KR20230173113A - 장쇄 당지질의 고리화 및 탈고리화 방법 - Google Patents

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Abstract

락톤 또는 산성 형태의 소포로지질의 혼합물의 선택적 고리화 또는 탈고리화를 위한 방법으로서, 락톤 형태는 소포로지질의 혼합물을 강력한 메틸화제와 반응시켜 적어도 70% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 수득함으로써 생산되고; 산성 형태는 소포로지질의 혼합물을 리페이스 B와 적어도 50%의 상동성을 갖는 유전자 조작된 효소와 반응시켜 적어도 70% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 수득함으로써 생산된다.

Description

장쇄 당지질의 고리화 및 탈고리화 방법
본 발명은 일반적으로 장쇄 당지질, 특히 소포로지질(sophorolipid)의 고리화 및 탈고리화를 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
당지질, 특히 탄수화물기가 람노스 또는 소포로스인 것이 유용한 생물계면활성제라는 것은 잘 알려져 있다. 이들은 또한 다른 생물학적 속성을 갖고 있으며 항균력이 있는 것으로 나타났다.
소포로지질은 칸디다 아피콜라(Candida apicola) 및 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola)와 같은 선택된 수의 비병원성 효모 종에 의해 합성된 표면-활성 당지질 화합물이다. 소포로지질은 전형적으로 12개 내지 18개 탄소 원자의 소수성 지방산 꼬리 및 친수성 소포로스 탄수화물 헤드 그룹으로 이루어지며; 6' 및/또는 6" 위치에서 아세틸화(Ac)될 수 있는 특이한 β-1,2 글리코시드 결합을 갖는 글루코스-유래 이당류이다. 하나의 말단 또는 하위-말단 하이드록실화된 지방산은 탄소 1(1')에서 소포로스 헤드에 β-글리코시드로 연결된다. 이 지방산의 카복실 말단은 유리형(산성 또는 개방 형태)이거나 또는 4" 또는 또는 때때로 6' 또는 6" 위치(락톤 형태 또는 폐쇄 형태)에서 내부적으로 에스터화되어 있으며, 이들의 예는 다음과 같다:
식 중, R1, R2 = H 또는 Ac.
식 중, R1, R2 = H 또는 Ac.
식 중, R1, R2 = H 또는 Ac.
.
구조 A 및 구조 B는 산성의 개방 형태 소포로지질이고; 구조 C 및 구조 D는 락톤 형태의 소포로지질이다. (A)는 포화된 산성 소포로지질이고, (B)는 불포화된 산성 소포로지질이고, (C)는 4" 위치에서 에스터화된 포화 단량체성 락톤 소포로지질이고, (D)는 4" 위치에서 에스터화된 포화 이량체성 락톤 소포로지질이다(Kulakovskaya, E. & K. T., [2014] Extracellular glycolipids of Yeasts; Biodiversity, Biochemistry and Prospects. Oxford, UK: Academic Press, Elsevier Inc.).
많은 생물계면활성제와 마찬가지로, 소포로지질은 생물막 형성을 방해하고 세균, 진균, 조류, 마이코플라스마 및 바이러스와 같은 다양한 임상적으로 관련된 유기체의 성장을 저해할 가능성이 있다. 이러한 생물계면활성제의 제안된 주요 작용 메커니즘은 막 지질 질서 교란이다.
소포로지질의 물리화학적 및 생물학적 특성은 락톤(폐쇄형 또는 고리형) 대 산성(개방형 또는 비고리형) 형태의 분포에 의해 크게 영향을 받는다. 발효에 의해 만들어진 제품의 상당 부분이 산성 및 락톤 형태로 존재하며, 종종 발효 브로스에서 약 50:50의 비율로 존재하기 때문에, 이들의 사용은 유용성이 다소 제한된다. 두 형태 모두 유익한 특성을 갖고 있지만, 일반적으로 이러한 특성을 최대한 활용하기 위해서는 둘 중 하나의 실질적으로 순수한 형태를 갖는 것이 바람직하다. 락톤 형태 표면 장력을 줄이는 데 더 효과적이며 더 나은 항균 특성을 갖는다. 산성 형태는 더 나은 거품 생성 능력 및 용해도를 나타낸다(Bacille, 2017). 그러나, 지질의 이러한 유익한 특성은 활용하기 어려울 수 있다. 예를 들어, 산성 형태는 낮은 pH에서 불안정하기 때문에 경구 투여가 종종 효과가 없어, 이 형태는 제품이 위장을 그대로 통과하여 위장관 하부에 도달하도록 설계된 용도에 적합하지 않다. 결과적으로, 발효에 의해 만들어진 제품의 상당 부분이 '산성' 형태라는 사실로 인해 동물 사료에서의 이의 용도가 다소 제한되었다.
