KR20230170931A

KR20230170931A - 코로나바이러스 감염 치료에 사용하기 위한 압타머

Info

Publication number: KR20230170931A
Application number: KR1020237038311A
Authority: KR
Inventors: 안네카트린 하버랜드; 요하네스 뮐러; 게르드 월루캣; 피터 괴텔
Original assignee: 베를린 큐어스 게엠베하
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2023-12-19
Also published as: CA3214646A1; US20240191241A1; EP4288547A1; JP2024509645A; AU2022255586A9; MX2023011974A; BR112023020893A2; CN117500927A; AU2022255586A1; AU2022255586B2; IL307360A; WO2022214670A1

Abstract

본 발명은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 감염을 극복한 환자의 장기 코로나와 관련된 질병 증상을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 데 사용하기 위한 새로운 압타머 분자, 이러한 압타머 분자를 포함하는 약학 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스 감염 치료에 사용하기 위한 압타머

코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의해 발생하는 감염의 치료에 사용하기 위한 새로운 압타머 분자, 시험관 내/체외(in vitro/ex vivo)에서 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스로 인한 감염을 예방하는 방법, 상기 압타머 분자를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트, 및 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 체세포 감염을 예방하기 위한 상기 압타머 분자의 용도에 관한 것이다.

새로운 고병원성 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 출현과 급속한 국제적 확산으로 인해 심각한 글로벌 공중보건 비상사태가 발생했다. 2003년의 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 2012년의 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)와 같은 다른 병원성 코로나바이러스 변종에 감염된 환자와 유사하게, SARS-CoV-2에 감염된 환자는 마른 기침, 발열, 두통, 호흡곤란, 폐렴 등 다양한 증상을 나타내며 사망률은 3~5% 범위이다.

2019년 12월 처음 발생한 이후 SARS-CoV-2는 전 세계적으로 212개 국가, 지역 및 지역으로 확산되었다. 2020년 4월 8일 기준, 전 세계적으로 1,317,130명의 바이러스 감염이 확인되었으며, 감염된 환자의 확인된 사망자는 74,304명이다(https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019).

현재 전 세계 여러 도시와 국가는 지속적인 확산을 최소화하기 위해 다양한 범위의 폐쇄 조치를 취하고 있으며, WHO는 SARS-CoV-2의 신속하고 세계적인 확산에 대한 국제적 공중보건 비상사태(Public Health Emergency of International Concern; PHEIC) 듀오를 발표했다.

코로나바이러스 게놈에 대한 계통발생학적 분석을 통해 SARS-CoV-2는 SARS-CoV, MERS-CoV, 박쥐 SARS 관련 코로나바이러스(SARSr-CoV) 뿐 아니라 인간과 다양한 동물 종에서 확인된 다른 구성원을 포함하는, 베타코로나바이러스(Betacoronavirus) 속의 새로운 구성원이라는 사실이 밝혀졌다.

각 코로나바이러스에는 스파이크(spike; S), 외피(envelope; E), 막(membrane; M), 뉴클레오캡시드(nucleocapsid; N) 단백질을 포함한 4가지 구조 단백질이 포함되어 있다. 그 중 스파이크 당단백질 또는 S 단백질은 바이러스 부착, 융합 및 진입에서 가장 중요한 역할을 하며, 항체, 진입 억제제 및 백신 개발을 위한 가장 유망한 표적 역할을 한다. S 단백질은 먼저 S1 하위 단위의 수용체 결합 도메인(RBD)을 통해 숙주 수용체에 결합한 다음 S2 하위 단위를 통해 바이러스와 숙주 막을 융합시켜 숙주 세포로의 바이러스 진입을 중개한다(Lu, G. et al. Nature 500, 227-231 (2013)). 즉, 바이러스 외피의 동종삼합체 스파이크 당단백질(각 스파이크 단량체의 S1 하위 단위 및 S2 하위 단위)은 세포 수용체에 결합하는 데 사용된다. 이러한 결합은 세포 진입을 위해 세포막과 바이러스막 사이의 융합으로 이어지는 일련의 사건을 촉발한다.

SARS-CoV와 MERS-CoV RBD는 서로 다른 수용체를 인식한다. SARS-CoV는 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin-converting enzyme 2; ACE2)를 수용체로 인식하는 반면, MERS-CoV는 디펩티딜 펩티다제 4(dipeptidyl peptidase 4; DPP4)를 수용체로 인식한다. SARS-CoV와 유사하게, SARS-CoV-2도 ACE2를 바이러스 S 단백질에 결합하는 숙주 수용체로 인식한다(Zhou, P., et al. Nature 579, 270-273 (2020)).

SARS-CoV 스파이크 및 세포 수용체 ACE2와의 상호 작용에 대한 저온 전자 현미경 연구에서는 표적 체세포의 ACE2 수용체에 결합하는 것이 SARS-CoV가 표적 세포에 진입하는 데 중요한 초기 단계임을 확인하였다. 최근 연구에서는 SARS-CoV-2 진입을 중재하는 데 있어 ACE2의 중요한 역할도 제시했다(Walls, A. C. et al. Cell S0092-8674(20)30262-2 (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058; 및 Hoffmann, M. et al. Cell S0092-8674 (20)30229-4 (2020); https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052)).

ACE2를 발현하는 HeLa 세포는 SARS-CoV-2 감염에 취약한 반면, 수용체가 부족한 세포는 그렇지 않다. 또한 시험관 내 결합 측정에서는 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain; RBD)이 낮은 nM 범위의 친화도로 ACE2에 결합하는 것으로 나타났다. 이는 RBD가 ACE2에 의한 SARS-CoV-2 결합을 담당하는, 스파이크 당단백질의 S1 하위 단위 내의 주요 기능 구성 요소임을 시사한다.

최근에는 SARS-CoV2가 헤파란 황산염을 보조 인자 또는 세포 부착 인자로 사용하여 이후의 성공적인 ACE-2 매개 세포 진입을 가능하게 한다는 것이 보고되었다. RBD와 헤파란 설페이트의 사전 접촉은 후속 세포 흡수에 필요한 "바이러스 수집기"로 기능할 수 있다. 여기에서는 SARS-CoV-2의 RBD의 양전하를 띤 아미노산이 헤파란 설페이트 및 헤파린에 대한 잠재적인 결합 파트너로 논의된다(Clausen et al., 2020, Cell 183, 1043-1057.e15.).

요약하면, 각 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 바이러스의 감염성과 병원성에 중요하고 관련이 있다. 이 단계에서는 코로나바이러스 스파이크 단백질을 겨냥하여 감염 과정을 방해할 수 있는 새로운 추가 물질을 식별하기 위한 연구 개발 활동이 활발히 진행되고 있다. 이 부분을 선택적으로 표적으로 삼는 항체가 개발될 수 있지만, 1단계 임상 시험을 통과하여 환자에게 안전하게 투여할 수 있는 (소형) 분자를 식별하는 것이 훨씬 더 유리할 수 있다.

또한 바이러스와 바이러스 감염주기에는 이론적으로 물질의 공격을 받을 수 있는 취약한 부위가 더 많다. 압타머라고도 알려진 올리고뉴클레오티드 기반 약물의 경우, 그러한 분자의 간섭에 취약한 몇 가지 중요한 부위가 이전에 확인되고 설명되었다. 소분자, 항체 유래 생물학적 제제 및 압타머를 포함한 약물의 추가 잠재적 표적 부위는 RNA 바이러스의 복제 과정에 관여하는 효소이다. 그러한 새로운 표적 부위와 그러한 새로운 표적 부위에 대한 친화성 분자의 특성화는 코로나바이러스과(Coronaviridae) 감염을 퇴치하기 위한 도구 키트를 보완할 것이다.

항바이러스 활성 압타머에 대한 개요는 Gonzalez et al.에 의해 제공되었다(Gonzalez, V.M. et al., 2016. Use of Aptamers as Diagnostics Tools and Antiviral Agents for Human Viruses. Pharmaceuticals (Basel) 9. https://doi.org/10.3390/ph9040078; 및 Zou et al., 2019. Application of Aptamers in Virus Detection and Antiviral Therapy. Front Microbiol 10, 1462. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01462).

실제로 중증급성호흡기증후군(SARS) 코로나바이러스 NTPase/헬리카제에 대한 억제성 RNA와 DNA 압타머의 분리를 기반으로 하는 항코로나바이러스 치료법이 추가로 보고되었다. 이러한 항바이러스 활성 압타머 중에서, 헤마글루티닌의 수용체 결합 영역을 차단하는 항인플루엔자 압타머 A22(-AATTAACCCTCACTAAAGGGCTGAGTCTCAAAACCGCAATACACTGGTTGTATGGTCGAATAAGTTAA; 서열번호 6)가 언급되어야 한다. 본 발명에 따른 표적으로서 바이러스의 세포 진입 매개체 외에, 인플루엔자 바이러스의 핵단백질과 같은 다른 바이러스-표적 결합 부위도 이미 확인되었다(Negri et al., 2012. Direct Optical Detection of Viral Nucleoprotein Binding to an Anti-Influenza Aptamer. Anal Chem. 2012 Jul 3; 84(13): 5501-5508.).

COVID-19 환자로부터 새로 제기된 데이터를 기반으로 한 최근 간행물은 SARS-CoV-2가 혈류와 신체의 다양한 부위에 도달하여 미세혈전증을 유발할 수 있음을 시사하거나 심지어 증명한 것으로 보고하였다. 이러한 미세혈전증은 현재 코로나19 환자의 주요 사망 원인 중 하나로 꼽힌다(Ackermann M. et al., N Engl J Med. 2020 doi: 10.1056/NEJMoa2015432; Varga Z et al., The Lancet 2020 doi: 10.1016/S0140?6736(20)30937?5.; Wichmann D et al. Annals of Internal Medicine 2020 doi: 10.7326/M20-2003).

팬데믹이 진행되는 동안 예를 들어, 이탈리아 연구에서 85% 이상의 높은 비율의 환자가 코로나19에서 회복된 후에도 지속적인 증상을 보이는 것이 분명해졌다(Carfi A, Bernabei R, Landi F, Gemelli Against COVID-19 Post-Acute Care Study Group (2020) Persistent Symptoms in Patients After Acute COVID-19. JAMA 324:603-605. https://doi.org/10.1001/jama.2020.12603). 코로나19 이후 증상의 정도에 관한 유사한 결과가 조사된 코로나19 환자의 75% 이상이 질병 후 증상을 보이는 것으로 나타난 독일 연구에서도 확인되었다(Puntmann VO, Carerj ML, Wieters I, et al (2020) Outcomes of Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging in Patients Recently Recovered From Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). JAMA Cardiol. https://doi.org/10.1001/jamacardio.2020.3557).

활성 SARS-CoV-2 감염 후 관찰된 지속되는 증상과 COVID-19가 가라앉은 복합적인 증상을 일반적으로 Post-COVID 증후군, 장기 코로나(Long COVID), SARS-CoV-2 감염의 급성 후유증(Post-Acute Sequelae of SARS-CoV-2 infection; PASC), 만성 코로나 증후군(chronic COVID syndrome; CCS) 또는 장거리 코로나(long-haul COVID)라고 한다.

이러한 증상에는 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 자세 기립성 빈맥 증후군(postural orthostatic tachycardia syndrome; PoTS), 자율신경 장애(dysautonomia), 횡단 척수염(transverse myelitis), 급성 괴사성 척수염(acute necrotising myelitis), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 등과 같은 하나 이상의 신경학적 장애뿐만 아니라 심근 염증(myocardial inflammation), 부정맥(arrhythmia), 빈맥(tachycardia), 서맥(bradycardia), 방실(atrioventricular; AV) 차단과 같은 심혈관 관련 증상이 포함될 수 있으며, 이는 심정지까지 확대될 수도 있다.

따라서, 활동성 SARS-CoV-2 감염의 예방 및 치료뿐만 아니라 장기 코로나(Long COVID) 형태의 감염에 따른 증상의 예방 및 치료를 위한 새로운 치료제가 요구된다. 흥미롭게도 최근 장기 코로나와 자가면역 사이의 연관성이 밝혀졌다. 이와 관련하여, SARS-CoV-2 유발 자가면역 반응은 질병의 중증도 및 수명(Long-COVID)에 대한 가능한 핵심 요인으로 제안되었다(Khamsi R 2021, Nature 590(7844):29-31.).

임의의 새로운 화합물 및 조성물은 이론적으로 환자의 코로나바이러스과에 의해 유발된 증상을 완화 및 치료하는 것을 포함하여 짧은 시간 내에 많은 임상 관련 응용 분야에서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 코로나바이러스과의 바이러스로 인한 감염을 앓고 있거나 극복한 대상의 치료에 사용하기 위한 새로운 분자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 체세포의 감염을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 이러한 바이러스 감염에 대해 사용될 수 있는 약제학적 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 체세포 감염을 예방하기 위한 신규 분자의 용도를 제공하는 것이다.

최근 코로나19 질병 과정에서 미세혈전증의 관련성이 인식된 점을 고려하여, 본 발명의 목적은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염에 효과적이면서 동시에 항응고 효과를 나타내는 새로운 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 코로나바이러스과 복제 기계 내의 신규한 표적 부위에 대해 지향되는 친화성 분자를 제공하는 것이다.

전술한 목적은 다음에 명시되는 본 발명의 측면에 의해 해결될 수 있다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 감염을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 개체의 치료법(therapy)에 사용하기 위한 압타머가 제공되며, 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산서열(GGT TGG TGT GGT TGG)의 핵산서열 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산서열을 포함한다.

본 발명의 제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 개체는 포유동물이고, 바람직하게는 상기 개체는 인간일 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 감염은 베타코로나바이러스(Betacoronavirus) 속, 바람직하게는 사르베코바이러스(Sarbecovirus) 아속 또는 메르베코바이러스(Merbecovirus) 아속으로부터의 바이러스, 더욱 바람직하게는 MERS-CoV, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된 것일 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 감염은 사르베코바이러스(Sarbecovirus) 아속으로부터의 바이러스, 바람직하게는 중증 급성 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus) 종으로부터의 바이러스, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 중 하나에 의해 유발된 것일 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 감염은 SARS-CoV-2에 의해 유발된 것일 수 있다.

