KR20230159841A - 항원 반응성 t 세포 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 대상체의 샘플로부터 T 세포에서 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 암-반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함하여, T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 반응성인 T 세포(암-반응성 T 세포)를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체의 암세포에 결합하는 TCR을 확인하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (A) 상기 방법에 따라 암 반응성 T 세포를 확인하는 단계, (B) 단계 (A)에서 확인된 암-반응성 T세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및 이로써, (C) 암세포에 결합하는 TCR을 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명은 추가로 이와 관련된 추가 방법 및 암-반응성 T 세포에 관한 것이다.

Description

항원 반응성 T 세포 수용체
본 발명은 T 세포 활성화 항원을 제시하는 대상체의 세포에 반응성인 T 세포(반응성 T 세포)를 확인하는 방법에 관한 것이며, (a) 상기 대상체의 샘플로부터 T 세포에서 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체의 세포, 바람직하게는 암 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (A) 반응성 T 세포를 확인하는 방법에 따라 반응성 T 세포를 확인하는 단계, (B) 단계 (A)에서 확인된 반응성 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및 이로써, (C) 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명은 추가로 이와 관련된 방법 및 암 반응성 T 세포에 관한 것이다.
최근 몇 년 동안, 개인화된 입양 세포 요법(Adoptive Cell Therapy, ACT)을 위한 항원-반응성 T 세포 수용체(TCR)를 확인하는 데 대한 관심이 증가하고 있다. 이러한 요법에서, 혈액 내의 환자의 순환 T 세포를 채취하고, 종양 반응성 TCR을 발현하도록 형질전환적으로 변형시킨 다음 환자에게 재주입한다.
예를 들어 종양-반응성 TCR을 확인하기 위한 T 세포의 공급원으로서, 종양-침윤 림프구(TIL)가 사용되었다. TIL 집단 내의 종양 반응성 T 세포는 이론적으로 CD69 및 Nur77과 같은 공지된 T 세포 활성화 바이오마커의 상향조절에 의해 확인될 수 있지만, 실제로 이러한 접근법에 의해 확인된 TCR의 값은 제한적이다.
T 세포 활성화의 추가 바이오마커가 문헌[cf. Cano-Gamez et al. (2020), Nat Comm 11:, art. 1801 (doi.org/10.1038/s41467-020-15543-y), Magen et al. (2019), Cell Rep 29(10):3019 (doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.131), 및 Oh et al. (2020), Cell 181(7):1612 (doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.017)]에 기재되었다. 또한, 예를 들어 면역 체크포인트 차단에 대한 비-반응을 예측하는 바이오마커(WO2018/209324) 및 면역요법 내성에 대한 바이오마커(WO2019/070755)가 기재되었다. 최근에, 종양 침윤 T 림프구로부터의 활성화 마커가 기재되었다(WO 2021/188954 A1, Lowery et al. (2022), Science 10.1126/science.abl5447).
T 세포 활성화는 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 맥락에서 항원, 예를 들어 폴리펩티드의 에피토프의 제시를 수반하는 것으로 오랫동안 인정되어 왔다. CD8+ T 세포 상의 CD8 단백질을 포함하는 TCR 복합체와 상호작용하는 MHC 클래스 I은 모든 유핵 세포에 의해 발현되는 반면, CD4+ T 세포 상의 CD4 단백질을 포함하는 TCR 복합체와 상호작용하는 MHC 클래스 II는 전문 항원 제시 세포, 주로 B-세포 및 수지상 세포에 의해서만 발현된다. 그러나 세포의 다른 표면 분자도 T 세포 상호작용 및 활성화에 관여하는 것으로 밝혀졌다(cf. 예를 들어 Iwabuchi & van Kaer (2019), Front Im-munol 10:1837 (doi: 10.3389/fimmu.2019.01837).
그럼에도 불구하고, 특정 항원, 예를 들어 암 항원에 반응성인 T 세포 및 상응하는 TCR을 제공하기 위한 개선된 방법이 여전히 필요하다. 이러한 문제는 청구항에서 특징지어지고 이하에서 본원에 기재된 실시양태들에 의해 해결된다.
이에 따라, 본 발명은 T 세포 활성화 항원을 제시하는 대상체의 세포에 반응성인 T 세포(반응성 T-세포)를 확인하는 방법에 관한 것이며,
(a) 상기 대상체의 샘플로부터 T-세포에서 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 대상체의 암세포에 반응성인 T 세포(암-반응성 T-세포)를 확인하는 방법에 관한 것이며,
(a) 상기 대상체의 샘플로부터 T-세포에서 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 암-반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 용어들은 당업계의 통상의 숙련가에게 이들의 통상적이고 관례적인 의미를 제공하여야 하며, 달리 나타내지 않는 한, 특별하거나 맞춤화된 의미로 제한되지 않아야 한다. 다음에서 사용되는 용어 "갖다(have)", "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(include)" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 비-배타적인 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어들은, 이들 용어들에 의해 도입된 특징 외에, 이 문맥에서 기술된 실체에 더 이상의 특징들이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가 특징들이 존재하는 상황을 모두 지칭할 수 있다. 일례로서, 표현 "A가 B를 갖는다(A has B)", "A가 B를 포함한다(A comprises B)" 및 "A가 B를 포함한다(A includes B)"는, B 이외에 A에 다른 요소가 존재하지 않는 상황(즉, A가 단독으로 그리고 배타적으로 B로 구성되는 상황) 및 B 이외에 하나 이상의 추가 요소, 예를 들어 요소 C, 요소 C 및 D 또는 심지어 추가 요소가 실체 A에 존재하는 상황을 모두 지칭할 수 있다. 또한, 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 표현 "포함하는(comprising a)" 및 "포함하는(comprising an)"은 바람직하게는 "하나 이상을 포함하는(comprising one or more)"을 지칭하며, 즉 "적어도 하나를 포함하는(comprising at least one)"과 동등하다. 따라서, 복수의 한 가지 항목에 관한 표현은, 달리 나타내지 않는 한, 바람직하게는 적어도 하나의 이러한 항목, 보다 바람직하게는 이들의 복수에 관한 것이다: 따라서, 예를 들어 "세포(a cell)"를 확인하는 것은 적어도 하나의 세포를 확인하는 것에 관한 것이며, 바람직하게는 다수의 세포를 확인하는 것에 관한 것이다.
또한, 이하에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바람직하게는", "보다 바람직하게는", "가장 바람직하게는", "특히", "보다 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로", 또는 유사한 용어는 추가의 가능성을 제한하지 않으면서 임의의 특징과 함께 사용된다. 따라서, 이러한 용어에 의해 도입된 특징은 임의의 특징이며, 어떤 식으로든 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은, 숙련가가 인식하는 바와 같이, 대안적인 특징을 사용하여 수행될 수 있다. 유사하게, "실시양태에서", "추가의 실시양태에서" 또는 유사한 표현에 의해 도입된 특징은, 본 발명의 추가의 실시양태에 관한 어떠한 제한도 없는, 본 발명의 범위에 관한 어떠한 제한도 없는, 및 이러한 방식으로 도입된 특징을 본 발명의 다른 임의의 또는 비-임의의 특징과 조합할 수 있는 가능성에 관한 어떠한 제한도 없는 임의의 특징인 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "표준 조건"은, 달리 언급되지 않는 한, IUPAC 표준 주위 온도 및 압력(SATP) 조건, 즉 바람직하게는, 25℃의 온도 및 100kPa의 절대 압력과 관련되며; 또한 바람직하게는, 표준 조건은 pH 7을 포함한다. 더욱이, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "약"은 관련 분야에서 일반적으로 인정되는 기술적 정밀도를 갖는 지시된 값과 관련되며, 바람직하게는 지시된 값 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게는 ± 5%와 관련된다. 또한, 용어 "본질적으로"는 지시된 결과 또는 사용에 영향을 미치는 편차가 부재하고, 즉 잠재적 편차는 지시된 결과가 ± 20% 이상, 보다 바람직하게는 10% 이상, 가장 바람직하게는 ± 5% 이상 벗어나게 하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, "본질적으로 구성되는"은 명시된 성분들을 포함하지만 불순물로서 존재하는 물질, 성분을 제공하기 위해 사용된 공정의 결과로서 존재하는 불가피한 물질, 및 본 발명의 기술적 효과를 달성하는 것 이외의 목적으로 첨가된 성분을 제외한 다른 성분을 배제하는 것을 포함한다. 예를 들어, "본질적으로 구성되는"이라는 어구를 사용하여 정의된 조성물은 임의의 공지된 허용가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포함한다. 바람직하게는, 성분 세트로 본질적으로 구성되는 조성물은 5중량% 미만, 보다 바람직하게는 3중량% 미만, 더욱 더 바람직하게는 1중량% 미만, 가장 바람직하게는 0.1중량% 미만의 비-특정된 성분(들)을 포함할 것이다.
2개의 생물학적 서열, 바람직하게는 DNA, RNA, 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도(예를 들어, "동일성%"로서 표현됨)는 당업계에 잘 알려진 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 동일성의 정도는 비교 창에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 창에서 서열의 단편은 최적 정렬을 위해 비교되는 서열과 비교하여 추가 또는 결실(예를 들어, 갭 또는 오버행)을 포함할 수 있다. 백분율은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 창에서의 총 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith 및 Waterman(1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman 및 Wunsch(1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson 및 Lipman(1988)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산화된 구현에 의해(GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위해 2개의 서열이 확인된 것을 감안할 때, GAP 및 BESTFIT가 이들의 최적 정렬 및 이에 따른 동일성 정도를 결정하기 위해 바람직하게 사용된다. 바람직하게는, 갭 가중치에 대해서는 5.00, 갭 가중치 길이에 대해서는 0.30의 디폴트 값이 사용된다. 본원에 언급된 생물학적 서열의 맥락에서, 용어 "본질적으로 동일한"은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 동일성% 값을 나타낸다. 이해되는 바와 같이, 용어 본질적으로 동일한은 100% 동일성을 포함한다. 전술한 내용은, 필요한 부분만 약간 수정하여(mutatis mutandis), "본질적으로 상보적인"이라는 용어에도 적용된다.
생물학적 거대분자, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 "단편"이라는 용어는 지시된 서열, 구조 및/또는 기능을 포함하는 각각의 생물학적 거대분자의 임의의 하위-부분, 바람직하게는 하위도메인과 관련된 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 따라서, 상기 용어는 생물학적 거대분자의 실제 단편화에 의해 생성된 하위-부분, 또한 추상적인 방식으로, 예를 들어 인실리코(in silico)로서 각각의 생물학적 거대분자로부터 유래된 하위-부분을 포함한다. 서열 정보, 특히 핵산 서열 및/또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 용어 "하위-서열"은 더 긴 서열의 일부만을 나타내는 서열에 대해 사용된다.
본원에서 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 명시된 화합물, 특히 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 단편, 예를 들어 T-세포 수용체 (TCR)의 가변 영역은 더 큰 구조에 포함될 수 있고, 예를 들어 보조 분자, 담체 분자, 지연제 및 다른 부형제에 공유 또는 비공유 연결될 수 있다. 특히, 명시된 바와 같은 폴리펩티드는 추가의 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 포함될 수 있으며, 이는 예를 들어 정제 및/또는 검출을 위한 태그로서, 링커로서, 또는 화합물의 생체내 반감기를 연장시키는 역할을 할 수 있다. 용어 "검출 가능한 태그"는 융합 폴리펩티드에 첨가되거나 도입되는 아미노산의 스트레치를 지칭하고; 바람직하게는, 태그는 본 발명의 융합 폴리펩티드에 C- 또는 N-말단으로 첨가된다. 상기 아미노산의 스트레치는 바람직하게는 태그를 특이적으로 인식하는 항체에 의한 융합 폴리펩티드의 검출을 가능하게 하거나; 또는 바람직하게는 킬레이터와 같은 기능적 입체형태를 형성할 수 있게 하거나; 또는 바람직하게는 예를 들어 형광 태그의 경우 시각화를 가능하게 한다. 바람직한 검출가능한 태그는 Myc-태그, FLAG-태그, 6-His-태그, HA-태그, GST-태그 또는 형광 단백질 태그, 예를 들어 GFP-태그이다. 이러한 태그는 모두 당업계에 잘 알려져 있다. 융합 폴리펩티드에 바람직하게 포함된 다른 추가 펩티드는 분비의 매개체로서, 혈액-뇌-장벽 통과의 매개체로서, 세포-침투 펩티드로서, 및/또는 면역 자극제로서 작용할 수 있는 추가의 아미노산 또는 다른 변형을 포함한다. 추가의 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드가 융합될 수 있는 펩티드는 신호 및/또는 수송 서열 및/또는 링커 서열이다. TCR의 가변 영역은, 바람직하게는, 아래 본원에 명시된 바와 같이 TCR 알파 또는 베타 쇄의 골격에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 공유 결합되어 있는 수개의, 전형적으로 적어도 20개의 아미노산으로 구성된 분자를 지칭한다. 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 20개 미만의 아미노산으로 구성된 분자는 통상적으로 "펩티드"로 간주된다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 50 내지 1000개, 보다 바람직하게는 75 내지 750개, 훨씬 더 바람직하게는 100 내지 500개, 가장 바람직하게는 110 내지 400개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체에 포함된다.
본 발명의 반응성 T 세포를 확인하는 방법은, 바람직하게는 시험관내 방법이다. 상기 방법은 상기 본원과 관련된 것들 이외에 추가의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 단계는, 예를 들어, 단계 a)를 위한 샘플을 제공하거나, 단계 b)에서 추가의 바이오마커를 결정하는 것과 관련될 수 있다. 또한, 상기 단계들 중 하나 이상은 자동화된 장비에 의해 수행되거나 보조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T-세포 수용체"는, "TCR"로 약칭되며, 바람직하게는 MHC 분자 또는 MHC-관련 분자, 예를 들어 MR1 또는 CD1의 맥락에서, 보다 바람직하게는 MHC 분자의 맥락에서, 훨씬 더 바람직하게는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자의 맥락에서, 가장 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서, 표적 세포에 의해 제시된 항원성 펩티드의 인식을 매개하는 T-세포의 표면 상의 폴리펩티드 복합체와 관련된다. 전형적으로, TCR은 하나의 TCR-알파 쇄 및 하나의 TCR-베타 쇄, 즉 알파/베타 쇄 이형이량체를 포함한다. 그러나, TCR은 또한 TCR 알파 및 베타 쇄 대신에 TCR 감마 및 TCR 델타 쇄를 포함할 수 있다. TCR 알파 및 베타 또는 감마 및 델타 쇄는 항원 인식을 매개하고, 각각은 막횡단 영역, 불변 영역, 접합 영역, 및 가변 영역을 포함하며, 각 TCR 알파, 베타, 감마, 또는 델타 쇄의 가변 영역은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 통상의 명명법에 따라, 알파 및 베타 쇄 또는 감마 및 델타 쇄로 구성된 복합체는 본원에서 "T-세포 수용체" 또는 "TCR"로 지칭되고, 알파 및/또는 베타 쇄 및 감마 및/또는 델타 쇄는 통상적으로 또는 단독으로 "TCR 폴리펩티드" 또는 "TCR 폴리펩티드들"로 지칭되는 반면 TCR 및 보조 폴리펩티드, 예를 들어 CD3 및 CD247을 포함하는 폴리펩티드 복합체는 "TCR 복합체"로 약칭되는 "T-세포 수용체 복합체"로 지칭된다. 바람직하게는 T-세포 수용체는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, 바람직하게는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 보다 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자에 결합하여, 질환에 기여하고/하거나 관련된 항원, 바람직하게는 암 항원 또는 자가면역 T 세포 항원, 보다 바람직하게는 암 항원, 훨씬 더 바람직하게는 암 특이 항원의 에피토프, 특히 암세포의 네오에피토프를 제시한다. 항원에 대한 T 세포 수용체의 결합은 숙련가에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 실시예에 본원에 명시된 바와 같은 방법에 의해, 또는 예를 들어 사량체 분석에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, MHC 상에 제시된 에피토프에 대한 TCR의 결합은 T-세포를 활성화시킨다. 다양한 유형의 T-세포의 활성화 바이오마커는 당업계에 공지되어 있으며, 특히 CD69, CD137, CD27, TRAP/CD40L, 및 CD134를 포함한다. TCR은 또한 가용성 TCR일 수 있다. 용어 "가용성 TCR"은, 원칙적으로, 막횡단 도메인이 결여된 상기 본원에 명시된 바와 같은 TCR과 관련된 것으로 숙련가에게 공지되어 있다. 따라서, 바람직하게는, 가용성 TCR은 TCR의 TCR 폴리펩티드의 불변 및 가변 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는, 가용성 TCR은 TCR의 TCR 폴리펩티드의 가변 영역을, 바람직하게는 융합 폴리펩티드의 형태로 포함한다.
