KR20230156912A - 오프-칩 압력 제어 원심 미세유체 분별 - Google Patents

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Abstract

원심 미세유체 분별은 원심분리 동안 원심 미세유체 칩의 포트에 적용되는 오프-칩 가압 유체 제어에 의해 용이해진다. 오프-칩 제어는 더욱 정밀한 추출을 위해서 칩의 칼럼에 있는 분별된 샘플의 원하는 부분을 추출 채널에 정렬하는데 활용된다. 더 높은 밀도 또는 더 낮은 밀도 매체는 분별된 샘플을 각각 축-근위 또는 축-원위 방향으로 변위시키는데 사용될 수 있다. 이미지 분석을 통해 칩의 픽셀 기반 스트로브 이미징(strobed imaging)을 자동화하면 분별 분석에서 사람의 개입을 감소시킬 수 있다.

Description

오프-칩 압력 제어 원심 미세유체 분별
본 발명은 일반적으로, 오프-칩(off-chip) 압력 제어를 이용한 원심 미세유체 분별(centrifugal microfluidic fractionation)에 관한 것이며, 특히 다-성분 샘플 유체의 성분에 대한 밀도 기반 추출(density-based extraction)을 위한 방법, 칩, 시스템 및 키트에 관한 것이다.
유체 샘플 분석은 상업적으로 중요한 활동이다. 특히, 천연 샘플은 빈번하게 매우 복잡하고 안정적인 혼합물이다. 많은 생체유체(예를 들어, 혈액, 우유, 소변, 타액, 눈물, 땀, 난자, 정자)와 탄화수소, 폐수, 오수, 유출수, 식품과 화학제품 및 부산물과 같은 자연적으로 발견되는 샘플은 매우 넓은 범위의 용해되거나 부유되거나 포함된 입자, 거대분자, 몸체, 세포, 유기체 및 유사한 덩어리를 운반하는 빈번하게는 수성 액체이다. 또한, 고체, 액체 또는 기체 물질을 연구하기 위해서 매우 다양한 오일- 또는 물-기반 샘플이 생성되며, 샘플은 테스트를 위한 이송 및 제어를 용이하게 하는 유체 특성을 가지도록 생성된다.
미세유체공학(Microfluidics)은 작은 액체 부피의 다중 분석에 큰 장점을 제공하는 새로운 분야이다. 저렴한 플라스틱 칩에 소량의 유체를 이동시킴으로써, 다양한 테스트 및 분석 절차가 생성될 수 있다. 원심 분리에 의해서, 원심분리기 아래 칩의 각각의 포트에 압력 제어 공급을 제공하면서 다양한 자동화된 미세유체 절차가 제공될 수 있다. 예를 들어, 출원인의 WO 2015/132743 호에 따르면, 다음은 원심분리 동안 원심 미세유체 칩(즉, 오프-칩); 공압 슬립 링(회전식 커플링); 원심분리기 장착 가압 유체 공급장치; 원심분리기 장착 펌프; 및 주변 환경에 대한 폐쇄된 미세유체 경로를 개방하기 위한 원심분리기 장착 전자 밸브의 포트에서 압력을 제어하는 효율적인 방법이다. 본 명세서에서 "포트(port)"는 통기구, 로딩 포트 및 제어된 압력 공급 포트를 포함한 다양한 목적으로 사용될 수 있는 미세유체 칩의 유체 인터페이스로 이해된다. 단지 통기구로서 사용되는 포트는 다른 포트보다 더 작을 수 있다. 수동 로딩에 사용되는 통기구는 다른 것보다 클 수 있으며, 로딩 포트 또는 제어된 압력 공급 포트는 루어 잠금장치(luer lock) 또는 기타 표준 커플러와 같이 밀봉된 연결을 확립하는데 도움이 되는 특징을 가질 수 있다.
유체 샘플의 정제는 다양한 반응 기반, 박막 및 필터 기반, 및 분리 기술로 수행될 수 있으며, 연구의 대부분이 이에 집중하고 있지만, 분별(본 명세서에서는 결정화, 증류, 가용화(solubilization) 또는 기타 분별 기술과 달리, 질량-밀도 분별(mass-density fractionation)만 언급함)은 특히, 상 변화를 요구하는 기술과 비교할 때 낮은 에너지 요구를 가지며; 샘플은 임의의 극심한 온도 변화로 인해서 변성되거나 변경되지 않으며; 통상적으로 샘플의 화학적 또는 생물학적 구성에 영향을 미치지 않으며; 공급, 화학적 순도 또는 반응 화합물의 상태에 의존하지 않으며; 온도, 압력 또는 환경 조건에 거의 민감하지 않으며; 교차 오염 위험이 매우 낮은 샘플에 노출되며; 매우 간단하고 물리적으로 신뢰할 수 있는 차별화 메커니즘을 제공한다는 점에서 다른 후보에 비해 많은 장점을 가진다. 실제 적용에 대한 유일한 제한은 샘플의 원하는 부분이 충분히 좁게 제한되고 샘플의 다른 성분과 구별되는 (질량)밀도를 갖는다는 점이다.
분별은 정제, 분리 또는 정량화에 더 큰 가치가 있으며, 원하는 성분의 질량 밀도의 합리적인 가변성을 가정할 때 샘플에 더 많은 성분이 포함되거나 포함될 수 있다. 복잡한 혼합물로부터 성분을 한 단계 격리하는 것은 해당 성분이 고유한 밀도 범위를 가지며 혼합물의 다른 어떤 것도 이러한 범위 내의 밀도를 갖지 않는 한 가능하지만, 이는 대부분의 자연 샘플이나 복잡한 샘플에서 항상 가능한 것이 아니다. 범위가 좁을수록, 더 정확한 추출 지점이 정의되어야 한다. 추출 지점을 크게 용이하게 하기 위해서는 조정된 밀도 매체가 추가될 수 있지만, 이는 원하는 성분이 특성화될 때만 가능하다. 또한, 특정 색상, 투명도 또는 기타 식별 가능한 특징의 밀도 매체를 사용하면 원심분리기 바이알(vial)에서 샘플을 구분할 수 있지만, 자동화에는 상당한 도움이 되지 않으며 원심 미세유체의 분별 시 입증된 사용이 제한된다.
일회용 용례에 대해 미세유체 칩의 비용을 충분히 낮게 유지하여 세정 및 오염 문제를 피하려면, 다물질 삽입물(insert) 및 전자장치(특히, 샘플 유체에 노출되는 것)를 피하는 것이 유리하며, 이는 일반적으로 고정된 미세유체 채널과 챔버를 남기게 된다. 칩 포트에서 압력 공급을 제어하면 칩 비용이나 복잡성을 증가시킴이 없이 다양한 공정을 가능하게 하지만 독립적으로 (압력)제어되는 포트의 수에 따라서 시스템 비용이 증가한다.
저장소의 고정된 부피와 분별 칼럼의 고정된 추출 지점은 많은 특히, 천연 액체 샘플 내 성분 부피의 가변성 측면에서 특히 문제가 된다. 하나의 샘플로부터 다른 샘플로의 본질적인 가변성은 원심 미세유체의 자동화된 분별에 대한 과제를 제기한다. (예를 들어, 출원인이 발행한 특허 패밀리(patent family): WO 2013003935 호를 사용한)정확한 계량이 당업계에 공지되어 있고, 이는 좁은 한도 내에서 분별 챔버 내의 초기 부피를 보장할 수 있지만, 전혈(whole blood)의 혈장의 부피와 같은 함량 분획(content fraction)의 본질적인 가변성을 설명할 수 없다. 이는 원하는 성분의 덜 선택적인 추출(원하지 않는 성분이 더 많음) 또는 원하는 성분의 덜 완전한 추출을 유도한다.
Kellogg 등의 미국 특허 제 6,719,682 호는 도 9a 내지 도 9h와 관련하여 분별용 원심분리 칩을 교시한다. 이는 특히, 챔버(401)에 샘플을 부정확하게 로딩할 수 있는 오버 플로우 챔버(404)가 있는 U자형 채널을 사용한다. 도입된 샘플이 부피를 초과하는 한(오버 플로우 부피를 초과하지 않는 한), 이러한 칩 레이아웃은 고정된 부피가 분리 칼럼(403)에 있도록 보장한다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 이러한 시스템은 샘플 구성의 다양성을 설명하지 않는다. 추출 모세관(406)이 하나의 혈액 샘플에 대해 잘 정렬될 수 있지만, 다른 샘플은 더 많은 적혈구와 더 적은 혈장을 가져서, 추출 모세관(406)의 오정렬을 초래할 것이다. 많은 유체 샘플의 경우에, 일반적으로 원심분리 이후까지 각각의 성분의 부피를 알 수 있는 방법이 없다. 따라서 테스트 없이, 통계에 기초하여 모세관(406)의 위치만을 선택할 수 있고, 불순물이나 불완전한 추출 측면에서 오류를 받아들일 수 있다.
이론적으로, 혈액 샘플이 있는 칼럼(403)에 밀도 매체의 계량된 부피를 도입할 수 있고, 이는 혈액 샘플의 별개의 상들 사이의 공간적 분리를 증가시키는 역할을 할 것이지만, 원하는 성분이 수집되지 않는 경우에 혈액의 다른 성분과 달리 추출된 액체에 포함될 밀도 매체가 있을 것이라는 점을 보장하기 때문에, 여전히 문제를 해결할 수 없다. 이는 허용 가능한 절충안처럼 보일 수 있지만, 칩에 대해 규정된 것과 다른 부피 구성을 가진 샘플은 결국 일반적으로 쓸모가 없는 매체만을 추출할 것이다. 예를 들어, "연막(buffy coat)"은 전형적으로 매우 작은 부피 비율의 혈액이므로 놓치기 쉽다.
예를 들어, Scott T. Moen 등의 A Centrifugal Microfluidic Platform that Separates Whole Blood Samples into Multiple Removable Fractions Due to Several Discrete but Continuous Density Gradient Sections (PLoS ONE 11(4): e0153137. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153137)라는 제목의 문서에서 분리 칼럼의 각각의 "레인(lane)"에서 상이한 밀도 매체의 사용을 교시한다. 출원인은 "밀도 구배 원심분리 공정은 밀도 층을 로딩하고 원하는 혈액 분획을 정확하게 추출하기 위해서 숙련된 인력과 상당한 양의 손재주를 요구한다. 또한 추출을 위해 별개의 백혈구 띠를 관찰하려면 상대적으로 많은 양의 혈액(전형적으로 1 내지 10 mL[8][9])이 필요하다. 그러나 대부분의 임상 용례에서는 더 적은 양의 혈액을 사용하여 분석을 수행하는 옵션을 갖는 것이 유리할 것이다"라고 언급한 서론에 주목한다.
추출의 정확성을 다루지는 않지만 개선할 수 있는 다른 기술은 칼럼을 채널에 의해 분리된 축 방향 근위 챔버 및 원위 챔버로 분할하거나, 아니면 추출 출구에 인접한 분리 칼럼의 허리부를 핀칭(pinching)하는 것이다. 이는 밀도 매체를 사용하는 것과 다소 유사한 것처럼 사람이 조작할 때, 추출의 정확성을 높일 수 있지만, 여전히 추출 출구가 원하는 성분과 잘 정렬되는 것을 보장하지 않는다.
Banks의 WO 2014/111721 호는 분리 채널(231)에 의해 상호 연결된 분리 챔버(230, 235)를 보여주며, 이는 제 1 분리 챔버와 제 2 분리 챔버 사이에 "핀치 포인트(pinch point)"를 도입한다고 언급하고 있다. Banks는 좁은 부분을 가진 단일 챔버도 작동할 것이라고 지적한다. Banks는 핀치 포인트의 이유가 "분리 후 분리 챔버 내에서 유체의 재혼합"을 감소시키기 위한 것이라고 언급한다. 출원인은 분리 칼럼을 좁힘으로써 분리된 상들 사이의 계면 면적이 감소하므로 추출 채널의 위치가 분별된 샘플 부피와 더욱 정밀하게 정렬될 수 있다고 생각한다. 원하는 성분을 모두 또는 독점적으로 추출하기 위한 정확한 정렬을 사용하면, 실질적으로 더 적은 다른 성분/밀도 매체 또는 실질적으로 더 많은 원하는 성분이 추출된다.
출원인은 전혈의 분획이 암 진단[1], 자가면역 질환[2] 및 생물의학 연구와 같은 많은 임상 용례에서 중요한 과정이라고 지적한다. [3] 일반적으로, 전혈 분획은 실험실 설정에서, 밀도 구배 매체에 혈액 샘플을 조심스럽게 계층화(layering)한 후 원심분리 함으로써 수행된다. [4] 이러한 방법은 적혈구 용해[5] 및 자기 분리와 같은 다른 샘플 준비 기술과 함께 실험실에서 혈액 취급에 가장 자주 사용되는 접근방식이다. [6] 그러나 시료 취급 과정은 복잡한 절차를 포함하며 다중 피펫팅 단계(pipetting step)를 통해 수동으로 종종 수행되며; 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 위해서 경험 있고 훈련된 작업자를 요구하는 시간 소모적이고 노동 집약적인 작업이다. 따라서 자동화된 분별 장치 및 절차가 매우 바람직하다.
따라서, 개선된 원심 미세유체 분별을 위한 미세유체 칩, 미세유체 시스템 및 방법이 필요하다. 개선에는 개선된 자동화, 분획 추출 시간, 또는 정확성(추출에 원하지 않는 성분 포함의 감소 및/또는 원하는 성분 추출의 증가)이 포함될 수 있다.
