KR20230160876A - 뇌 손상의 복합 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뇌 손상, 구체적으로 저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않는, 바람직하게는 정기분만(at term) 또는 조산 신생아 대상체에서, 허혈성 및/또는 저산소성 뇌 병변의 치료 및 예방에 사용하기 위한 복합(병용) 요법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 뇌손상, 특히 저산소성-허혈성 뇌병증(hypoxic-ischemic encephalopathy)을 포함하나 이에 제한되지 않는 허혈성 및/또는 저산소성 뇌 병변을, 바람직하게는 정기분만(at term) 또는 조산(at preterm) 신생아 대상체에서, 치료 및 예방하는 데 사용하기 위한 병용(복합) 요법에 관한 것이다.
신경 성장 인자 (NGF 또는 hNGF)는 그 발견으로 노벨 의학상(1986, Rita Levi-Montalcini)이 수여된 신경 활성 단백질(neuroactive protein) 이다. 수십 년 동안 그 치료 잠재력은, 특히 만성/퇴행성 질환에서 광범위하게 연구되어 왔다. 재조합 인간 NGF(rhNGF)의 안구 제형(ocular formulation)은 최근 희귀 안구 질환인 신경영양 각막염(neurotrophic keratitis) 치료를 위해 EMA와 FDA의 승인을 받았다. 덜 조사된 것은 중추신경계(CNS)의 급성 병변에서 hNGF의 신경 보호 잠재력이다. 일부 과학 간행물은 내인성 신경 영양 인자의 생성에서의 결손이 신생아 저산소성 허혈성 손상 후 관찰되는 장기적 신경학적 결손의 중증도를 결정하는 데 기여하는 인자일 수 있다고 지적했고 (Wang et al., Int J Neurosci 2013; 123: 191-195), 따라서 병변의 급성기에 이들을 투여하는 것을 제안한다(Acta Cir Bras 2017; 32: 270-279, Int J Clin Exp Med 2013; 6: 951-955). 특히, NGF 투여는 어린 나이에 평가된 복잡한 행동의 발달 및 성숙의 결함을 제한한다. 불행하게도, hNGF는 또한 강력한 통각과민 효과(hyperalgesic effect)를 갖는다(Nat Med 1995; 1:774-780). (야생형) NGF는 두 개의 개별 수용체, 즉 (a) 뉴런 생존(neuronal survival)을 촉진하는 수용체 티로신 키나아제 A(TrkA)와 (b) 세포 사멸 조절에 관여되는 p75 뉴로트로핀 수용체에 결합함으로써 타켓 세포에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고(Mesentier-Louro et al., 2017, Int. J. Mol. Sci., vol. 18(98)), 그래서 야생형 NGF의 폴리펩티드 서열 요소(polypeptide sequence elements with wild-type NGF)가, 시신경 압착(optic nerve crush) 후, 세포자멸사(apoptosis) 자극을 통한 망막 퇴화의 악화 효과도 있을 수 있다(Mesentier-Louro et al., 2018, Mol. Neurobiol., vol. 56, p. 1056-1069 참조). 또한 야생형 인간 NGF의 잔기 R100은 p75에 대한 NGF의 결합에 관여하고, 그 잔기의 돌연변이가 p75 결합에 영향을 미친다는 것이 알려져 있다(예를 들어 WO 2008/006893 A1 참조). 야생형 NGF와 대조적으로, hNGF, 본 발명의 폴리펩티드는 p75에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는다(예를 들어, Malerba et al., 2015, PlosOne, 10(9):e0136425 참조). 인간 NGF P61SR100E는 또한 CHF6467 (SEQ ID No. 1)로 명명된, SEQ ID No. 1의 폴리펩티드에 상응한다.
저산소성 허혈성 뇌병증(HIE) 또는 신생아 질식은 심각한 신경학적 장애 및 주산기 사망률의 주요 원인이다. 서유럽과 미국에서는 그 발병률이 1,000 명 생존 출생아(live birth) 중 1.5 내지2명으로 추정되며 미숙아에서 유병률이 더 높다 (Pediatr Res 2013; 74, Suppl 1, 50-72). HIE 이후의 신경 세포 사멸(Neuronal death)은 프로그램된 세포 사멸 메커니즘에 의해 매개되는 세포자멸사 또는 자가소모(autophagy)에 의해 발생하거나, 또는 세포자멸사-괴사 세포 사멸 연속체에 의해 발생할 가능성이 가장 높으며(Ann Neurol 2011; 69: 743-758), 흥분독성 글루타메이트(excitotoxic glutamate)의 방출, NMDA 및 AMPA 수용체의 활성화, 세포 내 Ca2+ 과부하, 미토콘드리아 장애(mitochondrial impairment), 산화 스트레스, 카스파제 활성화(caspase activation) 및 염증을 포함하는 다수의 이벤트에 의하여 촉발된다(Lancet Neurol 2011; 10: 372-382).
의심할 여지없이, HI 상해(발작, insult)를 뒤따르는 뇌 손상은 초기 및 지연된 부상을 모두 초래하는 여러 기여 메커니즘과 경로가 있는 복잡한 과정이다(Patel, S. et al. (2014). Biochem. Soc. Trans. 42, 564-568). 따라서, 치료적 저체온증(저체온 치료, therapeutic hypothermia)에 추가되는 새로운 치료법, 현재 치료의 표준(Davidson, J. O., et al., (2015). Front. Neurol. 6.)은 신경 보호를 강화하기 위하여 시급히 필요하다. 더욱이, 저체온 치료가 중증 저산소성-허혈성 뇌병증에 대해서보다 중등증에 더 효과적이라는 증거가 있다 (Sabir, H., et al., (2012). Stroke 43, 3364-3370). 신생아 뇌 손상의 주요 병원성 요인 중 하나는 중추 및 말초 면역 체계의 활성화에 의해 유발되는 염증이라는 점의 인식이 확산되고 있다(Hagberg et al., (2015). Nat. Rev. Neurol. 11, 192-208). 면역 반응은 몇 분 안에 유발되며 상해 후 몇 주 또는 심지어 몇 달 동안 지속될 수 있다(Fleiss et al., 2015 Dev. Med. Child Neurol. 57, 17-28). 저체온증, 저산소성 허혈성 손상 후 황금 표준 개입(gold standard intervention )은 치료된 모든 갓난아이에게 유익한 것은 아니다(Bainbridge et al., 2012. Brain 136, 90-105). 신경 성장 인자(Nerve growth factor, NGF)는 그 신호 수용체(signaling receptor), trkA를 발현하는 특정 뉴런을 다양한 상해로부터 보호하는 것으로 나타났다(Holtzman et al., 1995 J. Neurosci. 15). 특히 발달 중인 뇌에서 NGF가 신경 세포를 넘어 확장되는 신경 보호 작용을 한다는 것을 나타내는 몇 가지 데이터가 있다(Fodelianaki et al., 2019 Exp. Cell Res. 377). 실제로, NGF는 갓난아이 저산소성 허혈성 뇌병증의 동물 모델에서 신경 보호적이며, 이것은 저산소성 허혈성 손상으로부터 신생아 뇌를 보호하기 위한 유망한 제제로 오랫동안 제안되어 왔다(Holtzman et al., 1996, Ann. Neurol. 39. doi:10.1002/ana.410390117).
치료적 저체온증은 중등도에서 중증의 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE)이 있는 신생아의 생존율을 개선하고 신경 발달 후유증을 줄이기 위한 치료 표준이다. 출생 후 6시간의 치료 기간 내에서 시작하여 약 72시간 동안 목표 중심 온도(target core temperature) 33.5℃로의 선택적 두부 냉각 또는 전신 냉각은 HIE가 있는 신생아의 생존과 신경학적 결과를 향상시킨다(J Pediatr 2015; 91: S78-S83). 비교적 적은 수의 전임상 연구가 여러 저체온 치료 온도를 비교하였지만, 33.5℃ 미만의 냉각은 HIE의 신생아 래트(rat) 모델에서 추가적인 신경 보호를 제공하지 않는 것으로 보이기 때문에 향후 임상 시험을 위해 상대적으로 온화한 냉각을 고려해야 한다고 최근에 제안되었다(Sci Rep 2016; 6: 23430). 저체온증은 주요 합병증과 관련이 없지만 HIE가 있는 영아의 비교적 적은 비율에게만 유익한 것으로 보인다(Int J Mol. Sci 2015; 16: 22368-22401). 특히, 치료적 저체온증에 의한 치료는 만삭(정기분만) 또는 이에 근접하게(> 1800g)에 태어난 갓난아이를 위해 현재 예약이 되며 일반적으로 특정 전문 지식과 장비를 갖춘 레퍼런스 센터(Reference Center)로 제한된다.
WO 2018087656는 비강내 투여에 의한 저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않는, 외상성 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변의 치료에 사용하기 위한 NGF 또는 NGF 유사 활성을 갖는 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Hou et al. (Chinese Journal of Primary Medicine and Pharmacy 2017;24(3):338-341)은 신생아 중등증 HIE((neonatal moderately severe HIE)의 치료를 위해 마우스 신경 성장 인자 요법과 결합된 두부 저체온증이 보호 효과가 있다고 보고한다. 상기 언급된 바와 같이, 신생아 질식의 치료에서 저체온법의 사용은 본 기술분야에서 잘 문서화되어 있다 (예를 들어, Volpe, 2001; Gunn et al, 2000 참조). 그러나, 현재까지 저체온법이 돌연변이 NGF, CHF6467의 투여와 병용될 수 있다는 교시 또는 제안은 당업계에 없었다. 또한 그러한 병용 요법이 결과적인 신경 보호 효과의 놀랍고 예상치 못한 향상으로 이어질 것이라는 제안도 없었다.
따라서, HIE의 치료를 위한 제제(agent)에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 특히, 저체온법의 효과를 향상시킬 수 있는 제제는 현재 임상 적용에 추가될 수 있는 매우 가치 있는 것이 될 수 있다.
CHF6467(hNGFp, SEQ ID No. 1)은 야생형 인간 신경 성장 인자(NGF)와 유사한 신경 영양 활성을 갖지만 그것의 통증 민감 활성(pain sensitizing activity)은 10배 낮다(Cattaneo, A. and Capsoni, S. (2019). Pharmacol. Res. 139. doi:10.1016/j.phrs.2018.10.028.).
본 발명은 포유류 대상체에서 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변(lesion)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드와 저체온법의 조합을 제공한다.
바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 20 μg/kg의 도즈로 투여된다.
바람직한 실시양태에서, 외상성 뇌 병변은 저산소성 허혈성 뇌병증이다.
바람직한 실시예에서, 포유류 대상체는 인간, 바람직하게는 상기 대상체는 신생아 또는 갓난아이 대상체 또는 미숙아 갓난아이 대상체이고, 바람직하게는 신생아 또는 갓난아이 대상체는 중등도 내지 중증의 저산소성 허혈성 뇌병증에 걸려 있다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 비강내로 투여되거나, 또는 상기 폴리펩티드는 반복적으로, 바람직하게는 1 내지 30일의 기간 동안, 바람직하게는 2 내지 14일의 기간 동안 투여된다. 반복되는 치료주기도 고안된다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 1일당 1회 내지 7회 사이에서 반복적으로 투여되거나, 또는 폴리펩티드는 한쪽 또는 양쪽 콧구멍에 투여된다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 1일 당 0.01 내지 1.00 mg의 도즈로, 바람직하게는 폴리펩티드의 도즈로 0.06 내지 0.12 mg/일, 바람직하게는 0.06 mg/일의 도즈로 투여된다.
바람직하게는 0.06mg/일의 양은 체중이 약 3kg인 신생아 또는 갓 난아이를 위한 것이다.
특히 체중이 더 높은 대상체에게 바람직한 용량(도즈)은 3 내지 333 μg/kg이다.
바람직한 용량은 약 20 μg/kg 내지 약 40 μg/kg, 바람직하게는 20 μg/kg이다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드가 반복적으로 투여되는 경우, 각 용량은 1일 당 0.01 내지 1.00 mg이고, 바람직하게는 폴리펩티드의 각 용량은 0.06 내지 0.12 mg/일이며, 바람직하게는 각 용량은 0.06 mg/일이다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 뇌 병변 발생 후 약 1시간 내지 24시간 이내에 투여된다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 아세테이트 버퍼 및/또는 메티오닌을 포함하는 조성물에 포함된다.
바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 저체온증(저체온법, 저체온을 이용한 치료법)과 동시에 및/또는 저체온법 후 24시간 이내에 투여된다.
바람직한 실시예에서, 저체온법은 저산소성 허혈성(HI) 상해 후 1시간 내지 10시간 이내에 개시되어야 하고, 바람직하게는 저체온법은 저산소성 허혈성(HI) 상해 후 2시간 내지 8시간 이내에 개시되어야 하며, 바람직하게는 저체온법은 저산소성 허혈성(HI) 상해 후 4시간 내지 6시간 이내에 개시되어야 한다.
바람직한 실시예에서, 저체온법은 저산소성 허혈성 (HI) 상해 후 약 1 내지 약 72 시간, 바람직하게는 적어도 약 4 시간, 더욱 바람직하게는 적어도 약 6 시간, 더욱 바람직하게는 저산소성 허혈성 (HI) 상해 후 적어도 약 12 시간의 기간 동안 유지되어야 한다.