"CDR"로 약칭되는 용어 "상보성 결정 영역"은 숙련가에 의해 이해된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 각각의 TCR 알파, 베타, 감마 및 델타 쇄는 3개의 CDR을 포함하고, 이는 본원의 다른 부분에 명시된 바와 같이 MHC 분자에 의해 제시된 펩티드에 TCR의 에피토프-특이성 결정 접촉을 제공하는 펩티드이다.
용어 "T 세포"는 상기 본원에 명시된 바와 같은 적어도 하나의 유형의 T 세포 수용체를 발현하는 림프구와 관련된 것으로 숙련가에 의해 이해된다. 바람직하게는, T 세포는 표적 세포의 표면에서 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 CD8+ T 세포이거나, 또는 표적 세포의 표면에서 MHC 클래스 II 분자를 인식하는 CD4+ T 세포이거나, 보다 바람직하게는 CD8+ T 세포이다. 바람직하게는, T 세포는 세포독성 T-세포, 보다 바람직하게는 "살해 세포"로도 지칭될 수 있는 CD8+ 세포독성 T-세포이다. 또한 바람직하게는, T 세포는 조절 또는 헬퍼 T 세포이고, 보다 바람직하게는 조절 T 세포이다. 바람직하게는, T 세포는 알파/베타 T 세포, 즉 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포이다. 바람직하게는, T 세포는 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 반응성이며, 즉 "반응성 T 세포"이고, 보다 바람직하게는 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 특이적으로 반응성이고; 따라서, T 세포는 바람직하게는 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 의해 활성화되고, 바람직하게는 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 의해 특이적으로 활성화되며, 용어 "T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 의해 특이적으로 활성화된" 및 "T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 특이적으로 반응성인"은 T 세포가 바람직하게는 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 의해 활성화되지만 특히 동일한 조직의 T-세포 활성화 항원을 제시하지 않는 세포에 의해서는 활성화되지 않는다는 것을 나타낸다. T 세포의 활성화는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 사이토카인 분비, 예를 들어 인터페론-감마 분비를 측정함으로써, 또는 본원의 실시예에 명시된 바와 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, T 세포는 암 세포에 반응성이며, 즉 "암-반응성 T-세포"이거나, T-세포 자가항원을 제시하는 세포에 반응성이며, 즉 "자가면역-반응성 T-세포"이다. 따라서, 바람직하게는, T 세포는 암 항원, 바람직하게는 아래 본원에 명시된 바와 같은 암-특이 항원을 인식하는 TCR을 발현한다. 상기에 따르면, 암세포에 반응성인 T 세포는 암 항원, 바람직하게는 암-특이 항원을 인식하는 TCR을 발현하는 T 세포이다. 또한 바람직하게는, T 세포는 자가면역 T-세포 항원, 바람직하게는 특이적 자가면역 T-세포 항원을 인식하는 TCR을 발현한다.
용어 "T-세포 활성화 항원"은 적절한 TCR을 발현하는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 대상체의 세포 표면 상에 제시된 임의의 구조와 관련되는 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 이에 대해 또한 표현 "활성화 항원"이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 폴리펩티드 또는 이의 단편, 다당류, 또는 지질이다. 보다 바람직하게는, 항원은 MHC 분자의 맥락에서, 바람직하게는 상기 본원에 명시된 바와 같이 상기 대상체의 상기 세포에 의해 제시된 폴리펩티드의 에피토프이다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 반응성 T-세포가 샘플에서 본원에 명시된 바와 같은 방법에 의해 확인되는 경우, 바람직하게는 상기 대상체에 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포가 존재한다는 추정이 있으며; 이러한 확인이 반드시 T-세포 활성화 항원을 확인하는 것을 포함하는 것은 아니므로, 확인된 반응성 T-세포 및/또는 이의 TCR은 T-세포 활성화 항원을 확인하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 바람직하게는, T-세포 활성화 항원은 암 항원 또는 자가면역-관련 T-세포 활성화 항원이다. 따라서, 반응성 T 세포는 특히 암-반응성 T 세포 또는 자가면역-반응성 T 세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 신체 세포("암 세포")의 집단에 의한 조절되지 않은 성장을 특징으로 하는, 사람을 포함한 동물의 질병과 관련된다. 이러한 조절되지 않은 성장은 주변 조직으로의 침입 및 파괴 및 가능하게는 신체의 다른 위치로의 암세포의 확산을 동반할 수 있다. 바람직하게는, 암이라는 용어에는 재발도 포함된다. 따라서, 바람직하게는, 암은 고형암, 전이, 또는 이의 재발이다. 암은 감염원, 바람직하게는 바이러스, 보다 바람직하게는 발암성 바이러스, 보다 바람직하게는 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 인간 T-림프친화성 바이러스 1, 유두종바이러스, 또는 인간 헤르페스바이러스 8에 의해 유도될 수 있다. 그러나 암은 또한 화학적 화합물, 예를 들어, 발암 물질에 의해 유도되거나 내인성으로, 예를 들어 자발적인 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
바람직하게는, 암은 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), 에이즈-관련 림프종(aids-related lymphoma), 항문암(anal cancer), 맹장암(appendix cancer), 성상세포종(astrocytoma), 비정형 기형(atypical teratoid), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 담관암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌간 신경교종(brain stem glioma), 유방암(breast cancer), 버킷 림프종(burkitt lymphoma), 카르시노이드 종양(carcinoid tumor), 소뇌 성상세포종(cerebellar astrocytoma), 자궁경부암(cervical cancer), 척색종(chordoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 두개인두종(craniopharyngioma), 자궁내막암(endometrial cancer), 뇌실막모세포종(ependymoblastoma), 뇌실막종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 두개외 생식 세포 종양(extracranial germ cell tumor), 성선외 생식 세포 종양(extragonadal germ cell tumor), 간외 담관암(extrahepatic bile duct cancer), 섬유육종(fibrosarcoma), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor), 임신성 융모성 종양(gestational trophoblastic tumor), 모양 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 두경부암(head and neck cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 시상하부 및 시각 경로 신경교종(hypothalamic and visual pathway glioma), 안내 흑색종(intraocular melanoma), 카포시 육종(kaposi sarcoma), 후두암(laryngeal cancer), 수모세포종(medulloblastoma), 수질상피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포 암종(merkel cell carcinoma), 중피종(mesothelioma), 구강암(mouth cancer), 다발성 내분비 종양 증후군(multiple endocrine neoplasia syndrome), 다발성 골수종(multiple myeloma), 용상식육종(mycosis fungoides), 비강 및 부비동 암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 비호지킨 림프종(non-hodgkin lymphoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 구강암(oral cancer), 구인두암(oropharyngeal cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 난소 상피암(ovarian epithelial cancer), 난소 생식 세포 종양(ovarian germ cell tumor), 난소 저악성 잠재성 종양(ovarian low malignant potential tumor), 췌장암(pancreatic cancer), 유두종증(papillomatosis), 부비동 및 비강 암(paranasal sinus and nasal cavity cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 크롬친화성 세포종(pheochromocytoma), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 흉막폐모세포종(pleuropulmonary blastoma), 원발성 중추신경계 림프종(primary central nervous system lymphoma), 전립선암(prostate cancer), 직장암(rectal cancer), 신세포암(renal cell cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암(salivary gland cancer), 세자리 증후군(sezary syndrome), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 소장암(small intestine cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 편평 경부암(squamous neck cancer), 고환암(testicular cancer), 인후암(throat cancer), 흉선 암종(thymic carcinoma), 흉선종(thymoma), 갑상선암(thyroid cancer), 요도암(urethral cancer), 자궁 육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(waldenstrom macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(wilms tumor)으로 구성된 목록으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 암은 고형암, 전이, 또는 이의 재발이다. 보다 바람직하게는, 상기 암은 교모세포종(glioblastoma), 췌장 도관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma), 골육종(osteosarcoma), 또는 비뇌 원발성 종양의 뇌 전이(brain metastasis of a non-brain primary tumor)이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 췌장암, 결장직장암, 또는 임의의 다른 원발성 또는 전이성 고형 종양 유형이고, 바람직하게는 췌장암 또는 결장직장암이다.
용어 "암 항원"은 암세포에 의해 발현되는 항원, 바람직하게는 폴리펩티드와 관련된다. 바람직하게는, 암 항원은 비-암세포에서 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 보다 바람직하게는 적어도 25배 더 낮은 비율로 발현된다. 바람직하게는, 암 항원은 대상체에서 동일한 조직의 비종양 세포에서는 발현되지 않으며, 보다 바람직하게는 대상체의 비-암세포에서 발현되지 않고; 따라서, 암 항원은 바람직하게는 암 특이 항원이다. 보다 바람직하게는, 암 항원은 암세포에 의해 발현되는, 네오항원(neoantigen)이고/이거나 네오에피토프(neoepitope)를 포함한다. 바람직하게는, 암 항원의 하나 이상의 펩티드는 상기 암 항원을 생산하는 숙주 세포의 표면 상에 MHC 분자, 보다 바람직하게는 MHC 클래스-I 분자를 통해 "암 에피토프"로서 제시되며, 이는 바람직하게는 암-특이적 에피토프 또는, 상기 명시된 바와 같이, 암 네오에피토프이다. 본원의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 암은 바람직하게는 고형암, 즉 종양-형성 암이고; 따라서, 암 항원은 바람직하게는 종양 항원, 보다 바람직하게는 종양-특이적 항원이고, 암 에피토프는 바람직하게는 종양 에피토프, 보다 바람직하게는 종양-특이적 에피토프이다.
용어 "자가면역 T 세포 활성화 항원"은, 원칙적으로, 대상체의 세포에 의해 제시된 임의의 항원과 관련된 것으로 숙련가에게 공지되어 있으며, 이의 인식이 자가면역 질환, 바람직하게는 T 세포 매개 자가면역 질환을 유발, 악화 또는 기여한다. T 세포 매개 자가면역 질환은 당업계에 공지되어 있고; 바람직하게는, T 세포 매개 자가면역 질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis), 셀리악병(celiac disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 제1형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus), 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism) 및 애디슨병(Addison's disease)으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 본원에서 제안된 바와 같은 자가면역-반응성 T-세포 및/또는 이의 TCR의 확인은 바람직하게는 T-세포 매개 자가면역 질환의 진단, 진단에 기여 및/또는 예측하는데 특히 적합하다. 그러나, 자가면역-반응성 T-세포 및/또는 이의 TCR은 또한 조절 T-세포의 생성에 사용될 수 있고, 따라서, T-세포 매개 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 자가면역-반응성 T-세포 및/또는 이의 TCR은 바람직하게는 새로운 자가면역 T-세포 활성화 항원의 확인에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본원에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터에 의해 암호화된 TCR 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 바람직하게는 그 표면에 제시할 수 있는 임의의 세포와 관련된다. 바람직하게는, 세포는 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 당업계에 공지된 일반적인 실험실 박테리아 균주의 세포, 가장 바람직하게는 에스케리치아 균주(Escherichia strain), 특히 대장균 균주(E. coli strain)이다. 또한 바람직하게는, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 효모 세포, 예를 들어 빵 효모의 균주의 세포이거나, 또는 동물 세포이다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 특히 마우스 또는 래트 세포이다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포는 인간 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 T 세포, 보다 바람직하게는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포, 보다 바람직하게는 CD8+ T 세포이다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, CD4 TCR은 바람직하게는 CD8+ T-세포에서 발현되고, CD4 TCR은 바람직하게는 CD8 T-세포에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 반응성인 T 세포 확인" 및 "반응성 T 세포 확인"은 이의 TCR의 적어도 CDR 서열의 결정을 허용하는 반응성 T-세포에 대한 정보를 제공하는 임의의 및 모든 수단 및 방법을 포함하는 넓은 의미로 사용된다. 이에 따라, 반응성 T 세포는 물리적 형태로 제공될 필요는 없지만 그러한 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 반응성 T-세포를 확인하는 것은 본원의 다른 부분에 명시된 바와 같은 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 T-세포를 나타내는 데이터세트를 확인하고, 임의로, 상기 반응성 T-세포의 TCR의 적어도 CDR 서열을 할당하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 데이터세트는 유전자 발현의 단일-세포 결정에 의해, 바람직하게는 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 결정되거나 결정되었다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법의 단계 a)는 샘플에서 T 세포의 유전자 발현의 단일-세포 결정을 수행하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 명시된 바와 같은 바이오마커 중 적어도 하나의 발현이 결정되어 반응성 T 세포를 확인하며; 임의로, 상기 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 것으로 밝혀진 상기 T 세포의 TCR의 CDR 서열이 적어도 시퀀싱된다. 그러나, 반응성 T 세포를 확인하는 단계는 또한 상기 반응성 T 세포를 물리적으로 제공하는 것도 포함할 수 있다. 따라서, 반응성 T-세포를 확인하는 방법의 단계 a)는 T-세포 상에서 및/또는 T-세포 내에서 명시된 바와 같은 바이오마커 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 표면 바이오마커의 발현은 예를 들어 항체 염색에 의해 결정될 수 있고, 임의로 FACS-측정 및/또는 -분류가 뒤따를 수 있다. 또한 바람직하게는, 단일 T 세포는 클론적으로 성장하고, 바이오마커 발현은 상기 클론적으로 성장한 세포의 분취량에서 결정된다. T 세포, 바람직하게는 살아있는 T 세포에서 바이오마커 발현을 결정하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다.
바이오마커의 발현의 결정은 숙련가에 의해 적절하다고 간주되는 임의의 바이오마커 유전자 산물의 양에 기반하여 수행될 수 있다. 따라서, 결정은 RNA, 특히 mRNA, 및/또는 폴리펩티드 유전자 산물의 양을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 발현은 또한 대리 바이오마커, 예를 들어 리포터 유전자가 각각의 바이오마커의 프로모터의 조절하에 발현되는 리포터 유전자 작제물의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다. 바람직하게는, 발현의 결정은 mRNA 및/또는 폴리펩티드 유전자 산물의 양을 결정하는 것을 포함한다.
반응성 T 세포를 확인하는 것은 본원의 다른 곳에 명시된 바와 같은 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 바이오마커의 발현은 정성적으로, 반정량적으로, 또는 정량적으로 결정될 수 있으며, 이 용어들은 원칙적으로 숙련가에게 공지되어 있다. 정성적 결정은 바이오마커가 T 세포에 의해 발현되는지 또는 발현되지 않는지, 예를 들어 바이오마커가 분석의 검출 수준 이상으로 발현되는지 여부를 결정하는 이진 평가(binary assessment)일 수 있다. 반정량적 결정은 발현을 발현 범주, 예를 들어 저, 중간, 또는 고 발현으로 분류하는 것을 포함할 수 있다. 정량적 결정이라는 용어는 세포 내의 바이오마커의 양 및 특히 농도, 평균, 중앙값 또는 평균의 계산, 정규화 및 유사한 계산을 포함하여 적어도 하나의 표준 수학적 연산에 의해 이러한 양으로부터 유도된 모든 값에 대한 정보를 제공하는 각각의 및 모든 결정을 포함하는 것으로 숙련가에 의해 이해된다.
바람직하게는, 반응성 T 세포를 확인하는 것은 T 세포에서 결정된 바이오마커 발현을 기준과 비교하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "기준(reference)"은 참조 세포에서의 바이오마커의 발현, 예를 들어 참조 세포 내의 바이오마커의 양을 지칭한다. 바람직하게는, 기준은 유전자 산물에 대한 역치(예를 들어, 양 또는 양의 비율)이다. 그러나, 기준은 또한 숙련가에 의해 적절하다고 간주되는 임의의 수학, 특히 정규화에 의해 양으로부터 유도된 값일 수 있다. 상기한 방법에 따르면, 기준은 바람직하게는 반응성 T 세포인 것으로 알려진 T 세포의 샘플로부터 수득된 기준이다. 이러한 경우, 샘플에서 발견된 바이오마커 유전자 산물에 대한 값이 상기 기준과 본질적으로 동일하다는 것은 반응성 T 세포를 나타낸다. 또한 바람직하게는, 기준은 반응성이 없는 것으로 알려진 T 세포의 샘플로부터 유래된다. 이러한 경우, T 세포에서 발견된 바이오마커 유전자 산물에 대한 값이 기준에 비해 증가되는 것은 T 세포가 반응성임을 나타낸다. 비자극된 T-세포 집단의 바이오마커 유전자 산물(들)의 상대적 또는 절대적 값에 대해 계산된 기준, 가장 바람직하게는 평균 또는 중앙값에 대해서도 필요한 부분만 약간 수정하여 동일하게 적용된다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, T 세포의 주어진 자연 집단의 T 세포의 작은 비율만이 한 번에 반응성일 것이다. 이에 따라, 활성화되지 않는 것으로 알려진 T-세포 집단에 대한 상기 설명은 활성화 상태가 알려지지 않은 T-세포의 자연 집단에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용될 수 있고; 따라서, 기준은 반응성 상태가 알려지지 않은 T 세포의 자연 샘플일 수 있다. 이러한 경우, T 세포에서 발견된 바이오마커 유전자 산물에 대한 값이 기준에 비해 증가되는 것은 T 세포가 반응성임을 나타낸다. 적절한 기준 값, 바람직하게는, 평균 또는 중앙값을 계산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 앞서 언급된 비자극 T-세포의 집단은 복수의 T-세포, 바람직하게는 적어도 10개, 보다 바람직하게는 적어도 100개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 1,000개, 가장 바람직하게는 적어도 10,000개의 비자극된 T-세포를 포함한다. 관심있는 T-세포의 바이오마커 유전자 산물에 대한 값과 기준 값은 상응하는 값이 본질적으로 동일하다면 본질적으로 동일하다. 본질적으로 동일하다는 것은 두 값 사이의 차이가 바람직하게는 유의하지 않다는 것을 의미하며, 상기 값들이 적어도 기준 값의 적어도 1st 내지 99th 백분위수, 5th 내지 95th 백분위수, 10th 내지 90th 백분위수, 20th 내지 80th 백분위수, 30th 내지 70th 백분위수, 40th 내지 60th 백분위수 사이, 바람직하게는, 기준값의 50th, 60th, 70th, 80th, 90th 또는 95th 백분위수의 간격 내에 있는 것을 특징으로 한다. 2개의 양이 본질적으로 동일한지를 결정하기 위한 통계 검정은 당업계에 잘 알려져 있다. 반면에, 두 값에 대해 관찰된 차이는 바람직하게는 통계적으로 유의해야 한다. 상대 또는 절대 값의 차이는, 바람직하게는, 기준값의 45th 내지 55th 백분위수, 40th 내지 60th 백분위수, 30th 내지 70th 백분위수, 20th 내지 80th 백분위수, 10th 내지 90th 백분위수, 5th 내지 95th 백분위수, 1st 내지 99th 백분위수 사이의 간격 밖에서 유의하다. 바람직하게는, 기준(들)은 데이터베이스와 같은 적절한 데이터 저장 매체에 저장되고, 따라서, 또한 장래의 평가를 위해 이용 가능하다.