선행 기술의 발효 방법은 브로스에서 한 형태의 다른 형태에 대한 비율을 증가시키기 위해 최적화되었지만, 이러한 형태를 합성적으로, 이상적으로는 실질적으로 순수한 형태로 생산할 수 있는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 목적은 상기 언급된 문제를 극복하거나 또는 적어도 완화시키는 장쇄 당지질, 특히 탄수화물기가 소포로스인 것의 고리화 및 탈고리화를 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 양태에 따르면, 락톤 또는 산성 형태의 소포로지질의 혼합물의 선택적 고리화 또는 탈고리화를 위한 방법이 제공되며, 해당 방법은 요구되는 형태에 따라서 다음 단계 중 어느 하나의 단계를 선택하는 단계를 포함한다:
(i) 소포로지질의 혼합물을 강력한 메틸화제와 반응시켜 적어도 70% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계; 또는
(ii) 소포로지질의 혼합물을 리페이스(Lipase) B와 적어도 50%의 상동성을 갖는 유전자 조작된 효소와 반응시켜 적어도 70% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계.
소포로지질의 출발 혼합물은 바람직하게는 적어도 40:60 내지 60:40의 락톤 대 산성 형태의 소포로지질을 포함한다.
본 발명의 두 번째 양태는 적어도 40% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 포함하는 소포로지질 조성물을 강력한 메틸화제와 반응시켜 적어도 80% w/w의 락톤 형Å의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계를 포함하는, 소포로지질의 산성 형태로부터 이의 락톤 형태를 생산하는 방법을 제공한다.
산성의 개방형 소포로지질 형태를 락톤의 폐쇄형 형태로 고리화시키기 위해 임의의 강력한 메틸화제가 사용될 수 있지만, 바람직하게는 메틸화제로서 다이아조메테인 또는 이의 유도체, 특히　TMS-다이아조메테인이 사용된다. 다른 강력한 메틸화제는 메틸 플루오로설포네이트 또는 메틸 트라이플루오로메테인 설포네이트를 포함한다. 트라이메틸아민 또는 아이오도메테인과 같은 더 약한 메틸화제는 고리화를 발생시키기에 충분하지 않다.
임의의 적합한 양의 메틸화제가 출발 소포로지질에 첨가될 수 있지만, 바람직하게는 헥세인 또는 메탄올과 같은 적합한 용매에 동몰량의 메틸화제가 첨가된다. 예를 들어, 1M 또는 2M.
바람직하게는, 적어도 40% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 포함하는 출발 소포로지질 조성물은 메틸화제와 반응하기 전에 건조되고, 보다 바람직하게는 적어도 1시간 동안 진공 건조된다.
바람직하게는, 출발 소포로지질은 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 75% w/w, 특히 100% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 포함한다.
메틸화제는 바람직하게는 감소된 온도, 바람직하게는 10℃ 미만에서 출발 소포로지질 조성물에 첨가된다. 교반은 반응에 도움이 될 수 있다.
용액은 바람직하게는 진공 건조되어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 락톤 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공한다.
본 발명의 세 번째 양태는 적어도 40% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 포함하는 소포로지질 조성물을 리페이스 B와 적어도 50%의 상동성을 갖는 유전자 조작된 효소와 반응시켜 적어도 70% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계를 포함하는, 소포로지질의 락톤 형태로부터 이의 산성 형태를 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 출발 소포로지질 조성물은 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 75% w/w, 특히 100% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 포함한다.
혼합물은 바람직하게는 물 또는 또 다른 적합한 용매에 용해되고, 적어도 35℃, 바람직하게는 37℃ 이상, 바람직하게는 적어도 40℃로 가열된다. 효소는, 예를 들어, 비드 또는 칼럼에 고정될 수 있다. 바람직하게는, 혼합물은 적어도 3시간, 바람직하게는 4시간 내지 6시간 동안 교반된다.
