KR20230150213A - 람노스와 오탄당을 동시에 발효하는 미생물 및 이를 이용한 바이오에탄올 생산방법 - Google Patents
람노스와 오탄당을 동시에 발효하는 미생물 및 이를 이용한 바이오에탄올 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 람노스와 오탄당을 동시에 발효하는 미생물 및 이를 이용한 바이오에탄올 생산방법에 관한 것으로, L-rhamnose를 대사할 수 없는 산업용 효모 Saccharomyces cerevisiae가 바이오에너지 생산에 뛰어난 성능을 가지고 있다는 점을 고려할 때, 본 발명에서 제작된 L-rhamnose를 활용한 엔지니어링 효모 균주는 바이오에너지 생산을 위한 새로운 산업용 탄소원으로 제시할 수 있다.
Description
본 발명은 람노스와 오탄당을 동시에 발효하는 미생물 및 이를 이용한 바이오에탄올 생산방법에 관한 것이다.
3세대 바이오매스라고도 불리는 해조류 바이오매스는 리그닌을 함유하지 않고 목질계 바이오매스에 비해 단위 면적당 생산 수율이 높으며 광합성을 통해 성장한다. 또한 탄수화물 함량이 높아 바이오에너지 생산에 적합한 바이오매스이다. 그러나 해조류 유래 다당류는 목질계 바이오매스보다 구조가 복잡하고 펙틴과 비전통적 단당류 등의 점질성 물질로 구성되어 있다. 해조류 바이오매스 중 녹조류는 다른 해조류에 비해 다당류 구조(셀룰로오스, 자일로글루칸, 글루쿠로난)가 단순하며 단일 탄소원인 L-rhamnose(45.0mol%), xylose(9.6mol%), glucuruonic acid(22.5 mol%) 및 iduronic acid(5.0 mol%)로 구성되어 있다.
녹조류의 주요 탄소원인 L-rhamnose는 Pichia stipitis, Pichia pastoris, Aspergillus niger와 같은 진균에서 유래한 비인산화 알돌라제 경로( non-phosphorylated aldolase pathway)를 통해 피루브산과 L-lactaldehyde로 전환된다. 이 경로는 L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase), L-람노노 락토나아제(L-rhamnono lactonase), L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase) 및 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase) 그리고 전사 인자(transcription factors)에 의해 조절된다. 다음으로, L-lactaldehyde는 락트알데하이드 탈수소효소(lactaldehyde dehydrogenase) 또는 락트알데하이드 환원효소(lactaldehyde reductase)에 의해 L-락테이트(L-lactate)와 1,2-프로판디올(1,2-propanediol)로 전환된다.
L-rhamnose를 활용하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있지만, 미생물에서 이종 L-rhamnose 이화 경로의 완전한 구축을 통한 L-rhamnose의 활용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.
따라서, 본 발명자들은 3개의 오탄당 대사경로 관련 유전자와 L-rhamnose transporter 유전자와 5개의 진균 L-rhamnose 대사경로 유전자를 도입하여 자일로스(xylose) 및 L-rhamnose를 대사할 수 있는 재조합 S. cerevisiae 균주를 제작하였으며, 상기 재조합 균주를 배양하는 경우 에탄올 및 1,2-프로판올을 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 L-람노스 대사경로(L-rhamnose pathway) 및 자일로스 대사경로(D-xylose pathway)가 도입된 L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 바이오알코올 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 바이오알코올 생산 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자, L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자, L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase), 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자, 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
이어서, 본 발명은 상기 재조합 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 바이오알코올 생산용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 바이오알코올 생산방법을 제공한다.
또한, 상기 바이오알코올은 에탄올(ethanol) 또는 1,2-프로판디올(1,2-propanediol)일 수 있다.
