KR20230152070A

KR20230152070A - 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법

Info

Publication number: KR20230152070A
Application number: KR1020237032270A
Authority: KR
Inventors: 보 첸; 신즈헹 구오
Original assignee: 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-11-02
Also published as: EP4297800A1; MX2023009922A; JP2024510911A; WO2022182983A1; CA3208818A1; AU2022226257A1

Abstract

칼슘-칼모듈린 의존성 키나제(CaMK) 또는 사이클릭-AMP 반응 요소-결합 단백질(CREB)의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 CaMK 또는 CREB 또는 CaMK 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한 CaMK 또는 CREB의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 CaMK 또는 CREB 또는 CaMK 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 포함하고 CaMK 또는 CREB를 암호화한다.

Description

망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 특허 협력 조약에 따라 출원된 국제 출원이며, 2021년 2월 26일 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/154,432, 및 2021년 4월 20일 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/177,230의 우선권의 이익을 주장하고, 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.

정부 권리 진술

본 개시내용은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 EY028921 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 개시내용에 대해 특정 권리를 갖는다.

서열 목록

본 출원은 2022년 2월 3일 생성된 서열 목록을 함유하며; ASCII 형식의 파일은 H2257236.txt로 지정되고 크기가 119.4 KB이다. 파일은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다. 여기에 제출된 서열 목록은 국제 출원의 일부를 형성하는 서열 목록과 동일하다.

시각 정보는 망막 신경절 세포(RGC)라고 하는 망막의 출력 뉴런에서 나오는 축삭 다발인 시신경을 통해 눈에서 뇌의 고등 처리 센터로 전달된다. RGC의 손실은 다양한 병리학적 상태에서 시각 장애 및 실명의 주요 원인이다. 일부 조건은 흥분독성 및 망막 허혈(retinal ischemia)을 포함하여 RGC 소마(soma)를 손상시키는 반면, 다른 조건은 시신경 횡절단, 압박, 시신경유두부종(papilledema) 및 녹내장(glaucoma)을 포함하여 RGC 축삭을 손상시킨다. 실제로, 녹내장은 전 세계적으로 되돌릴 수 없는 시각 장애의 주요 원인이다.

RGC 손상 후 시력을 회복하는 데 있어서 장벽은 재생하기 위해 축삭을 유도하는 것이다. RGC 및 그들의 기능을 보존하기 위한 효과적인 신경보호 접근법을 개발하려는 충족되지 않은 임상 요구가 있다. 망막 허혈 및 흥분독성의 고위험 개체에 대한 급성 및 대규모 RGC 손실을 예방하기 위해 조기 신경보호 치료가 필요하다. 안압을 줄이기 위한 치료에도 불구하고 여전히 실명으로 진행되는 녹내장 환자의 상당한 비율에 대해서도 RGC 신경보호 중재가 필요하다. 외상성 시신경 손상이 있는 환자의 경우, RGC 생존을 촉진하는 것은 망막-뇌 연결을 재생하려는 노력을 도울 수 있다.

본 개시내용은 당업계에서 이러한 결핍 및 다른 결핍을 극복하려는 것에 관한 것이다.

따라서 광범위한 병리학적인 다양한 손상으로부터 RGC 소마 및 축삭을 보호하는 데 효과적인 표적을 식별하는 것과 같이, RGC 변성 또는 손실이 관여하는 시력 장애에 대한 치료적 접근법을 식별하는 것이 바람직하다. 본 개시내용은 Ca2+/칼모듈린 의존성 단백질 키나제의 활성을 증가시키는 약제학적 조성물의 식별 및 RGC 변성 또는 손실을 치료하고 시력 장애를 치료하는 데 있어서 이의 용도를 포함하며, CaMK 활성이 RGC를 포함하여 흥분독성 세포 사멸을 촉진함을 입증하는 기존 문헌을 고려하면 놀라운 일이다. 본 개시내용은 또한 RGC 변성 또는 손실을 치료하고 시력 장애를 치료하는 데 있어서 사용될 때 사이클릭-AMP 반응 요소-결합 단백질(CREB)의 활성을 증가시키는 약제학적 조성물의 식별을 포함한다

측면에서 본원에는 CaMK의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예에서, 조성물은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV)를 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, CaMK는 CaMKI, CaMKII, 및 CaMKIV 중 하나 이상으로부터 선택된다. 추가의 예에서, CaMK는 CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ 중 하나 이상으로부터 선택된다. 또 다른 예에서, CaMK는 구성적으로 활성이다. 또 다른 추가의 예에서, CaMKII는 T286D 치환을 포함하는 CaMKIIα 및 T287D 치환을 포함하는 CaMKIIβ 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다.

또 다른 예에서, 조성물은 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 예에서, 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인(Synuclein) 프로모터, 또는 시냅신(Synapsin) 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄(Neurofilament Heavy) 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 CaMK를 포함한다.

또 다른 예에서, 투여는 안구내 투여 및 전신 투여로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 대상체는 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있다. 또 다른 예에서, 변성을 예방하는 것은 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, CaMK의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예에서, 조성물은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터는 AAV를 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 조성물은 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 예에서, 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 CaMK를 포함한다.

또 다른 예에서, 투여는 안구내 투여 및 전신 투여로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 대상체는 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있다. 또 다른 예에서, 변성 예방은 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 치료는 시력 손실의 예방을 포함한다.

또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 포함하고 CaMK를 암호화한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함한다. 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 또 다른 예에서, 벡터는 아데노 연관 벡터를 포함한다. 추가의 예에서, CaMK는 CaMKI, CaMKII, 및 CaMKIV 중 하나 이상으로부터 선택된다. 또한 추가의 예에서, CaMK는 CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ 중 하나 이상으로부터 선택된다.

또 다른 예에서, CaMK는 구성적으로 활성이다. 또 다른 예에서, CaMKII는 T286D 치환을 포함하는 CaMKIIα 및 T287D 치환을 포함하는 CaMKIIβ 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다.

또한 또 다른 측면에서, CREB의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예에서, 조성물은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV)를 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, CREB는 구성적으로 활성이다. 또 다른 예에서, CREB는 VP-16 CREB를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 예에서, 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 CREB를 포함한다.

또 다른 측면에서, CREB의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예에서, 조성물은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터는 AAV를 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 조성물은 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 예에서, 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 조성물은 CREB를 포함한다.

또 다른 예에서, 투여는 안구내 투여 및 전신 투여로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 대상체는 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있다. 또 다른 예에서, 변성을 예방하는 것은 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 치료는 시력 손실의 예방을 포함한다.

또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 포함하고 CREB를 암호화한다. 또 다른 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함한다. 예에서, 망막 신경절 세포 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 또 다른 예에서, CREB는 구성적으로 활성이다. 또 다른 예에서, CREB는 VP-16 CREB를 포함한다.

본 개시내용의 이들 및 다른 특징, 측면, 및 이점은 하기 상세한 설명을 첨부된 도면을 참조하여 읽을 때 더 잘 이해될 것이다:
도 1a-1y는 본 개시내용의 측면에 따라 RGC에서 CaMKII 활성의 손실을 야기하는 흥분독성 및 시신경 손상의 예를 개시한다. (a-f) PBS(a-c) 또는 NMDA(d-f) 주사 후 2시간에 Tuj1-표지된 RGC에서 CaMKII 인산화(T286에서 CaMKIIα + T287에서 CaMKIIβ)를 보여주는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CaMKII 활성을 유지하거나(a-c) 손실하는(d-f) Tuj1⁺ RGC. 스케일 바, 20 μm. (g-h) 흥분독성 손상 후 RGC에서 CaMKII 인산화의 정량화. (g) PBS 대조군 또는 NMDA 주사 2시간 후 총 Tuj1+ RGC 및 pCaMKII+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. (h) PBS 대조군 또는 NMDA 주사 2시간 후 pCaMKII+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (i-t) 손상 없음(i-k) 또는 망막 신경 압착(optic nerve crush) 5일(l-n), 7일(o-q), 및 9일(r-t) 후(dpc) Tuj1-표지된 RGC에서 CaMKII 인산화(T286에서 CaMKIIα + T287에서 CaMKIIβ)를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CaMKII 활성을 손실한 Tuj1⁺ RGC(l-t). 스케일 바, 20 μm. (u-v) 시신경 손상 후 RGC에서 CaMKII 인산화의 정량화. (u) 손상되지 않은 망막 및 압착 5일, 7일, 및 9일 후 망막에서 총 Tuj1+ RGC 및 pCaMKII+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. (v) 손상되지 않은 망막 및 압착 5일, 7일, 및 9일 후 망막에서 pCaMKII+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:36.22, R²:0.8445, *P<0.0001. (w-x) 매일 PBS(w) 또는 AIP(x) 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보여주는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (y) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001.
도 2a-2h는 본 개시내용의 측면에 따라 RGC에서 CaMKII 활성의 손실을 야기하는 흥분독성 및 시신경 손상의 예를 개시한다. (a-f) CaMKIIα의 경우 Thr286(CaMKIIβ의 경우 Thr287)에서 인산화된 차단 펩티드가 없거나(b) 있는(e) Tuj1 표지된 RGC에서 pCaMKII 면역반응성을 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (g) NMDA 손상 2시간 후 손상되지 않은 망막 및 손상된 망막으로부터의 정제된 RGC에서 pCaMKII 및 GAPDH를 보이는 웨스턴 블롯(Western blot). (h) NMDA 손상 2시간에 손상되지 않은 망막 및 손상된 망막으로부터의 정제된 RGC에서 상대 pCaMKII 수준. 데이터는 평균 ± s.d., n=3개의 블롯으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001.
도 3a-3t는 본 개시내용의 측면에 따라 흥분독성 및 시신경 손상으로부터 RGC를 보호하는 CaMKII의 재활성화의 예를 개시한다. (a-d) 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα WT, AAV-CaMKIIα K42R, 및 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (e) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, NMDA 주사 후 7일에 CaMKIIα 변이체로 처리 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:515.5, R²:0.9898, *P<0.0001. (f-i) 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIβ WT, AAV-CaMKIIβ K43R, 및 AAV-CaMKIIβ T287D 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (j) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, NMDA 주사 후 7일에 CaMKIIβ 변이체로 처리 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:423.3, R²:0.9876, *P<0.0001. (k-n) 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα WT, AAV-CaMKIIα K42R, 및 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 망막 신경 압착 후 2주에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (o) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, 망막 신경 압착 후 2주에 CaMKIIα 변이체로 처리 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:379.0, R²:0.9861, *P<0.0001. (p-s) 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIβ WT, AAV-CaMKIIβ K43R, 및 AAV-CaMKIIβ T287D 처리된 눈에서 망막 신경 압착 후 2주에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (t) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, 망막 신경 압착 후 2주에 CaMKIIβ 변이체로 처리 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:361.3, R²:0.9855, *P<0.0001.
도 4a-4k는 본 개시내용의 측면에 따라 RGC에서 AAV-매개 유전자 전달의 예를 개시한다. (a-c) AAV-GFP의 유리체내 주사 2주 후 Tuj1+ RGC에서 GFP 발현을 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (d) 형질도입 효율은 총 RGC에서 GFP+ RGC의 백분율로 표시된다. 데이터는 평균 ± s.d., n=5 개의 망막으로 표시된다. (e-j) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에 주사 2주 후 RGC에서 pan-CaMKII 수준을 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (k) RGC에서 pan-CaMKII 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P=0.0033.
도 5a-5o는 본 개시내용의 측면에 따라 RGC 보호에서 더 많은 CaMKII 변이체 뿐만 아니라 RGC-특이적 프로모터 mSncg의 성능의 예를 개시한다. (a-e) 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα K42D, AAV-CaMKIIα T286A, AAV-CaMKIIα T286D/T305A/T306A, 및 CaMKIIα T286D/T305D/T306D 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (f) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, NMDA 주사 후 7일에 CaMKIIα 변이체로 처리 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:761.4, R2:0.9935, *P=0.0001. (g-h) 대조군(AAV-mSncg-EBFP) 또는 AAV-mSncg-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (i) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된 NMDA 주사 후 7일에 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (j-n) 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIβ K43D, AAV-CaMKIIβ T287A, CaMKIIβ T287D/T306A/T307A, 및 CaMKIIβ T287D/T306D/T307D 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (o) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된 NMDA 주사 후 7일에 CaMKIIβ 변이체로 처리 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:579.0, R2:0.9914, *P=0.0002.
도 6a-6o는 본 개시내용의 측면에 따라 흥분독성 또는 축삭 손상 후 손상후 및 장기간 RGC 보호를 제공하는 CaMKII의 재활성화의 예를 개시한다. (a-b) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 손상후 치료에서 망막 신경 압착 후 2주에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (c) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, 망막 신경 압착 2주 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (d-g) 대조군(AAV-EBFP) 및 AAV-CaMKIIβ T287D 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 2개월 및 12개월에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (h) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, NMDA 주사 2개월 및 12개월 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:1370, R²:0.9971, *P<0.0001. (i-n) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIβ T287D 처리된 눈에서 망막 신경 압착 후 1개월, 2개월, 및 6개월에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (o) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된 시신경 손상 1개월, 2개월 및 6개월 후 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:523.2, R²:0.9932, *P<0.0001.
도 7a-7z는 본 개시내용의 측면에 따라 흥분독성 및 시신경 손상으로부터 RGC를 보호하기 위해 CaMKII의 하류에서 작용하는 CREB의 예를 개시한다. (a-c) 손상되지 않은 눈(a), 및 대조군(AAV-EBFP)(b) 또는 AAV-CaMKIIα T286D(c) 처리된 눈에서 NMDA 주사 2시간 후, RGC에서 CREB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CREB 활성을 유지하거나(a) 손실한(b) Tuj1⁺ RGC, 이는 CaMKIIα T286D로 처리 후 회복되었다(c). 스케일 바, 20 μm. (d-e) NMDA-유도 흥분독성 손상 2시간 후 RGC에서 CREB 인산화의 정량화. (d) 손상되지 않은 눈 또는 NMDA-손상된 눈에서 총 Tuj1+ RGC 및 pCREB+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. (e) 손상되지 않은 눈 또는 NMDA 손상된 눈에서 pCREB+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:6139, R²:0.9988, *P<0.0001. (f-g) AAV-CaMKIIα T286D+ 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα T286D+AAV-A-CREB 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (h) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (i-j) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-VP16-CREB 처리된 눈에서 NMDA 주사 후 7일에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (k) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (l-t) 손상되지 않은 눈(l), 및 대조군(AAV-EBFP)(m-o) 또는 AAV-CaMKIIα T286D(p-r) 처리된 눈에서 망막 신경 압착 5일, 7일 및 9일 후, RGC에서 CREB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CREB 활성을 손실한 Tuj1⁺ RGC(m-o). 스케일 바, 20 μm. (s-t) 시신경 손상 후 RGC에서 CREB 인산화의 정량화. (s) 손상되지 않은 망막 및 압착 5일, 7일, 및 9일 후 손상된 망막에서 총 Tuj1+ RGC 및 pCREB+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. (t) 손상되지 않은 망막 및 압착 5일, 7일, 및 9일 후 손상된 망막에서 pCREB+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:89.58, R²:0.9389, *P<0.0001. (u-v) AAV-CaMKIIα T286D+ 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα T286D+AAV-A-CREB 처리된 눈에서 망막 신경 압착 후 2주에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (w) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (x-y) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-VP16-CREB 처리된 눈에서 망막 신경 압착 후 2주에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (z) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001.
도 8a-8v는 본 개시내용의 측면에 따라 RGC 보호에서 CaMKII의 하류에 있는 신호전달 메커니즘의 예를 개시한다. (a-b) AAV-CaMKIIα T286D + 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα T286D + AAV-A-CREB 처리된 눈에서 NMDA 주사 2시간 후 RGC에서 CREB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CREB 활성을 손실한 Tuj1⁺ RGC. 스케일 바, 20 μm. (c-d) 흥분독성 손상 후 RGC에서 CREB 인산화의 정량화. (c) NMDA 주사 2시간 후 총 Tuj1+ RGC 및 pCREB+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. (d) NMDA 주사 2시간의 pCREB+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (e-f) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-VP16-CREB 처리된 눈에서 NMDA 주사 2시간 후 RGC에서 CREB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CREB 활성을 손실한 Tuj1⁺ RGC. 스케일 바, 20 μm. (g-h) 흥분독성 손상 후 RGC에서 CREB 인산화의 정량화. (g) NMDA 주사 2시간 후 총 Tuj1+ RGC 및 pCREB+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. (h) NMDA 주사 2시간의 pCREB+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P=0.0003. (i) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 2시간 후, RGC에서 TrkB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (j) RGC에서 pTrkB 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:19.26, R²:0.8652, *P=0.0124. (k-l) AAV-CaMKIIα T286D + 대조군(AAV-EBFP), 또는 AAV-CaMKIIα T286D + AAV-A-CREB 처리된 눈에서 망막 신경 압착 5일 후 RGC에서 CREB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CREB 활성을 손실한 Tuj1⁺ RGC. 스케일 바, 20 μm. (m-n) 신경 손상 5일 후 RGC에서 CREB 인산화의 정량화. (m) 망막 신경 압착 5일 후 총 Tuj1+ RGC 및 pCREB+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. (n) 망막 신경 압착 5일 후 pCREB+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (o-p) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-VP16-CREB 처리된 눈에서 망막 신경 압착 5일 후 RGC에서 CREB 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 화살촉, CREB 활성을 손실한 Tuj1⁺ RGC. 스케일 바, 20 μm. (q-r) 신경 손상 5일 후 RGC에서 CREB 인산화의 정량화. (q) 망막 신경 압착 5일 후 총 Tuj1+ RGC 및 pCREB+/Tuj1+ RGC의 수. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. (r) 망막 신경 압착 5일 후 pCREB+/Tuj1+ RGC의 백분율. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P=0.0002. (s) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 망막 신경 압착 3일 후, RGC에서 DLK 염색을 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (t) RGC에서 DLK 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:192.3, R2:0.9846, n.s.(유의하지 않음, P=0.18). (u) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 망막 신경 압착 3일 후, RGC에서 c-Jun 인산화를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (v) RGC에서 p-c-Jun 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:87.73, R²:0.9669, n.s.(유의하지 않음, P=0.09).
도 9a-9i는 본 개시내용의 측면에 따라 녹내장의 유도된 모델 및 유전적 모델에서 RGC의 CaMKII-매개 보호의 예를 개시한다. (a) 주사 후 자석을 사용하여 전방의 둘레 주위에 고르게 분포된 자성 마이크로비드의 이미지. (b) H&E 염색 후 눈 절편의 이미지는 홍채각막각에서 마이크로비드 축적을 보여준다. 스케일 바, 100 μm. (c) PBS(가짜) 또는 마이크로비드의 주사 후 안압(IOP)의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹 당 n=6개의 눈으로 표시된다. (d-e) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 상승된 IOP의 유도 후 2개월에 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (f) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=6개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (g-h) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 생존 RGC를 보이는 2개월령 GLAST-/- 마우스로부터의 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 40 μm. (i) RGC의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 야생형 망막에 대한 RGC의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, GLAST-/- 망막에서 RGC 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=5개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001.
도 10a-10p는 본 개시내용의 측면에 따라 녹내장의 유도된 모델 및 유전적 모델에서 RGC 축삭의 CaMKII-매개 보호의 예를 개시한다. (a-d) 손상되지 않은 망막 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 망막에서 마이크로비드 주사 2주 후 RGC에서 pan-CaMKII 수준을 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (e) RGC에서 pan-CaMKII 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P<0.0001. (f-h) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 상승된 IOP의 유도 후 2개월에, 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색된 시신경의 반초박 절편의 광 현미경 이미지. 스케일 바, 4 μm. (i) 축삭의 수(왼쪽 Y-축), 및 손상되지 않은 눈에 대한 축삭의 백분율(오른쪽 Y-축)로 표시된, 축삭 생존의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 신경으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P=0.0056. (j-m) 손상되지 않은 망막 또는 AAV 주사 후 3주에 GLAST-/- 마우스의 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 망막의 RGC에서 pan-CaMKII 수준을 보이는 망막의 전조직 표본의 공초점 이미지. 스케일 바, 20 μm. (n) RGC에서 pan-CaMKII 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=3개의 망막으로 표시된다. 독립표본 t-검정, *P=0.0055. (o-p) 대조군(AAV-EBFP) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 DAPI(청색)로 염색된 시신경 유두 형태(밝은 빛) 및 핵층을 보여주는 8개월령 GLAST-/- 마우스로부터의 절편의 이미지. 스케일 바, 80 μm.
도 11a-11m은 본 개시내용의 측면에 따라 뇌에 대한 RGC 축삭 및 그들의 표적 돌출부를 보호하는 CaMKII 재활성화의 예를 개시한다. (a) 시신경, 외측슬상체(lateral geniculate nucleus: LGN), 및 상구(superior colliculus: SC)의 전진성 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB) 추적의 개략적 예시. (b-d) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 7일 후, 시신경에서 RGC 축삭의 전진성 CTB 추적의 공초점 이미지. 스케일 바, 300 μm. 삽입도: 망막에서 CTB 채워짐을 보이는 전조직 표본 망막의 이미지. (e) 시신경에서 CTB 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 신경으로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:281.7, R²:0.9843, *P<0.0001. (f-h) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 7일 후 반대측성 LGN으로 돌출되는 RGC 축삭의 전진성 CTB 추적의 공초점 이미지. 스케일 바, 300 μm. (i) 반대측성 LGN에서 CTB 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 뇌로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:155.8, R2:0.9719, *P<0.0001. (j-l) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 7일 후, 반대측성 SC로 돌출되는 RGC 축삭의 전진성 CTB 추적의 공초점 이미지. 스케일 바, 300 μm. (m) 반대측성 LGN에서 CTB 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 뇌로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:226.9, R²:0.9805, *P<0.0001.
도 12a-12h는 본 개시내용의 측면에 따라 동측성 반구에 대한 RGC 축삭 돌출부를 보호하는 CaMKII 재활성화의 예를 개시한다. (a-c) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 7일 후, 동측성 LGN로 돌출되는 RGC 축삭의 전진성 CTB 추적의 공초점 이미지. 스케일 바, 300 μm. (d) 동측성 LGN에서 CTB 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 뇌로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:145.0, R²:0.9699, *P<0.0001. (e-g) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 7일 후, 동측성 SC로 돌출되는 RGC 축삭의 전진성 CTB 추적의 공초점 이미지. 스케일 바, 300 μm. (h) 동측성 SC에서 CTB 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4개의 뇌로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:162.2, R²:0.9730, *P<0.0001.
도 13a-13q는 본 개시내용의 측면에 따라 기능적 시력을 보존하는 CaMKII 재활성화의 예를 개시한다. (a-c) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 7일 후, PERG 기록의 대표적인 반응. (d) PERG 진폭의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4 마리의 마우스로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:47.95, R²:0.9142, *P<0.0001. (e-g) 손상되지 않은 눈, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 눈에서 NMDA 주사 10일 후 PVEP 기록의 대표적인 반응. (h) PVEP 진폭의 정량화. PVEP 진폭은 각 동물에 대해 표시되고(적색) 그룹에 걸쳐 평균적이다(청색). 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4 마리의 마우스로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:40.67, R²:0.9004, *P=0.0002. (i) 시각적 수중 작업의 개략도. (j-l) 손상되지 않은 마우스, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된(양쪽 눈) 마우스에서 NMDA 주사 4-14일 후, 공간 주파수의 함수로서 시각적 수중 작업 성능. 각 열에 대해, 각 행은 단일 마우스의 결과를 보여준다. 각 동물에 대해, 가장 적합한 추세선이 생성되었고, 70% 올바른 선택과 교차하는 곡선의 지점은 예민함에 대한 임계값으로 채택되었다. (m) 시각적 수중 작업에서 측정된 예민함(공간 주파수 임계값). 데이터는 평균 ± s.d., 그룹당 n=4 마리의 마우스로 표시된다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA, F:529.8, R²:0.9916, *P<0.0001. (n) 시각 절벽(Visual cliff) 테스트의 개략도. (o) 손상되지 않은 마우스, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 마우스에서 NMDA 주사 7일 후, 시각 절벽 성능. 데이터는 앝은 쪽/깊은 쪽 선택의 수(왼쪽 Y-축) 및 백분율(오른쪽 Y-축)을 보여준다. Fisher의 정확도 테스트, *P=0.0373. (p) 어렴풋한(looming) 반응 테스트의 개략도. (q) 손상되지 않은 마우스, 및 대조군(PBS) 또는 AAV-CaMKIIα T286D 처리된 마우스에서 NMDA 주사 7일 후, 어렴풋한 자극에 대한 반응의 성능. 데이터는 반응자 및 비반응자의 수(왼쪽 Y-축) 및 백분율(오른쪽 Y-축)을 보여준다. Fisher의 정확도 검정, *P=0.0028.