출원인은 신규한 미세유체 칩, 키트, 시스템 및 방법을 포함한, 분별을 위한 저-비용, 고도로 다재다능하고 견고한 미세유체 기술을 실현했다. 이 기술은 칩에 대한 위상(2D 렌더링에서 선으로 나타나는 등밀도 표면(isopycnic surface)) 사이의 계면 수준(원심 분리기 축으로부터의 반경)을 변경하기 위해서 칩 포트에 공급되는 압력을 제어하는 것을 포함하거나 허용한다. 구부피으로, 이는 등밀도 표면을 변위시키기 위해서 제어된 속도와 부피로 분별 칼럼에 매체를 전달함으로써 달성된다. 등밀도 표면은 원심분리를 중단함이 없고 재혼합이나 분별을 방해함이 없이 천천히 대체될 수 있다. 분별 전에 하나 이상의 구배 매체를 사용하면 관심 있는 등밀도 표면을 구분하는데 도움이 될 수 있으며, 동일한 매체가 분별된 샘플을 대체하는데 사용될 수 있다.
따라서, 원심 미세유체 분별 방법이 제공되며, 이 방법은 원심 미세유체 칩의 분별 칼럼에 유체 샘플을 제공하는 단계; 샘플을 분별하기 위해 원심분리하는 단계; 그리고 원심 분리 동안: 원하는 분획의 분별된 샘플이 칼럼과 만나는 추출 채널과 정렬될 때까지, 특성화된 밀도의 제 1 매질의 부피를 칼럼에 분배하기 위해서 칩의 제 1 포트에 연결된 제 1 오프-칩 압력 공급 라인을 작동시키는 단계; 및 추출 채널의 축 근위 방향으로 위치된 분별된 샘플의 일부를 추출 채널 내로 흡인하도록 칩의 제 2 포트에 커플링된 제 2 오프-칩 압력 공급 라인을 작동시키는 단계를 포함한다.
제 1 오프-칩 압력 공급 라인은 바람직하게, 추출 채널의 축 근위 방향으로 위치된 통기 이송 챔버로 매체 챔버를 가압한다. 이송 챔버와 매체 챔버 사이의 유체 역학 저항은 제 1 매체가 이산화된 액적 스트림(discretized droplet stream)으로서 이송 챔버로 전달되거나; 이송 챔버와 칼럼 사이의 유체 역학 저항이 제 2 가압 유체 공급장치의 압력에 의해 극복될 때만 계량된 부피의 전달을 제한하는 것을 보장하기 위해서 제공될 수 있다.
또한, 원심 미세유체 분별 방법이 제공되며, 이 방법은 칩과 제어기의 적어도 일부를 원심분리기의 축에서 적어도 5 Hz의 속도로 회전시키기 위해서, 제 1 및 제 2 가압 유체 공급을 위한 제어기 및 원심 미세유체 칩을 갖춘 원심 미세유체 칩 제어기를 원심분리기에 장착하는 단계로서, 칩은 원심분리기 축에 대해 근위 지점과 원위 지점 사이에 연장하는, 부피를 둘러싸는 통기되는 분별 칼럼; 분별된 유체의 성분이 제 1 가압 유체 공급장치의 작동에 의해 칼럼으로부터 제거될 수 있는, 근위 지점과 원위 지점 사이의 칼럼과 만나는 추출 채널; 입구와 출구를 가지는 통기되는 이송 챔버; 특성화된 밀도의 제 1 매체를 함유하는 제 2 가압 유체 공급장치에 작동 가능하게 커플링된 매체 챔버; 매체 챔버를 입구와 출구를 칼럼과 각각 커플링하는 제 1 및 제 2 도관; 및 제 2 가압 유체 공급장치에서 압력을 가함이 없이 이들 2 개의 챔버 사이의 흐름을 제한하는 칼럼과 매체 챔버 사이의 유체역학적 저항 요소를 포함하는, 단계; 칼럼에 유체 샘플을 제공하는 단계; 샘플을 상이한 질량 밀도를 가지는 복수의 성분으로 분별하도록 칼럼에서 유체 샘플을 원심분리하는 단계; 원심분리를 중단함이 없이, 원하는 분획의 분별된 샘플이 추출 채널과 정렬될 때까지 칼럼에서 분별된 샘플을 변위시키기 위해서 조절된 부피의 매체를 이송 챔버를 통해 칼럼 내로 분배하는 단계; 및 추출 채널을 통해 분별된 샘플의 일부를 선택적으로 추출하기 위해서 제 1 가압 유체 공급장치를 작동시키는 단계를 포함한다.
어느 하나의 방법에서, 매체는 샘플보다 더 높은 질량 밀도를 가질 수 있으며, 그런 경우에 바람직하게, 추출 채널의 칼럼 축 원위 방향으로 주입되거나; 매체는 등밀도 표면보다 더 낮은 질량 밀도를 가질 수 있으며 바람직하게, 추출 채널의 칼럼 축 근위 방향으로 주입된다. 칼럼은 축 원위 지점이 U 바닥인 U자형 챔버를 포함할 수 있어서, U자형 챔버의 하나의 분기(branch)에 추가된 매체가 분별된 샘플을 다른 분기로 이동시킨다.
U자형이든 아니든 칼럼은 추출 채널로부터 멀어지는 것보다 칼럼이 추출 채널에서 더 좁아진다는 점에서 허리 모양(waisted)일 수 있다. 칩은 적어도 2 개의 매체 챔버, 또는 제 1 매체뿐만 아니라 제 1 매체와 상이한 밀도를 가지는 하나 이상의 제 2 밀도 매체를 생성하기 위한 혼합 챔버를 더 포함할 수 있으며, 상기 방법은 원심분리 전에 일정한 양의 제 2 매체를 칼럼에 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다.
어느 하나의 방법은 원심분리 동안 칩을 이미징하기 위한 카메라와 조명 장비 및 이미지 데이터를 분석하여 칼럼의 추출 채널에 대한 등밀도 표면을 결정하고 이미지 데이터 분석에 응답하여 제 1 및 제 2 가압 압력 공급장치에서 압력을 제어하는 소프트웨어를 더 포함할 수 있다.
유체 샘플을 제공하는 것은 칩 제어기에 장착되는 바이알로부터 샘플을 로딩하는 것을 포함할 수 있거나; 분별된 샘플의 일부를 추출하는 것은 칩 제어기에 장착되는 바이알로 회수된 유체를 배출하는 것을 포함한다.
또한, 이에 따라서 원심분리기의 축을 중심으로 회전하기 위해서 원심분리기에 장착하기 위한 원심 미세유체 칩이 제공된다. 미세유체 네트워크를 가지는 칩은: 축에 대해 근위 지점과 원위 지점 사이에서 연장하는 분별 칼럼으로서, 근위 지점은 제 1 포트에 있거나 제 1 포트에 커플링되는, 분별 칼럼; 제 1 포트에 대한 칩의 제 2 포트에서의 압력에 따라서 원심분리 동안 유체가 칼럼으로부터 제거되거나 차단되는, 근위 지점과 원위 지점 사이의 칼럼과 만나는 추출 채널; 입구, 및 칼럼에 커플링된 출구, 그리고 그에 커플링되는 제 3 포트를 가지는 이송 챔버; 이송 챔버의 압력에 대한 제 4 포트에서의 압력 변화가 원심 분리 동안 매체 챔버로부터 이송 챔버로 유체를 흡인하는데 사용될 수 있도록, 칩의 제 4 포트 및 입구에 작동 가능하게 커플링된 제 1 매체 챔버; 및 원심분리 동안 그 사이의 흐름을 제한하는 칼럼과 매체 챔버 사이의 유체역학적 저항 요소를 포함한다.
칼럼은 칼럼이 칼럼의 축 근위 및 축 원위 지점에서보다 추출 채널에서 더 좁다는 점에서 허리 모양일 수 있거나; U 바닥의 근위 방향으로 축을 연장하는 2 개의 분기가 있는 U자형을 가진다.
칩은 적어도 2 개의 매체 챔버, 또는 제 1 매체뿐만 아니라 제 1 매체와 상이한 밀도를 가지는 하나 이상의 제 2 밀도 매체를 생성하기 위해서 2 개 이상의 다른 매체 챔버에 커플링된 혼합 챔버; 또는 각각의 분별된 성분을 위한 2 개 이상의 각각의 챔버로 이어지는 추출 채널 포크(fork)를 더 포함할 수 있다.
매체 챔버의 부피 용량은 추출 채널에 인접한 칼럼 축 부피의 적어도 절반일 수 있다.
또한, 유체가 로딩된 칩을 포함하는 원심 미세유체 시스템이 제공되며, 예를 들어 의도된 분별된 샘플의 등밀도 표면보다 더 높은 밀도를 가지는 매체를 함유한 매체 챔버가 있고, 이송 챔버는 추출 채널의 원위 방향으로 칼럼 축에 커플링되거나; 매체 챔버는 의도된 분별된 샘플의 등밀도 표면보다 더 낮은 밀도를 가지는 매체를 포함하고, 이송 챔버는 추출 채널의 근위 방향으로 칼럼 축에 커플링되고, 칼럼은 축 원위 지점이 U 바닥인 U자형 챔버를 포함하여, U자형 챔버의 하나의 분기에 추가된 매체는 분별된 샘플을 다른 분기로 이동시킨다.
미세유체 칩 제어기에 장착된 시스템이 또한 제공되며, 이 시스템은 제 2 및 제 3 포트에 커플링된 각각의 가압 유체 공급 라인, 및 그곳의 압력을 제어하기 위한 각각의 흐름 제어기를 가지며, 미세유체 칩 제어기 및 칩은 축을 중심으로 한 회전을 위해서 원심분리기에 장착될 수 있다.
시스템은 원심분리 동안 칩을 이미징하기 위한 카메라 및 조명 장비; 칼럼의 추출 채널에 대한 등밀도 표면을 결정하기 위해서 칩 이미징을 분석하도록 구성된 프로세서; 및 이미지 데이터의 분석에 응답하여 제 1 포트와 제 2 포트에서의 압력을 제어하는 수단을 더 포함할 수 있다.
마지막으로, 위에서 정의된 칩, 및 샘플로부터 추출하려는 원하는 성분의 원하는 등밀도 표면의 특성화된 밀도를 가지는 적어도 하나의 매체의 공급장치를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 칩 및 제어기의 적어도 일부를 원심분리기의 축에서 적어도 5 Hz의 속도로 회전시키기 위해서, 칩을 원심분리기에 장착하도록 구성된, 제 1 및 제 2 가압 유체 공급을 위한 제어기를 가지는 원심 미세유체 칩 제어기를 더 포함할 수 있다.
청구범위의 사본이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 추가 특징은 다음의 상세한 설명 과정에서 설명되거나 자명해질 것이다.
본 발명을 더욱 명확하게 이해할 수 있도록, 본 발명의 실시예가 이제, 첨부 도면을 참조하여 예로서 상세히 설명될 것이다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 원심 미세유체 분별 칩의 평면도이다.
도 1a 내지 도 1e는 제 1 원심 미세유체 분획 추출 공정을 수행하는 일련의 상태로 도 1의 칩을 예시한다.
도 1f, 도 1g, 및 도 1h는 본질적으로 동일한 분획 추출 공정을 수행하지만 샘플 유체의 하나의 성분의 밀도보다 더 낮지만 추출된 분획의 밀도보다 더 큰 밀도를 가지는 변위 유체를 사용하는 일련의 상태로 도 1의 칩의 제 1 변형예를 도시한다.
도 2는 분별 칼럼이 U자형이고 그 출구 주위가 허리 모양이고 변위 유체가 축 근위 방향으로 공급되는 제 2 변형예에 따른 원심 미세유체 분별 칩의 평면도이며, 이 도면은 분획 추출의 각각의 단계에서 칼럼 내 레벨 세트를 더 포함한다.
도 2a는 조밀한 매체의 초기 부피를 가지는 대안적인 분획 추출 공정의 각각의 단계에서 칼럼 내의 레벨 세트를 도시하는 제 2 변형예의 칩을 예시한다.
도 3은 제 3 변형예에 따른 원심 미세유체 분별 칩의 단일 평면의 평면도이며, 여기서 분별 칼럼은 오버플로우 챔버(overflow chamber)를 가지고, 변위 유체는 축 근위 방향으로 공급되며, 출구는 4 개의 축-동심 관통 구멍으로 구성되며; 도면은 분획 추출의 각각의 단계에서의 레벨 세트를 더 포함한다.
도 4a 내지 도 4c는 각각의 순차적 분별 추출 상태에서 원심 미세유체 분별 칩의 제 4 변형예의 평면도를 예시하며, 제 4 변형예는 칼럼과 오버플로우가 있는 계량 챔버 사이에 유체역학적 저항을 가진다.
도 5는 원심 미세유체 분별 칩의 제 5 변형예의 평면도를 예시하며, 제 5 변형예는 그의 출구 주위에 허리 모양의 칼럼을 가지며 변위된 유체를 축 원위 방향으로 공급하며, 이 도면은 선택된 범위의 질량 밀도를 분해하는 2 개의 구배 매체를 보여주는 제 1 분별 추출 공정의 각각의 단계에서 칼럼 내의 레벨 세트를 더 포함한다.
도 6은 맞춤 밀도 매체를 배합하기 위한 4 개의 챔버를 더 포함하는 원심 미세유체 분별 칩의 제 6 변형예의 개략도이다.
도 7은 추출된 분획을 유지하기 위해서 챔버가 제공된다는 점에서 도 1과 상이한 원심 미세유체 분별 칩의 제 7 변형예의 개략도이며; 칩은 원심분리기의 블레이드와 통합된 온-보드 압력 공급장치를 제공하는 원심 미세유체 제어기에 장착된다.