및/또는 압타머는 0.03mg/ml의 압타머 농도에서 인간 보정 혈장의 프로트롬빈 시간(빠른 값)을 40% 이하로 낮출

본 발명의 제1 측면의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 압타머는 항응고 활성을 갖고,

바람직하게는 상기 압타머는 인간 교정 혈장의 부분 트롬보플라스틴 시간으로 측정되는 응고 시간(PTT, 또는 대안적으로 aPTT)을 0.03 mg/ml의 압타머 농도에서 60초 이상으로 연장할 수 잇는 것; 및/또는 압타머는 0.03mg/ml의 압타머 농도에서 인간 교정 혈장의 프로트롬빈 시간(빠른 값)을 40% 이하로 낮출 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제1 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 압타머는 인간 트롬빈과 선택적으로 상호작용하거나 인간 트롬빈에 결합하며, 바람직하게는 인간 트롬빈에 대한 압타머의 결합에 관한 KD 값은 1μM 이하일 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 압타머는 바이러스의 스파이크(S) 당단백질(바람직하게는 바이러스의 스파이크(S) 당단백질의 수용체 결합 도메인(RBD))과 선택적으로 상호작용함으로써, 보다 바람직하게는 바이러스의 스파이크 당단백질과 대상 숙주 세포의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 또는 디펩티딜 펩티다제 4(DPP4)의 상호작용을 방지하거나 방해함으로써, 체세포의 감염을 방해할 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 이전 구현예의 더욱 바람직한 구현예에서, 스파이크 당단백질의 수용체 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2(SARS-CoV-2 스파이크 RBD) 또는 SEQ ID NO: 3(SARS-CoV 스파이크 RBD) 또는 SEQ ID NO: 4(MERS-CoV 스파이크 RBD)의 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 스파이크 당단백질의 수용체 결합 도메인은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 가지며, 보다 바람직하게는 서열번호 2의 서열을 갖는다.

본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 압타머는 전신 전달(systemic delivery) 또는 폐 전달(pulmonary delivery), 바람직하게는 폐 전달, 더욱 바람직하게는 흡입(inhalation)에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염을 극복한 환자의 장기 코로나와 관련된 질병 증상을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 개체의 치료법(therapy)에 사용하기 위한 압타머가 제공되며, 여기서 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산서열(GGT TGG TGT GGT TGG)의 핵산서열 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산서열을 포함한다.

제2 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 질병 증상은 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 자세 기립성 빈맥 증후군(postural orthostatic tachycardia syndrome; PoTS), 자율신경 장애(dysautonomia), 떨림(tremor), 주의력 결핍(attention deficit), 무형실어증(anomic aphasia), 신경병증(neuropathy), 횡단 척수염(transverse myelitis), 급성 괴사성 척수염(acute necrotising myelitis), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 등과 같은, 신경학적 증상;

심근 염증(myocardial inflammation), 부정맥(arrhythmia), 빈맥(tachycardia), 서맥(bradycardia), 고혈압 (hypertension), 방실(AV) 차단(atrioventricular block)과 같은, 심혈관 관련 증상;

탈모증(alopecia) 및 습진(eczema)과 같은, 피부과 증상; 또는

위장병(gastrointestinal diseases),

을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 압타머는 G-단백질 결합 수용체에 특이적인 자가항체와 그의 표적 단백질의 상호작용을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 제2 측면의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 압타머는 G-단백질 결합 수용체에 대한 자가항체가 검출될 수 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 제2 측면의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 환자는 G-단백질 결합 수용체에 대한 기능성 자가항체,

바람직하게는 인간 G-단백질 결합 수용체 아드레날린성 알파-1 수용체, 아드레날린성 베타-2 수용체, 엔도텔린 1 ETA 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체, MAS-수용체 및/또는 침해수용 수용체 중 어느 하나에 특이적인 기능성 자가항체,

보다 바람직하게는 아드레날린성 베타-2 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체, MAS-수용체 중 어느 하나에 특이적인 기능성 자가항체를 나타내고,

특히 바람직하게는 상기 환자는 아드레날린성 베타-2 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체 및 MAS-수용체 각각에 특이적인 기능성 자가항체를 포함하는 항체 패턴을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 제3 측면에 따르면, 압타머를 사용하여 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 체세포의 감염을 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 시험관내/생체외(in vitro/in vivo)에서 수행되고, 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산 서열(GGT TGG TGT GGT TGG) 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 제3 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이고, 바람직하게는 상기 세포는 인간 세포일 수 있다.

본 발명의 제4 측면에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 압타머 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 제4 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 제1 측면에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 전신 전달(systemic delivery) 또는 폐 전달(pulmonary delivery), 바람직하게는 폐 전달, 더욱 바람직하게는 흡입(inhalation)에 의해 대상체에게 투여하기 위한 것이다.

본 발명의 제5 측면에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 따라 사용하기 위한 하나 이상의 압타머 및 용기를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명의 제6 측면에 따르면, 체세포가 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의해 감염되는 것을 예방하기 위한 본 발명의 제1 측면에 정의된 압타머의 용도가 제공되며, 상기 압타머는 시험관내/생체외(in vitro/in vivo)에서 사용된다.

본 발명의 제7 측면에 따르면, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2의 RNA-의존성 RNA 중합효소의 아미노산 서열 Leu-Tyr-Arg-Asn-Arg-Asp-Val(LYRNRDV; 서열번호 9) 및/또는 His-Arg-Phe-Tyr-Arg-Leu-Ala-Asn(HRFYRLAN; 서열번호 10)의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 분자가 제공된다.

본 발명의 제7 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 친화성 분자는 최대 900 달톤의 분자량을 갖는 소분자이고, 보다 바람직하게는 상기 친화성 분자는 신시내티 대학(University of Cincinnati)의 화합물 컬렉션, ApexBio Technology LLC의 DiscoveryProbe™ 생체활성 화합물 라이브러리 플러스, Cayman Chemical의 SARS-CoV-2 스크리닝 라이브러리를 포함하는 그룹으로부터의 임의의 하나의 소분자 컬렉션에서의 소분자일 수 있다.

본 발명의 제7 측면의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 친화성 분자는 펩타이드 기반 화합물, 더욱 바람직하게는 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있다.

본 발명의 제7 측면의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 친화성 분자는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 제8 측면에서, 약제로 사용하기 위한 상기 제7 측면의 친화성 분자가 제공될 수 있다.

본 발명의 제9 측면에서, 상기 제7 측면의 친화성 분자는 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 의한 감염을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 개체의 치료법(therapy)에 사용하기 위해 제공될 수 있다.

도 1은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 4번 펩티드의 존재 하에서 BC 007의 사중체 형성에 대한 NMR 분석을 보여준다; 상부 스펙트럼: BC007과 서열 YRLFRK를 갖는 4번 펩티드4의 1:1 혼합물의 1H-NMR 스펙트럼; 중간부 스펙트럼: 순수한 물(pure water)에서의 서열번호 5의 4번 펩타이드의 스펙트럼; 하부 스펙트럼: KCl 존재 시 BC007의 4중 구조 스펙트럼을 각각 나타낸다.
도 2는 도 1과 동일한 스펙트럼을 보여주나, 8.5-6.0ppm 사이의 범위로 확대하여 나타낸 것이다. 중간부 및 하부: 순수한 기질은 다소 날카로운 신호를 나타내며, 두 물질의 상호 작용으로 인해 상위 스펙트럼에서 위치가 넓어지고 이동한다.
도 3은 VeroFM 및 Calu-3 세포에서 BC 007의 항바이러스 용량-반응 효과(antiviral dose-response effect)를 기반으로 세포 배양에서 BC 007에 의한 SARS-CoV-2 복제 억제를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 압타머 BC007(서열번호 1)의 고정화된 인간 트롬빈에 대한 결합에 관한 ELISA 시험 결과를 보여준다.
도 5는 각각 (A) 부분 트롬보플라스틴 시간(partial thromboplastin time; PTT) 및 (B) 프로트롬빈 시간(빠른) 값으로써 측정된, 압타머 BC007(서열번호 1) 및 AS1411(서열번호 7)에 의해 유발된 응고 억제를 측정한 결과를 보여준다.
도 6은 SARS-CoV-2의 RNA-의존성 RNA 중합효소(서열번호 8의 전장 서열)의 펩타이드 LYRNRDV(상단, 서열번호 9) 및 펩타이드 HRFYRLAN(하단; 서열번호 10) 존재 하에서 BC007의 사중체 형성에 대한 NMR 분석을 보여준다.
도 7은 SARS-CoV-2의 RNA 의존성 RNA 중합효소의 펩타이드 HRFYRLAN(서열번호 10)으로 적정된 BC007의 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry; ITC)분석을 보여준다. 상단: 열분석도(thermogram); 하단: 결합 등온선(binding isotherm).
도 8은 SARS-CoV-2의 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)에도 존재하는 상대적으로 높은 전하를 띤 펩타이드 제어 서열인 NRKRISN(서열 번호: 11)으로 적정된 BC007의 ITC 분석을 보여준다. 상단: 열분석도(thermogram); 하단: 결합 등온선(binding isotherm).
도 9는 대조 펩타이드 NRKRISN(서열번호 11)과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 4번 펩타이드(서열번호 5; YRLFRK) 존재 하에서 BC007의 NMR 분석 결과를 비교한 것이다.
도 10은 장기 코로나 증상과 환자 혈청의 동반 GPCR 자가항체에 대한 개요를 보여준다.
도 11은 Post-COVID 증상을 겪는 환자의 혈청에서 G-단백질 결합 수용체를 표적으로 하는 기능적으로 활성인 자가항체를 생물학적 검정으로 측정한 결과를 보여준다.
A: 베타2-아드레날린 수용체(beta2-R), 침해셉틴 수용체(nociceptin-R), 안지오텐신 II AT1 수용체(AT1) 및 알파1-아드레날린 수용체(alpha1-R)에 대한 양성 만성 친화성 자가항체; 이러한 측정은 음성 크로노트로픽 효과를 발휘하는 항체를 차단하는 길항제 아트로핀, A779 및 BQ123의 존재 하에 수행되었다. 압타머 BC 007과 사전 배양했을 때 기능적 활성이 사라졌다. 대조군은 건강한 기증자의 샘플이었다.
B: MAS-수용체(MAS-R), 무스카린성 M2-수용체(M2-R), 엔도텔린 수용체(ETA-R)에 대한 음성 연대성 자가항체; 여기서 양성 연대성 작용 자가항체의 활성은 ICI118.551, J113397, 로사르탄(losartan) 및 우라피딜(urapidil)에 의해 차단되었다. 압타머 BC 007과 사전 배양했을 때 기능적 활성이 사라졌다. 대조군은 건강한 기증자의 샘플이었다.
Neuro^* = 신경학적 증상; Cardiovasc^** = 심혈관 증상, n.a. = 해당 없음, PoTS = 자세 기립성 빈맥 증후군; NOC-_fAAB^§ = 노시셉틴 수용체에 대한 기능적 활성 자가항체, β2-_fAAB^$ = 베타1-아드레날린 수용체를 표적으로 하는 자가항체, α1-_fAAB^& = 알파1-아드레날린 수용체를 표적으로 하는 자가항체, ETA-_fAAB+ = 엔도텔린 수용체를 표적으로 하는 자가항체, M2-_fAAB^% = 무스카린 수용체를 표적으로 하는 자가항체, AT1-_fAAB^? = 안지오텐신 II AT1 수용체를 표적으로 하는 자가항체, MAS-_fAAB^# = MAS 수용체를 표적으로 하는 자가항체.

본 발명은 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스의 스파이크 단백질과 선택적으로 상호작용할 수 있어 이러한 바이러스에 의한 체세포 감염을 방해할 것으로 예상되는 신규 화합물의 식별에 기초한다. 더욱이, 본 발명자들은 특정 압타머 분자가 인간 세포에서 그러한 바이러스의 감염 활성 및 복제를 억제할 수 있다는 것을 성공적으로 확인하였다.

본 발명자들은 흔히 트롬빈 결합 압타머 또는 BC007이라고도 불리는 서열번호 1의 압타머와 여러 결합 파트너(트롬빈 등) 사이의 상호작용을 집중적으로 연구하였다. NMR 기술을 사용하여 BC007과 트롬빈 사이의 상호작용의 특이성을 조사하는 동안, BC007에 의한 NMR에서 검출 가능한 사중 구조의 채택을 통하여 입증된 바와 같이, BC007에 대한 강력한 결합에 전체 길이의 트롬빈 분자가 필요하지 않다는 사실을 확인하였다.

실제로, 결합 부분에서 수득한 훨씬 더 짧은 펩타이드 서열은 동일한 결과를 가져오는 것으로 인식되었다(데이터는 표시되지 않음). 실제로 BC007의 사중 접힘을 유발하는 전장 트롬빈에서 채취한 펩타이드는 양전하를 갖는 측쇄, 바람직하게는 아르기닌을 갖는 여러 아미노산을 함유하는 서열 모티프로 구성되거나 보유한다는 것이 분명해졌다. 이러한 펩타이드는 양전하로 인해 용매 쪽 표면을 나타낼 수 있으며, 트롬빈뿐만 아니라 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스의 스파이크 단백질과 같은 다른 단백질에서 청구된 압타머에 의해 선택적으로 결합될 수 있다.

놀랍게도, 발명자들은 다양한 코로나바이러스 균주의 스파이크 단백질, 특히 수용체 결합 도메인에 속하는 서열이 아르기닌이 풍부한 클러스터와 같이 양전하를 갖는 측쇄를 갖는 여러 아미노산을 포함하는 서열 모티프를 보유한다는 사실을 알게 되었다(상기 Hoffmann et al., 2020 참조).

특정 압타머와 트롬빈의 상호작용을 연구한 실질적인 경험과 함께 이 정보를 바탕으로, 본 발명자들은 SARS-CoV-2의 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 내에서 양전하를 띤 아미노산과 아르기닌이 풍부한 서열 섹션(예: 클러스터)의 대표적인 클러스터와 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소 내부의 표적 펩타이드를 성공적으로 식별했다.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 서브유닛의 수용체 결합 도메인의 일부인 4번 펩타이드(아미노산 서열 YRLFRK, 서열번호 5)는 BC007과의 결합 연구를 위한 대표적인 펩타이드로 선정되었다. 놀랍게도 실제로 BC007이 4중 접힘을 적응시키도록 유도하는 4번 펩티드와 BC007 사이에 강한 상호작용이 있다는 것이 관찰되었다(아래 실시예 섹션의 도 1 및 2 및 실시예 1 참조).