명세서 전반에 걸쳐 "하나의 예", "또 다른 예", "예" 등에 대한 언급은 예와 관련하여 기재된 특정 요소(예를 들어, 특징, 구조, 및/또는 특성)가 본원에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되고, 다른 예에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있음을 의미한다. 또한, 임의의 예에 대해 기재된 요소는 문맥상 달리 분명하게 지시하지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.

본 개시내용은 대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법, 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법, 및 약제학적 조성물에 관한 것이다. 예에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위해 적용가능한 하나 이상의 구성요소를 포함한다.

CaMK 및 CREB 신호전달은 RGC 소마에 대한 흥분독성 손상 또는 RGC 축삭에 대한 시신경 손상 후 심각하게 손상되는 것으로 본원에 개시되어 있으며, 이러한 경로의 활성 증가는 RGC를 손상으로부터 강력하게 보호하기 위해 본원에 개시되어 있다. CaMK는 RGC 소마 및 축삭의 손실을 특징으로 하는 실명의 주요 원인인 녹내장의 유도된 모델 및 유전적 모델에서 RGC를 보호하기 위해 본원에 개시되어 있다. 또한 CaMK의 활성 증가는 장거리 RGC 축삭 돌출부를 보호하고 망막에서 뇌의 1차 시각 피질까지의 전체 시각 경로에서 시각 기능을 회복시킨다는 것이 본원에 개시되어 있다. 또한 CREB의 활성 증가는 RGC를 보호한다는 것이 본원에 개시되어 있다.

CaMK 활성을 증가시키는 보호 효과가 RGC 및 시력에 영향을 미친다는 본 개시내용은 CaMK를 억제하면 세포독성을 둔화시킨다는 이전 증거를 고려하여, 특히 놀라운 일이다. 칼슘은 일련의 세포 과정을 조절하는 역할을 하는 매우 다방면의 세포내 신호이다(Berridge 등, 2000). 종종 세포질 증가 형태의 Ca2+ 항상성 손실은 세포 손상을 야기한다(Dong 등, 2006). 비정상적인 Ca2+ 활성화는 흥분독성 및 시신경 손상과 같은 손상 후 RGC 사멸에 관여하는 것으로 알려져 있다(Hartwick 등, 2008; Prilloff 등, 2007). CaMKII는 Ca2+ 신호 전달의 중심 조절자 및 실행자이다(Hudmon and Schulman, 2002a). 따라서, 이전 연구는 CaMKII 억제가 RGC를 흥분독성 세포 사멸로부터 보호한다는 것을 제시하였으며, 이는 증가된 CaMK 활성이 RGC 변성을 촉진한다는 것을 시사한다. 이에 반해, 놀랍게도 본원에 개시된 바와 같이, CaMK 활성을 촉진하는 것은 RGC 및 시력을 보호한다.

본원에 개시된 바와 같이, RGC 소마에 대한 흥분독성 손상 또는 RGC 축삭에 대한 시신경 손상은 RGC에서 CaMK 및 그의 하류 표적 CREB의 불활성화를 야기하였다. CaMK 또는 CREB의 활성 증가는 두 손상으로부터 RGC를 보호하였다. 또한, CaMK-매개 RGC 보호는 녹내장의 유도된 동물 모델 및 유전적 동물 모델에서 질환 진행을 늦추었다. CaMK 활성 증가는 RGC 소마를 구할 뿐만 아니라, 망막에서 뇌의 시각 중계 중심까지의 장거리 RGC 축삭 돌출부를 보호한다. RGC의 CaMK 매개 보호를 증가시키는 것은 또한 전체 시각 경로에서 기능적 시력을 회복시키며, 이는 망막 및 뇌의 1차 시각 피질에서 시각 반응 개선 뿐만 아니라 시각적으로 유도된 행동에 의해 입증된다. 또한 RGC의 변성을 감소시키고 시력 손실을 치료하는 방법, 및 RGC를 포함하여 CaMK 활성 또는 CREB 활성을 증가시키기 위한 조성물을 포함하는 약제학적 조성물로서 CaMK 또는 CREB의 증가된 활성을 표적으로 하는 것이 개시되어 있다.

CaMK의 이소형은 CamKI, CaMKII, 및 CaMKIV를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 CaMK 중 임의의 것의 활성 증가는 RGC 변성을 예방한다. 예를 들어, CaMKI, CaMKII, 또는 CaMKIV의 활성 증가는 RGC 변성을 예방한다. CaMKII는 CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ를 포함한 여러 이소형을 포함한다. CaMKIIα 또는 CaMKIIβ의 활성 증가는 RGC 변성을 예방한다. CaMKII 활성 증가는 또한 RGC를 손상시키는 것으로 알려진 손상 후 이러한 손상에 노출된 대상체와 비교하여 CaMK 활성을 증가시키기 위한 치료에 노출시켜 시력을 개선한다. CaMKI, CaMKII(CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ를 포함하나 이에 제한되지 않음), 및 CaMKIV를 포함한 CaMK 중에서 알려진 공유된 세포 기능, 및 본원에 개시된 바와 같이 RGC 변성을 예방하고 시력 손실을 치료하는 다양한 CaMK의 능력을 고려하면, 당업자는 CaMKI, CaMKII(CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ를 포함하나 이에 제한되지 않음), 및 CaMKIV 중 임의의 하나 이상의 활성 증가가 RGC 변성을 예방할 수 있고, RGC 소마 손실을 예방할 수 있고, 뇌에서 RGC 축삭 돌출부의 손실을 예방할 수 있고, RGC 축삭의 손실을 예방할 수 있고, 시력 손실을 예방할 수 있고, 시력 손실을 치료할 수 있고, 전술한 것 중 임의의 하나 이상일 수 있음을 이해할 것이다.

일부 예에서, CaMK의 활성 증가는 대상체에 의해 발현되거나, CaMK의 활성이 본원에 개시된 방법에 따라 증가된 세포 또는 세포들에서 대상체에 의해 발현된 CaMK와 상이한 아미노산 서열을 갖는 CaMK의 변이체의 활성 증가를 포함할 수 있다. 예를 들어, CaMK의 활성 증가는 본 개시내용에 개시된 바와 같은 CaMK, 또는 대상체의 게놈에 의해 암호화된 CaMK, 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CaMK 활성이 증가된 대상체의 세포 또는 세포들에서 달리 발현될 CaMK와 상이한 CaMK의 활성을 약 1% 이상, 또는 약 2% 이상, 또는 약 3% 이상, 또는 약 4% 이상, 또는 약 5% 이상, 또는 약 6% 이상, 또는 약 7% 이상, 또는 약 8% 이상, 또는 약 9% 이상, 또는 약 10% 이상, 또는 약 11% 이상, 또는 약 12% 이상, 또는 약 13% 이상, 또는 약 14% 이상, 또는 약 15% 이상, 또는 약 16% 이상, 또는 약 17% 이상, 또는 약 18% 이상, 또는 약 19% 이상, 또는 약 20% 이상, 또는 약 21% 이상, 또는 약 22% 이상, 또는 약 23% 이상, 또는 약 24% 이상, 또는 약 25% 이상, 또는 약 30% 이상, 또는 약 35% 이상 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, CaMK의 활성 증가는 본 개시내용에 개시된 바와 같은 CaMK, 또는 대상체의 게놈에 의해 암호화된 CaMK, 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CaMK 활성이 증가된 대상체의 세포 또는 세포들에서 달리 발현될 CaMK와 상이한 CaMK의 활성을 전술한 CaMK에 비해 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 약 30개 이상, 약 25개 이상, 약 40개 이상, 또는 약 50개 이상 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 단독으로 또는 조합하여 포함함으로써 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, CaMK의 활성 증가는 구성적으로 활성인 CaMK의 활성 증가를 포함할 수 있다. 구성적으로 활성이란 활성, 또는 증가된 활성, 또는 지속된 활성이 대상체 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CaMK 활성이 증가된 대상체의 세포 또는 세포들에서 CaMK의 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있도록 달리 또는 일반적으로 요구되는 하나 이상의 다른 세포 신호전달 이벤트에 의존하거나 감소되지 않는 CaMK를 의미한다. 비제한적인 예로서, CaMKII의 활성화는 일반적으로 Ca2+ 유입 및 후속 Ca2+/칼모듈린 결합에 의해 개시될 수 있으며; CaMKII의 결과적인 형태 변화는 CaMKIIα의 경우 트레오닌 286(T286) 또는 CaMKIIβ의 경우 트레오닌 287(T287)에서 자가인산화를 허용하여, 두 이소형의 이러한 이소형의 활성을 향상시킬 수 있으며, 이에 의해 자가인산화 발생하는 경우, CaMK는 Ca2+ 농도가 떨어진 후 활성을 유지할 수 있다. 또 다른 예에서, 구성적으로 활성인 CaMK는 CaMKIIα의 절두된 N-말단 촉매 도메인, 또는 CaMKIIβ의 절두된 N-말단 촉매 도메인을 포함할 수 있으며, 절두는 구성적으로 활성이다.

예에서, CaMK의 활성 증가는 CaMKIIα 또는 CaMKIIβ의 구성적으로 활성인 변이체, 또는 전술한 변이체 중 임의의 것과 같으나 이에 제한되지 않은 또 다른 CaMK의 변이체의 활성 증가를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 개시내용에 따른 CaMK의 활성 증가는 T286D 치환된 CaMKIIα의 수준, 발현, 또는 활성의 증가를 포함할 수 있으며, 이는 임의의 특정 작용 메커니즘에 제한되지 않고, CaMK의 활성 인산화된 상태를 모의할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 본 개시내용에 따른 CaMK의 수준, 발현, 또는 활성의 증가는 T287D 치환된 CaMKIIβ의 활성 증가를 포함할 수 있으며, 이는 임의의 특정 작용 메커니즘에 제한되지 않고, CaMK의 활성 인산화된 상태를 모의할 수 있다. 또 다른 예에서, CaMK의 활성 증가는 CaMKIIα의 N-말단 촉매 도메인, 또는 CaMKIIβ의 N-말단 촉매 도메인의 수준, 발현, 또는 활성의 증가를 포함할 수 있으며, 이는 구성적으로 활성인 것으로 알려져 있다.

일부 예에서, CREB의 활성 증가는 대상체에 의해 발현되거나, 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CREB의 활성이 증가된 세포 또는 세포들에서 대상체에 의해 발현된 CREB와 상이한 아미노산 서열을 갖는 CREB의 변이체의 활성 증가를 포함할 수 있다. 예를 들어, CREB의 활성 증가는 본 개시내용에 개시된 바와 같은 CREB, 또는 대상체의 게놈에 의해 암호화된 CREB, 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CREB 활성이 증가된 대상체의 세포 또는 세포들에서 달리 발현될 CREB와 상이한 CREB의 활성을 약 1% 이상, 또는 약 2% 이상, 또는 약 3% 이상, 또는 약 4% 이상, 또는 약 5% 이상, 또는 약 6% 이상, 또는 약 7% 이상, 또는 약 8% 이상, 또는 약 9% 이상, 또는 약 10% 이상, 또는 약 11% 이상, 또는 약 12% 이상, 또는 약 13% 이상, 또는 약 14% 이상, 또는 약 15% 이상, 또는 약 16% 이상, 또는 약 17% 이상, 또는 약 18% 이상, 또는 약 19% 이상, 또는 약 20% 이상, 또는 약 21% 이상, 또는 약 22% 이상, 또는 약 23% 이상, 또는 약 24% 이상, 또는 약 25% 이상, 또는 약 30% 이상, 또는 약 35% 이상 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, CREB의 활성 증가는 본 개시내용에 개시된 바와 같은 CREB, 또는 대상체의 게놈에 의해 암호화된 CREB, 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CREB 활성이 증가된 대상체의 세포 또는 세포들에서 달리 발현될 CREB와 상이한 CREB의 활성을 전술한 CREB에 비해 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 약 30개 이상, 약 25개 이상, 약 40개 이상, 또는 약 50개 이상 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 단독으로 또는 조합하여 포함함으로써 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, CREB의 활성 증가는 구성적으로 활성인 CREB의 활성 증가를 포함할 수 있다. 구성적으로 활성이란 활성, 또는 증가된 활성, 또는 지속된 활성이 대상체 또는 본원에 개시된 방법에 따라 CREB 활성이 증가된 대상체의 세포 또는 세포들에서 CREB의 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있도록 달리 또는 일반적으로 요구되는 하나 이상의 다른 세포 신호전달 이벤트에 의존하거나 감소되지 않는 CREB를 의미한다. 비제한적인 예로서, CREB의 활성 증가는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 9,587,000에 개시된 바와 같이 단순 헤르페스 바이러스 VP16 단백질의 활성화 도메인과 CREB의 DNA 결합 도메인 사이의 융합인 VP16-CREB로 알려진 CREB 변이체의 발현 증가를 포함할 수 있다.

CREB 활성은 대상체에서, 예컨대 대상체의 RGC를 포함하여 대상체의 망막에서 CREB의 양을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. CREB 발현은 대상체 또는 이의 세포 또는 세포들에서 폴리뉴클레오티드로부터 CREB의 발현을 야기하기 위해 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 RGC와 같은 세포를 형질감염시킴으로써 증가될 수 있다. CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드로부터 CREB의 발현을 자극, 촉진 또는 향상시키기 위해 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부와 작동가능하에 연관된 시스-조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시스-조절 요소는 프로모터 서열 및 인핸서 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스-조절 요소에 대한 서열은 전사 시작 부위로부터 10개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 20개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 30개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 40개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 50개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 60개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 70개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 80개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 90개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 100개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 125개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 150개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 175개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 200개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 225개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 250개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 275개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 300개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 325개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 35개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 375개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 400개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 425개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 450개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 475개 미만의 뉴클레오티드, 전사 시작 부위로부터 500개 미만의 뉴클레오티드, 또는 전사 시작 부위로부터 500 내지 1,000개의 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다

프로모터는 RNA 중합 효소가 하류 유전자 서열의 전사 개시를 위해 결합하는 뉴클레오티드 서열이다. 유전자가 발현되는 세포에서 특히 활성인 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 상류에 있는 프로모터를 포함하여 조직- 또는 세포-유형 특이적 발현을 나타내는 많은 유전자. 프로모터는 다른 것보다 일부 세포에서 보다 활성일 수 있으며, 예컨대 특이적 세포- 또는 조직-유형에서만 활성이거나, 다른 것에 비해 특정 세포- 또는 조직-유형에서 고도로 활성이다. 프로모터는 전사가 개시되는 서열을 포함한다. 진핵생물 프로모터는 TATA 박스, 전사 인자 IIB 인식 부위, 및 코어 프로모터 서열(또는 개시자)과 같은 특징을 포함할 수 있고 전형적으로 포함한다. 전사 인자는 결합하고 RNA 폴리머라제는 전사 개시를 위해 프로모터에 결합한다.

