다(즉, 각각 H 원자를 공여하거나 수용할 수 있는 기). 예를 들어, 카르복실산 작용기는 염기성 조건 하에서 카르복실레이트 음이온을 형성할 수 있고, 아민 작용기는 산성 조건 하에서 사차 암모늄 양이온을 형성할 수 있다. 작용기는 또한 이온 교환 프로세스를 통해 이온화될 수 있을 수 있다.
당업자는, 그러한 고분자를 형성하기 위해 중합될 수 있는 단량체에 관하여, 고정화 고분자 절편으로서 이용될 수 있는 다양한 고분자를 인식할 것이다. 예를 들어, 적합한 고분자는 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리스티렌, 폴리이타코닉산, 폴리-p-스티렌 카르복실산, 폴리-p-스티렌 설폰산, 폴리비닐 설폰산, 폴리비닐 포스폰산, 폴리 모노아크릴옥시에틸 포스페이트, 폴리 모노아크릴옥시에틸 포스폰산, 폴리-2-(메타크릴로일옥시) 에틸 포스페이트, 폴리-2-(메타크릴로일옥시)에틸 포스폰산, 폴리에타크릴산, 폴리-알파-클로로아클릴산, 폴리크로톤산, 폴리푸마르산, 폴리시트라콘산, 폴리메사콘산, 폴리말릭산, 폴리-2-(디메틸 아미노) 에틸 및 프로필 아크릴레이트 및 메타크릴레이트, 대응하는 폴리-3-(디에틸아미노) 에틸 및 프로필 아크릴레이트 및 메타크릴레이트, 폴리디메틸아미노에틸메타크릴레이트, 및 이들의 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 고정화 고분자 절편을 형성하기 위해 사용될 수 있는 적합한 단량체는 아크릴산, 메타클릴산, 이타콘산, p-스티렌 카르복실산, p-스티렌 설폰산, 비닐 설폰산, 비닐 포스폰산, 모노아크릴옥시에틸 포스페이트, 모노아크릴옥시에틸포스폰산, 2-(메타크릴로일옥시) 에틸 포스페이트, 2-(메타크릴로일옥시) 에틸 포스폰산, 에타크릴산, 알파-클로로아클릴산, 크로톤산, 푸마르산, 시트라콘산, 메사콘산, 말레산, 2-(디메틸 아미노) 에틸 및 프로필 아크릴레이트 및 메타크릴레이트, 대응하는 3-(디에틸아미노) 에틸 및 프로필 아크릴레이트 및 메타크릴레이트, 디메틸아미노에틸메타크릴레이트, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
고정화 고분자 절편은 약 1개 내지 약 20개의 포스포네이트기, 예컨대 1개의 포스포네이트기, 2개의 포스포네이트기, 3개의 포스포네이트기, 4개의 포스포네이트기, 5개의 포스포네이트기, 6개의 포스포네이트기, 7개의 포스포네이트기, 8개의 포스포네이트기, 9개의 포스포네이트기 또는 10개의 포스포네이트기, 11개의 포스포네이트기, 12개의 포스포네이트기, 13개의 포스포네이트기, 14개의 포스포네이트기, 15개의 포스포네이트기, 16개의 포스포네이트기, 17개의 포스포네이트기, 18개의 포스포네이트기, 19개의 포스포네이트기 또는 20개의 포스포네이트기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고정화 고분자 절편은 20개보다 많은 포스포네이트기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 고정화 고분자 절편은 5개의 포스포네이트기를 포함한다.
고정화 고분자 절편은 한 유형의 단량체의 중합 또는 둘 이상의 상이한 단량체의 조합에 의해 형성될 수 있다. 따라서, 고정화 고분자 절편은 호모폴리머 절편 또는 공중합체 절편일 수 있다.
고정화 고분자 절편을 집합적으로 형성하는 중합된 단량체 단위의 수에 대한 특별한 제한은 없지만, 본 발명의 일부 구현예에서 그것이 상대적으로 낮은 수평균 분자량을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 고정화 고분자 절편은 (전체 절편을 구성하는) 약 50개 미만, 또는 약 40개 미만, 또는 약 30개 미만, 또는 약 5개 내지 약 25개, 또는 약 5개 내지 약 15개의 중합된 단량체 잔기 단위를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 고정화 고분자 절편은 1개 내지 약 30개의 중합된 단량체 잔기 단위를 포함한다.
일 구현예에서, 고정화 고분자 절편은 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체의 중합된 잔기로 구성된다.
고정화 고분자 절편은 공중합 입체 안정화제, 공중합 매핑 모이어티 또는 공중합 발광 모이어티를 형성하기 위해 입체 안정화 고분자 절편 또는 결합 고분자 절편에 공유적으로 결합된다.
고정화 고분자 절편은 입체 안정화 고분자 절편 또는 결합 고분자 절편과 다르며 그것에 의해 공중합 입체 안정화제, 공중합 매핑 모이어티 및 공중합 발광 모이어티의 공중합체 특징을 제공한다.
고분자 매핑 모이어티 및 고분자 발광 모이어티는 (사용될 때) 결합 고분자 절편을 포함한다. 결합 고분자 절편은 고정화 고분자 절편에 공유적으로 결합된다. "결합(coupling)" 고분자 절편인 것은 그것이 본원에 설명되는 바와 같이 고정화 고분자 절편을 매핑기 또는 발광기에 링크 또는 연결시키는 사슬이라는 것을 의미한다. 따라서, 그러한 매핑기 또는 발광기는 일반적으로 결합 고분자 절편에 공유적으로 결합될 것이다. 결합 고분자 절편은 또한 나노미립자 물질 표면으로부터 매핑기 및 발광기를 분리하고 이동시키는 역할을 하며 그것에 의해 그들을 보다 기능적으로 만들며, 예를 들어 매핑기의 경우 표적 부위 상의 수용체에 보다 이용가능하게 만든다.
당업자는, 그러한 고분자를 형성하기 위해 중합될 수 있는 단량체에 관하여, 결합 고분자 절편으로서 이용될 수 있는 다양한 고분자를 인식할 것이다. 예를 들어, 적합한 고분자는 폴리아크릴아미드(PA), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리아킬렌 산화물(예를 들어, 폴리에틸렌 산화물(PEO) 및 폴리프로필렌 산화물(PPO)), 폴리옥사머, 폴리히드록실에틸아크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리디메틸아미노-에틸메타크릴레이트, 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 폴리아크릴산(PAA), 폴리메타크릴아미드, 폴리 비닐 에스테르, 폴리 비닐 아미드, 폴리술폰화디비닐벤젠, 폴리-L-리신, 폴리아스파르테이트, 폴리 락틱산, 폴리에틸렌이민, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아스파르테이트, 폴리말릭 무수물, 폴리말릭산, 또는 전술한 것 중 어느 하나의 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 결합 고분자 절편을 형성하기 위해 사용될 수 있는 적합한 단량체는 아크릴아미드, 비닐알코올, 알킬렌 산화물(예를 들어 에틸렌 산화물 및 프롤필렌 산화물), 하이드록시에틸아크릴레이트, N-이소프로필아크릴아미드, 디메틸아미노-에틸메타크릴레이트, 비닐 피롤리돈, 아크릴산, 메타크릴아미드, 비닐 에스테르, 비닐 아미드, 술폰화비닐벤젠, L-라이신, 아스파르테이트, 젖산, 에틸렌이민, 알킬시아노아크릴레이트, 아스파르테이트, 말레산 무수물, 말레산, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 결합 고분자 절편은 약 100개 미만의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖고, 특정 구현예에서, 전체 고분자 절편을 구성하는 약 30개 내지 약 80개의 중합된 단량체 잔기 단위, 또는 약 50개 내지 약 80개의 중합된 단량체 잔기 단위, 예컨대 약 70개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는다.
일 구현예에서, 결합 고분자 절편은 폴리아크릴아미드를 포함하거나 이로 구성된다.
다른 구현예에서, 결합 고분자 절편은 약 10개 내지 약 100개의 중합된 단량체 잔기 단위를 포함하거나 이로 구성된다.