이러한 강력한 상호작용은 매우 그럴듯하며 전체 길이의 분자, 전체 스파이크 단백질 및 전체 바이러스 입자에서 지속될 가능성이 높으며, 여기서 스파이크 단백질은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스의 감염성과 병원성을 담당한다. 또한, 코로나바이러스과의 다른 바이러스 균주의 스파이크 단백질 내에 양전하를 띤 아미노산 클러스터의 존재에 기초하여, 본 발명이 다른 바이러스에 대해서도 유용할 가능성이 있다.

본 발명의 압타머와 SARS-CoV-2의 스파이크 서열 모티프의 강력한 상호작용에 대한 이러한 증거에서 출발하여, 발명자는 인간 세포를 감염시키는 SARS-CoV-2에 대한 본 발명의 압타머의 억제 활성에 대한 분석을 수행했다.

놀랍게도, 본 발명의 압타머는 SARS-CoV-2의 바이러스 활성을 매우 효율적으로 억제함을 입증했을 뿐만 아니라 실제로 현재 코로나 19에 대한 잠재적인 치료 옵션으로 논의되는 다른 항바이러스제를 능가하는 것으로 나타났다(실시예 2 참조)

이들 결과는 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스에 의한 감염을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는데 있어서, 본 발명의 압타머를 사용하는 치료 적용의 기초가 되는 치료 효과를 분명히 반영한다.

관찰된 효과 외에도, G-사중(G-quadruple) 올리고뉴클레오티드 구조는 HIV 감염에서 예시로, 항바이러스 효과를 유발하는 것으로 이전에 보고되었으며, 이는 숙주 세포(ISIS5320)로의 HIV 진입을 억제할 뿐만 아니라 HIV 인테그라제 자체(T30177 또는 AR177, 임상시험 최초의 인테그라제 억제제)도 억제한다(확인을 위해, Roxo, C., et al., 2019. G-Quadruplex-Forming Aptamers-Characteristics, Application, and Perspectives. Molecules 24. https://doi.org/10.3390/molecules24203781 참조).

HIV는 SARS-CoV-2 및 기타 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스와 마찬가지로 ssRNA 바이러스이므로 바이러스 복제 단계가 비슷하다. 따라서 결합 파트너와의 상호작용 시 G-사중체와 같은 접힘을 채택할 수 있는 청구된 압타머는 스파이크 단백질과의 직접적인 상호작용 외에도 SARS-CoV-2 인테그라제 또는 기타 취약한 부위를 억제할 수 있을 가능성이 매우 높다.

또한, COVID-19로 고통받는 환자의 사망에서 미세혈전증의 중요한 관련성을 나타내는 최근 데이터, 항혈전 및 항응고 효과가 있는 분자가 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스 감염과 관련하여 연구되고 있다. 현재 청구된 압타머 분자가 코로나바이러스과 계열의 바이러스 감염과 싸우고 동시에 항응고 효과를 나타내는 능력은 본 발명을 코로나19 및 기타 코로나바이러스과 계열에 속하는 바이러스 관련 질병에 대한 사용에 더욱 적합하게 만든다.

이는 압타머 AS1411(서열번호 7)과 같은 코로나19에 대한 치료제로 최근 제안된 다른 압타머에 비해 본 발명의 압타머의 특별한 이점이다. 이러한 비교용 압타머에는 항혈전 효과 또는 항응고 효과가 없으므로 본 발명의 이중 공격 방식이 결여되어 있다. AS1411은 원래 세포 표면에 있는 뉴클레올린이라는 단백질과 결합하는 합성 DNA 분자로 개발됐다. 이러한 활성을 바탕으로 이전에 암치료를 위한 실험약물로 연구된 바 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 서열번호 1의 핵산서열(GGT TGG TGT GGT TGG)의 핵산서열 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산서열을 포함하는,

코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염을 극복한 환자의 장기 코로나와 관련된 질병 증상을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 개체의 치료법(therapy)에 사용하기 위한 압타머가 제공된다.

본 발명 내에서, 바이러스에 의한 감염을 치료하는데 사용한다는 것은 개체의 첫 번째 감염이 본 발명에 따라 사용하기 위한 압타머에 의해 예방될 수 있음을 의미한다. 또한, 더 중요하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 압타머는 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 감염된 것으로 확인된 대상체의 감염을 치료, 치유 또는 감염의 추가 진행을 예방하는 데 사용되어야 한다.

위에서 논의된 바와 같이 Clausen et al., 2020의 새로운 발견과 관련하여, 서열번호 1의 압타머는 RBD의 헤파린 결합 모티브와 경쟁할 수도 있다는 것이 더욱 그럴듯하고 타당하다. 상기 압타머는 이미 잘 알려져 있고 트롬빈의 피브리노겐 결합 부위인 엑소사이트 1에 대한 결합 외에도 트롬빈의 헤파린 결합 모티브(엑소사이트 2; 참조: Padmanabhan 및 Tulinsky, 1996 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 52:272-282)와 선택적으로 상호작용하는 것으로 보고되었다. 이러한 헤파린 결합 부위에서 음으로 하전된 아미노산의 증가된 존재로 인해, 트롬빈의 헤파린 결합 모티브에 대한 공지된 결합과 유사하게 SARS-CoV-2 RBD의 헤파린 결합 부위에 대한 서열번호 1의 결합이 타당할 것으로 생각된다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 압타머는 대상 숙주 세포의 세포성 헤파란 설페이트와 선택적으로 상호작용함으로써 체세포의 감염을 추가로 방해할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이러스 감염을 치료, 치유 또는 추가 진행을 예방해야 하는 상기 개체는 척추동물이고, 더욱 바람직하게는 상기 개체는 포유동물이다. 본 발명의 의미 내에서, 상기 포유동물 군에는 쥐, 생쥐, 흰족제비, 토끼, 고양이, 개, 말, 소(cattle), 젖소(cow), 돼지, 양, 인간이 아닌 영장류 및 인간이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 가장 바람직하게는 대상은 인간이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 명세서에 개시되고 기술된 본 발명의 압타머는 서열번호 1(GGT TGG TGT GGT TGG)의 핵산 서열 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산 서열(GGT TGG TGT GGT TGG)을 포함하고, 특히 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산 서열(GGT TGG TGT GGT TGG)로 구성된다.

두 서열 사이 동일성의 백분율 결정은 Karlin 및 Altschul의 수학적 알고리즘을 사용하여 본 발명에 따라 수행된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873-5877). 이러한 알고리즘은 Altschul et al.의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램의 기초이다(J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-410). BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램으로 수행된다. 비교 목적으로 간격 정렬을 얻기 위해 Altschul et al.에 의해 설명된 대로 Gapped BLAST가 활용된다(Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402). BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 활용하는 경우 해당 프로그램의 기본 매개변수가 사용된다.

본 발명의 보다 바람직한 실시형태에 따르면, 압타머 서열은 본 명세서에 개시된 개별화된 압타머 서열과 적어도 85%의 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%의 동일성, 특히 바람직하게는 적어도 95%의 동일성의 핵산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명의 목적에 있어서, "압타머"라는 용어는 표적 분자에 특이적으로 그리고 높은 친화도로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 정의된 조건에서 압타머는 특정 3차원 구조로 접힐 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 청구된 압타머는 표적 서열과 특이적으로 그리고 높은 친화도로 상호작용한다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 압타머는 코로나바이러스과 계열 바이러스의 스파이크 당단백질 내의 서열, 바람직하게는 S1 서브유닛 내의 서열, 보다 바람직하게는 그의 수용체 결합 도메인 내의 서열과 상호작용한다. 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 압타머는 7개 아미노산 범위 내에서 2개 이상의 양전하를 띤 아미노산, 더욱 바람직하게는 아르기닌을 갖는 바이러스 서열 내의 영역에 결합한다.

본 발명의 압타머는 핵산 분자의 서열, 즉 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 압타머는 본 명세서에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

본 발명의 압타머는 바람직하게는 변형되지 않은 및/또는 변형된 D- 및/또는 L-뉴클레오티드를 포함한다. 핵산 염기의 일반적인 한 문자 코드에 따르면 "C"는 시토신을 나타내고, "A"는 아데닌을 나타내며,"G"는 구아닌을 나타내고, "T"는 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열인 경우 티민을 나타내며, "T"는 뉴클레오티드 서열이 RNA 서열인 경우 우라실 뉴클레오티드를 나타낸다. 아래에서 반대로 표시되지 않는 경우, "뉴클레오티드"라는 용어는 리보뉴클레오티드 및 디옥시리보뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 압타머는 DNA- 또는 RNA-뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있고, 따라서 각각 DNA-압타머 또는 RNA-압타머로 지칭될 수 있다. 본 발명의 압타머가 RNA-뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 본 발명 전체에 걸쳐 명시된 서열 모티프 내에서 "T"는 우라실을 나타내는 것으로 이해된다.

본 발명 전반에 걸쳐 간결함을 위해 명시적인 DNA-뉴클레오티드 서열만을 언급한다. 그러나, 각각의 RNA-뉴클레오티드 서열도 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다.

한 실시양태에 따르면, DNA-압타머를 사용하는 것이 바람직하다. DNA-압타머는 일반적으로 RNA-압타머보다 혈장에서 더 안정적이다. 그러나 대안적인 구현예에 따르면, RNA-압타머가 바람직하다. 또 다른 구현예에 따르면, 단일 가닥 뉴클레오티드 서열이 바람직하다. 또 다른 대안적 구현예에 따르면, 이중 가닥 뉴클레오티드 서열이 바람직하다.

본 발명의 압타머는 2'-변형된 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 2'-플루오로-, 2'-메톡시-, 2'-메톡시에틸- 및/또는 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드. 본 발명의 압타머는 또한 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다.

용어 "2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드", "2'-메톡시-변형된 뉴클레오티드", "2'-메톡시에틸-변형된 뉴클레오티드" 및/또는 "2-아미노-변형된 뉴클레오티드"는 각각 변형된 리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 압타머는 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어, 알킬화, 즉 적어도 하나의 뉴클레오티드의 메틸화, 아릴화 또는 아세틸화, 거울상 이성질체의 포함 및/또는 하나 이상의 다른 뉴클레오티드 또는 핵산 서열과 압타머의 융합이 포함된다. 그러한 변형은 예를 들어 5'- 및/또는 3'-PEG- 또는 5'- 및/또는 3'-CAP 변형을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 압타머는 바람직하게는 잠긴 핵산(locked-nucleic acids; LNA), 2'-플루오로-, 2'-메톡시- 및/또는 2'-아미노- 변형된 뉴클레오티드로부터 선택되는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

잠긴 핵산(LNA)은 입체구조가 고정된 각 RNA 뉴클레오티드의 유사체를 나타낸다. 잠긴 핵산의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바이사이클릭 리보뉴클레오시드를 포함하며, 여기서 2'-OH 기는 메틸렌 기를 통해 C₄ 탄소 원자와 연결된다. 잠긴 핵산은 각각의 변형되지 않은 RNA-압타머 대응물에 비해 뉴클레아제에 비해 향상된 안정성을 나타낸다. 또한 혼성화 특성이 향상되어 압타머의 친화력과 특이성이 향상된다.

또 다른 바람직한 변형은 소위 3'-CAP-, 5'-CAP-구조 및/또는 변형된 구아노신 뉴클레오티드(예: 7-메틸-구아노신)를 압타머의 3' 및/또는 5'-말단에 추가하는 것이다. 3'- 및/또는 5'-말단의 이러한 변형은 압타머가 뉴클레아제에 의한 빠른 분해로부터 보호되는 효과를 갖는다.

대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 압타머는 페길화된 3' 또는 5'-말단을 나타낼 수 있다. 3'- 또는 5'-PEG 변형은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위의 첨가를 포함하며, 바람직하게는 PEG 기는 1 내지 900개의 에틸렌 기를 포함하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 450개의 에틸렌 기를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 압타머는 HO-(CH₂CH₂O)_n-H를 갖는 선형 PEG 단위를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 900의 정수이고, 바람직하게는 n은 1 내지 450의 정수이다.

본 발명의 압타머는 전체적으로 또는 부분적으로 펩타이드 핵산(PNA)으로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 압타머는 Keefe AD et al., Nat Rev Drug Discov. 2010 Jul;9(7):537-50 or in Mayer G, Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(15):2672-89 or in Mayer, G. and Famulok M., Pharmazie in unserer Zeit 2007; 36: 432-436에 기술된 내용에 따라서 추가로 변형될 수 있다.

"올리고뉴클레오티드"라는 용어는 일반적으로 다수의 연결된 뉴클레오시드 단위를 포함하는 폴리뉴클레오시드를 지칭한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 비롯한 기존 핵산 공급원으로부터 얻을 수 있지만, 합성법에 의해 생산되는 것이 바람직한다. 바람직한 구현예에서 각각의 뉴클레오시드 단위는 변형된 뉴클레오시드 염기 및/또는 변형된 당 단위를 포함하지만 이에 제한되지 않는 야생형 올리고뉴클레오티드와 비교하여 다양한 화학적 변형 및 치환을 포함할 수 있다.

화학적 변형의 예는 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Uhlmann, E. et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; and Hunziker, J. et al. (1995) Mod. Syn. Methods 7:331-417; and Crooke, S. et al. (1996) Ann. Rev. Pharm. Tox. 36:107-129 등이 본 발명에 참조로 도입된다.

뉴클레오시드 잔기는 특히 효소(예를 들어, 뉴클레아제) 분해에 대한 올리고뉴클레오티드의 안정성을 향상시키기 위해 수많은 공지된 뉴클레오시드간 연결 중 임의의 것에 의해 서로 커플링될 수 있다. 이러한 뉴클레오시드간 결합에는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포로티오에이트 및 술폰 뉴클레오티드간 결합이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체특이적 뉴클레오시드간 연결(예를 들어, (Rr)- 또는 (Sr)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 연결)을 갖는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "디뉴클레오티드"는 연결이 포스페이트 그룹을 포함하는지 여부에 관계없이 임의의 이러한 뉴클레오시드간 연결을 갖는 폴리뉴클레오시드 및 디뉴클레오시드를 포함하도록 명백히 의도된다. 특정 바람직한 구현예에서, 이들 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결 또는 이들의 조합일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다.

또한, 압타머는 구조적 완전성을 보호하고 세포 내부로의 전달을 촉진하기 위해 적합한 비히클에 캡슐화될 수 있다. 바람직한 비히클에는 리포솜, 지질 소포, 미세입자 등이 포함된다.