도 7a는 칩 제어기를 통해 이미지 기반 제어된 분획 추출을 위해 갖춰진 원심분리기에 장착된 제 7 변형예의 칩의 개략도이다.
도 8은 본 발명을 입증하기 위해 제작되고 사용된 제 8 변형예의 원심 미세유체 분별 칩의 개략도이며, 도 8a는 혈액으로부터 연막과 혈장을 추출하는데 사용된 칩의 사진이다.
도 9a 내지 도 9i는 상이한 분별 상태의 동일한 칼럼을 보여주는 사진이다.
도 10a 및 도 10b는 색상 필터링이 있거나 없는 동일한 상태의 동일한 분별 챔버의 사진으로, 혈액 이미징을 위해서 등밀도 표면이 얼마나 쉽게 분해될 수 있는 지를 보여준다.
본 명세서에서 원심 미세유체 분별 및 추출 기술이 교시된다. 이 기술에는 특정 기능을 갖춘 원심 미세유체 칩을 제공하며, 칩의 각각의 포트에 압력 제어를 제공하여 액체를 분별하고 칼럼의 내용물을 이동시켜 등밀도 표면을 추출 채널과 정렬시키며, 혼합물로부터 성분을 추출하는 것이 포함된다. 가장 큰 장점은 특히 샘플의 고유한 조성 변동성이 보통이거나 높고, 등밀도 표면이 가시광, 광학 또는 굴절률 측정을 통해 식별될 수 있는 경우에, 저렴한 장비, 제어 용이성, 자동화 가능성, 작은 샘플 부피, 추출의 높은 선택성 및/또는 높은 수율이다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 원심 미세유체 칩의 개략적인 평면도이다. 칩은 원심분리기에 장착되고 각각의 포트에서 공압식 칩 제어기가 장착된 원심분리기의 압력 제어 공급장치와 커플링되도록 구성된다. 원심분리기 및 압력 제어 공급장치의 작동으로 인해서 종래 기술의 저-부피 미세유체 분별 기술을 사용했을 때보다 더 적은 장비와 작업량으로 샘플의 분별 및 샘플의 원하는 부분에 대한 더욱 선택적이고 더 높은 수율의 추출이 가능해졌다.
본 발명의 모든 실시예에 공통적인 것처럼, 칩은 바람직하게 저가의 일회용, 또는 가능하면 쉽고 신뢰성 있게 세정되는 다용도 기판(10)의 릴리프-패턴 표면(relief-patterned surface)을 포함한다. 기판(10)은 카트리지의 일체형 부분일 수 있거나 칩의 강성을 개선하여 칩을 더 쉽게 취급하고 조작할 수 있는 피복 층(도면에 도시되지 않음)에 의해 덮여 있다. 기판(10) 및 피복 층은 바람직하게, 예를 들어 출원인의 미국 특허 제 10,369,566 호에 청구된 열가소성 엘라스토머(thermoplastic elastomer)로 구성된 2 개 중 하나와, 밀봉 특성을 갖춘 접합을 제공하도록 부착된다. 특히, 오일-프리(oil-free) MedipreneTM과 같은 TPE 및 ZeonorTM와 같은 경질 열가소성 플라스틱은 호환성이 매우 높은 소재이며 양호한 밀봉 형성 접합력을 가지는 것으로 밝혀졌다. 그 때문에, 기판(10)은 피복 층에 대해 밀봉될 때, 칩 내의 챔버를 둘러싸고 포트(12)에서만 네트워크를 노출시킨다. 칩 구성을 단순화하고 기판(10) 또는 커버에 관통 구멍을 필요하지 않기 때문에 포트(12)가 대안적으로 칩의 에지에 제공될 수 있지만(도 3의 39 참조), 포트는 도시된 바와 같이 더 쉽게 볼 수 있고 피복 층이나 기판에 관통 구멍을 더 많이 공급한다.
관통 구멍은 도시된 바와 같이 기판(10)에 제공되거나 피복 층을 통해 제공될 수 있다. TPE와 같은 엘라스토머 재료에 관통 구멍을 제공하면 강성 재료로 형성된 튜브나 다른 채널 지지체에 의해 엘라스토머 재료가 약간 압축되어 밀봉이 용이해질 수 있다는 장점이 있다.
칩은 도시된 바와 같이, 기판만이 임의의 릴리프 패턴을 지탱한다는 점에서 단일 기판 장치일 수 있다. 대안적으로, 칩은 릴리프 패턴 기판 및 포트용 관통 구멍만을 가지는 피복 층을 포함할 수 있거나, 칩은 어느 한쪽에 두 개의 피복 층과 함께, 하나 이상의 연결 관통 구멍이 양면에 패턴화된 단일 기판 릴리프를 포함할 수 있다(포트는 에지에 제공되거나 하나 이상의 피복 층을 통해 제공된다). 유리하게, 다층 칩에는 무용제 접합을 위해서 TPE와 TP의 교대 층이 제공될 수 있으며, 층들 사이에서 적합하게 정렬된다.
도 1이 단일 기판(10)의 단일 면 상의 모든 칩 특징을 도시하지만, 동일한 효과를 달성하기 위해서 다층 칩의 상이한 층에 번호가 병기된 요소 중 일부를 배치하는 것이 어렵지 않다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 목적을 위한 유용한 다층 칩에 대한 유일한 특정 제한은 모니터링된 영역(14)이 바람직하게 조명에 의해, 가장 바람직하게는 가시 스펙트럼에서 탐색 가능한 상태로 유지된다는 점이다. 그 때문에, 1- 칩의 검사 측면으로부터 영역(14)까지의 모든 층은 바람직하게, 검사 파장에 대해 매우 투명하고, 영역(14)의 검사를 손상시킬 수 있는 임의의 미세유체 채널이 없으며(특히, 모니터링된 영역은 검사 파장의 다중 반사를 피할 수 있기 때문에 바람직하게, 그러한 임의의 적층된 칩의 상단 또는 하단 기판에 있으며); 2- (검사 파장의 방향에 따라서)기판 또는 기판의 인접 층은 바람직하게 불투명하며, 샘플, 특히 분별된 샘플 및 임의의 색상의 밀도 매체와 관련하여 의도한 레벨의 이미징을 위한 양호한 대비를 제공한다.
릴리프 패터닝 위에 피복 층을 접합하면 흐름 제어 메커니즘에 의해 작동될 때 칼럼(15)으로부터 추출된 분획을 회수하기 위한 출구(16)를 갖는 분별 칼럼(15); 원하는 질량 밀도의 매체를 유지하기 위한 매체 챔버(17); 및 매체 챔버(17)와 칼럼(15) 사이의 제어식 전달 채널(18)을 한정하는 미세유체 채널과 챔버의 네트워크를 둘러싼다. 예시된 바와 같이, 제어식 전달 채널(18)은 J자형 저-유량 임피던스 채널(19), 고-유량 임피던스 사형 채널(serpentine channel)(21), 및 2 채널을 연결하는 통기 개구(20)를 가진다. J 채널(19)은 칼럼(15)의 축-원위 단부에 더 가까운 영역(14)의 축-원위 방향에서 칼럼(15)과 만난다.
사형 채널(21)은 도시된 바와 같이, 매체 챔버(17)의 축-원위 단부로부터 개구(20)까지 연장하며, 개구는 매체 챔버(17)와 칼럼(15) 둘 모두의 (임의의 충전 레벨의)축-근위 방향에 있다. 이는 임의의 원심 프로토콜 하에서, 임의의 유체가 J 채널(19)로부터 사형 채널(21) 내로 역류하는 것도 매우 어렵게 하거나 개구(20)에 위치된 공기 플러그가 변위되는 것을 매우 어렵게 하는데 유익하다. 그 때문에, 개구(20)는 결코 막히지 않는다. 사형 채널(21)의 유체역학적 저항은 매체 챔버(17)와 개구(20) 사이의 임계 압력 차이가 프라이밍 기간(priming period) 동안 유지될 때까지 그리고 유지되지 않는 한 흐름에 저항하고, 개구(20)와 만나는 곳에서 한정된 노즐(22)과 협력하여 사용 중에 매체의 액적-기반 이산화(droplet-based discretization)를 보장한다. 사형 채널(21)은 노즐(22)에서 통기 개구(20)와 만난다. 노즐(22)은 바람직하게, 다양한 매체 액체가 주어진 속도로 원심분리되는 동안 액적 스트림을 방출하도록 설계될 수 있고 포트(12c)(도 1a 참조)는 포트(12b)에 대해 양압으로 공급된다. 액적 크기와 속도는 전형적으로, 압력과 원심분리 속도를 변경함으로써 제어될 수 있다.
출원인은 작고 규칙적인 부피의 액적이 (표준 장비에 의해 제공된 한도 내에서)포트에 가해지는 실질적으로 균일한 압력과 실질적으로 일정한 원심력을 사용하여 매우 규칙적인 속도로 분배된다는 점에서 우수한 계량이 이러한 구조로 제공될 수 있음을 발견했다. 일정 부피가 되어야만 액적이 떨어진다는 점에서 분배가 양자화되기 때문에, 분배된 부피는 시간에 따라 매우 잘 제어될 수 있다. 쉽게 이용 가능한 광학 이미징과 머신 비전 기반 피드백(machine vision based feedback)을 통해서, 분별된 샘플 내에서 눈에 보이는 등밀도 표면의 변위에 대한 정확한 제어가 자동화될 수 있다. 액적 크기와 속도는 원심분리 속도 및/또는 압력을 변경함으로써 변경될 수도 있다.
매체 챔버(17)에 대한 개구(20)의 축-관련 위치는 개구(20)의 주변 압력에 대한 추가 제어를 통해 (임계 압력 차이 및 주기에 영향을 미치는 정도를 제외하면)매우 무관하게 만들어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 개구(20) 축을 매체 챔버(17)(내부의 임의의 충전 레벨) 근위에 배치하도록 제어하는 것에는 효과적이다. 칼럼(15)에 대한 개구(20)의 축-관련 위치는 다른 문제이며 J자형 채널(19)에서 기포 혼합을 방지하고 예시된 실시예에서 샘플 분획이 사형 채널(21)로 유입될 가능성을 피하기 위해서 칼럼(15)의 충전 레벨 위에 있어야 한다.
칼럼의 출구(16)는 포트로서 사용될 수 있거나 칩의 다른 층에 대한 비아(via)로서 사용될 수 있는 구멍(12')과 연통한다. 비아인 경우, 다른 층은 기판(10)의 축-근위 에지 상의 포트(12)를 덮지 않거나 이와 정렬된 관통 구멍을 가진다. 구멍(12')에 커플링된 폐쇄 채널인 비아가 칼럼(15)의 충전 레벨(바람직하게, 칼럼 내의 임의의 충전 레벨) 근처의 축을 통과하거나, 채널이 대응하는 포트에서 몇몇 압력 제어 수단을 사용하여 배기 챔버로 개방되는 경우에, 포트는 출구(16)를 통한 추출을 제어하도록 작동 가능한 가압 유체 공급장치에 커플링되거나, 포트는 대기로의 선택적인 개방을 위해 밸브가 달려 있다. 후자의 경우에, 포트를 폐쇄하는 것은 칼럼(15)으로부터 추출된 마지막 유체에 대한 덜 정확한 제어를 제공할 수 있지만, 예를 들어 추출될 샘플의 원하는 성분이 추출된 유체에 무해하게 포함되는 밀도 매체에 의해 적합하게 분리되는 경우에는 덜 중요할 수 있다. 유사하게, 포트(12')가 칩 외부 바이알로 이어지는 경우에, 칩을 바이알에 연결하는 튜브 또는 바이알 자체는 칼럼(15)의 충전 레벨에 가까운 축이거나, 바이알은 추출된 유체를 받아들이도록 감압되는, 제어되고 가압된 용기이다. 채널 및 구멍(12')을 통해, 추출된 유체 성분은 원심분리기에 의해 운반되거나, 칩에 장착되거나, 공압식 칩 제어기에 의해 운반되는 칩 외부 바이알 또는 용기로 전달될 수 있거나, 예를 들어 추가 분석을 위해서 칩의 다른 층으로 전달될 수 있다.
출구(16)는 칼럼(15)의 축-근위 단부와 축-원위 단부 사이에 정확하게 놓이며, 바람직하게는 출구(16)와 성분의 정렬을 결정하는데 사용되는 영역(14) 내에 놓이는 축-관련 위치를 가진다. 바람직하게, 출구(16)는 칩의 축-근위 반경(rmin)의 1.1 배와 칩의 축-원위 반경(rmax)의 0.9 배 사이에 놓인다. 칼럼의 축-근위 및 원위 반경은 칩 범위의 적어도 30%, 전형적으로 50 내지 80%에 걸쳐 있고, rmin < ½ rmax이다. 따라서 샘플의 예상 밀도 구배와 관련된 등밀도 표면에 주로 의존하는 출구에 대한 위치가 다양하다.
도 1a 내지 도 1e는 분획 추출의 주요 단계를 개략적으로 예시한다. 도 1a는 예시의 목적으로 칼럼(15) 내에 있고 J자형 채널(19)로 연장하는 전혈일 수 있는 샘플(25)뿐만 아니라, 챔버(17) 내에 있는 고밀도 매체(26)를 도시한다. 원심분리 하에 있는 액체에 의해 한정된 곡선으로 추측될 수 있듯이, 원심분리기의 축은 칩의 포트가 배열되는 상단(축-근위 칩) 에지의 중심에 상대적으로 가까우며, 이는 주어진 칩 길이와 원심분리 속도에 대해 강한 원심 구배 필드가 수반되므로 칩 제어기를 통해 장착할 때 원심 축에 대한 칩의 일반적인 위치 설정 중 하나이다.