고분자 매핑 모이어티 및 발광 모이어티 중 하나 또는 둘 다의 결합 고분자 절편의 추가 구현예에서 입체 안정화 고분자 절편보다 더 많은 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는다. 예를 들어, 결합 고분자 절편은 입체 안정화 고분자 절편보다 적어도 2개, 또는 적어도 4개, 적어도 6개, 또는 적어도 8개, 적어도 10개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 16개, 또는 적어도 18개, 또는 적어도 20개 더 많은 중합된 단량체 잔기 단위를 가질 수 있다. 결합 고분자 절편은 입체 안정화 고분자 절편보다 약 5개 내지 약 70개, 또는 약 5개 내지 약 60개, 또는 약 5개 내지 약 40개, 또는 약 5개 내지 약 20개, 또는 약 40개 내지 약 70개, 또는 약 50개 내지 약 70개 더 많은 중합된 단량체 잔기 단위를 가질 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 결합 고분자 절편에 입체 안정화 고분자 절편보다 더 많은 중합된 단량체 잔기 단위를 제공하는 것은 대식세포에서 단백질 흡착 및 후속 세포 흡수(uptake)의 경향이 덜한 표면 환경을 생성하는 역할을 한다고 믿어진다. 그것은 차례로 종양 미세환경에서 나노미립자 물질의 축적을 개선하는 것으로 믿어진다.
당업자는 그러한 각각의 고분자 절편의 필요한 기능을 제공하기 위해 주어진 나노미립자 물질과 함께 사용하기 위한 입체 안정화, 고정화 및 결합 고분자 절편의 적합한 조합을 선택할 수 있을 것이다.
공중합 매핑 모이어티 및 공중합 발광 모이어티는 각각 하나 이상의 매핑기 또는 하나 이상의 발광기를 각각 포함한다. 그러한 매핑기 및 발광기는 일반적으로 각각의 모이어티의 결합 고분자 절편에 공유적으로 결합될 것이다.
본원에 설명되는 바와 같은 하나 이상의 매핑기는 섬유아세포활성화 단백질(fibroblast activation protein; FAP)에 특이적으로 결합하는 제제(agent)를 포함한다
"섬유아세포활성화 단백질" 또는 "FAP"는 다양한 호로몬 및 세포외 기질 성분에 작용하는 세포 표면-발현 단백질 분해효소이다. 구조적으로, FAP는 6개의 아미노산 세포질 테일, 단일 20개의 아미노산 막횡단 도메인, 및 734개의 아미노산 세포외 도메인으로 구성된다.
FAP는 발달 동안 발현되며, 극히 드물게 건강한 성인 조직에서 발현된다. 대조적으로, FAP는 매우 다양한 암 및 종양 미세환경의 세포에서 고도로 상향조절된다.
따라서, FAP에 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 하나 이상의 매핑기는 코팅된 나노입자의 투여 시 피험자의 종양-연관 간질 세포에 선택적으로 결합할 수 있을 것이다. 적합한 매핑기는 섬유아세포활성화 단백질 억제제, 펩티드, 단백질, 및 FAP에 표적화되는 항체를 포함한다.
구현예에서, 제제는 소분자 억제제 및 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편으로부터 구성되는 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 제제는 소분자 억제제이다. 다른 구현예에서, 제제는 FAP 억제제이다.
적합한 FAP 억제제의 예는 다음 구조를 갖는 것들을 포함하며:
여기서 R1 및 R2는 동일하거나 상이하고, 수소, 할로겐, 및 C1-C4 알킬로 구성되는 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R3는 Ci-C4 알킬, 니트릴, 또는 이소니트릴이고;
R4, R5, 및 R6는 동일하거나 상이하고, 수소, 할로겐, 및 C1-C4 알킬로 구성되는 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
여기서, R1 및 R2 각각은 할로겐이다.
여기서, R1 및 R2 각각은 불소이다.
여기서, R3은 니트릴이다.
여기서, R4, R5, 및 R6 각각은 수소이다.
구현예에서, 제제는 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편이다.
다른 적합한 FAP 억제제의 예는 WO2013107820A1, US20200330624A1, EP3763726A1 및 US7399869B2에 설명되는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체"는, 본원에 사용되는 바와 같이, 표적 항원에 특이적으로 결합하거나, 이와 특이적으로 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; DR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결되는 2개의 무거운(H) 사슬 및 2개의 가벼운(L) 사슬을 포함하는 전장 면역글로블린 분자 뿐만 아니라, 그것의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄(heavy chain)는 중쇄 가변 영역(HCVR, VH 또는 VH로서 약칭될 수 있음) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 다음의 3개의 도메인을 포함한다 - CH1, CH2 및 CH3. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR, VL, VK, VK 또는 VL로서 약칭될 수 있음) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 하나의 도메인(CL1)을 포함할 것이다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework region; FR)으로서 또한 지칭되는 보다 보존적인 영역으로 산재되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)으로 칭해지는 초가변성(hypervariability) 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시 말단으로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
또한, 본원에 사용되는 바와 같이, "면역글로블린"(Ig)은 이로써 클래스 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD(또는 그것의 임의의 서브클래스)에 속하는 단백질로서 정의되고, 모든 종래에 공지된 항체 및 그것의 기능적 단편을 포함한다. 항체/면역글로블린의 "기능적 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항체/면역글로블린의 단편(예를 들어, IgG의 가변 영역)으로서 정의된다.
항체의 "항원-결합 영역" 또는 "항원-결합 단편"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 즉, CDR-1, -2, 및/또는 -3 영역에서 발견되며; 그러나, 가변 "프레임워크(framework)" 영역은 또한 CDR에 대한 스캐폴드를 제공하는 것과 같이 항원 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. "기능적 단편"은 F(ab')2 단편의 도메인, Fab 단편, scFv 또는 단일 면역글로블린 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩티드, 예를 들어 단일 중쇄 가변 도메인 또는 단일 경쇄 가변 도메인을 포함하는 작제물(construct)을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에서 발생하는 분자간 이황화물 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
하나 이상의 발광기(luminescent group)는 일부 형태의 자극 후에 원하는 파장에서 전자기 방사선 또는 음향 에너지를 방출하는 임의의 화학적 엔티티(entity)일 수 있다. 발광기는 화학발광(예를 들어 생물발광), 전계발광, 광발광, 방사성발광 또는 열발광일 수 있다. 특정 구현예에서, 발광기는 광자의 흡수 후에 특정 파장에서 광을 방출하는 광발광기이다. 광발광기 형광 또는 인광일 수 있다.
특정 구현예에서, 발광기는 시아닌 염료의 군에 속하는 형광기(fluorescent group)이다. 적합한 형광기는 인도시아닌 그린(ICG; 나트륨 4-[2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-[1,1-디메틸-3-(4-설포나토부틸)벤조[e]인돌-2-일리덴]헵타-1,3,5-트리에닐]-1,1-디메틸벤조[e]인돌-3-ium-3-yl]부탄-1-설포네이트), IR 염료 예컨대 IRdye 800 및 설포시아닌 염료 예컨대 설포-Cy3, 설포-Cy5, 및 설포-Cy7을 포함한다. 적합한 염로는, 예를 들어, 미국 메릴랜드주 헌트 밸리 소재 Lumiprobe Corporation으로부터 상업적으로 이용가능하다.
일 구현예에서, 발광기는 인도시아닌 그린, 설포-Cy3, 설포-Cy5, 및 설포-Cy7로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 적어도 하나의 공중합 입체 안정화제 및 적어도 하나의 공중합 매핑 모이어티를 갖는다. 다른 구현예에서, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 적어도 하나의 공중합 입체 안정화제, 적어도 하나의 공중합 표적화 모이어티 및 적어도 하나의 공중합 발광 모이어티를 갖는다.
본원에 고려되는 바와 같이, 나노미립자 물질 또는 나노미립자 물질을 포함하는 조성물은 매핑, 진단 및/또는 치료 적용에서 사용될 수 있다.