위에서 언급한 방식 중 하나로 본 발명의 압타머를 변형하는 것의 한 가지 이점은 압타머가 유해한 영향(예를 들어, 압타머가 사용되는 환경에 존재하는 뉴클레아제)에 대해 안정화될 수 있다는 것이다. 상기 변형은 압타머의 약리학적 특성을 조정하는데도 적합하다. 상기 변형은 바람직하게는 압타머의 친화성 또는 특이성을 변경하지 않는다.

본 발명의 압타머는 또한 캐리어 분자 및/또는 리포터 분자에 접합될 수 있다. 담체 분자는 압타머에 접합될 때 인간 혈장에서 접합된 압타머의 혈장 반감기를 연장시키는(예를 들어 안정성을 강화하거나 배설 속도에 영향을 미치는) 분자를 포함한다. 적합한 담체 분자의 한 예는 PEG이다.

리포터 분자는 접합된 압타머의 검출을 가능하게 하는 분자를 포함한다. 이러한 리포터 분자의 예로는 GFP, 비오틴, 콜레스테롤, 염료(예를 들어 형광염료), 전기화학적 활성 리포터 분자 및/또는 방사성 잔류물을 포함하는 화합물, 특히 PET(양전자 방출 단층 촬영) 검출에 적합한 방사성 핵종(예를 들어, ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁸²Rb 또는 ⁶⁸Ga)이 있다. 통상의 기술자는 적합한 담체 및 리포터 분자와 이들을 본 발명의 압타머에 접합시키는 방법을 잘 알고 있다.

본 발명의 첫 번째 측면의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 압타머는 항응고 활성을 갖는다. 항응고 활성은 바람직하게는 항혈전 활성을 의미할 수 있으며, 바람직하게는 미세혈전증을 예방하거나 감소시키는 것으로 이해된다.

보다 바람직하게는 본 발명의 압타머는 인간 보정 혈장의 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT 또는 대안적으로 aPTT)으로 측정된 응고 시간을 0.03 mg/ml의 압타머 농도에서 60초 이상으로 연장할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 압타머는 압타머 농도 0.03 mg/ml에서 인간 교정 혈장의 부분 트롬보플라스틴 시간으로 측정되는 응고 시간을 40초 이상, 더욱 바람직하게는 50초 이상 연장시킬 수 있다. 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 압타머는 압타머 AS1411(서열번호 7)보다 인간 교정 혈장의 부분 트롬보플라스틴 시간을 더 연장시킨다.

또한 더욱 바람직하게는 압타머는 압타머 농도 0.03mg/ml에서 인간 검량 혈장의 프로트롬빈 시간(Quick value)을 40% 이하로 낮출 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 압타머는 압타머 농도 0.03mg/ml에서 인간 교정 혈장의 프로트롬빈 시간(Quick value)을 80% 이하, 보다 바람직하게는 70% 이하, 더욱 바람직하게는 60% 이하, 특히 바람직하게는 50% 이하 로 낮출 수 있다. 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 압타머는 인간 교정 혈장의 프로트롬빈 시간(Quick value)을 압타머 AS1411(서열번호 7)보다 더 낮춘다.

하나의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 PTT 시간은 아래 실시예 섹션에 설명된 테스트를 사용하여 평가된다. 대안적으로 바람직하게는, PTT 시간 및/또는 빠른 값(Quick value)은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 평가된다. 교정 혈장으로는 건강한 개인의 임의의 인간 참조 혈장이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 HemosIL 인간 교정 혈장(Instrumentation Laboratory, Werfen)을 사용한다.

본 발명의 첫 번째 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 압타머는 인간 트롬빈과 선택적으로 상호작용하거나 인간 트롬빈에 결합하며, 바람직하게는 인간 트롬빈에 대한 압타머의 결합에 대한 KD 값은 1μM 이하, 더욱 바람직하게는 상기 KD 값은 100nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 상기 KD 값은 10nM 이하이다. 상기 KD 값은 바람직하게는 도트 블롯 결합 검정에서 일련의 인간 트롬빈 희석(1pM 내지 1000nM 범위)을 사용하고 1:1 NA:단백질 복합체를 설명하는 다음의 방정식을 결과 데이터에 맞추는 방식으로 결정될 수 있다:

(분획 압타머 경계 = 진폭*([트롬빈]/(KD+[트롬빈]))

(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA).

본 발명 내에서, 두 분자 사이의 선택적 결합 또는 상호작용 또는 특이적 결합 또는 상호작용은 바람직하게는 인용된 두 분자가 결합 파트너로서 관련되지 않거나 상호작용하지 않거나 결합하지 않는 분자에 비해 그 친밀도가 10배 이상, 보다 바람직하게는 50배 이상, 특히 바람직하게는 적어도 100배 이상 증가된 친화력으로 결합하거나 상호작용한다는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 압타머는 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 균주에 의한 감염 치료에 유용하다. 본 발명의 맥락에서, 상기 압타머는 인간 대상뿐만 아니라 동물 대상에게도 유용한 것으로 간주된다. 한 실시양태에 따르면, 상기 압타머는 인간 대상체에 사용하기 위한 것이다. 다른 구현예에 따르면, 상기 압타머는 동물 대상체에 사용하기 위한 것이다.

코로나바이러스 감염을 억제함으로써 코로나바이러스 감염의 잠재적인 부정적인 영향이 중화되고 감소되며 모든 질병 증상이 사라지거나 정상 수준으로 감소될 수 있다. 결과적으로, 코로나바이러스 감염으로 인해 발생하거나 이와 관련된 질병의 정도와 심각성이 크게 줄어들 수 있다. 따라서, 본 발명은 코로나바이러스 감염과 관련된 질병 또는 증상의 치료에 사용하기에 적합한 압타머를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 압타머를 이용하여 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열 바이러스에 의한 체세포 감염을 예방하는 방법이 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 감염을 예방하는 방법은 대상체에서 코로나바이러스과 계열의 바이러스에 의한 감염의 치료, 치유 또는 진행 예방을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내/생체외(in vitro/in vivo)에서 수행 될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 압타머와 접촉되는 세포는 전체 살아있는 유기체의 일부를 형성하지 않는다. 한 실시양태에서, 상기 접촉되는 세포는 세포 배양물에서 배양될 수 있다. 이러한 개별 세포 또는 세포 그룹의 배양은 당업계에서 일반적으로 수행되는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 생체내 및/또는 살아있는 전체 유기체의 일부를 형성하는 세포에서 수행될 수 있다. 이 실시예에 따르면, 접촉되는 세포, 조직 또는 기관은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스에 감염된 것으로 이전에 진단된 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 치료될 세포는 위장관 또는 호흡기관에 속하며, 더욱 바람직하게는 호흡기관에 속하고, 더욱 바람직하게는 폐 세포가 치료될 수 있다.

본 발명은 또한 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염을 극복한 환자의 장기 코로나와 관련된 질병 증상을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 개체의 치료법(therapy)에 사용하기 위한 압타머에 관한 것이다. 여기서, 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산서열(GGT TGG TGT GGT TGG)의 핵산서열 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산서열을 포함한다.

장기간의 코로나는 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염을 극복한 환자에게서 관찰된 상태 또는 복합적인 증상이다. 이와 관련된 복합적인 증상은 아직 조사 중이지만, 활동성 감염의 증상이 사라진 후에도 증상이 지속된다는 것이 점점 더 분명해지고 있다.

본원에 포함된 실험 데이터에 따르면, 활성 SARS-CoV-2 감염을 겪은 환자에서 관찰된 증상 중 상당수가 기능성 자가항체의 존재와 관련이 있다는 것이 분명하다(도 10). 본 발명의 압타머가 이러한 기능성 자가항체에 대해 억제 활성을 갖는다는 것이 이전에 입증되었기 때문에(본원의 도 11에서도 입증됨), 본 발명의 압타머는 장기 코로나(Long COVID)와 같은 증상에 대해 함께 그룹화되어 활성을 갖는 것으로 추정될 수 있다.

어느 경우이던지, 여기에 장기 코로나로 요약된 증상은 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염의 후기 효과(late effects) 또는 지연 효과(delayed effects)로 간주된다. 이와 관련하여, 장기 코로나에 대한 본 발명의 압타머의 특별한 효과는 본원에 기술되고 청구된 바와 같이 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스과의 바이러스에 의한 감염을 치료하는 일부로 볼 수 있다.

일 구현예에서, 상기 질병 증상은 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 자세 기립성 빈맥 증후군(postural orthostatic tachycardia syndrome; PoTS), 자율신경 장애(dysautonomia), 떨림(tremor), 주의력 결핍(attention deficit), 무형실어증(anomic aphasia), 신경병증(neuropathy), 횡단 척수염(transverse myelitis), 급성 괴사성 척수염(acute necrotising myelitis), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 등과 같은, 신경학적 증상;

탈모증(alopecia) 및 습진(eczema)과 같은, 피부과 증상; 또는

위장병(gastrointestinal diseases), 을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다.

바람직하게는, 상기 압타머는 G-단백질 결합 수용체에 특이적인 자가항체와 그의 표적 단백질의 상호작용을 억제하는데 사용될 수 있다. 또한 바람직하게는, 상기 압타머는 G-단백질 결합 수용체에 대한 자가항체가 검출될 수 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 상기 치료될 환자는 G-단백질 결합 수용체에 대한 기능성 자가항체,

바람직하게는, 인간 G-단백질 결합 수용체 아드레날린성 알파-1 수용체, 아드레날린성 베타-2 수용체, 엔도텔린 1 ETA 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체, MAS-수용체 및/또는 침해수용 수용체 중 어느 하나에 특이적인 기능성 자가항체,

보다 바람직하게는, 아드레날린성 베타-2 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체, MAS-수용체 중 어느 하나에 특이적인 기능성 자가항체를 나타내고,

특히 바람직하게는, 상기 환자는 아드레날린성 베타-2 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체 및 MAS-수용체 각각에 특이적인 기능성 자가항체를 포함하는 항체 패턴을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 압타머 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 압타머 또는 본 발명의 서로 다른 압타머의 혼합물 및 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 부형제(예를 들어, 적합한 담체 또는 희석제)를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 압타머는 약제학적 조성물의 활성 성분을 구성하고/하거나 유효량으로 존재한다. "유효량"이라는 용어는 질병 또는 병리학적 상태에 대한 예방적, 진단적 또는 치료학적 관련 효과를 갖는 본 발명의 압타머의 양을 의미한다. 예방 효과는 질병의 발병을 예방하는 것을 말한다. 치료 관련 효과는 질병의 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화하거나 질병 또는 병리학적 상태와 연관되거나 원인이 되는 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 매개변수를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 되돌리는 것을 말한다.

본 발명의 압타머를 투여하기 위한 각각의 양은 원하는 예방, 진단 또는 치료 효과를 달성하기에 충분히 높은 양일 수 있다. 임의의 포유동물에 대한 특정 투여량 수준, 투여 빈도 및 기간은 사용되는 특정 성분의 활성, 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간을 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 것이라는 것은 통상의 기술자라면 이해할 수 있을 것이다. 통상의 기술자는 잘 알려진 수단과 방법을 사용하여, 일상적인 실험을 통해 정확한 양을 결정할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물의 한 실시양태에 따르면, 총 압타머 함량의 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 본 발명의 압타머로 구성된다.

치료에 사용되는 경우, 약제학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 임의로 조합된 제형으로 투여될 것이다. 용어 "부형제"는 본 발명의 압타머 이외의 임의의 성분을 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식에 따라 크게 좌우된다. 상기 부형제는 적합한 담체 및/또는 희석제일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 경구 또는 정맥내로 투여될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 흡입에 의해 투여될 수 있다. 대안적인 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 정맥내로 투여될 수 있다.

바람직한 실시양태에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 전신 전달 또는 폐 전달, 바람직하게는 폐 전달, 더욱 바람직하게는 흡입에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 흡입 투여되는 약제학적 조성물은 바람직하게는 분말 또는 스프레이 형태일 수 있다.

인간 환자에게 투여하기 위해, 본 발명의 압타머 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물의 총 1일 용량은 물론 투여 방식에 따라 일반적으로 0.001 mg 내지 8000 mg 범위이다. 예를 들어, 정맥 내 일일 복용량은 0.001mg에서 40mg까지만 필요할 수 있다. 총 일일 복용량은 단일 또는 분할 복용량으로 투여될 수 있으며 의사의 재량에 따라 여기에 제공된 일반적인 범위를 벗어날 수 있다.

이러한 투여량은 체중이 약 75kg 내지 80kg인 평균 인간 대상을 기준으로 한다. 의사는 유아나 노인과 같이 체중이 이 범위를 벗어나는 피험자의 복용량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 맥락에서, 상기 압타머는 바람직하게는 하나 이상의 백신, 항원, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TLR 길항제, 펩티드, 단백질, 유전자 치료 벡터, DNA 백신, 보조제, 키나제 억제제, T-세포 치료제 또는 황산화 폴리글리세롤 또는 유사한 황산화 중합체와 조합하여 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 압타머, 용기 및 임의로 기록된 사용 설명서 및/또는 투여 수단을 함유하는 키트를 포함한다.

코로나바이러스 감염으로 인해 발생하거나 이와 관련된 질병을 치료하기 위해, 투여 경로에 관계없이, 본 발명의 압타머는 150 mg/kg 체중 이하, 바람직하게는 20 mg/kg 체중 이하, 더욱 바람직하게는 10mg/kg 체중 이하, 보다 더 바람직하게는 1μg/kg 내지 20mg/kg 체중 범위에서 선택되고, 가장 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg 체중 범위에서 선택되는 체중의 치료 주기당 전체 1일 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 압타머는 하루에 걸쳐, 바람직하게는 1일 2 내지 6회, 예를 들어 1일 4회에 걸쳐 다중 개별 투여 단계로 투여될 수 있다. 상기 압타머는 하루에 각각 1900mg씩 4회 투여될 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스로 체세포가 감염되는 것을 예방하기 위한 본원에 정의된 압타머의 용도가 제공된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 압타머는 시험관내/생체외에서 사용될 수 있다. 대안적인 바람직한 실시예에서, 상기 압타머는 생체 내에서 사용될 수 있다.

본 발명의 압타머의 제조 또는 대량 생산은 당업계에 잘 알려져 있고 단순한 일상적인 활동에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2의 RNA-의존성 RNA 중합효소(서열번호 8)의 아미노산 서열 Leu-Tyr-Arg-Asn-Arg-Asp-Val(LYRNRDV; 서열번호 9) 및/또는 His-Arg-Phe-Tyr-Arg-Leu-Ala-Asn(HRFYRLAN; 서열번호 10)의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 친화성 분자가 제공된다.