출구(16)는 원심분리 전체에 걸쳐 차단되어 전혈이 개구(12')로 진입하는 것을 방지한다는 점에 유의해야 한다. 이는 적합한 흐름 저항, 예를 들어 출구(16)를 개구(12')와 연결하는 채널의 유체역학적 저항, 사이펀(syphon)과 같은 밸브, 또는 칩의 인접한 층에 있는 해당 포트(도시되지 않음)로부터 칼럼(15)에 대한 개구(12') 상의 제어된 양압을 사용하여 달성될 수 있다. 이 시점에서, 각각의 포트(12a,b,c)는 대기로 개방될 수 있다. 실제로, 샘플(25) 및 매체(26)의 충전 라인이 시사하는 바와 같이, 적어도 포트(12a,b)는 대기로 개방되거나 원심분리가 시작된 이후 어느 시점에 있다.
샘플 로딩, 분별 및 분배 동안 포트(12b)를 차단하는 것은 샘플이 J 채널(19)로 진입하는 것을 방지하는 한 가지 방식이며, 이는 액적 주입을 시각화하거나 추출된 성분의 임의의 손실을 방지하는데 바람직할 수 있다. 공정 전반에 걸쳐 포트(12b)를 대기에 개방된 상태로 유지하는 것이 가장 효율적일 것으로 예상된다.
도 1b는 분별된 샘플(25)를 도시하며, 이는 지속적인 기간 동안 높은 원심분리 속도로 인해 발생한다. 분별된 샘플(25)은 3 개의 별개의 식별 가능한 상(25a,b,c)을 가지는 것으로 도시되며, 이는 샘플이 실질적으로 임의의 수의 상(식별 가능하거나 그렇지 않음)을 가질 수 있고 임의의 예상 구성일 수 있지만, 여기서 혈장(25a), 연막(25b) 및 적혈구(RBC)(25c)로 명명된다. 연막(25b)은 관찰을 용이하게 하기 위해서 인간 혈액에 대해 불균형적으로 큰 부피 분획으로 예시되어 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 예에서는 연막(25b)이 원하는 성분이라고 가정하며(혈액 샘플링의 경우에는 항상 그런 것이 아니지만), 주요 목표는 최소 혈장(25a) 및 RBC(25c)(또는 사용되는 경우에 다른 밀도 매체)를 사용하여 모든 연막(25b)을 추출하는 것보다 연막(25b)만을 배타적으로 추출하고 일부 연막(25b)을 칼럼(15)에 남겨 두는 것이 바람직하다는 점에서, 추출의 완전성이 아닌 추출의 순도이다. 본 발명은 분별의 원하는 부분(전체 식별 가능한 상과 일치하거나 일치하지 않을 수 있음)이 사전에 공지되지 않았지만 제한된 샘플의 분획 부피를 가지거나 원하는 성분이 귀하고 오버플로우 계량으로 인한 손실이 바람직하지 않을 때 특히 유용하며, 이들 모두는 원하는 부분의 축-관련 위치를 알 수 없기 때문이다.
관찰된 등밀도 표면과 비교하여 칼럼(15) 및 매체(26)의 부피 그리고 출구(16)의 상대 위치는 혈장(25a)의 실질적으로 적은 부피 조성이 샘플에 있고 칩이 작동할 수 있다는 점에서 넓은 여백으로 표시된다. 인식할 수 있는 바와 같이, 계량의 더 큰 정확성, 디자인에서 고려되는 샘플-간 부피 조성 변동의 감소, 및 (챔버(17) 및 칼럼(17) 모두에서)추출 공정에 필요한 매체의 부피 사이에는 간단한 절충안이 있다. 이 칩은 모든 범위의 샘플 및 중간 부피에 맞게 설계될 수 있다.
위에서 인용된 Banks의 WO 2014/111721 호에 설명된 바와 같이, 분별된 샘플의 재혼합은 지속적인 관심사이다. 샘플이 원하는 정도로 분별되면, 칩은 재혼합을 방지하기 위한 적합한 노력으로 유체 역학을 촉진하기 위해서 더 낮은 속도로 회전될 수 있다. 그러한 노력에는 매체(26)를 칼럼(16) 내에 천천히 첨가하는 것과 칼럼(16) 내에서 혼합 작용을 제한하는 것이 포함된다.
도 1c는 양압이 포트(12c)에 공급된 후 도 1b에 도시된 상태의 칩을 도시한다. 당연히 이는 포트(12b)의 음압에 의해 동등하게 공급될 수 있다(구멍(12')에서의 가스 압력이 차단되지 않고 조절된 경우에, 이는 협력적인 압력 공급에 의해 동등하게 감압되어야 할 수 있으며, 공급 챔버(17)에 있는 매체의 추가 중량으로 인해 샘플이 개구(20)로 상승하기 전에 분배가 보장되지 않는 경우에 J 채널을 통한 흡인을 제한하는 것이 추가로 필요하거나 바람직할 수 있으므로 양압이 포트(12c)에 적용되면 제어가 상당히 더 간단해질 수 있다). 먼저 매체(26)가 사형 채널(21)을 프라이밍한 다음 액체가 J자형 채널(19)에 한 방울씩 분배된다. 다른 실시예에서, 매체(26)의 색상, 불투명도, 산란 또는 굴절률은 특히, 매체의 축-관련 위치가 정렬에 유용한 경우에 등밀도 표면의 시각적 검출을 위해 선택되지만, 이러한 경우에는 매체(26)가 샘플의 가장 무거운 액체 성분의 밀도보다 더 큰 밀도를 가지며, 따라서 매체를 관찰할 수 있는 유일한 경우는 도시된 바와 같이 영역(14) 내에 있지 않은 J 채널(19) 내에 있을 것이다. 그러나, 칼럼(25) 내의 등밀도 표면의 축-관련 상승 또는 하강을 결정하기 위해서 임의의 관찰 가능한 상 경계가 적합하게 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
액적은 J 채널(19)의 벽에 대해 충분히 낮은 친화력을 가지며, J 채널에 비해 충분히 작아서, J 채널을 폐색하지 않으며, 이는 흐름을 손상시키는 기포를 포획하기 때문이다. 이를 보장하기 위해서, 노즐(22)의 유체역학적 직경은 예를 들어, J 채널 단면적의 3/4 내지 1/3보다 더 작을 수 있다. 원심장(centrifugal field) 하에서의 액적은 J 채널(19)에서 더 가볍고 분리된 상을 통과한다. 액적이 점유 분획을 통해 떨어질 때, 이들은 밀도 분리를 방해하는 경향이 있어 분배 전에 상 경계가 있는 분획보다 전혈과 더 유사할 수 있는 혼합물이 생성될 수 있다.
예시된 바와 같이 매체(26)는 분별된 샘플의 임의의 실질적인 상보다 더 큰 밀도를 가지며, 따라서 액적은 채널이 매체(26)에 의해 점유될 때까지 먼저 J 채널(19)의 바닥에 축적된다. 바닥이 충전되면, 액적은 이들이 축-원위 단부에 축적되는 칼럼(15) 내로 떨어진다. 기둥(15)과 만나기 전에 J 채널의 국지적인 바닥을 제공하지 않음으로써 J 채널(19)에 축적되는 것을 분명히 피할 수 있다. 도 1d는 칼럼(15)의 바닥에 있는 매체(26)의 상당한 부피를 도시하며, 이는 출구(16)를 향해 연막(25b)을 상승시킨다. 연막(25b)이 영역(14)으로 진입할 때, 이미징 시스템은 상승 속도를 모니터링하고 압력 및 원심분리 속도를 조절하여 원하는 등밀도 표면과 출구(16)의 정렬을 자동화할 수 있다.
도 1e는 출구(16) 바로 아래의 RBC(25c)로부터 연막(25b)을 분리하는 등밀도 표면을 도시한다. 이 시점에서, 예를 들어 개구(12')를 통해 음압을 흡인함으로써 추출 채널의 유체역학적 저항을 해제하거나 극복하면 연막(25b)이 (온-칩 또는 오프-칩)추출 챔버(도시되지 않음) 내로 흡인될 것이다. 혈장(25a)이 추출 챔버 내로 진입되지 않도록 보장하는 것도 동등하게 중요할 수 있다. 이를 위해서, 추출 채널의 유체역학적 저항을 유지하여 유속을 제한하고 이미징 시스템에서 결정한 대로 필요할 때 흐름의 중단을 제어함으로써 제어를 적용할 수 있다. 대안적으로, 전체 혈장(25a)은 예를 들어, 도 1f, 도 1g 및 도 1h에 도시된 바와 같이 분기된 출구(16)를 갖춘 칩으로 연막(25b) 추출 전에 (연막(25b)의 일부와 함께)제거될 수 있다.
여기서 도 1의 실시예의 변형예는 기능적으로 동일하거나 유사한 특징을 나타내기 위해서 동일한 참조 번호를 병기하고, 관련 차이점을 설명하는 것을 제외하면 설명이 반복되지 않는다. 여기서, 각각의 변형예는 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 추가의 대안적인 변형예 및 실시예를 형성하기 위해서 독립적이고 서로 조합될 수 있는 것으로 추정된다.
도 1f, 도 1g, 및 도 1h는 도 1에 도시된 것과 동일한 기판(10)을 도시하며, 하나의 변형예로 출구(16)는 샘플의 다수의 별개 성분을 차례로 추출하기 위해서 분기된다. 그 때문에 3 개의 개구(12')가 있다. 방법은 혈장(25a)을 추출하는 것으로 시작할 수 있지만, 이는 예시되지 않는다. 도시된 것은 연막(25b)의 추출이며, 여기서 매체(26)의 밀도는 분별된 샘플(25)의 상의 가장 낮은 밀도보다 더 낮지만 추출된 성분보다는 밀도가 높다고 추정된다. 추출된 성분이 이러한 디자인의 칩을 사용하여 매체(26)보다 밀도가 더 높은 경우에, J 채널(19)이 매체(26)와 샘플의 가장 가벼운 성분으로 충전되면, 매체(26)는 칼럼(15) 내에서 상승하여 그의 내용물을 교반할 것이다.
도 1f에 도시된 바와 같이, 매체(26)가 J 채널(19)의 바닥에 축적되는 대신에, 매체(26)는 RBC(25c)와 J 채널 내의 연막(25b) 사이의 상 경계에 축적된다. 원하는 등밀도 표면 아래의 분별된 칼럼 내로 더 가벼운 매체(26)를 주입하거나 등밀도 표면 위의 칼럼으로 더 높은 밀도의 매체(26)를 주입하는 공정이 필요한 경우에, 칩은 첨가된 매체(26)와의 혼합물을 재분별하도록 다시 원심분리할 수 있다.
도 1g에 의해서, 매체(26)는 J 채널(19)의 플러그를 점유하고 칼럼(15)과 J 채널 모두에서 더 가벼운 상을 위쪽으로 변위시키지만, 매체(26) 중 어떤 것도 칼럼으로 진입하지 않았으며, 칼럼(15) 및 J 채널의 내용물과 중량의 균형이 맞춰질 때까지 플러그를 J 채널의 바닥으로 축-원위 방향으로 변위시킬 것이다. J자형 채널(19)의 축-관련 위치는 매체(26)가 (RBC(25c) 내용물을 얻을 때 시간 경과에 따라 변하는)칼럼(15) 내용물의 평균보다 밀도가 높거나 낮은 지의 여부에 따라서 칼럼(15)의 위치보다 높거나 낮을 수 있다. 이러한 변화는 일반적으로 미묘하며 예시에서는 과장되어 있다.
도 1h에 의해서, 매체(26)의 부피는 J자형 채널(19)에서 균형을 유지할 수 있는 양을 초과하여 매체가 칼럼(15) 내로 흐른다. 매체(26)가 RBC(25c)를 매체(26)에 교반하여 혼탁한 혼합(예시할 수 없음)을 초래하는 동안, 분별된 연막(25b) 사이의 명확한 경계가 유지되어야 하며 이미징 시스템에 의한 모니터링을 허용해야 한다. 상이 혼합된 상과 추출된 성분을 분리하는 경우에, 또는 혼합된 상이 추출된 성분과 시각적으로 식별 가능한 경우에, 상의 혼합은 정렬 또는 추출 순도를 손상시키지 않을 수 있다.
도 2는 도 1의 기판(10)의 제 2 변형예의 개략적인 평면도이며, 다양한 변형예가 있을 수 있다. 분별 칼럼(15)은 주 칼럼(15a) 및 바람직하게, (예를 들어, 더 낮은 에칭 깊이의 결과로)더 작은 부피를 가지는 보조 칼럼(15b)을 갖춘 U자형 용기이다. 보조 칼럼(15b)은 테이퍼지고, 축-근위 방향으로 커지는 단면적을 가지며; 이는 더 적은 샘플이 초기에 보조 칼럼으로 진입하게 하고, 더 많은 양이 매체 추가 동안 진입하게 한다. 주 칼럼은 영역(14) 부근에서 조여지거나 허리 모양으로 된 부분을 가지며, 출구(16)는 칼럼(15)의 축에 근접한 액적 공급 혼합 챔버(30)로 이동한다. 또한, 제어된 전달 채널(18)은 동일한 일반 구성을 가지더라도, 칼럼(15)의 축-근위 단부 근처에 매체를 공급한다. 그 때문에, 매체는 추출된 채널의 밀도보다 낮은 밀도를 가져야 하거나, 더 높은 밀도의 매체가 사용되는 경우에 샘플이 그를 통과하는 동안 재혼합되기 때문에 매체가 분배된 후에 샘플이 굴절되어야 한다. 굴절은 생산 속도를 늦추고 관찰 가능한 정보가 적어 더 높은 정확도를 요구하므로 선호되지 않는다. 예시된 변형예는 영역(14)이 대부분 출구(16) 위로 연장하여, 추출된 성분이 출구(16)의 축-근위에서 시작하고 추가된 매체가 등밀도 표면을 원위 방향으로 이동시키는 경향이 있기 때문에 저밀도 매체용으로 설계되며, 이는 아래에서 추가로 설명된다.
