KR20240006270A - 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 상관관계를 가진 miRNA 및 경로(pathway) 조합 (이하, miRNA-pathway)을 선별하는 제1 단계; 상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway 및 지방간 질환의 유전자 발현 데이터 (RNA-seq)를 통합 분석하여 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟을 선별하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 선별된 타겟에서 지방간 질환 유전자들을 직접 조절하는 miRNA-pathway 조절 네트워크를 도출하는 제3 단계;를 포함하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법을 제공한다.
상기 데이터베이스 정보를 통합 분석하여 간 질환에서 통계적으로 유의한 miRNA 조절 네트워크를 구축할 수 있고, 이로부터 지방간 질환에 특이적인 miRNA 타겟을 선별하여, 지방간 질환의 진단 마커 또는 치료 조성물로 활용할 수 있다.
상기 데이터베이스 정보를 통합 분석하여 간 질환에서 통계적으로 유의한 miRNA 조절 네트워크를 구축할 수 있고, 이로부터 지방간 질환에 특이적인 miRNA 타겟을 선별하여, 지방간 질환의 진단 마커 또는 치료 조성물로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 지방간 질환의 진단을 위한 신규한 바이오마커 발굴 방법에 관한 것이다.
비만(Obesity)은 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)과 같은 다양한 대사 장애로부터 생겨난다. 많은 보고서에 따르면, 미국 비만 환자의 90%가 간 지방증(hepatic steatosis)에서 훨씬 더 심각한 형태의 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)에 이르는 비알코올성 지방간 질환이 있으며, 이는 섬유증(fibrosis), 간경변(cirrhosis) 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, HCC)을 유발할 수 있다. 비알코올성 지방간 질환은 간 대사 리프로그래밍과 관련되어 과도한 지질 축적 및 간에서 지질 대사의 불균형을 초래한다. 비알코올성 지방간 질환의 발병기전은 수년 동안 널리 연구되어 왔지만, 복잡한 장애의 기저에 깔린 분자 메커니즘은 여전히 조사되고 있다.
miRNA는 전사 후 표적 mRNA를 조절하는 짧은 비암호화 RNA로, 전사체 데이터에서 검출될 가능성이 있는 수백 개의 mRNA를 하향 조절할 수 있으며, 소수의 miRNA가 전체 전사체의 조절을 지배할 수 있다.
종래에는 이러한 질병들의 전사체 데이터에서 miRNA를 발굴하고 분자 메커니즘을 확인하기 위해, RNA 염기서열(RNA-seq)에서 비교, 대상 시료간의 발현 차이를 보이는 차별발현유전자(Differentially Expressed Genes, DEG)를 선별하여 경로 분석(pathway analysis), miRNA 조절 네트워크 분석 등을 각각 수행하였다. miRNA 타겟 집합과 하향 조절되는 유전자 그룹과의 유의한 교집합을 확인함으로써 발굴하고자 하는 miRNA 타겟을 확인할 수 있으나, miRNA 타겟이 아닌 다른 이유로 하향 조절된 유전자가 다수 포함되어 정확한 miRNA 타겟을 찾기가 어려운 문제가 있었다.
이에, 지방간 질환의 진단에 보다 적합한 바이오마커를 발굴하기 위한 효과적인 방법이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 간 질환의 다양한 데이터베이스 정보를 통합 분석하여 지방간 질환의 진단 또는 치료에 보다 적합한 miRNA 또는 타겟 유전자와 같은 바이오마커를 발굴하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상관관계를 가진 miRNA 및 경로(pathway) 조합 (이하, miRNA-pathway)을 선별하는 제1 단계; 하기 식 1을 이용하여 상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway 및 지방간 질환의 유전자 발현 데이터 (RNA-seq)를 통합 분석하여 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟을 선별하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 선별된 타겟에서 지방간 질환 유전자들을 직접 조절하는 miRNA-pathway 조절 네트워크를 도출하는 제3 단계;를 포함하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법을 제공한다.
<식 1>
상기 식에서, n1은 상기 miRNA 타겟 유전자 수, k1은 상기 n1 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, n2는 상기 pathway 타겟 유전자 수, k2는 상기 n2 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, O는 상기 miRNA 타겟 유전자 및 pathway 타겟 유전자의 중첩된 유전자 수, i는 상기 중첩된 유전자 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, j는 합계를 위한 인덱스이다.