본 발명 내에서, 상기 친화성 분자는 주어진 표적(예를 들어 서열번호 9 또는 서열번호 10의 펩타이드)에 대해 높은 친화성을 갖는 임의의 분자일 수 있다. 높은 친화력으로 결합한다는 것은 바람직하게는 관련되지 않은 에피토프, 단백질 또는 단백질 영역에 비해 10배 이상, 바람직하게는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상 증가된 친화도로 상기 표적 에피토프에 결합하는 것을 의미한다.

본 발명자들이 수행한 추가 연구에서, 청구된 압타머는 SARS-CoV-2의 RNA-의존성 RNA 중합효소의 이전에 알려지지 않은 두 개의 별개의 에피토프와 특이적으로 상호작용하고 결합한다는 사실이 발견되었다. 등온 적정 열량측정뿐만 아니라 NMR 연구를 통해, 본 발명의 압타머와 RNA-의존성 RNA 중합효소의 상기 에피토프 사이의 선택적 상호작용이 결정적으로 나타났다(도 6 및 7 참조). 특이적 결합이 관찰된 이 효소의 정의된 펩타이드 스트레치는 아미노산 731~737(LYRNRDV; 서열번호 9) 및 아미노산 650~657(HRFYRLAN; 서열번호 10)이다.

코로나바이러스과 계열의 다른 구성원인 SARS-CoV의 RNA-의존성 RNA 중합효소 서열에서도 동등한 표적 서열이 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). RNA-의존성 RNA 중합효소의 서열은 코로나바이러스과 계열 내에서 매우 높은 아미노산 서열 동일성을 공유하지만, 다른 바이러스성 RNA-의존성 RNA 중합효소 및 역전사효소와는 매우 낮은 서열 유사성을 갖는다는 것이 선행 기술로부터 공지되어 있다(예를 들어, Xu X, et al., (2003) SARS 코로나바이러스 중합효소의 분자 모델: 생화학적 기능 및 약물 설계에 대한 함의. Nucleic Acids Res 31:7117-7130, 페이지 7118, 오른쪽 열, 첫 번째 전체 단락, 두번째 문장 참조). 따라서, 코로나바이러스과 계열의 다른 바이러스의 RNA 의존성 RNA 중합 효소에도 동등한 표적 서열이 존재한다고 가정하는 것은 합리적이다.

NMR 연구에서 관찰된 이러한 강력한 상호작용은 이 경우에도 매우 그럴듯하며 코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 활성 바이러스뿐만 아니라 전체 길이의 분자에서도 지속될 가능성이 높다. 실제로 스파이크 단백질과 바이러스 RNA 의존성 RNA 폴리머라제에 대한 청구된 압타머의 추가 활성은 알려진 약물과 비교하여 세포 배양 분석에서 관찰된 우수한 결과를 설명할 수 있다.

렘데시비르(Remdesivir) 및 갈리데시비르(Galidesivir)와 같은 Coronaviridae에 대해 활성인 항바이러스제가 RNA-의존성 RNA 중합효소 내의 서열과 상호 작용할 수 있다는 것이 이전에 보고되었지만(예를 들어, Wang Y, Anirudhan V, Du R, Cui Q, and Rong L (2020) RNA-dependent RNA polymerase of SARS-CoV-2 as a therapeutic target. J Med Virol, doi: 10.1002/jmv.26264. for studies with Galidesivir and the identification of amino acids Thr455, Arg553, Lys621, Arg624, Asp452, Ala554, Asp623, Asn691, Ser759, Asp760 as target amino acids, and Wu C, Liu Y, Yang Y, Zhang P, Zhong W, Wang Y, Wang Q, Xu Y, Li M, Li X, Zheng M, Chen L, and Li H (2020) Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods. Acta Pharm Sin B, doi: 10.1016/j.apsb.2020.02.008. for studies with Remdesivir and the identification of amino acids Asn 497, Arg 569, Asp 684, Leu 576, Ala 685, Tyr 687 as target amino acids), 보고된 서열은 본 발명자들에 의해 확인된 펩타이드 스트레치와 구별되며 관련이 없다.

표적 효소인 RNA-의존성 RNA 중합효소는 코로나바이러스과 계열 바이러스의 바이러스 복제 기계의 핵심 구성 요소입다. 이러한 효소의 특이적 결합이 코로나바이러스과의 RNA 바이러스의 바이러스 RNA의 정확하고 효율적인 복제를 적어도 방해하거나, 손상시키거나 심지어 억제할 것이라는 점은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 방식으로, 숙주의 바이러스 수명주기에 영향을 미치므로 바이러스의 감염성은 감소할 것이다.

상기 핵심(key) 효소의 새로운 에피토프의 확인은 기술 분야에 상당한 기여를 한다. 왜냐하면, 바이러스 복제를 방해하거나 억제하는 추가 결합 파트너의 생성 및 확인을 가능하게 하기 때문이다. 또한, 새로 확인된 에피토프는 이전에 친화성 분자에 대한 적합한 결합 부위로 알려진 주요 효소의 임의의 에피토프와 구별되므로, 이에 결합하는 임의의 친화성 분자는 적어도 RNA-의존성 RNA 중합효소에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 분자에 의해 제공되는 억제 작용을 보충하는 역할을 할 것이다.

새로 확인된 에피토프가 효소 외부를 향해 위치하여 용매를 향하고 특정 상호작용 또는 결합을 위해 쉽게 접근할 수 있다는 것도 추가로 인식되고 입증되었다(데이터는 표시되지 않음). 또한 압타머 결합제는 대부분의 경우 표적 단백질의 기능을 방해할 수 있으며 생체 내에서 이러한 목적으로 의도적으로 발현되기도 한다는 점 역시 중요한 사실이다(Ulrich H (2005) DNA and RNA aptamers as modulators of protein function. Medicinal Chemistry (Shariqah (United Arab Emirates)) 1:199-208.).

놀랍게도, 본 발명의 압타머는 SARS-CoV-2의 바이러스 활성을 매우 효율적으로 억제함을 입증했을 뿐만 아니라 실제로 현재 코로나19에 대한 잠재적인 치료 옵션으로 논의되는 다른 항바이러스제를 능가하는 것으로 나타났다(실시예 2 참조). 이는 바이러스 감염 과정과 호스트에서의 복제에 대한 이중적인 효력 때문일 수 있다.

바이러스의 복제 주기에 결정적인 이 핵심 효소의 새로운 에피토프를 제공함으로써, 통상의 기술자는 당업계에 일반적으로 공지된 표준 절차를 사용하여 새로 확인된 에피토프에 친화성을 갖는 추가적인 소분자, 항체 또는 항체 유래 생물학적 제제, 또는 올리고뉴클레오티드/압타머를 확인, 생산(raise) 또는 생성(generate)할 수 있을 것이다.

본 발명의 제6 측면의 바람직한 실시양태에서, 상기 친화성 분자는 최대 900 달톤의 분자량을 갖는 소분자일 수 있다. 바람직하게는 상기 친화성 분자는 University of Cincinnati 화합물 컬렉션, ApexBio Technology LLC의 DiscoveryProbe™ Bioactive 화합물 라이브러리 플러스, Cayman Chemical의 SARS-CoV-2 스크리닝 라이브러리로 구성된 그룹의 임의의 하나의 소분자 컬렉션에서 나온 소분자일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 친화성 분자는 ZINC 15 데이터베이스에 존재하는 소분자일 수 있다(Sterling T 및 Irwin JJ, Journal of Chemical Information and Modeling 2015 55 (11), 2324-2337; DOI: 10.1021/acs.jcim.5b00559).

대안적으로 바람직하게는, 친화성 분자는 Kowalewski J 및 Ray A(2020)의 개시(Heliyon. 6. e04639. 10.1016/j.heliyon.2020.e04639.)에 따라 적어도 하나의 바이러스 표적, 보다 바람직하게는 적어도 2개의 바이러스 표적에 대해 잠재적인 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

COVID-19 억제와 관련하여 이전 논문에서는 이미 기존 약물 또는 소분자 라이브러리를 스크리닝하고 SARS-CoV-2 감염 또는 복제에 중요한 단백질과의 가능한 상호 작용/결합을 확인했으며, 특히 그러한 상호작용을 식별할 수 있는 적절한 in silico 방법(컴퓨터 프로그램)을 활용했다.

이러한 스크린에서 기존 약물은 SARS-CoV-2의 알려진 단백질 구조에 대한 잠재적 결합을 검사하여 알려진 바이러스 억제제 외에, SARS-CoV-2의 가능한 3CLpro-프로테아제 차단제로써, 항궤양제인 파모티딘(Wu C, Liu Y, Yang Y, Zhang P, Zhong W, Wang Y, Wang Q, Xu Y, Li M, Li X, Zheng M, Chen L, and Li H (2020) Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods. Acta Pharm Sin B, doi: 10.1016/j.apsb.2020.02.008.)과 RNA 의존성 RNA 중합효소의 가능한 차단제인 여러 항생제(Pokhrel R, Chapagain P, and Siltberg-Liberles J (2020) Potential RNA-dependent RNA polymerase inhibitors as prospective therapeutics against SARS-CoV-2. J Med Microbiol, doi: 10.1099/jmm.0.001203.) 및 RNA 의존성 RNA 중합효소의 차단제인 다른 소분자(Aftab SO, Ghouri MZ, Masood MU, Haider Z, Khan Z, Ahmad A, and Munawar N (2020) Analysis of SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase as a potential therapeutic drug target using a computational approach. Journal of Translational Medicine 18:275.)를 식별했다.

동일한 맥락에서, 통상의 기술자는 벌크 라이브러리로서 또는 특정 친화도, 특징 또는 요구 사항에 따라 하위 그룹화된 소분자의 임의의 이용 가능한 컬렉션 또는 라이브러리를 취하고 새로 식별된 서열번호 9 또는 10의 임의의 펩타이드 에피토프를 표적으로 하여 고처리량 분석을 실행할 수 있다. 그렇게 함으로써, 새로운 에피토프에 대한 특이적 결합을 나타내는 신규 소분자는 과도한 부담 없이 당업계에 일반적으로 공지된 표준 절차를 사용하여 식별될 수 있다.

바람직하게 사용될 수 있는 예시적인 소분자 컬렉션으로는, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 ChemBridge Corporation의 ChemBridge DIVERSet-CL 및 -EXP 컬렉션; 벨기에 겔 소재 Thermo Fisher Scientific의 Maybridge Screening 컬렉션; 미국 미시건주 앤아버 소재 Cayman Chemical의 항바이러스 스크리닝 라이브러리(공급업체/품목 번호 30390-50) 또는 SARS-CoV-2 스크리닝 라이브러리(공급업체/품목 번호 9003509); 또는 University of Cincinnati 화합물 컬렉션의 다양성 세트, 또는 당업자가 유용하다고 간주하는 적합한 소분자의 기타 이용 가능한 컬렉션 또는 라이브러리 등이 있다.

본 발명의 제6 측면의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 친화성 분자는 펩타이드 기반 화합물, 더욱 바람직하게는 항체 또는 이의 결합 단편이다.

새로운 항체 또는 그러한 항체의 결합 단편을 생성하기 위해, 예를 들어 상응하는 펩타이드 서열로 동물을 면역시키는 동안 새로 확인된 펩타이드 에피토프에 대해 확립되고 신뢰할 수 있는 하이브리도마 기술을 사용하여 효과적인 단일클론 항체를 생성하는 것은 쉽고 간단하며 일반적인 관행이다. 바이러스성 질병의 치료를 위해 전체 항체(약 150kDa)가 투여되지 않을 가능성이 있지만, 생체 내 표적 도달할 수 있도록 항체에서 파생된 단편(예: Fab 단편) 또는 더 작은 부분을 치료에 사용할 수 있다.

이러한 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)2, Fv, 디아바디, 단일 사슬 항체 단편 또는 에피토프에 대한 특이적 친화성을 갖는 다른 단편으로 구성되거나 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명 내에서, 서열번호 9 또는 10의 새로 발견된 에피토프에 특이적으로 결합하거나 그에 대해 유도되는 친화성 분자는 관련되지 않은 에피토프, 단백질 또는 단백질 영역에 비해 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 더 바람직하게는 적어도 100배 이상 증가된 친화도로 상기 표적 에피토프에 결합하는 친화성 분자를 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 분리된 표적 에피토프에 대한 친화성 분자의 특이적 결합은 하기에 추가로 설명되는 바와 같이 등온 적정 열량계로 측정할 때 500μM 미만, 바람직하게는 200μM 미만, 더 바람직하게는 100μM 미만의 KD에서 제공되는 것으로 간주된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 전장 RNA 의존성 RNA 폴리머라제에 대한 친화성 분자의 특이적 결합은 아래에 추가로 설명되는 등온 적정 열량계로 측정할 때 1mM 미만, 바람직하게는 100μM 미만, 더 바람직하게는 10μM 미만의 KD에서 제공되는 것으로 간주된다. 대안적으로 바람직하게는, 상기 KD 값의 결정을 위한 친화성 측정은 Biacore Assay Handbook 29-0194-00 Edition AA에 따른 GE Healthcare Life Sciences의 BiacoreTM 분석, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 친화성 측정을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 제6 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 친화성 분자는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드이다. 항체의 경우와 마찬가지로, 그러한 분석에 접근 가능하고 쉽게 사용될 수 있는 표적에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 분자를 생성하는 절차가 있다.

SELEX는 알려진 에피토프에 대한 새로운 올리고뉴클레오티드 결합제를 찾기 위한 기술 중 하나로, 1990년 초에 활용 및 보고되었다. 오늘날 다양한 SELEX 기반 압타머 선택 절차가 개발되어 사용되고 있으며(Ali MH, Elsherbiny ME, and Emara M (2019) Updates on Aptamer Research. International Journal of Molecular Sciences 20.), 이를 통해 고려할 수 있는 대상 거의 모두에 대한 압타머 선택이 가능해졌다(Stoltenburg R, Nikolaus N, and Strehlitz B (2012) Capture-SELEX: Selection of DNA Aptamers for Aminoglycoside Antibiotics. Journal of Analytical Methods in Chemistry 2012:415697.).

