JP2024508856A - 卵巣がんの診断方法及び処置方法 - Google Patents

Abstract

本出願は、卵巣がんを有するヒト患者のための処置プロトコルを設計する方法、並びに卵巣がんの処置方法を開示する。本出願はまた、腫瘍の種類によってヒト患者の卵巣がんを特徴付ける方法を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１５５，０８９号及び２０２１年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，１６７号の優先権の利益を主張し、これらは両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

分野
卵巣がんを有するヒト患者のための処置プロトコルを設計する方法、卵巣がんの処置方法、及びヒト患者の卵巣がんを腫瘍の種類によって特徴付ける方法。

背景
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍細胞、浸潤性免疫細胞、及び非細胞成分と絡み合った間質細胞で構成される複雑な生態系である。多様な細胞表現型及び機能表現型、並びにこれらの構成要素内及び構成要素間の動的相互作用は、腫瘍の異なる生物学を形成し、免疫療法に対する異なる応答に寄与し得る。しかしながら、これらの重要な細胞の不均一性及び相互作用の高分解能の特徴付けを欠けている。以前の研究のほとんどは、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はバルクＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）デコンボリューションアルゴリズム（例えば、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ、ｘＣｅｌｌ）などの比較的低分解能な技術に依存していた。Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：２０２３－２１３（２００３）；Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．，１２：４５３－４５７（２０１５）；Ａｒａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，１８：２０２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１７－１３４９－１（２０１７）。最近の研究は、別個の免疫表現型（Ｔｈｏｒｓｓｏｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４８：８１２－８３０．ｅ１４（２０１８））を特定するマルチオミクスプラットフォーム及びｉｎ ｓｉｔｕリンパ球定量化を統合したが、これらの研究は、細胞の不均一性及び空間分布に関する高分解能の情報を欠いていた。

腫瘍免疫連続体の概念は、全体量に加えて免疫浸潤物の空間分布をよりよく捕捉するために導入された。Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：１８６５－１８７４（２０１６）；Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５２：１７－３５（２０２０）。ＴＭＥ連続体は、ＴＭＥにおけるＴ細胞の空間的分布に基づく３つの免疫表現型を含む：（１）Ｔ細胞が腫瘍上皮に浸潤する免疫炎症／浸潤表現型；（２）浸潤性Ｔ細胞が腫瘍上皮ではなく腫瘍間質に蓄積する免疫除外表現型、及び（３）Ｔ細胞が非常に少数で存在するか又は完全に存在しない免疫砂漠表現型。このモデルに基づいて、デジタル病理ＣＤ８ ＩＨＣをバルクトランスクリプトーム分析と統合して、腫瘍免疫表現型に従って卵巣腫瘍を分類する機械学習アプローチが開発された。Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７９：４６３（２０１９）。この分類は、バルクＲＮＡｓｅｑデータに基づいて、異なる免疫表現型に関連する性質の特徴付けを可能にした。しかしながら、バルクＲＮＡｓｅｑの生来的な制限は、（１）細胞レベルでのＴＭＥの不均一性を調べる分解能、及び（２）示されていない細胞集団における変化を捕捉する感受性を欠くことである。この目的のため、単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）が、様々ながん適応症におけるＴＭＥの組成を調べるために過去１０年間にわたって使用されてきた。Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：９７８－９８５（２０１８）；Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：１２７７－１２８９（２０１８）；Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７６：７７－７８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．１１．０４３（２０１９）；Ｐｕｒａｍ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７１：１６１１－１６２４．ｅ２４（２０１７）；Ｓａｖａｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：９８６－９９３（２０１８）；Ｔｉｒｏｓｈ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：１８９－１９６（２０１６）；Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７９：２７４－２７８（２０２０）；Ｙｏｓｔ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５：１２５１－１２５９（２０１９）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５４：３２１－３３（２０１８）；Ｚｈａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７９：８２９－８４５（２０１９）。しかしながら、ほとんどのｓｃＲＮＡｓｅｑ研究は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の特徴付けに焦点を当てた。ＴＭＥ中の他の細胞型が免疫表現型をどのように形作るかの系統的な単一細胞の特徴付けは、これまで報告されていない。

概要
本開示は、ヒト卵巣がんの診断方法、処置方法、及び患者の転帰を予測するための方法に関する。本開示は、以下の実施形態を含むがこれらに限定されない複数の実施形態を含む。

実施形態１は、卵巣がんを有するヒト患者のための処置プロトコルを設計する方法であって、
ａ．患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定すること、並びに
ｂ．発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較することであって、
参照試料と比較したＧＺＭＫ発現レベルの上昇が生存の低下に関連し、参照試料と比較したＴＲＥＭ１レベルの上昇がＭＤＳＣ様骨髄細胞の存在に関連し、参照試料と比較したＴＲＥＭ２レベルの上昇がＴＡＭ様マクロファージの存在に関連する、発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較すること
を含む、卵巣がんを有するヒト患者のための処置プロトコルを設計する方法である。

実施形態２は、ヒト患者における卵巣がんの処置方法であって、
ａ．患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定すること、
ｂ．発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較することであって、ＧＺＭＫ発現レベルの上昇が生存の低下に関連し、ＴＲＥＭ１レベルの上昇がＭＤＳＣ様骨髄細胞の存在と関連し、ＴＲＥＭ２レベルの上昇がＴＡＭ様マクロファージの存在と関連する、発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較すること、並びに
ｃ．患者が、
ｉ．参照試料と比較したＴＲＥＭ１の発現増加を有する場合、ＭＤＳＣ様骨髄細胞を標的とする治療法を患者に投与すること、
ｉｉ．参照試料と比較したＴＲＥＭ２の発現増加を有する場合、ＴＡＭ様マクロファージを標的とする治療法を患者に投与すること、及び／又は
ｉｉｉ．参照試料と比較したＧＺＭＫの発現減少を有する場合、患者に化学療法を投与すること
を含む、ヒト患者における卵巣がんの処置方法である。

実施形態３は、腫瘍においてＧＺＭＫ発現の増加が示された後、化学療法を停止する、実施形態１又は２に記載の処置方法である。いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫレベルは、化学療法中の（同じ患者における）より早い時点での同じ発現レベルと比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫレベルは、参照試料と比較して上昇する。

実施形態４は、腫瘍においてＧＺＭＫ発現の増加が示された後、緩和ケアが患者に施される、実施形態１～３のいずれか一項に記載の処置方法である。

実施形態５は、ヒト患者における卵巣がんを、砂漠型、除外型、又は浸潤型の腫瘍として特徴付ける方法であって、
ａ．患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＣＤ８Ａ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定すること、並びに
ｂ．発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較することであって、参照試料と比較したＧＺＭＢのより高い発現が浸潤型腫瘍に関連し、参照試料と比較したＧＺＭＫのより高い発現が除外腫瘍に関連し、参照試料と比較したＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞のより高い発現が除外腫瘍に関連し、参照試料と比較したＴＲＥＭ１のより高い発現が砂漠腫瘍に関連し、参照試料と比較したＴＲＥＭ２のより高い発現が除外腫瘍及び浸潤腫瘍に関連する、発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較すること
を含む、ヒト患者における卵巣がんを、砂漠型、除外型又は浸潤型の腫瘍として特徴付ける方法である。

実施形態６は、卵巣がんを有するヒト患者を処置する方法であって、
ａ．患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＣＤ８Ａ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定することによって、卵巣がんを砂漠、除外、又は浸潤として特徴付けること、
ｂ．発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較することであって、参照試料と比較したＧＺＭＢのより高い発現が浸潤型の腫瘍に関連し、参照試料と比較したＧＺＭＫのより高い発現が除外腫瘍に関連し、参照試料と比較したＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞のより高い発現が除外腫瘍に関連し、参照試料と比較したＴＲＥＭ１のより高い発現が砂漠腫瘍に関連し、参照試料と比較したＴＲＥＭ２のより高い発現が除外腫瘍及び浸潤腫瘍に関連する、発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較すること、並びに
ｃ．患者を、
ｉ．ＴＲＥＭ１のより高い発現が砂漠腫瘍を示唆する場合、化学療法又は自己／同種異系エフェクター細胞で処置すること、
ｉｉ．ＧＺＭＢ及び／又はＴＲＥＭ２のより高い発現が浸潤腫瘍を示唆する場合、免疫療法（チェックポイント療法を含む）で処置すること、
ｉｉｉ．ＧＺＭＫのより高い発現が除外腫瘍を示唆する場合、緩和ケアで処置すること、
ｉｖ．ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞のより高い発現が除外腫瘍を示唆する場合、緩和ケアで処置すること、及び／又は
ｖ．免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞輸送調節因子、エピジェネティック調節因子、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）リモデリング分子、及び／又は放射線療法で処置すること
を含む、卵巣がんを有するヒト患者を処置する方法である。

実施形態７は、参照試料が健康な対象である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態８は、参照試料が治療に反応した患者であり、場合によっては患者が卵巣がんを有する患者であり得る、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態９は、参照試料が、既知の砂漠腫瘍を有する患者であり、場合によっては患者が卵巣がんを有する患者であり得る、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１０は、参照試料が、既知の除外腫瘍を有する患者であり、場合によっては患者が卵巣がんを有する患者であり得る、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１１は、参照試料が、既知の浸潤腫瘍を有する患者であり、場合によっては患者が卵巣がんを有する患者であり得る、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１２は、参照試料が複数の患者及び／又は対象にわたってまとめられたデータであり、場合によっては、患者が卵巣がんを有する患者であり得る、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１３は、方法が、患者からの腫瘍細胞中のＧＭＺＢ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の全てを評価することを含む、実施形態５～１２のいずれか１つに記載の方法である。腫瘍細胞は、腫瘍からの間質細胞又は免疫細胞であり得る。

実施形態１４は、方法が、患者からの腫瘍細胞中のＧＭＺＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の全てを評価することを含む、実施形態１～４又は７～１３のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１５は、方法が、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定する前に、患者から腫瘍試料を得ることを更に含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１６は、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の発現レベルが、免疫組織化学を使用して決定される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１７は、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の発現レベルが、ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定することによって決定される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１８は、方法が、腫瘍試料中の少なくとも１つの参照遺伝子の発現レベルを決定することを更に含み、すなわち、参照遺伝子は、研究者が患者からの腫瘍試料中の少なくとも１つの発現レベルを決定している遺伝子と同じ遺伝子である、実施形態１７に記載の方法である。

実施形態１９は、方法が、腫瘍試料中の少なくとも１つの参照遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベルに対してｍＲＮＡ転写物のレベルを正規化して、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２のｍＲＮＡ転写物の正規化レベルを提供することを更に含む、実施形態１７又は１８に記載の方法である。

実施形態２０は、ｍＲＮＡ転写産物のレベルがｓｃＲＮＡｓｅｑによって決定される、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２１は、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを評価する前に、腫瘍試料を腫瘍細胞、間質細胞、及び免疫細胞に分離する、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２２は、細胞分離がＦＡＣＳによって行われる、実施形態２１に記載の方法である。

実施形態２３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＧＺＭＫのｍＲＮＡ転写物の正規化レベルの上昇がある、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２４は、ＧＺＭＫ陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、ＧＺＭＫ陰性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の数よりも多い、実施形態２３に記載の方法である。

実施形態２５は、マクロファージにおいて、ＴＲＥＭ２のｍＲＮＡ転写物の正規化レベルの上昇がある、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２６は、化学療法が、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）（登録商標））、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ－１６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）））、ドキソルビシン（リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））など）、メルファラン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、トポテカン、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ニクロサミド、メトホルミン、ＢＡＹ ８７－２２４３、デシタビン、ガデシタビン、アザシチジン、アバゴボマブ、オレゴボマブ、ニボルマブを含むＮｅｏＶａｘ、アンロチニブ、ロスバスタチンを含むエノキサパリン、ニラパリブ、キアウラニブ、ペグ化リポソームドキソルビシンを含むトラベクチン、ＡＣＢ－Ｓ６－５００、ＳＧＩ－１１０、レトロゾール、パゾパニブ、パルボシクリブ、アパチニブ、マシチニブ、カバジタキセル、ＩＭＡＢ０２７、フルダラビン、ＡＢＴ－８８８、フォスタマチニブ、オラパリブ、テモゾロミド、タラゾパリブ、Ｐ５３－ＳＬＰ、ＯＭＰ－５４Ｆ２８、ヒドララジン及びバルプロ酸マグネシウム、フルダラビン、ラパチニブ、ベンダムスチンＨＣＬ、ソラフェニブ、カンレリズマブ、トレメリムマブ、トコトリエノール、及び／又はエキセメスタンを含む、実施形態２～４又は６～２５のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２７は、ＭＤＳＣ骨髄性細胞を標的とする治療法が、
ａ．シスプラチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン及び／又はパクリタキセル；
ｂ．肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）ベータアゴニスト；
ｃ．チェックポイント阻害剤、例えば、
ｉ．抗ＰＤ－１療法（例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、トリパリマブ、ＣＴ－０１１、モノクローナル抗体ＨＸ００８８、及び抗体ＡＫ１０５を含む抗ＰＤ－１抗体）；
ｉｉ．抗ＰＤ－Ｌ１療法（例えば、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、トレメリムマブ、ｍＡｂ ＺＫＡＢ００１、トレメリムマブ、及びラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体）；及び／又は
ｄ．抗ＴＧＦβ療法（例えば、ペンブロリズマブ及びフレソリムマブを含む抗ＴＧＦβ抗体）
を含む、実施形態２～４、７～１２、又は１４～２５のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２８は、がん免疫療法剤が、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、モトリモド、腫瘍溶解性ウイルス、ＮＹ－ＥＳＯ－１がんワクチン、抗ＸＢＰ１療法、抗アンジオポエチン療法、抗ＤＬＬ／Ｎｏｔｃｈ療法、抗ＨＥＲ２療法、抗メソテリン療法、抗ＲＡＮＫＬ療法、抗ＴＲＯＰ２療法、及び／又はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ｒ療法を含む、実施形態６～１３又は１５～２６のいずれか１つに記載の方法である。

図１Ａ～図１Ｇは、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析された１５個全ての卵巣がん試料からの腫瘍、免疫及び間質区画を示す。図１Ａは、全ての患者の腫瘍区画、間質区画及び免疫区画を組み合わせた、全ての配列決定されたライブラリから凝集した全ての細胞のｕＭＡＰ投影を示す。細胞をＦＡＣＳ選別区画に従って着色する。単一細胞ＲＮＡシーケンシングのために組み合わされた間質細胞及び免疫細胞は、濃い青色に着色されている。図１Ｂは、ｓｅｕｒａｔ ｌｏｕｖａｉｎクラスタリングによってインデックス付けされたｕＭＡＰを示す。クラスタ３４は、上皮マーカー（ＰＩＦＯ、ＣＡＰＳ、ＴＭＥＭ１９０、ＳＮＴＮ）の発現に基づいて正常な上皮細胞として特定され、更なる分析から除外された。Ｌａｍｂｒｅｔｃｈｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１－１９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－００９６－５（２０１８）；Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７９：２７４－２７８（２０２０）。図１Ｃは、ＢにおけるようなｕＭＡＰ投影を示すが、正常な上皮細胞が除去され、患者の同一性によって色付けされている。図１Ｄは、計算的にフィルタリングされた細胞のサブセットのｕＭＡＰ投影を示し、計算的に割り当てられた腫瘍区画、間質区画及び免疫区画によって色付けされている。図１Ｅは、代表的な間質細胞マーカー（ＣＯＬ３Ａ１、ＤＣＮ）、免疫細胞マーカー（ＰＴＰＲＣ、ＣＤ７９Ａ）及び正常な上皮細胞マーカー（ＰＩＦＯ、ＣＡＰＳ、ＴＭＥＭ１９０、ＳＮＴＮ）のマーカー遺伝子発現を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図１Ｆは、患者起源によって色付けされた全ての患者の間質細胞のｕＭＡＰ投影を示す。図１Ｇは、患者起源によって色付けされた全ての患者の免疫細胞のｕＭＡＰ投影を示す。

図２Ａ～図２Ｆは、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって定義される患者由来の原発性卵巣腫瘍の完全な細胞生態系を示す。図２Ａは、研究設計及びワークフローの概要を示す。バルクＲＮＡシーケンシング及びＣＤ８ ＩＨＣ染色を４２個の卵巣がん試料について行った。組み合わせた情報を使用して、各試料の免疫表現型を決定した。４２個の試料のうち、最も明確な免疫表現型を有する１５個の試料を選択し、各免疫表現型のうち５個は、浸潤、除外及び砂漠であった。各単一細胞解離試料から、腫瘍、免疫及び間質の細胞集団を選別し、次いで１０×単一細胞ＲＮＡシーケンシングに供した。計算分析には、クラスタ分析、細胞型分析及び単一患者分析、バッチ効果補正及び機能的分析並びに細胞相互作用分析が含まれた。免疫蛍光アッセイ及びＲＮＡｉｓｈアッセイ、並びに臨床バルクＲＮＡｓｅｑデータセットのデコンボリューション分析を使用して、所見を検証した。図２Ｂは、患者によって色付けされた１５人全ての患者の腫瘍細胞のｕＭＡＰ投影を示す。プロットの凡例における略語は、腫瘍免疫表現型及び各腫瘍免疫表現型内の患者数に対応する：ｄｅｓ＝砂漠、ｅｘｃ＝除外、ｉｎｆ＝浸潤。図２Ｃは、特定された細胞型によって色付けされた全ての患者の間質細胞のｕＭＡＰ投影を示す。同一のｕＭＡＰは、細胞型マーカー遺伝子発現レベルを示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図２Ｄは、特定された細胞型によって色付けされた全ての患者の免疫細胞のｕＭＡＰ投影を示す。同一のｕＭＡＰは、細胞型マーカー遺伝子発現レベルを示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図２Ｅは、患者あたりの間質細胞総数と比較した間質細胞型の割合を示す。各積み重ねられたバーは、間質細胞総数を１にスケーリングした患者を表す。図２Ｆは、患者あたりの全免疫細胞数と比較した免疫細胞型の割合を示す。

図３Ａ～図３Ｄは、ｓｃＲＮＡｓｅｑ選択卵巣がん試料の遺伝子発現及び免疫細胞浸潤分析を示す。図３Ａは、以前、Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１：５５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９４０８－２（２０２０）に記載された免疫表現型分類遺伝子のヒートマップを示す。１５個の卵巣がん試料のバルクＲＮＡシーケンシングからの遺伝子発現。図３Ｂは、１５個の選択された卵巣がん試料（５個の浸潤腫瘍、５個の除外腫瘍、及び５個の砂漠腫瘍）のＣＤ８ ＩＨＣ染色を示す。図３Ｃは、各患者の腫瘍細胞、間質細胞及び免疫細胞の細胞選別のためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。図３Ｄは、各患者についてのＦＡＣＳ選別されたＥｐＣＡＭ＋（腫瘍）細胞、ＣＤ４５＋（免疫）細胞及びＣＤ４５－ＥｐＣＡＭ－（間質）細胞のパーセンテージを示し、免疫表現型によってグループ分けされる。グラフは平均±ＳＤを示し、各ドットは患者を表す。積み重ねボックスプロットは、生存細胞のうちの腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞の平均パーセンテージを使用した免疫表現型による区画分布を示す。