상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway는, 상기 miRNA 및 pathway 정보를 수집하고 초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용하여 상기 miRNA 및 pathway가 통계적으로 유의한 교집합 영역으로 형성되는 부분으로부터 선택될 수 있다.
상기 통계적으로 유의한 교집합 영역은, 상기 초기하분포 P 값이 0.05 이하인 것일 수 있다.
상기 제2 단계는, 상기 식 1을 이용하여 상기 miRNA 및 pathway의 교집합 영역에서 상기 지방간 질환에 대해 하향 조절되는 유전자의 과포집 여부를 분석하여 수행될 수 있다.
상기 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟은, 상기 식 1의 P 값이 0.05 이하일 때 선별되는 것일 수 있다.
상기 제3 단계는, 초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용하여 통계적으로 유의한 조절 네트워크 데이터를 도출하여 수행되며, 상기 통계적으로 유의한 데이터는 초기하분포 P 값이 0.05 이하인 것일 수 있다.
상기 지방간 질환은, 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 일 수 있다.
본 발명에 따른 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법은 간 질환에서의 유전자 발현 데이터, miRNA 타겟 정보, pathway 데이터 및 간 질환 유전자 데이터베이스 정보를 통합 분석하여 간 질환에서 통계적으로 유의한 miRNA 조절 네트워크를 구축할 수 있고, 이로부터 지방간 질환에 특이적인 miRNA 및 해당 타겟 유전자를 선별할 수 있다.
상기 선별된 miRNA 및 타겟 유전자들은 지방간 질환의 진단 마커 또는 치료 조성물로 활용할 수 있다.
나아가, 상기 방법을 이용하여 각종 암 ,대사질환 등에서 해당 유전자 발현 데이터(RNA-seq 등)를 통해 주요 miRNA 와 조절받는 pathway 및 해당 타겟 유전자들을 도출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 질병 전사체 데이터에서 miRNA 발굴을 위한 새로운 접근 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 도 1의 방법에 따라, miRNA 타겟, pathway 정보, RNA-seq 발현 데이터, 질병유전자 정보의 통합 분석을 통해 간 질환 miRNA 조절 네트워크를 도출하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에 따라 지방간 데이터에서 도출된 miRNA-pathway 조절 네트워크를 나타낸 것이다.
도 4는 조건부 초기하분포를 이용한 miRNA 조절 패턴을 분석한 것이다.
도 5는 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 유전자 발현 데이터를 결합하여 NAFLD와 통계적 유의성을 갖는 miRNA 조절 관계를 도출한 것 중 상위 20개의 리스트이다.
도 6은 도 5에서 도출된 miR-653의 다양한 지방간 세포 또는 마우스 모델에서의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 7은 miR-653 과발현에 대한 지질 반응을 확인한 것이다.
도 8은 miR-653의 타겟 유전자를 확인한 것이다.
도 9는 miR-653의 타겟 유전자로 SIRT1에 대해 확인한 것이다.
도 10은 miR-653 과발현에 따른 지질 대사와 관련된 유전자들의 발현을 확인한 것이다.
도 11은 도 5에서 도출된 miR-493의 다양한 지방간 세포 또는 마우스 모델에서의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 12는 miR-493 과발현에 대한 지질 반응을 확인한 것이다.
도 13은 miR-493의 타겟 유전자를 확인한 것이다.
도 14는 miR-493의 타겟 유전자로 STAT5B에 대해 확인한 것이다.
도 15는 miR-493 과발현에 따른 지질 대사와 관련된 유전자들의 발현을 확인한 것이다.
도 2는 도 1의 방법에 따라, miRNA 타겟, pathway 정보, RNA-seq 발현 데이터, 질병유전자 정보의 통합 분석을 통해 간 질환 miRNA 조절 네트워크를 도출하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에 따라 지방간 데이터에서 도출된 miRNA-pathway 조절 네트워크를 나타낸 것이다.
도 4는 조건부 초기하분포를 이용한 miRNA 조절 패턴을 분석한 것이다.
도 5는 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 유전자 발현 데이터를 결합하여 NAFLD와 통계적 유의성을 갖는 miRNA 조절 관계를 도출한 것 중 상위 20개의 리스트이다.