따라서, 피험자의 종양 마진을 매핑하기 위한 방법이 제공되는 구현예에서, 방법은:
a. 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및
b. 나노미립자 물질을 검출하는 단계를 포함하며,
여기서 나노미립자 물질은 종양 미세환경에 축적되며, 그것에 의해 종양 마진을 매핑한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "매핑(mapping)" 또는 "종양 매핑(tumour mapping)"은 암에서 마진의 확립을 지칭한다. 전형적으로, 종양 매핑은 종양의 위치와 정도를 결정하기 위해 암에 대한 치료제의 투여 이전에 수행된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "종양" 및 "암"은 비정상 세포 증식과 연관되는 임의의 상태를 의미한다. 그러한 상태는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 구현예에서, 종양은 원발성 종양이다. 다른 구현예에서, 종양은 고형 종양이다.
구현예에서, 암은 전립선암, 다형성 교아종, 신경교종, 췌장암, 결장암, 유방암, 두경부암, 위암, 식도암, 난소암, 육종 및 폐암으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 암은 전립선암이다.
구현예에서, 종양은 in situ 매핑된다. 종양은 종양 조직 절제 이전 또는 이후에 in situ 매핑될 수 있다. 종양이 종양 조직 절제 이후에 매핑되는 맥락에서, 예를 들어 전통적인 병리학을 통해, 종양 조직 절제가 피험자로부터 모든 종양 조직을 완전히 제거하지 않았다는 것을 확립하는 것이 흔한 일이 아니라는 것을 종양 절제 이후에 인식될 것이다. 본 발명에 따른 나노미립자 물질은 유리하게는 실시간으로 그리고 전통적인 병리학 시험에 대한 필요 없이 모든 종양 조직이 실제로 절제되었다는 것을 확인하기 위해 종양 매핑이 종양 조직 절제 이후에 in situ 수행되게 할 수 있다.
구현예에서, 나노미립자 물질은 초음파, X-레이, 광학 이미징, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 및 자기 공명 영상(MRI)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 in-vivo 영상 기술을 사용하여 검출된다.
다른 구현예에서, 방법은 치료제의 투여 이전에 임상 표적 부피(clinical target volume; CTV) 및/또는 총 표적 부피(gross target volume; GTV)을 결정하는 단계를 더 포함한다.
"총 종양 부피" 또는 "GTV"는 총 종양의 위치 및 범위, 즉, d보이거나, 촉진되거나 영상화될 수 있는 종양 매스(mass)를 지칭한다.
"임상 표적 부피" 또는 "CTV"는 GTV 플러스 아임상(sub-clinical) 질병 스프레드를 위한 마진을 포함하는 종양 부피를 지칭한다. CTV는 치료를 달성하기 위해 적절하게 처리되어야만 한다는 것이 일반적으로 당업계에서 인식된다.
CTV 및 GTV의 계산을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예시적 예는 Burnet 등에 의해 설명되는 방법을 포함한다(2004, Cancer Imaging, 4(2): 153-161).
본원에 개시되는 다른 양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 피험자에서 암의 치료를 위한 방법이 제공되며, 방법은:
a. 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계;
b. 나노미립자 물질이 축적되는 피험자의 부위를 검출하는 단계; 및
c. 단계(b)에서 검출된 나노미립자 물질 부위에 상기 암에 대한 유효량의 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
암의 치료를 위한 치료 요법(regimen)은 당업자에 의해 결정될 수 있고 전형적으로 피험자의 연령, 체중 및 일반 건강에 더하여 종양의 유형, 크기, 단계 및 수용체 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 요인에 의존할 것이다. 다른 결정적인 요인은 재발성 질병을 발생시키는 위험일 수 있다. 예를 들어, 재발성 질병을 발생시키는 위험이 높거나 더 높은 것으로서 식별되는 피험자의 경우, 보다 공격적인 치료 요법이 재발성 질병을 발생시키는 위험이 낮거나 더 낮은 것으로 간주되는 피험자와 비교해서 처방될 수 있다. 유사하게, 보다 진행된 단계의 암, 예를 들어, III기 또는 IV기 질병을 갖는 것으로서 식별되는 피험자의 경우, 보다 공격적인 치료 요법이 덜 진행된 단계의 암을 갖는 피험자와 비교하여 처방될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)" 및 "치료하는(treating)"은 상태 또는 증상을 치료하거나, 그렇지 않으면 암 또는 다른 바람직하지 않은 증상의 시작 또는 증상을 어떤 방법으로든 예방, 방해, 지연, 저지 또는 역전시키는 임의의 및 모든 용도를 지칭한다. 따라서, 용어 "치료하는(treating)" 등은 그들의 가장 넓은 가능한 맥락에서 고려되어야 한다. 예를 들어, 치료는 피험자가 완전 회복 또는 치료까지 치료되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 다수의 증상을 나타내거나 이를 특징으로 하는 상태에서, 치료는 반드시 상기 증상 모두를 치료, 예방, 방해, 지연, 폐지 또는 역전시킬 필요는 없지만, 상기 증상 증 하나 이상을 치료, 예방, 방해, 지연, 폐지 또는 역전시킬 수 있다.
암이 치료될 피험자는 인간 또는 인간에게 경제적 중요성 및/또는 사회적 중요성을 갖는 포유동물일 수 있으며, 예를 들어, 그들이 또한 인간에게 경제적 중요성을 가짐에 따라 인간 이외의 육식동물(예를 들어, 고양이 및 개), 돼지(예를 들어, 피그, 호그, 및 멧돼지), 반추동물(예를 들어, 소, 황소, 양, 기린, 사슴, 염소, 들소, 및 낙타), 말, 및 동물원에서 사육되는 멸종 위기에 처한 그러한 종류의 새를 포함하는 새, 및 조류, 및 보다 구체적으로 가축화된 조류, 예를 들어, 가금류, 예컨대 칠면조, 닭, 오리, 거위, 뿔닭 등일 수 있다. 용어 "피험자"는 특정 연령을 의미하지 않는다. 따라서, 성인, 청소년 및 신생아 피험자가 커버되도록 의도된다.
용어 "피험자(subject)", "개인(individual)" 및 "환자(patient)"는 본 개시가 적용가능할 수 있는 임의의 피험자를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 구현예에서, 피험자는 포유동물이다. 다른 구현예에서, 피험자는 인간이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "치료적 유효량"이라는 용어는 암을 치료하기에 충분한, 그러한 치료를 필요로 하는, 특히 인간과 같은 포유동물인, 피험자에게 투여되거나 적용되는 치료제의 양 또는 정도를 의미한다. 투여되거나 적용될 치료제의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 피험자 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
구현예에서, 치료는 수술, 방사선 요법, 근접 요법, 광역학 요법, 광열 요법, 냉동 절제술, 초점 레이저 절제술 및 고주파 초음파 절제술을 포함하는 초점 절제 요법, 화학요법, 면역요법 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
구현예에서, 방법은 치료제의 투여 이전에 CTV 및/또는 GTV를 결정하는 단계를 더 포함한다.
본원에 개시되는 다른 양태에서, 암을 진단하기 위한 방법이 제공되며, 방법은:
a. 본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및
b. 피험자에서 나노미립자 물질을 검출하는 단계를 포함하며;
여기서, 피험자의 조직(예컨대 혈관 조직)에서 축적된 나노미립자 물질의 검출은 피험자가 암을 갖고 있다는 것을 나타낸다.
구현예에서, 피험자의 혈관 조직에서 축적된 나노미립자 물질의 검출은 피험자가 암을 갖고 있다는 것을 나타낸다.
본 발명은 매핑, 진단 및/또는 치료 적용에서 사용하기 위한 피험자에 투여하기에 적합한 조성물을 제공하며, 조성물은 약리학적으로 허용가능한 액체 담체에 분산되는 본 발명에 따른 나노미립자 물질을 포함한다.