図４Ａ～図４Ｃは、異なる腫瘍免疫表現型に関連する腫瘍固有の性質を示す。図４Ａは、除外／浸潤腫瘍の組み合わせセットと比較して、砂漠の腫瘍細胞において有意に濃縮されたホールマーク遺伝子セットを示す（調整済みｐ値＜０．０５）。偽バルク差次発現分析を、差次的発現モデル（方法）における各腫瘍のＧ２／Ｍ状態を補正しながら、砂漠腫瘍の腫瘍細胞発現を除外／浸潤腫瘍と比較して実施した。倍数変化発現値及び調整済みｐ値を組み合わせて、遺伝子セット濃縮分析の入力として遺伝子をランク付けした。図４Ｂは、患者による抗原提示遺伝子セット発現のヒートマップを示す。Ｚスコア化された遺伝子発現を、ｓｃｒａｎ正規化発現値に基づいて計算した。バイオリンプロットは、免疫表現型による細胞あたりの抗原提示シグネチャスコアの分布を示す。抗原提示シグネチャスコアは、ヒートマップに示される遺伝子に基づいて計算した。図４Ｃは、患者による酸化的リン酸化遺伝子セット発現のヒートマップを示す。Ｚスコア化された遺伝子発現を、ｓｃｒａｎ正規化発現値に基づいて計算した。バイオリンプロットは、免疫表現型による細胞あたりの酸化的リン酸化シグネチャスコアの分布を示す。シグネチャスコアを、ヒートマップに示される遺伝子に基づいて計算した。

図５Ａ～図５Ｂは、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析された１５個全ての卵巣がん試料からの腫瘍、免疫及び間質区画を示す。図５Ａは、砂漠（ｄｅｓ）対浸潤（ｉｎｆ）／除外（ｅｘｃ）遺伝子セット濃縮分析からのホールマーク ＥＭＴリーディングエッジ遺伝子のヒートマップを示す。図５Ｂは、ｄｅｓ対ｉｎｆ／ｅｘｃ遺伝子セット濃縮分析からのホールマーク血管新生リーディングエッジ遺伝子のヒートマップを示す。

図６は、卵巣腫瘍に浸潤するＴ細胞の細胞特性及び機能特性を示す。図６は、バッチ平衡ｋ最近傍補正前後の全患者のＴ細胞のｕＭＡＰ投射を示す。

図７は、卵巣がんにおける骨髄細胞サブセットの特徴付けを示す。図７は、バッチ平衡ｋ最近傍補正前後の全患者の骨髄細胞のｕＭＡＰ投影を示す。

図８Ａ～図８Ｊは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なる状態が、免疫浸潤表現型及び除外腫瘍免疫表現型を特徴付けることを示す。図８Ａは、特定された細胞集団によって色付けされた全ての患者由来の全てのＴ細胞のｕＭＡＰ投影を示す。図８Ｂは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞マーカーの発現によって色付けされた全てのＴ細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図８Ｃは、各Ｔ細胞集団の上位２０の有意なマーカー（調整済みｐ値＜０．０５）のｚスコア化された遺伝子発現のヒートマップを示し、選択された遺伝子標識が示される。Ｚスコア化された遺伝子発現は、ｓｃｒａｎ正規化及び細胞集団あたりの平均発現値に基づいて計算した。図８Ｄは、ＧＺＭＢ及びＧＭＺＫの発現によって色付けされた全てのＴ細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図８Ｅは、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ集団及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ集団についてのＴ細胞活性化マーカー及び疲弊マーカーのｚスコア化された遺伝子発現値のヒートマップを示す。ｚスコアは、それぞれの細胞集団中の全ての細胞の、及び除外免疫表現型又は浸潤免疫表現型からの平均ｓｃｒａｎ正規化発現に基づいて計算した。図８Ｆは、ＥＯＭＥＳ、ＫＬＲＧ１、ＣＭＣ１、ＥＮＴＰＤ１及びＣＸＣＬ１３の発現によって色付けされた全てのＴ細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図８Ｇは、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ定量の箱ひげ図（上）を示す。各データポイントは、腫瘍及び間質内のＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ又はＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ陽性細胞の総数に対する間質又は腫瘍内の二重陽性ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ又はＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ細胞の割合を表す。ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ（左下）及びＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ（右下）のコハイブリダイゼーションの代表的な画像。青色：ＣＤ８Ａ。ピンク色：ＧＺＭＢ又はＧＺＭＫ。矢印は二重陽性細胞を強調している。Ｔ：腫瘍面積。Ｓ：間質領域。図８Ｈは、緑色の全てのＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞の割合、及び青色の全てのＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞の割合による積み重ね棒グラフを示す。各バーは１つの腫瘍を表し、最初の５つのバーは除外腫瘍を示し、最後の５つのバーは浸潤腫瘍を示す。図８Ｉは、ＩＣＯＮ７（ｎ＝３５１）、ＲＯＳｉＡ（ｎ＝３０８）及びＴＣＧＡ（ｎ＝４１２）のバルクＲＮＡシーケンシングデータを使用して計算された免疫表現型による試料ごとのＧＺＭＫ／ＣＤ８＋又はＧＺＭＢ／ＣＤ８＋スコアの箱ひげ図を示す。ウィルコクソン検定を用いて統計的有意性を決定した。右パネルは、試料が３つのデータセットのそれぞれにおいて除外免疫表現型又は浸潤免疫表現型を有するかどうかを予測するロジスティック回帰モデルにおけるＧＺＭＢ／ＣＤ８＋スコア、ＧＺＭＫ／ＣＤ８＋スコア、又はそれらの組み合わせの説明される分散を示す棒グラフを示す。各モデルによって説明される分散の有意差を、カイ二乗検定を用いて試験した。図８Ｊは、ＣＤ８＋スコア及びＧＺＭＫ／ＣＤ８＋スコア変数について９５％信頼区間を有するコックス比例ハザードモデルのハザード比を示す。浸潤腫瘍及び除外腫瘍のみを有するＩＣＯＮ７ケモアーム患者に基づくモデル。棒グラフは、ＣＤ８＋スコア及びＧＺＭＫ／ＣＤ８＋スコアを有する付加モデルと比較した、ＣＤ８＋スコア又はＧＺＭＫ／ＣＤ８＋スコアのみによる、単一モデルの説明される分散を示す。モデルの統計的差異は、カイ二乗検定を使用して試験した。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１．

図９Ａ～図９Ｈは、卵巣腫瘍に浸潤するＴ細胞の細胞特性及び機能特性を示す。図９Ａは、各患者の総Ｔ細胞数に対する各Ｔ細胞集団の割合を用いた積み重ね棒グラフを示す。図９Ｂは、腫瘍免疫表現型によってグループ分けされた総ＣＤ４＋Ｔ細胞数と比較した、ＣＤ４＋ＩＬ７ Ｒ細胞、ＣＤ４＋ＣＸＣＬ１３及びＣＤ４＋ＦＯＸＰ３細胞の割合の棒グラフを示す。図９Ｃは、免疫表現型によってグループ分けされた総Ｔ細胞数に対するＴｇｄ／ＮＫ ＦＧＦＢＰ２及びＣＤ８＋ＦＧＦＢＰ２細胞の割合を有する棒グラフを示す。図９Ｄは、選択されたエフェクター及びメモリーＴ細胞マーカーの遺伝子発現によって色付けされた全てのＴ細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図９Ｅは、多重ＩＦ定量箱ひげ図を示す。各データポイントは、腫瘍又は間質領域における二重陽性ＣＤ３＋ＧＺＭＢ＋細胞に対する三重陽性ＣＤ３＋ＧＺＭＢ＋ＰＤ－１＋細胞の割合を表す。除外腫瘍（上）及び浸潤（下）腫瘍の代表的なＩＦ画像。濃い青色：ＤＡＰＩ、薄い青色：ＣＤ３、ピンク色：グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、黄色：ＰＤ－１、緑色：ＰＤ－Ｌ１、及び赤色：ＰａｎＣＫ。黄色の矢印は二重陽性ＣＤ３＋ＧＺＭＢ＋細胞を表し、緑色の矢印は三重陽性ＣＤ３＋ＧＺＭＢ＋ＰＤ－１＋細胞を表す。図９Ｆは、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ定量箱ひげ図を示す。各データポイントは、腫瘍及び間質におけるＣＤ８Ａの総数に対する全間質＋腫瘍二重陽性ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ又はＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ細胞の割合を表す。図９Ｇは、この研究のために単一細胞プロファイリングされた１５個の卵巣がん試料のバルクＲＮＡシーケンシングデータ、ＩＣＯＮ７及びＲＯＳｉＡ臨床試験データセット及びＴＣＧＡについての、免疫表現型による患者ごとのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ ＣＤ８＋Ｔ細胞シグネチャｚスコアによる箱ひげ図を示す。ＧＺＭＢ及びＧＺＭＫの遺伝子発現は、シグネチャｚスコア計算から除外されている。図９Ｈは、ＣＤ８＋スコア、ＧＺＭＢ／ＣＤ８＋スコア及びＧＺＭＫ／ＣＤ８＋スコア変数について９５％信頼区間を有するコックス比例ハザードモデルのハザード比を示す。浸潤腫瘍及び除外腫瘍のみを有するＩＣＯＮ７ケモアーム患者に基づくモデル。図９Ｂ～図９Ｃについて、有意性を、ランダム効果として患者の変動性を説明するｔ統計量によって決定した。図９Ｅ～図９Ｇについて、有意性をウィルコクソン検定によって決定した。^＊ｐ値＜０．０５、^＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１。ｎ．ｓ：有意性なし。

図１０Ａ～図１０Ｄは、線維芽細胞表現型とＴ細胞の局在化との関連を示す。図１０Ａは、特定された細胞集団によって色付けされた、全ての患者由来の線維芽細胞のｕＭＡＰ投影を示す。図１０Ｂは、シグネチャスコア発現によって色付けされた全ての線維芽細胞のｕＭＡＰ投影を示す。シグネチャスコアの発現は、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃ．Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：２３２－２５３（２０２０）；ａｎｄ Ｅｌｙａｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：１１０２－１１２３（２０１９）に以前に記載されたように導出された。図１０Ｃは、各線維芽細胞集団の上位２０マーカーのｚスコア化された遺伝子発現のヒートマップを示す。Ｚスコア化された遺伝子発現は、ｓｃｒａｎ正規化及び細胞集団あたりの平均発現値に基づいて計算した。図１０Ｄは、腫瘍免疫表現型によってグループ分けされた総線維芽細胞数と比較したＴＧＦＢ ＣＡＦ及びＩＬ１ ＣＡＦ細胞の割合を有する棒グラフを示す。各単一ドットは患者を表す。有意性は、ランダム効果として患者の変動性を考慮したｔ統計量によって決定した。

図１１Ａ～図１１Ｂは、卵巣がんにおける線維芽細胞集団を示す。図１１Ａは、特定されたｕＭＡＰクラスタによってグループ分けされた細胞ごとのＣＡＦシグネチャスコア分布のバイオリンプロットを示す。ＣＡＦシグネチャスコアは、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：２３２－２５３（２０２０）；ａｎｄ Ｅｌｙａｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：１１０２－１１２３（２０１９）。に以前に記載されたように導出された。図１１Ｂは、各患者の総線維芽細胞数に対する各線維芽細胞集団の割合を用いた積み重ね棒グラフを示す。

図１２Ａ～図１２Ｆは、異なる腫瘍免疫表現型に関連する骨髄細胞の表現型的及び機能的に多様なサブセットを示す。図１２Ａは、特定された細胞集団によって色付けされた全ての患者由来の骨髄細胞のｕＭＡＰ投影を示す。図１２Ｂは、選択された細胞集団マーカー遺伝子の発現によって色付けされた全ての骨髄細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図１２Ｃは、特定された単球／マクロファージ集団によって色付けされた全ての患者由来の全ての単球／マクロファージの拡散マップ投影を示す。ｂｂｋｎｎ補正データ投影に基づいて拡散マップを計算した。図１２Ｄは、Ｚｈａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，１７９，８２９－８４５ ｅ８２０（２０１９）からのＴＡＭ様及びＭＤＳＣ様骨髄サブセットのシグネチャスコアによって色付けされた骨髄細胞のｕＭＡＰ投影を示す。特定されたマクロファージ／単球集団によってグループ分けされた細胞シグネチャごとのスコアによるバイオリンプロット。図１２Ｅは、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２発現によって色付けされた全ての骨髄細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図１２Ｆは、総単球及びマクロファージ細胞数に対する組み合わせたＣＤ１６９／ＣＸ３ＣＲ１マクロファージ及びＭＡＲＣＯマクロファージ／ＦＣＮ１単球の割合を示す棒グラフである。有意性は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて決定した。

図１３Ａ～図１３Ｄは、卵巣がんにおける骨髄細胞サブセットの特徴付けを示す。図１３Ａは、選択された骨髄細胞集団マーカーの発現によって色付けされた全ての患者の骨髄細胞のｕＭＡＰ投影を示す。濃い陰影は、より高い発現を示す。図１３Ｂは、各特定された単球／マクロファージ集団の上位２０個のマーカーのｚスコア化された遺伝子発現のヒートマップを示す。Ｚスコア化された遺伝子発現は、ｓｃｒａｎ正規化及び細胞集団あたりの平均発現値に基づいて計算した。図１３Ｃは、ｓｃｒａｎ正規化発現値に基づく細胞ごとのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ単球及びマクロファージシグネチャスコアのバイオリンプロットを示す。バイオリンプロットは、特定されたマクロファージ／単球集団によってグループ分けされる。図１３Ｄは、各患者の総単球／マクロファージ数に対する各単球／マクロファージ集団の割合の積み重ね棒グラフを示す。

図１４Ａ～図１４Ｇは、区画間相互作用によって形成された腫瘍免疫表現型を示す。図１４Ａは、区画及び細胞型によるＣＸＣＬ１６及びＣＸＣＲ６発現のドットプロットを示す。図１４Ｂは、免疫表現型によってグループ分けされた、各患者の腫瘍細胞における平均ＣＸＣＬ１６ ｓｃｒａｎ正規化発現の箱ひげ図を示す。図１４Ｃは、３つの腫瘍免疫表現型における対応する細胞の濃縮を示すヒートマップと共に、細胞型によるＣＸＣＲ３及び対応するケモカインリガンド発現のドットプロットを示す。図１４Ｄは、免疫集団及び間質集団並びに腫瘍細胞区画におけるＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１２、及びＣＸＣＲ４の平均発現のドットプロットと共に、ヒートマップは、３つの腫瘍免疫表現型における対応する細胞の濃縮を示す。図１４Ｅは、細胞型によるドットプロットＣＸ３ＣＲ１及び対応するケモカインリガンド発現を示す。図１４Ｆは、骨髄細胞型によるＣＸ３ＣＲ１発現のボックスプロットを示す。図１４Ｇは、各免疫表現型のＴＭＥとの関連における区画間ケモカインリガンド－受容体相互作用のモデルを示す。線維芽細胞のモデルは、浸潤腫瘍におけるより高いＩＬ１ ＣＡＦの傾向に基づいて示される。図１４Ａ、図１４Ｃ、図１４Ｄ及び図１４Ｅにおいて、各ドットの色強度は、全患者にわたる平均ｓｃｒａｎ正規化発現を示し、サイズは、その群の細胞の総数と比較した、遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表す。図１４Ｂ及び図１４Ｆにおいて、各ドットは、各患者の平均発現レベルを示す。ウィルコクソン検定を用いて統計的有意性を計算した。

図１５Ａ～図１５Ｉは、腫瘍区画、免疫区画及び間質区画にわたるケモカインリガンド－受容体分析を示す。図１５Ａは、免疫細胞集団によるＣＸＣＬ１６発現の箱ひげ図を示す。図１５Ｂは、免疫表現型によって色付けされた、Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ６発現対腫瘍細胞におけるＣＸＣＬ１６発現の散布図を示す。図１５Ｃは、免疫表現型によって色付けされた、全ての免疫細胞におけるＣＸＣＲ３発現対単球／マクロファージにおけるＣＸＣＬ１９、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１発現の散布図を示す。ドットサイズは、全ての単球／マクロファージと比較したＣＤ１６９マクロファージの相対的割合を示す。図１５Ｄは、細胞型によるＣＸＣＲ５及びＣＸＣＬ１３発現のドットプロットを示す。図１５Ｅは、免疫表現型によって色付けされた、全てのＢ－ＴＩＬにおけるＣＸＣＲ５発現対ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３発現の散布図を示す。ドットサイズは、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞と比較したＣＤ４＋ＣＸＣＬ１３ Ｔ細胞の相対的割合を示す。図１５Ｆは、免疫表現型によって色付けされた、全ての免疫細胞におけるＣＸＣＲ４発現対線維芽細胞におけるＣＸＣＬ１２又はＣＸＣＬ１４発現の散布図を示す。ドットサイズは、全ての線維芽細胞と比較したＩＬ１ ＣＡＦの相対的割合を示す。図１５Ｇは、免疫表現型によって色付けされた、全ての骨髄細胞におけるＣＸ３ＣＲ１発現対間質細胞におけるＣＣＬ２６又はＣＸ３ＣＬ１発現の散布図を示す。図１５Ｈは、細胞型によるＣＣＲ７及び対応するケモカインリガンド発現のドットプロットを示す。免疫表現型によってグループ分けされた、各患者の内皮細胞における平均ＣＣＬ２１ ｓｃｒａｎ正規化発現の箱ひげ図。ウィルコクソン検定を用いて統計的有意性を計算した。図１５Ｉは、免疫表現型によって色付けされた、Ｂ－ＴＩＬにおけるＣＣＲ７発現対内皮細胞におけるＣＣＬ２１発現の散布図を示す。図１５Ｄ及び図１５Ｈに示すように、各ドットの色強度は、全患者にわたる平均ｓｃｒａｎ正規化発現を示し、サイズは、その群の細胞の総数と比較した、遺伝子を発現する細胞のパーセンテージを表す。

図１６は、各患者の細胞あたりの抗原提示及び酸化的リン酸化シグネチャスコアの分布を示すバイオリンプロットを示す。Ｚスコア化された遺伝子発現を、ｓｃｒａｎ正規化発現値に基づいて計算した。

図１７Ａ及び図１７Ｂは、卵巣腫瘍に浸潤するＴ細胞の細胞特性及び機能特性を示す。図１７Ａは、特定されたＴ細胞集団によってグループ分けされた細胞あたりの機能不全及び疲弊スコアのバイオリンプロットを示す。Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｓｃｏｒｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｌｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７６，７７５－７８９ ｅ７１８（２０１９）ａｎｄ Ｙｏｓｔ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５，１２５１－１２５９（２０１９）。有意性は、ランダム効果として患者の変動性を考慮したｔ統計量によって決定した。図１７Ｂは、各Ｔ細胞亜集団におけるＴＣＦ７発現のボックスプロットを示す。各ドットは、１人の患者及びＴ細胞亜集団における平均ＴＣＦ７発現を表す。有意性をウィルコクソン検定によって決定した。

図１８は、卵巣がんにおける骨髄細胞サブセットの特徴付けを示す。図１８は、ｂｂｋｎｎ補正後の全患者のＤＣ細胞のｕＭＡＰ投影を示す。細胞は、それらの識別ＤＣ亜集団クラスタによって着色される。

図１９は、卵巣がんにおける骨髄細胞サブセットの特徴付けを示す。図１９は、各特定されたＤＣ亜集団の上位２０個のマーカーのｚスコア化された遺伝子発現のヒートマップを示す。Ｚスコア遺伝子発現は、ｓｃｒａｎ正規化及び細胞集団あたりの平均発現値に基づいて計算した。