도 6은 도 5에서 도출된 miR-653의 다양한 지방간 세포 또는 마우스 모델에서의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 7은 miR-653 과발현에 대한 지질 반응을 확인한 것이다.
도 8은 miR-653의 타겟 유전자를 확인한 것이다.
도 9는 miR-653의 타겟 유전자로 SIRT1에 대해 확인한 것이다.
도 10은 miR-653 과발현에 따른 지질 대사와 관련된 유전자들의 발현을 확인한 것이다.
도 11은 도 5에서 도출된 miR-493의 다양한 지방간 세포 또는 마우스 모델에서의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 12는 miR-493 과발현에 대한 지질 반응을 확인한 것이다.
도 13은 miR-493의 타겟 유전자를 확인한 것이다.
도 14는 miR-493의 타겟 유전자로 STAT5B에 대해 확인한 것이다.
도 15는 miR-493 과발현에 따른 지질 대사와 관련된 유전자들의 발현을 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자는 종래의 문제를 해결하기 위해, pathway 정보를 매개로 활용하여, 질병 RNA-seq 데이터를 결합하여 분석하는 새로운 방식을 개발하였다 (도 1). 이를 이용하여 간 질환에서 통계적으로 유의한 miRNA 조절 네트워크를 구축하고, 주요 miRNA들과 타겟 유전자를 선별하여 간 질환에 미치는 영향을 실험으로 검증함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 miRNA 타겟 정보, pathway 데이터, 유전자 발현 데이터, 및 간 질환 유전자 데이터베이스 정보를 통합 분석하여 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커를 발굴하는 방법을 제공한다.
보다 상세하게는, 상기 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법은 상관관계를 가진 miRNA 및 경로(pathway) 조합 (이하, miRNA-pathway)을 선별하는 제1 단계; 하기 식 1을 이용하여 상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway 및 지방간 질환의 유전자 발현 데이터 (RNA-seq)를 통합 분석하여 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟을 선별하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 선별된 타겟에서 지방간 질환 유전자들을 직접 조절하는 miRNA-pathway 조절 네트워크를 도출하는 제3 단계;를 포함할 수 있다.
<식 1>
상기 식에서, n1은 상기 miRNA 타겟 유전자 수, k1은 상기 n1 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, n2는 상기 pathway 타겟 유전자 수, k2는 상기 n2 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, O는 상기 miRNA 타겟 유전자 및 pathway 타겟 유전자의 중첩된 유전자 수, i는 상기 중첩된 유전자 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, j는 합계를 위한 인덱스이다.
본 발명에 따른 바이오마커 발굴 방법에 있어서, 상기 miRNA-pathway 조합을 선별하는 제1 단계는 다양한 데이터베이스로부터 miRNA 및 pathway 정보를 수집하여 상기 miRNA 및 pathway가 교집합 영역으로 형성되는 부분으로부터 선택됨으로써 수행될 수 있다. miRNA 및 pathway의 상당한 중첩은 miRNA가 잠재적으로 해당 pathway를 조절함을 의미하며, 상기 제1 단계는 초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용함으로써 통계적으로 유의한 데이터를 도출할 수 있다. 이 때, 상기 통계적으로 유의한 교집합 영역(miRNA-pathway 쌍)은 상기 초기하분포의 P 값이 0.05 이하일 때 도출된 데이터이다.
상기 데이터베이스는 당해 기술분야에서 널리 알려진 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, miRNA 타겟 정보는 TargetScan, TargetRank, miRDB, miRanda, mirSVR 등으로부터 수집될 수 있고, pathway 정보는 WikiPathway, Reactome, Biocarta, KEGG, Gene Ontology 등으로부터 수집될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 단계의 방법에 따라 370,000 개의 유의한 miRNA-pathway 조합을 선별하였다.
본 발명에 따른 바이오마커 발굴 방법에 있어서, 상기 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway를 선별하는 제2 단계는 하기 식 1을 이용하여 상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway 및 지방간 질환의 유전자 발현 데이터 (RNA-seq)를 통합 분석함으로써 수행될 수 있다.
<식 1>
상기 식에서, n1은 상기 miRNA 타겟 유전자 수, k1은 상기 n1 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, n2는 상기 pathway 타겟 유전자 수, k2는 상기 n2 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, O는 상기 miRNA 타겟 유전자 및 pathway 타겟 유전자의 중첩된 유전자 수, i는 상기 중첩된 유전자 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, j는 합계를 위한 인덱스이다.