반응성 T 세포를 확인하는 것은 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나, 바람직하게는 CCL4, CCL4L2, CCL3 및 CCL3L1 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 바람직하게는 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 바람직하게는 아래 본원의 표 1로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 상기한 바이오마커는 "핵심 시그너처(core signature)"의 바이오마커이며, 즉 각각의 바이오마커 단독 또는 이들의 임의의 조합은 반응성 T 세포를 나타낸다. 상기한 바이오마커는, 원칙적으로, 숙련가에게 공지되어 있고, 이의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 서열은 공개 데이터베이스로부터 이용 가능하다. "CCL4"는 또한 "케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4"로도 알려져 있고, 인간 CCL4의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank Acc No. NP_996890.1로부터 이용 가능하다. "CCL4L2"는 또한 "C-C 모티프 케모카인 4-유사"로도 알려져 있고, 인간 CCL4L2의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank Acc No. NP_001278397.1로부터 이용 가능하다. "CCL3"은 또한 "케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3"으로 알려져 있고, 또한 대식세포 염증성 단백질 1-알파 (MIP-1-알파)로서 지칭될 수 있으며; 인간 CCL3의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank Acc No. NP_002974.1로부터 이용 가능하다. "CCL3L1"은 또한 "케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3-유사 1"로도 알려져 있고, 인간 CCL3L1의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank Acc No. NP_066286.1로부터 이용 가능하다. "CXCL13"은 또한 "B 림프구 화학유인물질" 및 "B 세포-유인 케모카인 1"이라는 명칭으로 알려져 있고, 인간 CXCL13의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank Acc No. NP_006410.1로부터 이용 가능하다. 바람직하게는, CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현은 반응성 T 세포를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 상기한 바이오마커 중 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개, 가장 바람직하게는 4개 모두의 발현은 반응성 T 세포를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 반응성 T 세포를 확인하는 것은 표 1에 열거된 바와 같은 "유전자 세트 1"로부터의 적어도 하나의 바이오마커, 바람직하게는 CXCL13, CCL3, 또는 CXCL13 및 CCL3의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 바이오마커(들)의 발현은 반응성 T-세포를 나타낸다.
바람직하게는, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 IFNG, HAVCR2, FNBP1, CSRNP1, SPRY1, RHOH, FOXN2, HIF1A, TOB1, RILPL2, CD8B, GABARAPL1, TNFSF14, EGR1, EGR2, TAGAP, TNFSF9, ANXA1, MAP3K8, PIK3R1, DUSP2, DUSP4, DUSP6, CLIC3, RASGEF1B, LAG3, XCL2, NR4A2, DNAJB6, NFKBID, MCL1, EVI2A, SLC7A5, H3F3B, NR4A3, REL, IRF4, CST7, ATF3, TNF, GPR171, BCL2A1, ITGA1, TNFAIP3, NR4A1, RUNX3, HERPUD2, FASLG, CBLB, PTGER4, SLA, XCL1, BHLHE40, LYST, KLRD1, ZNF682, CTSW, SLC2A3, NLRP3, SCML4, VSIR, LINC01871, 및 ZFP36L1로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 바람직하게는 아래 본원의 표 2로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 바이오마커는 "부속 1 시그너처(accessory 1 signature)"의 바이오마커, 즉 표 2의 각각의 바이오마커는, 단독으로 또는 표 2의 적어도 하나의 추가 바이오마커와 조합하여, 표 1의 적어도 하나의 바이오마커와 조합하여 결정되는 경우 반응성 T 세포를 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나에 더하여 표 2의 적어도 하나의 바이오마커의 발현은 반응성 T 세포를 나타낸다.
바람직하게는, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 CCL5, GZMH, CLEC2B, GZMA, CD69, GZMK, 및 CRTAM으로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 바람직하게는 아래 본원의 표 3으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 바이오마커는 "부속 2 시그너처"의 바이오마커이고, 즉 표 3의 각각의 바이오마커는, 단독으로 또는 표 2 또는 표 3의 적어도 하나의 추가의 바이오마커와 조합하여, 표 1의 적어도 하나의 바이오마커와 조합하여 결정되는 경우 반응성 T 세포를 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나에 더하여 표 3의 적어도 하나의 바이오마커의 발현은 반응성 T 세포를 나타낸다.
상기의 관점에서, 표 1 내지 3의 모든 바이오마커는, T-세포에서 발현될 때, 반응성을 나타내고/내거나 반응성 T-세포의 확인에 기여할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 적어도 하나의 배제 바이오마커(exclusion biomarker), 즉 발현될 때, T-세포가 비-반응성임을 나타내는 바이오마커의 결정을 추가로 포함한다: 바람직하게는, 본원에 언급된 반응성 T-세포를 확인하는 방법은 GNLY 및 FGFBP2로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하고(표 4), 여기서 상기 바이오마커 중 적어도 하나의 발현은 비반응성 T 세포를 나타낸다. 따라서, 바이오마커(들) GNLY 및/또는 FGFBP2는 배제 바이오마커로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 TNFRSF9, VCAM1, TIGIT, HAVCR2, GZMB, GPR183, CCR7, IL7R, VIM, LTB, 및 JUNB로 구성된 목록으로부터 선택된 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 4개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 5개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 6개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 7개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 8개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 9개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 10개, 훨씬 더 바람직하게는 모든 11개의 바이오마커(들)의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 바람직하게는 아래 본원의 표 5로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 표 1의 적어도 하나의 바이오마커와 조합된 표 5의 바이오마커가 "유전자 세트 2"의 바이오마커이다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 표 5의 마커의 발현은 반응성 T 세포 (예측 "R"), 또는 비반응성 T 세포 (예측 "NR")를 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 단독으로 또는 표 5의 적어도 하나의 추가 바이오마커와 조합하여 "R"로 표지된 표 5의 각각의 바이오마커는 바람직하게는 "유전자 세트 1"의 적어도 하나의 바이오마커, 즉 표 1의 적어도 하나의 바이오마커와 조합하여 결정되는 경우 반응성 T 세포를 나타낸다. 또한 바람직하게는, 단독으로 또는 표 5의 적어도 하나의 추가 바이오마커와 조합하여 "NR" 표지된 표 5의 각각의 바이오마커는 비반응성 T 세포를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T-세포를 확인하는 방법은 종양-반응성 T-세포에 대한 마커로서 TNFRSF9, VCAM1, TIGIT, HAVCR2, GZMB 중 적어도 하나, 및/또는 비-종양-반응성 T-세포에 대한 마커로서 GPR183, CCR7, IL7R, VIM, LTB, JUNB 중 적어도 하나를 결정하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 ACP5, NKG7, KRT86, LAYN, HLA-DRB5, CTLA4, HLA-DRB1, IGFLR1, HLA-DRA, LAG3, GEM, LYST, GAPDH, CD74, HMOX1, HLA-DPA1, DUSP4, CD27, ENTPD1, AC243829.4, HLA-DPB1, GZMH, KIR2DL4, CARD16, HLA-DQA1, CCL5, CST7, LINC01943, PLPP1, CTSC, PRF1, MTSS1, FKBP1A, CXCR6, HLA-DMA, ATP8B4, GZMA, GALNT2, CHST12, SNAP47, TNFRSF18, SIRPG, CD38, RBPJ, TNIP3, AHI1, NDFIP2, FABP5, RAB27A, ADGRG1, CTSW, APOBEC3G, IFNG, CTSD, PKM, NAB1, PSMB9, PARK7, KLRD1, ASXL2, KLRC2, LAIR2, FAM3C, ZFP36, FTH1, FOS, ZFP36L2, ANXA1, CD55, SLC2A3, LMNA, CRYBG1, DUSP1, PTGER4, MYADM, BTG2, 및 NFKBIA로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 4개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 5개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 10개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 15개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 20개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 30개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 40개, 가장 바람직하게는 모든 바이오마커(들)의 발현을 추가로 결정하는 것을 포함한다. 따라서, 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 바람직하게는 아래 본원의 표 6으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 표 6의 바이오마커는 표 1의 적어도 하나의 바이오마커와 조합하여 "유전자 세트 3"의 바이오마커이다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 표 6의 마커의 발현은 반응성 T 세포 (예측 "R"), 또는 비반응성 T 세포 (예측 "NR")를 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 단독으로 또는 표 5의 적어도 하나의 추가 바이오마커와 조합하여 "R"로 표지된 표 6의 각각의 바이오마커는 바람직하게는 "유전자 세트 1"의 적어도 하나의 바이오마커, 즉 표 1의 적어도 하나의 바이오마커, 및/또는 예측 "R"로 표지된 표 5의 적어도 하나의 바이오마커와 조합하여 결정되는 경우 반응성 T 세포를 나타낸다. 또한 바람직하게는, 단독으로 또는 표 6의 적어도 하나의 추가 바이오마커와 조합하여 "NR"로 표지된 표 6의 각각의 바이오마커는 바람직하게는 예측 "NR"로 표지된 표 5의 적어도 하나의 바이오마커와 조합하여 결정되는 경우 비반응성 T 세포를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 종양-반응성 T 세포에 대한 마커로서 ACP5, NKG7, KRT86, LAYN, HLA-DRB5, CTLA4, HLA-DRB1, IGFLR1, HLA-DRA, LAG3, GEM, LYST, GAPDH, CD74, HMOX1, HLA-DPA1, DUSP4, CD27, ENTPD1, AC243829.4, HLA-DPB1, GZMH, KIR2DL4, CARD16, HLA-DQA1, CCL5, CST7, LINC01943, PLPP1, CTSC, PRF1, MTSS1, FKBP1A, CXCR6, HLA-DMA, ATP8B4, GZMA, GALNT2, CHST12, SNAP47, TNFRSF18, SIRPG, CD38, RBPJ, TNIP3, AHI1, NDFIP2, FABP5, RAB27A, ADGRG1, CTSW, APOBEC3G, IFNG, CTSD, PKM, NAB1, PSMB9, PARK7, KLRD1, ASXL2, KLRC2, LAIR2, 및 FAM3C 중 적어도 하나 및/또는 비-종양-반응성 T 세포에 대한 마커로서 ZFP36, FTH1, FOS, ZFP36L2, ANXA1, CD55, SLC2A3, LMNA, CRYBG1, DUSP1, PTGER4, MYADM, BTG2, 및 NFKBIA 중 적어도 하나를 결정하는 것을 포함한다.
상기의 관점에서, 바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 적어도 CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; 또는 TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB의 발현을 결정하는 것을 포함한다.
또한 상기의 관점에서, 바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 적어도 CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + CCL3 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; CXCL13 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB; 또는 CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB의 발현을 결정하는 것을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본원에 언급된 반응성 T 세포를 확인하는 방법은 적어도 CXCL13 + CCL3 + TNFRSF9 + VCAM1 + TIGIT + HAVCR2 + GZMB + GPR183 + CCR7 + IL7R + VIM + LTB + JUNB의 발현을 결정하는 것을 포함한다.
숙련가는 본원에 언급된 바이오마커가 상이한 대립유전자로부터 복수의 이소형으로 발현될 수 있고/있거나 예를 들어 세포내 트래피킹 및/또는 분비 동안 세포에서 추가로 처리될 수 있는 전구체 형태로 발현될 수 있다는 것을 알고 있다. 또한, 숙련가는 비인간 종으로부터의 대상체가 바람직하게는 상기 본원에 나타낸 특정 서열의 상동체를 발현할 것이며, 이는 바람직하게는 BLAST 알고리즘과 같은 서열 정렬 및/또는 이에 기반한 검색 알고리즘, 및 적절한 데이터베이스, 바람직하게는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에 의해 확인될 수 있다는 것을 알고 있다. 바람직하게는, 명시된 바와 같은 바이오마커의 아미노산 서열은 본원에 언급된 특정 바이오마커 서열과 적어도 50%, 보다 바람직하게는 75%, 더욱 더 바람직하게는 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 가축, 예를 들어 소, 말, 돼지, 양 또는 염소, 반려 동물, 예를 들어 고양이 또는 개, 또는 실험실 동물, 예를 들어 래트, 마우스 또는 기니피그와 관련된다. 바람직하게는, 포유동물은 영장류, 보다 바람직하게는 원숭이, 가장 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 특히 대상체의 암 세포에 반응성인 T 세포를 확인하는 방법의 경우에 대상체는 암을 앓고 있다. 그러나, 대상체는 겉보기에 건강한 대상체, 바람직하게는 적어도 50세, 보다 바람직하게는 적어도 60세, 보다 바람직하게는 적어도 70세, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80세인 것으로 예상된다.
용어 "샘플"은 분리된 세포의 샘플 또는 조직 또는 기관으로부터, 바람직하게는 종양으로부터의 샘플을 지칭한다. 따라서, 샘플은 바람직하게는 암을 인식하는 림프구, 바람직하게는 T 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 가정된다. 보다 바람직하게는, 샘플은 종양 침윤성 림프구 (TIL)를 포함하거나 포함하는 것으로 가정된다. 또한 바람직하게는, 샘플은 암 세포, 보다 바람직하게는 종양 세포를 포함한다. 따라서, 샘플은 바람직하게는 TIL 및 암 세포를 포함하며, 바람직하게는 종양 샘플이다. 그러나, 샘플은 또한 비-암 조직의 샘플, 바람직하게는 암-인접 조직의 샘플, 또는 말초 혈액 단핵구 (PBMC)의 샘플일 수 있다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, 조직 또는 기관 샘플은 예를 들어, 생검, 수술, 또는 숙련가에 의해 적절하다고 간주되는 임의의 다른 방법에 의해 임의의 조직 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 분리된 세포는 림프, 혈액, 혈장, 혈청, 액(liquor) 및 기타와 같은 체액으로부터, 또는 원심분리 또는 세포 분류와 같은 분리 기술에 의해 조직 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 세포를 포함하는 조직 또는 체액 샘플이다. 바람직하게는 샘플은 체액의 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플이다. 체액 샘플은 숙련가에게 잘 알려진 일상적인 기술, 예를 들어, 정맥 또는 동맥 천자, 세척, 또는 숙련자에 의해 적절하다고 간주되는 임의의 다른 방법에 의해 대상체로부터 수득될 수 있다.
유리하게는, 임의로 추가 바이오마커를 포함하여 바이오마커 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1 및/또는 CXCL13을 사용하면 세포에 의해 제시된 항원에 반응성인 TCR을 포함하는 T-세포를 확인할 수 있고, 따라서, 배양에 의해 또는 T-세포에서 각각의 TCR을 발현함으로써, 예를 들어 암의 세포 요법을 위한 예를 들어 암세포를 인식하는 T 세포를 제공하기에 특히 적합하다는 것이 본 발명의 기초가 되는 연구에서 발견되었다.
상기 이루어진 정의는 필요한 부분만 약간 수정하여 하기에 적용된다. 이하에서 추가로 이루어진 추가의 정의 및 설명은 필요한 부분만 약간 수정하여 본 명세서에 기재된 모든 실시양태에 대해서도 적용된다.
본 발명은 또한 대상체의 세포, 바람직하게는 암세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(A) 반응성 T 세포를 확인하는 방법에 따라 반응성 T 세포를 확인하는 단계,
(B) 단계 (A)에서 확인된 반응성 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및, 이로써,
(C) 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 단계를 포함한다.