1990년에 압타머가 처음 확립된 이후, 압타머는 뉴클레오티드, 보조인자 또는 아미노산과 같은 소분자부터 펩타이드, 다당류 및 단백질과 같은 소분자부터 전체 세포, 바이러스 및 단세포 유기체와 같은 복잡한 구조에 이르기까지 다양한 종류의 표적에 대해 설명되었다(예를 들어, Zhang Y, Lai BS, and Juhas M (2019) Recent Advances in Aptamer Discovery and Applications. Molecules 24 참조).

이와 관련하여, 코로나바이러스과 바이러스의 주요 효소 내에 신규한 에피토프를 제공함으로써 통상의 기술자는 당업계에 일반적으로 공지된 표준 절차를 사용하여 소분자, 항체 유래 화합물 및 압타머와 같은 추가적인 친화성 분자를 생성할 수 있다. 이러한 추가 친화성 분자는 바이러스의 주요 효소 내 아직 알려지지 않은 부위에 특이적으로 결합하여 바이러스 복제 주기를 방해하기 때문에 SARS-CoV-2 감염과 대항하기 위한 그럴듯한 활성 물질로 간주된다.

본 명세서에 기술된 본 발명의 모든 실시예는 통상의 기술자가 이러한 조합이 기술적 의미가 없다고 생각하지 않는 한 임의의 조합으로 조합 가능한 것으로 간주된다.

실시예

1. BC007과 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)의 서열 모티프 사이의 상호작용에 대한 NMR 분석

모든 NMR 스펙트럼은 298K에서 90/10 H2O/D2O에서 Bruker AV600 분광계(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)를 사용하여 600MHz에서 획득하였다. Bruker 펄스 프로그램 zggpw5에 포함된 Watergate w5 펄스 시퀀스를 사용하여 용매 신호를 억제했다. 포함된 수집 매개변수는 다음과 같다: 시간 도메인 = 65K, 스캔 수 = 512, 스위프 폭 = 24ppm 및 90° 고전력 펄스 = 13.8μs.

BC007과 서열번호 5의 펩타이드의 농도는 1mM이었다. 첨가물 없이 순수한 H₂O/D₂O 혼합물 0.5ml에 물질을 용해시켰다.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인의 서열번호 5 펩타이드와 결합한 BC007의 도 1의 상부 NMR 스펙트럼(상부 스펙트럼)은 펩타이드와의 상호작용에 의해 유도되고 12.5ppm에서 8개의 이미노 신호에 의해 명확하게 인식될 수 있는 BC007의 사중 구조의 형성을 보여준다; 스펙트럼의 상기 펩타이드 신호는 칼륨 유도 접힘과 비교하여 강하게 이동하고 넓어지며, 이는 두 분자(BC007과 펩타이드)의 상호 작용으로 인해 발생한다.

도 1의 하부 NMR 스펙트럼에서 12ppm 범위의 이미노 신호는 칼륨 이온의 존재에 의해 유도된 구조 형성을 명확하게 나타낸다. 그러나 이미노 양성자의 화학적 이동은 상부 스펙트럼의 신호와 분명히 다르다. 12ppm 범위의 이미노 신호는 펩타이드 단독의 경우 관찰되지 않는다(중간 스펙트럼).

서열번호 1의 압타머는 칼륨 이온의 존재 하에서 그 특징적인 접힘이 안정화되고(Schultze, P. et al., 1994. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). J. Mol. Biol. 235, 1532?1547. https://doi.org/10.1006/jmbi.1994.1105) 물 속에서 주로 랜덤 코일 구조로 존재하는 것으로 이전에 보고되었다 (참조: Weisshoff, H. et al., 2018. Characterization of Aptamer BC 007 Substance and Product Using Circular Dichroism and Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J Pharm Sci. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2018.04.003).

도 2의 확대된 그림에서는 각 분자에만 존재하는 피크가 매우 날카로운 신호를 기반으로 하는 것을 볼 수 있다. 그런 다음 이러한 신호는 코로나바이러스에 대해 활성인 것으로 생각되는 제제인 서열번호 1의 압타머와 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인의 대표적인 서열인 서열번호 5의 도메인 사이의 강한 상호 작용으로 인해 상위 스펙트럼에서 위치가 확대되고 이동된다.

이러한 결과에 기초하여, 상기 상호작용은 완전한 바이러스 물질 및 세포 진입 및 감염을 위해 스파이크 단백질 및 이들의 수용체 결합 도메인을 사용하는 코로나바이러스과의 동일한 계열의 다른 계통과 함께 생체 내 조건에서도 발생할 것으로 예상된다.

2. 인간 및 영장류 세포주에서 BC 007에 의한 SARS-CoV-2 복제 억제

BC 007의 항바이러스 용량-반응 효과에 대한 조사를 VeroFM 및 Calu-3 세포에서 수행했다. 서열번호 1의 압타머 BC 007을 다양한 농도(MOI 0.0005까지)로 바이러스에 첨가하고 4℃에서 15분 동안 유지한 후, 혼합물을 세포에 첨가하고 바이러스 부착 및 유입을 개시하기 위하여, 30분 동안 37℃까지 데웠다.

30분 동안 인큐베이션한 후, 상층액을 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 세척 후 동일한 최종 농도의 BC 007을 함유하는 배지를 첨가했다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 후(복제), 이전에 설명된 대로 수행된 플라크 분석을 위해 각 농도에 대한 샘플 분취량을 채취했다(Herzog et al., Virology Journal 2008, 5:138).

BC007은 Vero 및 Calu-3 세포주에서 저용량으로 바이러스 복제를 매우 효율적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 3 참조). 바이러스 감염 억제에 대해 결정된 최대 절반 유효 농도(EC50, 또는 절반 최대 억제 농도 IC50이라고도 함)는 Calu-3 세포의 경우 3.74μM, Vero 세포의 경우 0.21μM이었다.

SARS-CoV-2의 잠재적인 치료와 관련된 다른 항바이러스제와의 비교에 대해서는 Wang et al., Cell Research 2020, 30:269-271가 본 발명의 참조로 도입된다.여기서 리바비린(ribavirin), 펜시클로비르(penciclovir), 파비피라비르(favipiravir), 니타족사니드(nitazoxanide), 클로로퀸(chloroquine) 및 렘데시비르(remdesivir)는 Vero E6 세포와 초기 MOI 0.05로 설정된 유사한 실험 설정에서 테스트되었다.

상기 Wang et al.의 보고서에서 EC50은 리바비린의 경우 109.50μM, 펜시클로비르의 경우 95.96μM, 파비피라비르의 경우 61.88μM, 니타족사니드의 경우 2.12μM, 클로로퀸의 경우 1.13μM, 렘데시비르의 경우 0.77μM로 측정되었다(Wang et al., 2020의 269페이지 왼쪽 열과 오른쪽 열을 연결하는 전체 단락 및 270페이지 그림 1a 참조).

렘데시비르로 얻은 결과를 토대로 렘데시비르는 낮은 마이크로몰 농도에서도 바이러스 감염을 강력하게 차단한다는 결론을 얻었다. 또한 렘데시비르는 SARS-CoV-2 억제 효과를 테스트하는 데 사용된 농도에서 실질적인 세포 독성이 부족했다.

Wang et al., 2020에 보고된 결과를 고려하면, 본 발명의 압타머를 사용하여 Vero 세포에서 얻은 결과는 코로나바이러스과 감염에 대한 잠재적인 치료 옵션으로 현재 논의된 다른 항바이러스제를 사용하여 관찰된 효율성에 대하여 동등하거나, 심지어 그 이상으로 바이러스 감염을 강력하게 차단한다는 것이 분명해졌다.

중요하게도, Wang et al., 2020에서 매우 잘 수행되는 것으로 확인된 분자와 유사하게, 본 발명의 압타머는 Vero 및 인간 세포(Calu-3)에서 SARS-CoV-2의 감염 활성을 효율적으로 억제했을 뿐만 아니라 인간 세포에서 관찰된 SARS-CoV-2 억제를 위해 의도되고 필요한 용량으로 성공적으로 완료된 임상 1단계에서 이미 나타난 바와 같이 독성이 전혀 없었다(Becker et al., Clin Drug Investig 2020 May;40(5):433-447).

현재 논의된 치료 옵션으로서 기존의 치료제인 렘데시비르과 비교되는 본 발명의 압타머의 두드러진 장점은 상기 압타머의 제조가 간단하고 용이하다는 점이다. 코로나바이러스과 계열 바이러스 감염 치료를 위해 제안된 항바이러스제의 예인 렘데시비르에는 약 70가지의 원료, 시약 및 촉매가 필요한 것으로 보고되었으며, 그중 일부는 인간에게 매우 위험한 것으로 알려져 있다(참조: Langreth, Robert(2020년 5월 14일). "All Eyes on Gilead". Bloomberg Businessweek. Bloomberg, L.P.).

더욱이, 합성에는 약 25개의 시간 소모적인 화학적 단계가 포함되어 있어 계약 제조업체의 원자재부터 완제품까지 원래의 전체 제조 공정에 9~12개월이 소요된다.

대조적으로, 변형되지 않은 DNA 분자로서 사용 및 투여될 수 있는 본 발명의 압타머는 렘데시비르와 같은 항바이러스제에 소요되는 비용의 일부만으로 몇 주 만에 세계적인 수요를 만족시키는 최대 킬로그램 양까지 대규모로 생산될 수 있다.

3. BC007과 인간 트롬빈의 상호작용 및 그에 따른 응고 억제

인간 트롬빈(250nM)을 Nunc Maxisorp ELISA-플레이트에서 4℃에서 밤새 0.1M 탄산 완충액으로 고정시킨 후, 인산염 완충 식염수 용액(PBS), pH 7,4에서 1% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단을 수행한다. 그 후, 5'-비오틴화 압타머 BC007을 다양한 농도(100nM, 500nM 및 1000nM)로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 트롬빈에 결합된 압타머는 POD 결합 뉴트라비딘을 통해 검출되며, 여기서 POD의 양은 과산화수소/테트라메틸벤지딘(TMB) 반응을 통해 결정되고 판독은 450nm의 측정 파장(기준 파장은 650nm)에서 플레이트 판독기로 수행되었다. 세척은 일상적인 ELISA-세척 완충액을 사용하여 각각 수행되었다. 트롬빈이 없는 플라스틱 플레이트가 대조군 역할을 한다. 트롬빈 결합 분석 결과는 도 4에 나타나 있다.

응고 억제 여부를 확인하기 위해 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT)을 다음과 같이 측정하였다:

50μl의 1 mM 압타머 용액(참조 압타머로서 SEQ ID NO:1의 BC007 또는 SEQ ID NO: 7의 압타머 AS1411)을 1mL HemosIL 인간 보정 혈장((Instrumentation Laboratory, Werfen)에 희석한다. 그 후 상기 용액을 HemosIL 보정 혈장에서 0.083, 0.028, 0.009, 0.003, 0.001mg/ml의 농도로 1:2로 연속 희석한다.

이 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 인지질 및 완충액과 함께 배양되었다. 칼슘을 첨가한 후 ACL TOP Coagulation system(Werfen)을 사용하여 응고까지 걸리는 시간을 측정했다. 결과는 도 5A에 표시하였다.

서열번호 7의 압타머 BC007 및 참조 압타머 AS1411의 빠른 값은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 결정되었다. 결과는 그림 5B(빠른 값)에 표시되었다.

4. BC007과 SARS-CoV-2의 RNA 의존성 RNA 중합효소의 두 서열 모티프 간의 상호작용 분석

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2의 RNA+의존성 RNA 중합효소(NCBI Reference Sequence: YP_009725307.1)에서 채취한 두 개의 서열 섹션: HRFYRLAN(His ⁶⁵⁰-Arg ⁶⁵¹-Phe ⁶⁵²-Tyr ⁶⁵³-Arg ⁶⁵⁴-Leu ⁶⁵⁵-Ala ⁶⁵⁶-Asn ⁶⁵⁷) 및 LYRNRDV(Leu ⁷³¹-Tyr ⁷³²-Arg ⁷³³- Asn ⁷³⁴- Arg ⁷³⁵- Asp ⁷³⁶- Val ⁷³⁷)를 NMR-분광학을 통해 BC007과의 결합 및 상호 작용에 대해 분석했다.

도 6의 위쪽에 나타난 LYRNRDV와 조합된 BC 007의 상부 NMR 스펙트럼은 11.5~12.5ppm 사이의 이미노 신호에 의해 감지되게 할 수 있는 반대쪽 음향 신호 흡수에 유도된 BC 007의 사중 구조의 형성을 보여준다. 하부 스펙트럼은 BC 007과 HRFYRLAN 사이의 결합을 보여준다.

첨가물 없이 순수한 H2O/D2O 혼합물 0.5ml에 물질을 용해시켰다. SARS-CoV-2 단백질의 이러한 서열 섹션과 BC 007의 상호작용을 조사한 NMR 데이터는 298K에서 90/10 H2O/D2O의 Bruker AV600 분광계(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)에서 600MHz로 획득되었다. Bruker 펄스 프로그램 zggpw5에 포함된 Watergate w5 펄스 시퀀스를 사용하여 용매 신호를 억제했다. 수집 매개변수는 다음과 같다: 시간 도메인 = 65K, 스캔 수 = 512, 스위프 폭 = 24ppm 및 90° 고전력 펄스 = 13.8μs.

HRFYRLAN과 BC007 사이의 결합에 대한 추가 분석은 등온 적정 열량계(ITC)에 의해 수행되었다. 이 ITC 분석의 결과는 도 7에 표시되어 있으며, 여기서 열분석도는 위쪽 부분, 결합 등온선은 아래쪽 부분에 표시하였다.

ITC 실험은 MicroCal PEAQ-ITC 미세열량계(Malvern Panalytical GmbH, Germany)에서 수행되었다. 두 상호작용 파트너 모두 50mM 인산나트륨, 150mM NaCl 완충액, pH 7.06에 용해되었다. 실험은 25℃에서 수행되었다. 일상적인 실험에서, 펩타이드(3.6 또는 4mM)를 열량계 셀의 압타머 용액(200μM)에 2μl 단계로 적정했다. 주입 사이의 시간 간격은 200초로 조정되었으며, 열 신호가 기준선으로 돌아가는 데 충분한 시간이었다. 반응 혼합물을 750rpm으로 연속적으로 교반하였다.