그런 다음, 최종 생성물은, 예를 들어, 여과에 의해 효소로부터 제거되고, 건조, 예를 들어, 진공 건조된다.
바람직하게는, 최종 생성물은 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 산성 소포로지질을 갖는다.
해당 방법은 락톤 형태를 산성 형태로 전환시키기 위해 리페이스, 특히 리페이스 B와 동일한 기능을 갖는 유전자 조작된 효소를 사용한다. 바람직하게는, 유전자 조작된 효소는 리페이스 B와 적어도 50%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 70%의 상동성, 특히 적어도 80%의 상동성, 이상적으로 적어도 90%의 상동성을 갖는다.
바람직하게는, 유전자 조작된 효소는 서열번호 1 내지 5로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 상동체를 포함한다. 보다 바람직하게는 효소는 서열번호 1을 포함하거나 또는 효소는 적어도 아미노산 서열 서열번호 2 내지 5를 갖는다.
핵산 코딩 서열은 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 혼입될 수 있다. 핵산을 포함하는 벡터는 하나 이상의 조절 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 벡터 또는 이의 일부는 효소의 발현을 위해 세균 또는 효모와 같은 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 이는 에피솜일 수 있거나, 또는 일시적이거나 또는 안정적인 방식으로 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
바람직하게는 숙주는 피키아 종(Pichia spp.), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 선택된다.
효소는 성장하여 배지에 발현될 수 있거나, 또는 세포 배양물은 화학적으로, 기계적으로 또는 물리적으로 파괴되어 활성 효소를 방출할 수 있다.
순수한 형태의 효소는 플로우-스루 시스템 또는 반복 사용을 위해 고정될 수 있다.
본 발명의 더 나은 이해를 위해 그리고 그것이 어떻게 실행될 수 있는지를 더 명확하게 보여주기 위해, 이제 단지 예로서 첨부된 도면을 참조할 것이다:
도 1은 메틸화제, 구체적으로 TMS-다이아조메테인으로 처리하기 전 발효에 의해 형성된 소포로지질 혼합물에 대한 ESI-ToF 질량 스펙트럼이다;
도 2는 메틸화제, 구체적으로 TMS-다이아조메테인으로 처리한 후 도 1의 조성물에 대한 ESI-ToF 질량 스펙트럼이다; 그리고
도 3은 리페이스, 구체적으로 C. 안타르크티카(C. antarctica)로부터의 리페이스 B로 처리한 후 도 2의 조성물에 대한 ESI-ToF 질량 스펙트럼이다.
본 발명은 락톤 형태의 실질적으로 순수한 소포로지질 또는 산성 형태의 실질적으로 순수한 소포로지질을 생산할 수 있는 합성 방법을 제공한다. 본 개시내용의 맥락에서, 바람직하게는 소포로지질의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 특히 100%는 최종 생성물에서 목적하는 락톤 형태 또는 산성 형태로 존재한다. 이는 락톤 또는 산성 형태의 유익한 특성을 기반으로 하는 화합물을 사용하는 능력을 크게 증가시킨다
본 발명은 특히 탄수화물기가 소포로스인 장쇄 당지질의 고리화를 위한 새로운 방법을 제공한다.
실시예 1: 산성 형태와 락톤 형태의 혼합물로부터의 락톤 형태의 소포로지질의 단일-단계 제조.
발효에 의해 형성된 소포로지질 혼합물을 락톤 형태의 지질의 단일 단계 제조를 수행하기 전에 완전히 건조시켰다.
이 실시예에서, 10g 내지 12g(w/w)의 소포로지질을 250㎖ 증발 플라스크에 넣고, 70℃에서 수조 위의 회전 증발기에 넣고, 100rpm으로 회전하도록 설정하였다. 그런 다음 다음과 같은 일련의 진공을 시스템에 적용하였다:
초기 진공은 200mbar로 설정하였다;
10분 후, 진공을 160mbar로 감소시키고;
20분 후, 진공을 140mbar로 감소시키고;
30분 후, 진공을 120mbar로 감소시키고;
40분 후, 진공을 100mbar로 감소시키고;
50분 후, 진공을 70mbar로 감소시키고;
60분 후, 진공을 50mbar로 감소시키고;
70분 후, 진공을 30mbar로 감소시키고;
80분 후, 진공을 20mbar로 감소시키고; 그리고
그 후, 진공을 20mbar에서 추가로 60분 동안 유지하였다.