TCR을 확인하는 방법은, 바람직하게는, 시험관내 방법이다. 상기 방법은 본원과 관련된 것들 이외에 추가 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예를 들어, 추가의 핵산 또는 아미노산 서열을 결정하거나, 상기 반응성 T-세포에 의한 CD8 및/또는 CD4 발현을 결정하는 것과 관련될 수 있다. 또한, 상기 단계들 중 하나 이상은 자동화된 장비에 의해 수행되거나 보조될 수 있다.
아미노산 서열 및/또는 핵산 서열과 같은 "서열을 제공하는"이라는 용어는 상기 서열에 대한 정보를 제공하거나 상기 서열 정보를 액세스 가능하게 만드는 임의의 및 모든 수단 및 방법을 포함하는 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 따라서, 서열은 바람직하게는 데이터 캐리어에 유형으로 내장된 서열 정보로서 제공될 수 있다. 그러나, 서열은 또한 상기 서열을 포함하는 분자의 형태로, 바람직하게는 상기 서열을 포함하는 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 TCR로서, 보다 바람직하게는 동일한 것을 포함하는 숙주 세포로서 제공될 수 있다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 상기한 숙주 세포가 제공되는 경우, 서열 정보는 숙련가에게 공지된 표준 방법, 예를 들어 상기 숙주 세포 또는 이의 일부에 의해 발현된 TCR의 핵산 시퀀싱에 의해 제공될 수 있다.
"TCR을 확인하는"이라는 용어는 적어도 이의 CDR 서열의 결정을 가능하게 하는 TCR에 대한 정보를 제공하는 임의의 및 모든 수단 및 방법을 포함하는 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 이에 따라, TCR은 반드시 물리적 형태로 제공될 필요는 없지만 제공될 수도 있다. 따라서, TCR을 확인하는 것은 적어도 TCR의 CDR 서열 또는 적어도 상기 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 CDR 서열을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열은 유전자 발현의 단일-세포 결정에 의해, 바람직하게는 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해, 바람직하게는 상기 본원에 명시된 바와 같이 결정되거나 결정되었다. 그러나, TCR을 확인하는 것은 또한, 예를 들어 상기 TCR을 발현하는 숙주 세포, 바람직하게는 T-세포를 제공함으로써, 또는 확인된 TCR 폴리펩티드의 적어도 CDR을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 제공함으로써 상기 TCR을 물리적으로 제공하는 것을 포함할 수 있다. 이해되는 바와 같이, TCR이 숙주 세포와 같은 자가-복제 개체의 맥락에서 제공되는 경우, TCR의 적어도 CDR의 아미노산 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 복합체를 제공할 필요가 없을 수 있다.
바람직하게는, 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법은 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 단계 B1)을 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 방법은 숙주 세포, 바람직하게는 T-세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 단계 B1)을 추가로 포함하고, 즉 바람직하게는 숙주 세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR 및 적어도 하나의 부속 TCR 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 명시된 용어 "적어도 CDR을 포함하는 TCR"은 적어도 CDR은 단계 B)에서 결정된 바와 같은 것인 반면 TCR 폴리펩티드의 잔류 서열은 하나 이상의 상이한 알파 및 베타 또는 감마 및 델타 쇄의 서열, 예를 들어 이종 서열일 수 있는 TCR과 관련된다. 보다 바람직하게는, TCR 분자의 가변 영역은 단계 B)에서 제공되고, 단계 B1)에서 TCR 폴리펩티드의 일부로서 발현된다. 그러나, TCR 폴리펩티드의 추가의 단편 또는 완전한 TCR 폴리펩티드의 서열이 단계 B)에서 제공되고, 단계 B1)에서 임의로 발현되는 것도 예상된다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 단계 B1)에서 발현되는 것보다 더 긴 서열을 단계 B)에서 제공하는 것이 또한 가능하며; 예를 들어, 바람직하게는, TCR 폴리펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열은 단계 B)에서 제공될 수 있는 반면, 이의 CDR만이 예를 들어 이종 TCR 폴리펩티드의 맥락에서, 단계 B1)에서 제공될 수 있거나; 또는, TCR 폴리펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열은 단계 B)에서 제공될 수 있고, CDR을 포함하는 항원 결합 영역의 아미노산 서열은 예를 들어 이종 TCR 폴리펩티드의 맥락에서 단계 B1)에서 발현될 수 있다. 달리 나타내지 않는 경우, TCR 폴리펩티드는 바람직하게는 완전한 분자, 즉 각각 막횡단 영역, 불변 영역, 결합 영역 및 가변 영역을 포함하는 완전한 분자로서 발현된다.
바람직하게는, T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 결합하는 TCR을 확인하는 방법은 주요 조직적합성 복합체 (MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 T-세포 활성화 항원, 바람직하게는 암 항원을 제시하는 세포에 대한 단계 B1)에서 발현된 TCR의 결합을 결정하는 단계 B2)를 추가로 포함한다. 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 복합체화된 T-세포 활성화 항원에 대한 TCR의 결합, 바람직하게는 TCR에 포함된 결합을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 바람직하게는, 예를 들어 숙주 세포의 표면 상에서 발현될 수 있는 TCR에 검출 가능한 표지를 지닌 MHC 분자에 복합체화된 T-세포 활성화 항원 복합체의 결합을 결정하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 잘 알려진 예는 바람직하게는 T 세포 활성화 항원과 복합체화된 가용성 사량체 MHC 분자를 사용하는 사량체 분석이다.
바람직하게는, T 세포 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법은 단계 B1)에서 발현된 TCR에 의해 상기 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포의 인식을 결정하는 단계 B3)을 추가로 포함한다. 이러한 인식을 결정하는 검정은 당업계에 공지되어 있으며, 특히 결합 검정, 활성화 검정 및 용해 검정을 포함한다. 이들 모든 검정에서는, 바람직하게는 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 명시된 바와 같이 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 T-세포와 같은 숙주 세포와 공동-배양한다. 결합 검정에서는, 암 세포 및 상기한 숙주 세포가 서로 결합하는지, 바람직하게는 T 세포 활성화 항원 및 TCR을 제시하는 세포의 적어도 MHC 분자를 포함하는 면역학적 시냅스를 형성하는지 여부를 결정한다. 활성화 검정에서는, 명시된 바와 같은 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 숙주 세포, 바람직하게는 T-세포를 상기 공동-배양 후에 면역학적 활성화, 예를 들어 인터페론-감마 생산의 바이오마커에 대해 시험한다. 용해 검정에서는, 명시된 바와 같이 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 숙주 세포, 바람직하게는 T-세포가 상기 공동-배양 동안 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포의 적어도 일부를 용해하는지 여부를 결정한다.
바람직하게는, 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법은 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 가용성 TCR을 생성하고 주요 조직적합성 복합체 (MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 암 세포 및/또는 암 항원에 대한 상기 가용성 TCR의 결합을 결정하는 단계 B4)를 추가로 포함한다. 가용성 TCR은 상기 본원에 기재되어 있다. 바람직하게는, 검출 가능한 표지를 지닌 가용성 TCR이 단계 B4)에서 사용되며; 따라서, 이러한 표지된 가용성 TCR의 결합은 예를 들어 형광-활성화된 세포 선별 장비에 의해 검출될 수 있다.
바람직하게는, TCR을 확인하는 방법에서, 상기 적어도 하나의 바이오마커의 발현은 바람직하게는 적어도 100개 T-세포, 보다 바람직하게는 적어도 1000개 T-세포의 유전자 발현의 단일-세포 결정에 의해 결정된다. 이러한 경우, 단계 (B)의 반응성 T-세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은 유전자 발현의 단일-세포 결정의 일부로서 제공될 수 있고, 즉, 상기 CDR을 암호화하는 mRNA는 유전자 발현의 상기 단일-세포 결정의 일부로서 시퀀싱될 수 있다. 바람직하게는, 상응하는 서열은 유전자 발현의 단일-세포 결정 전에 예비-증폭된다. 그러나, 상기 CDR을 암호화하는 mRNA는 또한 별도의 시퀀싱 단계에서, 바람직하게는 적절한 바코딩 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 전술한 경우에, 상기 방법은 상기 적어도 CDR 서열의 아미노산 서열을 포함하는 상기 유전자 발현 데이타에 기초하여 T-세포를 클러스터링하는 추가 단계(B*1) 및 상기 적어도 하나의 바이오마커를 발현하지 않는 클러스터와 비교하여 상기 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 클러스터에서 증가된 상대 빈도로 클러스터링되는 TCR 또는 TCR들을 선택하는 추가 단계(B*2)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(i) 본 발명에 따른 방법에 따라 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 결합하는 TCR을 확인하는 단계,
(ii) T 세포에서 단계 (I)의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 TCR을 발현시키는 단계, 및 이로써,
(iii) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 단계를 포함한다.
T 세포를 제공하는 방법은, 바람직하게는, 시험관내 방법이며, 그 중 하나 이상의 단계는 자동화된 장비에 의해 수행되거나 보조될 수 있다.
상기 방법은 상기 본원과 관련된 것들 이외에 추가 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는, 예를 들어, 단계 (i)의 TCR의 CDR을 암호화하는 적어도 폴리뉴클레오티드를 TCR 알파, 베타, 감마, 또는 델타 쇄 골격으로 클로닝하는 것, 또는 단계 (i)의 TCR 폴리펩티드의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 TCR 알파 및 베타 또는 TCR 감마 및 델타, 쇄 백본으로, 바람직하게는 적어도 하나의 발현 벡터 상에서 클로닝하는 것; 또는 TCR 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 발현 벡터로 클로닝하는 것을 포함한다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, TCR 알파 쇄의 CDR 및/또는 가변 영역은 바람직하게는 TCR 알파 쇄 골격으로 클로닝될 것이고; TCR 베타 쇄의 CDR 및/또는 가변 영역은 바람직하게는 TCR 베타 쇄 골격으로 클로닝될 것이다. 앞서 말한 것은 필요한 부분만 약간 수정하여 감마 및 델타 쇄에 적용된다. 상기 방법은 또한 암세포를 인식하는 T 세포를 확장, 바람직하게는 클론적으로 확장하여 암세포를 인식하는 T-세포의 제제를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 암세포를 인식하는 T-세포는 단계 (i)에서 확인된 T-세포 또는 이의 클론 유도체 (즉, 딸 세포)일 수 있는 것으로 인지될 것이다.
바람직하게는, T 세포를 제공하는 방법은 활성화제를 제시하는 세포, 예를 들어 암 세포에 대한 단계 (ii)의 T 세포의 반응성을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "T 세포의 반응성을 시험하는"은 명시된 바와 같은 T 세포가 반응성인지 여부를 결정하기 위해 숙련가에 의해 적합하다고 간주되는 각각의 및 모든 방법을 포함한다. 반응성을 시험하기 위한 바람직한 방법, 예를 들어 결합 결정, T 세포의 활성화, 및/또는 활성화 항원을 제시하는 세포, 예를 들어 암 세포의 용해는 상기 본원에 기재되어 있다.
본 발명은 추가로 약제에 사용하기 위한, 특히 대상체에서 암 또는 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 각각 서열번호 3 및/또는 4를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 T-세포 수용체를 포함하는, 상기 본원에 명시된 바와 같은 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포에 반응성인 T 세포를 확인하는 방법에 의해 확인되고/되거나 상기 본원에 명시된 바와 같은 T-세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T-세포를 제공하는 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 반응성 T 세포에 관한 것이다.
용어 "치료하는" 및 "치료"는 본원에 언급된 질환 또는 장애 또는 그에 수반되는 증상의 유의한 정도까지의 개선을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 상기 치료는 또한 본원에 언급된 질환 또는 장애에 대한 건강의 전체적인 회복을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 치료는 치료될 모든 대상체에서 효과적이지 않을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 상기 용어는 바람직하게는, 본원에 언급된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 통계학적으로 유의한 부분이 성공적으로 치료될 수 있음을 요구한다. 부분이 통계적으로 유의한지 여부는 다양한 잘 알려진 통계 평가 도구, 예를 들어, 신뢰 구간의 결정, p-값 결정, 스튜던트 t-검정, 만-휘트니 검정 등을 사용하여 당업계의 숙련가에 의해 더 이상의 어려움 없이 결정될 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. p-값은 바람직하게는 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001이다. 바람직하게는, 치료는 주어진 코호트 또는 집단의 대상체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%에 대해 효과적이어야 한다. 바람직하게는, 암을 치료하는 것은 대상체에서 종양 부담을 감소시키는 것이다. 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 예를 들어 암의 치료의 효과는 예를 들어 암 단계 및 암 유형을 포함하는 다양한 인자에 의존한다.
용어 "예방하는"은 본원에 언급된 질환 또는 장애와 관련하여 대상체에서 특정 기간 동안 건강을 유지하는 것을 지칭한다. 상기 기간은 투여된 약물 화합물의 양 및 본 명세서의 다른 부분에서 논의된 대상체의 개별적인 요인에 의존할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예방은 본 발명에 따른 화합물로 치료받은 모든 대상체에서 효과적이지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 상기 용어는 바람직하게는, 코호트 또는 집단의 대상체의 통계적으로 유의한 부분이 본원에 언급된 질환 또는 장애 또는 이의 수반되는 증상을 앓는 것을 효과적으로 예방하는 것을 요구한다. 바람직하게는, 이러한 맥락에서 대상체의 코호트 또는 집단은 통상적으로, 즉 본 발명에 따른 예방 조치 없이, 본원에 언급된 바와 같은 질환 또는 장애를 발병할 것으로 예상된다. 부분이 통계적으로 유의한지 여부는 본 명세서의 다른 부분에서 논의된 다양한 잘 알려진 통계 평가 도구를 사용하여 당업계의 숙련가에 의해 더 이상의 어려움 없이 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체를 포함하는, 상기 본원에 명시된 바와 같은 방법에 의해 확인되고/되거나 상기 본원에 명시된 바와 같은 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 반응성 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용되는 형태로 본원에 명시된 바와 같은 숙주 세포, 특히 T 세포를 포함하는 화합물 또는 화합물들 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 화합물 및/또는 부형제는 약제학적으로 허용되는 염으로 제형화될 수 있다. 허용 가능한 염은 아세테이트, 메틸에스테르, HCl, 설페이트, 클로라이드 등을 포함한다. 약제학적 조성물은, 바람직하게는, 국소적으로 또는 전신적으로, 바람직하게는 정맥내 또는 종양내로 투여된다. 화합물은 일반적인 약제학적 조성물로 또는 별도의 약제학적 조성물로서 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있으며, 여기서 상기 별도의 약제학적 조성물은 부분 키트의 형태로 제공될 수 있다. 특히, 보조제(adjuvant)의 공동-투여가 예상될 수 있다.
화합물은, 바람직하게는, 통상적인 절차에 따라 숙주 세포 또는 약물을 표준 약제학적 담체와 조합함으로써 제조된 통상적인 투여 형태로 투여된다. 이러한 절차는 원하는 제제에 적절하게 성분을 혼합, 분산 또는 용해시키는 것을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은 그것이 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수에 의해 지시된다는 것을 이해할 것이다.
담체(들)는 제형의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 허용 가능해야 한다. 사용되는 약제학적 담체는, 예를 들어, 고체, 겔 또는 바람직하게는 액체일 수 있다. 액체 담체의 예는 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등이다. 적합한 담체는 상기 언급된 것들 및 당업계에 잘 알려진 다른 것들을 포함한다[예를 들어, 참조; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]. 희석제(들)는 바람직하게는 T 세포의 생물학적 활성 및 잠재적인 추가 약제학적 활성 성분에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 행크 용액이다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형은 또한 다른 담체, 보조제, 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다.
치료학적 유효 용량은 본원에 언급된 병태를 예방, 개선 또는 치료하는 본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 화합물의 양을 지칭한다. 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물에서 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해, 예를 들어, ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량) 및/또는 LD50(집단의 50%에 치사적인 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수(therapeutic index)이며 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다.
투여 섭생은 주치의에 의해, 바람직하게는 관련 임상 인자를 고려하여, 바람직하게는 본원의 다른 곳에 기재된 방법들 중 어느 하나에 따라 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 인자에 따라 좌우될 수 있다. 진행은 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 전형적인 용량은, 예를 들어, 104 내지 109개 숙주 세포의 범위일 수 있다; 그러나, 이러한 예시적인 범위보다 낮거나 높은 용량이 특히 상기한 인자를 고려하여 예상된다. 본원에 언급된 약제학적 조성물 및 제형은 본 명세서에 언급된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 적어도 한 번 투여된다. 그러나, 상기 약제학적 조성물은 1회 이상, 예를 들어, 바람직하게는 1회 내지 4회, 보다 바람직하게는 2회 또는 3회 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 명시된 바와 같은 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법에 따라 제공되거나 확인 가능한 활성화 항원에 결합하는 적어도 하나의 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 숙련가에게 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 본원에 명시된 바와 같은 핵산 서열 또는 핵산 서열들을 포함하거나 또는 이들로 구성된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드로서(즉, 이의 자연적 맥락으로부터 단리된) 또는 유전자 변형된 형태로 제공되어야 한다. 상기 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게는 cDNA를 포함하는 DNA이거나, 또는 RNA이다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 키메라 분자이고, 즉, 바람직하게는 잔류 핵산 서열에 이종성인 바람직하게는 적어도 20 bp, 보다 바람직하게는 적어도 100 bp의 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 자연적으로 발생된 변형된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 글리코실화 또는 메틸화된 폴리뉴클레오티드 또는 인공적으로 변형된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 비오티닐화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다.