또한 시스-조절 요소에는 하나 이상의 인핸서 서열이 포함될 수 있다. 인핸서는 프로모터 내에서 또는 그에 의해 개시된 전사를 향상시키는 시스-조절 요소의 일부이다. 인핸서는 예를 들어, 다른 인자의 모집 및 프로모터에 대한 전사 기구를 용이하게 하거나 향상시키는 인핸서에 추가의 전사 인자의 결합을 통해서와 같이 프로모터에서 전사 개시를 촉진하는 역할을 할 수 있다. 프로모터와 마찬가지로, 많은 유전자는 세포- 또는 조직-특이적 또는 세포- 또는 조직-향상된 발현에 관여하는 향상을 갖는다. 일부 예에서, 시스-조절 요소는 주어진 세포 환경에서 전사 발현에 영향을 미칠 수 있는 인트론 서열, 스플라이스 부위, 엑손 서열, 또는 이의 임의의 조합과 같은 다른 특징을 포함할 수 있다. 예에서, 세포-유형 특이적 시스-조절 요소는 세포 유형-특이적 시스-조절 요소가 발현을 구동하도록 의도된 것 외에 세포 유형에서 발현을 억제하는 특징을 포함할 수 있다.

예에서, 시스-조절 요소는 뒤섞인(promiscuous) 시스-조절 요소를 포함할 수 있다. 뒤섞인 시스-조절 요소는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질감염된 세포 유형과 관련 없이 또는 최소한으로 관련하여 발현을 구동할 수 있거나 구동하도록 설계될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 뒤섞인 시스-조절 요소는 상이한 조직, 계통, 연령 등의 세포를 포함한 상이한 세포 유형에서 CaMK 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 촉진할 수 있다. 뒤섞인 시스-조절 요소의 예는 CMV 초기 인핸서/닭 β 액틴(CAG) 프로모터 시스-조절 요소, 인간 β-액틴 프로모터 시스-조절 요소, 인간 신장 인자-1α 프로모터 시스-조절 요소, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 시스-조절 요소, 시미안 바이러스 40 프로모터 시스-조절 요소, 및 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제를 포함한다 또 다른 예에서, 시스-조절 요소는 세포-특이적 시스-조절 요소를 포함할 수 있다.

세포-특이적 시스-조절 요소는 미리 결정된 세포 유형 또는 유형들에서 단지, 또는 대부분, 또는 우선적으로, 또는 우세하게 발현을 구동할 수 있거나 구동하도록 설계될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 세포-특이적 시스-조절 요소는 폴리뉴클레오티드로 형질감염될 수 있는 다른 세포 유형에서 발현이 없거나, 최소한, 또는 무시할 수 있거나, 실질적이지 않은 발현이 있는 미리 결정된 세포 유형 또는 유형들에서 단지, 또는 대부분, 또는 우선적으로, 또는 우세하게 발현을 구동할 수 있거나 구동하도록 설계될 수 있거나, 이러한 셀(sell)에서 CaMK 또는 CREB 활성을 증가시키지 않거나 시스-조절 요소가 발현을 구동하도록 설계된 세포 유형 또는 유형들에서 유도된 활성에 비해 최소한, 또는 무시할 수 있거나, 실질적이지 않은 정도로만 수행할 수 있거나 수행하도록 설계될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용에 따른 세포-특이적 시스-조절 요소는 세포-특이적 시스-조절 요소가 발현을 구동하도록 의도되거나 설계된 것 외에 형질감염된 세포 유형 또는 유형들에서의 발현 수준과 비교하여, 시스-조절 요소가 약 0%, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 65% 이하, 약 70% 이하, 약 75% 이하, 약 80% 이하, 약 85% 이하, 약 90% 이하, 약 95% 이하, 약 100% 이하, 약 150% 이하, 약 200% 이하, 약 250% 이하, 약 300% 이하, 약 350% 이하, 약 400% 이하, 약 450% 이하, 약 500% 이하, 약 550% 이하, 약 600% 이하, 약 650% 이하, 약 700% 이하, 약 750% 이하, 약 800% 이하, 약 850% 이하, 약 900% 이하, 약 1,000% 이하, 또는 그 이상 발현을 구동하도록 의도되거나 설계된 형질감염된 세포 유형에서 발현을 증가시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 본 개시내용에 따른 세포-특이적 시스-조절 요소는 시스-조절 요소가 발현을 구동하도록 의도되거나 설계되지만 세포-특이적 시스-조절 요소가 발현을 구동하도록 설계되거나 의도되지 않은 형질감염된 세포 유형 또는 유형들에서 발현이 없거나, 최소한, 무시할 수 있거나, 검출불가능한 수준인 혈질감염된 세포 유형에서 발현을 유발할 수 있다.

예에서, 시스-조절 요소는 RGC에서 전사체의 발현을 구동하는 시스-조절 요소일 수 있다. 예를 들어, 시스-조절 요소는 RGC 프로모터로서 본원에서 언급된 RGC에서 전사체의 발현을 구동하는 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 시스-조절 요소는 RGC에서 발현되는 것으로 알려진 전사체의 프로모터, 인핸서, 또는 둘 다일 수 있다. 시스-조절 요소는 전사체가 망막의 다른 세포 또는 눈의 다른 세포에서 발현되는 것보다 더 높은 정도로 RGC에서 발현되는 것으로 알려진 전사체의 프로모터, 인핸서, 또는 둘 다일 수 있다. 예에서, RGC 프로모터는 눈 조직의 다른 세포에 비해, 또는 망막의 다른 세포에 비해 RGC에서 발현이 더 높은 전사체의 프로모터일 수 있다. 예에서, RGC 프로모터는 다른 세포와 비교하여 RGC에서 전사체의 구별가능한 발현 수준에 기초하여 세포를 RGC로 식별하기에 충분한, 눈 조직의 다른 세포에서, 또는 망막의 다른 세포의 전사체의 발현 수준보다 충분히 더 높은 RGC에서 전사체의 발현 수준을 구동할 수 있다.

예에서, RGC 프로모터는 RGC 외에 눈의 다른 조직의 세포 또는 다른 망막의 세포에서 전사체의 발현을 구동하지 않을 수 있다. 예를 들어, 전사체는 RGC에서 검출가능할 수 있지만(예컨대 전사체의 mRNA의 제자리 혼성화 검출에 의해), 예에서, 눈의 다른 조직의 세포에서 검출가능하지 않을 수 있거나, 또 다른 예에서, 망막의 다른 세포 유형에서 검출가능하지 않을 수 있다. 또 다른 예에서, RGC 프로모터는 하나의 예에서, 눈의 또 다른 세포의 조직 또는, 또 다른 예에서, 망막의 또 다른 세포 유형에서 전사체 발현 수준의 적어도 약 2 배, 또는 적어도 약 3 배, 또는, 적어도 약 4 배, 또는 적어도 약 5 배, 또는 적어도 약 6 배, 또는 적어도 약 7 배, 또는 적어도 약 8 배, 또는 적어도 약 9 배, 또는 적어도 약 10 배, 또는 적어도 약 11 배, 또는 적어도 약 12 배, 또는 적어도 약 13 배, 또는 적어도 약 14 배, 또는 적어도 약 15 배, 또는 적어도 약 16 배, 또는 적어도 약 17 배, 또는 적어도 약 18 배, 또는 적어도 약 19 배, 또는 적어도 약 20 배, 또는 적어도 약 25 배, 또는 적어도 약 50 배, 또는 적어도 약 75 배, 또는 적어도 약 100 배, 또는 적어도 약 150 배, 또는 적어도 약 200 배, 또는 적어도 약 250 배, 또는 적어도 약 300 배, 또는 적어도 약 350 배, 또는 적어도 약 400 배, 또는 적어도 약 450 배, 또는 적어도 약 500 배, 또는 적어도 약 600 배, 또는 적어도 약 700 배, 또는 적어도 약 800 배, 또는 적어도 약 900 배, 또는 적어도 약 1,000 배, 또는 적어도 약 5,000 배, 또는 적어도 약 10,000 배, 또는 적어도 약 25,000 배, 또는 적어도 약 50,000 배, 또는 적어도 약 75,000 배, 또는 적어도 약 100,000 배인 RGC에서 전사체의 발현을 구동할 수 있다. 발현 수준은 눈 조직으로부터의 세포의 다른 정제된 세포 유형과 같은 다른 세포 유형과 비교하여 정제된 RGC에서 웨스턴 블롯 분석에 의한 이식유전자 발현의 측정에 의해 결정될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 예에서, RGC 프로모터는 감마-시누클레인 프로모터, 예컨대 인간 감마-시누클레인 프로모터, 마우스 감마-시누클레인 프로모터, 또는 대상체의 RGC에서 전사체의 발현을 구동하는 또 다른 감마-시누클레인 프로모터일 수 있다. 또 다른 예에서, RGC 프로모터는 시냅신 1 프로모터, 예컨대 인간 시냅신 1 프로모터, 마우스 시냅신 1 프로모터, 또는 대상체의 RGC에서 전사체의 발현을 구동하는 또 다른 시냅신 1 프로모터일 수 있다. 또 다른 예에서, RGC 프로모터는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터, 예컨대 인간 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터, 마우스 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터, 또는 대상체의 RGC에서 전사체의 발현을 구동하는 또 다른 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터일 수 있다. 또 다른 예에서, RGC 프로모터는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 예컨대 인간 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 마우스 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 대상체의 RGC에서 전사체의 발현을 구동하는 또 다른 신경미세섬유 중쇄 프로모터일 수 있다. 신경미세섬유 중쇄 프로모터는 긴 형태의 신경미세섬유 중쇄 프로모터 또는 짧은 형태의 신경미세섬유 중쇄 프로모터일 수 있다. 이러한 예에서 대상체는 포유동물, 또는 인간, 또는 마우스, 또는 래트, 또는 개, 또는 고양이, 또는 말, 또는 소, 또는 양, 또는 돼지일 수 있다. 전술한 프로모터의 뉴클레오티드 서열의 예는 표 1에 주어지며, 이 중 임의의 것은 본원에 개시된 모든 예에 대한 가능한 예로서 명시적으로 포함된다.

표 1: RGC 프로모터의 예

예에서, RGC 프로모터는 표 1에 개시된 프로모터와 100% 미만의 서열 상동성을 가질 수 있다. 예에서, RGC 프로모터는 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 60% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 65% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 70% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 75% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 80% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 85% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 90% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 95% 서열 상동성, 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 97% 서열 상동성, 또는 표 1에 개시된 프로모터와 적어도 약 99% 서열 상동성을 가질 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이, 벡터는 시스-조절 요소 및 본원에 개시된 임의의 구성적으로 활성인 CaMK를 포함하여 본원에 개시된 임의의 CaMK를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 CaMK를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 벡터는 시스-조절 요소 및 본원에 개시된 임의의 구성적으로 활성인 CREB를 포함하여 본원에 개시된 임의의 CREB를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 CREB를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예에서, 임의의 이러한 시스-조절 요소는 하나 이상의 인핸서 및 하나 이상의 프로모터 중 하나 이상을 포함하는 유비쿼터스 시스-조절 요소일 수 있다. 시스-조절 요소는 편재적으로 활성이거나 뒤섞일 수 있으며, 이는 예로서 RGC를 포함하는 다수의 상이한 세포 유형에서 전사체의 발현을 구동할 수 있음을 의미한다. 또 다른 예에서, 임의의 이러한 시스-조절 요소는 임의의 다른 세포 유형 또는 또 다른 세포 유형에서가 아니라 RGB에서, 또는 망막의 다른 세포에서가 아니라 RGC에서, 또는 눈의 다른 조직의 세포에서가 아니라 RGC에서 전사체의 발현을 구동할 수 있다. 이러한 시스-조절 요소는 RGC 프로모터일 수 있다.

전술한 시스-조절 요소 중 임의의 것 및 본원에 개시된 CaMK 또는 CREB 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 조합은 본원에 개시된 임의의 및 모든 방법에서 벡터에 포함되나 이에 제한되지 않는 것을 포함하여 이의 용도와 마찬가지로 본 개시내용에 명시적으로 포함된다. 예에서, 시스-조절 요소 및 본원에 개시된 바와 같은 CaMK 또는 CREB를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 재조합일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 재조합은 폴리뉴클레오티드의 시스-조절 요소 및 CREB 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 자연 발생하지 않는 서열과 함께 스플라이싱함으로써 생성되었음을 의미한다. 예를 들어, 임의의 이러한 예는 시스-조절 요소 및 CaMK 또는 CREB를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 시스-조절 요소는 공손히 CaMK 또는 CREB 외에 자연 발생 유전자 서열로부터 유래되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 개미 벡터는 전술한 예 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 이러한 벡터를 포함하는 임의의 이러한 예는 본원에 개시된 바와 같은 방법 중 임의의 것에 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

예에서, CaMK 또는 CREB의 활성은 CaMK 또는 CREB를 세포로 도입할 수 있거나, CaMK 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입할 수 있는 벡터를 세포와 접촉시켜, 암호화된 CaMK 또는 CREB의 발현을 야기함으로써 증가될 수 있다. 벡터는 거대분자 또는 세포로 전달될 단백질, 폴리펩티드, 유전자, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자 복합체를 지칭한다. 벡터는 예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 알파바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 리포솜 및 다른 지질-함유 복합체, 및 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 표적 세포로 전달하는 것을 매개할 수 있는 다른 거대분자 복합체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예는 재조합 핵산을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.

예에서, CaMK 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 아데노 연관 바이러스 내에서 캡시드화(encapsidated)될 수 있다. 예에서 재조합 아데노 연관 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12 중 하나 이상으로부터 선택된 혈청형의 것이다. 다른 예는 전술한 AAV 혈청형 중 2개 이상으로부터의 구성요소를 포함하는 하이브리드인 바이러스 벡터를 포함한다..

RGC에서 활성 증가는 벡터를 대상체에 주사하는 것과 같이 전술한 CaMK 또는 CREB를 RGC에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 주사는 안내 또는 전신일 수 있다. 주사는 근육내, 뇌실내, 복강내, 피하, 또는 RGC에서 CaMK 또는 CREB의 활성을 증가시키기 위해 RGC를 벡터와 접촉시킬 수 있는 임의의 다른 경로에 의할 수 있다.

예에서, 본원에 개시된 임의의 특징 또는 특징들을 단독으로 또는 임의의 조합으로 혼입하는 방법은 RGC의 변성을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. RGC의 변성 감소는 RGC 수의 손실, RGC의 사멸, RGC 소마 수의 손실, RGC 축삭 수의 손실, 및 뇌를 포함하나 이에 제한되지 않는 RGC 축삭 돌출부의 손실 중 하나 이상을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. RGC 변성은 실명 증가를 포함하는 시력 손실을 포함할 수 있다. 예에서, RGC의 변성 감소는 시력 손실을 예방 또는 치료하는 것을 포함할 수 있다. 예에서, RGV에서 CaMK 또는 CREB 활성 증가는 예컨대 RGC 기능장애 또는 변성을 유발할 수 있는 것과 같은, 흥분독성 또는 다른 손상 또는 부상에 의해 유발될 수 있는 시력 또는 시각적 능력의 감소를 예방한다.

RGC의 변성은 다양한 병리학적 상태에서 시각 장애 및 실명의 주요 원인이다. 흥분독성 및 망막 허혈을 포함한 일부 조건은 RGC 소마를 손상시키는 반면, 시신경 횡절단, 압박, 시신경유두부종 및 녹내장 또는 안압의 병리학적 또는 유해한 증가의 다른 사례를 포함한 다른 조건은 RGC 축삭을 손상시킨다. RGC 변성 예방은 안압을 줄이는 치료와 같은 다른 치료가 주어진 경우에도 이러한 실명 장애로 달리 진행될 녹내장 환자를 포함하나 이에 제한되지 않는 녹내장 환자의 감소된 시각적 능력 또는 예민함, 또는 실명을 예방, 감소, 또는 줄일 수 있다. 또 다른 예에서, CaMK 또는 CREB 활성은 대상체의 RGC에서 증가될 수 있으며 여기서 대상체는 녹내장의 발생 또는 악화에 대한 유전적 소인을 보유한다. 일부 예에서, 방법은 RGC 변성이 발생하기 전에, 또는 어느 정도 이미 발생한 것으로 여겨질 수 있는 추가의 RGC 변성이 발생하였거나, 이를 예방하는 것으로 여겨지기 전에, 또는 임의의 정도의 RGC 변성이 발생한 것으로 알려져 있거나 여겨지지만 대상체가 이러한 변성이 발생하기 쉬운 것으로 여겨지는 경우 RGC에서 CaMK 또는 CREB 활성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다.

일부 예에서, 방법은 시각적 능력 또는 시각적 예민함의 손상 또는 감소 또는 실명(부분 실명 또는 완전 실명을 포함할 수 있음)을 경험하거나 이로 진단받지 않은 대상체, 또는 시각적 예민함 또는 능력의 일부 손상 또는 감소가 있는 대상체, 또는 어느 정도 실명이 대상체에 의해 검출, 진단, 또는 경험한 대상체의 RGC에서 CaMK 또는 CREB 활성을 증가시키는 것으로 포함할 수 있으며, 여기서 대상체는 전술한 시각 장애 중 임의의 것의 발생 또는 악화를 예방, 감소, 또는 완화하는 것과 같이, 시각적 능력 또는 예킨함의 이러한 장애, 감소, 또는 손실, 또는 실명(부분 실명 또는 완전 실명을 포함할 수 있음)의 발생 또는 악화 위험이 있는 것으로 여겨진다. 예에서, 이러한 대상체는 녹내장으로 진단되거나, 녹내장이 발생하기 쉬운 것으로 진단되거나, 망막의 변성 또는 시각적 능력 또는 예민함 감소 또는 실명 발생(부분적 실명 또는 완전 실명을 포함할 수 있음)을 야기할 가능성이 알려져 있거나, 여겨지거나, 예상되거나, 예측되거나, 갖는 허혈성 이벤트 또는 다른 외상이 발생하기 쉬운 것으로 진단될 수 있다. 본원에 개시된 RGC에서 CaMK 또는 CREB 활성 증가를 위한 임의의 예 중 임의의 하나 이상은이 RGC 변성을 감소 또는 예방하기 위한 임의의 전술한 방법 또는 대상체에서 시력 손실을 치료하기 위한 전술한 방법에 포함될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 포함하고 CaMK 또는 CREB를 암호화한다. 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 CaMK 또는 CREB는 CaMKI, CaMKII, CaMKIV, 구성적으로 활성인 CaMK, CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, CaMKIIδ, T268D 치환된 CaMKIIα, T287D 치환된 CaMKIIβ, CaMKIIα의 절두된 N-말단 촉매 도메인, CaMKIIβ의 절두된 N-말단 촉매 도메인, CREB, 구성적으로 활성인 CREB, 또는 VP16-CREB를 포함하나 이에 제한되지 않는 전술한 CaMK 또는 CREB 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 시스-조절 요소, 예컨대 뒤섞인 시스-조절 요소, 또는 세포-특이적 시스-조절 요소, RGC 프로모터, 감마-시누클레인 프로모터, 또는 다른 시스-조절 요소를 포함할 수 있다.

일부 예는 RGC 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 전술한 시스-조절 요소 중 임의의 것이 있거나 없는, 전술한 CaMK 또는 CREB 중 임의의 것을 암호화하는 서열을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 이러한 폴리뉴클레오티드는 약제학적 조성물의 일부가 아니다. 예에서, 전술한 벡터 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 벡터는 약제학적 조성물의 일부가 아니다.

또 다른 예에서, CaMK의 활성을 증가시킬 수 있는 조성물, 화합물, 제제, 약제, 또는 다른 물질은 본 개시내용에 따라 RGC의 변성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예로서, 올레산(CAS 112-80-1)은 CaMK 활성을 자극하는 것으로 알려져 있다. CaMK 활성 증가가 RGC 변성 및 시력 손실을 억제한다는 본 개시내용을 고려하면, CaMK 활성인자로서, 올레산은 본원에 개시된 바와 같은 CaMK를 증가시키는 다른 방법과 마찬가지로, RGC 변성을 예방하고, 시력 손실에 대한 치료로서 사용되는 것으로 예상될 것이다. 올레산, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 CaMK 활성 또는 발현의 또 다른 자극인자 또는 활성인자, 또는 CaMK 대신 본원에 개시된 바와 같은 방법의 모든 예 및 임의의 대상체에서 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, 대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키거나, 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법이 본 개시내용에 명백하게 포함된다.