상기 제2 단계는 상기 식 1을 이용하여 miRNA 및 pathway의 교집합 영역에서 상기 지방간 질환에 대해 하향 조절되는 유전자의 과포집 여부를 분석함으로써, 보다 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway를 선별할 수 있다.
상기 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟은, 상기 식 1에 따라 도출된 P 값이 0.05 이하인 것에서 선별될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 지방간 질환은 간 지방증(hepatic steatosis)에서 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)에 이르는 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이에 따라 NAFLD에 특이적인 miRNA-pathway를 선별할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커 발굴 방법에 있어서, 상기 지방간 질환 유전자들을 직접 조절하는 miRNA-pathway 조절 네트워크를 도출하는 제3 단계는 지방간 질환과 관련된 것으로 이미 알려진 유전자들을 수집하여 상기 제2 단계에서 선별된 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 데이터와 교집합 영역으로 형성되는 부분으로부터 선택됨으로써 수행될 수 있다. 상기 제3 단계 또한, 상기 제1 단계와 마찬가지로 초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용함으로써 통계적으로 유의한 데이터를 도출할 수 있고, 상기 통계적으로 유의한 데이터는 초기하분포 P 값이 0.05 이하인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제3 단계의 방법에 따라 약 500 개의 miRNA-pathway 조합을 선별하였고, 지방간 유도 세포 및 동물 모델 실험을 통해 이의 매커니즘을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 경로(pathway) 정보를 매개로 질병 RNA-seq 데이터를 결합하여 질병 전사체 데이터로부터 miRNA 타겟 발굴
종래 질병 전사체 데이터에서 miRNA 타겟 발굴을 위한 기존의 접근 방식에 따른 한계점을 극복하기 위해, miRNA 타겟, pathway 정보, RNA-seq 발현 데이터 및 질병유전자 정보의 통합 분석을 통해 특정 질병의 miRNA 조절 네트워크를 도출하는 3 단계의 새로운 접근 방식을 제시하였다 (도 2). 상세하게는 하기와 같으며, 지방간 질환을 대상 질병으로하여 관련 유전자를 직접 조절하는 최종 miRNA - 타겟 pathway 도출을 진행하였다.
1 단계 : 통계적으로 유의한 miRNA - 타겟 pathway 선별
miRNA 타겟 정보 (DB : TargetScan, TargetRank, miRDB, miRanda, mirSVR 등) 및 pathway 정보 (DB : WikiPathway, Reactome, Biocarta, KEGG, Gene Ontology 등) 로부터 초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용하여, 전체 370,000 여개의 유의한 중첩도를 갖는 miRNA - 타겟 pathway 조합을 선별하였다 (도 3).
2 단계 : NAFLD에 특이적인 miRNA - pathway 타겟 유전자 선별
상기 1 단계에서 선별된 miRNA - 타겟 pathway 조합과 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 유전자 발현 데이터 (RNA-seq)를 활용하여 NAFLD에 특이적인 miRNA - pathway 타겟 유전자를 선별하였다.
하기 식 1과 같이 나타나는 조건부 초기하분포를 이용하여 교집합 영역에서 하향(down) 조절된 유전자 (RNA-seq)의 과포집 여부를 평가함으로써, 해당 miRNA가 교집합에 포함된 하향 조절 유전자들을 조절하는 것으로 예측할 수 있다 (도 4). 이 때, 하기의 조건부 초기하분포의 우측 꼬리를 이용해서 과포집 여부의 p-value를 평가할 수 있다.
<식 1>
상기 식에서, n1은 miRNA 타겟 유전자 수를, k1은 상기 n1 중 NAFLD 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수를 의미하고, n2는 pathway 타겟 유전자 수를, k2는 상기 n2 중 NAFLD 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수를 의미한다.
O는 상기 miRNA 타겟 유전자 및 pathway 타겟 유전자의 중첩된 유전자 수를 나타내며, i는 그 중 NAFLD 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수를 의미하며, j는 합계를 위한 인덱스이다.
이 때, 상기 P 값이 0.05 이하인 결과를 사용하여 평가할 수 있다.