본 발명은 또한
(I) 대상체의 샘플에서 T 세포의 복수의 바이오마커의 발현 데이터를 제공하는 단계,
(II) 단계 (A)의 바이오마커의 발현에 기초하여 상기 복수의 T 세포의 클러스터링을 제공하는 단계;
(III) 단계 (B)의 T 세포의 TCR 쇄의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계;
(IV) 단계 (C)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 TCR에 의한 암세포의 인식을 결정하는 단계;
(V) TCR이 단계 (D)에서 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 것으로 결정된 T-세포와 클러스터링하는 추가 T-세포에 대해 단계 (C) 및 (D)를 적어도 한 번 반복하는 단계, 여기서, 상기 추가 T 세포의 TCR은 단계 (D)의 TCR과 동일하지 않음;
(VI) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포의 가장 높은 분율을 포함하는 단계 (B)의 적어도 하나의 클러스터를 결정하는 단계; 및
(VII) 단계 (F)에서 결정된 클러스터에서 가장 높은 분율의 T 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 바이오마커를 결정하여, 반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 단계를 포함하여, 반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은, 바람직하게는, 시험관내 방법이다. 또한, 이것은 상기 명시적으로 언급된 것 이외에 단계들을 포함할 수 있다. 또한, 상기 단계들 중 하나 이상은 자동화된 장비에 의해 보조되거나 수행될 수 있다.
용어 "발현 데이터를 제공하는" 및 "아미노산 서열을 제공하는"은 각각의 데이터를 이용 가능하게 하는 각각의 및 모든 수단을 포함하는 것으로 숙련가에 의해 이해된다. 이러한 데이터는 기존 데이터베이스, 바람직하게는 발현 데이터베이스로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, T 세포의 복수의 바이오마커의 발현 데이터를 제공하는 것은 예를 들어 당업계에 공지된 방법에 따라 발현 어레이에 이로부터 유래된 RNA 또는 cDNA의 혼성화에 의해 상기 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, 발현 데이터를 제공하는 것은 단일 세포에 대한 발현 데이터를 제공하는 것, 즉 각각의 세포에 대한 바이오마커의 발현 데이터를 개별적으로 제공하여, T 세포에 의해 발현되는 바이오마커의 세트 확인을 가능하게 하는 것이다. 따라서, 발현 데이타는 바람직하게는 유전자 발현의 단일-세포 결정에 의해, 보다 바람직하게는 본원의 다른 부분에 명시된 바와 같이, 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 결정된다. 바람직하게는, 발현 데이타는 상기 T 세포에 의해 발현된 TCR의 적어도 CDR의 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 데이타는 T-세포 활성화 바이오마커의 발현 데이터 및/또는 상기 본원에 명시된 바이오마커의 발현 데이타를 포함한다.
용어 "클러스터링을 제공하는"은 발현된 바이오마커의 유사한 세트를 공유하는 클러스터로 개별 T 세포의 할당을 제공하는 것과 관련된다. 상기 클러스터링은 바람직하게는 당업계에 공지된 알고리즘, 예를 들어 그래프-기반 클러스터링 또는 k-평균 클러스터링[MacQueen (1967), "Some methods for classification and analysis of multivariate observations", 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability]에 의해 컴퓨터-구현 방식으로 수행된다. 클러스터링은 당업계에 또한 공지된 방법, 예를 들어 tSNE (van der Maaten and Hinton (2008), J Machine Learning Res 9:2579) 또는 UMAP (McInnes et al. (2020), arXiv:1802.03426v3), 바람직하게는 UMAP에 의해 시각화될 수 있다. 그러나, 다른 클러스터링 방법들도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다수의 클러스터, 즉 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 25개가 제공된다. 바람직하게는, 클러스터링, 즉 클러스터링 단계의 결과는 대상체-특이적이다.
용어 "적어도 하나의 클러스터를 결정하는"은 숙련가에 의해 이해된다. 방법의 단계 (II)에 따르면, 클러스터링이 제공되어, 바람직하게는 적어도 두 개의 클러스터를 제공하며; 단계 (IV)에 따라, 적어도 2개의 클러스터의 구성원이 이들이 반응성 T 세포인지 여부에 대해 평가되고, 단계 (VI)에 따라, T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포의 가장 높은 분율을 포함하는 적어도 하나의 클러스터가 결정된다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 이 단계는 바람직하게는 어떤 바이오마커가 반응성 T-세포를 나타내는지를 초기에 알 필요 없이 반응성 T-세포를 포함하는 클러스터(들)를 확인한다. 일단 클러스터가 확인되면, 동일한 클러스터의 추가의 T-세포 구성원은 바람직하게는 또한 암 반응성인 것으로 가정될 것이다. 또한, 이해되는 바와 같이, 단계 (III) 및 (IV)를 적어도 한 번, 바람직하게는 적어도 두 번, 보다 바람직하게는 적어도 세 번 반복하는 것은 클러스터 정의를 더욱 정제할 수 있게 한다. 최종적으로 확인된 클러스터(들)에서 가장 높은 빈도로 발현된 바이오마커는 바람직하게는 암-반응성 T-세포의 바이오마커인 것으로 가정될 것이다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본원에 개시된 실시양태들 중 하나 이상에서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램을 추가로 개시하고 제안한다. 구체적으로, 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 판독 가능한 데이터 캐리어에 저장될 수 있다. 따라서, 구체적으로, 상기 나타낸 바와 같은 방법 단계 a) 내지 d)의 하나, 하나 이상 또는 심지어 모두는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여, 바람직하게는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때 본원에 개시된 실시양태들 중 하나 이상에서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 개시하고 제안한다. 구체적으로, 프로그램 코드 수단은 컴퓨터 판독 가능한 데이터 캐리어에 저장될 수 있다.
또한, 본 발명은 그 위에 저장된 데이터 구조를 갖는 데이터 캐리어를 개시하고 제안하며, 이것은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 작업 메모리 또는 메인 메모리와 같은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 내로 로딩한 후, 본원에 개시된 실시양태들 중 하나 이상에 따라 방법을 실행할 수 있다.
본 발명은 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행될 때, 본원에 개시된 실시양태들 중 하나 이상에 따라 방법을 수행하기 위해, 기계 판독 가능한 캐리어에 저장된 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품을 추가로 제안하고 개시한다. 본원에 사용된 바와 같이, 컴퓨터 프로그램 제품은 거래 가능한 제품으로서의 프로그램을 지칭한다. 제품은 일반적으로 종이 형식과 같은 임의의 형식으로, 또는 컴퓨터 판독 가능한 데이터 캐리어 상에 존재할 수 있다. 구체적으로, 컴퓨터 프로그램 제품은 데이터 네트워크를 통해 배포될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 본원에 개시된 실시양태들 중 하나 이상에 따라 방법을 수행하기 위한, 컴퓨터 시스템 또는 컴퓨터 네트워크에 의해 판독 가능한 명령어들을 포함하는 변조된 데이터 신호를 제안하고 개시한다.
바람직하게는, 본 발명의 컴퓨터-구현된 측면들을 참조하면, 본원에 개시된 실시양태들 중 하나 이상에 따른 방법의 방법 단계들 중 하나 이상 또는 심지어 모든 방법 단계들은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일반적으로, 데이터의 제공 및/또는 조작을 포함하는 임의의 방법 단계들은 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법 단계들은, 전형적으로 샘플을 제공하는 것 및/또는 실제 측정들을 수행하는 특정 측면들과 같은 수동 작업을 필요로 하는 방법 단계들을 제외하고, 임의의 방법 단계들을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 다음을 추가로 개시한다:
- 적어도 하나의 프로세서를 포함하는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크, 여기서 상기 프로세서는 본 설명에서 기재된 실시양태들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 구성됨,
- 데이터 구조가 컴퓨터 상에서 실행되는 동안에 본 설명에 기재된 실시양태들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 구성된 컴퓨터 로딩가능 데이터 구조,
- 프로그램이 컴퓨터 상에서 실행되는 동안에 본 설명에 기재된 실시양태들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 구성된 컴퓨터 프로그램,
- 컴퓨터 프로그램이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행되는 동안에 본 설명에 기재된 실시양태들 중 하나에 따른 방법을 수행하기 위한 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램,
- 선행하는 실시양태에 따른 프로그램 수단을 포함하는 컴퓨터 프로그램, 여기서 상기 프로그램 수단은 컴퓨터가 읽을 수 있는 저장 매체에 저장됨,
- 저장 매체, 여기서 데이터 구조는 저장 매체에 저장되고, 데이터 구조는 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크의 메인 및/또는 작업 스토리지에 로딩된 후에 본 설명에 기재된 실시양태들 중 하나에 따른 방법을 수행하도록 구성됨, 및
- 프로그램 코드 수단을 갖는 컴퓨터 프로그램 제품, 여기서 프로그램 코드 수단이 컴퓨터 또는 컴퓨터 네트워크 상에서 실행되는 경우, 프로그램 코드 수단은 본 설명에 기재된 실시양태들 중 하나에 따른 방법을 수행하기 위해 저장 매체에 저장되거나 저장될 수 있음.
상기의 관점에서, 하기 실시양태가 특히 고려된다:
실시양태 1: T 세포 활성화 항원을 제시하는 대상체의 세포에 반응성인 T 세포(반응성 T-cell)를 확인하는 방법으로서,
(a) 상기 대상체의 샘플로부터 T-세포에서 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함하고,
바람직하게 여기서 상기 T 세포 활성화 항원은 암 항원 또는 자가면역 T 세포 항원, 보다 바람직하게는 암 항원인 방법.
실시양태 2: 암 세포에 반응성인 T 세포(암-반응성 T-세포)를 확인하는 방법으로서,
(a) 대상체의 샘플로부터 T-세포에서 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 암-반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 2: 실시양태 1 또는 2에 있어서, 단계 (a)가 CCL4, CCL4L2, CCL3, CCL3L1, 및 CXCL13 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 발현, 바람직하게는 CXCL13 및 CCL3의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 4: 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)가 IFNG, HAVCR2, FNBP1, CSRNP1, SPRY1, RHOH, FOXN2, HIF1A, TOB1, RILPL2, CD8B, GABARAPL1, TNFSF14, EGR1, EGR2, TAGAP, TNFSF9, ANXA1, MAP3K8, PIK3R1, DUSP2, DUSP4, DUSP6, CLIC3, RASGEF1B, LAG3, XCL2, NR4A2, DNAJB6, NFKBID, MCL1, EVI2A, SLC7A5, H3F3B, NR4A3, REL, IRF4, CST7, ATF3, TNF, GPR171, BCL2A1, ITGA1, TNFAIP3, NR4A1, RUNX3, HERPUD2, FASLG, CBLB, PTGER4, SLA, XCL1, BHLHE40, LYST, KLRD1, ZNF682, CTSW, SLC2A3, NLRP3, SCML4, VSIR, LINC01871, 및 ZFP36L1로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 5: 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 발현이 단계 (a)에서 유전자 발현의 단일-세포 결정에 의해, 바람직하게는 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 결정되고/되거나 상기 샘플이 종양 샘플인 방법.
실시양태 6: 대상체의 세포, 바람직하게는 암 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법으로서,
(A) 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에 따라 반응성 T 세포를 확인하는 단계,
(B) 단계 (A)에서 확인된 반응성 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및, 이로써,
(C) 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 7: 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)의 적어도 하나의 바이오마커 및/또는 단계 (B)에서의 핵산 서열이 단일-세포 시퀀싱, 바람직하게는 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 결정되는 방법.
실시양태 8: 실시양태 6 또는 7에 있어서, 상기 방법이 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 단계 B1)을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 9: 실시양태 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 단계 B1)을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 10: 실시양태 9에 있어서, 상기 방법이 바람직하게는 사량체 분석에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된, 세포 상에 제시된 활성화 항원, 바람직하게는 암 항원에 대한 단계 B1)에서 발현된 TCR의 결합을 결정하는 단계 B2)를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 11: 실시양태 9 또는 10에 있어서, 상기 방법이 단계 B1)에서 발현된 TCR에 의해 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포의 인식을 결정하는 단계 B3)을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 12: 실시양태 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 가용성 TCR을 생성하고, 주요 조직적합성 복합체(MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 T 세포 활성화 항원; 바람직하게는 암 항원에 대한 상기 가용성 TCR의 결합을 결정하는 추가 단계 B4)를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 13: T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이
(i) 실시양태 6 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에 따라 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 결합하는 TCR을 확인하는 단계,
(ii) T 세포에서 단계 (I)의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 TCR을 발현하는 단계, 및, 이로써,
(iii) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 14: 실시양태 13에 있어서, 상기 방법이 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대한 단계 (ii)의 T 세포의 반응성을 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 15: 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 조직 샘플 또는 체액 샘플인 방법.
실시양태 16: 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플인 방법.
실시양태 17: 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 암 샘플인 방법.
실시양태 18: 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 비-암 조직, 바람직하게는 암-인접 조직의 샘플인 방법.
실시양태 19: 약제에 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 확인되고/되거나 실시양태 13 또는 14에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 반응성 T 세포로서, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 T-세포 수용체를 포함하는 반응성 T 세포.
실시양태 20: 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 확인되고/되거나 실시양태 13 또는 14에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 반응성 T 세포로서, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 T-세포 수용체를 포함하는 반응성 T 세포.
실시양태 21: 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 겉보기에 건강한 대상체인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 22: 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 암에 걸린 대상체인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 23: 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포가 암 세포, 바람직하게는 종양 세포인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 24: 반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
(I) 대상체의 샘플에서 T 세포의 복수의 바이오마커의 발현 데이터를 제공하는 단계,
(II) 단계 (I)의 바이오마커의 발현에 기초하여 상기 복수의 T 세포의 클러스터링을 제공하는 단계;
(III) 단계 (II)의 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계;
(IV) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대한 단계 (III)의 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포의 반응성을 결정하는 단계;
(V) TCR이 단계 (IV)에서 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대해 반응성인 것으로 결정된 T-세포와 클러스터링하는 추가 T-세포에 대해 단계 (III) 및 (IV)를 적어도 한 번 반복하는 단계, 여기서 상기 추가 T-세포의 TCR은 단계 (IV)의 TCR과 동일하지 않음;
(VI) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포의 가장 높은 분율을 포함하는 단계 (II)의 적어도 하나의 클러스터를 결정하는 단계; 및
(VII) 단계 (VI)에서 결정된 클러스터에서 가장 높은 분율의 T 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 바이오마커를 결정하여, 암-반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 25: 선행하는 실시양태 중 어느 것에 있어서, 상기 T-세포(들)가 CD8+ T-세포(들) 또는 CD4+ T-세포이고, 바람직하게는 CD8+ T-세포인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 26: 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCR이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 또는 TCR 감마 쇄 및 TCR 델타 쇄를 포함하고, 바람직하게는 이들로 구성되며, 바람직하게는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하고, 보다 바람직하게는 이들로 구성되는 것인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 27: 실시양태 6 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에 따라 제공되거나 확인 가능한 활성화 항원에 결합하는 적어도 하나의 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 28: 선행하는 실시양태 중 어느 것에 있어서, 상기 반응성 T 세포가 암-반응성 T 세포인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 29: 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)가 TNFRSF9, VCAM1, TIGIT, HAVCR2, GZMB, GPR183, CCR7, IL7R, VIM, LTB, 및 JUNB로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 30: 실시양태 1 내지 3 및 29 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)가 ACP5, NKG7, KRT86, LAYN, HLA-DRB5, CTLA4, HLA-DRB1, IGFLR1, HLA-DRA, LAG3, GEM, LYST, GAPDH, CD74, HMOX1, HLA-DPA1, DUSP4, CD27, ENTPD1, AC243829.4, HLA-DPB1, GZMH, KIR2DL4, CARD16, HLA-DQA1, CCL5, CST7, LINC01943, PLPP1, CTSC, PRF1, MTSS1, FKBP1A, CXCR6, HLA-DMA, ATP8B4, GZMA, GALNT2, CHST12, SNAP47, TNFRSF18, SIRPG, CD38, RBPJ, TNIP3, AHI1, NDFIP2, FABP5, RAB27A, ADGRG1, CTSW, APOBEC3G, IFNG, CTSD, PKM, NAB1, PSMB9, PARK7, KLRD1, ASXL2, KLRC2, LAIR2, FAM3C, ZFP36, FTH1, FOS, ZFP36L2, ANXA1, CD55, SLC2A3, LMNA, CRYBG1, DUSP1, PTGER4, MYADM, BTG2, 및 NFKBIA로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 31: 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)가
(i) CXCL13, CCL3 및 실시양태 29에 열거된 모든 바이오마커;
(ii) CXCL13, CCL3, 및 IL7R을 제외한 실시양태 29에 열거된 모든 바이오마커; 또는
(iii) CXCL13, CCL3, 및 GPR183을 제외한 실시양태 29에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 32: 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)가
(iv) CXCL13, CCL3 및 실시양태 29 및 실시양태 30에 열거된 모든 바이오마커;
(v) CXCL13, CCL3, 및 IL7R을 제외한 실시양태 29에 열거된 모든 바이오마커, 및 실시양태 30에 열거된 모든 바이오마커; 또는
(vi) CXCL13, CCL3, 및 GPR183을 제외한 실시양태 29에 열거된 모든 바이오마커, 및 실시양태 30에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 33: 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포 활성화 항원이 암 항원이고, 바람직하게는 상기 샘플이 종양 샘플인 방법.