약제학적 조성물은 대상체에게 투여하기 위한 제형을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 경구, 비경구(피하, 피내, 근육내, 안내, 정맥내 및 관절내 포함), 직장 및 국소(피부, 협측, 설하 및 안내 포함) 투여에 적합한 임의의 것을 포함할 수 있다. 가장 적합한 경로는 수용자의 상태 및 장애 또는 의도된 투여의 목적에 따라 달라질 수 있다. 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있고 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 방법은 CaMK 또는 CREB 또는 CaMK 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 임의의 예를 포함하여 전술한 것 중 임의의 것을 포함하는 벡터("활성 성분")를 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하고 긴밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 원하는 제형으로 성형하여 제조될 수 있다.

대상체에게 투여하기에 적합한 본 개시내용의 제형은 각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 샤셰(cachet) 또는 정제와 같은 별개의 단위; 분말 또는 과립; 수성 액체 또는 비수성 액체 중 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제시될 수 있다. 활성 성분을 포함하는 조성물은 또한 볼루스, 연약제 또는 페이스트로서 제시될 수 있다. 경구 또는 다른 투여의 경우, 활성 성분은 용액에 현탁될 수 있거나, 알코올, DMSO, 물, 염수와 같은 용매, 또는 또 다른 용액 또는 용매에 추가로 희석 또는 용해될 수 있고, 일부 예에서 담체 또는 다른 부형제일 수 있고 이를 함유할 수 있는 다른 용매에 현탁될 수 있다.

특정 구현예에서, 활성 성분은 하나 이상의 부형제와 혼입될 수 있고 소화가능한 정제, 협측 정제, 트로키(troche), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 또한 다음을 함유할 수 있다: 예를 들어, 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴 또는 이의 조합과 같은 결합제; 예를 들어, 인산이칼슘, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 또는 이의 조합과 같은 부형제; 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이의 조합과 같은 붕해제; 예를 들어, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제; 예를 들어, 수크로스, 락토스, 사카린 또는 이의 조합과 같은 감미제; 예를 들어 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리 향미제, 오렌지 향미제 등과 같은 향미제. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 외에도, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅제로서 존재할 수 있거나 달리 투여 단위의 물리적 형태를 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 정제, 알약, 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당, 또는 둘 다로 코팅될 수 있다. 투여 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 외에도, 액체 담체와 같은 담체를 함유할 수 있다. 젤라틴 캡슐, 정제, 또는 알약은 장용 코팅될 수 있다. 장용 코팅은 pH가 산성인 위 또는 상부 장에서 조성물의 변성을 예방한다. 소장에 도달하면, 그 안의 염기성 pH가 코팅을 용해시키고 조성물이 특수화된 세포, 예를 들어, 상피 장세포 및 파이어 패치(Peyer's patch) M 세포에 의해 방출되고 흡수되게 한다. 엘릭시르의 시럽은 감미제로서 활성 화합물 수크로스 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 체리 또는 오렌지 향과 같은 염료 및 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 이용되는 양에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지속-방출 제제 및 제형으로 혼입될 수 있다.

정제는 임의적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형함으로써 제조될 수 있다. 압축 정제는 임의적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 윤활제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의적으로 코팅되거나 스코어링될 수 있고 그 안의 활성 성분의 지속, 지연 또는 제어 방출을 제공하기 위해 제형화될 수 있다.

비경구 또는 다른 투여를 위한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제 및 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이게 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액을 포함한다. 비경구 또는 다른 투여를 위한 제형은 또한 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 제형은 다회 용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알의 단위 용량으로 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 식염수, 포스페이트 완충 염수(PBS) 등의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 뿐만 아니라 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 지칭한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로스 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함함으로써미생물 작용의 방지를 보장할 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장성제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 제제를 포함함으로써 주사용 약제학적 제형의 장기간 흡수를 유발할 수 있다. 주사용 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 생분해성 중합체에서 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 화학식 I의 화합물 대 중합체의 비율 및 이용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 화학식 I의 화합물의 방출 속도는 제어될 수 있다. 데포 주사용 제형은 또한 신체 조직과 호환되는 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획함으로써 제조된다. 주사용 제형은 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 직전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균화제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다. 적합한 불활성 담체는 락토스와 같은 당을 포함할 수 있다.

화학식 I의 화합물 제형은 고체 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지 여부, 및 주사와 같이 이러한 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 정맥내, 피내, 경피, 척추강내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 국소, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 국부, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접적으로 국소 관류 욕 표적 세포, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 액체 조성물(예를 들어, 리포솜)로, 또는 당업자에게 알려진 것과 같은 다른 방법 및 전술한 것 중 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990 참조.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 예를 들면, 연구자 또는 임상의가 찾고 있는 세포, 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 수 있는 활성 성분 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다. 용어 "치료적 유효량"은 이러한 양을 받지 않은 상응하는 대상체와 비교하여, 질환, 장애, 또는 부작용의 개선된 치료, 치유, 예방, 또는 완화, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도 감소를 초래하는 임의의 양을 의미한다. 용어는 또한 그의 범위 내에서 정상적인 생리학적 기능을 향상시키는 데 효과적인 양을 포함한다. 요법에서 사용하기 위해, 치료적 유효량의 활성 성분, 뿐만 아니라 이의 염, 용매, 및 생리학적으로 기능적인 유도체기 원료 화학물질로서 투여될 수 있다. 추가로, 활성 성분은 약제학적 조성물로서 제시될 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 유효량의 화학식 I의 화합물 및 임의적으로 약제학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있다. 어구 "약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 예를 들어, 인간과 같은 동물에게 적절하게 투여된 경우 유해한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 원치않은 반응을 생성하지 않는 분자 실체(entity) 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분을 함유하고 임의적으로 하나 이상의 추가 활성 성분을 포함할 수 있는 약제학적 조성물의 제조는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 더욱이, 동물(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국(FDA Office of Biological Standards)에 의해 요구된 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 함이 이해될 것이다.

추가로 본 개시내용에 따르면, 투여에 적합한 본 개시내용의 조성물은 불활성 희석제가 있거나 없이 약제학적으로 허용되는 담체에 제공될 수 있다. 담체는 동화될 수 있고 액체, 반고체, 즉, 페이스트, 또는 고체 담체를 포함할 수 있다. 임의의 통상적인 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수용자 또는 그 안에 함유된 조성물의 치료적 효과에 유해한 경우를 제외하고, 본 개시내용의 방법을 실시하는 데 사용하기 위한 투여가능한 조성물에서 그의 사용이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수, 액체, 리포솜, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 하나 이상의 구성요소의 산화를 지연시키는 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물 작용의 방지는 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항균제 및 항진균제와 같은 방부제에 의해 야기될 수 있다.

본 개시내용에 따르면, 화학식 I의 화합물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉, 용액, 현탁액, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합될 수 있다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적이다.

예에서, 본 개시내용은 약제학적 액체 비히클 또는 활성 성분 및 수성 용매를 포함하는 벡터 조성물의 사용을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "지질"은 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 광범위한 물질 중 임의의 것을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이 광범위한 부류의 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있고, 용어 "지질"이 본원에서 사용될 때, 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 그들의 유도체를 함유하는 화합물을 포함할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성(즉, 사람에 의해 설계되고 생산됨)일 수 있다. 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세리드, 스테로이드, 테르펜, 리소지질(lysolipid), 당스핑고지질, 당지질, 황산화물, 에스테르 및 에스테르- 결합 지방산을 갖는 지질 및 중합가능한 지질, 및 이의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당업자에 의해 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 것들 외에 화합물이 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다.

당업자는 조성물을 액체 비히클에 분산시키기 위해 이용될 수 있는 다양한 기술에 친숙할 것이다. 예를 들어, 활성 성분은 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질로 용해되거나, 지질로 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유적으로 결합하거나, 지질에 현탁액으로서 함유되거나, 미셸 또는 리포솜에 함유되거나 이와 복합체화되거나, 달리 지질 또는 지질 구조와 회합될 수 있다. 분산액은 리포솜의 형성을 초래할 수 있거나 초래하지 않을 수 있다.

대상체(예를 들어, 동물 또는 인간 환자)에게 투여되는 본 개시내용의 조성물의 실제 투여량은 체중, 병태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 현재 치료적 중재, 환자의 특발성 및 투여 경로와 같은 물리적 및 생리학적 인자, 및 치료 목적에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응 또는 치료 목적에 따라 달라질 수 있다. 어떠한 경우에도, 투여를 담당하는 의사는 개별 대상체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 투여량(들)을 결정할 수 있다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 예를 들어, 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 자연스럽게, 각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 성분의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 유효 기간과 같은 인자, 뿐만 아니라 다른 약리학적 요건이 이러한 약제학적 제형을 제조하는 분야의 숙련자에 의해 고려될 것이며, 이와 같이, 다양한 투여량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다.

예를 들어, 수용액 내 비경구 투여의 경우, 활성 성분을 포함하는 용액은 필요한 경우 적합하게 완충될 수 있고 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 되게 할 수 있다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 멸균 수성 매질이 이용될 수 있다. 예를 들어, 1회 투여량은 등장성 NaCl 용액 1 ml에 용해될 수 있고 피하주입 유체 1000 ml에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences"15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투여량의 일부 변경은 치료되는 대상체의 상태에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족할 수 있다.

멸균 주사용 용액은 상기 열거된 다양한 다른 성분을 갖는 용매에 활성 성분을 혼입한 후, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다. 분말 조성물은 예를 들어, 안정화제가 있거나 없이 물 또는 염수 용액과 같은 액체 담체와 조합될 수 있다.

본원에 개시된 CaMK 및 CREB의 예를 암호화하는 아미노산 서열의 예는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예와 함께 표 I에 제시되어 있다. 이해되는 바와 같이, 코돈 축퇴성으로 인해, 표 I에 제시된 아미노산 서열은 표 2에 제시된 것 외에 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있고, 표 2에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 가능한 뉴클레오티드 서열의 모든 이러한 변경은 본원에 명백하게 포함된다. CaMK 단백질의 N-말단 촉매 도메인은 전체 CaMK 단백질의 조절 영역(촉매 N-말단 도메인의 C-말단에 위치함)이 부족하여, 조절 영역에 의해 달리 발휘되는 억제 제어로부터 촉매 N-말단 도메인을 자유롭게 한다.

표 2: 아미노산 및 뉴클레오티드 서열

예에서, CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 100% 미만의 서열 상동성을 가질 수 있다. 예에서, CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 60% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 65% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 75% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 85% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 90% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 95% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 97% 서열 상동성, 또는 표 2에 개시된 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 99% 서열 상동성을 가질 수 있다.

예에서, CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 100% 미만의 서열 상동성을 가질 수 있다. 예에서, CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 60% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 65% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 75% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 85% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 90% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 95% 서열 상동성, 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 97% 서열 상동성, 또는 표 2에 개시된 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 99% 서열 상동성을 가질 수 있다.

표 1에 개시된 프로모터, 또는 표에 개시된 CaMK 또는 CREB 중 임의의 것의 발현을 구동하는 임의의 다른 RGC 프로모터 중 임의의 것을 포함하는 예가 제한없이 본원에 명백하게 개시된다. 또한 본원에 개시된 바와 같은 임의의 대상체에서 RGC 예방에 사용하기 위한 약제의 제조, 또는 시력 손실의 치료에서 화합물의 용도가 제한없이 본원에 명백하게 포함되며, 여기서 화합물은 CaMK 또는 CREB 단백질 또는 이의 변이, 또는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이, 및 임의적으로 임의의 RGC 프로모터 또는 본원에 개시된 다른 프로모터를 포함하고, 본원에서 RGC의 변성을 예방하거나 시력 손실의 치료에서 사용하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 전술한 것 중 임의의 것의 임의의 조합을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.

비제한적인 작업 실시예

하기 실시예는 본 개시내용의 특정한 구현예를 예시하기 위해 것이며, 결코 이의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본원에서 매우 상세하게 논의된 전술한 개념 및 추가의 개념의 모든 조합은 (이러한 개념이 상호 모순되지 않는 한) 본원에 개시된 발명의 주제의 일부인 것으로 고려됨이 이해되어야 한다. 특히, 본 개시내용의 끝에 보이는 청구된 주제의 모든 조합은 본원에 개시된 발명의 주제의 일부인 것으로 고려되고 본원에 기재된 이익 및 이점을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

재료 및 방법

동물

C57BL/6 마우스는 The Jackson Laboratory(메인주 바 하버)에서 구입하였다. GLAST-/- 마우스는 도쿄 의과 치과 대학(Tokyo Medical & Dental University: TMDU)의 Kohichi Tanaka 박사가 제공하였다. 모든 연구는 마운트 시나이 의과 아이칸 학교(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)의 IACUC에 의해 승인된 동물 프로토콜과 일치하는 절차를 준수하였다. 수컷 마우스는 자기 마이크로비드 폐색 모델에 사용하였고; 어느 한 성별의 마우스는 다른 실험을 위해 상이한 그룹으로 무작위 배정하였다.

AAV 플라스미드 구축 및 AAV 제조

pAAV-GFP 플라스미드는 Kevin Park 박사(마이애미 대학)에 의해 친절하게 제공받았다. AAV 플라스미드 구축을 위해, pAAV-GFP의 단백질-코딩 영역을 다음 플라스미드의 cDNA로 대체하였다: CaMKIIα WT(Addgene #21226), CaMKIIα K42R(Addgene #21221), CaMKIIα T286D(Addgene #16736), CaMKIIβ WT(Addgene #21227), CaMKIIβ K43R(Addgene #21225), CaMKIIβ T287D(Addgene #21223) 및 VP16-CREB 및 A-CREB(둘 다 미시간 주립 대학의 Hongbing Wang 박사로부터 제공받음). GenScript(뉴저지주 피스카타웨이)는 CaMKIIα WT로부터 CaMKIIα K42D 및 CaMKIIα T286A, CaMKIIα T286D로부터 CaMKIIα T286D/T305A/T306A 및 CaMKIIα T286D/T305D/T306D, CaMKIIβ WT로부터 CaMKIIβ K43D 및 CaMKIIβ T287A, CaMKIIβ T287D로부터 CaMKIIβ T287D/T306A/T307A 및 CaMKIIβ T287D/T306D/T307D를 생성하였다. AAV-mSncg-GFP는 Yang Hu 박사(스탠포드 대학)에 의해 친절하게 제공받았으며 AAV-mSncg-EBFP 및 AAV-mSncg-CaMKIIα T286D를 생성하는 데 사용하였다. AAV Rap-Cap 및 헬퍼 플라스미드는 AAVpro 293T 세포주(Takara Bio, 632273)에서 공동 형질감염을 위해 사용하였다. 불연속 요오딕사놀 구배 초원심분리는 AAV를 정제하는 데 사용하였다. 실시간 PCR에 의해 결정된 AAV 역가는 밀리리터당 1-4 x 10¹³개 게놈 카피의 범위 이내였다.

유리체내 주사 및 망막 신경 압착

성체 마우스를 케타민(100 mg/kg) 및 크실라진(10 mg/kg)의 혼합물로 복강내 주사하여 마취시켰다. GLAST-/- 마우스 새끼를 얼음에서 냉각시켜 마취시키고, 30-게이지 바늘로 눈꺼풀에 작은 절개를 만들어 안구를 노출시켰다. 유리체내 주사를 위해, 마이크로피펫을 톱니 둘레(ora serrata) 바로 뒤에 삽입하고, AAV 또는 다른 용액을 유리체로 주입하였다. N-메틸-D-아스파르트산(Millipore Sigma, 454575) 및 미리스토일화 Autocamtide-2-관련 억제 펩티드(Millipore Sigma, 189482)를 PBS에서 제조하였다. 망막 신경 압착을 위해, 시신경을 노출시키고 안구 뒤 대략 1 mm를 5초 동안 쥬얼러 포셉을 사용하여 안와내로 압착하였다. 수술 후 각막을 보호하기 위해 안연고제를 도포하였다.

마우스에서 IOP 상승 유도

IOP를 상승시키기 위해, 3개월령 마우스를 케타민 및 크실라진의 혼합물로 마취시켰다. 수술 전에 프로파라카인 하이드로클로라이드 점안액을 사용하였다. 자기 마이크로비드(Dynabeads®M-450 Epoxy, Thermo Fisher Scientific)를 전방으로 일방적으로 주입하고 최근에 기재된 바와 같이(Ito 등, 2016), 자석을 사용하여 전방 주위에 고르게 분포시켰다. 양쪽 눈의 IOP를 제조업체의 지침에 따라 TonoLab 안압계를 사용하여 모니터링하였다.

조직학 및 현미경 검사

면역조직화학을 위해, 관류된 마우스로부터 수술로 제거된 시신경 분절이 부착된 눈을 4% PFA에 후고정시켰다. 전조직 표본 염색을 위해 망막을 해부하였다. 망막의 전조직 표본을 PBX 중 5% 정상 당나귀 혈청 및 0.1% Triton X-100을 함유하는 염색 완충액에서 1시간 동안 차단하였다. 망막을 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하고 PBS로 3x 15분 세척한 후 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 망막을 다시 PBS로 3x 15분 세척한 다음 Fluoromount-G로 장착하였다. 사용된 1차 항체: Tuj1(1:250, Biolegend, 801202), pCaMKII(1:100, Abcam, ab32678), pan-CaMKII(1:100, Abcam, ab52476), pCREB(1:100, Abcam, ab32096), pTrkB(1:100, Thermo Fisher Scientific, MA5-32207), DLK(1:100, Thermo Fisher Scientific, PA5-32173), p-c-Jun(1:100, Cell Signaling Technology, 2361). 사용된 펩티드: CaMKII 알파(포스포 T286) 펩티드(12.5 μg/ml, Abcam, ab115237). 사용된 2차 항체: Alexa Fluor®488 AffiniPure 당나귀 항-마우스 IgG(1:500, Jackson ImmunoResearch Labs, 715-545-151), Alexa Fluor®594 AffiniPure 당나귀 항-마우스 IgG(1:500, Jackson ImmunoResearch Labs, 715-585-151), Cy™3 AffiniPure 당나귀 항-토끼 IgG(1:500, Jackson ImmunoResearch Labs, 711-165-152), Alexa Fluor®594 AffiniPure 당나귀 항-토끼 IgG(1:500, Jackson ImmunoResearch Labs, 711-585-152), Alexa Fluor®647 AffiniPure 당나귀 항-토끼 IgG(1:500, Jackson ImmunoResearch Labs, 711-605-152). Zeiss LSM 800 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. RGC 카운팅 및 신호전달 경로 연구를 위해, 정사각형(320 x 320 μm)을 분석을 위한 각 망막 전조직 표본의 주변 영역 주위(정사각형 중심에서 망막 가장자리까지 ~500 μm)에서 샘플링하였다.

시각 경로 CTB 추적을 위해, 1.5 μl의 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB, Alexa Fluor™488 Conjugate, Thermo Fisher Scientific, C22841)(PBS 중 2 μg/μl)를 유리체에 주입하였다. CTB 주사 3일 후, 동물에게 4% PFA를 관류시켰다. 시신경을 해부하고, 고정시키고, 이미지화를 위해 장착하였다. 뇌를 해부하고, 고정시키고, 3% 아가로스에 장착하였다. 뇌 절편(150 μm 두께)을 바이브라톰(vibratome)(1000VT, Leica)을 사용하여 LGN의 경우 관상으로 또는 상구의 경우 시상으로 절개하고 이전에 보고된 바와 같이(Zhang 등, 2011) 이미지화를 위해 장착하였다. Zeiss LSM 800 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다.

홍채각막각에서 마이크로비드 축적을 시각화하기 위해, 관류된 마우스의 눈을 수집하고 4% PFA에 후고정시켰다. 각 눈의 전방 부분을 해부하고, OCT 화합물에 포매하고, 저온유지장치(cryostat)를 사용하여 절개하고, H&E로 염색하고, 컬러 카메라가 장착된 Zeiss LSM 800 현미경으로 이미지화하였다.