詳細な説明
Ｉ． 定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図している。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞がほとんど存在しない」という用語は、非常に低い量（Ｔ細胞が占有する腫瘍面積の２０％未満であり、Ｔ細胞密度が、０～３の、病理学者が定義したＴ細胞相対密度範囲のうちの０である）から、従来の方法又は測定若しくは検出を使用する検出不能な量又は検出限界未満の量（ＬＯＤ）までを含む、存在するＴ細胞の量を指す。

薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、処置される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行われ得る。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

数値範囲は、範囲を定義する数を含む。測定値及び測定可能な値は、有効数字及び測定に関連する誤差を考慮して、近似値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。前述の一般的な説明及び詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。

本明細書に具体的に記載されていない限り、様々な成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載する本明細書の実施形態は、記載された成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられ；様々な成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と記載する本明細書の実施形態は、記載された成分「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられ；及び様々な成分「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」と記載する本明細書の実施形態は、記載された成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とも考えられる（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「又は」という用語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「及び／又は」と同等に使用される。

明細書及び特許請求の範囲の全ての数字は、「約」という用語によって修飾されている。これは、各数字が、問われている数値又は範囲の１０％と定義されるような小さな変動を含むことを意味する。

これより本発明の特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の図面に例示されている。本発明は、図示された実施形態に関連して説明されているが、それらは本発明をそれらの実施形態に限定することを意図していないことが理解されよう。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲及び含まれる実施形態によって定義される本発明内に含まれ得る全ての代替形態、修正形態、及び均等物を網羅することを意図している。

本明細書で使用されるいかなるセクションの見出しも、構成上の目的のみのためであり、決して所望の主題を限定するものと解釈されるべきではない。参照により組み込まれるいずれかの材料が、本明細書で定義されるいずれかの用語又は本明細書の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。本教示は、様々な実施形態に関連して説明されているが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、変更、及び均等物を包含する。

ＩＩ． 処置プロトコルを設計するための診断方法
本出願は、ヒト患者における卵巣がんの診断方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、これらの診断方法に基づいて処置プロトコルを設計することを含む。方法は、患者からの腫瘍試料中のグランザイムＫ（ＧＺＭＫ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、並びに骨髄細胞（ＴＲＥＭ）タンパク質ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２に発現するトリガー受容体の少なくとも１つの発現に関する。

いくつかの実施形態では、方法は、患者からの腫瘍試料中のＧＭＺＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の全てを評価することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者からの腫瘍細胞におけるＧＭＺＢ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の全てを評価することを含む。

したがって、いくつかの実施形態では、腫瘍試料は腫瘍細胞であり得る。腫瘍細胞は、腫瘍からの間質細胞又は免疫細胞であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は腫瘍生検であり得る。

Ａ． ＧＺＭＫ発現
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍発生及びウイルス感染又は細菌感染に対する防御応答において機能する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞量は、がんにおける無増悪生存に関連する。

表面抗原が結合すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性の重要なエフェクター分子をコードする遺伝子を差次的に発現し得る。グランザイムは、標的細胞を認識し、結合し、溶解するように発現されるエフェクター分子の群である。グランザイムの例としては、グランザイムＡ、Ｂ、Ｈ、Ｋ及びＭ（ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＭ）が挙げられる。多くの実施形態では、ＧＺＭＫ発現は、除外腫瘍細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞において上昇している。いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＧＺＭＫ／ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、浸潤腫瘍細胞及び砂漠腫瘍細胞に見られる。いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫ／ＣＤ８＋Ｔ細胞は、浸潤腫瘍細胞及び砂漠腫瘍細胞にはほとんど存在しない。

多くの実施形態では、卵巣がんを有するヒト患者の処置プロトコルを設計する方法は、ＧＺＭＫの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者からの腫瘍試料におけるＧＺＭＫ発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、ＴＭＥ、免疫浸潤表現型、免疫除外表現型、及び／又は免疫砂漠表現型の細胞を含む。

多くの実施形態では、方法は、下記のセクションＩＩ．Ｅ．に記載されるように、ＧＺＭＫの発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較することを更に含む。いくつかの実施形態では、参照試料と比較した場合のＧＺＭＫのより高い発現は、生存の低下に関連する。いくつかの実施形態では、参照試料と比較したＧＺＭＫレベルの上昇は、除外腫瘍と関連する。

Ｂ． ＧＺＭＢ発現
いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫの代わりに、ＧＺＭＢ発現がＣＤ８＋Ｔ細胞において上昇する。いくつかの実施形態では、セクションＩＩ．Ｅで以下に記載されるように、参照試料と比較した場合のＧＺＭＢのより高い発現は、浸潤腫瘍表現型に関連する。

Ｃ． ＴＲＥＭ１発現
多くの実施形態では、卵巣がんを有するヒト患者の処置プロトコルを設計する方法は、患者からの腫瘍試料中のＴＲＥＭ１の発現レベルを決定することを含む。ヒト腫瘍に浸潤するマクロファージにおけるＴＲＥＭ１の高発現は、攻撃的な腫瘍挙動及び患者の生存不良に関連する。ＴＲＥＭ１の薬理学的阻害は、炎症応答を弱めることによって、生存上の利点及び臓器損傷又は腫瘍成長からの保護を提供し得る。

多くの実施形態では、方法は、下記のセクションＩＩ．Ｅ．に記載されるように、ＴＲＥＭ１発現レベルを参照試料と比較することを含む。いくつかの実施形態では、参照試料と比較したＴＲＥＭ１の発現レベルの上昇は、ＭＤＳＣ様骨髄細胞の存在に関連する。いくつかの実施形態では、参照試料と比較したＴＲＥＭ１レベルの上昇は、砂漠腫瘍に関連する。

Ｄ． ＴＲＥＭ２発現
多くの実施形態では、卵巣がんを有するヒト患者の処置プロトコルを設計する方法は、患者からの腫瘍試料中のＴＲＥＭ２の発現レベルを決定することを含む。ＴＲＥＭ２は、肝細胞がん及び結腸直腸がんにおいて腫瘍抑制因子として作用する。ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２は、それぞれ骨髄細胞の異なるサブセットに連結され、卵巣がんの処置選択を知らせ得る。

多くの実施形態では、方法は、下記のセクションＩＩ．Ｅ．に記載されるように、ＴＲＥＭ２発現レベルを参照試料と比較することを含む。いくつかの実施形態では、参照試料と比較したＴＲＥＭ２発現レベルの上昇は、ＴＡＭ様マクロファージの存在に関連する。いくつかの実施形態では、参照試料と比較したＴＲＥＭ２レベルの上昇は、除外腫瘍及び／又は浸潤腫瘍に関連する。

Ｅ． 参考試料の使用
多くの実施形態において、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及び／又はＴＲＥＭ２の発現レベルが、参照試料と比較される。

いくつかの実施形態では、参照試料は健康な対象である。いくつかの実施形態では、参照試料は、身体の同じ部分などからの正常組織である。正常組織は、健常対象又は健常対象のプール、同じ患者、異なる患者、又は患者のプールに由来し得る。
いくつかの実施形態では、参照試料は、既知の砂漠腫瘍、既知の除外腫瘍、又は既知の浸潤腫瘍を有する患者である。参照試料は、患者腫瘍試料のＴＭＥにわたる細胞、又は浸潤、除外、若しくは砂漠などの特異的免疫表現型を有する細胞を指し得る。いくつかの実施形態では、参照試料は、浸潤細胞、除外細胞、及び／又は砂漠細胞の試料である。いくつかの実施形態では、参照試料は、対象の病歴又は患者の処置計画における特定の時点で得られた腫瘍試料である。いくつかの実施形態では、参照試料は、同じ患者、異なる患者、又は患者のプールに由来し得る。

いくつかの実施形態では、参照試料は、治療に応答した患者である。

いくつかの実施形態では、参照試料は、複数の患者及び／又は対象にわたってまとめられたデータである。いくつかの実施形態では、参照試料は、参照遺伝子（複数可）（すなわち、ハウスキーピング遺伝子）と比較したＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及びＴＲＥＭ２遺伝子発現レベルのそれぞれについて、高い閾値対低い閾値について事前に検証された患者腫瘍組織試料のプールである。

Ｆ． 遺伝子発現プロファイリング
様々な技術を使用して、患者腫瘍試料からのＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及び／又はＴＲＥＭ２の発現レベルを測定することができる。いくつかの実施形態では、発現レベルは、ＤＮＡ又はＲＮＡシーケンシング法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、方法は、ｍＲＮＡ転写物又はＲＮＡ転写物を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物はｓｃＲＮＡｓｅｑによって決定される。ＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及び／又はＴＲＥＭ２のｍＲＮＡ転写物の測定されたレベルは、腫瘍試料中の少なくとも１つの参照遺伝子（すなわち、ハウスキーピング遺伝子）のｍＲＮＡ転写物に対して正規化され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＧＺＭＫのＲＮＡ転写物の正規化レベルの上昇がある。いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫ陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＧＺＭＫ陰性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の数よりも多い。いくつかの実施形態では、マクロファージにおいて、ＴＲＥＭ２のＲＮＡ転写物の正規化レベルの上昇がある。

いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及び／又はＴＲＥＭ２の発現レベルは、免疫組織化学を使用して決定される。

いくつかの実施形態では、遺伝子発現プロファイリングは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの細胞選別技術を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及び／又はＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを評価する前に、腫瘍試料は、腫瘍細胞、間質細胞及び免疫細胞に分離され得る。

ＩＩＩ． 卵巣がんを、砂漠型、除外型又は浸潤型の腫瘍として特徴付ける方法
本発明の方法は、免疫表現型：砂漠、除外、及び浸潤に従ってヒト患者の卵巣がんを特徴付ける方法を含む。方法は、患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定することを含み得る。セクションＩＩで上述したように、各遺伝子発現レベルは、参照試料中の発現レベルと比較される。本明細書に開示される特性評価方法は、卵巣がんを有するヒト患者を処置する方法を知らせるために使用され得る。いくつかの実施形態では、処置方法は、卵巣がんを砂漠、除外、又は浸潤として特徴付けることを含む。

いくつかの実施形態では、参照試料と比較した場合のＧＺＭＫのより高い発現は、除外腫瘍表現型に関連する。

いくつかの実施形態では、参照試料と比較した場合のＧＺＭＢのより高い発現は、浸潤腫瘍表現型に関連する。

いくつかの実施形態では、参照試料と比較した場合のＴＲＥＭ１のより高い発現は、砂漠腫瘍表現型に関連する。

いくつかの実施形態では、参照試料と比較した場合のＴＲＥＭ２のより高い発現は、除外腫瘍表現型及び浸潤腫瘍表現型に関連する。

したがって、これらの関連付けにより、臨床医は、卵巣がんを、唯一のデータ点として、又は他のデータ点と組み合わせて、砂漠、除外、又は浸潤として特徴付けることが可能になる。

ＩＶ． 処置方法
本発明の方法は、ヒト患者における卵巣がんの処置方法を含む。多くの実施形態では、方法は、セクションＩＩで上述したように、患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定することを含む。多くの実施形態において、方法は、上記のセクションＩＩ．Ｅ．で記載されるように、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを参照試料中の発現レベルと比較することを含む。

いくつかの実施形態では、セクションＩＩＩで上述したように、卵巣がんを砂漠、除外又は浸潤として特徴付ける方法は、処置方法を知らせ得る。特徴付けの方法は、患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定することを含む。セクションＩＩで上述したように、各遺伝子の発現を参照試料と比較する。

Ａ． 患者の生存の増加に関連するより低いＧＺＭＫ発現を有する腫瘍を処置する方法
いくつかの実施形態では、参照試料と比較した場合のより低いＧＺＭＫ発現は、患者の生存の増加に関連する。いくつかの実施形態では、方法は、患者に化学療法を投与することを含む。いくつかの実施形態では、化学療法は、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）（登録商標））、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ－１６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）））、ドキソルビシン（リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））など）、メルファラン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、トポテカン、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ニクロサミド、メトホルミン、ＢＡＹ ８７－２２４３、デシタビン、ガデシタビン、アザシチジン、アバゴボマブ、オレゴボマブ、ニボルマブを含むＮｅｏＶａｘ、アンロチニブ、ロスバスタチンを含むエノキサパリン、ニラパリブ、キアウラニブ、ペグ化リポソームドキソルビシンを含むトラベクチン、ＡＣＢ－Ｓ６－５００、ＳＧＩ－１１０、レトロゾール、パゾパニブ、パルボシクリブ、アパチニブ、マシチニブ、カバジタキセル、ＩＭＡＢ０２７、フルダラビン、ＡＢＴ－８８８、フォスタマチニブ、オラパリブ、テモゾロミド、タラゾパリブ、Ｐ５３－ＳＬＰ、ＯＭＰ－５４Ｆ２８、ヒドララジン及びバルプロ酸マグネシウム、フルダラビン、ラパチニブ、ベンダムスチンＨＣＬ、ソラフェニブ、カンレリズマブ、トレメリムマブ、トコトリエノール、及び／又はエキセメスタンを含む。

Ｂ． 除外腫瘍を示すより高いＧＺＭＫ発現を有する腫瘍を処置する方法
いくつかの実施形態では、より高いＧＺＭＫ発現は、患者の生存の低下に関連し、及び／又は除外腫瘍を示す。いくつかの実施形態では、方法は、患者に化学療法を投与することを含む。いくつかの実施形態では、より高いＧＺＭＫ発現は、患者の生存の低下に関連する。いくつかの実施形態では、化学療法は、ＧＺＭＫ発現が腫瘍において示された後で停止される。いくつかの実施形態では、ＧＺＭＫ発現が腫瘍において示された後、緩和ケアが患者に施される。

Ｃ． 砂漠腫瘍を示すより高いＴＲＥＭ１発現を有する腫瘍を処置する方法
いくつかの実施形態では、より高いＴＲＥＭ１発現は、砂漠腫瘍を示す。いくつかの実施形態では、腫瘍は卵巣腫瘍である。これらの実施形態のいくつかでは、処置方法は、化学療法又は自己／同種異系エフェクター細胞で患者を処置することを含む。いくつかの実施形態では、化学療法は、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）（登録商標））、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ－１６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）））、ドキソルビシン（リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））など）、メルファラン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、トポテカン、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ニクロサミド、メトホルミン、ＢＡＹ ８７－２２４３、デシタビン、ガデシタビン、アザシチジン、アバゴボマブ、オレゴボマブ、ニボルマブを含むＮｅｏＶａｘ、アンロチニブ、ロスバスタチンを含むエノキサパリン、ニラパリブ、キアウラニブ、ペグ化リポソームドキソルビシンを含むトラベクチン、ＡＣＢ－Ｓ６－５００、ＳＧＩ－１１０、レトロゾール、パゾパニブ、パルボシクリブ、アパチニブ、マシチニブ、カバジタキセル、ＩＭＡＢ０２７、フルダラビン、ＡＢＴ－８８８、フォスタマチニブ、オラパリブ、テモゾロミド、タラゾパリブ、Ｐ５３－ＳＬＰ、ＯＭＰ－５４Ｆ２８、ヒドララジン及びバルプロ酸マグネシウム、フルダラビン、ラパチニブ、ベンダムスチンＨＣＬ、ソラフェニブ、カンレリズマブ、トレメリムマブ、トコトリエノール、及び／又はエキセメスタンを含む。

いくつかの実施形態では、処置は、ＭＤＳＣ様骨髄細胞を標的とする治療を含む。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣ様骨髄細胞は卵巣腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣ様骨髄細胞を標的とする治療法は、シスプラチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、パクリタキセル、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）ベータアゴニスト、チェックポイント阻害剤、及び／又は抗ＴＧＦβ療法（例えば、ペンブロリズマブ及びフレソリムマブを含む抗ＴＧＦβ抗体）を含み得る。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤療法は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、トリパリマブ、ＣＴ－０１１、モノクローナル抗体ＨＸ００８８、及び抗体ＡＫ１０５などの抗ＰＤ－１療法である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤療法は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、トレメリムマブ、ｍＡｂ ＺＫＡＢ００１、トレメリムマブ、及びラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）などの抗ＰＤ－Ｌ１療法である。

Ｄ． 浸潤腫瘍を示すより高いＧＺＭＢ及び／又はより高いＴＲＥＭ２発現を有する腫瘍を処置する方法
いくつかの実施形態では、より高いＧＺＭＢ発現及び／又はより高いＴＲＥＭ２発現は、浸潤腫瘍を示す。いくつかの実施形態では、浸潤腫瘍は卵巣腫瘍である。いくつかの実施形態では、処置は、ＴＡＭ様マクロファージ細胞を標的とする治療法を含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、例えばチェックポイント阻害剤療法などのがん免疫療法で患者を処置することを含む。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤療法は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、トリパリマブ、ＣＴ－０１１、モノクローナル抗体ＨＸ００８８、及び抗体ＡＫ１０５などの抗ＰＤ－１療法である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤療法は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、トレメリムマブ、ｍＡｂ ＺＫＡＢ００１、トレメリムマブ、及びラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）などの抗ＰＤ－Ｌ１療法である。いくつかの実施形態では、がん免疫療法剤は、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、モトリモド、腫瘍溶解性ウイルス、ＮＹ－ＥＳＯ－１がんワクチン、抗ＸＢＰ１療法、抗アンジオポエチン療法、抗ＤＬＬ／Ｎｏｔｃｈ療法、抗ＨＥＲ２療法、抗メソテリン療法、抗ＲＡＮＫＬ療法、抗ＴＲＯＰ２療法、及びＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ｒ療法を含み得る。

Ｅ． ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１及び／又はＴＲＥＭ２のより高い発現を有する腫瘍を処置する方法
いくつかの実施形態では、ＧＺＭＢ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２のより高い発現を有する腫瘍を処置する方法は、免疫エフェクター細胞で患者を処置することを含む。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞輸送調節因子、エピジェネティック調節因子、ＴＭＥリモデリング分子、及び放射線療法が挙げられる。

実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供される一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことが理解される。

本発明者らは、ヒト卵巣がんにおける腫瘍免疫連続体を転写的に分析し、ｓｃＲＮＡｓｅｑプロファイリング及び免疫組織化学を用いてこの複雑な生態系における組成及び細胞間相互作用を特徴付ける。新たに診断された卵巣がんを有する１５人の患者に由来する腫瘍組織からの合計９３，２１８個の単一細胞を分析し、３つの免疫表現型に関連して腫瘍区画、免疫区画及び間質区画の細胞表現型及び機能的表現型を定義することを可能にする。並行して、本発明者らは、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイを使用して、浸潤腫瘍及び除外腫瘍におけるＣＤ８＋ＧＺＭＢ及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞の空間分布を特徴付け、卵巣がん患者からの複数の独立した大規模なバルクＲＮＡｓｅｑ臨床データセットにおける異なる免疫表現型におけるそれらの差次的濃縮を検証する。最後に、本発明者らは、ケモカインリガンド－受容体相互作用に関連して、これらの多様な細胞表現型内及び細胞表現型間の潜在的なクロストークを特定する。本発明者らの包括的な単一細胞プロファイリング研究は、明確な腫瘍免疫表現型を形作る生物学への更なる洞察を提供し、免疫連続体に沿って腫瘍をシフトさせ、それによってがん免疫療法の臨床的利益を最適化するための新しい治療戦略を知らせ得る。