완충액에 펩티드를 첨가하는 것과 관련된 희석 열(별도의 대조 실험에서 결정됨)은 측정된 결합 열에 무시할 수 있는 작은 상수 값을 가졌다. 기기 소프트웨어(MicroCal PEAQ-ITC 분석)는 주입된 리간드의 몰량에 대한 반응열의 기준선 조정, 피크 통합 및 정규화뿐만 아니라 데이터 피팅 및 결합 매개변수 평가에도 사용되었다.

이 ITC 분석에서는 두 바인딩 파트너인 BC007과 HRFYRLAN 간의 1:1 화학량론적 바인딩이 밝혀졌으며 이는 실제적이고 구체적인 결합을 강력하게 뒷받침한다.

ITC 분석을 위한 대조 실험은 NRKRISN 서열(SEQ ID NO:11; 이론적 pI 값 12.01)을 갖는 SARS-CoV-2의 스파이크 RBD로부터 고도로 전하된 펩타이드를 사용하여 실행되었다. 결과는 도 8에 나와 있다. 이 대조를 사용하면 RNA-의존성 RNA 중합효소 HRFYRLAN(이론적 pI 값은 10.84)과 LYRNRDV(이론적 pI 값은 8.75) 및 BC 007의 결합 펩타이드 사이의 유일한 비특이적 정전기 상호작용이 명확하게 제외될 수 있다.

실험은 MicroCal PEAQ-ITC 미세열량계(Malvern Panalytical GmbH, Germany)에서 다시 수행되었다. 두 상호작용 파트너 모두 50mM 인산나트륨, 150mM NaCl 완충액, pH 7.16에 용해되었다.실험은 25°C에서 수행되었다.일상적인 실험에서, 펩타이드(3.6 또는 4mM)를 열량계 셀의 압타머 용액(200μM)에 2μl 단계로 적정했다. 주입 사이의 시간 간격은 200초로 조정되었으며, 이는 열 신호가 기준선으로 돌아가는 데 충분했다. 반응 혼합물을 750rpm으로 연속적으로 교반하였다. 완충액에 펩타이드를 첨가하는 것과 관련된 희석 열(별도의 대조 실험에서 결정됨)은 측정된 결합 열에 무시할 수 있는 작은 상수 값을 가졌다. 기기 소프트웨어(MicroCal PEAQ-ITC 분석)는 주입된 리간드의 몰량에 대한 반응열의 기준선 조정, 피크 통합 및 정규화뿐만 아니라 데이터 피팅 및 결합 매개변수 평가에도 사용되었다.

마지막으로, 대조 펩타이드인 NRKRISN에 대한 BC007의 잠재적인 결합을 분석하기 위해 NMR 분광학도 수행되었다. 그 결과는 도 9에 나타나 있다. NRKRISN과 조합된 BC 007의 NMR 스펙트럼은 BC 007의 사중체 구조가 거의 완전히 형성되지 않았음을 보여주며, 이는 11.5 내지 12.5ppm 사이의 누락된 이미노 신호에서 인식될 수 있다. 비교를 위해, 상부 스펙트럼은 펩타이드 서열 YRLFRK(SARS-CoV-2의 스파이크 단백질로부터의 서열, 이론적인 pI 값 11.0)의 BC 007 결합을 나타낸다.

첨가물 없이 순수한 H₂O/D₂O 혼합물 0.5ml에 물질을 용해시켰다. BC 007과 SARS-CoV-2 단백질의 이 서열 섹션의 상호 작용을 조사한 NMR 데이터는 298K에서 90/10 H₂O/D₂O의 Bruker AV600 분광계(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)에서 600MHz로 수집되었다. Bruker 펄스 프로그램 zggpw5에 포함된 Watergate w5 펄스 시퀀스를 사용하여 용매 신호를 억제했다. 포함된 수집 매개변수는 다음과 같다: 시간 도메인 = 65K, 스캔 수 = 512, 스위프 폭 = 24ppm 및 90° 고전력 펄스 = 13.8μs.

5. 활성 SARS-CoV-2 감염에서 회복된 환자의 혈청에서 GPCR 자가항체의 식별 및 특성 규명

PCR로 확인된 급성 질환에서 회복된 후 25명의 환자로부터 혈청을 채취했다. 코로나19 이후 증상을 보인 환자는 23명, 무증상인 환자는 2명이었다.

안전 예방 조치로, 코로나19 환자 혈청은 사용 전 56℃에서 30분간 열 비활성화되었다. 그 후, 0.4 mL의 시료를 1 L의 투석 완충액(0.15 M NaCl, 10 mM 인산염 완충액, pH 7.4; Membra-Cel MD 44, 14 kDa, Serva)에 대해 24시간 동안 투석하여 저분자 생리활성 화합물과 펩타이드를 제거했다. 마지막으로, 투석된 샘플 40μL를 생물학적 검정에 추가했다(최종 희석률 1:50).

GPCR-fAAB의 식별 및 특성화를 위해 베타1-아드레날린 수용체에 대한 GPCR-fAAB에 대해 생물검정이 사용되었으며, 유사하게 여러 GPCR-fAAB의 병렬 측정을 위해 다른 GPCR-fAAB에 대해서도 사용되었다. 상기 생물검정은 Davideit et al. 및 Wenzel et al(Davideit H et al (2019) Determination of Agonistically Acting Autoantibodies to the Adrenergic Beta-1 Receptor by Cellular Bioassay. Methods Mol Biol 1901:95-102. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8949-2_8; 및 Wenzel K, Schulze-Rothe S, Haberland A, et al (2017) Performance and in-house validation of a bioassay for the determination of beta1-autoantibodies found in patients with cardiomyopathy. Heliyon 3:e00362. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2017.e00362)에 자세히 설명되어 있다.

각각의 자가항체와 접촉시킨 후, GPCR을 발현하는 자발적 박동 심근세포의 기저 박동률의 변화를 측정 신호로 사용하였다. 수용체 특이성은 특정 수용체 차단제를 추가하여 이 효과를 무효화하거나 해당 수용체-에피토프와 경쟁하는 세포외 루프 펩티드를 추가하여 확인했다. 세부적으로: β2-fAAB의 사양을 위해 수용체 길항제 ICI118.551(0.1μM)이 사용되었으며 인간 β2-아드레날린 수용체의 첫 번째 또는 두 번째 세포외 루프에 해당하는 중화 펩타이드도 사용되었다.

음성 크로노트로픽 무스카린성 M2 수용체-자가항체(M2-fAAB)의 효과는 아트로핀(1μM)에 의해 차단되었다. Losartan(1μM)은 양성 크로노트로픽 AT1-fAAB의 효과를 차단하고 A779(1μM)는 음성 크로노트로픽 MAS-fAAB의 효과를 차단했다. MAS-fAAB의 확인을 위해, 인간 MAS 수용체의 첫 번째 및 두 번째 세포외 루프에 해당하는 추가 경쟁 펩티드를 활용했다.

ETA-fAAB는 특정 엔도텔린 수용체 길항제 BQ123(0.1μM) 및 수용체의 첫 번째 또는 두 번째 세포외 루프에 해당하는 경쟁 펩타이드를 추가하여 부정적인 크로노트로픽 효과를 차단함으로써 확인되었다.

nociceptin 수용체 길항제 J113397(0.1μM)을 사용하여 양성 크로노트로픽 NOC-fAAB 및 첫 번째 또는 두 번째 세포외 루프에 해당하는 경쟁 펩타이드의 효과를 차단했다. 1μM 우라피딜 또는 프라조신을 첨가 시 α1-fAAB의 양성 크로노트로피 효과가 사라졌다. 모든 펩타이드에 대해 100μg/mL의 저장 용액 2μL를 해당 GPCR-fAAB 샘플 40μL에 첨가하고 혼합물을 세포로 옮기기 전에 30분 동안 배양했다.

회복된 코로나19 환자의 25개 혈청에서 여러 가지 다른 GPCR-fAAB가 확인되었다. 조사된 25명의 환자 모두 2~7개의 서로 다른 GPCR-fAAB를 가지고 있었다(도 10).

조사된 거의 모든 환자에서 나타난 두 가지 기능적 활성 자가항체는 β2-아드레날린 수용체(β2-fAAB)와 무스카린성 M2 수용체(M2-fAAB)에 대한 것이었다. 이들 fAAB는 각각 표적 수용체에 대해 양성 및 음성 크로노트로픽 반응을 유도했다.

조사된 코로나19 이후 환자 25명 중 23명(92%)에게 존재했던 두 개의 다른 fAAB는 안지오텐신 II AT1 수용체(fAT1-AAB)와 안지오텐신 1-7 MAS 수용체(MAS-AAB)에 대한 것이었다. 이들 수용체는 레닌 안지오텐신 시스템(RAS)에 속하며 각각의 fAAB에 의해 표적화될 때 각각 양성 및 음성 크로노트로피 효과를 유발한다.

회복된 환자 중 8명은 감염 후 탈모(탈모증)를 경험했다. 이 환자들의 혈청에서 음성 크로노트로픽 ETA-fAAB(4/8), 양성 크로노트로픽 NOC-fAAB(5/8), 양성 크로노트로픽 α1-AAB(3/8) 등 3개의 추가 GPCR-fAAB가 발견되었다. 모든 탈모증 환자가 세 가지 GPCR-fAAB를 모두 나타내는 것은 아니다. 대신 발생 빈도는 다양하며 아직 패턴을 감지할 수 없다. 도 10에서 볼 수 있듯이, 조사된 코로나19 이후 환자 25명 중 2명은 어떤 증상도 보이지 않고 fAAB가 발생했다.

바이러스 추적 검사가 음성인 후에도 오랫동안 지속되는 지속적인 피로 유사 증상은 이 연구의 환자에서 자주 보고된 장애였다(17/25). 전형적인 코로나바이러스 독립적 피로 증후군을 앓고 있는 환자의 경우 β2-fAAB, M2-fAAB 및 일부 경우 ETA-fAAB의 발생이 이미 보고되었다.

여기서 조사된 거의 모든 혈청에는 β2-fAAB와 M2-fAAB가 포함되어 있다. β2-fAAB와 M2-fAAB의 조합은 PoTS와 자율신경 장애를 앓고 있는 환자의 혈청에서도 확인되었으며, 두 가지 모두 현재 코로나19 이후 환자에서 관찰되는 상태이다(각각 3/25와 2/25, 중복 없음).

더욱이, β2-fAAB와 M2-fAAB의 이러한 조합은 본 발명자에 의하여, 복합 부위 통증 증후군(CRPS) 환자, 기면증 1형을 앓고 있는 환자, 여기서 추가적으로 10건 중 9건의 사례에서 NOC-fAAB 및 소섬유 질환 환자에서 확인되었다.

조사된 코로나19 환자 혈청(23/25)의 90% 이상에서 관찰된 확인된 GPCR-fAAB 중 2개는 RAS 수용체, 즉 안지오텐신 II AT1 수용체와 안지오텐신(1-7) MAS 수용체에 대한 것이었다. 이러한 혈관 활성 AT1-fAAB는 이전에 악성 고혈압, 치료 저항성 고혈압, 자간전증 및 신장 질환 환자에서 확인되었다.

이 데이터는 이미 장기 코로나19 질병 증상 발생에서 GPCR-AAB의 중요한 역할을 나타낸다. 따라서 BC007은 이러한 항체의 유해한 효과에 대해 확립된 활성제로서 장기간의 코로나 증상으로 고통받는 환자에게 유망한 치료 옵션으로 볼 수 있다.

6. 압타머 BC 007(SEQ ID NO. 1) 투여 전후의 Long-COVID-19 혈청 샘플에서의 GPCR-AAB 활성 특성 분석

샘플 준비

코로나19를 극복했지만 장기간 코로나19와 관련된 증상이 지속되는 환자의 혈청은 안전 조치로 사용하기 전 56℃에서 30분간 열을 가하여 불활성화하였다. 그 후, 0.4 mL의 시료를 1 L의 투석 완충액(0.15 M NaCl, 10 mM 인산염 완충액, pH 7.4; Membra-Cel MD 44, 14 kDa, Serva)에 대해 24시간 동안 투석하여 저분자 생리활성 화합물 및 펩타이드를 제거했다.

장기 코로나 19 혈청 샘플에서 GPCR-AAB 활성 측정을 위한 자발 박동 신생아 쥐 심근세포의 생물학적 검정(Cardiomyocyte Beat Rate Assay, CBRA-LC).

장기 코로나 19 환자의 혈청에서 GPCR-AAB를 추정하기 위해 투석된 샘플 40μL를 생물학적 분석에 추가했다(최종 희석률 1:50). AAb의 시간변환 효과는 Wallukat G 및 Wollenberger A (1987) Biomed Biochim Acta 46:S634-639에 설명된 대로 CBRA의 원리에 따라 측정되었다.

하나의 샘플에서 서로 다른 GPCR-AAB의 조합을 결정하기 위해 (Wallukat G et al. (2018) PLoS ONE 13:e0192778.); (Wallukat G et al. ((2019) Methods Mol Biol 1955:247-261); 및 (Orjatsalo M et al. (2021) Sleep Med 77:82-87.)에 설명된 측정 원리가 적용되었다.

분석을 위해 신생아 쥐 심근세포의 단층을 준비하고 12.5 cm2 Falcon 플라스크에서 배양하였다. 처음에는 6개 심근세포 클러스터의 기본 박동률을 시각적으로 결정하고 기록했다. 양성 크로노트로픽 반응을 발현하는 GPCR-AAB를 측정하기 위해 세포를 수용체 차단제 칵테일(M2-AAB를 차단하는 1μM 아트로핀, ETA-AAB를 차단하는 0.1μM BQ123, MAS-AAB를 차단하는 1μM A779)과 함께 사전 배양하여 모든 음성 크로노트로픽 GPCR-AAB 효과를 차단하였다.

40 μL의 투석된 샘플(희석 1:50)을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 양성 크로노트로픽 반응이 동일한 클러스터에서 다시 측정되었다. 기저박동수와의 차이를 델타맥박수[ΔPR/min]로 표현하였다. beta2-AAb(0.1μM ICI118,551), AT1-AAB(1μM Losartan), alpha1-AAB(1μM 우라피딜 또는 프라조신) 및 nociceptin-AAB(0.1μM J113397)의 양성 크로노트로픽 효과를 차단하는 수용체 차단제의 후속 점진적 추가로 양성 크로노트로픽 GPCR-AAB의 전체 활성에서 해당 AAB의 비율이 결정되었다.