3 단계 : 간 질환 유전자들을 직접 조절하는 miRNA 선별
질병 유전자 데이터베이스 (DB : DisGeNet, CTD 등)에서 알려진 질병 관련 유전자들을 수집하고, 초기하분포를 이용하여 상기 2단계에서 선별한 타겟 유전자들 (도 4의 교집합 부분에서 하향 조절된 유전자들)과의 교집합을 평가하여, NAFLD에서 잘 알려진 유전자들을 직접 조절하는 miRNA들을 심화 선별하였다.
본 실시예에서는 NAFLD 관련 miRNA 타겟 (TargetScan), pathway (WikiPathway), NASH 환자 샘플의 RNA-seq (Hoang et al. 2019) 를 분석한 결과, 500개의 유의한 miRNA가 도출되었고, 그 중 상위 20개의 리스트를 도 5에 나타내었다.
<실시예 2> 선별된 miRNA에 의한 NAFLD 발병 기전 규명
상기 실시예 1에서 선별된 miRNA (miR-653, miR-493)와 NAFLD와의 관련성을 실험 검증하였다.
선별된 miRNA의 서열정보는 하기와 같다.
- miR-653-5p : 5'-GUGUUGAAACAAUCUCUACUG-3'
- miR-493-5p : 5'-UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU-3'
더불어, 하기 실험에 사용된 관련 유전자의 프라이머 서열정보는 표 1과 같다.
| 유전자 | 프라이머 서열 | |
| SIRT1 | Forward (F) | CCCTCAAAGTAAGACCAGTAGC |
| Reverse (R) | CACAGTCTCCAAGAAGCTCTAC | |
| STAT5B | F | AGTGACTCAGAAATTGGCGG |
| R | AGGTAATTCAAGTCTCCCAAGC | |
| PPARGC1A | F | ACCAAACCCACAGAGAACAG |
| R | GGGTCAGAGGAAGAGATAAAGTTG | |
| IRS1 | F | AAGTGATCCTGAAGCCCAAG |
| R | TCACGAAGCTGATGGTCTTG | |
| INSR | F | GGAAGTTACGTCTGATTCGAGG |
| R | TGAGTGATGGTGAGGTTGTG | |
| FOXO3 | F | CAGATCTACGAGTGGATGGTG |
| R | TCTTGCCAGTTCCCTCATTC | |
| NR2C2 | F | GTAACACGTACACAGACCTCTC |
| R | GTGAAAACACTCAATGGGCC | |
| EGFR | F | AAGCCATATGACGGAATCCC |
| R | GGAACTTTGGGCGACTATCTG | |
| PRKCA | F | CGGAATGGATCACACTGAGAAG |
| R | ACATAAGGATCTGAAAGCCCG | |
1. 세포 실험방법
HepG2 간 세포에 유리지방산 (free fatty acid, FFA)의 혼합물인 올레산(Oleic acid)/팔미트산(Palmitic acid) 혼합물(OA/PA mixture)를 처리하여, 생체 외 지방간 모델 (in vitro fatty liver)을 유도하였다. 유도된 지방간 모델에서 miR-653 및 miR-493에 의한 각각의 간 세포 내 지방 축적의 양상을 대조군과 비교하는 Oil-Red O 염색과 트리글리세라이드 및 콜레스테롤과 같은 대사 지표를 분석하였으며, 이러한 차이 양상을 규명하고자 SIRT1, STAT5B 및 이에 의한 지방 대사 관련 하위 신호전달과 유전자 발현을 비교 분석하였다. 또한, miR-653과 SIRT1, miR-493과 STAT5B 간의 직접적인 유전자 발현 조절 여부를 파악하기 위해 SIRT1과 STAT5B의 3‘-비번역부위(UTR)를 각각 루시퍼레이즈 벡터에 클로닝하여 루시퍼레이즈 어세이를 진행하였다.
2. 동물 모델 실험방법
동물 모델의 경우, 마우스에 다양한 식이 방법 및 유전자 변형을 통해 비만에 의한 비 알코올성 지방간이 유도된 마우스 모델을 활용하였다.
먼저, 가장 많이 활용되는 비만 유도 식이 방식인 고지방식이 (High-fat diet, HFD)의 경우, 12주간의 식이 섭취를 진행한 마우스 모델로부터 간 조직을 확보하였다.