실시양태 34: 실시양태 34에 있어서, 상기 암이 췌장암, 결장직장암, 또는 임의의 다른 원발성 또는 전이성 고형 종양 유형이고, 바람직하게는 췌장암 또는 결장직장암인 방법.
실시양태 35: 대상체의 세포, 바람직하게는 암 세포 상에 제시된 T 세포 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법으로서, 상기 방법이
(A) 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 34 중 어느 하나의 방법에 따라 반응성 T 세포를 확인하는 단계,
(B) 상기 단계 (A)에서 확인된 반응성 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및, 이로써,
(C) 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 36: 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)의 적어도 하나의 바이오마커 및/또는 단계 (B)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 발현이 단일-세포 시퀀싱, 바람직하게는 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 결정되는 방법.
실시양태 37: 실시양태 35 또는 36에 있어서, 상기 방법이 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 단계 B1)을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 38: 실시양태 37에 있어서, 상기 방법이 바람직하게는 사량체 분석에서, 바람직하게는 주요 조직적합성 복합체 (MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 T 세포 활성화 항원에 대한 단계 B1)에서 발현된 TCR의 결합을 결정하는 추가 단계 B2)를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 39: 실시양태 37 또는 38에 있어서, 상기 방법이 단계 B1)에서 발현된 TCR에 의해 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포의 인식을 결정하는 단계 B3)을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 40: 실시양태 35 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 가용성 TCR을 생성하고, 주요 조직적합성 복합체(MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 암 세포 및/또는 암 항원에 대한 상기 가용성 TCR의 결합을 결정하는 단계 B4)를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 41: T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이
(i) 실시양태 35 내지 40 중 어느 하나에 따른 방법에 따라 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 결합하는 TCR을 확인하는 단계,
(ii) T 세포에서 단계 (I)의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 TCR을 발현하는 단계, 및, 이로써,
(iii) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 42: 약제에 사용하거나 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 34 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 확인되고/되거나 실시양태 35 내지 40 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 반응성 T 세포로서, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체를 포함하는, 반응성 T 세포.
실시양태 43: 반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
(I) 대상체의 샘플에서 T 세포의 복수의 바이오마커의 발현 데이터를 제공하는 단계,
(II) 단계 (I)의 바이오마커의 발현에 기초하여 상기 복수의 T 세포의 클러스터링을 제공하는 단계;
(III) 단계 (II)의 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계;
(IV) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대한 단계 (III)의 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포의 반응성을 결정하는 단계;
(V) TCR이 단계 (IV)에서 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대해 반응성인 것으로 결정된 T-세포와 클러스터링하는 추가 T-세포에 대해 단계 (III) 및 (IV)를 적어도 한 번 반복하는 단계, 여기서 상기 추가 T-세포의 TCR은 단계 (IV)의 TCR과 동일하지 않음;
(VI) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포의 가장 높은 분율을 포함하는 단계 (II)의 적어도 하나의 클러스터를 결정하는 단계; 및
(VII) 단계 (VI)에서 결정된 클러스터에서 가장 높은 분율의 T 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 바이오마커를 결정하여, 암-반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 44: 실시양태 1 내지 3 및 29 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 T-세포(들)가 CD8+ T-세포(들) 또는 CD4+ T-세포, 바람직하게는 CD8+ T-세포(들)인, 반응성 T 세포 또는 방법.
실시양태 45: 실시양태 35 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCR이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하고, 바람직하게는 이들로 구성되는 것인, 반응성 T 세포 또는 방법.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 이들의 전체 개시 내용 및 본 명세서에 구체적으로 언급된 개시 내용과 관련하여 본원에 참고로 포함된다.
도 1: a) 및 b)는 2명의 환자에 대한 T 세포의 UMAP 클러스터링의 결과를 개별적으로 보여준다. d)-f) 및 도 g)-j)는 환자 1 (d)-f)) 및 환자 2 (g)-j))에 대한 클러스터링된 세포에서 각각 핵심 유전자 CCL3, CCL3L1, CCL4 및 CCL4L2의 발현을 보여주고, (k)는 환자 2에서 핵심 유전자 CXCL13의 발현을 보여준다.
도 2: 환자 1 (a) 및 환자 2 (b)에 대한 핵심 유전자 CCL3, CCL3L1, CCL4 및 CCL4L2의 발현에 기초하여 정의된 암-반응성 T 세포의 클러스터를 보여주는 반면 c)는 환자 2)에서 핵심 유전자 CXCL13의 발현에 기초하여 정의된 암-반응성 T 세포의 클러스터를 보여준다.
도 3: a)는 환자 1에 대한 전사체 클러스터(Y축)에서의 선택된 TCR 클론(X축)의 분포를 보여준다. b)는 반응성 클러스터에서의 TCR 분율에 기반한 TCR의 클러스터링을 보여주고, c)는 FACS 기반 분석에 기반한 TCR 시험 결과를 보여준다.
도 4: a)는 환자 2에 대한 전사체 클러스터(Y축)에서의 선택된 TCR 클론(X축)의 분포를 보여준다. b)는 반응성 클러스터에서의 TCR 분율에 기반한 TCR의 클러스터링을 보여주고, c)는 NFAT 리포터 분석에 기반한 TCR 시험 결과를 보여준다: TCR 형질전환 Jurkat 세포와 펩티드-로딩된 자가 PBMC의 공동-배양은 TCR4가 종양에 의해 발현된 IDH1.R132H 돌연변이 에피토프를 인식한다는 것을 확인시켜 준다. 데이터는 3번의 기술 반복실험의 평균 + SD로 표시된다. 3개의 독립적인 실험을 대표한다. CD3+CD28 자극은 T 세포의 가능한 최대 활성화를 나타낸다. MOG는 분석에서 TCR에 의해 결합되지 않은 음성 대조군 펩티드이다.
도 5: 17.855개의 T-세포로 구성된 원발성 절제 가능한 PDAC를 가진 9명의 환자로부터의 9개의 췌장 도관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) 샘플에 대한 T 세포의 UMAP 클러스터링의 결과를 보여준다.
도 6: a)는 9개의 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플에 대한 T 세포의 UMAP에서 종양-반응성 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포의 분포를 보여준다. b)는 9개의 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 T 세포의 UMAP에서 종양 비-반응성 TCR을 발현하는 T-세포의 분포를 보여준다. 독특한 T 세포 클론형을 나타내는 총 106개의 TCR이 시험되었으며, 그 중 53개는 종양-반응성이고 53개는 종양-비반응성인 것으로 밝혀졌다. 각 TCR은 동일한 결과를 가진 적어도 3개의 독립적인 실험에서 시험되었다.
도 7: a)는 단일 세포 시퀀싱에 의해 인간 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터 단리된 TCR의 반응성을 평가하는 시험관내 실험의 대표적인 예를 보여준다. 일차 인간 T 세포를 RNA 유전자 형질감염에 의해 지시된 TCR로 형질도입한 다음 종양 세포의 유무에 관계없이 배양하고 T 세포 활성화 마커 TNF-알파(TNFa)에 대한 세포내 유세포 분석 염색에 의해 T 세포 반응성을 결정하였다. 지시된 TCR은 모두 9개의 PDAC 종양 중 하나로부터 유래하였으며 동일한 PDAC 종양 샘플로부터 유래된 자가 종양 세포주에 대해 시험되었다. 나타낸 바와 같이, TCR은 종양 비-반응성(TNR) 또는 종양-반응성(TR)인 것으로 재현 가능하게 밝혀졌다. 모의-형질감염된 T-세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 형질감염된 TCR을 암호화하는 유전자 작제물은 마우스 TCR 알파 및 베타 쇄의 불변 영역과 조합하여 관심 TCR 알파 및 베타 쇄의 가변 영역을 포함한다. 이는 유전자 형질도입된 TCR 유전자의 올바른 페어링(pairing)을 촉진하고, 마우스 TCR 불변 도메인(mTCRb)에 대한 항체에 의한 이식유전자-암호화된 TCR 발현의 검출을 가능하게 한다. 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 종양-반응성은 이식유전자-암호화된 TCR을 발현하는, 보다 구체적으로는 종양-반응성(TR) TCR을 발현하는 T-세포에 대해서만 나타난다. b)는 T 세포 반응성이 T-세포 활성화 마커 CD107a에 대한 염색에 의해 평가된다는 유일한 차이점을 갖는 위와 동일한 실험을 보여준다.
도 8: 유전자 세트 1에 포함된 유전자에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP에 대한 분포를 보여준다. 큰 UMAP 플롯은 유전자 세트 1 내에 포함된 5개의 유전자를 모두 사용한 예측 결과를 보여준다 (시그너처 1 = SIGN1). 작은 UMAP 플롯은 5개의 단일 유전자 각각을 사용한 예측 결과를 보여준다. 도 6A의 UMAP 플롯과 비교하면 이들 5개 유전자 중 CXCL13 및 CCL3이 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포에 대한 최상의 바이오마커인 것으로 나타났다.
도 9: 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해서만 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 T 세포의 UMAP에 대한 분포를 보여준다 (시그너처 2 = SIGN2).
도 10: a)는 유전자 세트 2에 의해 구성된 11개의 유전자와 조합하여 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP에 대한 분포를 보여준다 (함께: 시그너처 3 = SIGN3). 큰 UMAP 플롯은 13개의 유전자를 모두 사용한 종양-반응성(TR) T 세포의 예측 결과를 보여준다 (SIGN3). b)는 종양-반응성(TR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위해 SIGN3 내에서 바이오마커로 선택된 7개의 단일 유전자 각각을 사용한 종양-반응성(TR) T 세포의 예측의 작은 UMAP 플롯을 보여준다. c)는 종양 비-반응성(TNR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위한 바이오마커로서 SIGN3 내에서 선택된 6개의 단일 유전자 각각을 사용한 종양 비-반응성(TNR) T 세포의 예측의 작은 UMAP 플롯을 보여준다.
도 11: a)는 유전자 세트 2에 의해 구성된 유전자 및 유전자 세트 3에 의해 구성된 유전자와 조합하여 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP에 대한 분포를 보여준다 (함께: 시그너처 4 = SIGN4). 큰 UMAP 플롯은 90개의 유전자 모두를 사용한 종양-반응성(TR) T 세포의 예측 결과를 보여준다 (SIGN4). b)는 종양-반응성(TR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위해 SIGN4 내에서 바이오마커로 선택된 70개 유전자 모두를 사용한 종양-반응성(TR) T 세포의 예측의 UMAP 플롯을 보여준다. c)는 종양 비-반응성(NTR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위한 바이오마커로서 SIGN4 내에서 선택된 20개의 유전자 모두를 사용한 종양 비-반응성(TNR) T 세포의 예측의 작은 UMAP 플롯을 보여준다.
도 12: a)는 106개의 시험된 TCR로부터의 실제 반응성 데이터(도 6)를 기준으로 사용하여, 9개의 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 단일 T-세포 데이터 세트를 사용한 4개의 전술한 유전자 시그너처(SIGN1-4) 각각의 예측의 정확도를 보여준다. Seurat 객체의 모든 세포에 대한 Ucell 점수는 AddModuleScore_Ucell 함수를 사용하여 결정되었다. 출력 데이터는 종양 반응성(TR) 또는 종양 비반응성(NTR)인 기능적으로 시험된 클론형의 세포만 포함하도록 필터링되었다(도 6). 0.02보다 높은 점수를 받은 모든 클론형은 반응성으로 예측된 것으로 주지되었다. 0.02 이하의 점수를 받은 모든 클론형은 비-반응성으로 예측된 것으로 주지되었다. 이에 기반하여 본 발명자들은 각 시그너처에 대한 정확한 예측 및 거짓 예측의 백분율을 계산하였다: 정확 = (참 R + 참 NR) / (예측된 R / 예측된 NR); 거짓 R = 참 R / (예측된 R / 예측된 NR); 거짓 NR = 참 NR / (예측된 R / 예측된 NR). 도시된 바와 같이, CXCL-13, CCL-3 및 유전자 세트 1에 포함된 11개의 유전자를 포함하는 SIGN3는 정확한 예측율이 92.45%인 반면 위음성률(거짓 NR)이 7.55%이고 거짓 반응율(거짓 R)이 0%라는 점에서 가장 정확한 결과를 제공한다. b)는 지시된 바와 같은 하나 또는 두 개의 유전자가 생략된 SIGN3을 사용한 유사한 분석의 결과를 보여준다. SIGN3 내에 포함된 13개의 유전자 각각은 유전자 중 하나가 생략된 경우 거짓 NR 및/또는 거짓 R 비율이 증가한다는 점에서 TCR 예측의 품질에 기여한다. 유전자 IL7R 및 GPR183의 경우, 이들 유전자 중 하나의 생략은 예측의 품질에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 두 유전자를 모두 생략하면 예측의 정확도가 떨어지며, 이는 이러한 유전자가 상호 교환이 가능하지만 둘 다 예측의 품질에 기여한다는 것을 나타낸다.
도 13: a)는 유전자 세트 2에 의해 구성된 유전자와 조합된 유전자 CXCL13 및 CCL3 (함께: SIGN3)에 의해 또는 NIH 특허 출원 제WO 2021/188954호 (NIH)에 기재된 바와 같은 CD8-양성 또는 불특정 T-세포에 대한 모든 유전자, 구체적으로 ACP5, AF243829.4, AFAP1IL2, AHI1, ALOX5AP, APOBEC3C, APOBEC3G, ARHGAP9, ASB2, CARD16, CCL3, CCL4, CCL4L2, CD3G, CD74, CD8A, CD8B, CLIC3, CST7, CTSW, CXCL13, CXCR6, ENTPD1, GALNT2, GNLY, GZMA, GZMB, GZMH, GZMK, HAVCR2, HCST, HLA-DMA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HMGN3, HMOX1, IFNG, ITGAE, ITGAL, ITM2A, JAML, KLRB1, LINC01871, LYST, MIR155HG, MPST, NAP1L4, NELL2, NKG7, NSMCE1, ORMDL3, PD-1, PDLIM4, PLEKHF1, PPP1R16B, PRF1, PTMS, RAB27A, RARRES3, RBPJ, RGS1, SLF1, SMC4, TIGIT, TNFRSF7, TNFRSF9, VCAM1, ANXA1, CCR7, CD45RA, EEF1B2, EMP3, FCGR3A, IL7R, LGALS3, LTB, LYAR, RGCC, RPL36A, S100A10 및 SELL를 포함하는 85-유전자 세트에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터 UMAP에 대한 분포를 보여준다. b)는 106개의 시험된 TCR(도 6)의 실제 반응성 데이터를 기준으로 사용하고 이전 도면의 범례에 설명된 바와 같은 방법론을 사용하여, 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 단일 T 세포 데이터 세트를 사용한 2개의 상기한 시그너처 각각의 예측의 정확도를 보여준다. C)는 알려진 TCR 반응성을 갖는 106개 T 세포 클론형 각각에 대해 수득된 예측 점수를 보여준다(R= 종양-반응성; TNR = 종양 비-반응성). Seurat 객체의 모든 세포에 대한 Ucell 점수는 도 12에 기재된 바와 같이 AddMod-uleScore_Ucell 함수를 사용하여 결정되었다. 종양 비-반응성(TNR)의 클론형당 최고 점수(0.019)에 기반하여, 종양 반응성 9TR) 예측 점수에 대한 컷 값을 0.02로 설정하여 다양한 유전자 시그너처의 예측 정확도를 검증하고 비교하였다. 클론형당 평균 점수는 TR 및 TNR 클론형에 대해 별도로 계산되고 플롯팅되었다.