주 칼럼(15a)과 보조 칼럼(15b)을 갖춘 U자형 분별 칼럼(15)은 샘플을 위한 2 개의 자유 표면, 및 2 개의 통기구를 가지며, 따라서 (더 이상 J자형이 아닌)채널(19)을 통한 더 가벼운 매체의 추가로 주 칼럼(15a)의 밀도가 높은 성분(의 더 작은 부피)이 보조 칼럼(15b)으로 이동하게 하여, 15b에서 레벨이 상승하지만 15a 만큼은 아니다. 이러한 보조 칼럼(15b) 없이, 더 가벼운 매체를 추가해도 추출된 성분(25b)의 높이가 변경되지 않는다.
주 칼럼(15a)은 출구(16)에서 그리고 출구 위에서 허리 모양이다. 종래 기술에 예시된 바와 같이, 허리 모양의 칼럼(15)은 추출 제어를 실질적으로 개선한다. 이에 대한 하나의 이유는 원하는 상을 원하지 않는 상으로부터 분리하는 등밀도 표면의 영역이다. 두 개의 다음 후보 사항을 고려한다: 목표가 성분 수집을 최대화하면서 더 조밀한 상의 비말 동반을 피하는 것이라면, 더 무거운 성분에 너무 가깝기 때문에 더 좁은 채널에 성분의 제공으로 추출되지 않는 성분의 부피를 감소시킨다. 목표가 가장 적은 양의 밀도가 높은 성분으로 모든 성분을 수집하는 것이라면, 원하는 성분 모두가 수집되도록 보장하는데 필요한 등밀도 표면 아래의 최소 축-관련 위치가 더 작은 부피의 밀도가 더 높은 성분을 비말 동반하므로, 더 좁은 채널이 더 양호하다. 등밀도 표면적을 감소시키면 위 경계의 길이도 감소하는데, 이는 다른 상황이 변함 없다면 이미징을 더욱 어렵게 한다. 적합한 광학 장치를 사용하여 이미지를 더 작은 시야로 확대하는 것이 항상 가능하기 때문에, 이는 이미징 손상을 필요로 하지 않는다.
칩의 제 2 변형예 사이의 마지막으로 주목할만한 차이점은 추출된 성분이 온-칩에서 처리되는 방식이다. 출구(16)는 액적 공급 혼합 챔버(30)에, 구부피으로 주 칼럼(15a) 내용물의 최종 레벨(lf)과 실질적으로 축-동일 위치에 커플링된다. 그 때문에, 유체는 포트(12f)에서의 음압에 의해 제공되는 것과 같은 과도한 공압력에 의해 원심력에 맞서 흡인된다. 포트(12f)에서의 음압(주 칼럼(15a)의 압력에 비해)은 프라이밍 지연 후 추출된 분획을 노즐(32)로 흡인하고, 노즐(32)은 추출된 분획을 일련의 액적로서 혼합 챔버(30)로 분배한다. 동시에, 그리고 더 짧은 프라이밍 지연으로, 통기된 시약 공급장치(33) 챔버로부터의 시약은 노즐(34)을 통해 혼합 챔버(30)로 흡인되어 제 2 액적 스트림을 혼합 챔버(30) 내로 주입한다. 출원인의 미국 특허 제 9,555,382 호의 교시에 따르면, 원심장 하에서 이러한 제 2 액적 스트림은 노즐(32) 위쪽으로 흡인되어 일련의 액적 위로 계단식으로 흘러내리며, 이러한 액적은 높은 표면적과 근접성을 고려하여 상대적으로 빠르게 혼합된다. 수렴하는 액적 스트림은 혼합 챔버(30)에 머무르지 않며, 출원인의 공동 계류 중인 WO/2021/156844 호에 교시된 비색 인터페이스 피닝 챔버(colorimetric, interface pinning chamber)와 같은 판독 챔버(35)로 직접적으로 분배된다.
도 2는 각각의 시점에서 각각의 챔버와 칼럼의 액체 내용물의 자유 표면을 도시하는 몇몇 충전 라인을 개략적으로 그린다. 이들 충전 라인은 (칩이 설계된)원심분리기에 장착될 때 칩에 대한 축 위치를 보여준다. 예를 들어, 주 칼럼 및 보조 칼럼(15a,b)과 중간 챔버(17)는 개략적으로 도시된 초기 충전 레벨(lI) 및 최종(lf) 충전 레벨을 가진다. 또한, 추출된 성분 또는 연막(25b)에 대응하는 밴드는 3 가지 상태(25b, 25b', 25b'')로 표시되어 저밀도 매체(26)의 첨가가 증가함에 따라서 원하는 분획의 변위를 보여준다. 특히, 연막(25b)은 전혈이 분별될 수 있으므로 초기 충전 레벨(1i)에 대해 예시된다(연막 부피가 가시성을 위해 과장된 것을 제외함). 연막(25')은 몇몇 저밀도 매체가 챔버에 추가된 후의 위치를 보여준다. 더 많은 RBC가 15b로 이동함에 따라서 이것이 연막을 주 칼럼(15a)의 축-원위 방향으로 보내고 보조 칼럼(15b)의 축-근위 방향으로 보낸다. 주 칼럼(15a)의 허리 모양 영역 내에서, 연막은 표면적이 감소함에 따라서 축-관련 깊이가 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한, 영역(14)은 바람직한 특징을 나타낸다는 점에 주목해야 하며: 축-원위 및 축-근위 계면을 모두 포함하는 전체 연막 부피가 전체 공정에 걸쳐서 영역(14) 내에 있다. 이는 매체의 액적 기반 분배를 제어하기 위한 대부분의 정보를 제공한다. 보조 칼럼(15b)에서 연막의 축-관련 깊이는 축-근위 방향으로 이동함에 따라서 감소한다.
도 2a는 연막(25b)이 특히 귀한 경우에 바람직한 도 2의 기판(10)에 대한 공정의 변형예를 개략적으로 예시한다. 보조 칼럼(15b)에 포획되는 연막을 잃는 것이 허용되지 않는 경우에, 샘플을 로딩하기 전에 고밀도 매체 주입하여 레벨(10)을 충전한다. 밀도가 높은 매체로서, 칼럼(15)의 U 바닥을 차지할 것이다. 그 후, 샘플을 로딩하여 고밀도 매체를 레벨(11A)로 가져오는데, 이는 고밀도 매체 이외에는 보조 칼럼(15b)을 점유하는데 충분하지 않다. 따라서 레벨(l1)은 분별 전후의 칼럼(15)에 있는 혈액 및 고밀도 매체의 레벨이다. 그 후, 개구(20)를 통해 저밀도 매체를 도입하면 보조 칼럼(15b)에 RBC(25c)의 비말 동반을 유도하며, 이는 쉽게 혼합될 수 있지만 분별된 샘플 내 상 경계의 이미징에는 영향을 미치지 않는다. 추가된 저밀도 매체의 증가는 원하는 등밀도 표면이 출구(16)와 정렬될 때까지 이러한 효과를 계속한다.
이는 불필요하기 때문에 본 도면에 도시되지 않지만, 기판(10)은 대안적으로, 예를 들어 보조 칼럼(15b)을 통해 샘플 로딩 전에 칼럼(15) 내로 고밀도 매체를 분배하기 위한 고밀도 매체 공급 챔버를 포함할 수 있다. 고밀도 매체 공급 챔버는 샘플이 원심분리 전에 로딩되는 경우에 일반적으로 요구되지 않는데, 이는 고밀도 매체가 먼저 공급되는 경우에만 임의의 전혈이 보조 칼럼(15b)으로 진입하는 것을 방지하는 이점이 제공되기 때문이며, 이는 동일한 로딩 시스템에 의해 고밀도 매체의 계량된 부피를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 즉, 원심분리 단계 동안 또는 원심분리 단계 사이에서 자동화된 오프-칩 로딩을 용이하게 하는 출원인의 WO 2020/100039 호와 같은 오프-칩 로딩 시스템이 있다.
청구된 칩의 모든 특징이 그의 단일 층에 제공될 필요는 없다는 점에 유의해야 한다. 도 3은 매체 챔버(17)와 개구(20)를 커플링하는 유체역학적 저항 요소, 및 판독 챔버(35)에 대한 출구(16)(또한, 상이한 형태를 가짐)의 커플링과 같은 여러 특징이 도시된 층에 제공되지 않는다는 점에서 본질적으로 불완전한 제 3 칩 변형예의 개략도이다. 다양한 기능은 칩의 연결된 층에 의해 제공될 수 있다.
제 2 변형예와 마찬가지로, 제 3 칩 변형예는 축-근위 방향으로 주 칼럼(15a)에 공급되는 저밀도 매체를 사용한다. 칼럼(15)의 형상은 보조 칼럼(15b)이 부피 임계값을 초과할 때 저밀도 또는 혼합 성분을 제거하는 오버플로우 챔버(15c)에 커플링된다는 점에서 상이하다. 이는 더 많은 양의 더 가벼운 밀도 매체가 분배되도록 허용하고, 추가된 더 가벼운 밀도 매체의 부피에 비해 등밀도 표면의 축-관련 위치의 더 큰 변화를 허용한다.
제 3 변형예에 따른 제어된 전달 채널(18)은 실질적으로 수정되었으며, 포트(12a 내지 12d) 중 어느 것도 압력 제어될 필요가 없으며 로딩 포트 및 공기 통기구로서만 역할을 할 수 있다. 매체의 흐름을 개구(20)로 지향시키는 압력 제어 포트(12c) 대신에, 원심장이 지속적으로 이러한 흐름을 압박하지만, 이는 인접한 층(보이지 않음)에 위치된 구멍(36) 사이에 커플링된 유체역학적 흐름 저항에 의해 차단된다. 이러한 유동 저항은 매체 챔버(17)의 충전 레벨의 근위 방향으로 축을 연장하는 사형 경로일 수 있거나 압력 제어 채널일 수 있다. 따라서 매체의 액적 분배를 보장하고, 출구(16)에서 선택적으로 추출하고, (인접한 층의 작업에 의해 처리되거나 처리되지 않은)추출된 성분을 구멍(36)을 통해 판독 챔버(35)로 전달하는 것을 보장하기 위해서 인접한 층의 포트에 활성 압력이 필요하다.
제 3 변형예의 칩은 다층 구조를 가진다. 예를 들어, 도시된 기판(10)은 하나의 측면에 릴리프 패터닝을 가질 수 있지만, 4 개 구멍 출구(16) 및 몇몇 다른 구멍(36)은 예를 들어, 인접한 층의 채널 및 통기된 챔버와 작동 가능하게 만나는 개방형 관통 구멍을 구성한다. 칩 제어기의 모든 채널 또는 밸브에 대한 단일 클램프 포트 커플링을 용이하게 하기 위해서 칩의 하나의 에지에 있는 단일 라인의 모든 칩 포트를 하나의 측면으로부터 공급하는 것이 바람직할 수 있다.
판독 챔버(35)는 12 개의 마이크로- 또는 나노-구조의 기능화된 웰(well)을 가지며, 각각의 웰은 구멍(36)을 통해 수용되는 (처리되거나 처리되지 않은)추출된 성분을 분석하기 위한 각각의 표적 부분(target moiety)을 가진다. 판독 챔버(35)는 2 개의 추가 챔버(33a,b)에 커프링되며, 이는 예를 들어, 현상액 및 세정액을 판독 챔버(35)에 공급하기 위해서 포트(12e, 12f)에 각각 커플링된다(예를 들어, 출원인의 공동 계류 중인 WO/2021/156844 호에 설명된 바와 같음). 이를 수행하기 위해서, 포트(12e, 12f)는 예를 들어, 출원인의 미국 특허 제 10,702,868 호의 도 11에 설명된 바와 같이, 한 번에 챔버 내의 유체를 방출하기 위해서 대기로 개방되는 폐쇄형 통기구일 수 있다. 대안적으로, 이러한 유체 변위를 제어하기 위해서 칩 제어기의 동일하거나 다른 가압 유체 공급장치로부터 추가의 흐름 제어 장치가 제공될 수 있다. 판독 챔버(35)는 판독 챔버(35)가 충전되고 사이펀 밸브가 프라이밍되는 경우에만 모든 유체(웰에 부착되는 유체 제외)를 추출하기 위한 사이펀 밸브 출구를 가진다. 출구는 출원인의 WO 2020/100039 호에 교시된 바와 같이, 온-칩 폐기물 저장소 없이 유체 제거를 위한 에지 포트(39)로 이어진다.
도 3은 주 칼럼(15a), 및 축이 위치되는 위치를 제공하는 중간 챔버(17)의 충전 레벨을 도시한다. 이전 실시예와 달리, 축은 기판 중심의 우측에 위치된다. 칼럼(15a)은 샘플이 처음에 칼럼(15)을 충전하는 레벨인 충전 레벨 1(l1)이 보조 칼럼(15b)의 오버플로우 레벨에 의해 한정됨을 보여준다. 대응하는 추출된 성분은 주 칼럼과 보조 칼럼 모두에서 연막(25b)으로 표시된다. 보조 칼럼(15b)의 오버플로우 레벨은 유체 성분이 출구(16)를 통해 칼럼(15)으로부터 추출될 때까지의 모든 단계에서의 레벨이다. 레벨 2(l2)에서 주 칼럼(15a)은 점진적으로(다소 과장됨) 상승했고, 주 칼럼 및 보조 칼럼의 연막(25b')이 (개별적으로)이동했다. 또한, 연막(25b')은 주 칼럼(15a)에서 축-원위 방향으로 이동하고, 보조 칼럼(15b)에서 축-근위 방향으로 이동한다. 몇몇 실시예에서, 보조 칼럼(15b)의 연막(25b)은 출구(16)와의 정렬이 달성되기 전에 흘러 넘친다.