메티오닌(Methionine)/콜린(Choline) 결핍 식이(MCD)는 간에서 VLDL의 합성이 진행되지 못해 주변조직으로 지방을 전달하지 못하여 지속적으로 간에 지방이 축적되는 형태로인해 유도되는 비 알코올성 지방간 모델로, 6주간의 식이 섭취를 진행한 마우스 모델로부터 간 조직을 확보하였다.
또한, 렙틴(Leptin)을 생성하지 못하는 유전자 변이 모델인 ob/ob 마우스 모델로부터 5주간의 정상 식이를 진행한 후, 간 조직을 확보하였다. 각각의 비만에 의해 유도된 비 알코올성 지방간 마우스 모델의 간 조직으로부터 RNA 레벨에서 대조군 대비 miR-653과 miR-493의 유전자 발현 레벨을 각각 파악하였다.
3. 실험결과
miR-653의 경우, 도 6을 참조하면, 지방증(steatosis), 또는 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 판정을 받은 환자 샘플 (A), 유리지방산(free fatty acid, FFA) 혼합물인 올레산(Oleic acid)/팔미트산(Palmitic acid) 혼합물(OA/PA mixture) 처리에 따른 간 세포 지방간 유도 모델 (B), 고지방식이(High-fat diet, HFD) 마우스 모델 (C), 메티오닌(Methionine)/콜린(Choline) 결핍 식이(MCD) 마우스 모델 (D), 유전자 변형에 의해 비만이 유도되는 ob/ob 마우스 모델 (E)에서 miR-653의 발현 양상을 확인한 결과, (E)의 ob/ob 마우스 모델 외 모두 miR-653의 발현이 유의적으로 크게 증가하는 것으로 나타났다.
도 7을 참조하면, miR-653을 과발현 시킨 후 Oil Red O staining을 진행한 결과 (F), 세포에 FFA 혼합물 (OA/PA)을 처리하여 in vitro 지방간을 유도한 경우 (miR-653 + OA/PA), 지질 축적이 더욱 증가함을 확인할 수 있었고, 이는 트리글리세라이드(Triglyceride) (G) 및 총 콜레스테롤(Total cholesterol) (H)을 측정하였을 때도 모두 유의성있게 증가하는 것으로 확인되었다.
도 8을 참조하면, miR-653의 직접 타겟 유전자를 확인한 것으로, 대표적으로 SIRT1를 선정할 수 있다.
도 9를 참조하면, SIRT1의 3’UTR 내에 miR-653과 상보적 서열이 있음을 확인 (K)하였고, 이를 바탕으로 타겟 분석을 진행하였다.
그 결과, (L)에 나타난 바와 같이, WT(wild type)의 경우에는 miR-653 과발현에 의해 감소함을 확인할 수 있고, miR-653과 SIRT1의 3’UTR 내의 상보적 서열의 돌연변이 유발(mutagenesis)를 통해 MUT(mutant)를 제작하여 추가적으로 확인하였을 때, 이러한 변화가 약화(blunt)되는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 이를 통해 miR-653이 SIRT1을 직접적으로 조절함을 판단할 수 있다.
더불어, 도 10을 참조하면, 지질 대사와 관련된 유전자들의 발현을 qPCR 기법을 통해 확인하였을 때, 지질생성(Lipogenesis)에 관여하는 SREBF1 및 FASN이 miR-NC (negative control) + OA/PA에 비해 miR-653 + OA/PA에서 유의성 있게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
이를 토대로 miR-653이 NAFLD 상태에서 증가하며, 지질생성에 관여하여 NAFLD를 조절할 것으로 예상된다.
miR-493의 경우, 도 11을 참조하면, 지방증(steatosis), 또는 비알코올성 지방간염(NASH) 판정을 받은 환자 샘플 (A), 유리지방산(FFA) 혼합물인 올레산/팔미트산(OA/PA) 혼합물 처리에 따른 간 세포 지방간 유도 모델 (B), 고지방식이(HFD) 마우스 모델 (C), 메티오닌/콜린 결핍 식이(MCD) 마우스 모델 (D), 유전자 변형에 의해 비만이 유도되는 ob/ob 마우스 모델 (E)에서 miR-493의 발현 양상을 확인한 결과, (A), (B), 및 (D)에서 miR-493의 발현이 유의적으로 크게 증가하는 것으로 나타났으며, (A)에서 지방증과 비알코올성 지방간염 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
도 12를 참조하면, miR-493을 과발현 시킨 후 Oil Red O staining을 진행한 결과 (F), 세포에 FFA 혼합물 (OA/PA)을 처리하여 in vitro 지방간을 유도한 경우 (miR-653 + OA/PA), 지질 축적이 더욱 증가함을 확인할 수 있었고, 이는 트리글리세라이드(Triglyceride) (G) 및 총 콜레스테롤(Total cholesterol) (H)을 측정하였을 때도 모두 유의성있게 증가하는 것으로 확인되었다.