도 14: a) 상부 패널은 Caushi 등[Caushi et. al. (2021), Nature 596(7870):126]에 의해 공개된 바와 같은 폐암 환자 MD01-004로부터의 T 세포의 UMAP 상에서 종양-반응성(TR) T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 T-세포의 분포를 보여준다. 하단 패널은 동일한 UMAP 상에서 종양 비-반응성(TNR) TCR을 발현하는 T 세포의 분포를 보여준다. 독특한 T 세포 클론형을 나타내는 총 19개의 TCR을 시험하였으며, 그 중 14개는 종양-반응성(TR)이고 5개는 종양 비-반응성(TNR)인 것으로 밝혀졌다. b)는 유전자 세트 2에 의해 구성된 유전자와 조합된 유전자 CXCL13 및 CCL3 중 어느 하나(함께: SIGN3)에 의해 또는 NIH 특허 출원 제WO 2021/188954호 (NIH)에 기재된 바와 같은 CD8-양성 또는 불특정 T-세포에 대한 모든 유전자(구체적인 유전자 명칭에 대해서는 도 13의 범례 참조)를 포함하는 85-유전자 세트에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 폐암 환자 MD01-004의 UMAP 상의 분포를 보여준다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것에 불과하다. 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 단일 세포 라이브러리 제조
T 세포를 풍부하게 하기 위해 종양의 단일 세포 현탁액을 CD45+CD3+ 집단에 대해 FACS-분류하였다. 분류된 T 세포의 단일 세포 라이브러리 작제는 제조업체의 프로토콜에 따라 크롬 단일 세포 면역 프로파일링 키트(10X Chromium)를 사용하여 수행하였다. 그후, 작제된 scVDJ 및 scRNA 라이브러리를 각각 Hiseq2500 Rapid/Nextseq550 및 Hiseq4000 (Illumina) 상에서 시퀀싱하였다.
실시예 2: 단일 세포 RNA 분석
시퀀싱 원시 데이터를 유전자 발현 매트릭스를 생성하기 위해 기본 설정으로 상응하는 GRCh38 게놈 어셈블리가 있는 cellranger 파이프라인(v3.1.0)으로 처리하였다. 매트릭스를 R로 가져와서 Seurat 패키지를 사용하여 분석하였다. 품질 관리를 위해, UMI, 유전자 수 및 미토콘드리아 유전자 발현 백분율에 기반하여 이상치(outlier)를 제거하였다. 그후, 유전자 발현을 형질전환시키고 정규화한 다음 VDJ 유전자를 후속적으로 가변 유전자로부터 제거하였다. 주성분 분석(Principal Component Analysis)에 기반하여 매우 가변성인 유전자를 선택하고 엘보우 플롯(elbow plot)의 변곡점을 기반으로 성분 수를 선택하였다. 그후 비감독(unsupervised) 그래프-기반 클러스터링 방법을 사용하여 세포를 클러스터링하고 시각화를 위해 UMAP을 플롯팅하였다. 차등 유전자 발현 분석은 MAST를 사용하여 수행하였으며 상향조절된 유전자를 사용하여 각 클러스터를 정의하였다.
scVDJ 데이터를 기본 설정의 cellranger 파이프라인을 사용하여 유사하게 처리하였다. 그후 T 세포 수용체 데이터를 유전자 발현 데이터에 맵핑하여 개별 TCR 클론의 전사체학적 분포를 결정하였다. K-평균 클러스터링은 전사체 클러스터에서의 이들의 분포를 기반으로 TCR을 클러스터링하기 위해 수행하였다.
실시예 3: 클로닝
TCR을 클로닝하기 위해, TCR의 가변 영역의 합성 알파 및 베타 VDJ 단편을 Twist Biosciences로부터 입수하였다. TCR 변수 단편은 단일-단계 Bsa-I 매개된 골든 게이트 반응(Golden Gate reaction)을 사용하여 진핵 세포에서 벡터의 염색체외 복제를 허용하는 S/MAR 서열-보유 발현 벡터(pSMARTer)에 삽입하였다. 발현 벡터는 TCR의 별개의 알파 및 베타 폴리펩티드 쇄의 생산을 용이하게 하기 위해 p2a 자가-절단 펩티드 링커 및 뮤린 알파 및 베타 불변 TCR 영역을 보유하도록 설계되었다. 벡터는 후속적으로 NEB5-알파 적격 대장균(NEB); 항생제 내성에 의해 이식유전자에 대해 스크리닝된 콜로니; 및 형질감염을 위해 NucleoBond Extra Maxi EF 키트(Macherey-Nagel)를 사용하여 제조된 내독소-비함유 플라스미드로 형질전환되었다. 일부 실험에서, TCR 가변 단편은 시험관내 전사 및 RNA 형질감염을 위해 pcDNA3.1 플라스미드 백본에 삽입되었다.
실시예 4: NFAT 분석
클로닝된 TCR 발현 벡터 및 나노-루시페라제-기반 NFAT 리포터 벡터(pDONR, 4x NFAT-반응 요소 포함)를 전기천공(Neon Transfection system, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 Jurkat Δ76 세포에 형질감염시켰다. 간단히 말해서, Neon 100 μl 팁(8 μg TCR 발현 벡터 + 5 μg NFAT 리포터 벡터)으로 전기천공당 2x106개 세포를 사용하였다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 기반하여 수확 및 세척한 다음 1325V, 10ms, 3 펄스로 전기천공하고, 10% FCS를 함유하는 항생제-비함유 RPM1 1640 배지로 옮겼다. 환자-자가 PBMC를 항원 제시 세포(APC)로서 사용하고 50U/ml Benzonase(Sigma-Aldrich)를 포함하는 X-VIVO 15 배지(Lonza)에서 공동-배양하기 전에 24시간 동안 해동하고, 96웰 백색 불투명 조직 배양 처리 플레이트(Falcon)에 웰당 1.5x105개 세포로 시딩하기 전에 6-8시간 동안 휴지시켰다. 세포에 16시간 동안 150 μl의 총 용적으로 최종 농도 10μg/ml의 펩티드를 로딩하였다. 사용된 펩티드는 동일한 농도의 인간 IDH1R132H 펩티드(p123-142), MOG(p35-55) 및 음성 대조군으로 동일한 용적의 PBS + 10% DMSO(비히클)였다. 전기천공 48시간 후, TCR-형질전환 Jurkat Δ76 세포를 수확하고 펩티드-로딩된 PBMC와 1:1 비율로 6시간 동안 공동-배양하였다. 인간 T-세포 TransAct 비드(Miltenyi)를 양성 대조군으로 사용하였다. InfluenzaHA(p307-319)에 대해 공개적으로 알려진 TCR을 분석 기준으로 사용하였다. TCR 활성화를 나타내는 나노-루시페라아제 유도는 제조업체의 프로토콜에 따라 Nano-Glo 루시페라아제 분석 시스템(Promega)을 사용하여 분석하였으며, PHERAstar FS 플레이트 판독기(BMG Labtech)에서 신호를 검출하였다.
실시예 5: FACS-기반 분석
클로닝은 PCR에 의해 T7 프로모터를 첨가하여 상기한 바와 같이 수행하였다. 그후 PCR 산물을 DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research)를 사용하여 정제하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 Cellscript 키트를 사용하여 시험관내(in vitro) 전사를 위한 주형으로서 사용하였다. RNA의 농도와 무결성은 각각 Nanodrop 및 Bioanalyzer로 평가하였다. 그후 RNA를 Lonza 4D nucleofactor 장치를 사용하여 확장된 자가 PBMC로 전기천공하였다. 전기천공 후, 세포를 1mL의 배지(TexMACS + 2% AB)를 함유하는 48웰 플레이트에 플레이팅하기 전에 실온에서 10분 동안 배양하고 밤새 휴지되도록 하였다. 배양에 앞서, 150k 세포를 대조군으로 사용하기 위해 CD3, CD4, CD8a, mTCRβ로 염색하였다. 그후 나머지 전기천공된 세포를 표적 세포(종양 세포주/환자 유래 이종이식편)와 함께 5시간 동안 공동-배양하고 1시간 후에 Golgistop 및 Golgiplug를 추가하였다. 공동-배양 후, 죽은 세포 바이오마커(dead cell biomarker), CD3, CD4, CD8a, mTCRβ, TNFα 및 IFNγ에 대해 세포를 염색한 다음 FACSLyric (BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. 일부 실험에서, 죽은 세포 바이오마커, CD3, CD4, CD8a, mTCRβ, TNFα 및 CD107a에 대해 세포를 염색한 다음, FACSLyric을 사용하여 측정하였다. 분석은 FlowJo를 사용하여 수행하였다.
실시예 6: 결과-1
6.1 유전자 발현에 기반한 T 세포의 클러스터링
단일 세포 RNA-seq 데이터세트를 그래프-기반 비감독 클러스터링을 사용하여 정규화, 변환 및 클러스터링하였다. 2명의 선택된 환자 데이터가 여기에 표시된다. 15개의 클러스터 및 16개의 클러스터가 각각 환자 1(도 1a) 및 환자 2(도 1b)로부터 확인되었다.
6.2 시그너처 유전자의 발현
차등 유전자 발현을 MAST를 사용하여 수행하였으며 각 클러스터에 대해 상향조절된 유전자 발현이 발견되었다. 다수의 환자에서, 본 발명자들은 시그너처 유전자 CCL3, CCL3L1, CCL4 및 CCL4L2를 발현하는 클러스터를 확인하였다. 도 1d-1f 및 도 1g-1j는 2명의 선택된 환자의 시그너처 유전자의 발현을 보여준다. 또 다른 시그너처 유전자 CXCL13 발현이 선택된 환자에서 또한 나타난다(도 1k).
6.3 시그너처 유전자에 기반한 반응성 클러스터 정의
시그너처 유전자 CCL3, CCL3L1, CCL4 및 CCL4L2의 발현에 기반하여, 반응성 클러스터를 정의하였다(도 2a 및 2b). 시그너처 유전자 CXCL13의 발현에 기반하여 정의된 반응성 클러스터는 도 2c에 도시되었다.
6.4 CCL3/CCL3L1/CCL4/CCL4L2 시그너처
도 3a는 환자 1에서 상위 13개의 가장 높은 빈도의 TCR 클론형을 도시한다. 앞서 기재된 바와 같이, 시그너처 유전자를 발현하는 클러스터 4는 시그너처 클러스터로 정의되었다. 분포로부터, 본 발명자들은 TCR1, TCR12 및 TCR13이 시그너처 클러스터에서 T 세포의 분포가 더 높다는 것을 명확하게 알 수 있다.
도 3b는 시그너처 클러스터에서의 T 세포의 분율에 기반한 k-평균 클러스터링 결과를 보여준다. 이 클러스터링 결과에 기반하여 3개의 클러스터가 발견되었다. 시그너처 클러스터에서 T 세포의 분율이 높은 클러스터는 반응성이어야 하고, T 세포의 분율이 중간 정도인 클러스터는 반응성일 가능성이 있어야 하며, 시그너처 클러스터에서 T 세포의 분율이 가장 낮은 클러스터는 비-반응성이어야 한다. 따라서, TCR1은 반응성인 것으로 예측되었고, TCR12 및 TCR13은 반응성일 가능성이 있는 것으로 예측된 반면, 다른 TCR은 비-반응성이다. 그후 TCR을 클로닝하여 이러한 TCR의 종양 반응성을 시험하고 시그너처 유전자에 기반하여 TCR 예측을 확증하였다.
도 3c는 FICS-기반 TCR 시험의 결과를 보여준다. 시그너처 유전자에 의해 예측된 바와 같이, TCR1, TCR13 및 아마도 TCR12만이 상응하는 환자의 종양 세포와 공동 배양시 IFNγ를 분비하므로, TCR1 및 TCR13이 실제로 암세포에 반응성이며 TCR12는 가능하게는 반응성임을 보여준다.
6.5 CXCL13 시그너처
도 4a는 환자 2에서 상위 5개의 가장 높은 빈도의 CD4 TCR을 예시한다. 분포로부터, TCR4가 시그너처 클러스터에서 더 높은 분포를 가진 유일한 TCR임은 분명하다. 추가 k-평균 클러스터링(도 4b)은 또한 이 시그너처 클러스터에서의 T 세포 분율에 기반하여 2개의 클러스터가 있음을 발견하였다. TCR4로만 구성된 더 높은 분율을 가진 클러스터는 반응성인 것으로 예측되었다. 그후 이 TCR을 클로닝하고 NFAT 분석으로 시험하였다. 유전자 시그너처에 의해 종양 반응성인 것으로 예측된 TCR4는 펩티드-로딩된 PBMC와 공동배양할 때 실제로 반응성이다(도 4c). 이러한 TCR4에 대한 정확한 서열은 서열번호 1 및 2에 표시된 바와 같다.
실시예 7: 결과-2
7.a 유전자 발현에 기반한 인간 췌장암 샘플로부터 단리된 T 세포의 클러스터링
단일 세포 RNA-seq 데이터세트를 그래프-기반 비감독 클러스터링을 사용하여 정규화, 변환 및 클러스터링하였다. 9명의 환자 데이터로부터의 조합된 데이터가 여기에 표시되며, 9개의 클러스터를 보여준다(도 5).
7.b 기능적 TCR 반응성과 유전자 발현의 연관성
9개의 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 T 세포의 UMAP에서 종양-반응성 T 세포 수용체(TCR)(도 6a) 및 종양 비-반응성 TCR(도 6b)을 발현하는 T 세포의 분포. 독특한 T 세포 클론형을 나타내는 총 106개의 TCR을 시험하였으며, 그 중 53개는 종양-반응성이고 53개는 종양 비-반응성인 것으로 밝혀졌다.
7.c 자가 종양 세포에 대한 시험관내 TCR 반응성의 분석
단일 세포 시퀀싱에 의해 인간 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터 단리된 TCR을 다음과 같이 종양-반응성에 대해 시험하였다. 일차 인간 T 세포를 종양 세포의 유무에 관계없이 배양하고, T 세포 활성화 마커 TNF-알파(TNFa; 도 7a) 또는 CD107a(도 7b)에 대한 세포내 유세포 분석 염색에 의해 T 세포 반응성을 측정한 후 RNA 유전자 형질감염에 의해 표시된 TCR로 형질도입하였다. 나타낸 TCR은 모두 9개의 PDAC 종양 중 하나로부터 유래되었으며 동일한 PDAC 종양 샘플로부터 유래된 자가 종양 세포주에 대해 시험되었다. 나타낸 바와 같이, TCR은 종양 비-반응성(TNR) 또는 종양-반응성(TR)으로 재현 가능하게 밝혀졌다. 모의-형질감염된 T-세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
7.d 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포와 관련된 유전자의 확인
종양-반응성(TR) TCR을 발현하는 T-세포와 관련된 것으로 확인된 유전자가 표 8에 나타내어져 있다. 유전자는 로지스틱 회귀(LR) 검정과 함께 Seurat의 FindMarkers 함수를 사용하여 종양-반응성 클러스터(클러스터 6)와 종양 비-반응성 클러스터(클러스터 1, 3, 8) 간의 차등 발현 시험을 통해 정의되었다. 두 그룹의 세포 사이에 0.8배(로그-스케일) 이상의 차이가 컷오프 값으로 사용되었다. 열거된 모든 유전자는 클러스터 6에서 높게 발현된다.
7.e 비-종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포와 관련된 유전자의 확인
종양 비-반응성(TNR) TCR을 발현하는 T 세포와 관련된 것으로 확인된 유전자가 표 8에 나타내어져 있다. 유전자는 로지스틱 회귀(LR) 검정과 함께 Seurat의 FindMarkers 함수를 사용하여 종양-반응성 클러스터(클러스터 6)와 종양 비-반응성 클러스터(클러스터 1, 3, 8) 간의 차등 발현 시험을 통해 정의되었다. 두 그룹의 세포 사이에 0.8배(로그-스케일) 이상의 차이가 컷오프 값으로 사용되었다. 열거된 모든 유전자는 클러스터 1, 3 및 8에서 높게 발현된다.
7.f 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포의 확인을 위한 CCL3L1, CCL4, CCL4L2, CCL3 및 CXCL13 유전자 시그너처를 가진 PDAC 단일 T 세포 시퀀싱 데이터 세트의 분석
도 8은 유전자 세트 1에 포함된 유전자(CCL3L1, CCL4, CCL4L2, CCL3 및 CXCL13)에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP 상의 분포를 보여준다. 큰 UMAP 플롯은 유전자 세트 1에 포함된 5개의 유전자를 모두 사용한 예측 결과를 보여준다 (시그너처 1 = SIGN1). 작은 UMAP 플롯은 5개의 단일 유전자 각각을 사용한 예측 결과를 보여준다. 도 6a의 UMAP 플롯과 비교하면 이러한 5개 유전자 중 CXCL13 및 CCL3이 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포에 대한 최고의 바이오마커인 것으로 나타났다.
7.g 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포의 확인을 위한 CCL3, 및 CXCL13 유전자 시그너처를 가진 PDAC 단일 T 세포 시퀀싱 데이터의 분석
도 9는 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해서만 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP 상의 분포를 보여준다 (시그너처 2 = SIGN2).