実施例１．単一細胞転写プロファイリングは、患者由来の原発性卵巣腫瘍の完全な細胞生態系を定義する
１．１． 臨床試料－ヒト腫瘍試料、調達及び処理
ＫＩＹＡＴＥＣ試料収集。書面によるインフォームドコンセントを提供した後、卵巣がんが疑われるか、又は既知の卵巣がんを有する１８歳を超える患者を、Ｐｒｉｓｍａ Ｈｅａｌｔｈ（以前はＧｒｅｅｎｖｉｌｌｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＩＲＢ－Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｃ）として知られていた）による施設内審査委員会（ＩＲＢ）承認の生物学的プロトコルに登録した。Ｐｒｉｓｍａ Ｈｅａｌｔｈによって指定されたガイドライン及び規制に従って組織取得を行い、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。原発腫瘍部位の外科的減量又は腹腔鏡生検で新鮮組織を収集した。

ｉｎ ｓｉｔｕ検証収集ｉｎ ｓｉｔｕ検証のため、独立した卵巣がん組織コレクション（ｎ＝１７）を、Ｃｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州ブリスベン）から調達した。調達された試料もまた、適切な施設内審査委員会（ＩＲＢ）の承認を得た。

１．２． ＣＤ８免疫組織化学
新鮮な組織試料をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、１０μｍ切片をガラススライドにマウントした。再水和及び抗原回復を、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ９．０（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使用して行った。スライドを、抗ＣＤ８［１４４Ｂ］（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）又はＩｇＧ１［Ｂ１１／６］アイソタイプ対照（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）で、両方とも１：５０の希釈で、室温で２時間染色した。染色を、マウス及びウサギ特異的ＨＲＰ／ＤＡＢ ＩＨＣ検出キット（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使用して検出した。画像を、Ｊｅｎｏｐｔｉｋ（ドイツ国イェーナ）ＰｒｏｇＲｅｓ Ｃ１４ ｐｌｕｓカメラ及びＰｒｏｇＲｅｓ ＣａｐｔｕｒｅＰｒｏソフトウェアを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ ７０顕微鏡で撮影した。

１．３． ｓｃＲＮＡｓｅｑのための細胞調製
手術の２４時間以内に、卵巣組織を受け取り、直ちに単一細胞に酵素的に解離させ、これを、解離前に組織を凍結したｅｘｃ５を除いて、１０％ＤＭＳＯを含有する培地中で凍結保存した。このプロトコルをＫＩＹＡＴＥＣによって検証した。凍結腫瘍細胞懸濁液を解凍し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０９％ＮａＡｚｉｄｅ）で希釈した。細胞を、二重蛍光ＡＯ／ＰＩを用いてＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ ２０００で計数した。次いで、細胞をＦｃＲブロッキング試薬と共に３０分間インキュベートし、続いて抗体を氷上で更に３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎで選別する直前に、細胞を生及び死マーカー７－ＡＡＤ（１／１６）及びカルセインブルー（１／５００）で染色した。ダブレットを除外し、低７－ＡＡＤ及び高カルセインブルーに基づいて生細胞を特定した。卵巣組織あたりの腫瘍区画、免疫区画及び間質区画に細胞を選別するために使用される抗体は、抗ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（１／１００、＃３０４０１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び抗ＥｐＣＡＭ－ＡＰＣ（１／２０、＃３２４２０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。選別後、試料を直ちにスピンし、セルソーターによって提供された細胞数に従って６００～１，０００細胞／μＬでＰＢＳに再懸濁した。Ｍａｔｅｒ Ｍｉｘ＋細胞懸濁液を調製するために、本発明者らは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ（ｖ２ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、米国カリフォルニア州）のＣｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ Ｔａｂｌｅを参照して、適切な体積のヌクレアーゼフリー水及び対応する体積の単一細胞懸濁液（標的細胞回収５０００～６０００細胞）を、各管で合計１００μｌずつＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘに添加する。９０μｌの上記混合物をクロムチップＢに充填し、続いてプロトコル（Ｇｅｌ Ｂｅａｄ＆Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔ Ｖ２及びＣｈｉｐ Ｋｉｔ（＃ＰＮ－１２０２３７、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ））に従ってゲルビーズ及び他の試薬をチップに充填した。Ｇｅｌ Ｂｅａｄ－Ｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ（ＧＥＭ）生成及び細胞バーコード化のためのクロムコントローラーを実行した後、ＧＥＭ逆転写インキュベーションのためにＧＥＭをサーマルサイクラーに移し、続いてポストＧＥＭ－ＲＴクリーンアップ、ｃＤＮＡ増幅、ＱＣ及び定量化を行った。

１．４． ｓｃＲＮＡＳｅｑライブラリの調製
各患者について、免疫細胞及び間質細胞が分離されず、区画あたり２つのライブラリ（腫瘍及び免疫／間質）が生成された４つの砂漠腫瘍を除いて、１区画あたり１つのライブラリ（腫瘍、免疫及び間質）を生成し、患者あたり３つのライブラリを得た。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｌｉｂｒａｒｙ（ｖ２ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用した３’遺伝子発現ライブラリの構築を、製造者の説明書（ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｌｉｂｒａｒｙ－ｐｒｅｐ／ｄｏｃ／ｕｓｅｒ－ｇｕｉｄｅ－ｃｈｒｏｍｉｕｍ－ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－３－ｒｅａｇｅｎｔ－ｋｉｔｓ－ｕｓｅｒ－ｇｕｉｄｅ－ｖ２－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に従って実施した。技術的バッチ効果を低減するために、本発明者らは、区画表現型及び免疫表現型の両方によるライブラリの生成をランダム化した。ライブラリ構築後のＱＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃｈｉｐ（＃５０６７－４６２７、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンタクララ）によって行い、ライブラリを、ＫＡＰＡライブラリ定量化ユニバーサルキット（＃０７９６０１４０００１、Ｒｏｃｈｅ）によって定量化した。

１．５． ｓｃＲＮＡｓｅｑライブラリのシーケンシング及び生データ処理
患者あたりの全てのライブラリをプールし、高出力キットｖ２又はｖ２．５を備えるＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００で配列決定した（１５０サイクル）。本発明者らは、キットｖ２及びｖ２．５の両方が同様の結果を生成し、同じライブラリ上の両方のキットからの配列決定結果を比較して、技術的バッチ効果が検出されないことを確認した。リードを、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ ｖ３．０．２（１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）を使用してヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングした。まず、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒサンプルシート付きのｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｍｋｆａｓｔｑコマンドを使用して、各フローセルのベースコールファイルをｆａｓｔｑファイルに分離した。第２に、引数にライブラリ名を指定することによって各ライブラリの単一細胞性質カウントを生成するために、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒカウントコマンドを呼び出した。フィルタリングされた特徴的なバーコードマトリックスを、更なるデータ分析に使用した。

１．６． ｓｃＲＮＡシーケンシングデータの分析
ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒからのコアｓｃＲＮＡｓｅｑ工程を、ｓｅｕｒａｔ ｖ３．０．０を使用して行った。まず、リード１０ｘ及びｍａｋｅｓｅｕｒａｔｏｂｊｅｃｔを用いて、各ライブラリをｓｅｕｒａｔオブジェクトに変換した。区画注釈のフィルタリングを行い、プールされたライブラリで配列決定された砂漠免疫細胞から砂漠間質を分離するために、４４個全てのライブラリのデータを併合した（図１Ａ～図１Ｅ）。データを、少なくとも１０個の細胞において発現された遺伝子及び少なくとも２００個の遺伝子、６０００個以下の遺伝子及び５％未満のミトコンドリア転写物を発現した細胞を含むようにフィルタリングした。これらのカットオフは、各ライブラリのＱＣ検査によって決定した。続いて、データを対数正規化し、平均分散検査によって可変遺伝子を検出し、スケーリングし、主成分を計算した。エルボープロットを使用して上位主成分を特定し、ｕＭＡＰ次元削減に使用した。クラスタ特定は、ＦＡＣＳ間質及び腫瘍注釈に基づいて混合間質－腫瘍界面を最もよく分離する解像度で行った。免疫、間質、腫瘍及び正常な上皮クラスタを特定するために、各クラスタについて以下の遺伝子マーカーの平均発現を計算した：１）免疫区画：ＰＴＰＲＣ、ＣＤ７９Ａ、２）間質区画：ＶＷＦ、ＰＥＣＡＭ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＤＣＮ、３）腫瘍区画：ＥＰＣＡＭ、４）正常上皮細胞：ＰＩＦＯ、ＣＡＰＳ、ＴＭＥＭ１９０、ＳＮＴＮ。クラスタ同一性は、０．８を超える平均発現カットオフで決定され、ＦＡＣＳ注釈とほとんど一致した注釈が得られた。ＦＡＣＳ注釈付き区画以外の区画及び正常な上皮細胞のクラスタ（クラスタ３４）でクラスタ化した細胞を、更なる分析から除去した。

各フィルタリングされた区画及び新たに注釈が付けられた区画の生データを、上記のように更に下流の分析のために別々に処理した。次元削減のための主成分の数は、各区画に対して個別に決定された。間質区画及び免疫区画における主要な細胞型を、以下の遺伝子マーカー：１）線維芽細胞：ＤＣＮ、Ｃ１Ｒ、ＰＤＧＦＲＡ、ＯＧＮ、２）内皮細胞：ＰＥＣＡＭ１、３）周皮細胞：ＲＧＳ５、４）Ｂ－ＴＩＬ：ＭＳ４Ａ１、５）形質細胞：ＳＤＣ１、６）Ｔ細胞：ＣＤ２、ＣＤ３Ｅ、７）骨髄系細胞：ＣＤ１４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＩＬＲＡ４のクラスタごとの平均発現によって定義した。線維芽細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞集団の更なる分析のため、データをこれらの細胞にサブセット化し、上記のように生データから開始して処理した。

各個々の患者のＴ細胞及び骨髄細胞集団の分析は、サブセット化された集団を患者ごとに分割し、上記のように生データを処理することによって行った。５０個未満の骨髄細胞又はＴ細胞を有する患者データを単一患者分析から除外した。陽性クラスタ遺伝子マーカーを、ｓｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ機能及びウィルコクソン検定を使用して特定した。線維芽細胞表現型の分析のために、砂漠の４つの線維芽細胞は、他の全ての腫瘍とは別個にクラスタ化しているため除外した。

ｕＭＡＰ、ヒートマップ、バイオリンプロット、箱ひげ図にプロットされた遺伝子発現値は、生の発現値（ｓｃｒａｎ ｖ１．１０．２）に基づいて計算されたｓｃｒａｎ正規化発現値である。Ｌｕｎ，Ａ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１－１４（２０１６）；ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１６－０９４７－７（２０１６）。

１．７． 結果
卵巣がんにおける腫瘍免疫連続体のランドスケープを分析するために、本発明者らは、新たに診断された４２人の卵巣がん患者から収集した腫瘍試料に対してＲＮＡｓｅｑ及びＣＤ８ ＩＨＣ分析を行った（図２Ａ）。ＲＮＡｓｅｑデータを利用して、以前に開発された卵巣がん特異的転写分類指標（Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１：５５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９４０８－２（２０２０））を用いて、各腫瘍（すなわち、浸潤、除外又は砂漠）の免疫表現型を予測した（図３Ａ）。並行して、間質及び腫瘍上皮へのＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤を、ＣＤ８ ＩＨＣ染色に基づいて評価した（図３Ｂ）。本発明者らは、分類指標に基づく予測とＣＤ８ ＩＨＣカテゴリー分類の両方を使用して、腫瘍免疫表現型を各腫瘍試料に割り当てた（データは示さず）。次に、本発明者らは、３つの免疫表現型のそれぞれを代表する５つの腫瘍を有する合計１５個の卵巣腫瘍を選択し、ｓｃＲＮＡｓｅｑを実施してこれらの表現型に関連する細胞組成を更に特徴付けた。腫瘍区画、間質区画及び免疫区画を分離するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、各腫瘍試料の腫瘍細胞（ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ４５－）、間質細胞（ＥｐＣＡＭ－ＣＤ４５－）及び免疫細胞（ＥｐＣＡＭ－ＣＤ４５＋）を選別した（図３Ｃ）。３つの区画（腫瘍、免疫、間質）の各々を、砂漠腫瘍におけるＣＤ４５＋免疫細胞の割合が低いために、患者によってプールされた砂漠間質細胞及び免疫細胞（間質／免疫）を除いて、別個のライブラリとしてｓｃＲＮＡｓｅｑに供した（図３Ｄ）。合計で４４個のライブラリを配列決定し、プールされたライブラリから４０，５３９個の腫瘍細胞、３５，２９６個の間質細胞、１５，０４９個の免疫細胞及び２，３３４個の間質／免疫細胞が得られた。プールされた砂漠腫瘍ライブラリにおける間質細胞及び免疫細胞の同一性を、実施例１のセクション１．６（図１Ａ～図１Ｅ）で上に記載されたように計算的に割り当てた。

次に、本発明者らは、不均一性及び細胞組成をより良好に特徴付けるために各区画を別々に分析した。腫瘍細胞は主に患者によってクラスタ化され、これは以前の研究で示された強い患者間の不均一性を反映している可能性が高い（図２Ｂ）。Ｊｅｒｂｙ－Ａｒｎｏｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７５：９８４－９９７．ｅ２４（２０１８）；Ｐｕｒａｍ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７１：１６４４．ｅ１－１６１１．ｅ２４（２０１７）；Ｔｉｒｏｓｈ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：１８９－１９６（２０１６）。対照的に、間質区画及び免疫区画の両方からの細胞を、細胞型によってクラスタ化し、細胞型クラスタ内では患者によって様々な程度で二次クラスタ化した（図２Ｃ、図２Ｄ、図１Ｆ、及び図１Ｇ）。本発明者らは、既知の細胞型マーカー：間質区画において、線維芽細胞（ＣＯＬ１Ａ１、ＰＤＧＦＲＡ）、内皮細胞（ＰＥＣＡＭ１）及び周皮細胞（ＲＧＳ５）；並びに免疫区画内の骨髄細胞（ＣＤ１４）、Ｔ細胞（ＣＤ３Ｅ）、形質細胞（ＣＤ７９Ａ、ＳＤＣ１）、並びに腫瘍浸潤Ｂリンパ球（Ｂ－ＴＩＬ）（ＣＤ７９Ａ、ＭＳ４Ａ１）の発現に基づいて細胞型を定義した（図２Ｃ及び図２Ｄ）。間質区画及び免疫区画内の細胞型の相対的有病率は患者間で非常に可変的であり、腫瘍免疫表現型との明確な関連を示さなかった（図２Ｅ及び図２Ｆ）。

実施例２．異なる腫瘍免疫表現型に関連する腫瘍固有の性質
２．１． 擬似バルク差次的発現及び遺伝子セット濃縮分析
本発明者らは、擬似バルクアプローチを使用して、差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）分析を行った。各試料について、各遺伝子の生ＵＭＩカウントを、その試料に由来する目的の細胞集団の細胞全体で合計し、試料レベルのＵＭＩカウントを得た。試料全体で５個未満の細胞及び５０個未満のリードを有する遺伝子を有する試料は、分析から除外した。次いで、本発明者らは、ｃａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓ（ｅｄｇｅＲ）を使用して各擬似バルク試料のサイズ係数を計算し、ｖｏｏｍ－ｌｉｍｍａを使用してこれらの試料レベルの擬似バルク発現プロファイルに対して差次的遺伝子発現分析を行った。腫瘍区画におけるＧ２／Ｍ補正擬似バルク発現分析のために、本発明者らは、前述のようにＧ２／Ｍ細胞周期遺伝子によるＣｅｌｌＣｙｃｌｅＳｃｏｒｉｎｇ関数を使用して細胞あたりのＧ２／Ｍスコアを計算した。Ｔｉｒｏｓｈ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：１８９－１９６（２０１６）。細胞あたりのスコアは、患者によって平均化され、共変量としてｖｏｏｍ－ｌｉｍｍａ設計行列に加えられた。ｆｇｓｅａパッケージ及びｍｓｉｇｄｂｒパッケージを使用した分子シグネチャデータベース収集からのホールマーク遺伝子セットを使用した差次的遺伝子発現分析の結果に対して、遺伝子セット濃縮分析を行った。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：１５５４５－１５５５０（２００５）。詳細には、差次的に発現された遺伝子リストを、組み合わせた対数倍率変化及び調整済みｐ値に従ってランク付けし、遺伝子セット濃縮分析のための入力として使用した。

２．２． 統計分析
統計分析はＲで実施した。各分析に使用した統計方法は、図面の説明文に記載されている。全ての箱ひげ図は、２５％（下部ヒンジ）、５０％、及び７５％の分位点（上部ヒンジ）を報告する。下側ウィスカーは、下側ヒンジの－１．５^＊四分位範囲以上の最小の観測値を示し、上側ウィスカーは、ｇｅｏｍ＿ｂｏｘｐｌｏｔ（）関数におけるデフォルトとしての上側ヒンジの＋１．５^＊四分位範囲以下の最大の観測値を示す。棒グラフのエラーバーは、標準偏差を表す。

２．３． 結果
本発明者らはまず、腫瘍固有の性質が免疫浸潤のパターンに寄与するかどうかを調べた。腫瘍細胞区画からのｓｃＲＮＡｓｅｑデータを使用して、本発明者らは、差次的発現パターンを特定するために腫瘍免疫表現型間の擬似バルク差次的発現分析を行った。注目すべきことに、除外腫瘍と浸潤腫瘍との間に有意な腫瘍細胞転写の差はなかった（全て調整済みｐ値＞０．０５）。これは、検出力を制限する免疫表現型（図２Ｂ）内であっても、腫瘍間の不均一性に起因し得るか、あるいは、ＣＤ８＋Ｔ細胞除外対腫瘍上皮における浸潤の主な推進要因が、腫瘍細胞自体ではなく、ＴＭＥにおける他の細胞内にあることを示唆し得る。対照的に、２９個の遺伝子が、砂漠腫瘍と浸潤腫瘍及び除外腫瘍の組み合わせセットとの間で有意に差次的に発現された。遺伝子セット濃縮分析により、これらの遺伝子は主に増殖経路に関連しており、それらの特定は増殖性分子サブタイプを有する３つの砂漠腫瘍によって推進されることが明らかになった。したがって、他の生物学的プロセスを特定するために、本発明者らはＧ２／Ｍ状態を考慮した。Ｇ２／Ｍ補正解析は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）及び血管新生に関与する遺伝子が砂漠腫瘍において有意に濃縮されていることを見出した（調整済みｐ値＝それぞれ０．０３及び０．０１、図４Ａ、図５Ａ及び図５Ｂ、並びに表１）。一方、除外腫瘍及び浸潤腫瘍の腫瘍細胞は、主にＭＨＣクラスＩ及びＩＩのプロセシング及び提示のための機構をコードする遺伝子によって駆動されるインターフェロン応答経路（調整済みｐ値＝０．０３）において有意に濃縮された（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ；Ｂ２Ｍ；ＨＬＡ－ＤＱＡ１；ＴＡＰ１；ＰＳＭＢ８；ＰＳＭＢ９）（図４Ａ、図４Ｂ及び図１６、並びに表１）。興味深いことに、本発明者らはまた、除外腫瘍及び浸潤腫瘍における酸化的リン酸化経路の有意な濃縮を観察した（調整済みｐ値＝０．０４、図４Ａ、図４Ｃ、及び図１６）。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＤＵＦ変異体遺伝子）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨＣ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＢ）、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ変異体遺伝子）、及びＶ型ＡＴＰアーゼのサブユニットを含むこの経路の構成要素は、砂漠腫瘍の腫瘍細胞における低レベル（平均）から、除外腫瘍における中間レベルまで、浸潤腫瘍における高発現まで、一連の発現レベルを示した（図４Ｃ及び図１６）。