바람직하게는, 저체온법은 출생 후 적어도 약 4시간, 더욱 바람직하게는 적어도 약 6시간 또는 12시간의 기간 동안 유지된다.
바람직한 실시예에서, 포유동물의 온도(체온)는 약 32℃ 내지 약 36℃, 바람직하게는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도로 유지되어야 한다.
본 발명의 또 다른 태양은 다음에 의하여, 이를 필요로 하는 포유동물에서 신생아 질식을 치료하는 것에 관한 것이다:
(a) 분만 전 및/또는 분만 중에 포유동물의 어미에게 치료 유효량(therapeutically effective amount)의 CHF6467을 투여하는 단계; 그리고
(b) 출생 후 포유동물을 저체온증에 있게 하는 것.
저체온증은 온도가 체온(body temperature) 아래로 표류하고 의도적으로 체온을 유지하지 못하게 함으로써 수동적으로 생성될 수 있다. 신생아는 변온성(poikilothermic)이기 때문에 자신의 주변의 온도를 빠르게 가지게 된다(assume). 대안적으로, 환자는 의도적으로 자신의 주변 온도를 낮춤으로써 능동적으로 저체온증이 될 수 있다.
본 발명의 추가의 태양은 다음을 통해 이를 필요로 하는 포유동물에서 신생아 질식을 치료하는 것에 관한 것이다.
(a) 포유동물에 CHF6467의 치료적 유효량을 투여하는 단계; 그리고
(b) 포유동물을 저체온증 또는 저체온 상태에 노출시키는 것.
바람직한 실시예에서, 포유동물은 출생 후 최초 4주 이내의 갓난아이 대상체이다. 보다 바람직하게는, 포유동물은 생후 첫 2주, 보다 더욱 바람직하게는 생후 첫 주에 있다.
바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본 발명의 제2 태양에 대한 바람직한 실시예는 제1 태양에 대하여 전술한 것과 동일하다.
본 발명의 또 다른 태양은 저체온법과 결합하여, 포유동물에게 치료적 유효량의 크세논을 투여함으로써 이를 필요로 하는 포유동물에서 신생아 질식을 치료하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 신생아 질식 치료를 위한 약제의 제조에 CHF6467를 사용하는 것에 관한 것으로서, 상기 치료는 CHF6467을 저체온법과 결합하여 대상체에게 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 신생아 질식의 치료를 위하여, 저체온법과 함께, CHF6467을 사용하는 것에 대한 것이다.
포유류 대상체에서 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조합의 바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 0.06 내지 0.12 mg/일의 용량(도즈)으로 투여되고, 포유동물의 온도는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도로 유지되어야 한다.
포유류 대상체에서 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조합의 바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 약 20 μg/kg 내지 40 μg/kg의 용량으로 투여되고, 포유동물의 온도는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도로 유지되어야 한다.
첨부한 도면 및 비제한적인 예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시적으로 설명한다.
도 1은 CA1 해마 시냅스에서 베이스라인 전달(기저 전달, baseline transmission)에 대한 CHF6467의 효과를 보여준다. 도 2는 CHF6467은 OGD(예방 설정)에 의해 유발된 우울증을 되돌린 것을 보여준다. 정규화된 통합 데이터(Normalized pooled data)는 필드 흥분성 시냅스 후 전위(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)에 대한 OGD의 효과와 OGD 동안 다양한 농도(0.03 및 0.1μg/mL)에서 관류된(perfused) CHF6467의 보호 효과를 보여준다.
도 3은 OGD에 의해 유발된 EPSC 우울증이 CHF6467 관류(치료 설정)에 의해 회복되는 것을 보여준다. 패널 A는 단독의 OGD (닫힌 원) 및 OGD + CHF6467 (열린 원) 이후의 정규화된 EPSC 데이터의 시간 경과를 보여준다. 히스토그램은 OGD 및 OGD + CHF6467 이후 기록의 마지막 10분의 평균 정규화된 EPSC 데이터를 보여준다. 패널 B는 CHF6467이 OGD가 없는 상태에서 베이스라인 전달에 어떠한 변화도 유발하지 않는다는 것을 보여준다.
도 4는 OGD에 대한 저체온법과 CHF6467의 시너지 효과를 보여준다. 15분의 OGD 기간 후 관류된 CHF6467과 저체온법의 시너지 효과를 보여주는 정규화된 통합 데이터.
도 5는 신생아 저산소성-허혈성 뇌병증의 래트 모델의 실험 프로토콜의 다이어그램을 보여준다. TTC = 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride).
도 6은 생후 10일에 저산소성 허혈성 손상 72시간 후 어린 래트의 Log 변환된 뇌경색 부피에 미치는, 비강내 CHF6467(20 및 40μg/kg) 단독 및 저체온법과 결합될 때의 영향을 보여준다. 동물의 수는 각 열 위에 표시된다.
도 7(도 7a, 도 7b, 도 7c)은 가짜 수술된(sham-operated), 비히클 처리된(vehicle-treated) 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE), CHF6467, 20ug/kg로 치료된 HIE(HIE+CHF 20ug/ml)에서의, 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO)에서의, CHF6467 및 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO+CHF)에서의 래트 시토카인 및 케모카인의 패널의 해마 mRNA 수준을 보여준다. 표준 오차 평균(SEM)± 평균의 산점도(Scatter plot). ** p <0.01 및 * p<0.05 대 HIE.
도 8(도 8a, 도 8b, 도 8c)은 가짜 수술, 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE), CHF6467, 20ug/kg로 치료된 HIE(HIE+CHF 20ug/ml), 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO), CHF6467 및 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO+CHF)에서의 래트 시토카인 및 케모카인의 패널의 피질 mRNA 수준(cortical mRNA level)을 보여준다. 표준 오차 평균(SEM)± 평균의 산점도. ** p<0.01 및 * p<0.05 대 HIE.
도 9는 치료군별 평균 log10 변환 뇌경색 부피(mean log10-transformed brain infarcted volume)의 통계 분석을 보여준다.
도 10은 SSSHPIFHR (SEQ ID No. 2) 펩티드의 정량화에 의해 결정된 대조군 어린 래트에서 비강내 투여 후 CHF6467뇌 침투를 보여준다.
도 11은 저산소성 허혈성 손상에 노출된 어린 래트에서 비강내 투여 후 CHF6467 뇌 침투를 보여준다. 상이한 래트 뇌 영역에서 CHF6467 특이적 펩티드 SSSHPIFHR (SEQ ID No. 2) (A) 및 QAAWEFIR (SEQ ID No. 3) (B) 및 비특이적 펩티드 QYFFETK (SEQ ID No. 4)(C)의 L/H 비 (light to heavy ratio).
도 3은 OGD에 의해 유발된 EPSC 우울증이 CHF6467 관류(치료 설정)에 의해 회복되는 것을 보여준다. 패널 A는 단독의 OGD (닫힌 원) 및 OGD + CHF6467 (열린 원) 이후의 정규화된 EPSC 데이터의 시간 경과를 보여준다. 히스토그램은 OGD 및 OGD + CHF6467 이후 기록의 마지막 10분의 평균 정규화된 EPSC 데이터를 보여준다. 패널 B는 CHF6467이 OGD가 없는 상태에서 베이스라인 전달에 어떠한 변화도 유발하지 않는다는 것을 보여준다.
도 4는 OGD에 대한 저체온법과 CHF6467의 시너지 효과를 보여준다. 15분의 OGD 기간 후 관류된 CHF6467과 저체온법의 시너지 효과를 보여주는 정규화된 통합 데이터.
도 5는 신생아 저산소성-허혈성 뇌병증의 래트 모델의 실험 프로토콜의 다이어그램을 보여준다. TTC = 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride).
도 6은 생후 10일에 저산소성 허혈성 손상 72시간 후 어린 래트의 Log 변환된 뇌경색 부피에 미치는, 비강내 CHF6467(20 및 40μg/kg) 단독 및 저체온법과 결합될 때의 영향을 보여준다. 동물의 수는 각 열 위에 표시된다.
도 7(도 7a, 도 7b, 도 7c)은 가짜 수술된(sham-operated), 비히클 처리된(vehicle-treated) 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE), CHF6467, 20ug/kg로 치료된 HIE(HIE+CHF 20ug/ml)에서의, 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO)에서의, CHF6467 및 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO+CHF)에서의 래트 시토카인 및 케모카인의 패널의 해마 mRNA 수준을 보여준다. 표준 오차 평균(SEM)± 평균의 산점도(Scatter plot). ** p <0.01 및 * p<0.05 대 HIE.
도 8(도 8a, 도 8b, 도 8c)은 가짜 수술, 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE), CHF6467, 20ug/kg로 치료된 HIE(HIE+CHF 20ug/ml), 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO), CHF6467 및 저체온법으로 치료된 HIE(HIE+IPO+CHF)에서의 래트 시토카인 및 케모카인의 패널의 피질 mRNA 수준(cortical mRNA level)을 보여준다. 표준 오차 평균(SEM)± 평균의 산점도. ** p<0.01 및 * p<0.05 대 HIE.
도 9는 치료군별 평균 log10 변환 뇌경색 부피(mean log10-transformed brain infarcted volume)의 통계 분석을 보여준다.
도 10은 SSSHPIFHR (SEQ ID No. 2) 펩티드의 정량화에 의해 결정된 대조군 어린 래트에서 비강내 투여 후 CHF6467뇌 침투를 보여준다.
도 11은 저산소성 허혈성 손상에 노출된 어린 래트에서 비강내 투여 후 CHF6467 뇌 침투를 보여준다. 상이한 래트 뇌 영역에서 CHF6467 특이적 펩티드 SSSHPIFHR (SEQ ID No. 2) (A) 및 QAAWEFIR (SEQ ID No. 3) (B) 및 비특이적 펩티드 QYFFETK (SEQ ID No. 4)(C)의 L/H 비 (light to heavy ratio).
CH6467 또는 SEQ ID No. 1의 폴리펩티드의 신경 보호 효과는 저산소성-허혈성 뇌병증(HIE)의 실험 모델에서 인비트로(in vitro)와 인비보(in vivo)를 사용하여 연구되었다. 저산소성 허혈성 뇌 손상의 확립된 인비트로 모델인, 산소-포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation, OGD)을 겪고 있는 급성 해마 절편에서, CHF6467은 비정상적인 흥분성 시냅스 후 전류(EPSC)를 유의하게(의미가 있게) 약화시켰다. 예기치 않게, CHF6467과 저체온증(저체온법, hypothermia)의 조합(combination)은 비정상적인 EPSC를 완전히 역전시켰다(도 4). 신생아 저산소성-허혈성 뇌병증의 확립된 모델인, 저산소증이 뒤따르는 영구적인 좌측 총경동맥 폐색(permanent left common carotid artery occlusion)을 겪는 신생아 래트에서, CHF6467(20 및 40 μg/kg)의 비강내 투여는 비히클 처리된 동물에 비해 경색된 뇌의 부피를 유의하게 감소시켰다. 놀랍게도, CHF6467과 저체온법의 조합은 정상체온(normothermia)에서 비히클 처리 동물에 비해 경색된 뇌의 부피를 86% 만큼 극적으로 감소시켰다. 예상외로, CHF6467과 저체온법의 조합의 신경보호 효과는 시너지 효과를 나타내는 단일 제제/작용(CHF6467 또는 저체온법) 단독의 신경보호 효과보다 훨씬 컸다(도 6). 특히, 생체 내에서 CHF6467의 바람직한 용량(20 μg/kg)의 효과는 신경 보호를 제공하는 데 있어 저체온법과 시너지 효과를 냈다. CHF6467 치료에서 사망률, 임상 징후 또는 체중 감소는 관찰되지 않았으며, 이는 CHF6467이 관용성(tolerance)이 우수하게 나타남을 시사한다.
이어서, 본 발명은 뇌손상, 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변, 바람직하게는 저산소성 허혈성 뇌병증의 치료에 CHF6467과 저체온법을 조합하여 사용하는 것을 제공한다. 특히, CHF6467과 저체온법의 조합은 중등도 내지 중증의 저산소성 허혈성 뇌병증이 있는 영아 및 신생아에서 저체온법만의 경우에 비해, 특히 적절한 용량이 고려될 때, 본원의 아래 실험 부분에 보고된 바와 같이, 사망률 및 중증 신경 발달 장애를 유의미하게 감소시킬 수 있다.
또한, 저산소성 허혈성 뇌 손상을 입은 래트 새끼의 피질과 해마에 있는 신경염증 마커의 패널에 대한 CHF6467의 단독 또는 저체온법과의 병용의 조절 효과도 조사되었다.
해마와 전두두정 피질에서 여러 시토카인 및 케모카인의 mRNA 수준의 뚜렷한 증가는 가짜 수술 래트와 비교하여 저산소성 허혈성 손상을 겪은 래트에서 측정되었다. CHF6467(20ug/kg, 비강내)은 저산소성 허혈성 손상에 노출된 래트의 해마 영역에서 여러 신경염증 마커의 상향 조절에 유의미하게 대응(counteract)한 반면 저체온법 자체는 CHF6467만큼 효과적이지 않았다. 피질에서 CHF6467(20ug/kg) 자체는 저산소성 허혈성 손상에 의해 유발된 일부 신경염증 마커 상향 조절에 대응하는 데 효과적이었고 이러한 효과는 일부 경우에 따라 저체온법과의 조합에 의해 증가되었다.