% wt/wt에 기초하여, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 다양한 범위의 공중합 입체 안정화제 및 공중합 매핑 모이어티를 가질 수 있다. 예를 들어, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 10%-90%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 90%-10%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 10%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 90%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 15%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 85%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 20%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 80%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 25%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 75%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 30%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 70%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 35%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 65%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 40%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 60%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 45%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 55%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 50%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 50%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 55%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 45%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 60%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 40%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 65%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 35%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 70%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 30%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 75%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 25%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 80%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 20%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티, 85%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 15%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티 또는 90%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 10%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티를 가질 수 있다. 특정의 구체적 구현예에서, 나노미립자 물질은 그것의 표면에 결합되는 70%(wt/wt)의 공중합 입체 안정화제 및 30%(wt/wt)의 공중합 매핑 모이어티를 가질 수 있다.
당업자는 본 발명에 따른 나노미립자 물질이 액체 담체에 분산될 때 유체역학적 직경을 나타낼 것임을 인식할 것이다. 유체역학적 직경은 나노미립자 물질 자체(per se)로부터 그리고 적어도 나노입자와 연관되거나 이에 결합되는 공중합 입체 안정화제 및 매핑 모이어티로부터 유도되는 거리 또는 크기이다. 따라서, 분산된 나노미립자 물질의 유체역학적 직경은 나노미립자 물질 자체 및 적어도 공중합 입체 안정화제 및 매핑 모이어티의 조합에 의해 제공되는 직경을 나타내는 것으로 보일 수 있다. 분산된 나노미립자 물질이 대칭 형상을 갖지 않는 경우, 유체역학적 직경은 분산된 나노미립자 물질에 의해 제시되는 가장 큰 유체역학적 직경인 것으로 간주될 것이다.
일 구현예에서, 분산된 나노미립자 물질의 유체역학적 직경은 약 300 nm 미만, 약 250 nm 미만, 약 100 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 25 nm 미만 또는 약 15 nm 미만이다.
추가 구현예에서, 분산된 나노미립자 물질의 유체역학적 직경은 약: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300 nm이다.
임의의 여지를 회피하기 위해, 분산된 나노미립자 물질의 "유체역학적 직경"에 대한 본원의 언급은 분산 코팅된 나노입자의 평균 직경(적어도 약 50 넘버 %)을 나타내도록 의도된다. 분산 코팅된 나노입자의 유체역학적 직경은 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS)에 의해 본원에서 결정된다.
본 발명에 따른 나노미립자 물질 또는 조성물은 초음파, X-레이, 광학 이미징, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 및 자기 공명 영상(MRI)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 in-vivo 이미징 기술과 함께 사용될 수 있다.
일 적용에서, 나노미립자 물질은 FAP 표적화기(예를 들어, 억제제)을 포함하고 그들을 포함하는 조성물은 고형 종양, 예컨대 전립선암, 교모세포종, 췌장암, 결장암, 유방암 및 폐암과 연관되는 종양 미세환경(예를 들어, 종양 연관 간질 세포 및 암 세포) 내의 세포와 같은 FAP를 발현하는 세포의 검출을 허용한다. 종양 미세환경의 세포에 의해 발현되는 FAP에 특이적으로 결합함으로써, 나노미립자 물질은 암에 의해 영향을 받는 조직의 경계 및 마진의 식별(즉, 종양 매핑)에 대해 유용하다. 또한, 나노미립자 물질 및 조성물은 암의 검출(즉, 진단)에 대해 또는 암의 치료의 일부로서 유용할 수 있다는 점이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 나노미립자 물질은 치료, 예컨대 초점 요법, 방사선 요법, 양성자 치료 또는 근접 요법의 시작 전에 종양 매핑을 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 종양 미세환경의 영역을 포함하는, 종양을 정확하게 매핑함으로써, 종양의 수술적 절제가 보다 정확하게 수행되어 바람직하지 않은 부작용을 제한하고 종양 매스의 비최적 용적 축소(debulking)의 위험을 최소화할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 용어 "할로겐" 및 "할로"는 I, Br, Cl 및 F를 언급한다.
본 명세서에서, 단독으로 또는 "알케닐옥시알킬", "알킬티오", "알킬아미노" 및 "디알킬아미노"와 같은 복합어로 사용되는 용어 "알킬"은 직쇄, 분지형 또는 사이클릭 알킬, 바람직하게는 C1-20 알킬 또는 사이클로알킬을 나타낸다. 직쇄 및 분지형 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 아밀, 이소아밀, sec-아밀, 1,2-디메틸프로필, 1,1-디메틸-프로필, 헥실, 4-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 1,2,2,-트리메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 헵틸, 5-메톡시헥실, 1-메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 4,4-디메틸펜틸, 1,2-디메틸펜틸, 1,3-디메틸펜틸, 1,4-디메틸-펜틸, 1,2,3,-트리메틸부틸, 1,1,2-트리메틸부틸, 1,1,3-트리메틸부틸, 옥틸, 6-메틸헵틸, 1-메틸헵틸, 1,1,3,3-테트라메틸부틸, 노닐, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-메틸-옥틸, 1-, 2-, 3-, 4- 또는 5-에틸헵틸, 1-, 2- 또는 3-프로필헥실, 데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8-메틸노닐, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-에틸옥틸, 1-, 2-,3- 또는 4-프로필헵틸, 운데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-메틸데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-에틸노닐, 1-, 2-, 3-, 4- 또는 5-프로필옥틸, 1-, 2- 또는 3-부틸헵틸, 1-펜틸헥실, 도데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-메틸운데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-에틸데실, 1-, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-프로필노닐, 1-, 2-, 3- 또는 4-부틸옥틸, 1-2-펜틸헵틸 등을 포함한다. 사이클릭 알킬의 예는 모노- 또는 폴리사이클릭 알킬기 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실 등을 포함한다.
실시예
실시예 1: 자성 나노입자의 합성
파트 (a) 대형 마그헤마이트 입자는 공침(co-precipitation) 방법을 사용하여 생성되었다. 전형적인 반응에서, FeCl2.4H2O(20 g) 및 FeCl3.6H2O(27 g)이 500 mL의 0.4 M HCl에 용해되었다. 암모니아 용액(3M, 500 mL)은 오버헤드 교반기 하에서 교반하면서 철염 용액에 첨가되었다. 형성되는 블랙 마그네타이트 나노입자는 자기적으로 분리되었고 MilliQ 물로 세척되었다. 그 다음, 마그네타이트 나노입자는 200 mL의 질산철(III)(1M 질산 중 0.34 M)에서 1시간 동안 100℃에서 가열함으로써 마그헤마이트로 산화되었다. 형성되는 브라운 마그헤마이트 나노입자는 자기적으로 분리되었고 MilliQ 물로 세척되었다. 입자는 불순물을 제거하기 위해 MilliQ 물에 분산되었고 14,000 kDa MW 컷-오프 투석 튜브를 사용하여 Milli-Q 물에 2-3일 동안 투석되었다. 입자는 투과 전자 현미경에 의해 분석되었고 16.8 ± 3.3 nm의 평균 직경을 갖는 것으로 발견되었다.
파트 (b) 소형 마그헤마이트 입자는 공침 방법을 사용하여 생성되었다. 전형적인 반응에서, FeCl2.4H2O(1.46 g) 및 FeCl3.6H2O(2.7 g)이 50 mL의 0.4 M HCl에 용해되었다. 암모니아 용액(3 M, 50 mL)은 오버헤드 교반기 하에서 교반하면서 철염 용액에 첨가되었다. 형성되는 블랙 마그네타이트 나노입자는 자기적으로 분리되었고 MilliQ 물로 세척되었다. 그 다음, 입자는 교반과 함께 1시간 동안 100℃에서 20 mL의 질산철(III)(1M 질산 중 0.34 M)를 사용하여 마그헤마이트로 산화되었다. 결과적 브라운 마그헤마이트 나노입자는 자기적으로 분리되었고 MilliQ 물로 세척되었다. 입자는 불순물을 제거하기 위해 Milli-Q 물에 분산되었고 14,000 kDa MW 컷-오프 투석 튜브를 사용하여 Milli-Q 물에 투석되었다. 입자는 투과 전자 현미경에 의해 분석되었고 12.4 ± 3.2 nm의 평균 직경을 갖는 것으로 발견되었다. 입자 Z-평균 직경은 DLS에 의해 측정되었고 44.5 nm인 것으로 발견되었다.