L-rhamnose를 대사할 수 없는 산업용 효모 S. cerevisiae가 바이오에너지 생산에 뛰어난 성능을 가지고 있다는 점을 고려할 때, 본 발명에서 제작된 L-rhamnose를 활용한 엔지니어링 효모 균주는 바이오에너지 생산을 위한 새로운 산업용 탄소원으로 제시할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, Saccharomyces cerevisiae 내 새롭게 구축된 L-람노스 대사경로 및 자일로스 대사경로 및 상기 L-람노스 대사경로 관련 유전자의 염색체 내 삽입위치를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스를 단일 탄소원으로 이용하는 재조합 균주와 야생형 균주의 발효 프로파일 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스를 단일 탄소원으로 이용하는 야생형 균주와 L-람노스를 소비하는 재조합 균주의 발효 프로파일 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스 및 자일로스를 공동소비하는 재조합 균주와 자일로스를 단일 탄소원으로 이용하는 재조합 균주의 발표 프로파일 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스 및 자일로스를 공동소비하는 재조합 균주의 대사체 분석 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스 및 자일로스 공동소비에 따른 재조합 균주의 대사 반응에 대한 in-silico 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 글루코스의 이화대사물 억제 (catabolite repression)가 완화된 재조합 균주의 대사산물 생산량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스를 단일 탄소원으로 이용하는 재조합 균주와 야생형 균주의 발효 프로파일 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스를 단일 탄소원으로 이용하는 야생형 균주와 L-람노스를 소비하는 재조합 균주의 발효 프로파일 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스 및 자일로스를 공동소비하는 재조합 균주와 자일로스를 단일 탄소원으로 이용하는 재조합 균주의 발표 프로파일 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스 및 자일로스를 공동소비하는 재조합 균주의 대사체 분석 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 있어서, L-람노스 및 자일로스 공동소비에 따른 재조합 균주의 대사 반응에 대한 in-silico 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 글루코스의 이화대사물 억제 (catabolite repression)가 완화된 재조합 균주의 대사산물 생산량 측정 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
일 측면에서, 본 발명은 L-람노스 대사경로(L-rhamnose pathway) 및 자일로스 대사경로(D-xylose pathway)가 도입된 L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자, L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자, L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase), 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자, 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자, L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자, L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase), 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자 및 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 L-람노스 대사경로 관련 유전자이다.
또한, 상기 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 L-람노스 수송체 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 2의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 L-람노스 탈수소효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 3의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 L-람노노 락토나제 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 4의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 4의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 L-람노네이트 탈수효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 5의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Aspergillus niger 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 6의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 6의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 알데히드 탈수소효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자는 자일로스 대사경로 관련 유전자이다.
또한, 상기 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 7의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 7의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 자일로스 환원효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 8의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 8의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 자일로스 탈수소효소 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 9의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 9의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 자일룰로키나제 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 도입은 유전체 편집(Genome Editing)에 의해 서열번호 1 내지 9의 염기서열로 표시되는 표적 유전자가 미생물의 염색체 내에 삽입되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “유전체 편집(Genome Editing)”은 뉴클라아제(nuclease)를 이용하여 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 (non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다.
또한, 상기 뉴클레아제(nuclease)는 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9(CRISPR associated protein 9)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 미생물의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라 표적 유전자를 선별할 수 있다.
또한, 상기 유전자 편집(gene editing)은 가이드 RNA(gRNA), 프로모터, 서열번호 1 내지 9의 염기서열 중 어느 하나 이상의 염기서열로 이루어진 표적 유전자 및 터미네이터를 포함하는 발현 벡터 및 Cas9 단백질 발현 벡터를 미생물 내로 형질전환하여 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 일 실시예에 있어서, 상기 가이드 RNA(gRNA)는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “가이드 RNA(guide RNA, gRNA)”는 는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프로모터는 PCCW12 프로모터, PTDH3 프로모터, PTEF1 프로모터 PPGK1 프로모터 및 PFBA1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로모터(promoter)"는 하류 유전자의 전사를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 프로모터는 목적 단백질의 발현을 가져오는 임의의 프로모터일 수 있고, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보여주는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 돌연변이, 절단된 및 혼성화 프로모터를 포함하고, 숙주 세포에 대하여 상동성 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 고유의 또는 이질적일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 터미네이터는 TADH2 터미네이터, TTDH3 터미네이터, TTEF1 터미네이터, TCYC1 터미네이터, TPGK1 터미네이터 및 TFBA1 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나. 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "터미네이터(terminator)"는 전사의 종료를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 미생물 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 잠재성 게놈 삽입물일 수 있다. 적합한 숙주내로 형질전환되면, 상기 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제되어 기능을 하거나, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터로서 통상적으로 사용되기 때문에, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "플라스미드(plasmid)"와 벡터(vector)"는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 “형질전환”은 미생물이 외부로부터 주어진 DNA를 받아들여 미생물의 유전적 성질이 변하는 것을 의미한다.