본원에 인용된 각각의 참고문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업자의 명세서, 지침, 프리젠테이션 등을 포함)은, 이상의 기재 또는 이하의 기재이던 간에, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명이 특정 교시 보다 선행할 자격이 없다는 점을 인정하는 것으로서 그리고/또는 일반적인 통상 지식 이외의 특정 참고문헌이 이것이 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있을 만큼 충분히 명확하고 완전한 정보를 포함하고 있다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
표현 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, "및", "또는" 및 두 가지 의미 모두("및" 또는 "또는")의 명시적인 기재를 제공하는 것으로 받아들여져야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 특정되지 않는 한, 용어 "약(about)", "대략(ca.)" 및 "실질적으로(substantially)"는 모두 대략 또는 거의를 의미하며, 본원에 제시된 수치 또는 범위의 맥락에서 바람직하게는 +/- 10%, 더욱 바람직하게는 +/- 5%, 언급되거나 청구된 수치 또는 범위의 근사범위(around)를 가리킨다.
달리 명백하게 특정되지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 본 명세서의 문맥에서 "포함하는"에 의해 도입된 리스트의 구성원(member)에 더하여 추가의 구성원이 선택적으로 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 본 발명의 특정 실시예로서는 용어 "포함하는"은 더 이상의 구성원이 존재하지 않을 가능성을 내포하는 것으로 의도되며, 즉 해당 실시예의 목적을 위해서는 "포함하는"은 "구성되는(consisting of)"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
달리 명백하게 특정되지 않는 한, 본 발명에 관한 상대적인 양의 모든 표시는 중량/중량 기준으로 이루어진다. 일반적인 용어에 의해 규정(characterization)되는 구성요소의 상대적인 양의 표시는 상기 일반적인 용어에 의해 커버되는 모든 특정 변형 형태 또는 구성원의 전체 양을 지칭하는 것을 의미한다. 일반적인 용어에 의해 정의되는 특정 구성요소가 특정 상대량으로 존재하는 것으로 특정되고, 이 구성요소가 일반적인 용어에 의해 커버되는 특정 변형 형태 또는 구성원인 것으로 추가적으로 특징지어지는 경우, 상기 일반적인 용어에 의해 커버되는 구성요소의 전체 상대량이 특정된 상대량을 초과하도록 상기 일반적인 용어에 의해 커버되는 다른 변형 형태 또는 구성원이 추가적으로 존재하지 않음을 의미한다; 보다 바람직하게는 상기 일반적인 용어에 의해 커버되는 다른 변형 형태 또는 구성원은 전혀 존재하지 않는다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 신경 성장 인자(nerve growth factor) 라는 용어는 야생형 NGF만을 의미하며 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드를 포함하지 않다.
용어 "NGF 뮤테인(NGF mutein)" 및 용어 "NGF의 뮤테인(mutein of NGF)" 또는 NGF와 관련하여 "이의 뮤테인"은, 본원에서 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 야생형 NGF와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 특징으로 하는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드는 NGF의 뮤테인이다. 이는 임의의 종, 바람직하게는 포유류 종을 지칭한다; 그러나, 인간 NGF 뮤테인이 항상 바람직하다. 바람직하게는 NGF의 뮤테인은 NGF, 특히 인간 NGF와 80 내지 99.5%의 서열 동일성(sequence identity)을 가지며, 더욱 바람직하게는 뮤테인은 NGF, 특히 인간 NGF와 90 내지 99%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "저체온법(저체온증, hypothermia)"은 예를 들어, 수동적 또는 능동적 기술을 통해 체온을, 바람직하게는 3 내지5℃만큼 낮춤으로써 특정 대상체(예를 들어 신생아 대상체)를 저체온 상태에 있게 하는 것을 지칭한다. 바람직한 저체온법 온도는 32℃ 내지 36℃ 사이, 바람직하게는 32℃ 내지 35℃ 사이에 있으며, 바람직하게는 32℃ 또는 33℃이다.
본원에 사용된 바와 같이, "동시에(simultaneously)"는 CHF6467이 저체온법과 같은 시점(concurrently)에 적용/투여되는 것을 의미하는 데 사용되는 반면, 용어 "병용, 조합(in combination)"은 CHF6467이 동시에가 아니라면, 그럼 순차적으로(sequentially), CHF6467 및 저체온증 둘 다 치료 효과를 나타내는 시간 프레임 내에, 즉 이들이 둘 다 동일한 시간 프레임 내에서 치료적으로 작용할 수 있는 시간 프레임 내에서 투여되는 것을 의미하는 데 사용된다. 따라서, "순차적으로" 투여하는 것은, CHF6467의 순환 반감기(circulatory half-life) 또는 타켓 조직 체류 시간(target tissue residence time)은 이것이 신생아 대상체가 저체온 상태에 노출될 때 치료적으로 유효한 양으로 존재하는 전제에서, CHF6467이 저체온법 전 또는 후로, 5분, 10분 또는 몇 시간 내에 투여되는 것을 허용할 수 있다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로, 특히 본원에 기재된 바와 같이 안과 장애를 특징으로 하는 환자/대상체와 관련하여 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "예방"은 광범위하게 이해되어야 하며, 뇌손상의 발병의 예방뿐만 아니라, 뇌손상의 진행의 예방을 포함한다. 특히, 뇌의 장애 및/또는 손상을 수반하는 장애의 맥락에서, 용어 "예방은" 또한 뇌 손상의 추가 진행의 예방을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "치료"는 광범위하게 이해되어야 하며, 장애의 증상의 개선을 제한 없이 포함한다.
본 발명에 따르면, "유효량(effective amount)"은 단독으로 또는 추가 도즈와 함께, 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양 또는 도즈이다.
용어 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 특정 물질이, 작용제와 임의로 그리고 바람직하게는 조합하여, 사용된 도즈에서 상기 작용제가 과도한 역효과를 유발하지 않고, 대상체에 투여될 수 있는 것을 일반적으로 가리킨다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 생리학적으로 호환가능(physiologically compatible)하고, 본원에 기재된 바와 같이 대상에게 투여하기에 적합하거나, 또는 이러한 투여를 달리 방해하지 않는 용매(solvent), 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등 중 어느 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 제한 없이 물, 식염수, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 덱스트로오스(dextrose), 글리세롤, 에탄올, 폴리소르베이트 80(polyorbate 80) 등 중 어느 하나 이상, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 특히 액체 약학 조성물의 경우, 등장성제(isotonic agent), 예를 들어, 당(sugar), 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화 나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 습윤제(wetting agent) 또는 유화제(emulsifying agent), 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 제제의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킨다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 본 발명에 따른 조성물에 포함된다.
용어 "약제학적 활성제(pharmaceutically active agent)"는 대상체에게 투여할 때 사용될 수 있는 제제(작용제, agent)를 지칭하며, 여기서 제제는 예를 들어, 질환 또는 장애의 증상을 개선시키는데 도움이 될 것이다. 또한, "약제학적 활성제"는 치료적 유효량으로 대상체에게 투여될 때 대상체의 상태 또는 질환 상태에 대해 긍정적 또는 유리한 효과를 가질 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 활성제는 치유적 특성을 가지며, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개선, 경감, 완화, 역전, 발병 지연 또는 중증도를 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 약제학적 활성제는 예방적 특성을 가질 수 있고, 질환의 발병을 지연시키거나 이러한 질환 또는 병리학적 상태의 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작용제는 청구된 바와 같은 낭포성 섬유증을 치료하기 위한 약제학적 활성 성분으로서 본원에서 고려된다. 또 다른 예에서, 약제학적 활성 단백질은 단백질을 정상적으로 발현하지 않거나, 원하는 수준으로 발현하지 않거나, 단백질을 잘못 발현하는 세포 또는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, 약제학적 활성 단백질은 바람직한 단백질을 공급함으로써 돌연변이를 보상하거나, 또는 충분히 높은 발현의 결여를 보상할 수 있다. 용어 "약제학적 활성 펩티드 또는 단백질(pharmaceutically active peptide or protein)"은 전체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며, 또한 이의 약제학적 활성 단편(pharmaceutically active fragment)을 지칭할 수 있다. 또한 펩티드 단백질의 약제학적 활성 유사체(pharmaceutically active analog)를 또한 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체(subject)" 및 "환자"는 포유동물에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 가축화된 동물(domesticated animal), 마우스(mouse), 래트(rat), 토끼 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 실험 동물(laboratory animal), 뿐만 아니라 동물원의 동물과 같은 사육 상태의 동물이다. 본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 특히 인간을 포함한다. 대상체(인간 또는 동물)는 두 세트의 염색체를 가지고 있다. 즉, 대상체는 이배체(diploid)이다. 용어 "환자"는 병태(condition)를 앓고 있거나, 병태를 앓을 위험이 있거나, 병태를 앓았거나, 병태를 앓을 것으로 예상되거나, 예를 들어 작용제의 투여에 의해 요법을 받을 수 있는 대상체를 의미한다. 환자의 상태(병태)는 만성 및/또는 급성일 수 있다. 따라서, "환자"는 또한 요법을 받거나 그리고/또는 요법을 필요로 하는 대상체로서 설명될 수 있다.
용어 "요법(therapy)"은 광범위하게 이해되어야 하며, 대상체에서 병태를 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 하는 대상체의 치료를 지칭한다. 바람직한 실시예에서, 요법은 구체적으로 대상체에게 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 "서열번호 1의 폴리펩티드(polypeptide of SEQ ID NO: 1)"라고도 지칭되는 본 발명에 따른 제제(agent, 작용제)가 이제 보다 상세히 설명된다. 용어 "서열번호 1의 폴리펩티드" 및 유사 용어는 본원에서 서열번호 1로 정의된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 동등한 생물학적 활성을 갖는 작용제를 나타낸다. 따라서, 이러한 용어 내에는 이러한 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 부분 또는 유사체도 또한 포함된다. 폴리펩티드의 생물학적으로 동등한 부분의 한 예는 서열번호 1의 폴리펩티드의 도메인 또는 서브서열일 수 있으며, 이는 상기 도메인 또는 서브서열이 서열번호 1의 전장 폴리펩티드(full-length polypeptide 와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 발휘할 수 있게 하는 결합 부위 또는 대안적으로 이러한 폴리펩티드를 위한 유전자 코딩(gene coding)을 포함한다. 용어 "실질적으로 동일한 생물학적 활성"은 실시예 1-3에 기재된 분석에서 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 갖는 등가 부분 또는 유사체 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 생물학적으로 동등한 유사체의 예는 서열번호 1의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)일 수 있지만, 그러나 또한 폴리펩티드의 상동성 유사체(homologous analogue)일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 폴리펩티드의 특이적 생물학적 활성을 모방하는 완전히 합성된 분자는 "생물학적으로 동등한 유사체"를 구성할 것이다.
보다 바람직하게는, 용어 "서열번호 1의 폴리펩티드" 및 유사용어는 서열번호 1로 정의된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 본원에서 나타내고; 선택적으로, 이러한 작용제는 그 중에서도 서열번호 1에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이다. 가장 바람직하게는, 용어 "서열번호 1의 폴리펩티드" 및 유사한 용어는 본원에서 서열번호 1로 정의된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 나타내고; 이 실시예에서, 작용제는 서열번호 1에 의해 정의된 바와 같은 순차적 순서(sequential order)로 118개의 아미노산 잔기(amino acid residue)로 구성된 폴리펩티드로 구성된다. 본 실시예 및 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 선택적으로 1개 또는 2개 또는 3개의 내부 시스테인 결합(internal cysteine bond)을 가지며(carry), 따라서, 시스테인 (Cys, C) 잔기가 서로 공유적으로 연결(covalently linked)되어 분자내 디설파이드 브리지(intramolecular disulfide bridge)를 형성한다. 상기 시스테인 결합은 바람직하게는 야생형 인간 NGF에서의 결합과 동등하다.
본 발명의 폴리펩티드는 선택적으로 추가의 번역후 변형(further post-translational modification)을 특징으로 할 수 있다. 이러한 번역후 변형은 선택적으로 글리코실화(glycosylation) 및/또는 인산화(phosphorylation)를 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 글리코실화 및/또는 인산화가 없다. 실제로, 본원의 실험 예가 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변(저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 치유에 대한 유익한 효과를 보인다는 것과 도움이 되는 유익 대 부작용 비율과, 이로써 사용된 폴리펩티드는 박테리아에서 사이토실 재조합 발현(cytosolic recombinant expression)에 의해 얻어졌으며, 이는 전형적으로 글리코실화 및/또는 인산화를 초래하지 않음을 고려하면, 본 발명의 유익한 효과는 이러한 유형의 번역후 변형에 의존하지 않는다는 것이 타당하다.