実施例３．ＣＤ８^＋Ｔ細胞の異なる状態は、免疫浸潤腫瘍及び除外腫瘍の免疫表現型を特徴付ける
３．１． 多重免疫蛍光（ＩＦ）
Ｃｕｒｅｌｉｎｅ，Ｉｎｃ．から調達した１７個の卵巣がん試料からの４μＭ組織切片を、ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｕｌｔｒａ自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で実施される多重ＩＦアッセイに供した。ＦＦＰＥ組織切片からのエピトープ回収、抗体滴定、インキュベーション及び画像取得の詳細な説明は、以前に記載された。Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：８７３－８８５（２０１７）。簡潔には、各標的について、対応する１抗体（１Ａｂ）（ヒトＣＤ３（＃ａｂ１３５３７２、Ａｂｃａｍ）、ＧＺＭＢ（＃１４－８８８９－８０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｐａｎ－サイトケラチン（＃７６０－２５９５、Ｒｏｃｈｅ）、ＰＤ－１（＃ａｂ５２５８７、Ａｂｃａｍ）又はＰＤ－Ｌ１（＃７９０－４９０５、Ｒｏｃｈｅ））をスライド上でインキュベートし、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート２Ａｂ（ＧＺＭＢの場合はＧａＲｔ－ＨＲＰ（＃７６０－４４５７）、ＰＤ１及びｐａｎ－サイトケラチンの場合はＧａＭｓ－ＨＲＰ（＃７６０－７０６０）、ＣＤ３及びＰＤＬ１の場合はＧａＲｂ－ＨＲＰ（＃７６０－７０５８））とインキュベートし、次いで、標的をチラミドコンジュゲートフルオロフォア（ＴＳＡ－ＦＬ）で検出した。次の標的検出は、同じスキームに従った、等である。同じ種の１抗体の潜在的な交差反応を防ぐために、加熱工程を導入して、次の標的を検出する前に１Ａｂ及び２Ａｂ複合体を不活性化した。次いで、スライドを４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号７６０－４１９６）で対比染色した。スライドを、マイクロカバーガラス、２４×５０ｍｍのＮｏ．１．５（ＶＷＲ、カタログ番号：４８３９３２４１）及びＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｐ３６９６２）を使用してカバーガラスをかぶせた。蛍光画像の取得は、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ Ｚ１（ドイツ国オーバーコッヘン）で行った。関心領域（ＲＯＩ）、すなわち腫瘍、ｐａｎＣＫ＋腫瘍付近（ｅｐｉｔｕｍｏｒ）又は間質領域内の固有に染色されるか、又は同時に染色されるマーカーを有する細胞の計数に関する画像分析を、前述のようにスキャン画像に対して行った。Ｒａｃｏｌｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃａｎｃｅｒ，７：２８２，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０４２５－０１９－０７６３－１（２０１９）。これらのＲＯＩは、病理学者による腫瘍病変のマニュアル注釈及び画像上の腫瘍の浸潤的先端部に基づいてＤＰアルゴリズムによって計算された。壊死領域を手動で除外した。各スライド全体について、個々の視野（ＦＯＶ）をタイル状に並べて処理する。デジタル病理（ＤＰ）アルゴリズムは、マーカーによって検出される表現型／関心領域を特定するために使用される。詳細には、アルゴリズムは以下の工程を含む：（１）前処理：前処理を適用して、ＦＯＶにおける様々な蛍光アーチファクトを除去した。（２）細胞検出：放射状対称性アルゴリズムを使用して、細胞の中心を検出し、それに投票した。（３）性質の抽出：形態、外観、強度、勾配、及び方向の性質を抽出した。（４）細胞分類：サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、及びロジスティック回帰アルゴリズムなどの異なる機械学習分類指標を使用した。続いて、各分類の精度を評価した。最良の精度を有する分類指標を使用して、細胞を分類した。（５）腫瘍周辺領域及び間質領域のセグメント化：領域成長及び適応閾値化を組み合わせる方法を使用して、腫瘍周辺領域及び間質領域をセグメント化した。表現型／関心領域を識別した後、ＤＰアルゴリズムは、自動的に計算されたＲＯＩにおいてオブジェクトの密度及びそれらの空間的相互関係を特徴付ける統計的メトリックを報告する。異なるカテゴリーの読み出し分析を報告した：（１）ＲＯＩ領域；（２）異なるＲＯＩ内の表現型のカウント；（３）特定の特徴を有する細胞のカウント；（４）ＲＯＩから異なる距離における表現型のカウント。三重陽性細胞がないため、２つの試料を下流分析から除外した。

３．２． 臨床データセット
本研究では、本発明者らのｓｃＲＮＡｓｅｑ所見を検証するために３つの卵巣がん臨床データセットを使用した：ｉ）ＩＣＯＮ７コレクション（ｎ＝３５１）、臨床試験登録：ＮＣＴ ００４８３７８２；ｉｉ）ＲＯＳｉＡコレクション（ｎ＝３０８）、臨床試験登録：ＮＣＴ ０１２３９７３２；ｉｉｉ）ＴＣＧＡコレクション（ｎ＝４１２）。Ｂｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，４７４：６０９－６１５（２０１１）。研究プロトコルは、優良医薬品診療（ｇｏｏｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）ガイドライン及びヘルシンキ宣言に準拠していた。倫理上の承認は、全ての参加国において、必要な場合は全ての参加センターにおいて得られた。全ての患者が、書面によるインフォームドコンセントを提供した。

３．３． ＲＮＡｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
５μｍのＦＦＰＥ卵巣腫瘍組織切片におけるＣＤ８Ａ及びＧＺＭＢ又はＣＤ８Ａ及びＧＺＭＫの二重検出のためのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｄｕｐｌｅｘ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＡＣＤ、カタログ番号３２２４４０）をＢＯＮＤ ＲＸ自動染色機（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｇｒｅｅｎ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋ（ＡＣＤ、カタログ番号３２２５５０）と共に使用して、製造者の説明書（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅブランド、カリフォルニア州ニューアーク）に従って行った。組織ＲＮＡの質を、ヒトシクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）については陽性対照プローブＨｓ－ＰＰＩＢ（ＡＣＤ、カタログ番号３１３９０８）、及びヒトＲＮＡポリメラーゼサブユニットＩＩＡ（ＰＯＬＲ２Ａ）についてはＨｓ－ＰＯＬＲ２Ａ（ＡＣＤ、カタログ番号３１０４５８－Ｃ２）、及び細菌ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）については陰性対照プローブｄａｐＢ（ＡＣＤ、カタログ番号３２０７５８）を用いて評価した。陽性対照プローブ染色では１細胞あたり平均４ドット以上の存在、陰性対照プローブ染色では１０細胞あたり平均１ドット未満の存在によって定義される許容可能なＲＮＡ品質を示す試料のみを、ＣＤ８Ａ（ＡＣＤ、カタログ番号５６０３９３、ＮＭ＿００１７６８．６、９７１～２３４２ｎｔ）、ＧＺＭＫ（ＡＣＤ、カタログ番号４７５９０３－Ｃ２、ＮＭ＿００２１０４．２、２５－１０２５ｎｔ）及びＧＺＭＢ（ＡＣＤ、カタログ番号４４５９７３－Ｃ２、ＮＭ＿００４１３１．４、３－９１２ ｎｔ）の標的プローブで更に分析した。ＦＦＰＥ ＨｅＬａ細胞対照スライドを、卵巣がんＦＦＰＥ組織スライドと共にランニング対照としてＰＯＬＲ２Ａ及びｄａｐＢについて並行して試験した。得られたスライドを、４０倍対物レンズを使用して３ＤＨｉｓｔｅｃｈ Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ（商標）ＳＣＡＮ ＩＩデジタルスライドスキャナ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスキャンした。スキャンした画像を、ＨＡＬＯ（登録商標）画像解析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して、腫瘍及び腫瘍関連間質領域におけるＣＤ８Ａ、ＧＺＭＢ及びＧＺＭＫの染色について解析した。ＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルを計数し、細胞あたりのドット数（ビン０＝０ドット／セル、ビン１＝１～３ドット／細胞、ビン２＝４～９ドット／細胞、ビン３＝１０～１５ドット／細胞、ビン４≧１５ドット／細胞、クラスタ内のドットが１０％超）に基づいて５つのカテゴリーに分類した。各ビン内のシグナルレベルと細胞のパーセンテージとを組み合わせるために、以下のように複合Ｈスコアを計算した：Ｈスコア＝（０×％ビン０内の細胞）＋（１×％ビン１内の細胞）＋（２×％ビン２内の細胞）＋（３×％ビン３内の細胞）＋（４×％ビン４内の細胞）。Ｈスコアは０～４００の範囲であった。腫瘍及び間質領域のＨスコアを別々にスコア化した。

３．４． バルクＲＮＡｓｅｑライブラリの調製及びシーケンシング
新鮮組織試料をＲＬＴ緩衝液（（＃７９２１６、Ｑｉａｇｅｎ）で機械的に解離し、続いてＲＮＡ抽出（＃７４１３６、Ｑｉａｇｅｎ）を行った。ＴｒｕＳｅｑ（＃２００２０５９５、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造者の説明書に従って使用してライブラリを作製し、プールし、高出力キットｖ２（＃２００２４９０７、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を有するＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００で配列決定した。

３．５． バッチ効果補正及び拡散擬時系列分析
線維芽細胞、Ｔ細胞及び骨髄集団の分析は患者主導型クラスタ化を明らかにしたため、本発明者らは、バッチ平衡ｋ近傍補正（ｂｂｋｎｎ）法を使用して患者効果（本明細書ではバッチ効果）を補正した。Ｐｏｌａｎｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３６：９６４－９６５（２０２０）。この目的のため、本発明者らは、ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ ｖ１．１２を使用して、ａｎｎｄａｔａ ｖ１．４．３、ｎｕｍｐｙ ｖ１．１７．０、ｂｂｋｎｎ ｖ１．３．９を含むパイソンモジュールｓｃａｎｐｙ ｖ０．６．２１をＲにインポートした。簡潔には、ｂｂｋｎｎを、ｓｅｕｒａｔによって計算され、エルボープロットによって決定されるように、上位主成分に適用し、ｓｃａｎｐｙを用いてクラスタを特定し、全ての結果をｓｅｕｒａｔに戻した。ｂｂｋｎｎが技術的差異のみを補正し、生物学的差異は補正していないことを検証するために、得られたクラスタ及びそれらのマーカーを単一ライブラリクラスタ分析の結果と手動で比較した（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。

３．６ 拡散擬時系列分析
拡散擬時系列分析は、ｂｂｋｎｎ補正されたａｎｎｄａｔａオブジェクト上のｓｃａｎｐｙ拡散マップ関数によって実行され、ｓｅｕｒａｔに戻された。

３．７． 亜集団及び細胞内機能の特定
線維芽細胞クラスタの同一性を、以前に特定された線維芽細胞表現型：ｉＣＡＦ、ｍｙＣＡＦ、並びにＩＬ１駆動及びＴＧＦＢ駆動のＣＡＦのｓｅｕｒａｔ ＡｄｄＭｏｄｕｌｅＳｃｏｒｅを使用して遺伝子シグネチャスコアを計算することによって決定した。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃ．Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：２３２－２５３（２０２０）；Ｅｌｙａｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：１１０２－１１２３（２０１９）。

樹立された骨髄クラスタ及びＴ細胞型クラスタを、以下の遺伝子マーカーのクラスタ平均発現を使用して注釈付けした：１）樹状細胞：ＣＤ１Ｃ、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＣＬ１９、ＣＣＲ７、２）形質細胞様樹状細胞：ＬＩＬＲＡ４、３）増殖性細胞：ＭＫＩ６７、４）Ｔｇｄ及びＮＫ細胞：ＴＲＤＣ、ＮＣＡＭ１、５）ＣＤ８ Ｔ細胞：ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、６）ＣＤ４ Ｔ細胞：ＣＤ４、ＣＤ４０ＬＧ。単一細胞分析の場合によくあるように、ＭＫＩ６７、ＰＣＮＡ及びＢＩＲＣ５などの増殖性遺伝子の高発現を有する細胞のクラスタが、分析された全ての細胞型において観察された。これらの増殖性細胞クラスタは、典型的には、優性細胞周期遺伝子発現プログラムのために分離することができない異なる亜集団の混合物を表し、本発明者らは、これらの情報のないクラスタを全ての下流分析から除外した。平均発現による注釈のカットオフを、クラスタ及び遺伝子発現分布の手動検査によって決定した。Ｔ細胞集団、骨髄系細胞集団及び線維芽細胞集団の亜集団遺伝子マーカーを遺伝子マーカーヒートマップにプロットし、ウィルコクソン検定を用いて他の全ての細胞に対する亜集団における有意な差次的発現について試験することによって特定した。

３．８． バルクＲＮＡシーケンシングデータ処理及び免疫表現型予測
ＫＩＹＡＴＥＣ、ＩＣＯＮ７、ＲＯＳｉＡ及びＴＣＧＡデータセットの生データ処理を、前述のように実行した。Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７９：４６３（２０１９）。簡潔には、生のカウントを、１００万当たりのカウント（ＣＰＭ）が試料の少なくとも１０％において０．２５よりも小さかった低発現遺伝子についてフィルタリングした。ＣＰＭは、ｅｄｇｅＲパッケージのｃｐｍ関数を用いて計算した。フィルタリングされた遺伝子発現マトリックスの生カウントに基づいて、ＣａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓ（ｅｄｇｅＲパッケージ）を使用してサイズ係数を計算し、その後のｖｏｏｍ－ｌｉｍｍａ差次的発現分析に使用した。以前に記載されたようにハウスキーピング遺伝子正規化データに適用された以前に構築された遺伝子発現に基づく分類指標を使用して、各試料の免疫表現型を予測した。（Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１：５５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９４０８－２（２０２０）。

３．９． バルクＲＮＡシーケンシングデータデコンボリューション及びシグネチャスコアリング
ＣＤ８＋ＧＺＭＢ陽性細胞及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ陽性細胞の割合を推定するために、ＣＤ８＋ＣＩＢＥＲＳＯＲＴシグネチャスコアに対するＧＺＭＢ又はＧＺＭＫの発現レベルを各試料について計算した。Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．，１２：４５３－４５７（２０１５）。詳細には、ｌｏｇ及びｖｏｏｍ変換データを使用して、ｍｕｌｔｉＧＳＥＡパッケージからのｓｃｏｒｅＳｉｎｇｌｅＳａｍｐｌｅｓを使用してＣＩＢＥＲＳＯＲＴ＿ＬＭ２２＿Ｔ＿ｃｅｌｌｓ＿ＣＤ８遺伝子セットのｚスコアを計算した。ＧＺＭＢ及びＧＺＭＫを遺伝子セットから除外した。次いで、ＣＤ８＋シグネチャスコアを、ｌｏｇ及びｖｏｏｍ変換したＧＺＭＢ又はＧＺＭＫの発現からから差し引いた。

３．１０． 生存分析
生存パッケージを使用して、ＩＣＯＮ７化学療法群におけるＣＤ８＋ＧＺＭＫ及びＧＺＭＢ Ｔ細胞と無増悪生存との関連の分析を行った。

３．１１． 結果
各免疫表現型について腫瘍微小環境の組成を分析するために、本発明者らは、各細胞型を別々に（すなわち、Ｔ細胞及び骨髄細胞）調査し、細胞亜集団及び細胞機能を定義した。全てのＴ細胞のバッチ補正ｕＭＡＰ提示に対するクラスタ分析により、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＣＤ８＋の分離が明らかになった（図８Ａ、図８Ｂ、及び図６Ａ）。さらに、本発明者らは、Ｔガンマデルタ受容体遺伝子ＴＲＤＣ及びＮＫ細胞マーカーＮＣＡＭ１を発現する２つのクラスタを特定した。ＮＫ細胞及びＴガンマデルタ（Ｔｇｄ）細胞は転写的に類似しているため、本発明者らはこれらの２つの細胞型を区別することができなかった。ＣＤ４＋Ｔ細胞内で、本発明者らは、それらの遺伝子発現マーカーに従って、制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、ＩＬ２ＲＡ）、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＸＣＬ１３、ＣＤ２００、ＩＣＯＳ）及び静止期ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ７Ｒ、ＧＰＲ１８３、ＬＭＮＡ、ＡＮＸＡ１）の３つの異なる機能的状態及び表現型状態を識別した（図８Ａ及び８Ｃ）。静止期ＣＤ４＋ＩＬ７Ｒ Ｔ細胞は、浸潤腫瘍と比較して除外腫瘍において有意に濃縮されたが（ｐ値＝０．０１）、浸潤腫瘍はより活性化された制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞を有する傾向があった（ｐ値＝０．１及び０．３、図９Ａ及び図９Ｂ）。本発明者らは、４つのＣＤ８＋Ｔ細胞状態を特定し、それらの特徴的なマーカーに基づいて、及びｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｕｎらによって報告されたＣＤ８＋Ｔ細胞命名法を使用してそれらに注釈を付けた：ｉ）ＣＤ８＋ＦＧＦＢＰ２、ｉｉ）ＣＤ８＋ＩＬ７Ｒ、ｉｉｉ）ＣＤ８＋ＧＺＭＢ及びｉｖ）ＣＤ８＋ＧＺＭＫ（図８Ａ及び図８Ｃ）。ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｕｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２０：２１８－２３２（２０２０）。ＣＤ８＋ＦＧＦＢＰ２細胞は、細胞傷害性エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞として以前に報告されている。Ｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７６（４）：７７５－７８９．ｅ１８（２０１９）。興味深いことに、Ｔｇｄ／ＮＫ細胞の異なるクラスタは、ＣＤ８＋ＦＧＦＢＰ２集団とマーカーを共有した：ＦＧＦＢＰ２、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢ、ＫＬＲＧ１及びＧＬＮＹ（図８Ａ及び図８Ｃ）。ＣＤ８＋ＦＧＦＢＰ２集団及びＴｇｄ／ＮＫ ＦＧＦＢＰ２集団の両方が砂漠腫瘍において有意に濃縮され、浸潤腫瘍にはほとんど存在しなかった（除外ではｐ＝０．００３及び０．０７、浸潤ではｐ＝１．２ｅ－０９及び３．５ｅ－０５、図９ａ及び図９ｃ）が、絶対細胞数は比較的小さかった（データは示さず）。ＣＤ８＋ＩＬ７Ｒ細胞は、ＩＬ７Ｒ及びＧＰＲ１８３を発現し（図８Ｃ）、ＮＳＣＬＣ及びＣＲＣで以前に観察されたセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に類似する転写プロファイルを有し（Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：９７８－９８５（２０１８）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５６４：２６８－２７２（２０１８））、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｕｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０，２１８－２３２（２０２０）によって提案された命名法に基づいてナイーブ様細胞の下で再グループ化された。