도 13을 참조하면, miR-493의 직접 타겟 유전자를 확인한 것으로, 대표적으로 STAT5B를 선정할 수 있다.
도 14를 참조하면, STAT5B 의 3’UTR 내에 miR-493과 상보적 서열이 있음을 확인 (K)하였고, 이를 바탕으로 타겟 분석을 진행하였다.
그 결과, (L)에 나타난 바와 같이, WT의 경우에는 miR-493 과발현에 의해 감소함을 확인할 수 있고, miR-493과 STAT5B의 3’UTR 내의 상보적 서열의 돌연변이 유발(mutagenesis)를 통해 MUT(mutant)를 제작하여 추가적으로 확인하였을 때, 이러한 변화가 약화되는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 이를 통해 miR-493이 STAT5B를 직접적으로 조절함을 판단할 수 있다.
더불어, 도 15를 참조하면, 지질 대사와 관련된 유전자들의 발현을 qPCR 기법을 통해 확인하였을 때, 지방생성에 관여하는 SREBF1 및 FASN이 miR-NC + OA/PA에 비해 miR-493 + OA/PA에서 유의성 있게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
이를 토대로 miR-493이 NAFLD 상태에서 증가하며, 지방생성에 관여하여 NAFLD를 조절할 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며,이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 상관관계를 가진 miRNA 및 경로(pathway) 조합 (이하, miRNA-pathway)을 선별하는 제1 단계;
하기 식 1을 이용하여 상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway 및 지방간 질환의 유전자 발현 데이터 (RNA-seq)를 통합 분석하여 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟을 선별하는 제2 단계; 및
상기 제2 단계에서 선별된 타겟에서 지방간 질환 유전자들을 직접 조절하는 miRNA-pathway 조절 네트워크를 도출하는 제3 단계;를 포함하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법:
<식 1>
상기 식에서, n1은 상기 miRNA 타겟 유전자 수, k1은 상기 n1 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, n2는 상기 pathway 타겟 유전자 수, k2는 상기 n2 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, O는 상기 miRNA 타겟 유전자 및 pathway 타겟 유전자의 중첩된 유전자 수, i는 상기 중첩된 유전자 중 상기 지방간 질환 데이터에 의해 하향 조절된 유전자수, j는 합계를 위한 인덱스이다.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제1 단계에서 선별된 miRNA-pathway는,
상기 miRNA 및 pathway 정보를 수집하고 초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용하여 상기 miRNA 및 pathway가 통계적으로 유의한 교집합 영역으로 형성되는 부분으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법.
- 제 2 항에 있어서,
상기 통계적으로 유의한 교집합 영역은,
상기 초기하분포 P 값이 0.05 이하인 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법.
- 제 2 항에 있어서,
상기 제2 단계는,
상기 식 1을 이용하여 상기 miRNA 및 pathway의 교집합 영역에서 상기 지방간 질환에 대해 하향 조절되는 유전자의 과포집 여부를 분석하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 지방간 질환에 특이적인 miRNA-pathway 타겟은,
상기 식 1의 P 값이 0.05 이하일 때 선별되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제3 단계는,
초기하분포(hypergeometric distribution)를 이용하여 통계적으로 유의한 조절 네트워크 데이터를 도출하여 수행되며,
상기 통계적으로 유의한 데이터는 초기하분포 P 값이 0.05 이하인 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 지방간 질환은,
비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)인 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 진단을 위한 바이오마커 발굴 방법.
Priority Applications (2)
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR102234904B1 (ko) * | 2018-11-30 | 2021-04-01 | 주식회사 쓰리빌리언 | 신규 표적 단백질과 그에 대한 동반진단 바이오마커 발굴 시스템 및 방법 |
-
2022
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024010134A1 (ko) | 2024-01-11 |
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