마이크로비드-주입된 눈의 축삭 생존 검사를 위해, 시신경을 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액 중 2.5% 글루타르알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드에 0.5시간 동안 실온에서 고정시킨 다음 2시간 동안 4℃에서 고정시켰다. 안구에서 1 mm 떨어진 시신경 영역을 수지에 포매하였다. 시신경의 반초박 절편을 톨루이딘 블루로 염색하고 100X 렌즈를 통해 컬러 카메라가 장착된 Zeiss LSM 800 현미경으로 이미지화하였다. 정사각형 영역(22 x 22 μm)을 분석을 위해 각 신경 부분의 말초 영역 주위(정사각형 중심에서 신경 가장자리까지 ~50 μm)를 샘플링하였다.

시신경 유두 분석을 위해, 관류된 마우스로부터 수술로 제거된 시신경 분절이 부착된 눈을 4% PFA에 후고정시켰다. 각막, 홍채, 및 수정체를 제거한 후, 냉동절편을 위해 눈을 OCT 화합물에 포매하였다. 시신경을 통해 절편을 수집하고, DAPI(Thermo Fisher Scientific, 62248)로 염색하고, Zeiss LSM 800 현미경으로 이미지화하였다.

이미지는 ImageJ(Schindelin 등, 2012) 및 Photoshop을 사용하여 분석하고 정리하였다.

RGC 정제 및 면역블롯팅

RGC 정제를 위해, 해부된 망막을 파파인에서 분해하고, 부드러운 피펫팅에 의해 단일 세포로 해리시켰다. 망막 세포 현탁액을 HBSS로 1 회 세척하고, HBSS+4% BSA에 재현탁하고 PE-Cyanine7 접합된 CD90.2(Thy-1.2) 항체(1:2,000, Thermo Fisher Scientific, 25-0902-81)와 함께 15분 동안 인큐베이션하여 세포 분류를 위해 RGC로 표지하였다(Lu 등, 2020). 과량의 HBSS로 다시 세척하고 HBSS+4% BSA에 재현탁한 후, 여과 전에 DAPI(1mg/ml, 1:1000, Thermo Fisher Scientific, 62248)를 첨가하여 죽은 세포를 표지하였다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 BD FACSAria II 분류기(BD Biosciences)에서 수행하여 RGC를 수집하였다.

면역블롯팅을 위해, 정제된 RGC를 Laemmli 샘플 완충액에서 95℃로 가열하여 용해시켰다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막에 전기전달하였다. 항체: pCaMKII(1:1000, Abcam, ab32678), WesternSure 염소 항-토끼 HRP(1:50000, LI-COR Biosciences, 926-80011), 재조합 HRP 항-GAPDH 항체(1:400000, Abcam, ab201822). 화학발광 검출을 위해 SuperSignal™ West Atto Ultimate Sensitivity Substrate(Thermo Fisher Scientific, A38555) 및 ChemiDoc Touch Imaging System(Bio-Rad)을 사용하였다. 이미지는 ImageJ(Schindelin 등, 2012) 및 Photoshop을 사용하여 분석하였다.

패턴 망막전위도검사(PERG)

PERG를 PERG 시스템을 사용하여 이전에 보고된 바와 같이 기록하였다(Chou 등, 2014; Williams 등, 2017). 마우스를 케타민/크실라진의 혼합물을 사용하여 마취시켰다. 동물의 체온을 피드백 제어 가열 단계로 37℃에서 유지하고 직장 프로브를 사용하여 모니터링하였다. 각막 건조를 방지하기 위해 필요에 따라 소량의 균형잡힌 식염수를 국소로 도포하였다. PERG 신호를 약간 상이한 주파수에서 2개의 LED 태블릿에서 교대로 생성된 격자의 대비 반전(0.05 사이클/도, 100% 대비)에 반응하여 주둥이에 배치된 피하 스테인리스 강 바늘로부터 기록하였다. 기준 및 접지 전극은 각각 머리 뒤쪽 및 꼬리 뿌리에서 내측에 배치된 유사한 바늘이었다. 전기 신호를 10,000 배 증폭하고 대역 통과 필터링하였다(1-300 Hz). 독립적인 PERG 반응을 비동기 평균화 방법을 사용하여 검색하였다. AAV 주사 및 NMDA 처리를 각 마우스의 한쪽 눈에서 일방적으로 수행하였다.

패턴 시각 유발 전위(PVEP)

PVEP 기록을 위해, 유리체내 NMDA 주사 3일 후 스테인리스 강 마이크로스크류(0.8 mm OD, 인치당 120개의 스레드, NAS721CE80-120, Antrin Miniature Specialties)를 기준 전극의 경우) 주둥이에서 전정(bregma)으로 2 mm 및 시옷점(lambda)에 수평으로 2 mm(활성 전극의 경우, 반대측성 1차 시각 피질 위에 놓임)에서 마우스 두개골에 이식하였다. 마이크로스크류 전진을 400 μm 피질 깊이로 설정하였는 데, 이 깊이에서 PVEP가 최대 진폭을 갖는다(Porciatti 등, 1999). 포매 수술 1주일 후 PVEP를 기록하였다. 마우스를 마취시키고 기록이 진행되는 동안 따뜻하게 유지하였다. 각막 건조를 방지하기 위해 필요에 따라 소량의 균형잡힌 식염수를 도포하였다. 악어 클립이 달린 전극(ETL-36RSAF, The Electrode Store)을 사용하여 두개골에서 나사를 연결하였다. 접지 전극을 꼬리의 뿌리에 배치하였다. 시스템을 사용하여 패턴화된 자극(0.05 사이클/도의 격자, 100% 대비)을 나타내고 PVEP 신호를 수집한다. 전기 신호를 10,000 배 증폭하고 대역 통과 필터링하였다(1-100 Hz). 전형적인 PVEP 반응은 약 100 ms에서 주요 음파 정점을 나타낸다(Porciatti 등, 1999). AAV 주사 및 NMDA 처리를 각 마우스의 한쪽 눈에서 일방적으로 수행하였다. 반대측성 눈은 빛을 차단하였고, 디스플레이 화면은 임의의 가능한 기여를 제거하기 위해 꼈다.

시각적 수중 작업에서 예민함 측정

시각적 예민함은 이전에 보고된 바와 같이 Acumen 시스템(Cerebral Mechanics)을 사용하여 측정하였다(Ecker 등, 2010; Prusky 등, 2000). 작업은 얕은 물을 함유하는 사다리꼴 모양 탱크에서 수행하였다. 탱크의 넓은 끝 양쪽에 2개의 디스플레이 화면이 있다. 고정된 수직 방향 사인파 격자는 2개 화면 중 하나에 무작위로 표시된 반면, 다른 화면에는 동일한 평균 휘도의 균질한 회색 이미지가 표시되었다. 동물을 좁은 끝에서 넓은 끝 화면을 향해 수영하고, 고정된 거리에서, 격자를 나타내는 화면을 선택하고 그 아래 숨겨진 물속에 잠긴 플랫폼을 탈출하도록 훈련시켰다. 훈련 격자는 0.054 사이클/도의 공간 주파수로 설정하였다. 테스트 동안, 격자의 공간 주파수는 휴식까지 0.018 사이클/도의 간격으로 서서히 증가하였으며, 여기서 동물은 10회 시험 중 7회 미만의 올바른 선택을 하였다. 동물이 시각적 예민함(공간 주파수 임계값)에 도달하였음을 결정하기 위해 서로 가까이 적어도 4회 휴식이 필요하다. 각 공간 주파수에서 올바른 선택의 누적 백분율을 산점도에 대해 계산하였다. 가장 적합한 추세선이 생성되었고 70% 올바른과 교차하는 곡선의 지점을 시력 임계값으로 채택하였다. 손상을 유도하기 위한 NMDA 주사 전에 마우스를 훈련시키고 그들의 시각적 예민함을 측정하였다. NMDA 주사 후 1일부터 3일까지, 마우스를 낮은(훈련) 공간 주파수에서 매일 테스트하여 훈련 활동을 유지하였다. NMDA 주사 후 4일부터 14일까지, 본 발명자들은 각 마우스에 대한 임계값(예민함)이 결정될 때까지 공간 주파수를 변경하였다.

시각 절벽 테스트

시각 절벽 장치는 Conduct Science(매사추세츠주 보스턴)에서 구입하였다. 시각 절벽 테스트 장치는 중앙 플랫폼(높이 1.5 인치 및 너비 2 인치)에 의해 2개 영역으로 분리된 62 x 62 x 19 cm 치수의 투명한 플렉시글라스 상자로 이루어지며, 얕은 쪽은 바로 아래에 체크무늬 패턴이 있고, 깊은 쪽은 2 피트 아래에 배치된 동일한 체크무늬 패턴이 있어 깊이 착시를 생성한다(Fox, 1965; Gu 등, 2018). 마우스를 중앙 플랫폼에 배치하였고, 물러나는 선택을 기록하였다. 각 마우스를 테스트에 한번씩 적용하였다. 각 테스트 후 상자 및 중앙 플랫폼을 철저하게 청소하였다.

어렴풋한 시각 자극 반응 검사

어렴풋한 시각 자극 반응에 대한 테스트를 기재된 바와 같이 80/20 Inc.(인디애나주 컬럼비아 시티)에서 구입한 재료로 구축된 17 인치 x 20 인치 x 12 인치 치수의 인클로저(enclosure)에서 수행하였다(Koehler 등, 2019). 은신처로서 역할을 하도록 5-인치 너비 판자를 인클로저의 한쪽 끝에 3 인치 높이로 배치하였다. 마우스가 환경을 탐색하고 은신처의 외부에 계속 있도록 장려하기 위해 은신처 반대쪽에 음식 조각을 배치하였다. 모니터를 인클로저의 상단에 배치하여 어렴풋한 자극을 표시하였으며, 이는 Blender 소프트웨어를 사용하여 만들어진 회색 바탕에 검은색 디스크가 확장되는 비디오이다. 자극 매개변수는 이전 연구에서 채택하였으며(Yilmaz and Meister, 2013), 250 밀리초 내에 반경 2-도에서 20-도까지 확장하는 원으로 이루어지며, 250 밀리초 동안 유지되었다. 자극은 프레젠테이션 사이에 500-밀리초 간격으로 15 회 표시되었다. 오버헤드 카메라는 마우스 행동을 기록하였다. 마우스를 자극 개시 전에 10분 동안 인클로저에 배치하여 순응할 시간을 허용하였다. 어렴풋한 자극 동안 3가지 반응을 평가하였다: 얼어붙기, 도망치기, 및 꼬리 흔들기(Koehler 등, 2019; Lim 등, 2016; Salay 등, 2018; Yilmaz and Meister, 2013). 마우스가 자극 과정 동안 이러한 행동 중 적어도 하나를 입증한 경우, 양성 어렴풋한 반응자로 집계하였다. 각 마우스를 테스트에 한번씩 적용하였다. 각 테스트 후 인클로저는 철저하게 청소하였다.

정량화 및 통계 분석

통계 분석을 위해 Excel 및 GraphPad Prism 9를 사용하였다. 각 실험에 대한 통계 세부사항은 모두 도면 범례에 기재되어 있다.

주사 및 손상 치료가 각 마우스에 대해 양쪽 눈에서 양쪽으로 수행된 행동 테스트의 경우, 표시된 "n"은 개별 마우스를 나타내고; 주사 및 손상 치료가 각 마우스에 대해 한쪽 눈에서 일방적으로 수행된 다른 테스트의 경우, 표시된 "n"은 개별 눈을 나타내며 따라서 마우스당 하나의 눈만 통계 분석에 사용하였다.

독립표본 t-검정을 사용하여 2개 그룹을 비교하였다. Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 ANOVA와, 각 그룹을 모든 다른 그룹과 비교하는 후속 테스트를 사용하여 여러 그룹을 비교하였다. Fisher의 정확도 테스트를 사용하여 시각 절벽 테스트 및 어렴풋한 시각 자극 반응 테스트에서 그룹을 비교하였다. P-값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

1. 흥분독성 및 축삭 손상은 RGC에서 CaMKII 활성 손실을 야기한다.

CaMKII는 포유동물에서 4개의 이소형(α, β, γ, 및 δ)을 가지며, 각 이소형은 상이한 유전자로부터 발현된다(Hudmon and Schulman, 2002b). CaMKIIα 및 CaMKIIβ는 설치류 망막에서 고도로 발현되는 2개의 주요 이소형이다(Terashima 등, 1994). CaMKII의 활성화는 NMDAR를 통한 Ca²⁺ 유입 및 후속 Ca²⁺/칼모듈린 결합에 의해 개시되고; CaMKII의 결과적인 형태 변화는 CaMKIIα의 경우 트레오닌 286(T286) 또는 CaMKIIβ의 경우 트레오닌 287(T287)에서 자가인산화를 허용하며, 이는 두 이소형의 지속적인 활성화에 중요하다(Miller 등, 1988; Schworer 등, 1988; Thiel 등, 1988). 자가인산화가 발생하는 경우, CaMKII는 Ca²⁺농도가 떨어진 후에도 활성을 유지한다(Lisman 등, 2002).

CaMKIIα/β 자가인산화를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여(도 2a-2f), 본 발명자들은 망막의 손상 후 RGC에서 CaMKII 인산화를 조사하였다. 먼저, 본 발명자들은 RGC를 손상시키기 위해 8주령 C57BL/6 마우스의 유리체방에 독성 수준의 NMDA(20 mM, 1.5 μl)를 주사한 후 NMDA-유도 흥분독성을 사용하여 RGC 소마를 손상시켰다(Manabe and Lipton, 2003; Seitz and Tamm, 2013). PBS 주사를 사용한 대조군 망막에서, CaMKII는 망막의 플랫 마운트(flat-mount) 제제에서 Tuj1 면역반응성에 의해 표지된 RGC에서 고도로 인산화된 반면(도 1a-1c); NMDA 주사를 사용한 망막에서, CaMKII는 주사 2시간 후 Tuj1+ RGC에서 대량으로 탈인산화되었다(도 1d-1h). 정제된 RGC를 사용한 면역블롯팅은 NMDA-유도 흥분독성 후 CaMKII 인산화에서 유의한 감소를 입증하였다(도 2g 및 2h). CaMKII 활성의 손실은 NMDA 주사 후 1주에 80% 초과의 RGC 손실과 상관관계가 있었다(도 3a 및 3e).

다음으로, 본 발명자들은 망막 신경 압착(ONC) 모델을 사용하여 RGC 축삭 손상 후 CaMKII 활성 변화 여부를 조사하였다. ONC에 의해 야기된 축삭절단은 RGC의 사멸을 지연시키며, 손상 2주 후 RGC의 거의 80%가 손실된다(Berkelaar 등, 1994; Hu 등, 2012). 본 발명자들은 8주령 C57BL/6 마우스에서 ONC를 수행하고 RGC 변성 과정 동안 압착 후 5, 7 및 9일(dpc)에 CaMKII 인산화를 분석하였다. 손상되지 않은 망막의 모든 RGC에서 CaMKII의 균일한 인산화와 비교하여(도 1i-1k), 손상 후 각 시점에서, RGC의 일부(~10%)가 CaMKII 활성을 손실하였으며, 이는 축삭절단 후 RGC의 점진적인 손실과 일치한다(도 1l-1v). 전반적으로, 이러한 결과는 RGC 소마에 대한 흥분독성 또는 RGC 축삭에 대한 시신경 손상이 RGC 손실 전에 CaMKII 활성의 손실을 초래하였음을 보여준다.

CaMKII 활성은 손상되지 않은 망막의 모든 RGC에서 고도로 검출가능하므로(도 1b 및 1j), 본 발명자들은 CaMKII 활성이 정상 RGC 활성에 필요한지 여부를 조사하였다. CaMKII 활성은 CaMKII의 매우 강력하고 특이적인 기질 경생 억제제인 미리스토일화 Autocamtide-2-관련 억제 펩티드(AIP, 1 mM, 1.5μl)의 매일 유리체내 주사(7일에 걸쳐 7회 주사)에 의해 억제되었다(Goebel, 2009; Laabich and Cooper, 2000). AIP 주사 1주 후, 비히클 대조군과 비교하여 RGC의 약 절반이 손실되었다(도 1w-1y). 이러한 결과는 CaMKII 활성이 정상 망막에서 RGC의 생존에 필수적임을 나타낸다.

2. CaMKII의 재활성화는 RGC를 흥분독성 또는 축삭 손상으로부터 보호한다.

CaMKII의 활성을 향상시키는 것이 RGC를 흥분독성 또는 축삭 손상으로부터 보호하기에 충분한지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 NMDA 주사 또는 ONC를 통해 손상을 개시하기 2주 전에 8주령 C57BL/6 마우스의 RGC에 CaMKII 변이체의 AAV2-매개 유전자 전달을 위한 유리체내 주사를 수행하였다. AAV2는 RGC의 95% 초과를 형질도입하는 데 효과적이었다(도 4a-4d)(Park 등, 2008). RGC에서 CaMKII 변이체의 발현 수준은 AAV 주사 2주 후 상대 pan-CaMKII 면역형광 강도를 기준으로 하여 내인성 CaMKII의 ~60%였다(도 4e-4k).

먼저, 본 발명자들은 RGC 소마가 NMDA-유도 흥분독성에 의해 손상되었을 때 CaMKIIα 변이체의 보호 효과를 조사하였다. NMDA 투여 1주 후, Tuj1⁺ RGC의 수는 AAV2-EBFP를 주사한 대조군 그룹과 비교하여 야생형 CaMKIIα-처리된 망막에서 거의 두 배가 되었으며(~34%), 이 경우 RGC의 ~15%만 남아있었다(도 3a, 3b, 및 3e). 키나제 활성이 CaMKIIα-매개 RGC 보호에 필수적인지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 키나제 활성에 필요한 ATP-결합을 방지하기 위해 효소의 촉매 코어 내에서 보존된 리신 잔기를 아르기닌 또는 아스파르트산으로 대체함으로써 2개의 키나제-사멸 돌연변이체인 CaMKIIα K42R 및 CaMKIIα K42D를 테스트하였다(Hanson 등, 1994). 본 발명자들은 CaMKIIα K42R(도 3a, 3c, 및 3e) 또는 CaMKIIα K42D 처리(도 5a, 5b, 및 5f)로 RGC 생존의 개선이 없음을 관찰하였으며, 이는 CaMKII 키나제 활성이 RGC를 NMDA-유도 흥분독성 RGC 사멸로부터 보호하는 데 필요함을 나타낸다.

CaMKII 활성의 추가 향상이 흥분독성 손상에 대응하는 데 보다 효과적일 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 자가인산화된 상태를 모의하는 CaMKIIα의 구성적으로 활성 돌연변이체인 CaMKIIα T286D를 테스트하였다(Fong 등, 1989). 놀랍게도, CaMKIIα T286D는 대조군 그룹에서 생존 RGC의 작은 비율(~15%)과 비교하여 NMDA 주사 후 1주에 대다수의 RGC(~90%)를 강력하게 보호하였다(도 3a, 3d, 및 3e). 그러나, 자가인산화-결핍 돌연변이체 CaMKIIα T286A(Fong 등, 1989)는 RGC를 보호하는 데 있어서 CaMKIIα T286D보다 훨씬 덜 효과적이었다(도 55a 및 5f).