전형적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 폴리펩티드가 투여되는 대상체에 의해 자연적으로 생성되지 않는 비천연 폴리펩티드이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 분리된 폴리펩티드(isolated polypeptide)이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본질적으로 숙주 세포 단백질, 분해 생성물 (예를 들어 데스-노나 변이체(des-nona variant) 등) 및 프로테아제 (예를 들어 트립신 등)를 함유하지 않는다. 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주 세포 단백질을 본질적으로 함유하지 않는 경우, 분해 생성물 (예를 들어 데스-노나 변이체 등) 및 프로테아제 (예를 들어 트립신 등)는 또한 "순수한 폴리펩티드"로 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 순수한 폴리펩티드로서 투여된다. 보다 바람직하게는, 서열번호 1 1로 이루어진 순수 폴리펩티드는 조성물에서 총 단백질에 대하여 중량 백분율이 90% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.2% 이상, 보다 바람직하게는 99.4% 이상, 보다 바람직하게는 99.6% 이상, 보다 바람직하게는 99.8% 이상, 보다 바람직하게는 99.9% 이상이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 순수 폴리펩티드는 우수제조관리기준(Good manufacturing practice, GMP)과 양립할 수 있는 순도 등급을 갖는다.
서열번호 1로 이루어진 폴리펩티드는, 인간 신경 성장 인자(NGF, 야생형 인간 NGF 또는 야생형 NGF로도 지칭됨)의 아미노산 서열과 2개 위치에서 상이하다. 야생형 폴리펩티드에 대하여 본 발명에 따른 폴리펩티드의 차이는 본원에 상세히 개시되고 본원의 실험예에 의해 뒷받침되는 바와 같이 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변(저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 치료 또는 예방에 현저한 효과를 갖고, 부작용이 없다.
인간 NGF의 여러 돌연변이(hNGF 돌연변이, hNGF mutant) 중에서, 돌연변이 인간 NGF P61SR100E는 뇌손상 치료에 가장 유망한 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명에 따른 치료 및/또는 예방의 구체적인 용도는 이들 참고문헌에 개시되어 있지 않으며, 이들 참고문헌은 또한 각각의 폴리펩티드를 인간에서 그의 의학적 이용을 가능하게 할 만큼 충분히 높은 순도로 이용가능하게 하는 데 실패했다. 따라서, 본원에 기재되고 제공된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 야생형 인간 NGF에 비해 몇 가지 예상치 못한 이점을 제공한다. 본 발명에 따른 제제의 투여는 뇌경색 부피의 감소를 가져오며(예를 들어 실시예 2 참조), 이러한 투여는 통증과 관련되지 않는다.
서열번호 1의 폴리펩티드는 자연계에서 발견되지 않으며, 또한 비 천연 폴리펩티드로서 지칭될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 작용제는 야생형 NGF가 아니며, 특히 야생형 인간 NGF가 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 비천연 폴리펩티드는 고순도로 제공된다. 선택적으로, 폴리펩티드는 수성 매질(aqueous medium)에 용해된다.
바람직하게는, 치료 및/또는 예방은 폴리펩티드가 투여되거나 투여되었던 대상체에서 부작용 또는 역효과를 일으키지 않는다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 포유류 대상체에서 임의의 바람직하지 않은 효과를 야기하지 않는다.
이러한 맥락에서 존재하지 않는 것이 바람직한 한 가지 부작용 또는 역효과는 통각과민(hyperalgesia) 또는 통증이다. 본 발명에 따른 치료 및/또는 예방이 포유류 대상체에서 통각과민을 유발하지 않는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에 따른 제제(작용제)의 투여는 어떠한 통각과민 증후군(hyperalgesic syndrome, 통증)을 유발하지 않는다.
통증의 부재는 통증과 관련된 기준 화합물 (예: 야생형 NGF)의 투여보다 더 쾌적한 (또는 덜 불쾌한) 치료를 가능하게할뿐만 아니라 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변(그러한 저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 한정되지 않음)의 치료 또는 예방의 성공에 적어도 부분적으로 원인이 된다는 점을 지적하는 것이 중요하다. 본 발명에 따른 폴리펩티드가 바람직하게는 비강으로(nasally) 투여된다는 것을 고려할 때, 통증의 부재는 치료 대상체가 통증을 피하기 위해 폴리펩티드를 긁어내거나 씻어내거나 또는 달리 이를 제거하는 것과 같은 부정적 반작용 없이 폴리펩티드의 투여를 받아들일 수 있게 하고, 그 결과로서, 상기 폴리펩티드는 저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 한정되지 않는 뇌 손상, 특히 허혈성 뇌 병변의 치료 또는 예방과 같은 치료적으로 유익한 효과를 발휘할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드와 관련된 통증의 부재는 소비자 간병인의 거부감 및 규제 당국의 우려를 극복하기에 적합할 것이다. 즉, 통증의 부재는 통증과 관련된 제제에 비해 이익 대 위험 비율의 상당한 증가와 관련이 있다.
특히, 바람직하게는, 이러한 치료 및/또는 예방은 포유류 대상체에서 통각과민을 유발하지 않는다. 한 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드가 투여되는 대상체는 기계적 무해자극통증(allodynia)을 앓지 않는다. 보다 정확하게는, 기계적 무해자극통증은 본 발명의 폴리펩티드가 투여되는 대상체에서 유발되지 않으며, 따라서 폴리펩티드가 투여되는 대상체는 기계적 무해자극통증을 겪지 않는다.
통상적으로, 본 발명에 따른 작용제의 투여는 대상체에 의해 잘 용인된다. 특히, 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 투여는 대상체에서 약물 중화 항약물 항체(drug-neutralising anti-drug antibody)의 형성과 관련되지 않는다. 실제로, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열은 야생형 인간 NGF와 단지 2개의 아미노산 위치에서만 상이하기 때문에, 인간에서 면역학적 내성(immunological tolerability)이 특히 유리하다는 것이 이치에 맞고, 본 발명의 폴리펩티드의 투여가 인간에서 항-약물 항체의 형성과 관련되지 않는다는 것이 이치에 맞다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 투여는 다음 중 하나 이상에 긍정적인 영향을 미친다: 염증, 신경 분포(innervation) 및 혈관신생(angiogenesis).
본 발명에 따른 병리는 일반적으로 뉴런 간 연결의 기계적 및/또는 병리학적 파괴 (예를 들어 퇴행성) 및 이러한 파괴에 의해 영향을 받는 부위의 뉴런, 신경교 세포(glial cell) 및 선택적으로 또한 혈관 조직(도관 조직, vascular tissue)의 사멸을 특징으로 하는 병리이다. 본 명세서에 따른 병리 또는 병태의 비제한적인 예는 중추신경계를 수반하는 외상성 사건으로부터 유래하는 병리/병태, 예컨대 뇌 손상 또는 외상성 뇌 손상 (traumatic brain injury, TBI) 또는 그와 관련되거나 이로부터 직접 유래된 병리/병태, 예컨대 저산소성/허혈성 뇌 손상 (hypoxic/ischemic brain injury, HIBI), 또는 바람직하게는 특히 신생아 환자에서 저산소성 허혈성 뇌병증 (HIE), 영아 뇌 마비(infantile cerebral paralysis) 또는 기계적 외상 또는 뇌 저산소증/허혈로 인한 기타 병리/상태에 의해 구성된다.
저산소성/허혈성 뇌병증(1차 또는 2차 손상), 주산기 손상(perinatal damage), 영아 뇌 마비, 뇌 동맥류 파열(brain aneurysm rupture), 뇌 동정맥 기형(brain arteriovenous malformation), 및 뇌동 혈전증(brain sinus thrombosis) 등 다양한 유형의 뇌 허혈로 인한 뇌 손상과 같은 손상도 또한 포함된다.
본 발명에 따르면, 혈관/순환계의 변화에 의해 야기된 병리는, 예를 들어, 외상성 손상을 포함하는 저산소성 허혈성 증후군; 출혈성 부상(hemorrhagic injury); 죽상 경화성 손상(atherosclerotic injury); 심장 관련 부상(cardiogenic injury); 고혈압 부상을 포함한다.
본 발명에 따르면, 수막염/뇌염 등과 같은 감염성 원인으로 인한 염증성 손상에 의한 병리(진균성, 박테리아성, 바이러스성, 프리온성(prionic) 또는 기타 병인에 관계없이)가 또한 포함된다.
소아 수준에서, 이러한 병리는, 예를 들어, 태아 및/또는 신생아 저산소증/질식; 주요 두부 외상; 급성 뇌출혈, 중독 (일산화탄소, 시안화물); 뇌동 혈전증; 응고 인자 결핍; 또는 유전 질환을 포함한다.
본 발명에 따르면, 서열번호 1의 폴리펩티드는 이러한 투여를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 투여를 필요로 하는 대상체는 본원에 기재된 장애를 앓고 있는 대상체, 이러한 장애를 앓을 위험이 있는 대상체, 또는 기타 이러한 장애로 고통받는 대상체일 수 있다. 상기 작용제는 치료적 유효량으로 대상체에게 투여된다. 치료적 유효량은 본원의 개시내용을 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 포유류 대상체에게 투여된다. 대상체는 또한 "환자"로 지칭될 수 있다. 가장 바람직하게는, 포유류 대상체는 인간이다.
대상체는 출생 시점부터 12주까지의 아기로 정의되는 갓난아이(newborn)일 수 있으며, 신생아(neotate)는 출생 시점부터 4주까지의 아기로 정의된다. 갓난아이 및 신생아의 치료가 본 발명에서 고려된다. 미숙아(premature)는 만삭(full term of gestation )이 끝나기 전에 태어난 아기이고, 조산아(preterm baby)는 만삭 3주 넘게 먼저 태어난 아기이다.
본 발명의 맥락에서, 예컨대 뇌 경색의 (부분적) 감소 또는 다른 병태 또는 장애의 다른 호전 또는 개선과 같은 뇌 손상을 예방하는 것이 본원에 청구된 바와 같이 본 발명의 바람직한 일체적 부분인 것이 바람직하고 또한 본원의 실험 예에 의해 입증된다. 실제로, 청구된 치료 효과를 달성하는 것이 본 발명의 기능적 기술적 특징이다. 본원의 실시예는 상기 기능적 기술적 특징이 본 발명의 폴리펩티드의 투여의 직접적인 결과로서 달성 가능한 것이 현실화되게 만든다. 즉, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드가 뇌 손상을 앓고 있는 대상체에 있어서, 특히 저체온법과 조합하여 개선을 달성하는 원인이 된다는 것을 확인하였다. 뇌 손상은 바람직하게는 뇌의 훼손 및/또는 장애 또는 기능 장애를 특징으로 한다.
특히, 뇌로의 투여는 비강(nasal cavity)의 독특한 해부학적 관계 및 기능을 이용함으로써 수행될 수 있다. 상부 전비강의 체판(cribriform plate)의 영역에 적용된 치료 물질 (생물학적 제제 포함)은 후각 신경을 두개골에서 비강으로 들어가게 하는 천공을 통해 중추 신경계에 접근할 수 있다는 것이 오랫동안 인정되어 왔다. 또한, 신경 조직에 의해 흡수되고 축삭 돌기(axonal projection)를 따라 운반될 수 있는 모든 약물의 경우, 후각 신경 자체와 삼차 신경(trigeminal nerve)의 관련 비강 가지(branch)를 통하는 보충적 경로가 존재하며, 이를 통해 치료적으로 관련된 약물 농도가 뇌의 많은 영역에 도달할 수 있다.
본 발명의 경우, 비강내(비내, intranasal) 투여는 바람직하게는 국소 투여를 위한 적절한 장치에 의해 수행될 것이며, 이는 비강 점막(nasal mucosa)을 통한 약물의 흡수에 의해 작용하고, 바람직하게는 직경이 10 내지 50 마이크로미터인 분무된 입자의 형성에 의한다.
본 발명의 조성물의 비내 투여에 적합한 장치의 예는 시판되고 있고 유사한 메카니즘으로 작동하는 장치 또는 MAD(점막 분무기 장치, mucosal atomizer device) 유형의 장치로 구성된다. 주사기에 MAD를 적용하면 약물 전체의 분무가 가능하므로 비강 점막에서 약물의 최적의 흡수를 보장하고 외부 환경 및 폐 구조로의 분산을 최소한으로 줄일 수 있다. 그러한 구조는 장치를 사용하기 쉽고 매우 효과적으로 만든다.
본 발명의 폴리펩티드를 MAD 장치에 의해 비강내로 투여하는 것은 CNS 수준에서 이러한 활성 성분 접근을 허용하는 유효하고 접근가능한 방법이다.
따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물로 로딩된 장치는 비강 점막 및 후각 상피(olfactory epithelium)에서 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 데 사용될 수 있는데, 이는 후각 경로(olfactory pathway) 및/또는 신경 종말(nerve ending)을 통해 뇌 실질 (brain parenchyma)쪽으로 이(폴리펩티드)를 운반할 목적이다. 따라서 이 장치는 약물과 결합되어 뇌의 신경 재생을 유도하는 목적으로, 예를 들어 뇌 저산소성 허혈성 손상 또는 신경퇴행성 질환의 결과를 치료하기 위하여 임상 치료에서 사용될 수 있고, 현재 약학적으로 치료할 수 없는 병리 또는 병태를 치료할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 1 이상의 1일 도즈(one or more daily dose)로 투여될 수 있으며, 1일 당 총량은 환자당 0.01 내지 1.00 mg의 범위이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 반복적으로 또는 단일 투여로 투여된다.
한 실시예에서, 폴리펩티드는 단일 투여로 투여된다. 그 실시예에서, 폴리펩티드는 단일 투여로 투여되고, 그 단일 투여 후에 투여가 중단된다.