또한, 상기 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법 (electroporation), 전기주입법 (electroinjection), 미세주입법 (microinjection), 인산칼슘공동-침전법 (calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총 (gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자, 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자 및 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)를 코딩하는 유전자에 활성 감소 돌연변이(deleterious mutation)가 도입된 것일 수 있다.
또한, 상기 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 10의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 10의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 글루코키나아제 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 11의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 11의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 헥소키나제 동종효소 1 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)을 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 12의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 12의 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 헥소키나제 동종효소 2 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “돌연변이(mutation)”는 유전 물질의 변이를 말하고, 점 돌연변이, 격자 이동(frame shift) 돌연변이, 삽입, 결실, 역위, 전좌 등을 포함한다. 돌연변이는 결실(deletion), 삽입(insertion), 점 돌연변이(point mutation), 격자 이동 돌연변이(frame shift mutation), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 점 돌연변이는 미스센스(missense) 돌연변이 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이일 수 있다. 상기 돌연변이에 의해 유전 물질이 상기 미생물의 게놈으로부터 결실 또는 도입될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “활성 감소 돌연변이(deleterious mutation)”는 i) 코딩 영역 내에서 정상 위치보다 앞선 부위에 정지 코돈이 있는 단백절단변이(protein truncating alterations); ii) 인트론과 엑손 접합 부위에서 비-동의코돈(non-synonymous codon, 아미노산 서열이 변경됨)이 있는 접합부위변이; 및 iii) 코딩 영역 내에서 염기서열 일부가 삽입 또는 삭제로 인해 코돈이 변경되는 프레임이동 변이(frameshift alterations)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자는 256번째 염기서열이 아데닌(adenine)에서 구아닌(guanine)으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자는 916번째 염기서열이 티민(thymine)에서 시토신(cytosine)으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)을 코딩하는 유전자는 1364번째 염기서열이 삭제된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 속 균주일 수 있고, 상기 사카로미세스(Saccharomyces) 속 균주는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 유바룸(Saccharomyces uqvarum), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 사케(Saccharomyces sake), 사카로마이세스 코레아누스(Saccharomyces coreanus), 사카로마이세스 리폴리티카(Saccharomyces lipolytica) 사카로마이세스보울라디(Saccharomyces boulardii) 및 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus)일 수 있고, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 L-람노스 및 자일로스를 탄소원으로 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 본 발명은 상기 재조합 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 바이오알코올 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이오알코올 생산용 조성물은 상술한 재조합 미생물을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 재조합 미생물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “조성물”은 목적 물질을 생산하기 위한 다양한 물질을 혼합한 것으로서, 미생물 배양배지, 탄소원, 미량 원소 및 미생물 종균이 포함된 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오알코올은 에탄올(ethanol) 또는 1,2-프로판디올(1,2-propanediol)일 수 있다.
나아가, 본 발명은 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 바이오알코올 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오알코올은 에탄올(ethanol) 또는 1,2-프로판디올(1,2-propanediol)일 수 있다.