T286에서 CaMKIIα의 자가인산화 외에도, 칼모듈린-결합 도메인 내의 T305 및 T306에서 인산화는 또한 키나제 활성을 조절한다. T286 인산화 및 Ca2+/CaM 해리 후, T305 및 T306에서 CaMKIIα의 자가인산화는 칼모듈린 결합에 대한 민감성을 파괴하고 따라서 추가 활성화를 방지한다(Coultrap 등, 2010; Patton 등, 1990). 해마 뉴런에서, T305 및 T306에서 인산화는 척추 크기 및 시냅스 강도의 CaMKIIα T286D-매개 제어, 뿐만 아니라 장기 강화작용(LTP) 또는 장기 억압(LTD) 유도에 참여한다(Pi 등, 2010a; Pi 등, 2010b). T305 및 T306에서 CaMKIIα의 추가 인산화가 RGC 생존에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 RGC 소마에 대한 흥분독성 손상 후 CaMKIIα T286D/T305A/T306A(T305/T306의 비인산화된 형태) 및 CaMKIIα T286D/T305D/T306D(T305/T306의 가인산화된 형태)의 처리 효과를 테스트하였다. CaMKIIα T286D/T305A/T306A는 NMDA 주사 후 1주에 RGC의 ~90%를 보호한 반면(도 5d 및 5f); CaMKIIα T286D/T305D/T306D는 RGC의 ~80%를 보호하였으며, 이는 T286D/T305A/T306A와 비교하여 RGC를 보호하는 데 있어서 약간 덜 효과적이다(도 5e 및 5f). 이러한 결과는 T305 및 T306에서 인산화가 RGC를 보호하는 데 있어서 CaMKIIα T286D의 최대 효과를 어느 정도 방해할 수 있음을 시사한다.

본 발명의 AAV2 발현 시스템에서 유비쿼터스 CAG 프로모터는 RGC의 95% 초과 뿐만 아니라 몇몇 다른 비-RGC 세포에서 이식유전자 발현을 구동한다(Park 등, 2008). CaMKII-매개 RGC 보호가 실제로 세포 자율적 방식으로 이식유전자 발현에 의한 것이었는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 마우스 RGC에서 AAV2-매개 이식유전자 발현을 구동하는 최근에 개발된 RGC-특이적 프로모터인 마우스 γ-시누클레인 프로모터(mSncg)를 사용하여(Wang 등, 2020), RGC에 대한 CaMKII 발현을 제한하였다. NMDA 주사 1주 후, CaMKIIα T286D의 AAV2-mSncg-매개 발현은 AAV2-CAG에 의해 매개된 것만큼 효과적으로 RGC를 보호하였으며(도 5g-5i), 이는 RGC에서 CaMKIIα T286D의 세포 자율적 발현이 NMDA-유도 흥분독성으로 이들을 보호하는 데 필수적임을 나타낸다.

CaMKIIβ는 마우스 망막에서 발현되는 다른 주요 이소형이므로, 본 발명자들은 NMDA-유도 흥분독성 후 CaMKIIβ 변이체의 보호 효과를 조사하였다. CaMKIIα 처리로부터 수득된 보호 효과와 유사하게, 야생형 CaMKIIβ는 적당한 보호 효과를 보인 반면, 구성적으로 활성인 돌연변이체 CaMKIIβ T287D는 NMDA 주사 1주 후 RGC를 보호하는데 있어서 훨씬 더 강력하였다(도 3f, 3g, 3i, 및 3j). 예상대로, 자가인산화-결핍 돌연변이체 CaMKIIβ T287A는 CaMKIIβ T287D에 비해 훨씬 적은 RGC를 보호하였다(도 5l 및 5o). 칼모듈린-결합 도메인 내의 T306 및 T307에서 인산화는 또한 CaMKIIβ T287D의 보호 효과를 약간 감소시켰으며, 이는 삼중 돌연변이체 CaMKIIβ T287D/T306A/T307A 또는 CaMKIIβ T287D/T306D/T307D를 사용한 치료 효과를 입증하였다(도 S3m-S3o). RGC의 CaMKIIβ-매개 보호는 분명히 키나제-사멸 돌연변이체 CaMKIIβ K43R(도 3h 및 3j) 또는 CaMKIIβ K43D(도 5k 및 5o)가 동일한 실험 조건 하에 RGC를 보호하지 못했기 때문에 키나제 활성에 또한 의존하였다.

다음으로, 본 발명자들은 RGC 축삭이 ONC에 의해 손상되었을 때 CaMKIIα 변이체의 보호 효과를 조사하였다. ONC 2주 후, 생존 RGC의 수(~49%)는 AAV-EBFP가 주입된 대조군 그룹에서 생존 RGC(~22%)와 비교하여 야생형 CaMKIIα 처리로 두 배 이상이 되었다(도 3k, 3l, 및 3o). 그러나, 키나제-사멸 돌연변이체 CaMKIIα K42R은 보호가 없음을 보여주었으며(도 3m 및 3o), 이는 CaMKII의 키나제 활성이 또한 RGC를 축삭절단-유도 세포 사멸로부터 보호하는 데 필요함을 나타낸다. 놀랍게도, 구성적으로 활성인 돌연변이체 CaMKIIα T286D는 가장 효과적인 보호 효과를 나타내었는 데, 손상 2주 후 RGC의 ~90%가 생존하였다(도 3n 및 3o). 예상대로, CaMKIIβ 변이체는 CaMKIIα 대응물과 유사한 보호 효과를 나타내었으며, CaMKIIβ 활성이 구성적으로 활성인 돌연변이체 CaMKIIβ T287D로 추가로 향상되었을 때 키나제 활성에 대한 필요성 및 놀라운 보호 효과를 확인하였다(도 3p-3t).

2개의 손상 모델을 사용하여, 본 발명의 결과는 RGC 소마에 대한 흥분독성 손상 또는 RGC 축삭에 대한 ONC 손상이 RGC 사멸 전에 CaMKII 불활성화를 필연적으로 야기함을 입증한다. 구성적으로 활성인 CaMKII 돌연변이체의 유전자 전달을 통한 CaMKII의 재활성화는 RGC를 두 손상으로부터 강력하게 보호한다. CaMKIIα T286D는 RGC에 대한 가장 강력한 보호를 나타냈기 때문에, 본 발명의 후속 연구의 초점이 되었다.

3. CaMKII 재활성화는 RGC의 손상후 및 장기 보호를 제공한다.

임상적으로 관련된 설정을 모방하기 위해, 본 발명자들은 CaMKII가 손상 후 재활성화될 때 RGC를 보호할 수 있는지 여부를 테스트하였다. 흥분독성 모델에서 RGC 변성은 AAV-매개 유전자 발현이 효과를 발휘하기에 너무 빠르지만, 망막 신경 압착 모델에서 RGC의 상대적으로 더 느린 변성은 AAV-매개 유전자 요법에 필요한 시간 창을 허용할 수 있다(Sun 등, 2011). 따라서, 본 발명자들은 ONC 직후 유리체내 AAV 주사를 수행하였다. 2주 후, RGC의 ~70%가 CaMKIIα T286D 처리 그룹에 남아있으며, EBFP의 AAV-매개 유전자 전달을 받은 대조군 그룹에 비해 생존율은 3배가 되었다(도 6a-6c). 이러한 결과는 CaMKII의 지연된 재활성화가 손상 개시 후 RGC를 강력하게 보호할 수 있음을 나타낸다.

CaMKII 재활성화는 NMDA-유도 흥분독성 1주 후 또는 ONC 2주 후 대다수의 RGC를 보호하였다. CaMKIIα T286D 처리의 장기 보호 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 흥분독성 또는 축삭 손상 후 훨씬 나중에 RGC 생존을 검정하였다. RGC 소마에 대한 흥분독성 손상 후, AAV-EBFP를 받은 대조군 그룹에서 RGC 수는 2개월에 ~12%(도 6d)에서 12개월에 남아있는 RGC ~8%(도 6e)까지 계속 감소하였다. 놀랍게도, CaMKIIα T286D 처리는 각각 손상 2개월 및 12개월 후 생존하는 RGC의 ~84% 및 ~77%를 초래하였다(도 6f-6h). 다음으로, 본 발명자들은 ONC가 RGC 축삭을 손상시킨 후 장기 RGC 생존을 조사하였다. ONC 후 1, 2, 및 6개월에 AAV-EBFP를 받은 대조군 그룹에서 RGC의 ~17%, ~12%, 및 ~7%만이 남아있는 반면(도 6i-6k 및 6o), CaMKIIα T286D 처리는 동일한 시점에 RGC의 ~82%, ~81%, 및 ~77%를 보호하였다(도 6l-6o). 종합하면, 이러한 결과는 CaMKII 재활성화가 흥분독성 또는 축삭 손상으로부터 RGC의 장기 보호를 제공할 수 있음을 입증한다.

4. CREB는 RGC를 보호하는 데 있어서 CaMKII의 하류에서 작용한다.

CaMKII-매개 RGC 보호의 하류 신호전달을 설명하기 위해, 자극-유도 전사 인자인 CREB(cAMP 반응 요소 결합 단백질)가 특히 관심 대상이었는 데, CREB가 시냅스 가소성 및 장기 기억 형성을 조절하는 데 있어서 CaMKII의 하류에서 중요한 역할을 하기 때문이다(Deisseroth 등, 1996; Ma 등, 2014). CREB는 또한 뇌 뉴런의 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다(Lonze and Ginty, 2002). 그러나, 망막 뉴런의 생존을 조절하는 데 있어서 CREB의 역할은 아직 결정되지 않았다. CREB는 CaMKII 및 다른 키나제에 의해 Ser133에서 인산화되며, 인산화 이벤트는 CREB의 전사 활성에 필요하다(Sheng 등, 1991).

먼저, 본 발명자들은 CREB가 NMDA-유도 흥분독성 모델에서 RGC를 보호하기 위해 CaMKII의 하류에서 작용하는지 여부를 조사하였다. Ser133에서 인산화된 CREB를 인식하는 항체를 사용하여, 본 발명자들은 CREB가 손상되지 않은 망막의 거의 모든 Tuj1⁺ RGC에서 고도로 인산화되었음을 밝혀내었다(도 7a, 7d, 및 7e). 그러나, NMDA 주사 2시간 후 RGC에서 CREB 인산화의 대규모 손실이 발생하였으며(도 7b, 7e, 및 7e), 이는 손상된 CREB 활성이 흥분독성 손상 후 RGC에서 CaMKII 불활성화의 하류에 있을 수 있음을 나타낸다. 이어서 본 발명자들은 CaMKII 재활성화가 NMDA 주사 후 CREB 활성을 복원할 수 있는지 여부를 조사하였다. 실제로, CaMKIIα T286D의 AAV2-매개 유전자 전달은 NMDA 손상에 노출된 거의 모든 RGC에서 CREB 인산화를 유지하는 데 충분하였다(도 7c, 7d, 및 7e).

CaMKII의 하류에 있는 RGC를 보호하는 데 있어서 CREB의 역할을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 내인성 CREB 단백질에 결합하고 CREB가 DNA에 결합하는 것을 방지하는 CREB의 우성 음성 변이체인 A-CREB와 함께 CaMKIIα T286D의 AAV2-매개 유전자 전달을 수행하였다(Ahn 등, 1998). AAV2 전달은 NMDA 주사 2주 전에 8주령 C57BL/6 마우스에서 수행하였고, 본 발명자들은 흥분독성 손상 1주 후 RGC 생존을 분석하였다. CaMKIIα T286D-매개 RGC 보호는 A-CREB 공동 처리로 거의 중화되었으며(도 7f-7h), 이는 CREB 활성화가 흥분독성 손상으로부터 CaMKII-매개 RGC 보호에 필요함을 나타낸다. 실제로, A-CREB 공동 처리는 NMDA 주사 2시간 후 RGC에서 CaMKIIα T286D에 의해 CREB 인산화를 유의하게 손상시켰다(도 8a-8d). CaMKII 활성화와 무관하게, CREB 단독의 활성화가 RGC를 흥분독성으로부터 보호하기에 충분한지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 NMDA 주사 2주 전에 CREB의 구성적으로 활성 변이체인 VP16-CREB(Barco 등, 2002)의 AAV2-매개 유전자 전달을 수행하고, 손상 1주 후에 RGC 생존을 분석하였다. 분명히, VP16-CREB 처리 단독은 대부분의 RGC(~65%)를 보호하였다(도 7i-7k). 해마에서 유사한 역할과 일치하게(Zhang 등, 2016), VP16-CREB는 NMDA 주사 2시간 후 RGC에서 CREB 인산화를 유지하였다(도 8e-8h). VP16-CREB의 보호 효과(188.7± 25.4 RGC/0.1mm²)는 CaMKIIα T286D의 보호 효과(251.2± 16.9 RGC/0.1mm²)보다 더 약했으며, 이는 흥분독성으로부터 RGC를 보호하는 데 있어서 CaMKII의 하류에 있는 다른 식별되지 않은 인자가 있을 수 있음을 시사한다.

BDNF(뇌 유도 신경영양 인자) /TrkB(트로포마이오신-관련 키나제 수용체 유형 B) 신호전달은 RGC의 신경 보호에 기여하고, 흥분독성은 이 경로를 하향조절한다(Chitranshi 등, 2019; Gomes 등, 2012). CaMKIIα T286D 처리가 BDNF/TrkB 신호전달에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 BDNF 결합에 의해 개시된 하류 신호 전달에 필수적인 TrkB 인산화를 조사하였다(Nagahara and Tuszynski, 2011). Tyr817에서 TrkB의 인산화는 손상되지 않은 망막의 RGC에서 용이하게 검출가능하였으며; NMDA 손상은 RGC에서 포스포-TrkB의 유의한 감소를 초래하였고, 이는 CaMKIIα T286D 처리에 의해 구제되었다(도 8i 및 8j). 이러한 결과는 CREB 외에도, CaMKII 재활성화가 흥분독성 손상 후 RGC 생존을 촉진하는 데 있어서 BDNF/TrkB 신호전달과 같은 다른 경로에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.

다음으로, 본 발명자들은 CREB가 ONC-유도된 축삭 손상 모델에서 RGC를 보호하기 위해 CaMKII의 하류에서 작용하는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 ONC 후 5, 7, 및 9일에 Ser133에서 CREB 인산화를 인식하는 항체를 사용하여 CREB 활성을 분석하였다. 손상되지 않은 망막의 RGC에서 균일한 CREB 인산화와 비교하여(도 7l), RGC의 비율(~10%)은 조사된 각 시점에서 CREB 인산화를 손실하였다(도 7m-7o, 7s, 및 7t). CREB 활성의 점진적인 손실은 ONC 후 CaMKII 활성의 점진적 손실과 일치하며(도 1l-1v), 이는 손상된 CREB 활성이 RGC 축삭 손상 후 CaMKII 불활성화의 하류에 있을 수 있음을 나타낸다. 다음으로, 본 발명자들은 CaMKII 재활성화가 ONC 후 CREB 인산화를 구제할 수 있는지 여부를 조사하였다. 실제로, CaMKIIα T286D의 AAV-매개 유전자 전달은 손상 후 거의 모든 Tuj1⁺ RGC에서 CREB 인산화를 유지하였다(도 7p-7t). 흥분독성 모델에서의 관찰과 유사하게, RGC 축삭 손상 2주 후 CaMKII-매개 RGC 보호를 위해 CREB 전사 활성이 필요하였는 데, 이는 우성 음성 변이체 A-CREB가 CaMKIIα T286D에 의해 매개된 보호 효과를 중화하였기 때문이다(도 7u-7w). 예상대로, A-CREB 공동 처리는 ONC 5일 후 RGC에서 CaMKIIα T286D-매개 CREB 인산화를 유의하게 손상시켰다(도 8k-8n). 반대로, 구성적으로 활성인 변이체 VP16-CREB의 유전자 전달에 의한 CREB 활성 단독을 향상시키면 ONC 5일 후 RGC에서 CREB 인산화를 유지하였고(도 8o-8r) 축삭 손상으로부터 RGC를 효율적으로 보호하였다(도 7x-7z).

DLK(이중 류신 지퍼 키나제)/c-Jun 경로는 시신경 손상 후 RGC 세포 사멸의 우성 매개인자이다(Watkins 등, 2013; Welsbie 등, 2013). CaMKIIα T286D 처리가 DLK/c-Jun 경로를 조절하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 세린 63에서 DLK 발현 및 c-Jun 인산화를 조사하였다. 이전에 보고된 바와 같이, DLK 및 c-Jun 인산화 수준은 손상되지 않은 망막에서 매우 낮았고 ONC 3일 후 극적으로 상향조절되었다. 그러나, CaMKIIα T286D 처리는 이러한 변화에 영향을 미치지 않았으며(도 8s-8v), 이는 시신경 손상으로부터 CaMKIIα-매개 RGC 보호가 DLK/c-Jun 경로를 억제함으로써 작용하지 않을 수 있음을 나타낸다.

종합하면, 본 발명의 결과는 CREB가 소마에 대한 흥분독성 또는 축삭에 대한 압착 손상으로부터 RGC를 보호하는 데 필요하고 충분하므로 CaMKII의 주요 하류 효과기임을 입증한다.

5. 녹내장의 유도된 모델 및 유전적 모델에서 RGC의 CaMKII-매개 보호.

RGC 축삭의 진행성 변성 및 각각의 소마의 후속 손실을 특징으로 하는 녹내장은 전 세계적으로 되돌릴 수 없는 실명의 주요 원인이다. 녹내장의 병인은 잘 이해되지 않지만, 전형적으로 상승된 안압(IOP)과 연관되어, RGC 축삭 손상 및 RGC의 결과적 사멸을 야기한다(Calkins, 2012; Nickells 등, 2012; Weinreb 등, 2016).

본 발명자들은 먼저 CaMKIIα T286D의 유전자 전달이 고혈압 의존적 녹내장의 마우스 모델에서 RGC를 보호하는지 여부를 테스트하였다. 고안압증(ocular hypertension)을 유도하기 위해, 본 발명자들은 자기 마이크로비드를 전방에 주입하여 방수 유출을 막았다(도 9a 및 9b)(Ito 등, 2016). 그 결과, IOP는 이후 8주 동안 지속적인 상승을 보였다(도 9c). 본 발명자들은 마이크로비드 주사 2주 전에 대조군으로서 CaMKIIα T286D 또는 EBFP의 처리를 위해 AAV의 유리체내 주사를 수행하고, 고안압증의 유도 8주 후에 RGC 생존을 분석하였다. CaMKII 발현 수준은 마이크로비드 주사 2주 후에 상대 pan-CaMKII 면역형광 강도를 기준으로 ~60% 증가하였다(도 10a-10e). 대조군 그룹에서 생존 RGC의 ~60%와 비교하여, CaMKIIα T286D 처리는 RGC의 ~82%를 보호하였으며(도 9d-9f), 이는 CaMKII 증대가 상승된 IOP로부터 손상이 지속적으로 진행될 때 RGC를 보호하는 데 효과적임을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 안구 뒤 1 mm에서 수집된 시신경 절편에서 축삭 생존을 조사하고(Yang 등, 2016) CaMKIIα T286D 처리가 RGC 축삭의 유의한 보호를 제공하였음을 밝혀내었다(도 10f-10i).

상승된 IOP가 녹내장에 대한 가장 잘 알려진 위험 인자이지만, 정상 압력에도 불구하고 상당한 수의 환자에서 질환이 발생한다. 정상 안압 녹내장 모델이 글루타메이트 수송체 Glast가 결핍된 마우스(GLAST-/-)(Harada 등, 2007)는 세포외액에 글루타메이트의 축적, 뿐만 아니라 증가된 산화 스트레스로 인해 RGC의 특징적 변성을 보여준다. 본 발명자들은 CaMKIIα T286D의 유전자 전달이 GLAST-/- 마우스의 정상 안압 녹내장 모델에서 RGC를 보호하는지 여부를 테스트하였다. GLAST 결핍 마우스에서 RGC 사멸의 개시는 대략 생후 7일에 시작한다. 따라서 본 발명자들은 생후 1일에 CaMKIIα T286D 처리를 위한 유리체내 AAV 주사를 수행하고 RGC의 변성이 안정화된 2개월령에 동물을 분석하였다(Harada 등, 2007). CaMKII 발현 수준은 AAV 주사 3주 후에 상대 pan-CaMKII 면역형광 강도를 기준으로 하여 ~50% 증가하였다(도 10j-10n). 유의하게, CaMKIIα T286D 처리는 대조군 그룹에 남아있는 ~65%와 비교하여 RGC의 90% 초과를 보호하였다(도 9g-9i). RGC 손실과 일치하게, 시신경 변성 및 함몰이 8개월령 GLAST-/- 마우스에서 뚜렷해졌다(Harada 등, 2007). CaMKIIα T286D 처리는 또한 이러한 마우스에서 RGC 축삭의 시신경 유두 고갈을 완화하였다(도 10o 및 10p).