파트 (c) 마그네타이트 입자는 공침 방법을 사용하여 생성되었다. 전형적인 반응에서, FeCl2.4H2O(1.46 g) 및 FeCl3.6H2O(2.7 g)이 2M HCl(10 mL) 및 MilliQ 물(40 mL)에서 용해되었다. 암모니아 용액(3 M, 50 mL)은 오버헤드 교반기 하에서 교반하면서 주사기 펌프를 사용하여 철염 용액에 첨가되었다. 형성되는 블랙 마그네타이트 나노입자는 자기적으로 분리되었고 8.2의 pH가 최종 입자 분산에 대해 도달된 때까지 MilliQ 물(50 mL)로 5회 세척되었다. 입자는 투과 전자 현미경에 의해 분석되었고 12.7 ± 3.3 nm의 직경을 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 2 (비교): 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록 -폴리(아크릴아미드) 70 -(Glu-CO-Lys) 고분자 PSMA 표적화 모이어티 및 이에 결합되는 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록 -폴리(아크릴아미드) 15 -블록 - (트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 고분자 입체 안정화제를 갖는 자성 나노입자의 합성(PSMA-표적화 나노입자).
파트 (a): 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70의 합성
2-(((부틸티오)카르보노티오일)-티오)-프로판산(0.5 g), 아크릴아미드(10.4 g), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.050 g), 디옥산(20 g) 및 물(30 g)이 둥근 바닥 플라스크에서 결합되었다. 혼합물은 질소 가스로 퍼징되었으며, 그 다음, 3시간 동안 70℃에서 반응하도록 허용되었다. 용액은 실온으로 냉각되도록 허용되었고 [2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산(2.0 g) 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.050 g)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 질소 가스로 퍼징되었고 4시간 동안 70℃로 가열되었다. 결과적 고분자는 아세톤에 침전되었고 진공 여과에 의해 수집되었다. 고분자는 물에 용해시키고, 아세톤에 침전시킴으로써 재-정제되었고 40℃에서 24 시간 동안 진공 오븐에서 건조되었다.
파트 (b): 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70-(Glu-CO-Lys)의 합성
Glu-CO-Lys의 제조. 40 mg의 Glu-CO-Lys-(t-Bu)3 에스테르는 디클로로메탄(dichloromethane; DCM) 내 20% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)에 용해되어 20 mg/mL의 농도를 산출하였다. 혼합물은 실온에서 2시간 동안 질소 가스로 버블링되었으며, 그 시간 후에 용매는 진공 속에서 제거되었다. 잔류물은 20% 수성 아세트산 2 mL에 용해되었고 혼합물은 클로로포름으로 3회 세척되었으며, 고진공 하에서 농축 건조되어 탈보호된(deprotected) Glu-CO-Lys를 야기하였다. 생성물은 빙초산에 용해되었고, 동결-건조되었고 추가 사용될 때까지 4℃에서 보관되었다.
폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70에 대한 Glu-CO-Lys의 접합. 파트(a)의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70(250 mg), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC.HCl, 60 mg) 및 N-하이드록시수신이미드(NHS, 12 mg)이 8 mL의 MES 완충액(100 mM, pH 5.5 - 6.0)에 용해되었다. 혼합물은 10분 동안 음파욕(sonic bath)에서 초음파 처리된 다음에 10 mL 아세톤에서 NHS-활성화 고분자의 침전이 이어졌다. 침전물은 3000 g에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집되었다. Glu-CO-Lys(20 mg)은 10X PBS 완충액에 용해되었고 NHS-활성화 고분자에 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 20시간 동안 교반되었다. Gly-CO-Lys-접합 고분자는 3 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 정제되었고 물로 3회 세척되었다. 생성물은 50 mg/mL의 최종 농도로 희석되었고 추가 사용을 위해 4℃에 보관되었다.
파트 (c): 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르)의 합성
아크릴아미드(2.8 g), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.050 g), 메톡시 트리에틸렌 글리콜 개질된 2-{[부틸술파닐)카보노티오일]술파닐}프로판산(1.0 g), 디옥산(10 g) 및 물(10 g)의 용액이 둥근 바닥 플라스크에 준비되었다. 혼합물은 15분 동안 질소 가스로 퍼징되었고, 그 다음, 교반과 함께 2시간 동안 70℃로 가열되었다. 혼합물은 실온으로 냉각되도록 허용되었고 [2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산(2.6 g) 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.050 g)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 15분 동안 질소 가스에서 퍼징되었고 4시간 동안 70℃로 가열되었다. 결과적 고분자는 아세톤에 침전되었고 진공 여과에 의해 수집되었다. 고분자는 물에 용해시키고, 아세톤에 침전시킴으로써 재-정제되었고 40℃에서 24시간 동안 진공 오븐에서 건조되었다. 고분자의 화학적 구조는 도 2에 도시된다.
파트 (d): 30% 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70-(Glu-CO-Lys) 및 70% 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르)의 혼합물을 사용하는 입자 안정화
파트 (c)에서 제조되는 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르)(36 mg) 및 파트 (b)의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70-(Glu-CO-Lys)(40 mg)이 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 실시예 1[00204]의 자성 입자(7 wt% 고체, 1 g)는 초음파 처리(sonication) 하에서 고분자 혼합물에 첨가되었다. pH는 10분 후에 5.5로 조정되었고, 그 다음, 다른 10분의 초음파 처리 후에 7.0으로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 100 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 30 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
현탁 매질로서 0.9% 식염수에서 DLS에 의해 측정되는 분산된 나노입자의 z-평균은 64.2 nm이었다. 강도 크기 분포는 도 3에 도시된다.
실시예 3: 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록 -폴리(아크릴아미드) 70 -FAPI 공중합 매핑 모이어티 및 이에 결합되는 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록- 폴리(아크릴아미드) 15 - 블록 -(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제를 갖는 자성 나노입자의 합성(FAP-매핑 나노입자).
파트 (a): 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70-FAPI의 합성.
실시예 2-파트 (a)의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70(50 mg), EDC.HCl(12 mg) 및 NHS(3 mg)이 2 mL MES 완충액(100 mM, pH 5.5 - 6.0)에 용해되었다. 용액은 10분 동안 음파욕에서 초음파 처리된 다음에 6mL의 아세톤에서 NHS-활성화 고분자의 침전이 이어졌다. 침전물은 3000g에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집되었다. FAPI(3 mg)는 50μL DMSO에 용해되었고 NHS-활성화 폴리아크릴아미드 고분자에 대한 첨가 전에 10X PBS 완충액과 함께 2 mL의 총 부피로 추가로 희석되었다. 반응 혼합물은 실온에서 20시간 동안 교반되었다. FAPI-접합 고분자는 3 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 정제되었고 물로 3회 세척되었다. 생성물은 50 mg/mL의 최종 농도로 희석되었고 추가 사용을 위해 4℃에서 보관되었다. 고분자의 화학적 구조는 도 4에 도시된다.
파트 (b): 30% 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70-FAPI 공중합 매핑 모이어티 및 70% 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제의 혼합물을 사용하는 입체 안정화.
실시예 2-파트 (c)의 18 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 및 파트 (a)에서 제조되는 20 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70-FAPI는 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 고분자 혼합물은 초음파 처리 하에서 실시예 1 파트 (a)의 자성 입자(35 mg)에 첨가되었다. pH는 10분 후에 5.5로 조정되었고 다른 10분의 초음파 처리 후에 7.0으로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 100 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 30 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
현탁 매질로서 0.9% 식염수에서 DLS에 의해 측정되는 분산된 나노입자의 z-평균은 59.7 nm이었다. 강도 크기 분포는 도 5에 도시된다.
파트 (c) 30% 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70 공중합 비-표적화 모이어티 및 70% 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제의 혼합물을 사용하는 대조군(control)으로서 사용되는 비-표적화 입자에 대한 입자 안정화(비-표적화 나노입자).
실시예 2 파트 (c)의 18 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)15-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 및 실시예 2 파트 (a)의 20 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)70이 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 고분자 혼합물은 초음파 처리 하에서 실시예 1 파트 (a)의 자성 입자(35 mg)에 첨가되었다. pH는 10분 후에 5.5로 조정되었고, 그 다음, 다른 10분의 초음파 처리 후에 7.0으로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 100 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 30 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
실시예 4: 전립선 종양의 묘사를 위한 추적자를 사용한 동물 실험.