대안적인 실시예에서, 폴리펩티드는 1일, 2일 또는 3일 내지 30일, 바람직하게는 7일 내지 14일의 기간 동안 반복적으로 투여된다. 만성적으로 진행되거나 재발하는 상태의 치료가 가능하도록 적절한 약효세척(휴약, washout) 기간 후 최대 30일의 반복 과정(Repeated courses)도 또한 고려된다.
한 실시예에서, 폴리펩티드는 반복적으로 투여된다. 한 실시예에서, 폴리펩티드는 예를 들어 뇌 손상의 완전한 치유가 될 때까지, 또는 적어도 손상의 증상의 개선이 관찰될 때까지 반복적으로 투여된다. 대안적으로, 폴리펩티드는 3 내지 30일, 바람직하게는 7 내지 14일의 기간 동안 반복적으로 투여된다. 선택적으로, 투여는 상기 간격의 완료 후에 중단된다. 특히 바람직한 실시예에서, 폴리펩티드는 하루에 적어도 3회 반복적으로 투여된다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 뇌의 훼손 후에 투여된다. 대안적으로, 폴리펩티드는 예상되는 뇌 손상 또는 잠재적인 뇌 손상(예: 신경외과적 개입 또는 염증성 뇌 병태 발생)의 상황 하에서 예방적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 뇌 세포 사멸의 정도를 최소화하기 위해 뇌 훼손의 진단 후 가능한 한 빨리 투여된다. "가능한 한 빨리(as soon as possible)"는 뇌 훼손 또는 손상의 진단 후 1일 이하의 실시예를 포함한다. 그러나, 폴리펩티드는 뇌 훼손의 손상의 발생 수일 후에 투여된다면 여전히 신경보호적이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 뇌의 훼손의 유발 후 적어도 3일 후에 투여된다.
본원에 기재된 제제 및 조성물은 유효량으로 투여된다. 특정 장애의 치료의 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질환의 진행을 늦추고, 바람직하게는 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에 대한 바람직한 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 발병의 예방 또는 발병의 지연을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 목적하는 반응은 장애의 증상의 국소 및/또는 전신의 완전한 치유를 포함한다.
본원에 기재된 제제 또는 조성물의 유효량(effective amount)은 치료될 병태 또는 장애, 장애의 중증도, 작용제가 투여되는 대상체의 개별적인 파라미터, 예컨대 연령, 생리학적 병태, 수반되는 병태(들)(존재하는 경우), 크기 및 체중, 치료 기간, 수반되는 요법의 유형(존재하는 경우), 투여 및 기타 매개 변수의 특정 경로에 따라 다르다. 따라서, 본원에 기재된 제제(작용제)의 투여되는 도즈는 이러한 다양한 파라미터에 의존할 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 투여량(도즈, 용량)으로 불충분한 경우, 더 높은 투여량(또는 상이한, 보다 국소적인 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변(저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 치료 및/또는 예방을 위하여 인간 대상체에게 투여하기 위한 치료제의 투여에 적합하고 치료적으로 유효한 투여량(도즈)은, 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변(저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 치료 및 예방을 위하여 설치류 대상체, 특히 마우스에 투여하기 위한 치료제의 투여에 실험적으로 결정된 적합하고 치료적으로 유효한 투여량에 기초하여 결정될 수 있다.
동물 모델(실시예 2 및 3)은 약리학적 반응을 확립하고 치료 제품의 잠재적 독성을 평가하는 데 도움이 된다. 일부 실시예에서, 대상체에게 투여되는 용량은 실시예 2 또는 실시예 3에 개시된 바와 같은 용량이다.
바람직하게는, 폴리펩티드의 투여량은 치료 개시시 또는 그 전에 결정된다. 일 실시예에서, 도우징(dosing)은 치료되는 병태의 진행에 따라 이후 투여(들)를 위해 조정된다. 대안적인 실시예에서, 투여량은 이후 투여(들)를 위하여 조정되지 않고, 따라서 후속 복용량(dosage, 투여량)은 제1 투여량에 대응한다.
폴리펩티드는 비강 및 전신 투여 모두를 통해서 활성이 된다. 구체적으로, 비강 투여의 경우, 바람직한 용량/대상체당 각 용량은 콧구멍당 폴리펩티드 0.10 내지 1.00 mg/일, 바람직하게는 콧구멍당 폴리펩티드 0.06-0.12 mg/일, 보다 바람직하게는 콧구멍당 폴리펩티드 약 0.06 mg/일의 양을 갖는다. 이러한 용량은 수용자 선호도, 허용 가능한 부피 부하 및 콧구멍 접근성과 같은 주요한 임상 상황에 따라 한쪽 콧구멍에 투여하거나 양쪽 콧구멍에 나누어 투여할 수 있다. 가장 바람직하게는, 이들 지시된 투여량(dosage)은 특히 인간에게 투여하기 위한 것이다.
이하에서, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 설명한다. 이러한 조성물은, 본 발명에 따른 뇌 손상, 특히 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소 병변(저산소성 허혈성 뇌병증을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 예방 및/또는 치료의 용도의 특정 맥락에서뿐만 아니라 그러한 것 자체, 이 둘 모두, 본 발명의 일부이다. 따라서, 본 발명은 이러한 조성물의 의학적 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 서열번호 1의 폴리펩티드가 유효성분으로 포함되어 있다. 추가의 성분이 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 폴리펩티드는 수성 매질(aqueous medium)에 포함된다. 상기 수성 매질은 포유류 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 특정 수성 조성물은 비강내 사용에 적합한 액체 조성물이다. 이 제제(formulation)는 농도 2 mg/mL, 20 mM 아세테이트 버퍼, 20 mM 메티오닌, pH 5.5를 갖는다. 이는 0.9% 식염수에 용해되고, 바람직하게는 20 μg/kg 또는 40 μg/kg(4 μL 총 부피, 2 μL/콧구멍)의 도즈로, 콧구멍을 교대로 하여(alternating nostrils), 바람직하게는 1 내지 5분 간격으로, 바람직하게는 도즈 사이에 2분 간격으로 비강내로 전달될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 본원에 기재된 서열번호 1의 폴리펩티드는 하나 이상의 담체 및/또는 하나 이상의 부형제를 추가적으로 포함하는, 액체 조성물과 같은 조성물에 포함된다. 본원에 사용된 용어 "담체(carrier)"는 천연 또는 합성 성질의, 유기 또는 무기 성분을 의미하며, 이는 유효 성분의 적용을 가능하게하고, 향상시키고 또는 촉진시키기 위해 유효 성분과 함께 결합된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "부형제(excipient)"는 본 발명의 약학 조성물에 존재할 수 있고 그러한 유효 성분이 아닌 모든 물질을 나타내려는 것이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 부형제로서 적어도 물을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 수성 매질을 포함하고, 보다 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 수용액의 형태이다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 수성 매질에 포함되고, 수성 매질은 포유류 대상체에게 투여된다. 수성 매질은 예를 들어 수용액일 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 서열번호 1의 폴리펩티드는 조성물, 예를 들어 약학 조성물 내에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 바람직하게는 무균 상태(sterile)이고, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리펩티드를 약제학적으로 활성인 펩티드 또는 단백질로 함유하고, 그리고 선택적으로 본원에 언급되거나 언급되지 않은 추가의 작용제를 함유할 수 있다. 조성물은 임의의 상태, 예를 들어 액체, 냉동, 동결건조 등의 상태일 수 있다.
본 명세서에서 설명되는 조성물은 염, 버퍼 물질, 보존제(preservative), 담체, 희석제(diluent) 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 바람직하게는 약제학적으로 허용가능하다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 비독성이고 그리고/또는 약학 조성물의 유효 성분의 작용과 상호작용하지 않는 것을 나타낸다.
본 발명에서 사용하기 위한 적합한 완충(버퍼) 물질은 20 mM 아세테이트 버퍼를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물(제제)은 제한 없이, 하기 실시예 중 하나 이상에 따라 보존될 수 있다:
- 제1 실시예: 상기 제제는 -70℃ 또는 -20℃에서 냉동보관될 수 있고 (데이터는 나타내지 않음), 투여 전에 해동될 수 있다.
- 제2 실시예: 상기 제제는 냉장고, 바람직하게는 섭씨 +2℃ 내지 +8℃의 온도 범위에서 보관될 수 있다 (데이터는 나타내지 않음).
- 제3 실시예: 상기 제제는 건조 또는 동결건조(freeze-drying)를 거친 후, 예를 들어 실온 또는 2 내지 8℃에서 저장될 수 있다 (데이터는 나타내지 않음). 투여 전에 재구성될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 사용하기에 적합한 보존제는 당업계에 공지된 것을 포함하며, 그 중에서도 예시를 위한 것으로 그러나 비제한적으로, 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤잘코늄(benzalkonium) 및 그의 염, M-크레졸(M-cresol), 페놀, 클로로부탄올(chlorobutanol), 파라벤(paraben) 및 티메로살(thimerosal)이 있다. 이들 및 다른 보존제는 임의로 본 발명에 따른 조성물에 포함된다.
따라서, 본 발명은 치료적 용도, 즉 요법에 의해 인간 또는 동물 신체의 치료에 사용하기 위한 서열번호 1의 폴리펩티드를 제공한다. 요법(therapy)에는 병태의 예방 및/또는 치료가 포함될 수 있다. 치료적 용도의 관점에서, 상기 폴리펩티드는 또한 약제학적 활성 단백질 또는 펩티드(a pharmaceutically active protein or peptide)로서 지칭될 수 있다.
선택적으로, 본 발명에 따른 투여는 적어도 또 다른 치료제, 예를 들어 염증, 부종/부음(oedema/swelling), 두개내압 상승, 감염, 발작, 통증, 심리적 후유증 등에 대항하기 위한 제제의 투여를 수반한다. 다른 치료제는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 일부일 수 있거나, 또는 대안적으로 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해, 동일하거나 상이한 부위에, 대상체에게 별개로 투여될 수 있다.
담체는 식염수 또는 인산염 완충제와 같은 임의로 완충된 등장성 용액(isotonic solution)일 수 있으며, 필요한 경우 비강내 투여를 위한 조성물의 제형화(formulation)에 적합한 적절한 보존제 또는 기타 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 투여는 환자의 필요에 따라 1일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 그 이상 수행될 수 있으며, 매회 투여량(용량, 도즈)은 전술한 바와 같이 1일 당 0.01 내지 1.00 mg의 CHF6467일 수 있다.
한 실시예에서, 예를 들어, 조성물은 1일 당 2-4회, 예를 들어 1일 3회, 각 투여당 0.02 내지 0.04 mg의 CHF6467의 투여량(용량, 도즈)으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 조성물은 투여당 NGF-유사 작용을 갖는 분자 및/또는 0.02 mg CHF6467의 투여량(용량, 도즈)으로 1일 3회 투여될 수 있다.
조성물은 하나 이상의 치료 사이클(주기) 동안 상술한 방법 및 투여량 중 임의의 것으로 투여될 수 있다.
이러한 치료 주기는 예를 들어 1일에서 2주 사이에 지속될 수 있다.
예로서, 약학 조성물은 다수(예를 들어 10 내지 20의 임의의 수)의 예비-제조된 부분표본(aliquot, 앨리쿼트)의 형태로 제공될 수 있으며, 이들 각각은 비제한적인 예로서, 1 ml의 생리학적 용액(physiological solution) 또는 임의의 다른 적합한 담체를 함유하고, 여기서 0.5 내지 2.0 mg의 CHF6467이 희석된다. 그러한 부분표본은 파이알(작은 병, phial)에 담겨질 수 있거나, 또한, 특정 사용 용이성을 제공하는 실시예에서, MAD 장치에 연결하기에 적합한 사전 투여된 주사기(pre-dosed syringe)에 함유될 수 있다. 부분표본의 실시예는 1일 당 0.01 내지 1.00 mg의 CHF6467의 도즈를 투여할 수 있는 가능성을 제공하도록 제공된다. 가능한 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 예를 들어 1 mg의 CHF6467을 함유하는 1 ml 부분표본을 포함할 수 있으며, 이러한 유형의 제제(formulation)는 체중이 약 10 kg인 어린이에게 특히 적합하다. 대안적으로, 조성물은 예를 들어, 체중이 약 20 kg인 어린이 등을 위하여 2 mg의 CHF6467과 함께 적합한 담체의 1 ml 부분표본을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 권고된 투여량의 지식에 있어서, 약학 조성물의 적합한 부분표본을 체중 범위로 제조하는 것은 본 기술분야의 통상의 기술자가 간단히 구현할 수 있는 것이다.
혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)을 우회하여, 뇌쪽으로 약물을 운반할 목적으로 약물을 비강 내 투여할 가능성은 이미 10 년 전에 제안되었으며 현재 일부 유형의 진정제 또는 마취제 투여에 사용되고 있으며, 이를 위하여, 비강 내 투여를 통해, 용량을 줄이고 약물과, 따라서 가능한 부작용도 제한할 수 있다.
추가적 실시예에 따르면, 상기 하나 이상의 부분표본은 소아 투여 또는 성인에서의 투여를 위해 사전 보정될 수 있고, 적절한 양의 CHF6467을 포함하는 체중 범위당 단일 도즈로 세분될 수 있다.