次に、本発明者らは、２つの最大のＣＤ８＋Ｔ細胞クラスタである、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞に注目し（図８Ｃ及び図８Ｄ）、それらの潜在的な機能状態及び空間分布を詳細に更に特徴付けた。ＧＺＭＢ Ｔ細胞集団及びＧＺＭＫ Ｔ細胞集団の両方がｓｃＲＮＡｓｅｑ研究において以前に報告されているが、それらの機能は以前にはほとんど理解されていなかった。Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：９７８－９８５（２０１８）；Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，５７９：２７４－２７８（２０２０）；Ｙｏｓｔ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５：１２５１－１２５９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０５２２－３（２０１９）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５６４：２６８－２７２（２０１８）；Ｚｈａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７９：８２９－８４５．ｅ２０（２０１９）。本発明者らのデータは、両方の集団が活性化表現型（ＩＣＯＳ、ＣＤ６９）を示唆するマーカーを発現し、両方とも他のグランザイム（ＧＺＭＡ、ＧＭＺＨ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、パーフォリン（ＰＲＦ１）、グラニュライシン（ＧＮＬＹ）及びＣＣＬ４の発現によってエフェクター機能を実証したことを明らかにした（図９Ｄ）。しかし、それらは活性化状態及び疲弊様状態において著しく異なっていた。ＣＤ８＋ＧＺＭＢ集団は、ＣＴＬＡ４、ＴＯＸ、ＬＡＧ３及びＰＤＣＤ１の発現によって示唆されるように、大いに活性化された疲弊様の表現型を示した（図８Ｅ）。さらに、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ集団を、ＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）及びＣＸＣＬ１３の発現によってマークした（図８Ｆ）。ＣＤ３９及びＣＸＣＬ１３は、それぞれ腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞及び後期機能不全Ｔ細胞の潜在的マーカーとして以前に特定されている。Ｓｉｍｏｎｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５７：５７５－５７９（２０１８）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｕｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２０：２１８－２３２（２０２０）。

興味深いことに、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞の活性化／疲弊状態は、排除外腫瘍と比較して浸潤腫瘍で有意に大きく、ＬＡＹＮ、ＣＤ６９及びＴＮＦＲＳＦ９などの活性化マーカー及び疲弊マーカーの発現が高かった（図８Ｅ）。以前に開発された機能障害スコア（Ｌｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７６，７７５－７８９ ｅ７１８（２０１９））及びコアＴ細胞疲弊シグネチャ（Ｙｏｓｔ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５，１２５１－１２５９（２０１９））を本発明者らのデータセットに適用すると、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞が最も高度の機能不全及び疲弊を示すことも確認された（図１７）。浸潤腫瘍対除外腫瘍におけるＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞の活性化状態をタンパク質レベルで検証するために、本発明者らは、独立した検証コレクションからの１７個の卵巣がん組織（９個浸潤、８個除外）をサイトケラチン（ＰａｎＣＫ）、ＣＤ３、ＰＤ－１及びＧＺＭＢに対する多重免疫蛍光に供した。全てのＧＺＭＢ＋Ｔ細胞（ＣＤ３／ＧＺＭＢ二重陽性）のうち、ＰＤ－１について陽性のＧＺＭＢ＋Ｔ細胞の割合は、腫瘍上皮における除外腫瘍と比較して、浸潤腫瘍において有意に高く（ｐ値＝０．０７７）（図９Ｅ）、このことは、浸潤腫瘍におけるＧＺＭＢ＋Ｔ細胞の、具体的には腫瘍領域におけるＧＺＭＢ＋Ｔ細胞の、より高い活性化状態を裏付けている。

対照的に、ＣＤ８＋ＧＺＭＫ細胞は、潜在的なエフェクターメモリーＴ細胞又は機能不全前Ｔ細胞として以前に記載されている。Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：９７８－９８５（２０１８）；Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７６：７７－７８９（２０１９）；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．１１．０４３；Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，５７９：２７４－２７８（２０２０）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５６４：２６８－２７２（２０１８）；Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６９：１３４２－１３５６．ｅ１６（２０１７）。本発明者らは、これらの試験で報告されたように、ＥＯＭＥＳ、ＫＬＲＧ１及びＣＭＣ１を含むＣＤ８＋ＧＺＭＫ細胞集団で同様のマーカープロファイル発現を見出した（図８Ｆ）。まとめると、これらの観察結果は、ＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞は機能不全前のエフェクターメモリー細胞を表すのに対し、それらの腫瘍反応性の可能性に関連し得るＣＤ８＋ＧＺＭＢ細胞のより進行した機能不全状態を示唆する。

ＣＤ８＋ＧＺＭＢ及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞の異なる機能不全状態を考慮して、本発明者らは、間質対腫瘍上皮におけるこれらのＴ細胞サブセットの空間的分布がそれらの機能状態の差に寄与するかどうかを調べた。本発明者らは、検証コレクションからの同じ１７個の卵巣がん試料を、ＧＺＭＫ／ＣＤ８Ａ及びＧＺＭＢ／ＣＤ８Ａのｉｎ ｓｉｔｕコハイブリダイゼーション、並びにＨ＆Ｅ染色による間質対腫瘍領域内の局在化のためのＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイに供した。ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ及びＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ二重陽性Ｔ細胞の両方が、除外腫瘍の腫瘍周囲間質及び浸潤腫瘍の腫瘍上皮に蓄積した（図８Ｇ）。この観察から、本発明者らは、ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ Ｔ細胞及びＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ Ｔ細胞の両方が、少なくとも浸潤腫瘍において腫瘍上皮に浸潤する能力を有し、したがって、腫瘍上皮への近接性は、ＧＺＭＢ＋集団及びＧＺＭＫ＋集団の機能不全状態の違いを説明することができないと結論付けた。

次に、本発明者らは、本発明者らのｓｃＲＮＡｓｅｑ分析に基づいて、機能不全ＣＤ８＋ＧＺＭＢ及び機能不全前ＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞が、浸潤腫瘍と比較して除外腫瘍において異なる有病率を示したかどうかを尋ねた：５つの浸潤腫瘍のうち３つは、全ての除外腫瘍と比較してより低いＣＤ８＋ＧＺＭＫの割合を示し、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ亜集団についてはその逆であった（図８Ｈ及び図９Ａ）。本発明者らは、除外腫瘍を有するＣＤ８＋ＧＺＭＫ機能不全前亜集団と、浸潤腫瘍を有するＣＤ８＋ＧＺＭＢ機能不全亜集団と、の関連があると仮定した。この仮説を検証するために、本発明者らは、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ及びバルクＲＮＡｓｅｑデコンボリューションアプローチを使用した。本発明者らのＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ結果は、浸潤試料と比較して、除外試料中のＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞の割合が有意に高いことを示したが（ｐ＝０．０３）、ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＢ二重陽性細胞の割合に有意差はなかった（図９Ｆ）。

ｉｎ ｓｉｔｕ検証に加えて、本発明者らは、３つの卵巣がんコホートからのバルクＲＮＡｓｅｑデータを調査することによって、より大きな研究で本発明者らのｓｃＲＮＡｓｅｑ所見を検証した：ＴＣＧＡ（ｎ＝４１２）、（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１）、ＩＣＯＮ７臨床試験コレクション（ｎ＝３５１）、及びＲＯＳｉＡ臨床試験コホート（ｎ＝３０８）。Ｂｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，４７４：６０９－６１５（２０１１）；Ｏｚａ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２７：５０－５８（２０１７）；Ｐｅｒｒｅｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６５：２４８４－２４９６（２０１１）。本発明者らはまず、以前に確立された分類指標を用いて、これらの試料の腫瘍免疫表現型を予測した。Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７９：４６３（２０１９）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ ＣＤ８シグネチャを使用してバルクＲＮＡｓｅｑデータをデコンボリューションすると、本発明者らの研究で使用した１５個の卵巣がん試料で本発明者らが観察されたものと同様に、３つ全てのコホートにおいて除外腫瘍及び浸潤腫瘍におけるより高いＣＤ８^＋Ｔ細胞含有量が確認された（図９Ｇ）。ＣＤ８＋ＧＺＭＫ対ＧＺＭＢ Ｔ細胞集団の免疫表現型特異的濃縮を検証するために、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の中の各集団の割合の代用として、各試料のＣＤ８＋Ｔ細胞シグネチャスコアに対するＧＺＭＫ又はＧＺＭＢ発現の比を使用した。本発明者らのモデルと一致して、３つ全ての臨床コホートにおいて、除外腫瘍は、浸潤腫瘍と比較して有意に高いＧＺＭＫ／ＣＤ８＋代用比を示した（図８Ｉ）。同様に、ＧＺＭＢ／ＣＤ８＋比は、除外腫瘍よりも浸潤腫瘍において高かったが、この差の統計学的有意性は、より大きなＴＣＧＡデータセットにおいてのみ達成された。さらに、浸潤表現型対除外表現型を予測するロジスティック回帰モデルにおいてＧＺＭＢ／ＣＤ８＋及びＧＺＭＫ／ＣＤ８＋比を組み合わせると、３つ全てのコホートにおいていずれかの単一比モデルよりも説明される分散が有意に増加し（図８Ｉ）、ＣＤ８＋ＧＺＭＫ及びＧＺＭＢ細胞集団の割合が両方とも表現型と関連しており、したがって、これらの腫瘍免疫表現型がそれらのＣＤ８＋Ｔ細胞の機能状態において重要な定性的及び定量的差異を示すことを裏付けている。

本発明者らの以前の研究において、発明者らは、腫瘍が浸潤表現型又は砂漠表現型と比較して除外表現型を示した場合、化学療法を受けた卵巣がん患者の生存の低下を観察した。Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７９：４６３（２０１９）。ＣＤ８＋ＧＺＭＢ及びＧＺＭＫ細胞と浸潤腫瘍及び除外腫瘍との差次的関連性のため、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の状態が化学療法処置下での臨床転帰とも関連するかどうかを尋ねた。ＩＣＯＮ７臨床試験の化学療法処置群の１０３人の患者のコホートでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞量がより長い無増悪生存期間（ＰＦＳ）と弱く関連していることが観察され（ｐ＝０．０９３、図８Ｊ）、これは卵巣がんにおけるＣＤ８ Ｔ細胞浸潤の良好な予後効果を示す以前の所見と一致していた。Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１２４：１９２－１９８（２０１２）；Ｌｏ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：９２５－９３４（２０１７）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：２０３－２１３（２００３）。興味深いことに、ＧＺＭＢ／ＣＤ８＋比はこのコホートでは臨床転帰と関連しなかったが、ＧＺＭＫ／ＣＤ８＋比は、特に多変量モデルで全体的なＣＤ８＋Ｔ細胞スコアと組み合わせた場合、より短いＰＦＳと有意に関連していた（ｐ＝０．０２９、図８Ｊ及び図９Ｈ）。したがって、ＧＺＭＫ陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的割合は生存の低下と関連しており、この比は、全ＣＤ８＋Ｔ細胞含有量よりも患者の転帰に関するより多くの情報を提供する。

要約すると、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞は浸潤腫瘍において濃縮されているが、静止期ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞は除外腫瘍において濃縮されており、両方のＣＤ８＋Ｔ細胞型が腫瘍上皮において見出され得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の特徴付けにより、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞についてのより疲弊した細胞傷害性エフェクター機能表現型が明らかにされたが、エフェクターメモリーＴ細胞のマーカーはＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞を特徴付けた。最後に、ＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞のより高い割合は、卵巣がんにおける化学療法下でのより悪い転帰に関連する。

実施例４．線維芽細胞表現型はＴ細胞の局在化と関連する
４．１． 結果
最近の研究は、いくつかの腫瘍タイプにおけるがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の異なるサブセットを明らかにした。Ａｖｅｒｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，６７：９０－１０６（２０１８）；Ｃｏｓｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，３３：４６３－４７９．ｅ１０（２０１８）；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：２３２－２５３（２０２０）；Ｏｈｌｕｎｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２１４：５７９－５９６（２０１７）。しかしながら、腫瘍免疫表現型とのそれらの関連はほとんど理解されていない。本発明者らは、線維芽細胞の３つの主要なクラスタを特定した（図１０Ａ）。３つの線維芽細胞クラスタのうちの２つは、ｐａｎＣＡＦシグネチャの高い発現を示し（Ｅｌｙａｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：１１０２－１１２３（２０１９）から得られた）、ＣＡＦの存在を示した（図１０Ｂ及び図１１Ａ）。以前、ＣＡＦは、炎症性ＣＡＦ（ｉＣＡＦ）及び筋線維芽細胞（ｍｙＣＡＦ）として、又はＩＬ１活性化ＣＡＦ（ＩＬ１ ＣＡＦ）及びＴＧＦＢ活性化ＣＡＦ（ＴＧＦＢ ＣＡＦ）として記載されていた。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：２３２－２５３（２０２０）；Ｅｌｙａｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：１１０２－１１２３（２０１９）。最も強いｐａｎＣＡＦシグナルを有する２つのクラスタのうち、一方のクラスタは高いｉＣＡＦ及びＩＬ１＿ＣＡＦシグネチャ発現を示し、他方のクラスタは高いｍｙＣＡＦ及びＴＧＦＢ＿ＣＡＦ発現を示した（図１０Ｂ及び図１１Ａ）。したがって、本発明者らは、これらのクラスタにそれぞれＩＬ１ ＣＡＦ及びＴＧＦＢ ＣＡＦと注釈を付けた。

これらの異なるＣＡＦ集団の機能への更なる洞察を得るために、本発明者らは、ＴＧＦＢ ＣＡＦ及びＩＬ１ ＣＡＦを区別する遺伝子発現プロファイルを調べた。ＴＧＦＢ ＣＡＦ集団の上位２０のマーカーには、ＴＧＦβ誘導性反応性間質に以前に関連していた遺伝子：ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）、平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、並びにコラーゲンサブユニット（ＣＯＬ１０Ａ１，ＣＯＬ１１Ａ１）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１１）、トランスジェリン（ＴＡＧＬＮ）及びフィブロネクチン（ＦＮ１）が含まれる（図１０Ｃ）。Ｒｙｎｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：２９４１－２９５１（２０１５）。一方、ＩＬ１ ＣＡＦ集団を特徴付けるマーカーには、ＣＸＣＬ１４、ＣＣＬ２、及びサイトカインシグナル伝達抑制因子３（ＳＯＣＳ３）などのサイトカイン／ケモカインシグナル伝達の性質が含まれていた。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０：２３２－２５３（２０２０）；Ｅｌｙａｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：１１０２－１１２３（２０１９）；Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：７７７－７９９２（２０１９）。本発明者らは以前に、卵巣がんにおけるＴＧＦβ媒介性反応性間質とＴ細胞除外免疫表現型との間の関連を特定した。Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７９：４６３（２０１９）。したがって、本発明者らは、異なる線維芽細胞亜集団が異なる腫瘍免疫表現型に関連し得るかどうかを分析した：ＩＬ１ ＣＡＦは浸潤腫瘍において濃縮される傾向を示す（ｐ＝０．１１）が、ＴＧＦＢ ＣＡＦと除外腫瘍との関連は有意ではない（図１０Ｄ及び図１１Ｂ）。これらのＴＧＦＢ ＣＡＦは、腫瘍細胞の排除に寄与することができ、５つの除外腫瘍のうち４つ及び５つの浸潤腫瘍のうち２つのみの線維芽細胞の４０％以上を表す高密度マトリックスを形成する反応性間質遺伝子を発現するが、除外腫瘍との関連を更に分析するためのＴＭＥ中のこれらの細胞の分布を含む追加の調査が必要である。

線維芽細胞の第３のクラスタは、ｐａｎＣＡＦシグネチャの認め得るが低下した発現を示した（図１１Ａ）。本発明者らは、このクラスタに線維芽細胞様集団として注釈を付けた（図１１Ｂ）。注目すべきことに、これらの線維芽細胞様細胞は、ほぼ排他的に１つの砂漠（ｄｅｓ３）及び１つの除外腫瘍（ｅｘｃ４）に見られた（図１１Ｂ）。このクラスタの上位マーカーには、上皮細胞に関連する遺伝子（ＳＬＰＩ、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ８、ＫＲＴ１８、ＷＦＤＣ２）が含まれる。Ｓｈｉｈ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１３：ｅ０２０６７８５（２０１８）。したがって、このクラスタは、ＥＭＴを受けた腫瘍細胞を表すことが可能である。これらの細胞の特質をよりよく理解するために、更なる調査が必要である。

実施例５．異なる腫瘍免疫表現型に関連する骨髄細胞の表現型的及び機能的に多様なサブセット
５．１． 結果
骨髄区画の分析（図７Ａ）により、ＣＤ１Ｃ及びＣＬＥＣ１０Ａ発現によって示される樹状細胞（ＤＣ）、ＬＩＬＲＡ４を発現する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、並びにＣＤ１４発現によって示される４つのマクロファージ／単球クラスタを代表するクラスタが特定された（図１２Ａ及び図１３Ａ）。ＤＣ集団のサブクラスタ分析により、ｉ）ＳＰＰ１ ＤＣ、ｉｉ）ＡＰＯＥ ＤＣ、ｉｉｉ）ＣＣＲ７ ＤＣ、ｉｖ）ＣＤ１Ｃ ＤＣ、及びｖ）ＸＣＲ１ ＤＣを含む特徴的な遺伝子に従って標識された５つのクラスタが特定された（図１８）。これらのクラスタのうちの３つは、以前に記載されたＤＣサブセットに確実に割り当てることができ、ＸＣＲ１ ＤＣはｃＤＣ１集団を表し（ＸＣＲ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＡＤＭ１）、ＣＤＣ１ ＤＣはｃＤＣ２集団として（ＦＣＥＲ１Ａ、ＣＤ１Ｃ、ＣＬＥＣ１０Ａ）、ＣＣＲ７ ＤＣは成熟ＤＣを表す（ＣＣＲ７、ＬＡＭＰ３）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＭＡＦＢ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＣＤ１４、ＦＣＧＲ１Ａ及びＣＤ１６３の発現に基づいて、本発明者らは、ＡＰＯＥ ＤＣクラスタが炎症性単球由来ＤＣ集団（Ｃｏｌｌｉｎ ａｎｄ Ｂｉｇｌｅｙ，２０１８）を表す一方で、ＳＰＰ１ ＤＣは、Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．によって記載されたＣＤ１ｃ－ＣＤ１４１－ＤＣサブセット（ＳＥＲＰＩＮＡ１及びＦＣＧＲ３Ａ）（Ｖｉｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）との類似性を共有すると仮定した（図１９）。残念なことに、ＤＣの数は、これらのＤＣサブセットと腫瘍免疫表現型との関連を調べるには少なすぎた。これらの細胞の機能及びＴＭＥにおけるそれらの分布を検証するために、更なる研究が必要とされる。