6-8주령의 수컷 질소성 산소 요구량 중복 면역 부전증(NOD scid) 감마 마우스는 전립선으로 직접 인간 전립선암 세포(human prostate cancer cell; LNCaP)로 주사되었다. 4주 내지 6주의 종양 성장 후, 마우스는 꼬리 정맥으로 PSMA 또는 FAP 표적화 모이어티(실시예 2 - 파트 (d) 및 실시예 3 - 파트 (b) 각각에서 제조됨)를 갖거나, 표적화 모이어티(실시예 3 - 파트 (c)에서 제조됨)가 없는 15 mg/ml의 자성 나노입자의 40 mg/kg으로 주사되었다. 주사 24시간 후, 마우스는 희생되었고 조직은 분석을 위해 수집되었다. 절제된 전립선 종양은 10% 중성-완충 포르말린에 고정되었고 2mM 디메글루민 가도펜테테이트을 갖는 1% 한천 겔에 장착되었고 Siemens 3.0T을 사용하여 T2-강조 MRI를 받았다(도 6). 종양의 평균 신호 강도의 분석은 FAP-매핑 나노입자가 매핑 모이어티가 없는 나노입자에 비해 71% 증가된 대비(contrast)를 제공했다는 것을 나타냈다. PSMA-표적화 나노입자는 표적화 모이어티가 없는 나노입자에 비해 단지 18% 증가된 대비를 제공하였다.
10% 중성-완충 포르말린에 고정된 절제된 전립선 종양은 파라핀 블록에 장착되었다. 5 ㎛ 두께 섹션이 절단되고 프러시안 블루(Prussian Blue)로 염색되어 철 나노입자의 존재를 시각화하였다(도 7에서, 5x 배율로, 다크 블루 염색에 의해 표시됨). PSMA-표적화 또는 FAP-매핑 나노입자가 주사된 마우스는, 최소 염색을 나타낸 매핑/표적화 모이어티가 없는 나노입자가 주사된 마우스와 대조적으로, 철에 대한 증가된 염색을 나타냈다. 시각적 검사에서, FAP-매핑 입자가 주사된 마우스의 종양은 PSMA-표적화 나노입자와 대조적으로 증가된 철 염색을 나타냈다. FAP-매핑 나노입자가 종양의 경계 주변에서 그리고 혈관계를 따라 흡수되었다는 점이 주목되었다.
24시간 나노입자 흡수 기간 후에, 마우스는 펜토바르비탈(pentobarbital)로 복강내 주사되었고 10% 중성 완충 포르말린으로 경심관류로 관류 고정되었다. 전체 고정된 마우스는 Bruker 14.1T 시스템을 사용하여 T2-강조 MRI 스캔을 받았다(도 6). FAP 또는 PSMA-기반 나노입자로 주사된 마우스의 종양은 전립선 종양에서, 특히 종양 주변부(도 8의, 흰색 화살표에 의해 표시되는 종양) 상에서 저강도 영역/증가된 역상 대비를 나타냈다.
실시예 5: 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록 -폴리(아크릴아미드) 30 -FAPI 공중합 매핑 모이어티 및 실시예 1 파트 (b)로부터의 소형 마그헤마이트 코어 입자를 사용하여 이에 결합되는 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록- 폴리(아크릴아미드) 10 - 블록 -(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제를 갖는 마그헤마이트 나노입자의 합성(소형 마그헤마이트 FAP-매핑 나노입자).
파트 (a): 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30의 합성
2-(((부틸티오)카르보노티오일)-티오)-프로판산(0.2 g), 아크릴아미드(1.8 g), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.020 g), 디옥산(3.6 mL) 및 물(4 mL)이 둥근 바닥 플라스크에서 결합되었다. 혼합물은 질소 가스로 퍼징되었으며, 그 다음, 2.5시간 동안 70℃에서 반응하도록 허용되었다. 용액은 실온으로 냉각되도록 허용되었고 [2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산(0.489 g) 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.020 g)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 질소 가스로 퍼징되었고 2.5시간 동안 70℃로 가열되었다. 결과적 고분자는 아세톤에 침전되었고 원심분리에 의해 수집되었다. 고분자는 물에 용해시키고, 아세톤에 침전시킴으로써 재-정제되었고 48동안 진공 하에서 건조되었다.
파트 (b): 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI의 합성.
파트 (a)의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30(150 mg), EDC.HCl(72 mg) 및 NHS(18 mg)이 8mL MES 완충액(100 mM, pH 5.5 - 6.0)에 용해되었다. 용액은 10분 동안 음파욕에서 초음파 처리된 다음에 1 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 활성화 용액의 제거가 이어졌다. FAPI(18 mg)이 50 μL DMSO에 용해되었고 NHS-활성화 폴리아크릴아미드 고분자에 대한 첨가 전에 10X PBS 완충액과 함께 8 mL의 총 부피로 추가로 희석되었다. 반응 혼합물은 실온에서 20시간 동안 교반되었다. 짧은 FAPI-접합 고분자는 1 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 정제되었고 물로 3회 세척되었다. 생성물은 50 mg/mL의 최종 농도로 희석되었고 추가 사용을 위해 4℃에 보관되었다. 고분자의 화학적 구조는 도 9에 도시된다.
파트 (c): 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르)의 합성
아크릴아미드(0.93 g), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.030 g), 메톡시 트리에틸렌 글리콜 개질 2-{[부틸술파닐)카보노티오일]술파닐}프로판산(0.5 g), 디옥산(7 mL) 및 물(4 mL)의 용액이 둥근 바닥 플라스크에 준비되었다. 혼합물은 15분 동안 질소 가스로 퍼징되었고, 그 다음, 교반하면서 1.5시간 동안 70℃로 가열되었다. 혼합물은 실온으로 냉각되도록 허용되었고 [2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산(1.2 g) 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)(0.030 g)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 15분 동안 질소 가스로 퍼징되었고 2시간 동안 70℃로 가열되었다. 결과적 고분자는 아세톤에 침전되었고 원심분리에 의해 수집되었다. 고분자는 48시간에 걸쳐 진공에서 건조되었다. 고분자의 화학적 구조는 도 10에 도시된다.
파트 (d): 30% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI 공중합 매핑 모이어티 및 70% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제의 혼합물을 사용한 마그헤마이트 나노입자의 안정화(추적자 1, 30%FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자).
파트 (c)에서 제조된 44 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 및 파트 (b)에서 제조된 50 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI가 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 고분자 혼합물은 초음파 처리 하에서 실시예 1 파트 (b)의 물(30 mg/mL) 중 60 mg 자성 입자에 첨가되었다. pH는 10분 후에 5.5로 조정되었고, 그 다음, 다른 10분의 초음파 처리 후에 7.0으로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 10 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자(추적자 1)는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 20 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다
파트 (e) 100% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI 고분자 매핑 모이어티를 사용한 마그헤마이트 나노입자의 안정화(추적자 2, 100%FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자).
파트 (c)에서 제조된 50 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI가 2 mL의 총 부피로 물에 희석되었다. pH는 6.9인 것으로 측정되었다. 고분자는 초음파 처리 하에서 실시예 1 파트 (b)의 물(30 mg/mL) 중 30 mg 자성 입자에 첨가되었다. 초음파 처리 단계 후, pH는 5.8인 것으로 측정되었다. 그것은 NaOH(0.1 M)를 사용하여 초음파 처리 하에서 7.0으로 이후에 조정되었다. 초음파 처리는 총 20분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 10 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자(추적자 2)는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 20 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
파트 (f) 30% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30 공중합 비-표적화 모이어티 및 70% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제의 혼합물을 사용하여 대조군으로서 사용되는 비-표적화 마그헤마이트 나노입자의 안정화(추적자 3, 비-표적화 마그헤마이트 나노입자).