대안적인 실시예에서, 상기 하나 이상의 부분표본은 다수-도즈 부분표본(multi-dose aliquots), 예를 들어 "매일" 또는 "매주" 부분표본일 수 있으며, 이는 환자 체중에 기초하여 적합한 용량으로 세분될 수 있다.
이미 상술한 바와 같이, 일 실시예에 따르면 조성물의 투여를 위한 상기 하나 이상의 장치는 MAD(mucosal atomizer device, 점막 분무기 장치) 타입의 장치일 수 있다.
비제한적인 예로서, CHF6467은 키트의 형태일 수 있다. 본 발명의 키트는 다수(예를 들어 10 내지 20의 임의의 수)의 예비-제조된 부분표본(aliquot)을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 비제한적인 예로서, 1 ml의 생리학적 용액(physiological solution)을 함유하고, 여기서 0.01-1.00 mg의 CHF6467이 희석되고, 이는 10개의 사전 투여된 주사기에 대해, 0.01 내지 1.00 mg/대상체 또는 3 내지 333 μg/kg의 CHF6467을 투여할 수 있는 가능성을 제공한다. 이러한 부분표본은 폴리펩티드의 비강내 투여를 위한 MAD 장치가 이미 임의로 장착된 멸균 주사기에 이미 포함되어 있을 수 있다. 가능한 실시예에 따르면, 본 발명의 키트는 예를 들어 약 3 kg의 체중의 신생아를 위한 0.01 내지 1 mg의 CHF6467을 갖는 10개의 주사기를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 권고된 도즈에 대한 정보에 있어서, 체중 범위에 적합한 약제학적 키트를 제조하는 것은 당업자가 간단히 구현할 수 있는 것이다. 이러한 방식으로, 뇌의 대부분의 세로토닌 및 콜린성 영역(serotoninergic and cholinergic areas)에 존재하는 NGF(TrkA 및 p75)에 대한 뇌내 수용체(intracerebral receptor)를 자극할 수 있는 적절한 양의 CHF6467의 비강 내 투여를 보호할 수 있을 것이다. 또한 이러한 종류의 키트는 가정에서 그리고 신생아의 부모가 (방법론의 단순성과 안전성을 감안할 때) CHF6467을 비강 내 투여할 수 있도록 할 것이고, 이러한 신생아의 삶의 질을 크게 향상시킬 것이다.
또한, 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 주요 두부 외상(major head trauma)에 의해 유발되는 신경학적 결함을 앓고 있는 환자(소아 또는 신생아 연령의 환자 포함)뿐만 아니라, 주산기 손상에 의해 유발된 저산소성 허혈성 뇌병증에 의해 유발된 뇌 손상(cerebral damage)에 의해 영향을 받는 모든 어린이 및 영아 뇌 마비 및 이차성 뇌 손상 및 다양한 성질의 뇌 허혈(cerebral ischemia)(예를 들어 뇌동맥류 파열, 뇌 동정맥 기형 및 뇌동 혈전증)에 의해 일반적으로 영향을 받는 환자를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 신생아는 CHF6467로 치료하기 전에 저체온증을 겪는다(저체온법을 적용한다).
하나의 바람직한 실시예에서, CHF6467은 저체온법(저체온증)과 함께 순차적으로 투여된다.
하나의 바람직한 실시예에서, CHF6467은 저체온법(저체온증) 후 또는 그 전에 순차적으로 투여된다.
바람직한 실시예에서 CHF6467은 저체온법(저체온증)과 동시에 투여되고, 본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서, CHF6467은 치료적 유효량으로 투여된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, CHF6467은 준치료적 유효량(sub-therapeutically effective amount)으로 투여된다.
즉, CHF6467은 저체온 상태가 없는 상태에서 투여되는 경우 원하는 치료 효과를 생성하기에 불충분한 양으로 투여된다.
훨씬 더 바람직하게는, CHF6467과 저체온법(저체온증)의 조합은 시너지 효과를 가지는데, 즉 조합이 상승 효과를 가져온다.
특히 바람직한 일 실시예에서, CHF6467은 저산소성/허혈성 상해 그 자체 이전에 투여되거나, 또는 그밖에 발생한 것으로 의심되는 저산소성/허혈성 상해의 진단 상 확인 전에 투여된다. 따라서, 바람직한 일 실시예에서, CHF6467은 출생 전에 산모를 통해, 예를 들어 분만 전에 또는 분만 중에 산모에게 투여함으로써 신생아에게 투여된다.
바람직하게는, CHF6467은 출생 전 최대 약 48시간 또는 24시간 동안, 보다 바람직하게는 출생 전 최대 약 12시간 동안, 더욱 바람직하게는 출생 전 최대 약 6시간 또는 최대 약 3시간 또는 최대 약 1시간 동안 산모에게 투여된다. 그리고 출생 후 신생아는 저체온 상태에 노출된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, CHF6467은 출생 직후, 임상적으로 영향을 미치는 저산소성/허혈성 상해가 발생했을 수 있다고 의심할 수 있는 임상적 근거가 있는 경우, 이의 진단적 확인 이전에 신생아 또는 갓난아이에게 투여된다. 이러한 상황은 CHF6467이 다른 중요한 임상 활동이나 개입(intervention)을 방해하지 않고 투여될 수 있는 속도와 용이성에 의해 촉진된다.
실시예들
실시예 1: 산소-포도당 결핍(OGD)을 겪고 있는 급성 해마 절편(Acute hippocampal slices undergoing oxygen-glucose deprivation)
방법
C57Bl6/J 마우스(생후 30 내지 50일, 30-50 days of age)를 참수하여 죽이고 뇌를 빠르게 제거하고 산소화된(95% O2 대 5% CO2) 얼음처럼 차가운 인공 CSF(aCSF)(0℃)에 넣었다. 방시상 해마 절편(Parasagittal hippocampal slice)(250 내지 350 μM)을 바이브라톰(vibratome)을 사용하여 절단하고 실온에서 aCSF에서 1시간 동안 회복(recover) 시켰다. 단일 절편을 나일론 메쉬 위에 놓고 기록 챔버에 완전히 담그고 지속적으로 산소화된 aCSF(3mL/min, ~30℃)로 슈퍼퓨즈(superfuse)시켰다. 세포외 필드 기록(Extracellular field recording)은 쉐퍼 콜레터럴 섬유(Schaffer collateral fiber)에 배치된 양극성 전극을 사용하여 수행되어 방사층(stratum radiatum)의 CA1 영역에 배치된 aCSF로 채워진, 유리 미소 전극(glass microelectrode)으로 기록된 필드 흥분성 시냅스 후 전위(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)를 유도했다. 본 발명자들은 전세포 패치 클램프 기록(whole cell patch clamp recording)을 사용하여 OGD에 의해 변경된 단일 뉴런 파라미터에 대한 CHF6467의 신경보호 효과를 평가하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 자발적 흥분성 시냅스 후 전류(spontaneous excitatory postsynaptic current, sEPSC) 및 막 전위(membrane potential)(Vm)을 측정하였다. 본 발명자들은 또한 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)를 기록하여 OGD 동안 및 그 이후에 CHF6467의 신경보호의 시간 윈도우(time window)를 평가하였다. 인비트로 산소/포도당 결핍(OGD)은 포도당 없이 aCSF로 절편을 관류(perfuse)하고 95%N2 대 5%CO2로 가스를 공급하여 달성되었다. OGD 후, 절편을 포도당 및 O2를 함유하는 aCSF로 재관류(reperfuse)시켰다. 저체온증은 포도당을 함유하고 산소화된(95% O2 대 5% CO2) aCSF(+4℃)로 절편을 관류함으로써 달성되었다.
결과
본 발명자들은 OGD에 노출된 마우스 급성 해마 절편에서 CHF6467 및 저체온증(저체온법)의 단독 또는 조합의 신경보호 효과를 연구하였다.
첫째, 발명자들은 해마의 기저 신경 전달(basal neurotransmission)에 대한 CHF6467의 효과를 조사했다. 본 발명자들은 20분 동안 대조군 조건에서 fEPSC를 기록하는 실험을 수행하였고, 이어서 발명자들은 CHF6467을 상이한 농도(0.001 내지 0.1 μg/mL)에서 배스 용액(bath solution)에 15분 동안 첨가하였다. CHF6467은 0.1 μg/mL 농도에서 fEPSC의 진폭(amplitude)을 증가시킬 수 있었다(도 1).
정상적인 산소 처리(oxygenation)로 복귀 시 시냅스 기능(synaptic function)을 회복하는 해마 절편의 능력은 OGD의 지속 기간에 달려 있다. 본 발명자들의 실험 조건에서, 10분 동안 적용된 OGD는 비가역적인 fEPSP 저조(depression)를 유발하였다 (데이터는 나타내지 않음). OGD 동안 CHF6467의 배스 적용(bath application)은 대조군 조건에서 관찰된, fEPSP의 저조를 되돌렸다. OGD 동안 CHF6467로 처리된 슬라이스는 fEPSP 진폭의 완전한 회복을 보여주었다(도 2).
본 발명자들의 인비트로(시험관내) 모델에서 치료 윈도우(therapeutic window)를 연구하기 위해, 단일 뉴런에 대한 CHF6467의 신경보호 효과를 평가하는 전세포 패치 클램프 구성(whole cell patch clamp configuration)에서의 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 OGD의 15분 후에 비가역적으로 감소된 유발 흥분성 시냅스후 전류(evoked excitatory postsynaptic current, EPSC)를 기록하였다. 본 발명자들이 OGD 후에 이를 적용하였을 때 CHF6467의 신경보호 효과를 관찰한 반면(도 3A), CHF6467을 정상 조건 하에서 적용하였을 때 기저 신경전달의 변화는 관찰되지 않았다(도 3B).
지금까지 HIE에 대해 승인된 유일한 치료적 접근법을 나타내는, CHF6467과 저체온법 사이의 시너지 효과의 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 OGD 후 저체온법과 함께 CHF6467을 적용하는 실험을 수행하였다. 발명자들의 실험 조건에서, 저체온법은 OGD에 의해 유발된 EPSC의 감소를 부분적으로 되돌릴 수 있었다(도 4). 저체온법 도중에 CHF6467을 병용하면 EPSC의 OGD 감소를 완전히 구제할 수 있었다(도 4).
CHF6467의 인비트로 및 인비보 도즈와 투여 프로토콜은 잠재적인 임상 적용을 지원하기 위해 도즈-반응 연구에서 선택되었다. 인비트로에서 신경 손상의 최대 감쇠는 0.03 μM CHF6467에서 관찰되었다. 놀랍게도, 인비트로에서 CHF6467의 신경 보호 효과는 저체온법에 의해 4℃에서 신경의 전기생리학적 손상이 거의 완전히 역전될 때까지 극적으로 향상되었다.
전반적으로, 현재의 전기생리학적 데이터는 허혈(ischemia)에 의해 유발된 여러 기능적 변화에 대한 CHF6467의 신경보호 잠재력을 뒷받침한다.
CHF6467이 허혈 매개 흥분독성(ischemia-mediated excitotoxicity)으로부터 보호할 수 있다는 것(데이터는 나타내지 않음)을 보여주는 이러한 인비트로 결과에 비추어 볼 때 그리고 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, CHF6467은 저산소성-허혈성 뇌병증을 포함하되 이에 국한되지 않는 뇌 손상 또는 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소 병변의 치료를 위한, 저체온법과의 조합에서, 잠재적인 신경 보호 요법으로 작용할 수 있다.
실시예 2: 신생아 저산소-허혈성 뇌병증의 래트 모델
방법
동물들. 실험 및 동물 사용 절차는 National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23, revised 1996)에 따랐다. 실험 프로토콜은 1986년 11월 24일 자 유럽 공동체 위원회 지침(European Communities Council Directive)(86/609/EEC) 및 실험 및 다른 과학적 목적을 위하여 사용되는 척추동물 보호를 위한 유럽 협약(European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes)(ETS no. 123)에 따라, 피렌체 대학교 보건 과학부의 동물 관리 위원회(Animal Care Committee of the Department of Health Sciences, University of Florence)의 승인을 받았다. 사용되는 동물의 수와 이들의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다.
절차들. 외과적 시술은 Rice-Vannucci 모델을 따라, 출생후 7일째 Wistar rat (Harlan, MI, Italy)에 수행하였다(Ann Neurol 1981; 9:131-141). 간단히 말해서, 래트 새끼는 산소:아산화질소(1:1)에서 이소플루란 가스(유도, 4%; 유지, 1%)로 마취되었다. 왼쪽 총경동맥은 정중선 절개 후 4-0 실크를 사용하여 결찰되었다. 수술 후, 모든 새끼들은 1.5 시간 동안 회복과 수유를 위해 이들의 댐(dam, 어미)에게로 돌아왔다. 그런 다음 새끼를 수조(water-bath)에 부분적으로 잠긴 밀폐되고 환기되는 플렉시 글라스 챔버(Plexiglas chamber) (W20, D20, H17)에 넣고 120 분 동안 따뜻하고 가습된 가스 8 % 산소 92 % 질소에 연속 흐름에 의해 노출시켰다. 상해 후, 새끼들은 1 시간 동안 그들의 댐으로 돌아간 다음 정상 체온 (37 ℃) 또는 저체온 (32 ℃) 온도의 챔버에 4 시간 동안 배치되었다. CHF6467은 이전 실험에서 내성이 잘 나타난 것(잘 견디는 것, well tolerated)으로 나타난 20 μg / kg의 용량으로 저산소증 직후 및 24 시간 후에 비강 내 투여되었다. 그런 다음 모든 새끼들이 이들의 댐과 함께 있도록 하고 72시간 후 이소플루란 마취 하에 참수하여 희생시켰다. 경색 면적 및 부피 측정을 위해 1mm 두께의 관상 섹션(coronal section)을 블레이드로 절단하고 37℃에서 20분 동안 2% 2,3,5-트리페닐-테트라졸륨 클로라이드(TTC)에서 배양한 다음 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정했다. 경색 영역은 컴퓨터화된 이미지 분석 시스템(Image-Pro Plus 3.0, Silver Spring, MD, U.S.A.)을 사용하여 측정되었다. 경색 부피는 앞서 기술한 바와 같이 계산하였다(Ann Neurol 1981; 9:131-141).