도 4a 내지 도 4c는 각각의 분획 추출 상태에서 칩의 제 4 변형예의 개략도이다. 제 4 변형예는 허리 모양 칼럼(15), 및 칼럼(15)을 축-원위 방향으로 통기된 계량 챔버(44)에 커플링하는 유체역학적 저항(19')을 가진다. 충전 라인은 칩이 원심분리기의 축과 정렬된 칩의 축-근위 에지를 사용하여 원심분리기에 장착하도록 설계되었음을 시사한다. 칩이 더욱 통상적인 것과 직교하는 것이 아니라 이러한 방향으로 장착된다면, 상대적으로 많은 수의 칩이 동일한 원심분리기에 장착될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 모든 칩이 이미징될 수 있고, 통상적으로 6 개 이하의 칩만이 장착될 수 있는 경우에, 이와 같이 지향된 칩을 이미징하는 것은 달리 지향된 카메라를 필요로 한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 이렇게 장착된 칩을 위한 카메라는 입사각을 보는 것에 대한 보상을 필요로 할 수 있다.
예시된 제어식 전달 채널(18)은 개구(20)와 연통하지만 유체역학적 저항 (사형)채널과는 연통하지 않는 채널에 축-원위 방향으로 커플링된 매체 챔버(17)를 포함한다. 오히려 단순한 사이펀 채널(21'')이 사용된다. 개구(20)가 매체 챔버(17)의 축-근위 방향에 위치하는 경우에, 원심력은 채널의 매체(26)를 챔버(17)의 충전 레벨과 동일한 레벨까지만 상승시키므로 포트(12c)의 압력이 원심력을 압도할 때까지 매체가 분배되지 않는다. 대안적으로, 칩은 예를 들어, 출원인의 WO 2015/181725 호의 교시에 따라서 분배하기 위해 기울어질 수 있다. 매체(26)가 용량을 약간 초과할 수 있는 계량 챔버(44)를 직접적으로 충전하기 때문에 노즐(22)이 요구되지 않는다. 본 실시예에서, 매체(26)가 공급된 후에 등밀도 표면의 레벨이 제어되기 때문에 개구(20)를 통해 분배되는 매체의 부피에 대한 정밀한 제어가 필요하지 않다.
도 4a는 원심분리 후의 칩 상태를 구부피으로 도시한다. 몇몇 샘플(도시된 바와 같이 주로 RBC(25c)임)은 분별 원심분리 동안 원심력만으로 유체역학적 저항(19')으로 흡인된다. 샘플이 원심분리 전에 로딩되고 분별 속도로 설정된 경우에, 분별과 저항(19')으로의 흐름 사이의 경쟁이 보장될 것이고(포트(12c, 12b)가 대기로 개방된다고 가정) 주로 RBC가 계량 챔버(44)의 축-원위 바닥을 점유하는 것을 보장할 것이다.
도 4b는 칼럼(15)과 계량 챔버(44)가 충전된 칩을 도시한다. 포트(12c)에 양압이 유지되면 매체(26)는 사이펀(21'')을 통해 운반되어 개구(20) 내로 흘러 들어가 원심력 하에서 계량 챔버(44)로 떨어진다. 이미징 순간에, 계량 챔버는 최근에 충전되어 오버플로우 챔버(44a) 내로 흘러 넘친다. 이는 매체(26)가 낭비됨에 따라서 압력(또는 그에 상응하는 것)이 중지되는 순간이 된다.
매체의 질량 밀도는 도시된 바와 같이, RBC(25c)보다 크지만 반드시 필요한 것은 아니다. 매체의 침강 속도, RBC와의 혼합, 및 저항(19')을 통한 변위의 경쟁 속도가 혼탁한 혼합 챔버(44), 혼합 챔버(44) 내의 실질적으로 순수한 매체, 또는 혼합 챔버(44)의 상단에 떠 있는 RBC(25c)의 전체 층으로 유도될 수 있기 때문에 이와 관련하여 도면은 다소 개략적일 수 있다. 등밀도 표면보다 큰 임의의 밀도는 추가 후 굴절을 방지하는 장점을 위해 사용될 수 있다. 칼럼(15)의 등밀도 표면은 매체(26)의 첨가에 비례하여 상승하지만, 계량 챔버(44) 내의 밀도가 높아짐에 따라서 자유 표면은 칼럼(15)의 자유 표면에 대해 축-원위 방향으로 있게 된다. 유체역학적 저항(19')은 주로 분별 칼럼으로의 흐름이 점진적이도록 보장하고 재혼합을 방지하기 위해서 사용되며 주로 계량을 보장하기 위해서 사용되지는 않는다. 이러한 분배 방식에 의한 매체(26)의 공급된 부피에 대한 제어는 정확성이 부족하고 필요한 부피는 분별 전에는 알 수 없으므로, 이러한 실시예에서 사용되는 전략은 칼럼(15)을 과도하게 충전하고 양호하게 제어된 공정으로 칼럼(15)으로부터 초과분의 회수를 제어하는 것이다. 따라서 도 4b는 챔버(44)의 과도한 흐름을 도시한다. 매체(26)의 전달 속도는 충전 중에 계량 챔버(44) 내에 백업이 없음을 보장하기 위해서 저항(19')의 처리량보다 더 느리다.
예시된 공정이 계량 챔버(44)의 RBC(25)를 보여주지만, 이는 샘플을 로딩하고 매체를 직렬로 분배하거나 매체를 먼저 공급함으로써 이를 피하거나 감소시킬 수 있다는 것이 이해될 것이다. 매체를 공급하고 샘플을 동시에 로딩하는 것은 칼럼의 부피 중 매체가 차지하는 양을 최소화하는 동시에, 분별 후 저항(19')에 공기 주머니가 남아 있지 않도록 하는데 특히 유리하다. 분별 후 저항(19')에 공기가 남아 있지 않도록 하는 것이 어려운 경우에, 칼럼(15) 내에 유체역학적 저항(19')의 부피를 유지하여 임의의 기포가 등밀도 표면 위로 분별된 샘플을 상승시키는 것을 배제하기 위해서 칼럼(15)의 접합부 근처에 기포 트랩 구조를 제공하는 것은 사소한 것이다. 그러한 구조는 립(lip)과 포켓을 포함할 수 있으며 유체역학적 저항(19')과의 접합부 위의 칼럼(15) 측벽에 편리하게 위치된다.
도 4c는 추출 준비가 거의 완료된 상태의 칩을 도시한다. 도 4b의 상태 이후에 칼럼(15)으로부터 유체를 흡인하기 위해서 (동등한 양압 또는 양압 및 포트(12a, 12')의 차단은 분명히 동일한 효과를 가지지만)포트(12b, 12c)에 음압이 가해졌다. 계량 챔버(44)가 충전되면, 이는 오버플로우 챔버(44a)로 넘치게 되며, 여기서 이러한 액체는 도 4a의 챔버(44)의 매체 및 가능한 초기 내용물만을 함유할 수 있다. 액체가 추출 속도를 늦추기 위해서 추출되는 동안 칼럼(15)의 등밀도 표면이 모니터링될 수 있다. 연막(25b)의 등밀도 표면이 출구(16)와 정렬되기 때문에 도 4c에서 촬영된 이미지가 최종 자세로 있는 것처럼 보일 수 있지만, 포트(12b,c)의 압력을 유지하면서 구멍(12')에 대한 제어를 수행하는 것은 대부분의 칩 제어기에서, 특히 몇몇 독립적인 가압 유체 공급장치를 갖는 것들에서 어려울 수 있다. 이미지가 촬영되는 순간에 음압이 즉시 중단되면, 원심력은 챔버(44)와 칼럼의 레벨을 재조정하여, 칼럼과 챔버를 가로지르는 질량 분포에 따라서 달라지는 거리만큼 등밀도 표면의 상승을 유도할 수 있다. 따라서 동력학적으로 볼 때 정렬이 초과될 때까지 회수는 계속된다. 너무 많은 양의 유체가 회수되면, 회수 공정이 중단되고, 계속되는 원심 분리는 칼럼과 챔버(44) 내의 자유 표면의 균형을 재조정할 것이며, 도 4b의 상태로 복귀하거나 더 작은 부피를 챔버(44)에 주입함으로써 챔버(44) 내의 더 작은 부피가 다시 충전될 수 있다. 따라서 샘플 구성성분에 대한 사전 지식 없이 등밀도 표면을 출구(16)와 정렬하기 위해서 정확한 양의 매체가 분배될 수 있다.
도 5는 원심 미세유체 분별 및 추출을 위한 칩의 제 5 변형예의 개략도이다. 제 5 변형예는 새로운 특징을 갖지 않고, 단지 본 발명의 실시예에서 차이점 중 하나의 집합을 예시할 뿐이다. J 채널(19)은 그의 축-원위 단부에서 허리 모양의 챔버(15)와 만난다. 제 5 변형예는 고밀도 매체(26)를 칼럼(15)에 분배하기 위한 적어도 하나의 압력 제어 포트(12c)(포트(12c)에서의 양압, 또는 포트(12b)에서의 음압)를 갖는 기판, 및 추출이 개구(12')에 연결된 원하는 성분으로 제한되도록 보장하기 위한 오프-칩 밸브 또는 기타 압력 제어장치(도면에 없음)를 가진다.
도 5는 본질적으로 이웃 밀도의 성분을 실질적으로 분리함으로써 한 쌍의 밀도 매체(46a,b)가 분획 추출을 개선할 수 있는 방법을 예시한다. 샘플 성분 중간에 일정한 질량 밀도를 갖고 샘플과 혼합되지 않는 균질 액체의 부피가 분별 동안에 샘플 로딩 이전, 도중 또는 후에 칼럼(15) 내에 놓이는 경우에, 각각의 밀도 매체(46)는 본질적으로 분별된 샘플을 두 개로 나눌 것이다. 매체(46)의 일정한 질량 밀도가 추출될 성분의 최고 또는 최저 밀도와 정렬되도록 선택되면, 매체(46)는 1- 특히 매체(46)가 시각적, 광학적 또는 전자기적 검사를 용이하게 하는 색상, 굴절률, 불투명도 또는 기타 특성을 가지도록 선택되는 경우에, 관심 있는 등밀도 표면의 경계를 정하는데 특별한 장점을 가지며; 2- 그렇지 않으면 분별된 샘플의 등밀도 표면에 인접해 있을 수 있는 유기 물질이 추출된 성분에 진입하지 않도록 보장하는데 특별한 장점을 가지는데, 이는 그러한 유기 물질이 분석을 혼란스럽게 하거나 복잡하게 만들 수 있기 때문이다.
출원인은 특히, 촘촘한 밀도를 가지는 밀도 매체(46a, 46b) 쌍이 좁은 밀도 변화의 성분 추출을 효율적으로 허용하며, 이는 추출된 성분에 복잡성을 감소시키고 높은 순도를 제공함으로써 분석을 단순화하는데 매우 바람직할 수 있음을 발견했다.
도 5는 연막(25b) 측면에 밀도 매체(46a, 46b)가 있는 분별된 칩을 개략적으로 예시한다. 밀도 매체(46a, 46b)는 그의 균질한 질량 밀도와는 별도로 여러 제약조건: 즉, 샘플 내의 모든 종과의 낮은 반응성; 분별된 샘플 내의 특정 등밀도 표면 중 적어도 하나에서 가시적 마커를 생성; 추가 분석이 필요한 경우에 멤브레인, 필터, 압력, 열, 증발 또는 화학적 격리를 통해 추출된 성분으로 쉽게 분리; 또는 의도된 검출에 대한 낮은 광학적 배경 또는 간섭을 충족하도록 선택될 수 있다. 특히 권장되는 것은 광물성 및 탄화수소 오일, 내경화성 폴리머 수지, 모노머(monomer), 이들의 혼합물, 용액 및 희석액이다.
칼럼(15) 및 J 채널(19)의 분별된 내용물의 배열은 전혈이 로딩되고 이어서 포트(12a)를 통해 매체(46a,b)가 로딩되고, 이어서 고속 원심분리가 지속되는 것과 일치한다. 당업계에 주지된 바와 같이, 많은 샘플의 분별에는 고속 원심분리가 필요하다. 예를 들어, 축-근위 거리가 2 cm이고 축-원위 거리가 7 cm인 칼럼에서 혈액은 밸브 작동 및 분배와 같은 대부분의 미세유체 공정에 대해 약 5 Hz의 원심분리 속도(전형적으로 낮은 원심분리 속도)에서 충분한 원심력을 가질 수 있으며; 기포 혼합 또는 저항 유체 운동 촉진과 같은 몇몇 공정에는 10 내지 120 Hz가 필요하며; 원심 분별에서는 0.2 내지 1 kHz의 원심분리 속도가 일반적이다. 1.2 내지 2.5 kHz의 원심분리 속도는 전형적으로 초원심분리(ultracentrifugation)와 관련이 있다.