本発明者らは、類似の細胞集団を記載するために以前に使用された遺伝子マーカーに従って、４つのマクロファージ／単球クラスタを更に特徴付けた：ＦＣＮ１、ＭＡＲＣＯ、ＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９）及びＣＸ３ＣＲ１（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。Ａｒａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：１６３－１７２（２０１９）；Ａｚｉｚｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４：１２９３－１３０８－ｅ３６（２０１８）；Ｃａｓｓｅｔｔａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，３５：５８８－６０２．ｅ１０（２０１９）；Ｌａｖｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６９：７５０－７６５．ｅ１７（２０１７）；Ｚｉｌｉｏｎｉｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１－２９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１９．０３．００９（２０１９）。ＦＣＮ１クラスタは、以前に単球と関連付けられていたＶＣＡＮ及びＳ１００Ａ転写物の高発現を特徴とした（図１２Ｂ及び図１３Ｂ）。Ｖｉｌｌａｎｉ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５６（６３３５）：ｅａａｈ４５７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｈ４５７３（２０１７）；Ｚｉｌｉｏｎｉｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１－２９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１９．０３．００９（２０１９）。さらに、このクラスタは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ単球シグネチャの最も高い発現を示した（図１３Ｃ）。ＣＤ１６９及びＣＸ３ＣＲ１集団は補体因子遺伝子、成熟マーカー（ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ５）及びＭ２ ＣＩＢＥＲＳＯＲＴシグネチャを高度に発現したことから、本発明者らは、これらの集団を腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）様マクロファージとして特徴付けた（図１２Ｂ、図１３Ｂ、及び図１３Ｃ）。最後に、ＭＡＲＣＯクラスタは、ＦＣＮ１クラスタと比較してＶＣＡＮ発現が低く、ＴＡＭ様マクロファージと比較してＭ２シグネチャ及び成熟マーカー発現が低いことを特徴とした。したがって、本発明者らは、以前に記載された集団と同様のＭＡＲＣＯマクロファージとしてこれらの細胞に注釈を付けた。Ｚｉｌｉｏｎｉｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１－２９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１９．０３．００９（２０１９）。特定された細胞状態の分化軌跡を調べるために、本発明者らは擬時系列拡散マップ分析を行った。拡散マップ座標２に沿った軌跡は、ＭＡＲＣＯ未成熟マクロファージからＣＤ１６９及びＣＸ３ＣＲ１成熟マクロファージまでの連続体を辿り、成熟軌跡を示唆するが、拡散マップ座標１は、ＦＣＮ１単球から成熟ＣＤ１６９／ＣＸ３ＣＲ１マクロファージへの分化軌跡を反映する（図１２Ｃ）。骨髄細胞の状態を更に調査するために、本発明者らは、肝細胞癌における最近報告されたＴＡＭ様及びＭＤＳＣ様細胞のシグネチャを導出し、適用した。Ｚｈａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７９：８２９－８４５（２０１９）。実際、ＴＡＭ様マクロファージシグネチャはＣＤ１６９及びＣＸ３ＣＲ１マクロファージで発現し、ＭＤＳＣ様シグネチャはＦＣＮ１単球及びＭＡＲＣＯマクロファージで高度に発現した（図１２Ｄ）。骨髄細胞で発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）ファミリーの２つのメンバー、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の差次的発現は、以前にＴＡＭ様及びＭＤＳＣ様の状態と関連付けられていた。Ｚｈａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７９：８２９－８４５（２０１９）。これと一致して、本発明者らは、ＴＲＥＭ２がＴＡＭ様ＣＤ１６９／ＣＸ３ＣＲ１マクロファージでほぼ排他的に発現され、ＴＲＥＭ１がＭＤＳＣ様ＦＣＮ１単球／ＭＡＲＣＯマクロファージで発現されることを見出した（図１２Ｅ）。

最後に、本発明者らは、これらの異なる骨髄細胞集団が特定の腫瘍免疫表現型に関連するかどうかを評価した。ＭＤＳＣ様骨髄サブセット（ＦＣＮ１単球及びＭＡＲＣＯマクロファージ）は、砂漠腫瘍において有意に濃縮されていたが、ＴＡＭ様骨髄サブセット（ＣＤ１６９及びＣＸ３ＣＲ１マクロファージ）は、除外腫瘍及び浸潤腫瘍において濃縮されていた（ｐ＝０．０２、図１２Ｆ及び図１３Ｃ）。注目すべきことに、いずれの集団についても、除外腫瘍と浸潤腫瘍との間に差は観察されなかった。

実施例６．腫瘍免疫表現型は、区画間相互作用によって形成される
６．１． 擬似バルク差次的発現
本発明者らは、擬似バルクアプローチを使用して、差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）分析を行った。各試料について、各遺伝子の生ＵＭＩカウントを、その試料に由来する目的の細胞集団の細胞全体で合計し、試料レベルのＵＭＩカウントを得た。試料全体で５個未満の細胞及び５０個未満のリードを有する遺伝子を有する試料は、分析から除外した。次いで、本発明者らは、ｃａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓ（ｅｄｇｅＲ）を使用して各擬似バルク試料のサイズ係数を計算し、ｖｏｏｍ－ｌｉｍｍａを使用してこれらの試料レベルの擬似バルク発現プロファイルに対して差次的遺伝子発現分析を行った。腫瘍区画におけるＧ２／Ｍ補正擬似バルク発現分析のため、本発明者らは、以前に記載されたＧ２／Ｍ細胞周期遺伝子によるＣｅｌｌＣｙｃｌｅＳｃｏｒｉｎｇ関数を使用して、細胞あたりのＧ２／Ｍスコアを計算した（Ｓｅｕｒａｔ，ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３５２／６２８２／１８９）。細胞あたりのスコアは、患者によって平均化され、共変量としてｖｏｏｍ－ｌｉｍｍａ設計行列に加えられた。

６．２． 遺伝子セット濃縮分析

ｆｇｓｅａパッケージ及びｍｓｉｇｄｂｒパッケージを使用した分子シグネチャデータベース収集からのホールマーク遺伝子セットを使用した差次的遺伝子発現分析の結果に対して、遺伝子セット濃縮分析を行った。Ｋｏｒｏｔｋｅｖｉｃｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ０６００１２；ｄｏｉ：１０．１１０１／０６００１２（２０１９）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０２：１５５４５－１５５５０（２００５）。詳細には、差次的に発現された遺伝子リストを、組み合わせた対数倍率変化及び調整済みｐ値に従ってランク付けし、遺伝子セット濃縮分析のための入力として使用した。

６．３ ケモカイン受容体－リガンド相互作用分析
既知のケモカイン受容体及びリガンド対のデータベースを、ｃｅｌｌｐｈｏｎｅＤＢ（Ｅｆｒｅｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）（ｃｅｌｌｐｈｏｎｅｄｂ．ｏｒｇ／）からの組み合わせ情報及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのウェブサイト（ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ－ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）からのリソースを使用してキュレーションした。このデータベースを、以下の基準を使用して可能性のあるケモカイン－受容体相互作用についてフィルタリングした：１）各受容体－リガンド対は、細胞集団の細胞の少なくとも１０％で発現されるべきであり、２）各対は、同じ免疫表現型内で発現されるべきである。これは、６つの可能性のあるケモカイン受容体－リガンド相互作用をもたらし、その発現レベル及び受容体／リガンドを発現する細胞の数を各個々の患者において評価した。

６．４ 結果
本発明者らの腫瘍微小環境の単一細胞特性評価は、腫瘍免疫連続体を形成するのに役立ち得る細胞区画間の潜在的相互作用を調べることも可能にした。単一細胞データは細胞間シグナル伝達の決定的な証拠を提供することはできないが、様々なグループが、単一細胞データにおける細胞特異的受容体及びリガンド発現パターンの検討をどのように使用して仮説を効果的に生成することができるかを示している。Ｃａｍｐ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５４６：５３３－５３８（２０１７）；Ｃｏｓｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，３３：４６３－４７９．ｅ１０（２０１８）；Ｓｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２２：６００－６１０（２０１８）；Ｖｅｎｔｏ－Ｔｏｒｍｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５６３：３４７－３５３（２０１８）。そのようなアプローチに従って、本発明者らは、２３個の既知のケモカインリガンド－受容体対に注目し、どの細胞型がケモカインリガンド又は受容体を発現するかを決定し、関与する細胞型について、本発明者らは、受容体又はリガンドを発現する細胞の発現レベル及び割合に更に注目した。本発明者らは、１）受容体が細胞型又は亜集団の１％未満の細胞によって発現され、２）受容体及びリガンドの発現が患者の大部分について同じ患者において同時に起こらなかった、いずれの推定される相互作用対も除外した。このフィルタリングは、本発明者らがデータセットにおいて更に調査した６つの推定されるケモカインリガンド－受容体相互作用をもたらした。興味深いことに、本発明者らは、Ｔ細胞の動員及び遊走における各区画（腫瘍、免疫及び間質）を潜在的に暗示する証拠を見出した。

６．４．１ 腫瘍細胞－免疫細胞のクロストーク
Ｔ細胞の動員について知られているケモカインであるケモカインＣＸＣＬ１６は、腫瘍細胞並びに主に骨髄性細胞によって発現された（図１４Ａ及び１５Ａ）。Ｍａｔｓｕｍａｒａ，Ｓ．ａｎｄ Ｄｅｍａｒｉａ，Ｓ．Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．，１７３：４１８－４２５（２０１０）。さらに、本発明者らは、ＣＸＣＬ１６発現が、砂漠腫瘍と比較して、浸潤腫瘍及び除外腫瘍の腫瘍細胞区画において有意に高いことを観察した（ｐ値＝それぞれ０．０１２及び０．０２２、図１４Ｂ）。一方、ＣＸＣＬ１６受容体である、ＣＸＣＲ６は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞において特異的に発現され、ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＦＯＸＰ３ Ｔｒｅｇにおいて特に高いことが見出された（図１４Ａ）。Ｗｉｌｂａｎｋｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：５１４５－５１５４（２００１）。この共発現パターンは、本発明者らが十分な細胞を有していた全ての個々の患者で確認することができ、浸潤腫瘍の腫瘍細胞で特に明らかであった（図１５Ｂ）。ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＦＯＸＰ３ Ｔｒｅｇが浸潤腫瘍において濃縮されたという本発明者らの観察と合わせて、この知見は、ＣＸＣＲ６ Ｔ細胞が浸潤腫瘍において腫瘍上皮に動員され得る潜在的な機序を示唆した。

６．４．２． 免疫細胞－免疫細胞クロストーク
腫瘍細胞とＴ細胞との間の潜在的なＣＸＣＬ１６／ＣＸＣＲ６クロストークと同様に、本発明者らは、Ｔ細胞と骨髄細胞との間の可能性のあるクロストークを特定した。ＣＸＣＲ３受容体は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞によって発現され、その主要なリガンドであるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１は、樹状細胞及びＣＤ１６９マクロファージによって主に発現された（図１４Ｃ及び図１５Ｃ）。さらに、浸潤腫瘍におけるＢ－ＴＩＬによるＣＸＣＲ５の発現、並びにＣＤ４＋ＣＸＣＬ１３及びＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞による対応するケモカインリガンドＣＸＣＬ１３の発現は、浸潤腫瘍へのＢ－ＴＩＬの動員の潜在的な機構を示唆している（Ｋａｚａｎｉｅｔｚ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）１０，４７１（２０１９））（図１５Ｄ～図１５Ｅ）。

６．４．３． 間質細胞－免疫細胞クロストーク
間質細胞はまた、免疫細胞の動員に関与し得る。ケモカインＣＸＣＬ１４及びＣＸＣＬ１２は、ＩＬ１ ＣＡＦ集団によって発現され（図１４Ｄ）、それらは受容体ＣＸＣＲ４に結合することが知られている。Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，３１：３０８４－３０９７（２０１７）；Ｔａｎｅｇａｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８７：１７３１－１７３５（２０１３）；Ｖｅｇａ，Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９０：３９９－４０８（２０１１）。特に、この受容体は、免疫細胞によってほぼ排他的に発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって最も強く発現されることが見出され（図１４Ｄ及び図１５Ｆ）、これらはＩＬ１ ＣＡＦの弱い濃縮を示すが、Ｔ細胞は砂漠腫瘍ではまれであるため、浸潤腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞動員におけるＩＬ１ ＣＡＦの役割を示唆している。

内皮細胞及び周皮細胞は、ＣＸ３ＣＲ１の主要リガンドである、ＣＸ３ＣＬ１及び最近記載されたリガンドＣＣＬ２６を認識可能に発現する唯一の細胞型であった（図１４Ｅ）。Ｅｌ－Ｓｈａｚｌｙ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，４３：３２２－３３１（２０１３）。ＣＸ３ＣＲ１は、浸潤腫瘍及び除外腫瘍において主要な成熟マクロファージ集団の１つをマークしたため（図１４Ｆ）、本発明者らは、内皮細胞及び周皮細胞を介したＣＸ３ＣＲ１マクロファージの動員がこれら２つの免疫表現型に特異的であると仮定する（図１５Ｇ）。

骨髄細胞に加えて、Ｂ－ＴＩＬは、間質細胞区画との可能性のあるケモカイン受容体－リガンドのクロストークの証拠を示した。内皮細胞は、ＣＣＲ７＋細胞の動員を可能にするリガンドであるＣＣＬ２１を発現し、除外腫瘍の内皮細胞では有意に高い発現（ｐ＝０．０３）であり、浸潤腫瘍では一貫しているが有意ではない高い発現（ｐ＝０．０６、図１５Ｈ及び図１５Ｉ）であった。Ｃｏｍｅｒｆｏｒｄ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２４：２６９－２８３（２０１３）。本発明者らのデータセットでは、ほとんどのＣＣＲ７発現細胞はＢ－ＴＩＬであり、特に除外腫瘍及び浸潤腫瘍における内皮細胞を介した動員の可能性を示唆している。

７． 結論
これらの観察を要約すると、本発明者らは、腫瘍区画、免疫区画及び間質区画内、及びそれらの間の異なる組成及び潜在的なクロストークが異なる腫瘍免疫表現型を形成し得るモデルを仮定する（図１４Ｇ）。本発明者らのモデルでは、浸潤腫瘍及び除外腫瘍の両方を含む、ＴＭＥ中に免疫存在を有する腫瘍は、砂漠腫瘍とは異なる多くの共通の性質を共有する。例えば、浸潤腫瘍及び除外腫瘍の両方がＴ細胞及びＴＡＭ様マクロファージの濃縮を示したが、砂漠腫瘍はＴ細胞のほぼ完全な欠如を示すが、ＭＤＳＣ様細胞の濃縮を示す。浸潤腫瘍及び除外腫瘍におけるＴ細胞の存在は、ＣＸＣＲ３－ＣＸＣＬ９／１０／１１シグナル伝達を介したＴ細胞－ＴＡＭ様マクロファージクロストークによって部分的に促進され得る。さらに、ＣＸ３ＣＲ１リガンドを発現する内皮細胞及び周皮細胞はまた、浸潤腫瘍及び除外腫瘍におけるＣＸ３ＣＲ１ ＴＡＭ様マクロファージの動員に関与し得る。一方、浸潤腫瘍と除外腫瘍との間にも重要な違いがあった。浸潤腫瘍におけるＴ細胞浸潤のより大きな程度は、２つの因子によって影響され得る：１）浸潤腫瘍細胞は、最も高いＣＸＣＬ１６発現を示し、これは、ＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞の腫瘍上皮への動員を促進し得る；２）浸潤腫瘍はＩＬ１ ＣＡＦが豊富であり、ＣＸＣＬ１２／１４の発現はＣＸＣＲ４を介したＴ細胞動員を更に促進し得る。

８． 考察
がん免疫療法は特定の適応症では有効であるが、それでも全ての人に有効ではなく、応答の変動性は完全には理解されていない。Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６８：７０７－７２３（２０１７）。腫瘍の組成及びその微小環境のより良好な理解を発展させることにより、がん免疫療法の利益を改善してより多くの患者に拡大し、処置への個別化アプローチを可能にすべきである。Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５２：１７－３５（２０２０）。本研究では、本発明者らは、卵巣がんにおける腫瘍免疫連続体を含む３つの腫瘍免疫表現型の状況における腫瘍生態系全体の包括的なｓｃＲＮＡｓｅｑ解剖を報告する。本発明者らの研究は、腫瘍区画、免疫区画及び間質区画のそれぞれにおける細胞多様性の高解像度描写を提供するだけでなく、区画内及び区画間のクロストークがどのように腫瘍免疫表現型の生物学の形成に寄与し得、最終的に免疫療法に対する応答に影響を及ぼし得るかを強調する。

本発明者らはまず、腫瘍細胞自体の固有の特性が、免疫浸潤を促進又は妨害する環境に寄与するかどうかを調べた。Ｇａｌｏｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｂｒｕｎｉ，Ｄ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，１８：１９７－２１８（２０１９）。実際、腫瘍細胞区画のｓｃＲＮＡｓｅｑにより、浸潤／除外腫瘍において、高ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を表すインターフェロン応答／抗原提示経路の濃縮など、砂漠腫瘍と浸潤／除外腫瘍との間の転写プロファイルの有意差が明らかにされた。抗原提示のダウンレギュレーションは、本発明者らの以前のバルクＲＮＡシーケンシング、並びに砂漠腫瘍及び除外腫瘍におけるｉｎ ｓｉｔｕ ＭＨＣ－Ｉ ＩＨＣ研究で観察されている。Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１：５５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９４０８－２（２０２０）。本発明者らは、この研究の除外腫瘍において遺伝子レベルで抗原提示の強いダウンレギュレーションを観察しなかったが、ＭＨＣがタンパク質レベルルでダウンレギュレーションされ得ることを排除することはできない。浸潤／除外腫瘍を特徴付ける別の性質は、酸化的リン酸化経路のアップレギュレーションであった。腫瘍細胞の代謝は、例えば、Ｔ細胞機能に不可欠な代謝産物の競合、又は好ましくない微小環境を作り出し、Ｔ細胞の遊走を損なう乳酸塩のような廃棄産物の蓄積によって、Ｔ細胞の浸潤及び機能を直接損なう可能性があることが以前に報告されている。Ｈａａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，１３：ｅ１００２２０２，（２０１５）；Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｒａｔｈｍｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：４００－４０７（２０１８）。好気性解糖の代わりに酸化的リン酸化を使用すると、腫瘍細胞がピルビン酸を消費し、乳酸塩の蓄積が少なくなり（Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｒａｔｈｍｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：４００－４０７（２０１８））、これは効果的な免疫細胞浸潤のためのより好ましい環境を生成し得る。

腫瘍免疫連続体は、腫瘍床におけるＴ細胞の量及び位置に関して主に特徴付けられている。Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：１８６５－１８７４（２０１６）。免疫区画の本発明者らの単一細胞調査は、はるかに詳細を提供し、多様な表現型及び機能性Ｔ細胞及び骨髄細胞状態、並びに腫瘍免疫表現型におけるそれらの差次的濃縮を明らかにした。本発明者らが特定したＣＤ８＋ＧＺＭＢ及びＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞亜集団は、単一細胞研究において以前に記載されているが（Ｇｕｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４：９７８－９８５（２０１８）；Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７６：７７－７８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．１１．０４３（２０１９）；Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７９：２７４－２７８（２０２０）；Ｙｏｓｔ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５：１２５１－１２５９（２０１９）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５４：３２１－３３（２０１８）；Ｚｈａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７９：８２９－８４５（２０１９）、本発明者らの重要な知見の１つは、それらが異なる機能的状態を表すだけでなく、異なる腫瘍免疫表現型において差次的に濃縮されていることである。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団と腫瘍免疫表現型との関連の本発明者らの分析は、２つの洞察を提供した：１）機能不全／疲弊ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞は、除外腫瘍においてあまり活性化／疲弊しなかった；２）機能不全前／エフェクターメモリーＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞は、浸潤腫瘍と比較して除外腫瘍において濃縮されていた。両方の観察は、機能障害／活性化状態とＴ細胞の空間的分布、すなわち腫瘍上皮からのＴ細胞の浸潤又は除外との間の潜在的な関連によって説明され得る。除外腫瘍における免疫細胞除外は、腫瘍細胞による持続的な抗原刺激の欠如をもたらし、したがって、活性化／疲弊の少ないＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞及び機能不全前ＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞の濃縮に寄与する可能性がある。このモデルと一致して、本発明者らは、除外腫瘍における静止期ＣＤ４＋Ｔ細胞集団、並びに浸潤腫瘍における活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞の濃縮を見出した。まとめると、これらの観察結果は、予想されるように、除外腫瘍と比較して、浸潤腫瘍におけるより抗原刺激された免疫ランドスケープを指し示している。しかしながら、本発明者らの空間分析はまた、機能不全前のＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞集団が腫瘍上皮に浸潤する能力を有することを示唆する。したがって、空間的局在化、すなわち腫瘍上皮からのＣＤ８＋ＧＺＭＫ Ｔ細胞の除外は、それらの機能状態を完全に説明することができない。