CHF6467 비강내 제제 및 투여. 저산소증이 끝난 후, 래트를 앙와위 자세(supine position)로 눕혔다. CHF6467(배치 번호 NGF183704-TR1, 농도 2mg/mL, 20mM 아세테이트 버퍼, 20mM 메티오닌, pH 5.5)을 0.9% 식염수에 용해시키고 20μg/kg(총 부피 4μL, 2μL/콧구멍)의 용량으로 비강 내 전달하고, 도즈간 2분 간격으로 콧구멍을 교체했다.
통계 분석. 데이터는 n개의 실험의 평균(mean) ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 제시된다. 프로피디움 요오드화물 형광 강도 또는 TTC 염색 간의 차이의 통계적 중요성은 이원 분산분석(two-way ANOVA)을 사용하여 분석한 후 다중 비교를 위한 Holm-Sidak 테스트가 뒤따랐다. 모든 통계적 계산은 SigmaPlot(버전 11.0)을 사용하여 수행되었다. < 0.05의 확률 값(P)이 유의한 것으로 간주되었다.
결과
본 발명자들은 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE)의 신생아 래트 모델에서 CHF6467 단독 또는 저체온증과 병용할 때의 신경보호 효과를 연구하였다(Rice-Vannucci model; Ann Neurol 1981; 9: 131-141). 실험 프로토콜은 다이어그램에 나와 있다(도 5). 이 모델에서, 좌경동맥 폐색 후 저산소증(2시간 동안 8% O2 및 92% 질소)에 노출되면 이전에 설명한 바와 같이 비히클 처리된 래트 새끼(vehicle-treated rat pup)에서 동측성 뇌경색(ipsilateral cerebral infarction)이 ~80% 발생한다(Landucci et al., Neurosci Lett. 2018; 668:103-107).
경동맥 폐색에 동측인 신선한 반구에 대한 관찰 소견에는 선조체(striatum), 해마, 피질 및 시상(thalamus)의 창백(pallor), 위축(atrophy) 및 조직 손실이 포함되었다(데이터는 표시되지 않음). 뇌 절편을 2,3,5- 트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC)로 염색하였을 때, 본 발명자들은 HIE가 70.4 ± 7.8 mm3 부피인 극적인 뇌 경색을 생성한다는 것을 관찰하였다 (도 6).
저산소증이 끝난 후, 래트를 앙와위 자세로 놓았다. CHF6467을 0.9% 식염수에 용해시키고 20μg/kg 또는 40μg/kg(총 부피 4μL, 2μL/콧구멍)의 용량으로 비강 내 전달하고, 도즈 간에 2분 간격으로 콧구멍을 교대로 하였다. CHF6467을 비강내로 저산소증 후 즉시 및 24시간 후에 20μg/kg 및 40μg/kg(체중 3kg의 인간 신생아에 대해 약 60 내지 120 μg에 해당)을 투여하면 비히클에 비해 경색의 정도를 유의하게 감소시켰다.
저체온증(저산소증 종료 후 1시간 후에 시작하여 4시간 동안 32℃)은 정상 체온(정상 온도, normothermia)에서 비히클 처리된 동물에 대한 확장을 유의하게 감소시켰다(도 6). CHF6467 20μg/kg과 저체온증의 조합은 저체온증 단독에 의해 얻어진 것보다 훨씬 더 큰 경색 부피의 극적인 감소를 이끌어냈다(도 6). 흥미롭게도 그리고 놀랍게도 저체온증과 CHF6467 신경 보호의 조합은 단일 제제의 신경 보호 효과의 합을 대체(supercede)했다.
다른 치료 후 비히클 + 정상 체온 그룹의 평균 로그 변환 뇌 경색 부피(mean Log-transformed brain infarcted volume)의 평균 감소 백분율(mean percent reduction)은 다음과 같다.
- 정상 체온 + CHF6467 20μg/kg: -13.6%
- 정상 체온 + CHF6467 40μg/kg: -24.3%
- 저체온증 + 비히클: -13.4%
- 저체온증 + CHF6467 20 μg/kg: -47.9%
동물을 하루에 한 번 모니터링하여 임상 징후를 검사하고 사망률(mortality) 및 이환율(morbidity)에 대해 하루에 두 번 모니터링했다.
상호작용 효과의 분석
이하에서는 SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. CHF6467과 저체온증(저체온법) 사이의 상호작용 효과에 대한 통계적 분석은 각 치료군에 대해 별도의 분산(variance)을 가정하는 ANOVA 모델을 사용하여 log10 변환 데이터를 기반으로 했다. 저체온증(예/아니오), CHF6467(예/아니오) 및 이들의 상호 작용의 고정 효과가 모델에 포함되었다. 정상 체온 + CHF6467 40 μg/kg으로 치료한 그룹의 데이터는 이들이 상호작용 효과의 평가에 기여하지 않았기 때문에 분석에서 제외되었다(이 연구에는 그룹 저체온증 + CHF6467 40 μg/kg이 포함되지 않았기 때문임).
CHF6467 20μg/kg과 저체온증 사이의 상호작용은 통계적으로 유의했다(p = 0.006). 이 상호 작용은 도 9에서 분명하며, 여기서 평균 log10 변환 뇌 경색 부피는 치료 그룹에 의해 표시된다. CHF6467 20 μg/kg 및 저체온증의 부가효과(상호작용 없음)의 경우 평행선이 예상된다. 평행성(parallelism)의 부재는 CHF6467 20 μg/kg와 저체온증의 효과 사이의 상호작용을 시사했다. CHF6467 20μg/kg과 저체온증의 조합의 신경보호 효과는 CHF6467과 저체온증의 개별 효과의 합보다 컸다.
표 1은 CHF6467 단독 또는 저체온증과 병용할 때의 체중에 미치는 영향을 나타낸다. 체중 증가에 통계적으로 유의미한 차이가 없었고 부작용 임상 징후도 관찰되지 않았다.
표 1: CHF6467 단독 또는 저체온증과 병용 시의 체중에 미치는 영향
그런 다음 CHF6467은 저체온증과 병용하여 HIE(저산소성 허혈성 뇌병증)가 있는 신생아에서 신경 보호제로 사용될 수 있다.
실시예 3: 저산소성 허혈성 뇌 손상의 어린 래트 모델(juvenile rat model)에서 신경염증성 마커 발현(neuroinflammatory markers expression)에 대한 CHF6467의 효과
방법
실험 동물 절차. 실험 동물과 관련된 모든 절차와 조건은 지역 윤리 위원회의 검토 및 승인을 받았으며 이탈리아 보건부(Italian Ministry of Health)(승인 번호 671/2019-PR)의 허가를 받았다.
실험 절차는 앞서 설명한 대로 수행되었다(Landucci et al., 2018 Neurosci. Lett. 668). 간단히 말해서, 출생 후 7일째 Wistar 래트 새끼를 이소플루란 가스(유도, 4-5%; 유지, 1-2%)로 마취했다. 왼쪽 총경동맥은 중간선 절개(midline incision) 후 4-0 실크를 사용하여 결찰되었다. 수술 후, 모든 새끼들은 1 시간 동안 회복과 수유를 위해 그들의 댐(어미)으로 돌아왔다. 그런 다음 새끼를 수조(water-bath)에 부분적으로 잠긴 밀폐되고 환기되는 플렉시 글라스 챔버(Plexiglas chamber) (W20, D20, H17)에 넣고 120 분 동안 따뜻하고 가습된 가스 8 % 산소 92 % 질소에 연속 흐름에 의해 노출시켰다. 상해 후, 새끼들은 1 시간 동안 그들의 댐으로 돌아간 다음 정상 체온 (37 ℃) 또는 저체온 (32 ℃) 온도의 챔버에 4 시간 동안 배치되었다. CHF6467은 20 μg / kg의 용량으로 저산소증의 종료 후 즉시 비강 내 투여되었다. 그런 다음 모든 새끼들이 이들의 댐과 함께 있도록 하고24시간 후 참수하여 희생시켰다.
CHF6467 비강내 제제 및 투여. 저산소증이 끝난 후, 래트를 앙와위 자세(supine position)로 눕혔다. CHF6467(배치 번호 NGF183704-TR1, 농도 2mg/mL, 20mM 아세테이트 버퍼, 20mM 메티오닌, pH 5.5)을 0.9% 식염수에 용해시키고 20μg/kg 또는 40μg/kg(총 부피 4μL, 2μL/콧구멍)의 용량으로 비강 내 전달하고, 도즈간 2분 간격으로 콧구멍을 교체했다.
해마 및 피질 뇌 영역(cortical brain area)에서 RNA 추출. 샘플의 페놀/구아니딘 기반 용해(Phenol/guanidine-based lysis): 해마와 피질 모두에 대해 800ul의 QIAzol 용해 시약(QIAzol Lysis Reagent)/30mg 조직을 사용했다. 조직 샘플은 비드(bead)와 티슈 라이저(Tissue Lyser)(Qiagen) 장치를 결합하여 균질화하였다. 클로로포름을 첨가한 후, 균질액(homogenate)을 원심분리에 의해 수성상 및 유기상(aqueous and organic phases)으로 분리하였다. 상부, 수성상을 QiaCube Connect automable system (Qiagen)에 의해 추출하였다. gDNA를 제거하기 위해 DNase 단계를 포함하는 프로토콜이 선택되었다. RNA 샘플을 RNase 유리수(RNase free water)에서 용리하고 역전사(Reverse transcription) 단계까지 -80℃에서 보관했다.
RNA 샘플의 농도는 Nanodrop(ThermoFisher) 분석기에서 결정하고 각 샘플에 대해 하나의 RT 반응에서 1000ng의 RNA를 역전사(retrotranscribe)하기 위해 조정되었다. gDNA를 제거하기 위해 RT 반응 전에 추가적인 ezDNase™ Enzyme 단계를 수행했다. 제조사에 의해 제안된 열 사이클링 조건들(Thermal cycling condition)은 RT 반응을 허용하기 위해 따랐다.
신경염증 마커들의 패널. cDNA 샘플은 표적 및 하우스키핑 유전자에 대한 프라이머 및 프로브를 포함하여 맞춤형으로 설계된 어레이 플레이트(Taqman 유전자 어레이, Thermofisher)에서 테스트되었다.
다음 유전자 (괄호 내 Thermofisher 카탈로그 번호)를 연구 동안 표적으로 삼았다: 하우스키핑 유전자: 18s rRNA (Hs99999901_s1), B2m (Rn00560865_m1), Tbp (Rn01455648_m1); 표적 유전자: Ccl2(Rn00580555_m1), Ccl22(Rn01536591_m1), Ccl12(Rn01464638_m1), Tnf(Rn00562055_m1), Cxcl2(Rn00586403_m1), Ccl7(Rn01467286_m1), Ccr5(Rn02132969_s1), Ccl20(Rn00570287_m1), Il6(Rn01410330_m1), Cxcl10(Rn01413889_g1), Ccl6(Rn01456400_m1).
TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) 및 희석된 cDNA를 플레이트에 첨가하였다; PCR 반응을 수행하기 위해 제조업체에서 제안한 열 사이클링 조건을 따랐다. 결과는 하우스키핑 유전자 증폭에 기초한 2-
Ct 방법을 사용하여 계산되었다.
통계 분석은 Graph Prism 소프트웨어로 수행되었다. 단방향 일반 ANOVA 테스트에 이어 Dunnett 또는 Tuckey 임시(ad-hoc) 비교가 적용되었다.
결과
해마 및 전두두정 피질에서 시토카인 및 케모카인의 패널의 mRNA 레벨의 뚜렷한 증가가 가짜 수술된 래트와 비교하여 저산소성 허혈성 상해를 겪은 래트에서 측정되었다(도 7 및 8). CHF6467(20ug/kg, 비강내)은 저산소성 허혈성 상해에 노출된 래트의 해마 영역에서 여러 신경염증 마커(ccl2, cxcl2, TNF- alpha, IL-6, ccl20)의 상향 조절에 유의하게 대응한 반면, 저체온증 자체는, ccl2 상향 조절에 유의하게 대응했지만 CHF6467만큼 효과적이지 않았다(도 7).
피질에서 CHF6467(20ug/kg) 그 자체는 저산소성 허혈성 상해에 의해 유발된 일부 신경염증 마커 상향 조절(그러나 cxcl2만 통계적 유의성에 도달함)에 대응(counterac)했으며 이러한 효과는 일부 신경염증 마커(ccl7, ccl2, IL-6, TNF- alpha, cxcl2)의 경우 저체온증과의 조합에 의해 강화되었다(도 8).