7.h 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포의 확인을 위한 13개 유전자 시그너처(SIGN3)를 가진 PDAC 단일 T 세포 시퀀싱 데이터의 분석
도 10a는 유전자 세트 2에 의해 구성된 11개의 유전자와 조합하여 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP 상의 분포를 보여준다 (함께: 시그너처 3 = SIGN3). 도 10b의 작은 UMAP 플롯은 종양-반응성(TR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위해 SIGN3 내에서 바이오마커로 선택된 7개의 단일 유전자 각각을 사용한 종양-반응성(TR) T 세포의 예측을 보여준다. 도 10c의 작은 UMAP 플롯은 종양 비-반응성(TNR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위한 바이오마커로서 SIGN3 내에서 선택된 6개의 단일 유전자 각각을 사용한 종양 비-반응성(TNR) T 세포의 예측을 보여준다.
7.i 종양-반응성 TCR를 발현하는 T 세포의 확인을 위한 90개 유전자 서명(SIGN4)을 가진 PDAC 단일 T 세포 시퀀싱 데이터의 분석
도 11a는 유전자 세트 2에 의해 구성된 유전자 및 유전자 세트 3에 의해 구성된 유전자와 조합하여 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UMAP 상의 분포를 보여준다 (함께: 시그너처 4 = SIGN4). 도 11b의 작은 UMAP 플롯은 종양-반응성(TR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위해 SIGN4 내에서 바이오마커로 선택된 70개 유전자 모두를 사용한 종양 반응성(TR) T 세포의 예측을 보여준다. 도 11c의 작은 UMAP 플롯은 종양 비-반응성(NTR) TCR을 발현하는 T 세포를 예측하기 위한 바이오마커로서 SIGN4 내에서 선택된 20개의 유전자 모두를 사용한 종양 비-반응성(TNR) T 세포의 예측을 보여준다.
7.j 종양 반응성 TCR을 발현하는 T 세포의 정확한 예측을 위한 13-유전자 시그너처(SIGN3)로 구성된 모든 유전자의 중요성
도 12a에 나타낸 바와 같이, CXCL-13, CCL-3 및 유전자 세트 1에 포함된 11개의 유전자를 포함하는 SIGN3는 정확한 예측율이 92.45%인 반면 위음성률(거짓 NR)은 7.55%이고 거짓 반응율(거짓 R)은 0%라는 점에서 다른 3개의 유전자 시그너처에 비해 가장 정확한 결과를 제공한다. 도 12b는 지시된 바와 같은 하나 또는 두 개의 유전자가 생략된 SIGN3을 사용한 유사한 분석의 결과를 보여준다. 도시된 바와 같이, SIGN3 내에 포함된 13개의 유전자 각각은 유전자 중 하나가 생략된 경우 거짓 NR 및/또는 거짓 R 비율이 증가한다는 점에서 TCR 예측의 품질에 기여한다. 유전자 IL7R 및 GPR183의 경우, 이들 유전자 중 어느 하나의 생략은 예측의 품질에 영향을 미치지 않는다. 그러나 두 유전자를 모두 생략하면 예측의 정확도가 떨어지며, 이는 이들 유전자가 상호 교환 가능하지만 둘 다 예측의 품질에 기여한다는 것을 나타낸다.
7.k 13-유전자 시그너처(SIGN3) 및 제WO 2021/188954호에 기재된 바와 같은 유전자 시그너처를 사용한 췌장암 데이터 세트를 기반으로 한 반응성 TCR을 발현하는 T 세포의 예측의 비교
도 13a는 유전자 세트 2에 의해 구성된 유전자와 조합된 유전자 CXCL13 및 CCL3에 의해 또는 또는 NIH 특허 출원 제WO 2021/188954호 (NIH)에 기재된 바와 같은 CD8-양성 또는 불특정 T-세포에 대한 모든 유전자를 포함하는 85-유전자 세트(특정 유전자 명칭에 대해서는 도 13의 범례 참조)에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T-세포의 9개 췌장 도관 선암종(PDAC) 샘플로부터의 UTAP 상의 분포를 보여준다 (함께: SIGN3). 도 13b에 나타낸 바와 같이, SIGN3의 예측 정확도는 NIH 시그너처의 정확도보다 높다. 또한, 각 클론형에 대한 점수를 기반으로 한 종양-반응성(R)과 비-종양-반응성(NR) T 세포 클론형 간의 구별은 SIGN3을 사용할 때 덜 모호하다(도 13c).
7.l 13-유전자 시그너처(SIGN3) 및 제WO 2021/188954호에 기재된 바와 같은 유전자 시그너처를 사용한 폐암 데이터 세트를 기반으로 한 반응성 TCR을 발현하는 T 세포의 예측의 비교
도 14a, 상부 패널은 Caushi 등[Caushi et. al. (2021), Nature 596(7870):126]에 의해 공개된 바와 같은 폐암 환자 MD01-004로부터의 T 세포의 UMAP 상에서 종양-반응성(TR) T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 T-세포의 분포를 보여준다. 하단 패널은 동일한 UMAP 상에서 종양 비-반응성(TNR) TCR을 발현하는 T 세포의 분포를 보여준다. 독특한 T 세포 클론형을 나타내는 총 19개의 TCR을 시험하였으며, 그 중 14개는 종양-반응성(TR)이고 5개는 종양 비-반응성(TNR)인 것으로 밝혀졌다. 도 14b는 유전자 세트 2에 의해 구성된 유전자와 조합된 유전자 CXCL13 및 CCL3 중 어느 하나(함께: SIGN3)에 의해 또는 NIH 특허 출원 제WO 2021/188954호 (NIH)에 기재된 바와 같은 CD8-양성 또는 불특정 T-세포에 대한 모든 유전자를 포함하는 85-유전자 세트(구체적인 유전자 명칭에 대해서는 도 13의 범례 참조)에 의해 종양-반응성 TCR을 발현하는 것으로 예측된 T 세포의 폐암 환자 MD01-004의 UMAP 상의 분포를 보여준다.
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표 1: 핵심 시그너처의 바이오마커
표 2: 부속 1 시그너처의 바이오마커
표 3: 부속 2 시그너처의 바이오마커
표 4: 배제 시그너처의 바이오마커
표 5: 유전자 세트 2의 추가 바이오마커; 예측에 대해, R은 발현이 반응성 세포를 예측함을 의미하고, NR은 발현이 비-반응성 세포를 예측함을 의미한다.
표 6: 유전자 세트 3의 바이오마커; 예측에 대해, R은 발현이 반응성 세포를 예측함을 의미하고, NR은 발현이 비-반응성 세포를 예측함을 의미한다.
표 7: 종양-반응성 TCR을 발현하는 T 세포와 관련된 유전자/바이오마커
표 8: 종양 비-반응성 TCR을 발현하는 T 세포와 관련된 유전자/바이오마커
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum Universit? Heidelberg <120> Antigen Reactive T-Cell Receptors <130> DK16297PC1 <150> EP21164371.3 <151> 2021-03-23 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Leu Val Thr Ser Ile Thr Val Leu Leu Ser Leu Gly Ile Met 1 5 10 15 Gly Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Glu Ser Asn Glu Glu 20 25 30 Glu Pro Val His Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp 35 40 45 Tyr Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val 50 55 60 Ile His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Met Ala Ser Leu Ala 65 70 75 80 Ile Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu His Arg Ala Thr 85 90 95 Leu Arg Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Leu Arg Val Ala Tyr Ser 100 105 110 Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser 115 120 125 Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys 130 135 140 Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp 145 150 155 160 Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr 165 170 175 Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly 180 185 190 Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe 195 200 205 Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala 210 215 220 Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln 225 230 235 240 Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly 245 250 255 Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 <210> 2 <211> 315 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Pro Gly Leu Leu His Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Thr 1 5 10 15 Gly His Gly Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr 20 25 30 Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His 35 40 45 Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu 50 55 60 Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro 65 70 75 80 Asp Asn Phe Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp 85 90 95 Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr 100 105 110 Ser Arg Gly Val Ala Gly Ser Ser Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro 130 135 140 Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys 180 185 190 Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp 225 230 235 240 Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asn Ser Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly 305 310 315 <210> 3 <211> 807 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgaagttgg tgacaagcat tactgtactc ctatctttgg gtattatggg tgatgctaag 60 accacacagc caaattcaat ggagagtaac gaagaagagc ctgttcactt gccttgtaac 120 cactccacaa tcagtggaac tgattacata cattggtatc gacagcttcc ctcccagggt 180 ccagagtacg tgattcatgg tcttacaagc aatgtgaaca acagaatggc ctctctggca 240 atcgctgaag acagaaagtc cagtaccttg atcctgcacc gtgctacctt gagagatgct 300 gctgtgtact actgcatcct gagagtcgca tactctgggg ctgggagtta ccaactcact 360 ttcgggaagg ggaccaaact ctcggtcata ccaaacatcc agaatcctga gcctgccgtg 420 taccagctga aggaccctag aagccaggac agcaccctgt gcctgttcac cgacttcgac 480 agccagatca acgtgcccaa gaccatggaa agcggcacct tcatcaccga caagtgtgtg 540 ctggacatga aggccatgga cagcaagagc aacggcgcca ttgcctggtc caaccagacc 600 agcttcacat gccaggacat cttcaaagag acaaacgcca cctatcctag cagcgacgtg 660 ccctgtgatg ccacactgac cgagaagtcc ttcgagacag acatgaacct gaacttccag 720 aacctgagcg tgatgggcct gagaatcctg ctgctgaagg tggccggctt caacctgctg 780 atgaccctga gactgtggtc cagctga 807 <210> 4 <211> 945 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgggtcctg ggcttctcca ctggatggcc ctttgtctcc ttggaacagg tcatggggat 60 gccatggtca tccagaaccc aagataccag gttacccagt ttggaaagcc agtgaccctg 120 agttgttctc agactttgaa ccataacgtc atgtactggt accagcagaa gtcaagtcag 180 gccccaaagc tgctgttcca ctactatgac aaagatttta acaatgaagc agacacccct 240 gataacttcc aatccaggag gccgaacact tctttctgct ttcttgacat ccgctcacca 300 ggcctggggg acgcagccat gtacctgtgt gccaccagca gaggagtggc agggagtagc 360 aatcagcccc agcattttgg tgatgggact cgactctcca tcctagaaga tctgcggaac 420 gtgacccctc ctaaggtgtc cctgttcgag cctagcaagg ccgagatcgc caacaagcag 480 aaagccacac tcgtgtgcct ggccagaggc ttctttcccg atcacgtgga actgtcttgg 540 tgggtcaacg gcaaagaggt gcacagcggc gtctgcacag atccccaggc ctacaaagag 600 agcaactaca gctactgcct gagcagcaga ctgagagtgt ccgccacctt ctggcacaac 660 cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag tttcacggcc tgagcgaaga ggacaagtgg 720 cctgagggct ctcccaagcc tgtgacacag aatatctctg ccgaagcctg gggcagagcc 780 gattgtggaa ttaccagcgc cagctaccag cagggcgtgc tgtctgccac aatcctgtac 840 gagatcctgc tgggcaaagc cactctgtac gccgtgctgg tgtctaccct ggtcgtgatg 900 gccatggtca agcggaagaa cagccggaag agaagaggaa gcggc 945

Claims (19)

  1. T 세포 활성화 항원을 제시하는 대상체의 세포에 반응성인 T 세포(반응성 T-세포)를 확인하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체의 샘플로부터 T-세포에서 CXCL13, CCL3, CCL3L1, CCL4, 및 CCL4L2 중 적어도 하나의 발현을 결정하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 결정에 기초하여 반응성 T 세포를 확인하는 단계를 포함하고,
    바람직하게 상기 T 세포 활성화 항원이 암 항원 또는 자가면역 T 세포 활성화 항원이고, 보다 바람직하게는 암 항원인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 CXCL13, CCL3, CCL3L1, CCL4, 및 CCL4L2 중 적어도 2개, 바람직하게는 CXCL13 및 CCL3의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)가 TNFRSF9, VCAM1, TIGIT, HAVCR2, GZMB, GPR183, CCR7, IL7R, VIM, LTB, 및 JUNB로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 ACP5, NKG7, KRT86, LAYN, HLA-DRB5, CTLA4, HLA-DRB1, IGFLR1, HLA-DRA, LAG3, GEM, LYST, GAPDH, CD74, HMOX1, HLA-DPA1, DUSP4, CD27, ENTPD1, AC243829.4, HLA-DPB1, GZMH, KIR2DL4, CARD16, HLA-DQA1, CCL5, CST7, LINC01943, PLPP1, CTSC, PRF1, MTSS1, FKBP1A, CXCR6, HLA-DMA, ATP8B4, GZMA, GALNT2, CHST12, SNAP47, TNFRSF18, SIRPG, CD38, RBPJ, TNIP3, AHI1, NDFIP2, FABP5, RAB27A, ADGRG1, CTSW, APOBEC3G, IFNG, CTSD, PKM, NAB1, PSMB9, PARK7, KLRD1, ASXL2, KLRC2, LAIR2, FAM3C, ZFP36, FTH1, FOS, ZFP36L2, ANXA1, CD55, SLC2A3, LMNA, CRYBG1, DUSP1, PTGER4, MYADM, BTG2, 및 NFKBIA로 구성된 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가
    (i) CXCL13, CCL3, 및 제3항에 열거된 모든 바이오마커;
    (ii) CXCL13, CCL3, 및 IL7R을 제외한 제3항에 열거된 모든 바이오마커; 또는
    (iii) CXCL13, CCL3, 및 GPR183을 제외한 제3항에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가
    (iv) CXCL13, CCL3, 및 제3항 및 제4항에 열거된 모든 바이오마커;
    (v) CXCL13, CCL3, 및 IL7R을 제외한 제3항에 열거된 모든 바이오마커, 및 제4항에 열거된 모든 바이오마커; 또는
    (vi) CXCL13, CCL3, 및 GPR183을 제외한 제3항에 열거된 모든 바이오마커, 및 제4항에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화 항원이 암 항원이고, 바람직하게는 상기 샘플이 종양 샘플인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암이 췌장암(pancreatic cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 또는 임의의 다른 원발성 또는 전이성 고형 종양 유형이고, 바람직하게는 췌장암 또는 결장직장암인 방법.
  9. 대상체의 세포, 바람직하게는 암 세포 상에 제시된 T 세포 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 방법으로서, 상기 방법이
    (A) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 반응성 T 세포를 확인하는 단계,
    (B) 단계 (A)에서 확인된 반응성 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계; 및, 이로써,
    (C) 세포 상에 제시된 활성화 항원에 결합하는 TCR을 확인하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 적어도 하나의 바이오마커 및/또는 단계 (B)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 발현이 단일-세포 시퀀싱, 바람직하게는 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 결정되는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 방법이 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포에서 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 단계 B1)을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방법이 바람직하게는 사량체 분석에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 T 세포 활성화 항원에 대한 단계 B1)에서 발현된 TCR의 결합을 결정하는 단계 B2)를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 방법이 단계 B1)에서 발현된 TCR에 의해 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포의 인식을 결정하는 단계 B3)을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 B)에서 결정된 적어도 CDR을 포함하는 가용성 TCR을 생성하고, 주요 조직적합성 복합체(MHC), 바람직하게는 MHC 클래스 I, 분자에 복합체화된 암 세포 및/또는 암 항원에 대한 상기 가용성 TCR의 결합을 결정하는 단계 B4)를 추가로 포함하는 방법.
  15. T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따라 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 결합하는 TCR을 확인하는 단계,
    (ii) T 세포에서 단계 (I)의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 TCR을 발현하는 단계, 및, 이로써,
    (iii) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포, 바람직하게는 암 세포를 인식하는 T 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  16. 약제에 사용하거나 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인되고/되거나 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 반응성 T 세포.
  17. 반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
    (I) 대상체의 샘플에서 T 세포의 복수의 바이오마커의 발현 데이터를 제공하는 단계,
    (II) 단계 (I)의 바이오마커의 발현에 기초하여 상기 복수의 T 세포의 클러스터링을 제공하는 단계;
    (III) 단계 (II)의 T 세포의 TCR의 적어도 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 제공하는 단계;
    (IV) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대한 단계 (III)의 CDR을 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포의 반응성을 결정하는 단계;
    (V) TCR이 단계 (IV)에서 T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포에 대해 반응성인 것으로 결정된 T-세포와 클러스터링하는 추가 T-세포에 대해 단계 (III) 및 (IV)를 적어도 한 번 반복하는 단계, 여기서 상기 추가 T-세포의 TCR은 단계 (IV)의 TCR과 동일하지 않음;
    (VI) T 세포 활성화 항원을 제시하는 세포를 인식하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포의 가장 높은 분율을 포함하는 단계 (II)의 적어도 하나의 클러스터를 결정하는 단계; 및
    (VII) 단계 (VI)에서 결정된 클러스터에서 가장 높은 분율의 T 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 바이오마커를 결정하여, 암-반응성 T 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포(들)가 CD8+ T-세포(들) 또는 CD4+ T-세포, 바람직하게는 CD8+ T-세포(들)인, 반응성 T 세포 또는 방법.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR이 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하고, 바람직하게는 이들로 구성되는, 반응성 T 세포 또는 방법.
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