多くのグループによって研究されている１つの重要な疑問は、免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）、特に抗ＰＤ－（Ｌ）１抗体が、機能不全の腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を再活性化することができるかどうかである。更なる調査が必要であるが、最近の研究は、後期機能不全Ｔ細胞ではなく機能不全前Ｔ細胞がＩＣＢによって標的化され、抗腫瘍応答を促進するモデルを支持している。特に、機能不全前Ｔ細胞のプールに属するＴｓｃｍ細胞は、ＩＣＢ処置時に拡大し（Ｓａｄｅ－Ｆｅｌｄｍａｎｍ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７５：９９８－１０１３ ｅ１０２０（２０１８）；Ｕｔｚｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４５：４１５－４２７（２０１６））、ＩＣＢ処置に対するより長い応答期間と関連することが見出されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：３２６－３３６（２０１９））。これらの細胞の役割についての本発明者らの理解は、免疫療法の状況において高まっているが、多くの疑問が、ＩＣＯＮ７において使用される化学療法などの他のがん療法におけるそれらの役割において残されたままである。したがって、卵巣がん患者のコホートにおけるＴｓｃｍ細胞の単なる存在は、それらの生存に影響を与えない可能性がある。さらに、本発明者らの以前の研究（Ｄｅｓｂｏｉｓ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１１：５５８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９４０８－２（２０２０））及び本研究では、腫瘍に浸潤するＣＤ８＋ＴＩＬの量はＰＦＳと弱くしか関連しないことが観察された。除外腫瘍を有する患者はより短いＰＦＳを示し、全てのＣＤ８＋細胞の中のＣＤ８＋ＧＺＭＫ細胞の量は化学療法下でより短いＰＦＳを予測した。本発明者らは、除外腫瘍が濃縮されたこれらの機能不全前の細胞を見出したことから、ＰＦＳとの観察された関連が密接に関連している可能性がある。機能不全前の細胞の存在はｃｈｅｍｏコホートにおいてＰＦＳと逆相関しているが、これらの観察は、活性化された間質細胞と機能不全前／Ｔｓｃｍ細胞の両方がＩＣＢの下で同時に標的化される場合、最適な臨床的有効性を排除しない。

この研究の別の重要な知見は、異なる腫瘍免疫表現型の状況における異種骨髄細胞集団の詳細な考察である。本発明者らは、４つの骨髄細胞状態を特定した：ＦＣＮ１単球、並びにＭＤＳＣ様ＦＣＮ１単球及びＭＡＲＣＯ未成熟マクロファージからより成熟したＴＡＭ様ＣＤ１６９及びＣＸ３ ＣＲ１マクロファージへの成熟のスペクトルを有するＭＡＲＣＯ、ＣＤ１６９及びＣＸ３ＣＲ１マクロファージ。砂漠腫瘍はＭＤＳＣ様骨髄細胞（ＦＣＮ１及びＭＡＲＣＯ）が濃縮されていたが、浸潤／除外腫瘍はＴＡＭ様骨髄細胞が濃縮されていた。骨髄細胞の成熟レベルと異なる腫瘍免疫表現型との間の観察された関連性の１つの可能な説明は、ＴＭＥにおけるインターフェロンレベルであり得る。インターフェロンシグナル伝達は、マクロファージの活性化、それらの抗原提示活性及びそれらの炎症促進性機能において主要な役割を果たすことが示されている。Ｈｕ，Ｘ．ａｎｄ Ｉｖａｓｈｋｉｖ，Ｌ．Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３１：５３９－５５０（２００９）。ＩＦＮγの主な産生細胞は、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む免疫細胞である。Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９６：４１－１０１（２００７）。したがって、除外腫瘍及び浸潤腫瘍において、浸潤性免疫細胞は、インターフェロン産生を介して骨髄細胞の成熟を促進することができる。この仮説を支持して、本発明者らは、インターフェロン応答経路が、砂漠腫瘍と比較して浸潤腫瘍及び除外腫瘍の腫瘍区画において濃縮されていることを見出した。

この研究における知見は、がん免疫療法のための新しい治療戦略を知らせ得ることも注目に値する。例えば、本発明者らは、ＭＤＳＣ様細胞対ＴＡＭ様細胞で差次的に発現される骨髄細胞の２つのトリガー受容体、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２を見出した。ヒト腫瘍に浸潤するマクロファージにおける高いＴＲＥＭ１発現は、攻撃的な腫瘍挙動及び患者の生存不良に関連することが示されている。Ｈｏ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１７７：７６３－７７０（２００８）。一方、ＴＲＥＭ２は、肝細胞癌（Ｔａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，８：９（２０１９））及び結腸直腸がん（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ），１１（２０１９）において腫瘍抑制因子として作用することが示されている。ＴＲＥＭ分子の標的化は、最近、炎症性障害及びがんの処置のための新規な処置の機会として注目を集めている（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。異なる腫瘍免疫表現型に関連する骨髄細胞の異なるサブセットへのＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の特異的連結に関する本発明者らの知見は、それらの潜在的な役割への更なる洞察を提供し、ＴＲＥＭ分子を標的化するための治療戦略を知らせ得る。

最後に、本発明者らは、腫瘍区画、間質区画及び免疫区画の細胞成分がケモカイン受容体シグナル伝達を介してどのように相互作用し、それによって腫瘍免疫連続体を形成するのに役立ち得るかを調べた。本発明者らの研究は、腫瘍細胞がＣＸＣＲ６－ＣＸＣＬ１６軸を介してＴ細胞動員を潜在的に媒介し得る機構を明らかにした。本発明者らは、以前に記載されたように（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５２：１３８１－１３９１（２００５）、ＣＸＣＬ１６が骨髄細胞によって発現されることを見出したが、より重要なことには、本発明者らの分析は、ＣＸＣＬ１６が腫瘍細胞、特に浸潤及び除外卵巣腫瘍細胞でも発現されることを明らかにした。ＣＸＣＬ１６は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ６を介してシグナル伝達することが知られており（Ｗｉｌｂａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、本発明者らは、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３ Ｔｒｅｇ細胞及び機能不全ＣＤ８＋ＧＺＭＢ Ｔ細胞上のＣＸＣＲ６の最も高い発現を見出した。これらの所見は、浸潤腫瘍及び除外腫瘍における腫瘍細胞によるこれらのＴ細胞サブセットの潜在的な動員を示唆する。これらの知見を裏付けて、電離放射線がＣＸＣＬ１６の分泌を誘導し得ることが以前に示されており、そうでなければ、免疫原性が低い乳がんマウスモデルにおいてＣＸＣＲ６＋ＣＤ８＋活性化Ｔ細胞を腫瘍に動員するであろう。Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：３０９９－３１０７（２００８）。したがって、ＣＸＣＬ１６－ＣＸＣＲ６軸は、卵巣がんにおける腫瘍免疫連続体に寄与する重要な因子を表し得る。それにもかかわらず、ＣＸＣＬ１６走化性勾配の効果は、除外腫瘍と浸潤腫瘍との間で異なる可能性があり、それにより、Ｔ細胞は、ケモカイン勾配の存在にもかかわらず、除外腫瘍において腫瘍上皮に到達することができない。実際、本発明者らは、除外腫瘍内の筋線維芽細胞の大部分が筋線維芽細胞特異的マーカーＡＣＴＡ２（αＳＭＡ）だけでなく（Ｓａｈａｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０：１７４－１８６（２０２０））、コラーゲン遺伝子（ｆＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ１Ａ１）及び反応性間質に寄与することが以前に示された遺伝子（ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１１、ＦＮ１）も発現することを見出した（Ｐｌａｎｃｈｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１８６４０（２０１１）；Ｒｙｎｅｒ，Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２１：２９４１－２９５１（２０１５））。これらの所見は、特異的ＣＡＦが、高密度の細胞外マトリックスを産生することによって腫瘍上皮へのＴ細胞のアクセスを遮断する物理的障壁を作り出すという仮説を更に支持する。Ｓａｌｍｏｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２２：８９９－９１０（２０１２）；Ｚｅｌｔｚ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ，６２：１６６－１８１（２０２０）。

本発明者らの研究には、注意すべきいくつかの制限がある。生細胞をそれらの起源の区画（すなわち、免疫区画、間質区画又は腫瘍区画）に基づいて選別することによって、本発明者らは、少量の細胞集団を濃縮し、各区画の高解像度の分析を達成することができた。しかしながら、そのようなアプローチは、微小環境の組成を全体として記述することを可能にせず、それぞれの個々の区画に対する特定された細胞状態の割合を報告することしかできない。さらに、卵巣腫瘍及びそれらの免疫微小環境は不均一であることが報告されている。Ｊｉｍｅｎｅｚ－Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７０：９２７－９３８ ｅ９２０（２０１７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）：１１（２０１９）。本発明者らの研究では、同じ原発性腫瘍からの異なる腫瘍切片を利用し、直交法（トランスクリプトーム分類指標に基づく予測及びＣＤ８ ＩＨＣカテゴリー分類）を用いて各腫瘍の腫瘍免疫表現型を割り当てたが、そのような分類は腫瘍全体を表していない可能性がある。同じ腫瘍の複数のセグメント、並びに同じ患者からの異なる部位の転移性腫瘍の特徴付けを含む将来の研究は、卵巣がんの不均一な腫瘍微小環境への更なる洞察を提供し得る。最後に、異なる区画にわたる本発明者らのケモカイン受容体－リガンド分析は、トランスクリプトーム分析のみから得られ、将来の研究における高次元マルチプレックスｉｎ ｓｉｔｕ分析及び機能アッセイによるこれらの潜在的相互作用の更なる検証が必要とされる。

結論として、本発明者らの研究は、ＴＭＥにおける多様な細胞表現型及び機能表現型、並びにそれらの動的相互作用の詳細な分析を提供し、腫瘍免疫連続体のより豊富な特徴付けを可能にする。本発明者らの研究はまた、ＴＭＥ及び免疫表現型を形成するのに役立ち得る生物学への更なる洞察を提供する。最後に、本発明者らの知見はまた、治療標的の特定を可能にし、免疫抑制を克服し、がん免疫療法に対する応答を増加又は拡大するための新規な治療戦略を知らせ得る。

上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (28)

1. 卵巣がんを有するヒト患者のための処置プロトコルを設計する方法であって、
   ａ．前記患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定すること、並びに
   ｂ．前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較することであって、
   前記参照試料と比較したＧＺＭＫ発現レベルの上昇が生存の低下に関連し、前記参照試料と比較したＴＲＥＭ１レベルの上昇がＭＤＳＣ様骨髄細胞の存在に関連し、前記参照試料と比較したＴＲＥＭ２レベルの上昇がＴＡＭ様マクロファージの存在に関連する、前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較すること、
   を含む、卵巣がんを有するヒト患者のための処置プロトコルを設計する方法。
2. ヒト患者における卵巣がんの処置方法であって、
   ａ．前記患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定すること、
   ｂ．前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較することであって、ＧＺＭＫ発現レベルの上昇が生存の低下に関連し、ＴＲＥＭ１レベルの上昇がＭＤＳＣ様骨髄細胞の存在と関連し、ＴＲＥＭ２レベルの上昇がＴＡＭ様マクロファージの存在と関連する、前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較すること、並びに
   ｃ．前記患者が、
   ｉ．前記参照試料と比較したＴＲＥＭ１の発現増加を有する場合、ＭＤＳＣ様骨髄細胞を標的とする治療法を前記患者に投与すること、
   ｉｉ．前記参照試料と比較したＴＲＥＭ２の発現増加を有する場合、ＴＡＭ様マクロファージを標的とする治療法を前記患者に投与すること、及び／又は
   ｉｉｉ．前記参照試料と比較したＧＺＭＫの発現減少を有する場合、前記患者に化学療法を投与すること、
   を含む、ヒト患者における卵巣がんの処置方法。
3. 前記腫瘍においてＧＺＭＫ発現の増加が示された後、化学療法を停止する、請求項１又は２に記載の処置方法。
4. 前記腫瘍においてＧＺＭＫ発現の増加が示された後、緩和ケアが前記患者に施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の処置方法。
5. ヒト患者における卵巣がんを、砂漠型、除外型、又は浸潤型の腫瘍として特徴付ける方法であって、
   ａ．前記患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＣＤ８Ａ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定すること、並びに
   ｂ．前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較することであって、前記参照試料と比較したＧＺＭＢのより高い発現が浸潤型の腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＧＺＭＫのより高い発現が除外腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞のより高い発現が除外腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＴＲＥＭ１のより高い発現が砂漠腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＴＲＥＭ２のより高い発現が除外腫瘍及び浸潤腫瘍に関連する、前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較すること、
   を含む、ヒト患者における卵巣がんを、砂漠型、除外型又は浸潤型の腫瘍として特徴付ける方法。
6. 卵巣がんを有するヒト患者を処置する方法であって、
   ａ．前記患者からの腫瘍試料中のＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＣＤ８Ａ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの発現レベルを決定することによって、卵巣がんを砂漠、除外又は浸潤として特徴付けること、
   ｂ．前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較することであって、前記参照試料と比較したＧＺＭＢのより高い発現が浸潤型の腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＧＺＭＫのより高い発現が除外腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞のより高い発現が除外腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＴＲＥＭ１のより高い発現が砂漠腫瘍に関連し、前記参照試料と比較したＴＲＥＭ２のより高い発現が除外腫瘍及び浸潤腫瘍に関連する、前記発現レベルを参照試料中の前記発現レベルと比較すること、並びに
   ｃ．前記患者を、
   ｉ．ＴＲＥＭ１の前記より高い発現が砂漠腫瘍を示唆する場合、化学療法又は自己／同種異系エフェクター細胞で処置すること、
   ｉｉ．ＧＺＭＢ及び／又はＴＲＥＭ２の前記より高い発現が浸潤腫瘍を示唆する場合、免疫療法（チェックポイント療法を含む）で処置すること、
   ｉｉｉ．ＧＺＭＫの前記より高い発現が除外腫瘍を示唆する場合、緩和ケアで処置すること、
   ｉｖ．ＣＤ８Ａ／ＧＺＭＫ二重陽性細胞の前記より高い発現が除外腫瘍を示唆する場合、緩和ケアで処置すること、及び／又は
   ｖ．免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞輸送調節因子、エピジェネティック調節因子、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）リモデリング分子、及び／又は放射線療法で処置すること、
   を含む、卵巣がんを有するヒト患者を処置する方法。
7. 前記参照試料が、複数の患者及び／又は対象にわたってまとめられたデータである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記参照試料が、健康な対象である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記参照試料が、治療に応答した患者である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記参照試料が、既知の砂漠腫瘍を有する患者である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記参照試料が、既知の除外腫瘍を有する患者である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記参照試料が、既知の浸潤腫瘍を有する患者である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記方法が、前記患者からの腫瘍細胞中のＧＭＺＢ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の全てを評価することを含む、請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記方法が、前記患者からの腫瘍細胞中のＧＭＺＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の全てを評価することを含む、請求項１～４又は７～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記方法が、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１及びＴＲＥＭ２の少なくとも１つの前記発現レベルを決定する前に、前記患者から腫瘍試料を得ることを更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の前記発現レベルが、免疫組織化学を使用して決定される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の前記発現レベルが、ｍＲＮＡ転写レベルを測定することによって決定される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記方法が、前記腫瘍試料中の少なくとも１つの参照遺伝子の発現レベルを決定することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記方法が、前記腫瘍試料中の前記少なくとも１つの参照遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベルに対して前記ｍＲＮＡ転写物のレベルを正規化して、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の前記ｍＲＮＡ転写物の正規化レベルを提供することを更に含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 前記ｍＲＮＡ転写物の前記レベルがｓｃＲＮＡｓｅｑによって決定される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＴＲＥＭ１、及び／又はＴＲＥＭ２の少なくとも１つの前記発現レベルを評価する前に、前記腫瘍試料を腫瘍細胞、間質細胞、及び免疫細胞に分離する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記細胞分離がＦＡＣＳによって行われる、請求項２１に記載の方法。
23. ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＧＺＭＫのｍＲＮＡ転写物の正規化レベルの上昇がある、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ＧＺＭＫ陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、ＧＺＭＫ陰性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の数よりも多い、請求項２３に記載の方法。
25. マクロファージにおいて、ＴＲＥＭ２のｍＲＮＡ転写物の前記正規化レベルの上昇がある、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記化学療法が、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）（登録商標））、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ－１６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）））、ドキソルビシン（リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））など）、メルファラン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、トポテカン、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ニクロサミド、メトホルミン、ＢＡＹ ８７－２２４３、デシタビン、ガデシタビン、アザシチジン、アバゴボマブ、オレゴボマブ、ニボルマブを含むＮｅｏＶａｘ、アンロチニブ、ロスバスタチンを含むエノキサパリン、ニラパリブ、キアウラニブ、ペグ化リポソームドキソルビシンを含むトラベクテジン、ＡＣＢ－Ｓ６－５００、ＳＧＩ－１１０、レトロゾール、パゾパニブ、パルボシクリブ、アパチニブ、マシチニブ、カバジタキセル、ＩＭＡＢ０２７、フルダラビン、ＡＢＴ－８８８、フォスタマチニブ、オラパリブ、テモゾロミド、タラゾパリブ、Ｐ５３－ＳＬＰ、ＯＭＰ－５４Ｆ２８、ヒドララジン及びバルプロ酸マグネシウム、フルダラビン、ラパチニブ、ベンダムスチンＨＣＬ、ソラフェニブ、カンレリズマブ、トレメリルマブ、トコトリエノール、及び／又はエキセメスタンを含む、請求項２～４又は６～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ＭＤＳＣ骨髄細胞を標的とする治療法が、
    ａ．シスプラチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン及び／又はパクリタキセル；
    ｂ．肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）ベータアゴニスト；
    ｃ．チェックポイント阻害剤、例えば、
    ｉ．抗ＰＤ－１療法（例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、トリパリマブ、ＣＴ－０１１、モノクローナル抗体ＨＸ００８８、及び抗体ＡＫ１０５を含む抗ＰＤ－１抗体）；
    ｉｉ．抗ＰＤ－Ｌ１療法（例えば、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、トレメリムマブ、ｍＡｂ ＺＫＡＢ００１、トレメリムマブ、及びラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体）；並びに／又は
    ｄ．抗ＴＧＦβ療法（例えば、ペンブロリズマブ及びフレソリムマブを含む抗ＴＧＦβ抗体）、
    を含む、請求項２～４、７～１２、又は１４～２５のいずれか一項に記載の方法。
28. がん免疫療法剤が、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６抗ＰＤ－Ｌ１；Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、モトリモド、腫瘍溶解性ウイルス、ＮＹ－ＥＳＯ－１がんワクチン、抗ＸＢＰ１療法、抗アンジオポエチン療法、抗ＤＬＬ／Ｎｏｔｃｈ療法、抗ＨＥＲ２療法、抗メソテリン療法、抗ＲＡＮＫＬ療法、抗ＴＲＯＰ２療法、及び／又はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ｒ療法を含む、請求項６～１３又は１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
    

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