전형적인 미세유체 원심분리기는 수백 Hz 초과의 속도에서 작동하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 한다. 특히, 회전 유니온(rotary union)(즉, "슬립 링(slip ring)"으로도 불리는, 고정 부품과 회전 부품 사이에 유체를 커플링할 수 있는 회전 조인트)이 있는 원심분리기, 특히 다중 채널 유체 커플링이 있는 원심분리기는 몇몇 분별 공정에 바람직한 속도로 작동하기 위해서 비용 효율적으로 제공될 수 없다. 접촉 기반 전기 슬립 링은 속도를 감소시키고 고속 원심 분리기의 비용을 증가시킬 수 있지만, 유도로 작동하는 무선 또는 비접촉 슬립 링은 접촉 마찰에 의해 제한되지 않는다. 폐쇄형 가압 캐니스터(closed pressurized canister), 전자 기계 밸브, 열전 장치(thermoelectric device), 전자 통신 및 제어 회로, 공압 공급 도관은 전기 공급장치가 있는 임의의 원심 분리기가 원심 칩 제어기로서 작동할 수 있도록 원심 분리기에 추가된 경량 장치이다. 또한, 초원심분리 또는 고속 작동 중에 작동하지 않을 수 있는 온-보드 펌프는 일반적으로 칩 제어기에 장착되어 높은 가속도에 노출되어도 손상되지 않는다. 따라서 더 낮은 속도의 공정 중에만 활성화되는 온-보드 펌프가 제공될 수 있다. 마지막으로, 칩은 고속 원심분리기 또는 초원심분리기에서 원심분리된 다음 저속 원심분리기의 원심 미세유체 칩 제어기로 이전될 수 있다.
도 6은 원심 미세유체 분별 및 추출을 위한 칩의 제 6 변형예의 개략적인 평면도이다. 제 6 변형예는 제 5 변형예와 유사하지만, 복수의 압력 제어 포트(12c1-5), 및 챔버(17)와 커플링되는 4 개의 챔버(48a-48d)에 대한 것이다. 많은 포트는 단순히 포트를 막거나 밸브를 주변으로 개방하고 공기 플러그를 사용하여 분배를 제어하는 전기 기계식 밸브에 커플링될 수 있으나, 거품 혼합에 사용되는 포트(12c5)는 그에 연결할 수 있는 양압 공급장치를 가질 필요가 있으며, 이는 준비된 매체를 J 채널(19)로 펌핑하는데에도 사용될 수 있다. 이러한 실시예는 성분을 격리하기 위한 각각의 밀도 매체의 맞춤형 제제화(formulation) 및 테스팅을 허용한다.
제 6 변형예가 어떻게 사용될 수 있는 지를 예시하는 예로서, 출원인은 "On-the-fly Physical Property Changes of Aqueous Two-Phase Systems (ATPS) Using a Centrifugal Microfluidic Platform (CMP)"라는 제목의 문서의 모든 내용을 원용에 의해서 본 명세서에 포함한다. 이러한 문서에서는 챔버(48 및 17)를 가지는 칩을 갖춘 원심 미세유체 칩 제어기가 맞춤형 밀도 매체의 작은 샘플 부피를 생성하는데 어떻게 사용될 수 있는 지를 교시한다. 제어된 부피의 물, 염 용액, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 덱스트란(DEX) 또는 중합체의 기포 혼합(미국 특허 제 10,702,868 호에 교시됨)에 의해서, 수성 2상 시스템(aqueous two-phase system: ATPS)이 형성될 수 있다. 용액의 임계 농도 초과에서는 열역학적 비-호환성으로 인해서 단상 혼합물이 2상 용액으로 변경된다. 따라서 ATPS는 샘플과 혼합될 때까지 단상일 수 있다. 분리 후에는 뚜렷한 고밀도 및 저밀도 상이 나타난다.
반복을 통해 많은 상이한 매체 밀도를 생성하고 분석하고, 샘플의 관찰 가능한 원하는 상 성분을 분리하거나, 표지된 샘플(labelled sample)을 사용하는 능력은 제 6 변형예로 수행할 수 있는 비용 효과적인 밀도 결정 절차이다. 분별된 샘플에서 분석될 성분을 볼 수 있고, 매체 자체를 볼 수 있는 한, 등밀도 계면을 생성하는 매체 밀도를 쉽게 계산하거나 관찰할 수 있다. ATPS를 사용하면, 예를 들어 화학 분석을 단순화하기 위해서 샘플 내에서 더 좁은 밀도 성분을 제한할 수 있다.
또한, 영역(14)의 자동화와 머신-비전 검사(machine-vision inspection), 및 포트(12)에 대한 적합한 제어를 통해서, 밀도 기반 검출, 매체 생성 또는 추출을 위한 자동화된 공정이 작은 시약 부피를 사용하여 칩에서 수행될 수 있다.
도 7은 원심분리기의 블레이드와 통합된 칩 제어기(50)에 장착된 제 7 변형예의 원심분리 미세유체 분별 칩을 도시하는, 미국 특허 제 10,702,868 호에서 취한 개략도이다. 제 7 변형예는 본질적으로 도 1의 실시예이나, 칼럼(15)으로부터 추출된 성분을 유지하기 위해서 출구(16)에 커플링된 온-칩 챔버(49)가 있다. 성분의 제어된 추출을 위해서 각각의 포트(12)가 제공되며, 출구(16)와 챔버(49)를 커플링하는 채널은 추출에 대한 제어를 개선하기 위해서 유체 역학적 저항을 가질 수 있다.
칩의 4 개의 포트(12)는 배관(51)에 의해(몇몇 실시예에서는 각각의 포트를 각각의 채널에 커플링하기 위한 통합 채널 및 단일 클램프가 바람직하지만) 각각의 전기 기계 밸브(52)(도면의 용이함을 위해서 단지 3 개만이 식별됨)에 각각 커플링된다. 각각의 밸브(52)는 제어기(55)에 의해 작동된다. 2 개의 포트를 대기 또는 플레넘(plenum)(56)에 커플링하거나 폐쇄하고, 2 개의 포트를 플레넘(56)에 연결하거나 폐쇄하기 위한 밸브(52)가 도시된다. 플레넘(56)은 밸브(52)를 통해 포트(12)에 선택적으로 공급되는 가압 또는 감압 가스의 공유된 공급원이다. 플레넘(56)은 블레이드가 낮은 원심분리 속도로 회전하는 동안 작동하도록 구성되는 펌프(58)와 같은 가압 유체 공급장치, 또는 캐니스터와 같은 가압 유체 공급장치에 커플링될 수 있다.
사용 시, 칩 제어기에 장착하기 전에 칩(10)에 시료와 매체가 미리 로딩되면, 원심분리가 시작되고 샘플이 분별되며, 이는 모든 밸브가 전부피으로 폐쇄 또는 통기 상태에 있어야 하거나 단순히 분별 중에 작동되지 않아야 한다. 예를 들어, 칼럼의 이미징으로 입증된 바와 같이 분별이 완료되면, 원심분리 속도가 미세유체 처리 속도로 느려질 수 있다. 몇몇 샘플은 분별을 위해서 더 높은 원심분리 속도를 필요하지 않을 수 있음을 유의해야 한다. 밸브는 온-칩 챔버(49)에 인접한 포트(12)를 차단하고, 칼럼과 개구를 대기로 개방하고, 매체 챔버에 양압을 적용하도록 작동된다. 매체는 사형 경로를 따라 통기 개구로 진입하고, 개구로 진입 시 노즐에 의해 분리된다. 액적은 원심력하에서 칼럼의 축-원위 단부로 가라앉아 분별된 샘플의 등밀도 표면을 상승시킨다. 그런 다음 양압 하에서 작동하는 밸브가 폐쇄되거나 통기되고 정렬이 평가된다. 만족한다면, 밸브는 온-칩 챔버(49)를 배출하고; 다른 모든 포트에 압력을 가하도록 작동되며, 이는 출구와 정렬된 유체를 온-칩 챔버(49)로 흡인할 것이기 때문이다. 포트를 폐쇄하면 원하는 성분의 추출이 종료된다.
도 7a는 둘러싸인 원심분리 챔버의 축(59)에 장착된 칩과 칩 제어기(50)를 개략적으로 예시한다. 모터 케이싱 구동 칩 제어기(50)를 갖춘 원심분리기(60)가 도시된다. 엔클로저(enclosure)(61)의 리드(lid)에는 저속 원심분리 동안, 그리고 가능하다면 고속 원심분리(분획 완료를 평가하기 위해)에서도 영역(14)의 이미징을 허용하는 카메라(62)와 섬광 등(63)(단지 2 개만 표시됨)이 제공된다. 카메라에 의해 캡처된 이미지는 실시간으로 제어기(55)일 수 있거나 제어기(55)와 통신하는 프로세서에 공급된다. 바람직하게, 프로세서는 이미지 데이터를 분석하고 제어 신호를 제어기(55)와 원심분리기로 송신하여 밸브(52) 및 원심분리 속도를 제어한다. 이는 이미징 시스템 및 제어기(55)에 커플링된 컴퓨터 프로세서가 출구(16)에 대한 등밀도 표면의 축-관련 위치를 예측 제어하게 한다. 충분히 정확한 피드백을 사용하면 칩, 칩의 유체 함량 또는 칩 제어기 밸브의 교정 없이 제어가 제공될 수 있다. 이미징 데이터의 처리 및 분석을 위한 모든 아키텍처(architecture)가 사용될 수 있다. 카메라는 판독 챔버(35)를 추가로 이미지화할 수 있으므로 프로세서는 분별, 정렬, 추출 및 그 후의 판독을 보장할 수 있다.
실험
도 8은 본 발명을 입증하는데 사용되는 칩의 개략도이다. 칩은 제어된 전달 채널이 유사한 용도로 사용되는 오버플로가 있는 도 4의 것과 유사하지만, 중간 챔버(고밀도 매체용)가 부피 분배에 대한 개선된 제어를 위한 제 2 유체역학적 저항을 가지며 유체역학적 저항이 J 채널에 내장되어 있다는 점에서 구별되는 본 발명의 추가 변형예이다. 칼럼의 오버플로우 1은 플라즈마가 제거되는 것을 허용하고 추출 성분의 밀도가 높은 등밀도 표면에서만 차단을 필요로 하여 추출을 단순화한다.
도 8a는 칼럼에 분별된 혈액이 함유되어 있고 중유가 RBC 아래에 도입됨에 따라서 혈장 부피가 오버플로우 1로 유출되는, 제조된 대로의 칩의 사진이다. 샘플을 로딩하는 동안 일부 전혈이 오버플로우 1로 유출되어 현재는 분획되었다. 이 시점에서, 오일은 원하는 양의 오일이 오버플로우 2로 유출될 때까지 계량 챔버 내로 후퇴되어 칼럼에서 (백혈구의)등밀도 표면의 축-관련 위치를 변경할 수 있다.
이러한 칩은 100 mm × 50 mm × 6 mm 열가소성 부품(Zeonor 1060R, Zeon Chemicals)에서 채널과 저장소를 CNC 가공하여 제작되었다. 가공 후, 가공된 부품을 200 ㎛ 두께의 압출된 열가소성 엘라스토머 층(Mediprene OF 400M, Hexpol TPE)과 125 ㎛ 두께의 폴리카보네이트 필름(McMaster-Carr)으로 구성된 바닥 커버와 접촉함으로써 접합이 달성되었다. 조립된 칩은 접합 강도를 개선시키기 위해서 오븐에서 12 시간 동안 50 ℃에서 어닐링되었다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 가요성 튜브를 사용하여 외부 2 mL 바이알에 대한 연결을 제공하기 위해서 2 개의 금속 튜브가 칩에 접착되었다.
원심분리 동안 칩의 포트에 제어된 공기압을 공급할 수 있는 칩 제어기에 칩이 장착되었다. 칩 제어기에는 공기 펌프에 의해 제공되는 압력이나 일련의 8 개의 3-방 밸브를 사용하여 표준 대기압에 공압식으로 연결될 수 있는 8 개의 독립적인 포트가 제공된다. 칩의 상단 에지는 회전 중심으로부터 약 50 mm 떨어진 곳에 놓인다. 제어기는 원심분리 중에 칩의 이미징(회전 당 하나의 이미징)을 허용하는 트리거 신호(trigger signal)를 사용하여 회전과 동기화된 플래시와 카메라를 갖추고 있다.
이러한 구성으로, 다음 공정이 수행되었다. 칩은 먼저 다음 완충제: 2 매체 저장소 내의 밀도 구배 매체(Ficoll paque plus, Sigma-Aldrich) 550 ㎖ 및 고밀도 매체 저장소 내의 중액(heavy liquid)(밀도 2.85 g/cm3, LST 중액, Central Chemical Consulting) 500 ㎖으로 충전되었다. 충전 후에, 제 2 매체 챔버에 위치된 로딩 포트가 접착 테이프를 사용하여 차단되었다. 인산염 완충 식염수 용액으로 1:1로 희석된 1 ㎖ 부피의 전혈이 또한, 튜브를 사용하여 칩에 연결된 외부 2 ㎖ 바이알에 첨가되었다. 칩과 바이알은 칩 제어기의 회전 플랫폼에 고정되고 적절한 균형추가 설치되고 공압 매니폴드가 시스템에 연결되었다. 회전 플랫폼의 회전 속도는 800 rpm으로 설정되었다. 회전으로 인한 원심력으로 약 480 ㎖의 밀도 구배 매체가 계량되어 칼럼으로 이송된다(도 9b). 초과 부피는 오버플로우 1 챔버로 흐른다. 그런 다음 칩 제어기의 펌프가 시작되고 3 psi의 공기 압력을 제공하도록 설정된다. 회전 속도는 600 rpm으로 감소하고 포트 #1이 활성화되어(즉, 펌프에 연결되어) 희석된 혈액 샘플을 칼럼으로 이송하고 이를 밀도 구배 매체 위에 쌓는다(도 9c). 포트 #1은 도 8a에 도시된 대로 튜브를 사용하여 외부 바이알에 공압식으로 연결된다. 외부 바이알로부터 이송된 과잉 혈액 샘플은 폐기물 오버플로우 1 챔버로 흐른다. 그러면 펌프가 정지되고 포트 #1이 비활성화된다(즉, 주변 대기압에 연결된다). 혈액 샘플은 45분 동안 800 rpm 원심분리를 적용함으로써 분별되었다(도 9d 및 도 9e). 포트 #3에서 4 psi의 압력(회전 속도 800 rpm)을 공급함으로써 중액이 칼럼 바닥으로 이송되어, 분획된 혈액 샘플의 등밀도 라인의 레벨이 점차 증가된다(도 9f 및 도 9g). 중액의 이송량이 증가함에 따라서, 분별된 혈액 샘플(즉, 혈장)의 최상층은 칼럼 챔버로부터 폐기물 오버플로우 1 챔버로 점차 이송된다. 등밀도 표면에 대해 원하는 레벨에 도달하면, 칩 제어기의 펌프가 중지되고 포트 #3이 비활성화된다(도 9g). 도 9에 제공된 예에서, 연막 층이 칼럼 챔버 상단에 거의 도달될 때 중액 이송이 중단되었다. 그런 다음 4 psi의 압력을 공급하고 포트 #4, #5 및 #7을 동시에 활성화함으로써 칼럼의 액체 레벨이 낮아졌다. 연막 층이 칼럼 출구 채널 레벨에 거의 도달했을 때(도 9h), 포트 #4와 #5가 비활성화되어 연막이 WBC 챔버로 이송되게 한다(도 9i).