음성 크로노트로픽 반응을 나타내는 GPCR-AAB를 결정하기 위해, 테스트를 반대로 수행하였다. 준비된 환자 혈청 40μL(1:50)를 첨가하기 전에 양성 크로노트로픽 반응을 차단하는 수용체 차단제의 칵테일(베타2-AAB를 차단하는 0.1μM ICI118,551, AT1-AAB를 차단하는 1μM Losartan, alpha1-AAB를 차단하는 1μM 우라피딜 또는 프라조신, 노시셉틴-AAB를 차단하는 0.1μM J113397)을 사용하여 세포를 초기에 전처리했다.

음성 크로노트로픽 반응이 나타나는 경우, 이 후 점진적인 아트로핀(M2-AAB), BQ123(ETA-AAB) 및 A779(MAS-AAB)의 추가로 음성 크로노트로픽 GPCR-AAB의 전체 활성에서 해당 AAB의 비율이 결정된다.

BC007 치료 후 장기 코로나 환자의 추적 관찰

치료 성공 또는 치료 효과를 결정하기 위해, 환자는 BC007 투여 후 주어진 시간 간격(6h, 2d, 7d, 30d)으로 추적 관찰되었다. 다시, 모든 양성 크로노트로픽 GPCR-AAB 또는 모든 음성 크로노트로픽 GPCR-AAB에 대해 수용체 차단제 칵테일로 전처리된 심근세포에 환자 샘플을 추가했다.

환자 혈청에 의해 야기되는 반대 크로노트로픽 샘플 효과(모든 음성 크로노트로픽 GPCR-AAB에 대해 차단된 심근세포에 대한 양성 크로노트로픽 반응 또는 그 반대)가 검출될 수 없는 경우, 이는 이 샘플에 상응하는 GPCR-AAB가 없음을 나타내는 것으로 해석될 수 있다.

그러나 이러한 경우 단일 GPCR-AAB와 각각의 단일 수용체 차단제를 구별하는 것은 더 이상 불가능하다.

	BC007 투여 전	6시간 후	2일 후	7일 후	30일 후
양성 전체	8.17 U	2.09 U	0.67 U	0.6 U	0.17 U
β2-AAB	4.34 U	0.89 U	---	---	---
AT1-AAB	1.66 U	---	---	---	---
α1-AAB	2.17 U	1.20 U	---	---	---
음성 전체	- 5.50 U	- 1.83 U	0.67 U	0.6 U	0.17 U
M2-AAB	- 1.83 U	---	---	---	---
MAS-AAB	- 3.67 U	- 1.83 U	---	---	---

상기 표 1에 표시된 값과 실험 조건에 기초하여 1.17을 초과하는 값은 테스트된 자가 항체가 존재하는 것으로 간주되며, 이 역치 값보다 낮은 값은 없는 것으로 간주된다.

이 실험은 코로나19를 극복하고 감염 후에도 지속되는 증상을 겪고 장기 코로나19와 관련된 환자에서 발견 및 확인된 GPCR 자가항체가 실제 쥐 심근세포 분석에서 볼 수 있듯이 G-단백질 결합 수용체에 직접적이고 측정 가능한 영향을 미친다는 것을 보여준다.

또한, 장기 코로나 환자에게 BC007을 투여하면 이러한 자가항체의 특이적 결합 및 지속적인 중화를 통해 상기 GPCR 자가항체의 효과를 상쇄할 수 있다는 것이 명확하게 입증될 수 있다.

이 데이터는 BC007(서열번호 1)이 SARS-CoV-2 감염이 극복된 후 장기 코로나19의 주요 원인 중 하나로 나타나는 GPCR 자가항체를 중화할 수 있다는 본 발명의 기초에 대한 실험적 증거를 나타낸다. 본 발명자들에 의하여 유사한 관찰이 수행되고, 그에 대하여 발표된 바 있다(Hohberger et al. (2021) Front. Med. 8:754667).

종합하면, BC007과 GPCR 자가항체에 대한 구체적이고 효율적인 작용은 SARS-CoV-2 감염을 극복한 후에도 장기 코로나 증후군의 지속되는 질병 증상으로 고통받는 환자를 위한 가장 유망한 치료 옵션 중 하나를 나타낸다.

더욱 흥미롭게도, SARS-CoV-2 감염에 대한 BC007의 기능과 그 진행은 장기간의 코로나 증상에 대한 기능과 함께 진행 중인 감염뿐만 아니라 감염이 극복된 후에도 잠재적으로 지속되는 증상의 치료에 더욱 적합하다.

<110> Berlin Cures GmbH <120> APTAMERS FOR USE IN THE TREATMENT OF CORONAVIRIDAE INFECTIONS <130> BLC73438PCT1 <150> KR PCT/EP2021/059328 <151> 2021-04-09 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer BC007 <400> 1 ggttggtgtg gttgg 15 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Receptor-binding domain (RBD) of S1 Subunit of Spike protein of SARS-CoV-2 <400> 2 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser 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SEQ ID NO: 8) <400> 9 Leu Tyr Arg Asn Arg Asp Val 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Peptide HRFYRLAN (aa 650-657 of SEQ ID NO: 8) <400> 10 His Arg Phe Tyr Arg Leu Ala Asn 1 5 <210> 11 <211> 932 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Control peptide NRKRISN <400> 11 Ser Ala Asp Ala Gln Ser Phe Leu Asn Arg Val Cys Gly Val Ser Ala 1 5 10 15 Ala Arg Leu Thr Pro Cys Gly Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Val Tyr 20 25 30 Arg Ala Phe Asp Ile Tyr Asn Asp Lys Val Ala Gly Phe Ala Lys Phe 35 40 45 Leu Lys Thr Asn Cys Cys Arg Phe Gln Glu Lys Asp Glu Asp Asp Asn 50 55 60 Leu Ile Asp Ser Tyr Phe Val Val Lys Arg His Thr Phe Ser Asn Tyr 65 70 75 80 Gln His Glu Glu Thr Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Asp Cys Pro Ala Val 85 90 95 Ala Lys His Asp Phe Phe Lys Phe Arg Ile Asp Gly Asp Met Val Pro 100 105 110 His Ile Ser Arg Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Thr Met Ala Asp Leu Val 115 120 125 Tyr Ala Leu Arg His Phe Asp Glu Gly Asn Cys Asp Thr Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Leu Val Thr Tyr Asn Cys Cys Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys 145 150 155 160 Asp Trp Tyr Asp Phe Val Glu Asn Pro Asp Ile Leu Arg Val Tyr Ala 165 170 175 Asn Leu Gly Glu Arg Val Arg Gln Ala Leu Leu Lys Thr Val Gln Phe 180 185 190 Cys Asp Ala Met Arg Asn Ala Gly Ile Val Gly Val Leu Thr Leu Asp 195 200 205 Asn Gln Asp Leu Asn Gly Asn Trp Tyr Asp Phe Gly Asp Phe Ile Gln 210 215 220 Thr Thr Pro Gly Ser Gly Val Pro Val Val Asp Ser Tyr Tyr Ser Leu 225 230 235 240 Leu Met Pro Ile Leu Thr Leu Thr Arg Ala Leu Thr Ala Glu Ser His 245 250 255 Val Asp Thr Asp Leu Thr Lys Pro Tyr Ile Lys Trp Asp Leu Leu Lys 260 265 270 Tyr Asp Phe Thr Glu Glu Arg Leu Lys Leu Phe Asp Arg Tyr Phe Lys 275 280 285 Tyr Trp Asp Gln Thr Tyr His Pro Asn Cys Val Asn Cys Leu Asp Asp 290 295 300 Arg Cys Ile Leu His Cys Ala Asn Phe Asn Val Leu Phe Ser Thr Val 305 310 315 320 Phe Pro Pro Thr Ser Phe Gly Pro Leu Val Arg Lys Ile Phe Val Asp 325 330 335 Gly Val Pro Phe Val Val Ser Thr Gly Tyr His Phe Arg Glu Leu Gly 340 345 350 Val Val His Asn Gln Asp Val Asn Leu His Ser Ser Arg Leu Ser Phe 355 360 365 Lys Glu Leu Leu Val Tyr Ala Ala Asp Pro Ala Met His Ala Ala Ser 370 375 380 Gly Asn Leu Leu Leu Asp Lys Arg Thr Thr Cys Phe Ser Val Ala Ala 385 390 395 400 Leu Thr Asn Asn Val Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn 405 410 415 Lys Asp Phe Tyr Asp Phe Ala Val Ser Lys Gly Phe Phe Lys Glu Gly 420 425 430 Ser Ser Val Glu Leu Lys His Phe Phe Phe Ala Gln Asp Gly Asn Ala 435 440 445 Ala Ile Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Arg Tyr Asn Leu Pro Thr Met Cys 450 455 460 Asp Ile Arg Gln Leu Leu Phe Val Val Glu Val Val Asp Lys Tyr Phe 465 470 475 480 Asp Cys Tyr Asp Gly Gly Cys Ile Asn Ala Asn Gln Val Ile Val Asn 485 490 495 Asn Leu Asp Lys Ser Ala Gly Phe Pro Phe Asn Lys Trp Gly Lys Ala 500 505 510 Arg Leu Tyr Tyr Asp Ser Met Ser Tyr Glu Asp Gln Asp Ala Leu Phe 515 520 525 Ala Tyr Thr Lys Arg Asn Val Ile Pro Thr Ile Thr Gln Met Asn Leu 530 535 540 Lys Tyr Ala Ile Ser Ala Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly Val 545 550 555 560 Ser Ile Cys Ser Thr Met Thr Asn Arg Gln Phe His Gln Lys Leu Leu 565 570 575 Lys Ser Ile Ala Ala Thr Arg Gly Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser 580 585 590 Lys Phe Tyr Gly Gly Trp His Asn Met Leu Lys Thr Val Tyr Ser Asp 595 600 605 Val Glu Asn Pro His Leu Met Gly Trp Asp Tyr Pro Lys Cys Asp Arg 610 615 620 Ala Met Pro Asn Met Leu Arg Ile Met Ala Ser Leu Val Leu Ala Arg 625 630 635 640 Lys His Thr Thr Cys Cys Ser Leu Ser His Arg Phe Tyr Arg Leu Ala 645 650 655 Asn Glu Cys Ala Gln Val Leu Ser Glu Met Val Met Cys Gly Gly Ser 660 665 670 Leu Tyr Val Lys Pro Gly Gly Thr Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr Ala 675 680 685 Tyr Ala Asn Ser Val Phe Asn Ile Cys Gln Ala Val Thr Ala Asn Val 690 695 700 Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asp Gly Asn Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Val 705 710 715 720 Arg Asn Leu Gln His Arg Leu Tyr Glu Cys Leu Tyr Arg Asn Arg Asp 725 730 735 Val Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys His 740 745 750 Phe Ser Met Met Ile Leu Ser Asp Asp Ala Val Val Cys Phe Asn Ser 755 760 765 Thr Tyr Ala Ser Gln Gly Leu Val Ala Ser Ile Lys Asn Phe Lys Ser 770 775 780 Val Leu Tyr Tyr Gln Asn Asn Val Phe Met Ser Glu Ala Lys Cys Trp 785 790 795 800 Thr Glu Thr Asp Leu Thr Lys Gly Pro His Glu Phe Cys Ser Gln His 805 810 815 Thr Met Leu Val Lys Gln Gly Asp Asp Tyr Val Tyr Leu Pro Tyr Pro 820 825 830 Asp Pro Ser Arg Ile Leu Gly Ala Gly Cys Phe Val Asp Asp Ile Val 835 840 845 Lys Thr Asp Gly Thr Leu Met Ile Glu Arg Phe Val Ser Leu Ala Ile 850 855 860 Asp Ala Tyr Pro Leu Thr Lys His Pro Asn Gln Glu Tyr Ala Asp Val 865 870 875 880 Phe His Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Arg Lys Leu His Asp Glu Leu Thr 885 890 895 Gly His Met Leu Asp Met Tyr Ser Val Met Leu Thr Asn Asp Asn Thr 900 905 910 Ser Arg Tyr Trp Glu Pro Glu Phe Tyr Glu Ala Met Tyr Thr Pro His 915 920 925 Thr Val Leu Gln 930

Claims

서열번호 1의 핵산서열(GGT TGG TGT GGT TGG)의 핵산서열 및/또는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 핵산서열을 포함하는,
코로나바이러스과(Coronaviridae) 계열의 바이러스 감염을 극복한 환자의 장기 코로나와 관련된 질병 증상을 치료(treating), 치유(curing) 또는 예방(preventing)하는 개체의 치료법(therapy)에 사용하기 위한 압타머.
제1항에 있어서, 상기 질병 증상은 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 자세 기립성 빈맥 증후군(postural orthostatic tachycardia syndrome; PoTS), 자율신경 장애(dysautonomia), 떨림(tremor), 주의력 결핍(attention deficit), 무형실어증(anomic aphasia), 신경병증(neuropathy), 횡단 척수염(transverse myelitis), 급성 괴사성 척수염(acute necrotising myelitis), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 등과 같은, 신경학적 증상;
심근 염증(myocardial inflammation), 부정맥(arrhythmia), 빈맥(tachycardia), 서맥(bradycardia), 고혈압 (hypertension), 방실(AV) 차단(atrioventricular block)과 같은, 심혈관 관련 증상;
탈모증(alopecia) 및 습진(eczema)과 같은, 피부과 증상; 또는
위장병(gastrointestinal diseases),
을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머.
제1항 또는 제2항에 있어서, G-단백질 결합 수용체에 특이적인 자가항체와 그의 표적 단백질의 상호작용을 억제하는데 사용되는, 압타머.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, G-단백질 결합 수용체에 대한 자가항체가 검출될 수 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 압타머.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 G-단백질 결합 수용체에 대한 기능성 자가항체,
바람직하게는, 인간 G-단백질 결합 수용체 아드레날린성 알파-1 수용체, 아드레날린성 베타-2 수용체, 엔도텔린 1 ETA 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체, MAS-수용체 및/또는 침해수용 수용체 중 어느 하나에 특이적인 기능성 자가항체,
보다 바람직하게는, 아드레날린성 베타-2 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체, MAS-수용체 중 어느 하나에 특이적인 기능성 자가항체를 나타내고,
특히 바람직하게는, 상기 환자는 아드레날린성 베타-2 수용체, 무스카린성 M2 수용체, 안지오텐신 II AT1 수용체 및 MAS-수용체 각각에 특이적인 기능성 자가항체를 포함하는 항체 패턴을 나타내는 것을 특징으로 하는, 압타머.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 압타머 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 압타머 및 용기를 포함하는 키트.