그런 다음, 건조된 소포로지질을 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 최소량의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 그런 다음, 플라스크를 교반하면서 얼음조에 넣었다.
동몰량의 적어도 1M TMS 다이아조메테인(헥세인 중) 용액을 플라스크에 적가하였다. 플라스크를 3시간 내지 4시간 동안 교반하면서 얼음조에 두었다.
그런 다음, 용액을 진공 건조시켜 락톤 소포로지질을 높은 비율(80% 초과)로 수득하였다.
도 1 및 도 2는 메틸화제를 사용한 처리 전 및 처리 후 혼합물을 보여주는 전자분무 이온화 비행 시간(electrospray ionisation time of flight: ESI-ToF) 질량 스펙트럼이다. 처리 후 생성물은 산성 형태에 비해 소포로지질의 락톤 형태의 비율이 훨씬 더 높다는 것이 분명하다. 특히, 도 1에서 확인된 혼합물은 75.6%의 산성의 개방형 소포로지질 형태 및 24.4%의 락톤의 폐쇄형 소포로지질 형태로 구성되었다. 도 2에서, TMS-다이아조메테인으로 처리한 후, 혼합물은 이제 20.38%의 산성의 개방형 소포로지질 형태 및 79.62%의 락톤의 폐쇄형 소포로지질 형태로 구성되었다.
다이아조메테인 또는 메틸 플루오로설포네이트 또는 메틸 트라이플루오로메테인 설포네이트와 같은 다른 유형의 메틸화제가 TMS-다이아조메테인 대신 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 다이아조메테인 유도체가 사용되며, TMS-다이아조메테인 및 다이아조메테인이 산성 형태를 락톤 형태로 가장 효율적으로 전환시키는 바람직한 후보이다.
실시예 2: 락톤 형태와 산성 형태의 혼합물로부터의 소포로지질의 산성 형태의 단일-단계 제조.
실시예 1에서 제조된 락톤 소포로지질을 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 물에 용해시켰다. 용액을 45℃로 가열하고 교반하였다. 그런 다음, 약 1% w/w의 고정화된 리페이스 B 효소를 이 용액에 첨가하고, 이를 4시간 내지 6시간 동안 교반하였다. 리페이스 B는 스포로볼로마이세스 안타르크티쿠스(Sporobolomyces antarcticus)로도 지칭되는 모에스지오마이세스 안타르크티쿠스(Moesziomyces antarcticus), 트리코스포론 오리자에(Trichosporon oryzae), 슈도자이마 안타르크티카(Pseudozyma antarctica) 및 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica)로부터 유래한 것이었다.
고정화된 효소를 용액으로부터 여과 제거하였다. 그런 다음, 용액을 진공 건조시켜 산성 소포로지질을 높은 비율(80% 초과)로 수득하였다. 이는 산성 소포로지질의 더 높은 비율을 보여주는 도 3의 ESI-ToF 질량 스펙트럼에 설명되어 있다. 특히, 리페이스 B로 처리한 후, 혼합물은 이제 89.10%의 산성의 개방형 소포로지질 형태 및 10.90%의 락톤의 폐쇄형 소포로지질 형태로 구성되었다.
따라서, 실시예 1 및 실시예 2의 단계를 결합하면 다음 도식에 표시된 바와 같이 락톤 또는 산성 형태를 선택할 수 있다:
실시예 3: 산성 형태의 제조를 위한 에스터레이스 후보.
에스터레이스, 특히 리페이스(EC 3.1.1.3), 특히 리페이스 B가 락톤 소포로지질을 산성 형태로 전환할 수 있다는 것이 결정되면, 락톤 형태를 산성 형태로 전환시킬 수 있는 역할을 하는 리페이스 영역의 확인을 포함하여 다른 적합한 후보를 확인하기 위한 추가 조사를 수행하였다.
따라서, 상이한 종으로부터의 리페이스 B와 상동성을 공유하는 여러 관련 리페이스의 아미노산 서열을 비교함으로써 리페이스 B 단백질의 어느 부분이 가장 보존되는지 결정하기 위한 조사를 수행하였다.