도 9a 내지 도 9i는 위에서 정의된 공정의 여러 단계에서 칼럼(관심 영역)의 사진이다. 사진 A는 빈 칼럼뿐만 아니라, 픽셀 기반 이미지 분석을 위한 후보 관심 영역을 보여준다. 사진 B는 칼럼에 존재하는 2차 매체를 보여준다. 사진 C는 보조 매체 위에 첨가되거나 "쌓인" 전혈을 보여준다. 사진 D, E는 분별이 일어나는 것을 보여준다. 사진 F, G는 칼럼에 중유 매체 내로 축-원위 방향으로 추가하여 오버플로우 1 내로 유출되는 혈장을 보여준다. 사진 G, H는 중유를 회수하여 백혈구/연막 축을 원위 방향으로 이동시켜 칼럼 출구와 정렬하는 것을 보여준다. 사진 I은 연막이 추출된 후의 칼럼을 보여준다.
저비용 머신 비전 처리를 통한 머신 비전 기반 자동화의 간단함을 예시하기 위해서, 본 발명에 따른 매체 추가 및 제거 동안 등밀도 표면이 어떻게 뒤따를 수 있는 지를 명확하게 보여주기 위해 출원인이 도 9의 사진을 고려하는 동안에, 도 10a 및 도 10b가 제공된다. 도 10a 및 도 10b는 도 9의 사진 E의 2개 사본이다. 도 10a는 풀컬러 사진이고, 도 10b는 컬러 이미지의 녹색 레이어(green layer)만 회색조로 표시된다. 적색과 청색 색상을 제거하면 연막의 등밀도 표면이 강조된다(화살표로 표시된다).
작은 샘플의 분별을 실행하기 위해서 공압식 칩 제어기로 유체를 조작하는 능력이 입증되었다. 구조에 내재된 다른 장점은 당업자에게 자명하다. 실시예는 본 명세서에서 예시적으로 설명되며 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하려는 의미가 아니다. 전술한 실시예의 변형은 당업자에게 자명할 것이며 발명자에 의해 다음 청구범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (19)

  1. 원심 미세유체 분별 방법으로서,
    원심 미세유체 칩의 분별 칼럼에 유체 샘플을 제공하는 단계;
    샘플을 분별하기 위해 원심분리하는 단계; 그리고 원심 분리 동안,
    원하는 분획의 분별된 샘플이 칼럼과 만나는 추출 채널과 정렬될 때까지, 특성화된 밀도의 제 1 매질의 부피를 칼럼에 분배하기 위해서 칩의 제 1 포트에 커플링된 제 1 압력 공급 라인 내의 압력을 변화시키도록 제 1 오프-칩을 작동시키는 단계; 및
    추출 채널의 축 근위 방향으로 위치된 원하는 분획의 일부를 추출 채널 내로 흡인하도록 칩의 제 2 포트에 커플링된 제 2 압력 공급 라인 내의 압력을 변화시키도록 제 2 오프-칩을 작동시키는 단계를 포함하는;
    원심 미세유체 분별 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 포트는 칩의 매체 챔버와 유체 연통하며, 매체 챔버는 추출 채널의 축 근위 방향으로 위치된 통기 이송 챔버와 유체 연통하는,
    원심 미세유체 분별 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    유체 역학 저항은 이송 챔버와 매체 챔버 사이에 위치되며, 제 1 매체는 이산화된 액적 스트림으로서 이송 챔버로 전달되거나; 이송 챔버와 칼럼 사이의 유체 역학 저항은 유체역학 저항이 원심력에 의해 극복될 때만 계량된 부피의 전달을 제한하는;
    원심 미세유체 분별 방법.
  4. 원심 미세유체 분별 방법으로서,
    칩과 제어기의 적어도 일부를 원심분리기의 축에서 적어도 5 Hz의 속도로 회전시키기 위해서, 제 1 및 제 2 가압 유체 공급을 위한 제어기 및 원심 미세유체 칩을 갖춘 원심 미세유체 칩 제어기를 원심분리기에 장착하는 단계로서, 미세유체 네트워크를 가지는 칩은:
    원심분리기 축에 대해 근위 지점과 원위 지점 사이에 연장하는, 부피를 차지하는 통기되는 또는 통기 가능한 분별 칼럼;
    분별된 유체의 성분이 제 2 가압 유체 공급장치의 제어기 작동에 의해 칼럼으로부터 제거될 수 있는, 근위 지점과 원위 지점 사이의 칼럼과 만나는 추출 채널;
    입구와 출구를 가지는 통기되는 또는 통기 가능한 이송 챔버;
    특성화된 밀도의 제 1 매체를 함유하는 제 1 가압 유체 공급장치에 작동 가능하게 커플링된 매체 챔버;
    매체 챔버를 입구와 출구를 칼럼과 각각 커플링하는 제 1 및 제 2 도관; 및
    제 1 가압 유체 공급장치의 제어기의 제어 하에서 매체 챔버와 칼럼 사이의 흐름을 허용하기 위해서 제 1 및 제 2 도관 중 적어도 하나에 있는 유체역학적 저항 요소를 포함하는, 단계;
    칼럼에 유체 샘플을 제공하는 단계;
    샘플을 상이한 질량 밀도를 가지는 복수의 성분으로 분별하도록 칼럼에서 유체 샘플을 원심분리하는 단계; 그리고 원심분리하는 동안,
    원하는 분획의 분별된 샘플이 추출 채널과 정렬될 때까지 칼럼에서 분별된 샘플을 변위시키기 위해서, 제어된 부피의 매체를 이송 챔버를 통해 칼럼 내로 분배하도록 제 1 가압 유체 공급장치의 제어기를 작동시키는 단계; 및
    추출 채널을 통해 분별된 샘플의 일부를 선택적으로 추출하기 위해서 제 2 가압 유체 공급장치의 제어기를 작동시키는 단계를 포함하는;
    원심 미세유체 분별 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    매체는 원하는 분획의 등밀도 표면보다 더 높은 질량 밀도를 가지며 추출 채널의 축 원위 방향으로 칼럼 내로 주입되거나; 매체는 등밀도 표면보다 더 낮은 질량 밀도를 가지며 추출 채널의 축 근위 방향으로 칼럼 내로 주입되며, 칼럼은 축 원위 지점이 U 바닥인 U자형 챔버를 포함하여, U자형 챔버의 하나의 분기에 추가된 매체가 분별된 샘플을 다른 분기로 이동시키는,
    원심 미세유체 분별 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칼럼은 추출 채널로부터 멀어질 때보다 추출 채널에서 더 좁다는 점에서 허리 모양인,
    원심 미세유체 분별 방법.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칩은 적어도 2 개의 매체 챔버, 또는 제 1 매체뿐만 아니라 제 1 매체와 상이한 밀도를 가지는 하나 이상의 제 2 밀도 매체를 생성하기 위한 혼합 챔버를 더 포함하며, 상기 방법은 분별 전, 분별 후 또는 분별 중에 일정량의 제 2 매체를 칼럼으로 공급하는 단계를 더 포함하는,
    원심 미세유체 분별 방법.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원심분리 동안 칩을 이미징하기 위한 카메라와 조명 장비, 및 칼럼의 추출 채널에 대해 분별된 샘플의 등밀도 표면 위치를 결정하기 위해 이미지 데이터를 분석하고 이미지 데이터 분석에 응답하여 제 1 및 제 2 가압 유체 공급장치에서 압력을 제어하기 위한 소프트웨어를 작동하는 단계를 더 포함하는,
    원심 미세유체 분별 방법.
  9. 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유체 샘플을 제공하는 단계는 칩 제어기에 장착되는 바이알로부터 샘플을 로딩하는 단계를 포함하거나; 분별된 샘플의 일부를 추출하는 단계는 칩 제어기에 장착된 바이알로 회수된 유체를 배출하는 단계를 포함하는;
    원심 미세유체 분별 방법.
  10. 원심분리기의 축을 중심으로 회전하기 위해서 원심분리기에 장착하기 위한 원심 미세유체 칩으로서,
    미세유체 네트워크를 가지는 칩은:
    축에 대해 근위 지점과 원위 지점 사이에서 연장하는 분별 칼럼으로서, 축 근위 지점은 제 1 포트에 있거나 제 1 포트에 커플링되는, 분별 칼럼;
    칩의 제 2 포트에서의 압력에 따라서 원심분리 동안 유체가 칼럼으로부터 제거되거나 차단되는, 근위 지점과 원위 지점 사이의 칼럼과 만나는 추출 채널;
    입구, 및 칼럼에 커플링된 출구, 그리고 이송 챔버와 유체 연통하는 제 3 포트를 가지는 이송 챔버;
    이송 챔버의 압력에 대한 제 4 포트에서의 압력 변화가 원심 분리 동안 매체 챔버로부터 이송 챔버로 유체를 흡인하는데 사용될 수 있도록, 칩의 제 4 포트 및 입구에 작동 가능하게 커플링된 제 1 매체 챔버; 및
    원심분리 동안 그 사이의 흐름을 제한하는 칼럼과 매체 챔버 사이의 유체역학적 저항 요소를 포함하는;
    원심 미세유체 칩.
  11. 제 10 항에 있어서,
    칼럼은 칼럼이 추출 채널로부터 평균적으로 멀어지는 것보다 추출 채널에서 더 좁다는 점에서 허리 모양이거나; U 바닥의 축-근위 방향으로 연장하는 2 개의 분기가 있는 U자형을 가지는;
    원심 미세유체 칩.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    칩은 적어도 2 개의 매체 챔버, 또는 제 1 매체뿐만 아니라 제 1 매체와 상이한 밀도를 가지는 하나 이상의 제 2 밀도 매체를 생성하기 위한 2 개 이상의 다른 매체 챔버에 커플링된 혼합 챔버; 또는 각각의 분별된 성분에 대해서 2 개 이상의 각각의 챔버로 이어지는 추출 채널 포크를 더 포함하는;
    원심 미세유체 칩.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    매체 챔버의 부피 용량은 추출 채널의 축 근처에 놓이는 칼럼 부피의 적어도 절반인,
    원심 미세유체 칩.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 칩을 포함하는 원심 미세유체 시스템으로서,
    공급 챔버는 의도된 분별 샘플의 밀도보다 더 높은 밀도를 가지는 매체를 포함하며, 이송 챔버는 추출 채널의 축-원위 방향으로 칼럼에 커플링되는,
    원심 미세유체 시스템.
  15. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 칩을 포함하는 원심 미세유체 시스템으로서,
    공급 챔버는 의도된 샘플보다 낮은 밀도를 가지는 매체를 포함하며; 이송 챔버는 추출 채널의 축-근위 방향으로 칼럼에 커플링되며; 칼럼은 축 원위 지점이 U 바닥인 U자형 챔버를 포함하여, U자형 챔버의 하나의 분기에 추가된 매체는 분별된 샘플을 다른 분기로 이동시키는;
    원심 미세유체 시스템.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    칩의 제 2 및 제 4 포트에 커플링된 각각의 가압 유체 공급 라인을 갖는 미세유체 칩 제어기, 및 그곳의 압력을 제어하기 위한 각각의 흐름 제어기를 갖는 미세유체 칩 제어기에 장착되며, 미세유체 칩 제어기 및 칩이 그의 축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착될 수 있는,
    원심 미세유체 시스템.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원심분리 동안 칩을 이미징하기 위한 카메라와 조명 장비; 칼럼의 추출 채널에 대한 등밀도 표면을 결정하기 위해서 칩 이미징을 분석하도록 구성된 프로세서를 더 포함하는;
    원심 미세유체 시스템.
  18. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 칩, 및 샘플로부터 추출하려는 원하는 성분의 원하는 등밀도 표면의 특성화된 밀도를 갖는 적어도 하나의 매체의 공급장치를 포함하는, 키트.
  19. 제 18 항에 있어서,
    칩 및 제어기의 적어도 일부를 원심분리기의 축에서 적어도 5 Hz의 속도로 회전시키기 위해서 칩을 원심분리기에 장착하도록 구성된, 제 1 및 제 2 가압 유체 공급을 위한 제어기를 갖춘 원심 미세유체 칩 제어기를 더 포함하는,
    키트.
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