더욱이, CHF6467과 저체온증(저체온법)의 조합은 ccl2, ccl7, TNF- alpha 및 IL-6에 대한 단일 치료의 효과를 강화시켰다. 그런 다음 CHF6467은 미성숙 설치류 뇌에서 저산소증-허혈에 의해 유발되는 면역염증 반응에 대해 주요 조절 효과를 발휘할 수 있으며 이러한 효과는 저체온증과 결합될 때 불필요한 것이 아니다.
실시예 4: 래트 뇌에서의 CHF6467의 수량화(정량화, Quantification)
방법
펩티드 선택 및 중표지 표준물질(heavy labeled standard)의 합성
CHF6467 및/또는 성숙한 래트 NGF에 대해 서로 다른 특이성(specificity)을 나타내는 4개의 펩티드를 선택했으며(표 2), 이에 상응하는 AQUA (Absolute QUAntification) 상동체(homologue)는 Thermo Scientific에 의해 합성되었다.
표 2. 질량 분광계 검출(mass spectrometry detection)을 위해 선택된 NGF 펩티드.
* AQUA 분석(assay)을 위해 동위원소가 풍부한 서열(Sequences isotopically enriched): 아르기닌에 대한 중동위원소(heavy isotope)(13C6,15N4) 및 리신에 대한 (13C6,15N2)를 굵은 글꼴로 표시된 대로 마지막 아미노산에 추가했다.
실험 동물 절차
실험 동물과 관련된 모든 절차와 조건은 지역 윤리 위원회의 검토 및 승인을 받았으며 이탈리아 보건부(승인 번호 671/2019-PR)의 허가를 받았다. 앞서 설명한 바와 같이(Landucci et al., 2018, Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023.), 출생 후 7일째 Wistar 래트 새끼를 이소플루란 가스(유도, 4-5%; 유지, 1-2%)로 마취시켰다. 왼쪽 총경동맥은 중간선 절개 후 4-0 실크를 사용하여 결찰되었다. 수술 후, 모든 새끼들은 1 시간 동안 회복과 수유를 위해 이들의 댐으로 돌아왔다. 그런 다음 새끼를 수조에 부분적으로 잠긴 밀폐되고 환기되는 플렉시 글라스 챔버(Plexiglas chamber)(W20, D20, H17)에 넣고 120 분 동안 따뜻하고 가습 된 가스 8 % 산소 92 % 질소에 연속 흐름에 의해 노출시켰다. 상해 후, 새끼들은 1시간 동안 이들의 댐으로 돌려보내진 후 다음 정상 체온(37℃) 또는 저체온(32℃) 온도의 챔버에 4시간 동안 배치되었다. CHF6467은 저산소증이 끝난 직후 40μg/kg의 용량으로 비강 내 투여되었다. 또한, 저산소성 허혈성 상해를 겪지 않은 비실험 동물(naive animal) 그룹에 40 μg/kg을 비강 내 투여하였다. 그런 다음 모든 새끼는 이들의 댐과 함께 있도록 하고 2시간 후에 참수로 희생되었다.
CHF6467 비강내 제제 및 투여
저산소증이 끝난 후, 래트를 앙와위 자세로 놓았다. CHF6467(농도 2 mg/mL, 20 mM 아세테이트 버퍼, 20 mM 메티오닌, pH 5.5)을 0.9% 식염수에 용해시키고 40μg/kg(총 부피 4μL, 2μL/콧구멍)의 용량으로 비강 내 전달하고, 도즈 사이에 2분 간격으로 콧구멍을 번갈아 교체했다.
해마 및 피질 뇌 영역에서 단백질 추출
해동된 뇌 샘플(Thawed brain sample)을 얼음에 유지하고 추출 버퍼(Extraction Buffer)를 10:1(v/w) 비율로 첨가한다(50 mM ABC + 2% SDS + 프로테아제 억제제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail) dil.500X). 조직 균질화는 TissueLyser II 비드 밀링으로 30/s으로 2분간 수행된다. 그런 다음 샘플을 70℃에서 5분 동안 보관하고 25 U/mL 벤조나제(Benzonase)로 15분 처리하기 전에 실온에서 냉각시킨다. 단백질 함량은 BCA 분석에 의해 정량화된다.
단백질 분해(Protein digestion)
뇌 균질액은 환원 (5 mM DTT, 95℃에서 5분) 및 알킬화된다 (15 mM IAA, 암실에서 24℃에서 45분). 세제(detergent)는 피어스 스핀 컬럼(Pierce spin column)을 통해 샘플 버퍼에서 제거된다. 그런 다음 1:20(w/w) 비율로 37℃에서 5시간 트립신을 첨가하기 전에 소화 버퍼(digestion buffer)에 20% ACN을 첨가하고, 1:20(w/w) 비율로 트립신을 두 번째로 첨가하고 37℃에서 밤새 배양한다. 0.1% TFA로 반응을 소멸(quenching)시키기 전에 모든 샘플에 1.5ng/g AQUA 펩티드를 도핑한다.
샘플 분획(Sample fractionation)
분해된 샘플(Digested sample)은 Superdex 30 Increase 3.2/300 컬럼과 F9-R 콜렉터(collector)가 장착된 KTA Pure 25M 시스템을 통해 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 분획되며, 30% ACN, 0.1% TFA의 선형 그래디언트를 나타낸다.
CHF6467 검출 및 수량화
Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ Mass Spectrometer에 결합된 UltiMate™ 3000 RSLCnano 시스템을 통한 nanoLC-MS를 분석 전에 선택된 SEC 분획을 수집하고, SpeedVac 건조하고, 3% ACN, 0.1% TFA에서 재용해시킨다(resolubilize). NanoLC는 전농축 모드(preconcentration mode)로 작동하며 분리는 50cm x 75μm의 EASY-Spray PepMap RSLC C18 컬럼을 통해 수행된다. 이동상 그래디언트(Mobile phase gradient)는 100분에 5-40%B이며, 여기서 B는 80% ACN 및 0.1% FA이다. 질량 분광계 분석(Mass spectrometry analysis)은 관심 있는 CHF6467 펩티드 및 이들의 해당 중표지 펩티드(heavy labeled peptide)를 검출하기 위한 전체 스캔(full scan) 및 시간 제한 PRM 획득(timed PRM acquisition)으로 구성된다. 뇌 매트릭스에서 CHF6467 신호의 수준을 정량화하기 위해 임시 보정 곡선(Tentative calibration curve)이 만들어졌다. 대조군 동물의 조직 분석을 위해 0.09 및 12 ng/g 사이의 8포인트 농도 범위를 처음 테스트한 다음, HIE 동물을 분석하기 전에 0.06 내지 13.5 ng/g 사이의 6포인트 농도 범위를 테스트했다.
결과
CHF6467 변이체뿐만 아니라 자연적 성숙 인간 및 래트 NGF 이소형(isoform)의 서열 분석을 통해 본 발명자들은 긴 상동 영역뿐만 아니라 일부 독특한 트립신 펩티드를 식별하게 되었다(표 2). 본 발명자들은 본 연구에서 동물 모델을 고려하여, CHF6467 변이체의 단백질형인(proteotypic) 2개의 펩티드를 선택하였다: SSSHPIFHR (m/z 534.265) 및 QAAWEFIR (m/z 510.759). 본 발명자들은 또한 외인성 및 내인성 이소형 모두에 대해 잠재적으로 보고하는 펩티드의 기여도를 모니터링했다: QYFFETK (m/z 481.727, SEQ ID No. 4). 마지막으로, 본 발명자들은 잠재적인 내인성 반응에 대해 구체적으로 보고하기 위해 래트 선택적 펩티드, ALTTDDK(m/z 382.188, SEQ ID No. 5)를 확인했다.
본 발명자들은 대조군 어린 래트에서 비강내 투여 후 CHF6467의 분포를 예비시험하였다. 이 원리 증명은 소수의 샘플(3 개의 후구(olfactory bulb), 2 개의 해마 및 2 개의 뇌 피질(cerebral cortex))에서 수행되었다. CHF6467은 모든 샘플에서 검출되어 뇌의 관심 영역에 침투하는 이것의 능력의 증거를 제공했다. SSSHPIFHR(서열번호 2) 펩티드 신호(도 10)를 기반으로 수행된 정량화 추정치는 평균적으로 피질 영역과 해마에서 수백 피코그램(few hundreds of picograms)이 발견될 수 있음을 보여주었다.
본 발명자들은 저산소성 허혈성 상해를 받은 어린 래트에게 비강내 투여된 CHF6467의 뇌 침투 정도에 대한 조사와 함께 후속 연구를 수행한다(Landucci et al., 2018 Neurosci. Lett. 668. doi:10.1016/j.neulet.2018.01.023). 본 발명자들은 6 마리의 동물에서 뇌 피질과 해마를 분석하여 동측성(ipsilateral) 및 대측성(contralateral) 조직을 비교했다. 튜브의 균열로 인해 샘플 준비 중에 손실된 3개의 동측성 해마를 제외하고, CHF6467은 동일한 영역 내의 샘플 복제품 간에 공정한 재현성으로 분석된 모든 샘플에서 검출되었다(도 11). 정량화(quantitation)를 위해 선택된 세 개 펩티드 모두에 기초하여, 검출된 CHF6467 양은 테스트된 정량 범위(0.06 및 13.5 ng/g)를 벗어난 것으로 나타났으며, 이는 저산소성 허혈성 상해를 받은 이 동물 그룹 내에서 60pg/g 미만의 수준을 시사한다.
이 연구는 CHF6467이 비강 내 투여 후 뇌에 정말 진입하여 해마와 뇌 피질에 도달할 수 있음을 보여주는데, 이 때 CHF6467이 미성숙 설치류 뇌의 저산소성 허혈성 상해에 대한 이의 신경 보호 및 항신경염증 효과를 발휘할 수 있음을 보여준다.
질량 분광계는 복잡한 매트릭스에서 단백질을 특이적으로 검출하고 정량화하는 데 유용한 도구이다. 전반적으로, 데이터는 CHF6467의 비강내 투여가 관련 뇌 영역, 특히 해마 및 피질에서 검출 가능한 수준의 단백질로 귀결된다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING
<110> Chiesi Farmaceutici S.p.A.
<120> Combined treatment of brain injury
<130> N-486E
<150> EP21165013
<151> 2021-03-25
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 1
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Ser Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg
115
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<213> Artificial Sequence
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Ala Leu Thr Thr Asp Asp Lys
1 5
Claims (21)
- 포유류 대상체(mammalian subject)에서 외상성 뇌 병변 또는 뇌 허혈성 저산소성 병변의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드 및 저체온법(hypothermia)의 조합.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 20 μg/kg의 도즈로 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 외상성 뇌 병변이 저산소성 허혈성 뇌병증인 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유류 대상체가 인간, 바람직하게는 상기 대상체는 신생아 또는 갓난아기 대상체 또는 미숙아 갓난아기 대상체이고, 바람직하게는 상기 신생아 또는 갓난아기 대상체가 중등도 내지 중증의 저산소성 허혈성 뇌병증에 걸린 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 비강내 투여되거나, 또는 상기 폴리펩티드가 반복적으로, 바람직하게는 1 내지 30일, 바람직하게는 2 내지 14일의 기간 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 1일 당 1회 내지 7회 사이에 반복적으로 투여되거나, 또는 상기 폴리펩티드가 한쪽 또는 양쪽 콧구멍에 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 1일 당 0.01 내지 1.00 mg의 도즈로 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제7항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 0.06 내지 0.12 mg/일의 상기 폴리펩티드 도즈로 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제7항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 0.06 mg/일의 도즈로 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 반복적으로 투여되는 경우, 각각의 도즈는 1일 당 0.01 내지 1.00 mg인 것을 특징으로 하는 조합. - 제10항에 있어서,
각 도즈는 0.06 내지 0.12 mg/일의 상기 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조합. - 제10항에 있어서,
각 도즈는 0.06 mg/일인 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 상기 뇌 병변 이후 약 1시간 내지 24시간 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 아세테이트 버퍼 및/또는 메티오닌을 포함하는 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 저체온법과 동시에(simultaneously) 및/또는 저체온법 후 24시간 이내에 투여되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저체온법은 저산소성 허혈성(hypoxic-ischemic, HI) 상해(insult) 후 1시간 내지 10시간 이내에 개시되고, 바람직하게는 상기 저체온법은 저산소성 허혈성(HI) 상해 후 2시간 내지 8시간 이내에 개시되며, 바람직하게는 상기 저체온법은 저산소성 허혈성(HI) 상해 후 4시간 내지 6시간 이내에 개시되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저체온법은 저산소성 허혈성(HI) 상해 후 약 1 내지 약 72시간의 기간 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물(mammal)의 온도(체온)는 약 32℃ 내지 약 36℃의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제18항에 있어서,
상기 포유동물의 온도는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 0.06 내지 0.12 mg/일의 도즈로 투여되고, 상기 포유동물의 온도는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 조합. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 20 μg/kg의 도즈로 투여되고, 상기 포유동물의 온도는 약 32℃ 내지 약 35℃의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 조합.
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