방법:
C. 안타르크티카로부터의 리페이스 B 아미노산 서열(서열번호 1)을 취하여 표준 단백질-단백질 BLAST(pBLAST)를 수행하였다. 모든 정렬의 FASTA 시퀀스를 Jalview로 내보내고 가져왔다. MUSCLE 정렬은 C. 안타르크티카 유기체로부터 유래한 것이 아니라는 제약 조건으로 모든 서열에 대해 수행하였다. C. 안타르크티카로부터의 다른 리페이스 B 변이체는 서열번호 1과 97.14% 이상의 상동성을 갖는다.
서열번호 1:
나머지 서열에 대해 MUSCLE 정렬을 반복하고, 동일성 백분율을 결정하였다. 고도로 보존된 영역에 대한 컨센서스 서열을 분석하고, 예를 들어, 모든 단백질에 걸쳐 적어도 70% 동일성이 있는 영역을 강조하고, 특히 100% 동일성을 갖는 아미노산을 기록하였다.
아미노산의 4개의 보존된 영역이 확인되었으며, 서열번호 2 내지 5에 자세히 설명되어 있다. 이들 영역은 서열번호 1의 63번 내지 66번; 128번 내지 132번; 202번 내지 218번; 237번 내지 241번 아미노산 잔기에 해당한다. 이들 영역은 리페이스 B 활성에 필수적인 것으로 간주된다.
서열번호 2:
(서열번호 1의 63번 내지 66번 잔기에 해당함)
서열번호 3:
여기서, x1은 S, T 또는 G 아미노산 잔기에 해당한다.
(서열번호 1의 128번 내지 132번 잔기에 해당함)
서열번호 4:
여기서, x2는 T, N 또는 S 아미노산 잔기에 해당한다.
x3은 I, L 또는 F 아미노산 잔기에 해당한다.
x4는 Y, F 또는 W 아미노산 잔기에 해당한다.
x5는 A, S 또는 G 아미노산 잔기에 해당한다.
x6은 T, F, L 또는 S 아미노산 잔기에 해당한다.
x7은 E, D 또는 Q 아미노산 잔기에 해당한다.
x8은 I, V 또는 F 아미노산 잔기에 해당한다.
x9는 Q, E 또는 K 아미노산 잔기에 해당한다.
x10은 Q, E, N 또는 M 아미노산 잔기에 해당한다.
(서열번호 1의 202번 내지 218번 잔기에 해당함)
서열번호 5:
여기서, x11은 V, A 또는 L 아미노산 잔기에 해당한다.
x12는 S, D 또는 A 아미노산 잔기에 해당한다.
x13은 V, Y 또는 I 아미노산 잔기에 해당한다.
(서열번호 1의 237번 내지 241번 잔기에 해당함)
서열을 포함하는 벡터는 사카로마이세스 종, 아스퍼질러스 종 또는 에스케리키아 콜라이와 같은 숙주 유기체 또는 다른 적합한 숙주 유기체에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 pET 및 pESC 유도체를 포함할 수 있으며, 이는 에피솜일 수 있거나 또는 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 이는 성장하여 배지에 발현될 수 있거나 또는 세포 배양물이 화학적으로, 기계적으로 또는 물리적으로 파괴되어 효소를 방출할 수 있다. 정제가 수행될 수 있으며, 순수한 형태의 효소는 플로우-스루 시스템 또는 반복 사용을 위해 고정화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 락톤 형태의 실질적으로 순수한 소포로지질 또는 산성 형태의 실질적으로 순수한 소포로지질을 생산하기 위한 새로운 기법을 제공하여 락톤 또는 산성 형태의 유익한 특성을 기반으로 화합물을 사용하는 능력을 크게 증가시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Pathway Intermediates Limited <120> Methods for Cyclization and De-cyclization of Long Chain Glycolipids <130> WO/2022/200273 <140> PCT/EP2022/057351 <141> 2022-03-21 <150> GB2103925.0 <151> 2021-03-22 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lipase B <400> 1 Met Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Val Ala Gly Val Leu Ala Thr Cys 1 5 10 15 Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly 50 55 60 Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu 65 70 75 80 Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe 85 90 95 Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile 100 105 110 Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr 115 120 125 Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro 130 135 140 Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala 165 170 175 Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu 180 185 190 Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu 210 215 220 Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val 225 230 235 240 Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln 245 250 255 Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln 260 265 270 Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala 275 280 285 Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala 290 295 300 Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro 305 310 315 320 Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys 325 330 335 Ser Gly Ile Val Thr Pro 340 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lipase B <400> 2 Pro Gly Thr Gly 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lipase B <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> xaa is either S, T or G amino acid residues <400> 3 Xaa Trp Ser Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lipase B <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> xaa is either T, N or S amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> xaa is either I, L or F amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> xaa is either Y, F or W amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> xaa is either A, S or G amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> xaa is either T, F, L or S amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> xaa is either E, D or Q amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> xaa is either I, V or F amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> xaa is either Q, E or K amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> xaa is either Q, E, N or M amino acid residues <400> 4 Val Pro Thr Thr Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Val Xaa Pro 1 5 10 15 Xaa

Claims (20)

  1. 소포로지질(sophorolipid)의 산성 형태로부터 락톤 형태를 생산하는 방법으로서,
    적어도 40% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 포함하는 소포로지질 조성물을 강력한 메틸화제와 반응시켜 적어도 70% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계를 포함하는, 소포로지질의 산성 형태로부터 락톤 형태를 생산하는 방법.