종합하면, 본 발명의 결과는 CaMKII가 녹내장의 질환 진행을 늦추는 가치있는 치료적 표적일 수 있음을 보여준다.

6. CaMKII 재활성화는 뇌에서 RGC 축삭 및 그들의 돌출부를 보호한다.

RGC 축삭은 망막에서 뇌로 시각 정보를 전달하는 유일한 경로이다. RGC 축삭은 손상 후 거의 재생할 수 없으므로, RGC 축삭의 변성은 영구적인 시력 손실을 초래한다(Tran 등, 2019). 따라서, RGC 축삭의 무결성을 보호하는 것이 시력 보존에 중요하다. 본 발명자들은 CaMKII 재활성화가 망막 신경 압착에 의해 가해진 것들과 같은 심각한 기계적 손상에 대해 RGC 축삭 저항을 만들 것이라고 예상하지 않았지만, CaMKII 처리가 RGC 축삭을 흥분독성과 같은 병리생리학적 손상으로부터 보호하는지 여부를 조사하는 것이 중요하다. 실제로, RGC 소마를 손상시키는 것 외에도, 흥분독성 손상은 시신경에서 RGC 축삭의 Wallerian-유형 변성 및 뇌에서 표적 신경분포 손실을 야기한다(Saggu 등, 2010).

CaMKII의 재활성화가 뇌에 대한 RGC 축삭 및 축삭 돌출부를 보호하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 Alexa Fluor 488-접합된 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB)를 유리체에 주입하여 뇌에서 RGC 축삭의 2가지 주요 돌출부 표적인 외측슬상체(LGN) 및 상구(SC)에 대한 RGC 축삭을 전진성으로 추적하였다(도 11a). NMDA 주사 1주 후, RGC 축삭은 심하게 손상되었고, CTB 표지화 강도는 손상되지 않은 대조군과 비교하여 시신경에서 ~17%로 감소하였다(도 11b, 11c, 및 11e). 대조적으로, CTB 표지화 강도가 ~84%로 회복됨에 따라 CaMKIIα T286D 처리 후 상당한 수의 축삭이 흥분독성으로부터 보호되었다(도 11d 및 11e).

마우스에서, RGC 축삭은 주로 반대측성 반구체로 돌출된다(Herrera and Mason, 2007). NMDA 주사 1 주 후 뇌 표적에서 RGC 축삭 돌출부의 심각한 손실이 관찰되었으며, 각각 반대측성 LGN(도 11f, 11g, 및 11i) 및 SC(도 11j, 11k, 및 11m)에 CTB 표지화 강도의 ~24% 및 ~9%만이 남아있었다. 대조적으로, CaMKIIα T286D 처리는 반대측성 LGN(~73%, 도 6h 및 6i) 및 SC(~85%, 도 11l 및 11m)에 대한 대부분의 RGC 축삭 돌출부를 보호하였다. 동측성 LGN(도 12a-12d) 및 SC(도 12e-12h)에 대한 RGC 축삭 돌출부의 유사한 보호가 있었다. 종합하면, 본 발명의 결과는 CaMKII 재활성화가 RGC 소마를 보호할 뿐만 아니라, 궁극적으로 기능적 시력을 보존하는 데 필요한, 시신경에서 RGC 축삭 및 뇌에서 원위 돌출부 표적의 무결성을 강력하게 보존함을 입증한다.

7. CaMKII 재활성화는 시각 기능을 보존한다.

흥분독성으로부터 RGC의 CaMKII-매개 보호가 시력을 보존할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 먼저 CaMKIIα T286D의 치료가 패턴화된 시각 자극의 대비 조절에 반응하여 RGC 활성을 측정하는 패턴 망막전위도(PERG)를 사용하여 RGC 기능을 유지하는지 여부를 테스트하였다(Porciatti, 2007). PERG는 양안 자극 및 공통 주둥이 전극을 사용하여 마우스의 각 눈에서 동시에 유도되었다(Chou 등, 2014). PERG 반응(21.4 μV)은 손상되지 않은 망막에서 용이하게 검출가능하였고(도 13a), NMDA 주사 7일 후 유의하게 감소되었으며(4.0 μV)(도 13b 및 13d), NMDA-유도 흥분독성 후 RGC 기능의 심각한 손실을 반영한다. 유의하게, CaMKIIα T286D의 유전자 전달을 통한 CaMKII 재활성화는 손상되지 않은 망막에서 기록된 것과 유사한 수준으로 PREG 반응을 보존하였다(도 13c 및 13d).

눈을 떠난 후, 시각 정보는 LGN 및 SC와 같은 뇌의 여러 중계 센터를 통해 이동하여, 궁극적으로 1차 시각 피질에 도달한다. 다음으로 보존된 RGC 반응이 생체내에서 1차 시각 피질로 전달될 수 있는지 여부를 테스트하였다. 본 발명자들은 손상되지 않은 그룹, NMDA 손상된 그룹, 및 CaMKIIα T286D 처리 그룹으로부터 1차 시각 피질(Porciatti 등, 1999)에서 패턴 시각 유발 전위(PVEP)를 기록하였다. 패턴화된 시각 자극은 손상되지 않은 동물에서 현저한 반응(104.8 μV)을 도출하였으며(도 7e), NMDA 손상 후 뚜렷하게 감소하였다(20.9 μV)(도 13f). 놀랍게도, CaMKIIα T286D 처리는 PVEP 반응을 손상되지 않은 상태와 필적할만한 수준으로 보존하였다(도 13g 및 13h). 본 발명의 결과는 CaMKII 재활성화가 망막에서 뇌의 1차 시각 피질까지 전체 시각 경로에 대한 흥분독성 손상으로부터 기능을 보존함을 입증한다.

시각 경로의 CaMKII-매개 보호가 실제로 시력을 보존하는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 다수의 시각-기반 행동 테스트를 수행하였다. 먼저, 본 발명자들은 CaMKIIα T286D로 처리 후 마우스에서 시각적 예민함을 정량적으로 측정하기 위해 시각적 수중 작업을 사용하였다. 2개의 대안적인 강제 선택 시각적 행동 테스트인 시각적 수중 작업(Ecker 등, 2010; Prusky 등, 2000)은 컴퓨터 모니터에 표시되는 시각 자극와 연관된 위치인 물에 잠긴 숨겨진 플랫폼으로 헤엄치는 설치류의 훈련된 능력을 이용한다(도 13i). 마우스를 낮은 공간 주파수(0.05 사이클/도) 격자를 향해 헤엄치도록 훈련시켰다. 이후에, 공간 주파수를 점진적으로 증가시켰다. 시각적 예민함(즉, 공간 주파수 임계값)은 동물이 70% 미만의 올바른 선택을 할 때 결정된다. 시력은 손상되지 않은 마우스에서 ~0.515 c/d로 측정되었으며 (도 13j 및 13m), NMDA 손상 후 ~0.128 c/d로 떨어졌다(도 13k 및 13m). 중요하게는, CaMKIIα T286D 처리는 예민함을 ~0.388 c/d로 유의하게 개선시켰다(도 13l 및 13m).

이어서 본 발명자들은 CaMKIIα T286D 처리 후 시각 깊이를 식별하는 능력이 유지됨을 평가하기 위해 시각 절벽 테스트를 수행하였다. 이 테스트는 시각 절벽의 깊은 쪽을 피하고 얕은 쪽을 밟는 마우스의 선천적 경향에 기초한다(Fox, 1965; Gu 등, 2018). 마우스를 절벽의 깊은 쪽과 얕은 쪽 사이의 중앙 플랫폼에 배치하고, 양쪽 방향을 향해 걷는 선택을 기록하였다(도 13n). 손상되지 않은 그룹에서, 마우스 12 마리 중 11 마리가 얕은(안전한) 쪽을 선택하였으며 이전 보고서와 일치한다(Fox, 1965; Gu 등, 2018). NMDA 손상 후 유의하게 악화된 성능이 기록되었으며, 마우스 12 마리 중 7 마리가 얕은 쪽을 선택하였다. 대조적으로, CaMKIIα T286D-처리된 마우스 12 마리는 모두 얕은 쪽을 선택하였다(도 13o).

마지막으로, 본 발명자들은 환경 위협을 나타내는 어렴풋한 시각 자극에 대한 마우스의 선천적 방어 반응을 평가하였다. 어렴풋한 실험은 마우스가 숨을 수 있는 보호소, 마우스 행동을 기록하는 카메라, 및 어렴풋한 자극을 표시하는 오버헤드 모니터가 있는 인클로저에서 수행하였다(도 13p)(Koehler 등, 2019; Lim 등, 2016; Yilmaz and Meister, 2013). 어렴풋한 자극에 반응하여, 정상 시력을 갖는 마우스는 이전 연구와 일치하는 다음 행동 중 하나 이상을 지속적으로 나타냈다: 얼어붙기, 보호소로 도망치기, 및 꼬리 흔들기(Koehler 등, 2019; Lim 등, 2016; Salay 등, 2018; Yilmaz and Meister, 2013). 결과적으로, 본 발명자들은 이러한 행동 중 하나 이상에 반응하는 경우 어렴풋한 자극에 대한 반응자로서 마우스를 기록하였다. 손상되지 않은 그룹에서, 12 마리 마우스는 모두 반응자였다. NMDA 손상 후, 마우스 12 마리 중 3 마리만이 어렴풋한 자극에 반응하였다. 놀랍게도, CaMKIIα T286D-처리된 마우스 12 마리 중 11마리는 어렴풋한 자극에 반응하였다(도 13q).

종합하면, 본 발명의 결과는 CaMKII-매개 RGC 보호가 기능적 시력을 보존할 수 있다는 생체내 증거를 처음으로 제공한다.

실시예가 본원에 상세히 도시되고 기재되었지만, 다양한 변형, 첨가, 치환 등이 본 개시내용의 취지를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 숙련자에 의해 명백하게 될 것이며 따라서 뒤따르는 청구범위에 정의된 바와 같은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