파트(c)에서 제조된 44 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 및 파트(a)에서 제조된 50 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30가 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 고분자 혼합물은 초음파 처리 하에서 실시예 1 파트(b)의 물(30 mg/mL) 중 60 mg 자성 입자에 첨가되었다. pH는 10분 후에 5.5로 조정되었고, 그 다음, 다른 10분의 초음파 처리 후에 7.0으로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 10 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자(추적자 3)는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 20 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
실시예 6: FAP에 대한 소형 FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자 결합의 In-vitro 시험.
섬유아세포활성화 단백질에 대한 실시예 5 파트 (d), (e) 및 (f)의 30% FAP-매핑(추적자 1), 100% FAP-매핑(추적자 2) 및 비-표적화 마그헤마이트 나노입자(추적자 3)의 결합 친화력 각각은 FAP 발현 흑색종 세포주 C32P에서 그들의 세포 섭취를 비교함으로써 in vitro 평가되었다. C32 세포는 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충되는 RPMI 배지의 T75 세포 배양 플라스크에서 배양되었고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 보관되었다. 세포는 70-80% 합류(confluence)가 도달된 때 계대배양되었다. 세포 섭취를 측정하고 나노입자의 결합 친화력을 시험하기 위해, C32 세포는 상술한 바와 같은 전체 세포 배양 배지에서 웰(well) 당 3 x 105 세포의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 접종되었다. 플레이트는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배치되었고 24시간 동안 부착되도록 허용되었다.
모든 나노입자는 단지 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 세포 배양 배지에서 0.150 mgFe.mL-1의 농도로 제조되었다. 성장 세포 배양 배지는 플레이트로부터 제거되었고 추적자 분산액에 의해 교체되었다. 세 번의 복제(replicate)가 각각의 추적자를 시험하기 위해 사용되었다. C32 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 추적자 분산액과 함께 인큐베이션되었다. 세포는 PBS로 2회 세척되었고, 트립신을 사용하여 분리되었고 세포 펠릿(pellet)은 5분 동안 500 g에서 원심분리를 통해 수집되었다. 세포 펠릿은 PBS로 2회 더 세척되었고 최종적으로 가열 블록을 사용하여 밤새 60℃에서 건조되었다. 건조된 세포 펠릿은 미량 금속 등급 질산 및 염산(부피 당 1:1 비율)으로 분해되었고 샘플은 3 mL의 총 부피로 물로 희석되었다. 철 농도는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 측정되었다. 결과는, 도 11에 도시된 바와 같이, 추적자 3(비-표적화 마그헤마이트 나노입자)이 추적자 1(30% FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자) 및 추적자 2(100% FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자)와 비교하여 C32 세포에서 훨씬 더 낮은 세포 섭취를 가졌다는 것을 나타냈다.
실시예 7: 혈청의 존재 또는 부재에서 소형 공중합 FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자 대 단일 고분자 소형 FAP-매핑 마그헤마이트 나노입자의 결합 활성의 In-vitro 시험.
섬유아세포활성화 단백질에 대한 실시예 5 파트 (d) 및 (e) 각각의 30% FAP-매핑(추적자 1), 100% FAP-매핑(추적자 2)의 결합 활성은 세포 성장 배지의 혈청(FBS)의 존재 또는 부재에서 FAP 발현 흑색종 세포주 C32에서 그들의 세포 섭취를 비교함으로써 In-vitro 평가되었다. C32 세포는 실시예 6에 설명되는 바와 같이 배양되었다. C32 세포는 전체 세포 배양 배지에서 웰 당 3 x 105 세포의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 접종되었다. 플레이트는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배치되었고 24 시간 동안 부착되도록 허용되었다.
24시간 후, 전체 세포 배양 배지는 6개의 웰 플레이트 중 하나로부터 제거되었고 단지 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충되는 배지로 교체되었다. 다른 6개의 웰 플레이트의 세포 배양 배지는 제거되었지만 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충되는 배지로 교체되었다. 실시예 5 파트 (d) 및 (e)의 나노입자는 0.150 mgFe.mL-1의 최종 농도로 각각의 웰에 첨가되었다. C32 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 추적자 분산액과 함께 인큐베이션되었다. 세포는 PBS로 2회 세척되었고, 트립신을 사용하여 분리되었고 세포 펠릿은 5분 동안 500 g에서 원심분리를 통해 수집되었다. 세포 펠릿은 PBS로 2회 더 세척되었고 최종적으로 가열 블록을 사용하여 밤새 60℃에서 건조되었다. 건조된 세포 펠릿은 미량 금속 등급 질산 및 염산(부피 당 1:1 비율)으로 분해되었고 샘플은 3 mL의 총 부피로 물로 희석되었다. 철 농도는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 측정되었다. 획득된 데이터는 독립 샘플 T-테스트를 사용하여 유의성에 대해 분석 및 시험되었다. 도 12에 제시되는 결과는 추적자 모두에 대해 FBS의 부재 시의 결합과 비교하여 FBS의 존재 시의 결합에서 유의미한 감소가 있었다는 것을 도시한다. 그러나, 추적자 1(30% FAP-매핑 나노입자)의 결합 감소는 55% 이었으며, 추적자 2(100% FAP-매핑 나노입자)의 63% 결합 감소보다 통계학적으로 유의미하게 더 낮았다(p < 0.01). FBS의 부재 시 추적자 1 및 추적자 2의 흡수는 유의미한 차이를 나타내지 않았다(p > 0.05).
실시예 8: 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록 -폴리(아크릴아미드) 30 -FAPI 공중합 매핑 모이어티 및 실시예 1 파트 (c)로부터의 소형 마그네타이트 코어 입자를 사용하여 이에 결합되는 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산} 5 - 블록- 폴리(아크릴아미드) 10 - 블록 -(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제를 갖는 마그네타이트 나노입자의 합성(소형 마그네타이트 FAP-매핑 나노입자).
파트 (a): 30% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI 공중합 매핑 모이어티 및 70% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제의 혼합물을 사용한 마그네타이트 나노입자의 안정화(추적자 4, 30%FAP-매핑 마그네타이트 나노입자).
실시예 5 파트 (c)에서 제조된 44 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 및 실시예 5 파트 (b)에서 제조된 50 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30-FAPI가 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 고분자 혼합물은 10분 동안 초음파 처리 하에 실시예 1 파트 (c)의 물(25 mg/mL) 중 50 mg 자성 입자에 첨가되었다. 고분자 혼합물을 첨가하기 전에, 나노입자의 pH는 7.8인 것으로 측정되었다. 초음파 처리 단계 후, pH는 5.4인 것으로 측정되었다. 그것은 이후에 NaOH(0.1 M)를 사용하여 초음파 처리 하에서 6.0 및 7.0로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 10 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자(추적자 4)는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 20 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
파트 (b) 30% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30 공중합 비-표적화 모이어티 및 70% 짧은 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 공중합 입체 안정화제의 혼합물을 사용하는 대조군으로서 사용되는 비-표적화 입자에 대한 마그네타이트 나노입자의 안정화(추적자 5, 비-표적화 마그네타이트 나노입자).
실시예 5 파트 (c)에서 제조된 44 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)10-블록-(트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르) 및 실시예 5 파트 (a)에서 제조된 50 mg의 폴리{[2-(메타크릴로일옥시)-에틸]포스폰산}5-블록-폴리(아크릴아미드)30이 2 mL의 물에 용해되었다. pH는 NaOH(0.1 M)를 사용하여 4로 조정되었다. 고분자 혼합물은 초음파 처리 하에서 실시예 1 파트 (c)의 물(30 mg/mL) 중 50 mg 자성 입자에 첨가되었다. 고분자 혼합물을 첨가하기 전에, 나노입자의 pH는 7.8인 것으로 측정되었다. 초음파 처리 단계 후, pH는 5.4인 것으로 측정되었다. 그것은 이후에 NaOH(0.1 M)를 사용하여 초음파 처리 하에서 6.0 및 7.0로 조정되었다. 초음파 처리는 총 30분 동안 계속되었으며, 그 시간 후에 비결합 고분자는 10 kDa 분자량 차단막을 갖는 원심 여과기를 사용하여 제거되었다. 코팅된 나노입자(추적자 5)는 물로 3회 세척되고 식염수로 희석되어 20 mg Fe/mL에서 등장성 분산액을 제공하였다.