  2. 소포로지질의 락톤 형태로부터 산성 형태를 생산하는 방법으로서,
    적어도 40% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 포함하는 소포로지질 조성물을 리페이스 B와 적어도 50%의 상동성을 갖는 유전자 조작된 효소와 반응시켜 적어도 70% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계를 포함하는, 소포로지질의 락톤 형태로부터 산성 형태를 생산하는 방법.
  3. 락톤 형태 또는 산성 형태의 소포로지질의 혼합물의 선택적 고리화 또는 탈고리화 방법으로서,
    요구되는 형태에 따라서,
    (i) 상기 소포로지질의 혼합물을 강력한 메틸화제와 반응시켜 적어도 70% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계; 또는
    (ii) 상기 소포로지질의 혼합물을 리페이스(Lipase) B와 적어도 50%의 상동성을 갖는 유전자 조작된 효소와 반응시켜 적어도 70% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는 단계
    중 어느 하나의 단계를 선택하는 단계를 포함하는, 락톤 형태 또는 산성 형태의 소포로지질의 혼합물의 선택적 고리화 또는 탈고리화 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 소포로지질의 출발 혼합물은 적어도 40:60 대 60:40의 락톤 대 산성 형태의 소포로지질을 포함하는, 방법.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강력한 메틸화제는 다이아조메테인 또는 이의 유도체, 바람직하게는 TMS-다이아조메테인인, 방법.
  6. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강력한 메틸화제는 메틸 플루오로설포네이트 또는 메틸 트라이플루오로메테인 설포네이트인, 방법.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메틸화제는 바람직하게는 용매 중 동몰량의 메틸화제로 상기 출발 소포로지질에 첨가되되, 특히 상기 용매는 헥세인 또는 메탄올로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 40% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 포함하는 출발 소포로지질 조성물은 메틸화제와 반응하기 전에 건조되며, 바람직하게는 적어도 1시간 동안 진공 건조되는, 방법.
  9. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출발 소포로지질은 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 75% w/w, 특히 100% w/w의 산성 형태의 소포로지질을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메틸화제는 감소된 온도, 바람직하게는 10℃ 미만에서 상기 출발 소포로지질 조성물에 첨가되는, 방법.
  11. 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 진공 건조되어 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%의 락톤 소포로지질을 갖는 최종 생성물을 제공하는, 방법.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 출발 소포로지질 조성물은 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 75% w/w, 특히 100% w/w의 락톤 형태의 소포로지질을 포함하는, 방법.
  13. 제2항, 제3항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 물 또는 또 다른 적합한 용매에 용해되고, 적어도 35℃, 바람직하게는 37℃ 이상, 바람직하게는 적어도 40℃로 가열되는, 방법.
  14. 제2항, 제3항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 지지체에 고정화되는, 방법.
  15. 제2항, 제3항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 효소는 리페이스 B와 적어도 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 70%의 상동성, 특히 적어도 80%의 상동성, 이상적으로 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  16. 제2항, 제3항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 효소는 서열번호 1 내지 5로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 상동체를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유전자 조작된 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 유전자 조작된 효소는 각각 서열번호 2 내지 5의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 유전자 조작된 효소의 발현을 위해 숙주 세포에 삽입하기 위해 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나에 대한 핵산 서열을 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 혼입시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 숙주는 피키아 종(Pichia spp.), 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 선택되는, 방법.
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