참고문헌

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cctaaagcat acagtcagac caattagaca ataaaaggta tgtatagctt 2340 accaaataaa aaaattgtat tttcaagaga gtgtctgtct gtgtagccct ggctgttctt 2400 gaactcactc tgtagaccag gctggcctgg aaatccatct gcctgcctct gcctctctgc 2460 ctctctgcct ctctgcctct ctctctgcct ctctctgcct ctctctgccc ctctctgccc 2520 ctctctgccc ctctctgccc ctctctgccg ccctctgcct tctgccctct gccctctggc 2580 ctctggcctc tgccctctgc cctctggcct ctggcctctg cctctgcctc ttgagtgctg 2640 gaatcaaagg tgtgagctct gtaggtctta agttccagaa gaaagtaatg aagtcaccca 2700 gcagggaggt gctcagggac agcacagaca cacacccagg acataggctc ccacttcctt 2760 ggctttctct gagtggcaaa ggaccttagg cagtgtcact ccctaagaga aggggataaa 2820 gagaggggct gaggtattca tcatgtgctc cgtggatctc aagccctcaa ggtaaatggg 2880 gacccacctg tcctaccagc tggctgacct gtagctttcc ccaccacaga atccaagtcg 2940 gaactcttgg cacc 2954 <210> 10 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesized sequence <400> 10 atgggagccc gggagatctg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag 60 ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg 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tgtggaacat caagtgctca tgaagacagt gtgtggaacc 600 ccggggtact gcgcacctga gattctccga ggctgtgcct acggacctga ggtggacatg 660 tggtctgtag gaataatcac ctacatccta ctttgtggat ttgaaccatt ctatgacgag 720 cgaggtgatc agttcatgtt caggagaatt ctgaattgtg aatattactt tatctccccc 780 tggtgggatg aagtgtcttt aaatgccaag gacttggtca aaaagctcat tgttttggat 840 cccaagaaac ggctgactac atttcaagcc ctccaacacc catgggtcac aggtaaagcg 900 gccaactttg ttcacatgga cactgctcag aagaaacttt aa 942 <210> 13 <211> 313 <212> PRT <213> mus musculus <400> 13 Met Leu Lys Val Thr Val Pro Ser Cys Pro Ser Ser Pro Cys Ser Ser 1 5 10 15 Val Thr Ala Ser Thr Glu Asn Leu Val Pro Asp Tyr Trp Ile Asp Gly 20 25 30 Ser Asn Arg Asp Pro Leu Gly Asp Phe Phe Glu Val Glu Ser Glu Leu 35 40 45 Gly Arg Gly Ala Thr Ser Ile Val Tyr Arg Cys Lys Gln Lys Gly Thr 50 55 60 Gln Lys Pro Tyr Ala Leu Lys Val Leu Lys Lys Thr Val Asp Lys Lys 65 70 75 80 Ile Val Arg Thr Glu Ile Gly Val Leu Leu Arg Leu Ser His Pro Asn 85 90 95 Ile Ile Lys Leu Lys Glu Ile Phe Glu Thr Pro Thr Glu 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ctaaatgcca aggacttggt cagaaaatta 840 attgttttgg atccaaagaa acggctgact acatttcaag ctctccagca tccgtgggtc 900 acaggtaaag cagccaattt tgtacacatg gataccgctc aaaagaagct ctaa 954 <210> 17 <211> 317 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Met Leu Lys Val Thr Val Pro Ser Cys Ser Ala Ser Ser Cys Ser Ser 1 5 10 15 Val Thr Ala Ser Ala Ala Pro Gly Thr Ala Ser Leu Val Pro Asp Tyr 20 25 30 Trp Ile Asp Gly Ser Asn Arg Asp Ala Leu Ser Asp Phe Phe Glu Val 35 40 45 Glu Ser Glu Leu Gly Arg Gly Ala Thr Ser Ile Val Tyr Arg Cys Lys 50 55 60 Gln Lys Gly Thr Gln Lys Pro Tyr Ala Leu Lys Val Leu Lys Lys Thr 65 70 75 80 Val Asp Lys Lys Ile Val Arg Thr Glu Ile Gly Val Leu Leu Arg Leu 85 90 95 Ser His Pro Asn Ile Ile Lys Leu Lys Glu Ile Phe Glu Thr Pro Thr 100 105 110 Glu Ile Ser Leu Val Leu Glu Leu Val Thr Gly Gly Glu Leu Phe Asp 115 120 125 Arg Ile Val Glu Lys Gly Tyr Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Val Lys Gln Ile Leu Glu Ala Val Ala Tyr Leu His Glu Asn Gly Ile 145 150 155 160 Val His Arg Asp Leu 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caagaagctg tcagctagag atcaccagaa gctggagagg 180 gaggctcgga tctgccgcct gctgaagcat tccaacattg tacgcctcca tgacagcatc 240 tctgaagagg gcttccacta cctggtcttc gacctggtca ctggtgggga gctctttgaa 300 gacattgtgg cgagagagta ctacagtgag gctgacgcca gtcactgtat ccagcagatc 360 ctggaggctg ttctccattg tcaccaaatg ggggtcgtcc acagagacct caagcctgaa 420 aacctgctcc tggccagcaa atgcaaaggg gccgcagtga aactggcaga cttcggcctg 480 gccatcgagg ttcagggaga ccagcaggca tggtttggat ttgcgggaac accaggctac 540 ctgtctcccg aagttcttcg gaaggaggcc tatggcaaac cagtggatat ctgggcatgt 600 ggggtgatcc tgtatatcct gctggtggga tacccacctt tctgggatga ggaccagcac 660 aagctgtacc agcagatcaa ggctggggcc tatgacttcc catcccccga gtgggacacc 720 gttacccctg aagccaaaaa cctcatcaac cagatgttga ccatcaaccc cgccaagcgc 780 atcacggccc acgaggccct gaagcaccca tgggtctgcc aacgatccac ggtggcctcc 840 atgatgcaca gacaggagac tgtggaatgt ctgtga 876 <210> 21 <211> 291 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 21 Met Ala Thr Thr Val Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Glu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 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caagcccgtg cacaccacca tcctgaatcc ccacatccac 1260 ctgatgggcg acgagtcagc ctgcatcgcc tacatccgca tcacgcagta cctggacgct 1320 ggcggcatcc cacgcaccgc ccagtcggag gagacccgtg tctggcaccg ccgggatggc 1380 aaatggcaga tcgtccactt ccacagatct ggggcgccct ccgtcctgcc ccactga 1437 <210> 37 <211> 478 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 37 Met Ala Thr Ile Thr Cys Thr Arg Phe Thr Glu Glu Tyr Gln Leu Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val Lys 20 25 30 Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys 35 40 45 Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Cys 50 55 60 Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile Ser 65 70 75 80 Glu Glu Gly His His Tyr Leu Ile Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly Glu 85 90 95 Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp Ala 100 105 110 Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu Glu Ala Val Leu His Cys His Gln 115 120 125 Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Ala 130 135 140 Ser Lys Leu 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Gln Leu Ile Glu Ala Ile Ser Asn Gly Asp Phe Glu Ser 355 360 365 Tyr Thr Lys Met Cys Asp Pro Gly Met Thr Ala Phe Glu Pro Glu Ala 370 375 380 Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly Leu Asp Phe His Arg Phe Tyr Phe Glu 385 390 395 400 Asn Leu Trp Ser Arg Asn Ser Lys Pro Val His Thr Thr Ile Leu Asn 405 410 415 Pro His Ile His Leu Met Gly Asp Glu Ser Ala Cys Ile Ala Tyr Ile 420 425 430 Arg Ile Thr Gln Tyr Leu Asp Ala Gly Gly Ile Pro Arg Thr Ala Gln 435 440 445 Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Gln Ile 450 455 460 Val His Phe His Arg Ser Gly Ala Pro Ser Val Leu Pro His 465 470 475 <210> 38 <211> 1437 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 38 atggccacca tcacctgcac ccgcttcacg gaagagtacc agctcttcga ggaattgggc 60 aagggagcct tctcggtggt gcgaaggtgt gtgaaggtgc tggctggcca ggagtatgct 120 gccaagatca tcaacacaaa gaagctgtca gccagagacc atcagaagct ggagcgtgaa 180 gcccgcatct gccgcctgct gaagcacccc aacatcgtcc gactacatga cagcatctca 240 gaggagggac accactacct gatcttcgac ctggtcactg gtggggaact gtttgaagat 300 atcgtggccc gggagtatta cagtgaggcg gatgccagtc actgtatcca gcagatcctg 360 gaggctgtgc tgcactgcca ccagatgggg gtggtgcacc gggacctgaa gcctgagaat 420 ctgttgctgg cctccaagct caagggtgcc gcagtgaagc tggcagactt tggcctggcc 480 atagaggtgg agggggagca gcaggcatgg tttgggtttg cagggactcc tggatatctc 540 tccccagaag tgctgcggaa ggacccgtac gggaagcctg tggacctgtg ggcttgtggg 600 gtcatcctgt acatcctgct ggttgggtac cccccgttct gggatgagga ccagcaccgc 660 ctgtaccagc agatcaaagc cggcgcctat gatttcccat cgccggaatg ggacactgtc 720 accccggaag ccaaggatct gatcaataag atgctgacca ttaacccatc caaacgcatc 780 acagctgccg aagcccttaa gcacccctgg atctcgcacc gctccaccgt ggcatcctgc 840 atgcacagac aggagaccgt ggactgcctg aagaagttca atgccaggag gaaactgaag 900 ggagccattc tcaccacgat gctggccacc aggaacttct ccggagggaa gagtggggga 960 aacaagaaga gcgatggtgt gaaggaatcc tcagagagca ccaacaccac catcgaggat 1020 gaagacacca aagtgcggaa acaggaaatt ataaaagtga cagagcagct gattgaagcc 1080 ataagcaatg gagattttga gtcctacacg aagatgtgcg accctggcat gacagccttc 1140 gaacctgagg ccctggggaa cctggttgag ggcctggact tccatcgatt ctattttgaa 1200 aacctgtggt cccggaacag caagcccgtg cacaccacca tcctgaatcc ccacatccac 1260 ctgatgggcg acgagtcagc ctgcatcgcc tacatccgca tcacgcagta cctggacgct 1320 ggcggcatcc cacgcaccgc ccagtcggag gagacccgtg tctggcaccg ccgggatggc 1380 aaatggcaga tcgtccactt ccacagatct ggggcgccct ccgtcctgcc ccactga 1437 <210> 39 <211> 478 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 39 Met Ala Thr Ile Thr Cys Thr Arg Phe Thr Glu Glu Tyr Gln Leu Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val Lys 20 25 30 Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys 35 40 45 Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Cys 50 55 60 Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile Ser 65 70 75 80 Glu Glu Gly His His Tyr Leu Ile Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly Glu 85 90 95 Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp Ala 100 105 110 Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu Glu Ala Val Leu His Cys His Gln 115 120 125 Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Ala 130 135 140 Ser Lys Leu Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala 145 150 155 160 Ile Glu Val Glu Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly Thr 165 170 175 Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly Lys 180 185 190 Pro Val Asp Leu Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Val 195 200 205 Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Arg Leu Tyr Gln Gln 210 215 220 Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ala Lys Asp Leu Ile Asn Lys Met Leu Thr Ile Asn Pro 245 250 255 Ser Lys Arg Ile Thr Ala Ala Glu Ala Leu Lys His Pro Trp Ile Ser 260 265 270 His Arg Ser Thr Val Ala Ser Cys Met His Arg Gln Glu Thr Val Asp 275 280 285 Cys Leu Lys Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile Leu 290 295 300 Thr Thr Met Leu Ala Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Lys Ser Gly Gly 305 310 315 320 Asn Lys Lys Ser Asp Gly Val Lys Glu Ser Ser Glu Ser Thr Asn Thr 325 330 335 Thr Ile Glu Asp Glu Asp Thr Lys Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile Lys 340 345 350 Val Thr Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Ser Asn Gly Asp Phe Glu Ser 355 360 365 Tyr Thr Lys Met Cys Asp Pro Gly Met Thr Ala Phe Glu Pro Glu Ala 370 375 380 Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly Leu Asp Phe His Arg Phe Tyr Phe Glu 385 390 395 400 Asn Leu Trp Ser Arg Asn Ser Lys Pro Val His Thr Thr Ile Leu Asn 405 410 415 Pro His Ile His Leu Met Gly Asp Glu Ser Ala Cys Ile Ala Tyr Ile 420 425 430 Arg Ile Thr Gln Tyr Leu Asp Ala Gly Gly Ile Pro Arg Thr Ala Gln 435 440 445 Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Gln Ile 450 455 460 Val His Phe His Arg Ser Gly Ala Pro Ser Val Leu Pro His 465 470 475 <210> 40 <211> 876 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 40 atggccacca cggtgacctg cacccgcttc accgacgagt accagctcta cgaggatatt 60 ggcaaggggg ctttctctgt ggtccgacgc tgtgtcaagc tctgcaccgg ccatgagtat 120 gcagccaaga tcatcaacac caagaagctg tcagccagag atcaccagaa gctggagaga 180 gaggctcgga tctgccgcct tctgaagcat tccaacatcg tgcgtctcca cgacagcatc 240 tccgaggagg gcttccacta cctggtcttc gatctggtca ctggtgggga gctctttgaa 300 gacattgtgg cgagagagta ctacagcgag gctgatgcca gtcactgtat ccagcagatc 360 ctggaggccg ttctccattg tcaccaaatg ggggtcgtcc acagagacct caagccggag 420 aacctgcttc tggccagcaa gtgcaaaggg gctgcagtga agctggcaga cttcggccta 480 gctatcgagg tgcaggggga ccagcaggca tggtttggtt tcgctggcac accaggctac 540 ctgtcccctg aggtccttcg caaagaggcg tatggcaagc ctgtggacat ctgggcatgt 600 ggggtgatcc tgtacatcct gctcgtgggc tacccaccct tctgggacga ggaccagcac 660 aagctgtacc agcagatcaa ggctggtgcc tatgacttcc cgtcccctga gtgggacacc 720 gtcactcctg aagccaaaaa cctcatcaac cagatgctga ccatcaaccc tgccaagcgc 780 atcacagccc atgaggccct gaagcacccg tgggtctgcc aacgctccac ggtagcatcc 840 atgatgcaca gacaggagac tgtggagtgt ctgtga 876 <210> 41 <211> 291 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 41 Met Ala Thr Thr Val Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Glu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Tyr Glu Asp Ile Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Leu Cys Thr Gly His Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Ser Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu Glu Ala Val Leu His Cys His 115 120 125 Gln Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Asp Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Glu Ala Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala His Glu Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu 290 <210> 42 <211> 873 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 42 atggccacca tcacctgcac ccgcttcacg gaagagtacc agctcttcga ggaattgggc 60 aagggagcct tctcggtggt gcgaaggtgt gtgaaggtgc tggctggcca ggagtatgct 120 gccaagatca tcaacacaaa gaagctgtca gccagagacc atcagaagct ggagcgtgaa 180 gcccgcatct gccgcctgct gaagcacccc aacatcgtcc gactacatga cagcatctca 240 gaggagggac accactacct gatcttcgac ctggtcactg gtggggaact gtttgaagat 300 atcgtggccc gggagtatta cagtgaggcg gatgccagtc actgtatcca gcagatcctg 360 gaggctgtgc tgcactgcca ccagatgggg gtggtgcacc gggacctgaa gcctgagaat 420 ctgttgctgg cctccaagct caagggtgcc gcagtgaagc tggcagactt tggcctggcc 480 atagaggtgg agggggagca gcaggcatgg tttgggtttg cagggactcc tggatatctc 540 tccccagaag tgctgcggaa ggacccgtac gggaagcctg tggacctgtg ggcttgtggg 600 gtcatcctgt acatcctgct ggttgggtac cccccgttct gggatgagga ccagcaccgc 660 ctgtaccagc agatcaaagc cggcgcctat gatttcccat cgccggaatg ggacactgtc 720 accccggaag ccaaggatct gatcaataag atgctgacca ttaacccatc caaacgcatc 780 acagctgccg aagcccttaa gcacccctgg atctcgcacc gctccaccgt ggcatcctgc 840 atgcacagac aggagaccgt ggactgcctg tga 873 <210> 43 <211> 290 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 43 Met Ala Thr Ile Thr Cys Thr Arg Phe Thr Glu Glu Tyr Gln Leu Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val Lys 20 25 30 Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys 35 40 45 Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Cys 50 55 60 Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile Ser 65 70 75 80 Glu Glu Gly His His Tyr Leu Ile Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly Glu 85 90 95 Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp Ala 100 105 110 Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu Glu Ala Val Leu His Cys His Gln 115 120 125 Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Ala 130 135 140 Ser Lys Leu Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala 145 150 155 160 Ile Glu Val Glu Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly Thr 165 170 175 Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly Lys 180 185 190 Pro Val Asp Leu Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Val 195 200 205 Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Arg Leu Tyr Gln Gln 210 215 220 Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ala Lys Asp Leu Ile Asn Lys Met Leu Thr Ile Asn Pro 245 250 255 Ser Lys Arg Ile Thr Ala Ala Glu Ala Leu Lys His Pro Trp Ile Ser 260 265 270 His Arg Ser Thr Val Ala Ser Cys Met His Arg Gln Glu Thr Val Asp 275 280 285 Cys Leu 290 <210> 44 <211> 882 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 44 atgctggggg cagtggaagg ccccaggtgg aagcaggcgg aggacattag agacatctac 60 gacttccgag atgttctggg cacgggggcc ttctcggagg tgatcctggc agaagataag 120 aggacgcaga agctggtggc catcaaatgc attgccaagg aggccctgga gggcaaggaa 180 ggcagcatgg agaatgagat tgctgtcctg cacaagatca agcaccccaa cattgtagcc 240 ctggatgaca tctatgagag tgggggccac ctctacctca tcatgcagct ggtgtcgggt 300 ggggagctct ttgaccgtat tgtggaaaaa ggcttctaca cggagcggga cgccagccgc 360 ctcatcttcc aggtgctgga tgctgtgaaa tacctgcatg acctgggcat tgtacaccgg 420 gatctcaagc cagagaatct gctgtactac agcctggatg aagactccaa aatcatgatc 480 tccgactttg gcctctccaa gatggaggac ccgggcagtg tgctctccac cgcctgtgga 540 actccgggat acgtggcccc tgaagtcctg gcccagaagc cctacagcaa ggctgtggat 600 tgctggtcca taggtgtcat cgcctacatc ttgctctgcg gttaccctcc cttctatgac 660 gagaatgatg ccaaactctt tgaacagatt ttgaaggccg agtacgagtt tgactctcct 720 tactgggacg acatctctga ctctgccaaa gatttcatcc ggcacttgat ggagaaggac 780 ccagagaaaa gattcacctg tgagcaggcc ttgcagcacc catggattgc aggagataca 840 gctctagata agaatatcca ccagtcggtg agtgagcagt ag 882 <210> 45 <211> 293 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 45 Met Leu Gly Ala Val Glu Gly Pro Arg Trp Lys Gln Ala Glu Asp Ile 1 5 10 15 Arg Asp Ile Tyr Asp Phe Arg Asp Val Leu Gly Thr Gly Ala Phe Ser 20 25 30 Glu Val Ile Leu Ala Glu Asp Lys Arg Thr Gln Lys Leu Val Ala Ile 35 40 45 Lys Cys Ile Ala Lys Glu Ala Leu Glu Gly Lys Glu Gly Ser Met Glu 50 55 60 Asn Glu Ile Ala Val Leu His Lys Ile Lys His Pro Asn Ile Val Ala 65 70 75 80 Leu Asp Asp Ile Tyr Glu Ser Gly Gly His Leu Tyr Leu Ile Met Gln 85 90 95 Leu Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Val Glu Lys Gly Phe 100 105 110 Tyr Thr Glu Arg Asp Ala Ser Arg Leu Ile Phe Gln Val Leu Asp Ala 115 120 125 Val Lys Tyr Leu His Asp Leu Gly Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro 130 135 140 Glu Asn Leu Leu Tyr Tyr Ser Leu Asp Glu Asp Ser Lys Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Met Glu Asp Pro Gly Ser Val Leu Ser 165 170 175 Thr Ala Cys Gly Thr Pro Gly Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Ala Gln 180 185 190 Lys Pro Tyr Ser Lys Ala Val Asp Cys Trp Ser Ile Gly Val Ile Ala 195 200 205 Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Tyr Pro Pro Phe Tyr Asp Glu Asn Asp Ala 210 215 220 Lys Leu Phe Glu Gln Ile Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Phe Asp Ser Pro 225 230 235 240 Tyr Trp Asp Asp Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Phe Ile Arg His Leu 245 250 255 Met Glu Lys Asp Pro Glu Lys Arg Phe Thr Cys Glu Gln Ala Leu Gln 260 265 270 His Pro Trp Ile Ala Gly Asp Thr Ala Leu Asp Lys Asn Ile His Gln 275 280 285 Ser Val Ser Glu Gln 290 <210> 46 <211> 1113 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 46 atgctggggg cagtggaagg ccccaggtgg aagcaggcgg aggacattag agacatctac 60 gacttccgag atgttctggg cacgggggcc ttctcggagg tgatcctggc agaagataag 120 aggacgcaga agctggtggc catcaaatgc attgccaagg aggccctgga gggcaaggaa 180 ggcagcatgg agaatgagat tgctgtcctg cacaagatca agcaccccaa cattgtagcc 240 ctggatgaca tctatgagag tgggggccac ctctacctca tcatgcagct ggtgtcgggt 300 ggggagctct ttgaccgtat tgtggaaaaa ggcttctaca cggagcggga cgccagccgc 360 ctcatcttcc aggtgctgga tgctgtgaaa tacctgcatg acctgggcat tgtacaccgg 420 gatctcaagc cagagaatct gctgtactac agcctggatg aagactccaa aatcatgatc 480 tccgactttg gcctctccaa gatggaggac ccgggcagtg tgctctccac cgcctgtgga 540 actccgggat acgtggcccc tgaagtcctg gcccagaagc cctacagcaa ggctgtggat 600 tgctggtcca taggtgtcat cgcctacatc ttgctctgcg gttaccctcc cttctatgac 660 gagaatgatg ccaaactctt tgaacagatt ttgaaggccg agtacgagtt tgactctcct 720 tactgggacg acatctctga ctctgccaaa gatttcatcc ggcacttgat ggagaaggac 780 ccagagaaaa gattcacctg tgagcaggcc ttgcagcacc catggattgc aggagataca 840 gctctagata agaatatcca ccagtcggtg agtgagcaga tcaagaagaa ctttgccaag 900 agcaagtgga agcaagcctt caatgccacg gctgtggtgc ggcacatgag gaaactgcag 960 ctgggcacca gccaggaggg gcaggggcag acggcgagcc atggggagct gctgacacca 1020 gtggctgggg ggccggcagc tggctgttgc tgtcgagact gctgcgtgga gccgggcaca 1080 gaactgtccc ccacactgcc ccaccagctc tag 1113 <210> 47 <211> 370 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 47 Met Leu Gly Ala Val Glu Gly Pro Arg Trp Lys Gln Ala Glu Asp Ile 1 5 10 15 Arg Asp Ile Tyr Asp Phe Arg Asp Val Leu Gly Thr Gly Ala Phe Ser 20 25 30 Glu Val Ile Leu Ala Glu Asp Lys Arg Thr Gln Lys Leu Val Ala Ile 35 40 45 Lys Cys Ile Ala Lys Glu Ala Leu Glu Gly Lys Glu Gly Ser Met Glu 50 55 60 Asn Glu Ile Ala Val Leu His Lys Ile Lys His Pro Asn Ile Val Ala 65 70 75 80 Leu Asp Asp Ile Tyr Glu Ser Gly Gly His Leu Tyr Leu Ile Met Gln 85 90 95 Leu Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Val Glu Lys Gly Phe 100 105 110 Tyr Thr Glu Arg Asp Ala Ser Arg Leu Ile Phe Gln Val Leu Asp Ala 115 120 125 Val Lys Tyr Leu His Asp Leu Gly Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro 130 135 140 Glu Asn Leu Leu Tyr Tyr Ser Leu Asp Glu Asp Ser Lys Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Met Glu Asp Pro Gly Ser Val Leu Ser 165 170 175 Thr Ala Cys Gly Thr Pro Gly Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Ala Gln 180 185 190 Lys Pro Tyr Ser Lys Ala Val Asp Cys Trp Ser Ile Gly Val Ile Ala 195 200 205 Tyr Ile Leu Leu Cys Gly Tyr Pro Pro Phe Tyr Asp Glu Asn Asp Ala 210 215 220 Lys Leu Phe Glu Gln Ile Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Phe Asp Ser Pro 225 230 235 240 Tyr Trp Asp Asp Ile Ser Asp Ser Ala Lys Asp Phe Ile Arg His Leu 245 250 255 Met Glu Lys Asp Pro Glu Lys Arg Phe Thr Cys Glu Gln Ala Leu Gln 260 265 270 His Pro Trp Ile Ala Gly Asp Thr Ala Leu Asp Lys Asn Ile His Gln 275 280 285 Ser Val Ser Glu Gln Ile Lys Lys Asn Phe Ala Lys Ser Lys Trp Lys 290 295 300 Gln Ala Phe Asn Ala Thr Ala Val Val Arg His Met Arg Lys Leu Gln 305 310 315 320 Leu Gly Thr Ser Gln Glu Gly Gln Gly Gln Thr Ala Ser His Gly Glu 325 330 335 Leu Leu Thr Pro Val Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Cys Cys Cys Arg 340 345 350 Asp Cys Cys Val Glu Pro Gly Thr Glu Leu Ser Pro Thr Leu Pro His 355 360 365 Gln Leu 370

Claims

대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법으로서,
칼슘-칼모듈린 의존성 키나제(CaMK)의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 벡터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 벡터가 아데노 연관 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 CaMKI, CaMKII, 및 CaMKIV 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 구성적으로 활성인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 CaMKII가 T286D 치환을 포함하는 CaMKIIα 및 T287D 치환을 포함하는 CaMKIIβ 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되는 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제1항, 제2항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CaMK를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 안구내 투여를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있는 것인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성을 예방하는 것이 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함하는 것인, 방법.
대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법으로서,
칼슘-칼모듈린 의존성 키나제(CaMK)의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 CaMK 또는 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물이 벡터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 벡터가 아데노 연관 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 CaMKI, CaMKII, 및 CaMKIV 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 방법.
제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 방법.
제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 구성적으로 활성인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 CaMKII가 T286D 치환을 포함하는 CaMKIIα 및 T287D 치환을 포함하는 CaMKIIβ 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되는 것인, 방법.
제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CaMK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제26항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제18항, 제19항, 및 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CaMK를 포함하는 것인, 방법.
제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 안구내 투여를 포함하는 것인, 방법.
제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 것인, 방법.
제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있는 것인, 방법.
제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 시력 손실을 예방하는 것을 포함하는 것인, 방법.
약제학적 조성물로서,
폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 포함하고 칼슘-칼모듈린 의존성 키나제(CaMK)를 암호화하는 것인, 약제학적 조성물.
제36항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
제36항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
제39항에 있어서, 상기 벡터가 아데노 연관 벡터를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 CaMKI, CaMKII, 및 CaMKIV 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 CaMKIIα, CaMKIIβ, CaMKIIγ, 및 CaMKIIδ 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CaMK가 구성적으로 활성인, 약제학적 조성물.
제43항에 있어서, 상기 CaMKII가 T286D 치환을 포함하는 CaMKIIα 및 T287D 치환을 포함하는 CaMKIIβ 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
대상체에서 망막 신경절 세포의 변성을 감소시키는 방법으로서,
사이클릭-AMP 반응 요소-결합 단백질(CREB) 활성의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제45항에 있어서, 상기 조성물이 벡터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제46항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제47항에 있어서, 상기 벡터가 아데노 연관 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CREB가 구성적으로 활성인, 방법.
제49항에 있어서, 상기 CREB가 VP-16 CREB를 포함하는 것인, 방법.
제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제51항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제52항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제52항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제45항, 제46항, 제49항, 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CREB를 포함하는 것인, 방법.
제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 안구내 투여를 포함하는 것인, 방법.
제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 것인, 방법.
제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있는 것인, 방법.
제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 변성을 예방하는 것은 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함하는 것인, 방법.
대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법으로서,
사이클릭-AMP 반응 요소-결합 단백질(CREB) 활성의 활성을 증가시키기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 CREB 또는 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제60항에 있어서, 상기 조성물이 벡터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제61항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제61항에 있어서, 상기 벡터가 아데노 연관 벡터를 포함하는 것인, 방법.
제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CREB가 구성적으로 활성인, 방법.
제64항에 있어서, 상기 CREB가 VP-16 CREB를 포함하는 것인, 방법.
제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CREB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제66항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 망막 신경절 세포 프로모터를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제67항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제67항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제60항, 제61항, 제64항, 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CREB를 포함하는 것인, 방법.
제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 안구내 투여를 포함하는 것인, 방법.
제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 것인, 방법.
제60항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막 허혈, 및 시신경 손상 중 하나 이상을 갖거나 가질 위험이 있는 것인, 방법.
제60항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 망막 신경절 세포 소마 및 망막 신경절 호출 축삭 중 하나 또는 둘 다의 감소를 예방하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제60항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 시력 손실을 예방하는 것을 포함하는 것인, 방법.
약제학적 조성물로서,
폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 망막 신경절 세포 프로모터를 포함하고 사이클릭-AMP 반응 요소-결합 단백질(CREB)을 암호화하는 것인, 약제학적 조성물.
제76항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터, 또는 시냅신 1 프로모터, 또는 신경미세섬유 중쇄 프로모터, 또는 Thy-1 세포 표면 항원 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제76항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포 프로모터가 감마-시누클레인 프로모터를 포함하는 것인, 방법.
제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
제79항에 있어서, 상기 벡터가 아데노 연관 벡터를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CREB가 구성적으로 활성인, 약제학적 조성물.
제81항에 있어서, 상기 CREB가 VP-16 CREB를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.