실시예 9: FAP에 대한 소형 FAP-매핑 마그네타이트 나노입자 결합의 In-vitro 시험.
섬유아세포활성화 단백질에 대한 실시예 8 파트 (a) 및 (b)의 30% FAP-매핑 마그네타이트 나노입자(추적자 4) 대 비-표적화 마그네타이트 나노입자(추적자 5)의 결합 친화력은 FAP 발현 흑색종 세포주 C32에서 그들의 세포 섭취를 비교함으로써 In-vitro 평가되었다. C32 세포는 실시예 6에서 설명된 바와 같이 배양되었다. 세포 섭취를 측정하고 나노입자의 결합 친화력을 시험하기 위해, C32 세포는 상술한 바와 같은 전체 세포 배양 배지에서 웰 당 3 x 105 세포의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 접종되었다. 플레이트는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배치되었고 24 시간 동안 부착되도록 허용되었다.
모든 나노입자는 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충된 세포 배양 배지에서 0.150 mgFe.mL-1의 농도로 제조되었다. 세포 배양 배지는 플레이트로부터 제거되었고 추적자 분산액에 의해 교체되었다. 4개의 복제(replicate)가 각각의 추적자를 시험하기 위해 사용되었다. C32 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 추적자 분산액으로 인큐베이션되었다. 세포는 PBS로 2회 세척되었고, 트립신을 사용하여 분리되었고 세포 펠릿은 5분 동안 500 g에서 원심분리를 통해 수집되었다. 세포 펠릿은 PBS로 2회 더 세척되었고 최종적으로 가열 블록을 사용하여 밤새 60℃에서 건조되었다. 건조된 세포 펠릿은 미량 금속 등급 질산 및 염산(부피 당 1:1 비율)으로 분해되었고 샘플은 3 mL의 총 부피로 물로 희석되었다. 철 농도는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 측정되었다. 결과는 추적자 5(비-표적화 마그네타이트 나노입자)가 도 13에 도시된 바와 같이 추적자 4(30%FAP-매핑 마그네타이트 나노입자)와 비교하여 C32 세포에서 훨씬 더 낮은 세포 섭취를 가졌다는 것을 나타냈다.
본 개시는 설명된 특정 적용에 대한 그 사용에 있어서 제한되지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 개시는 본원에 설명되거나 도시되는 특정 요소 및/또는 특징과 관련하여 그 바람직한 실시예로 제한되지 않는다. 본 개시는 개시된 실시예 또는 실시예들에 제한되지 않지만, 하기의 청구범위에 의해 제시되고 정의되는 본 개시의 범위를 벗어나는 것 없이 수많은 재배열, 변형 및 대체가 가능하다는 것이 이해될 것이다.
명세서 및 이어지는 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(include)" 및 "포함하는(comprising)" 및 "포함하는(including)"과 같은 변화는 명시된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 의미하는 것으로 이해되지 않을 것이다.
본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 언급은, 그러한 선행 기술이 일반적인 일반 상식의 일부를 형성한다는 임의의 형태의 제안에 대한 승인이 아니며 그렇게 받아들여서도 안된다.
하기의 청구범위는 단지 임시 청구범위이며, 가능한 청구범위의 예로서 제공되고 본 출원에 기초한 임의의 향후 특허 출원에서 청구될 수 있는 범위를 제한하도록 의도되지 않는다는 점을 유의해야 한다. 정수는 본 발명을 추가로 정의하거나 또는 재-정의하기 위하여 나중에 예시적 청구범위에 추가되거나 이로부터 생략될 수 있다.

Claims (16)

  1. 피험자에 투여하기에 적합한 나노미립자 물질로서, 상기 나노미립자 물질은 그 표면에 결합되는 다음: 즉, (a) 액체에서 상기 나노미립자 물질의 분산을 촉진하는 공중합 입체 안정화제 - 상기 공중합 입체 안정화제는 (i) 상기 공중합 입체 안정화제를 상기 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화 고분자 절편, 및 (ii) 상기 고정화 고분자 절편과 다른 입체 안정화 고분자 절편을 포함함 -, 및 (b) 공중합 매핑 모이어티 - 상기 공중합 매핑 모이어티는 (i) 상기 공중합 매핑 모이어티를 상기 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화 고분자 절편, (ii) 섬유아세포활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제제를 포함하는 하나 이상의 매핑기, 및 (iii) 상기 고정화 고분자 절편과 다른 결합 고분자 절편을 포함함 -를 가지며, 상기 결합 고분자 절편은 상기 고정화 고분자 절편을 상기 하나 이상의 매핑기에 결합시키는, 나노미립자 물질.
  2. 제1항에 있어서,
    그 표면에 결합되는 다음: 즉, (c) 공중합 발광 모이어티를 가지며 상기 공중합 발광 모이어티는 (i) 상기 고분자 발광 모이어티를 상기 나노미립자 물질에 결합시키는 하나 이상의 결합기를 갖는 고정화 고분자 절편, (ii) 상기 나노미립자 물질의 in vivo 위치 시각화를 가능하게 하는 광에 응답하여 광 또는 음향 신호를 방출하기 위한 하나 이상의 발광기 및 (iii) 상기 고정화 고분자 절편과 다른 결합 고분자 절편을 포함하며, 상기 결합 고분자 절편은 상기 고정화 고분자 절편을 상기 하나 이상의 발광기에 결합시키는, 나노미립자 물질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 하나 이상의 발광기는 인도시아닌 그린, 설포-Cy3, 설포-Cy5, 및 설포-Cy7로부터 선택되는, 나노미립자 물질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입체 안정화 고분자 절편은 폴리아크리아미드-코-폴리아킬렌 산화물 블록 공중합체를 포함하는, 나노미립자 물질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폴리아크리아미드-코-폴리아킬렌 산화물 블록 공중합체는 약 8개 내지 약 60개의 중합된 아크릴아미드 단위 및 약 2개 내지 약 10개의 중합된 알킬렌 산화물 단위를 포함하는, 나노미립자 물질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 고분자 절편은 폴리아크릴아미드로 구성되는, 나노미립자 물질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입체 안정화 고분자 절편은 10개 내지 70개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는, 나노미립자 물질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 고분자 절편은 15개 내지 100개의 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는, 나노미립자 물질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 고분자 절편은 상기 입체 안정화 고분자 절편보다 더 많은 중합된 단량체 잔기 단위를 갖는, 나노미립자 물질.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노미립자 물질은 자성 나노미립자 물질인, 나노미립자 물질.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 자성 나노미립자 물질은 철(Fe), 마그헤마이트(γ-Fe2O3), 마그네타이트(Fe3O4) 또는 이들의 조합을 포함하는, 나노미립자 물질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    섬유아세포활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 상기 제제는 소분자 억제제 및 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편으로부터 선택되는, 나노미립자 물질.
  13. 피험자에 투여하기에 적합한 조성물로서, 상기 조성물은 약리학적으로 허용가능한 액체 담체에 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 상기 나노미립자 물질을 포함하는, 조성물.
  14. 피험자의 종양 마진을 매핑하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 나노미립자 물질 또는 제13항에 따른 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계; 및
    b. 상기 나노미립자 물질을 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 나노미립자 물질은 상기 종양 미세환경에 축적되며, 그것에 의해 상기 종양 마진을 매핑하는, 방법.
  15. 암을 진단하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 나노미립자 물질 또는 제13항에 따른 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계; 및
    b. 상기 나노미립자 물질을 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 피험자의 조직에서 상기 축적된 나노미립자 물질의 검출은 상기 피험자가 암을 갖고 있음을 나타내는, 방법.
  16. 암의 치료를 필요로 하는 피험자에서 암을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 나노미립자 물질 또는 제13항에 따른 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계
    b. 상기 나노미립자 물질이 축적되는 상기 피험자의 부위를 검출하는 단계; 및
    c. 단계(b)의 상기 나노미립자 물질 검출 부위에 상기 암에 대한 유효량의 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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