본 발명에서 용어 "배양"은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 상기 환경 조건은 대표적으로 영양소, 온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 배지는 크게 액체배지와 고체배지로 나뉠 수 있다. 본 발명의 재조합 미생물의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 배양은 상기 재조합 미생물로부터 에탄올(ethanol) 또는 1,2-프로판디올(1,2-propanediol)을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 효모(yeast)의 배양에 사용되는 것으로 알려진 YP(Yeast Extract Peptone) 배지, YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose) 배지, SCD(Soybean-Casein Digest) 배지 또는 YM(Yeast Malt) 배지를 사용할 수 있고, 효모의 종류에 따라 상기 배지에 포함된 성분 또는 이의 함량을 적절히 조절한 배지를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 재조합 미생물의 배양 온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃내지 35℃일 수 있으며, L-람노스 및 자일로스로 이루어진 혼합당과 균주의 원활한 접촉을 위해, 50rpm 내지 300rpm, 구체적으로 100rpm 내지 160rpm, 보다 구체적으로 120rpm 내지 140rpm으로 교반할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법은 상기 재조합 미생물을 L-람노스 및 자일로스, 바람직하게는 5 내지 15 g/L L-람노스 및 30 내지 50 g/L 자일로스를 포함하는 배양액에 배양하는 것일 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 배양액으로부터 바이오알코올을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 바이오알코올을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 엑토인 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면 HPLC, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 실험방법
1-1. 균주 및 배양 조건
숙주로 사용된 Saccharomyces cerevisiae D452-2와 D-galacturonic acid, L-arabionse, xylose를 대사할 수 있는 YE9 균주를 L-rhamnose 및 xylose의 혼합당 발효에 사용되었다. 본 발명에서 사용된 재조합 효모 S. cerevisiae 균주 및 플라스미드는 표 1에 기재하였다. S. cerevisiae는 YPD 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤 및 20g/L 글루코스)에서 배양되었다. 발효 실험을 위해 30℃에서 배양되었으며, 효모 형질전환을 위해 멸균 후 YPD 한천 플레이트에 항생제(100 μg/mL nourseothricin sulfate, 300 μg/mL hygromycin B)를 첨가하였다. Escherichia coli TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭하였고, 암피실린(LBA) 100 μg/mL 또는 50 μg/mL 카나마이신(LBK)이 첨가된 LB 배지(5 g/L 효모 추출물, 10 g/L 트립톤 및 10 g/L NaCl)에서 37℃에 배양하였다.
| Plasmids | Description/relevant genotype * |
| Saccharomyces cerevisiae | |
| D452-2 | Wild-type; Matα leu2 his3 ura3 |
| D452 P CCW12 -1 | D452-2 int#1::P CCW12 -cg#1-T ADH2 |
| D452 P CCW12 -2 | D452-2 int#1::P CCW12 -cg#1-T CYC1 |
| D452 P TDH3 | D452-2 int#6::P TDH3 -cg#1-T TDH3 |
| D452 P PGK1 | D452-2 int#1::P PGK1 -cg#1-T PGK1 |
| D452 P FBA1 | D452-2 int#1::P FBA1 -cg#1-T FBA1 |
| D452 P TEF1 | D452-2 int#1::P TEF1 -cg#1-T TEF1 |
| D452 rhtA | D452-2 int#1::P CCW12 -AnrhtA-T ADH2 |
| D452 RHA1 | D452-2 int#6::P TDH3 -PsRHA1-T TDH3 |
| D452 LRA2 | D452-2 int#1::P TEF1 -PsLRA2-T TEF1 |
| D452 LRA3 | D452-2 int#1::P CCW12 -PsLRA3-T CYC1 |
| D452 LRA4 | D452-2 int#1::P PGK1 -PsLRA4-T PGK1 |
| D452 ALD5 | D452-2 int#1::P FBA1 -PsALD5-T FBA1 |
| DY29 | The D452-2 strain expressing the heterologous L-rhamnose pathway; D452-2 int#1::rhtA-LRA2 int#11::LRA3-RHA1-LRA4-ALD5 |
| +XYL1 | The D452-2 strain expressing the heterologous L-rhamnose pathway and xylose reductase genes; D452-2 int#1::rhtA-LRA2 int#11::LRA3-RHA1-LRA4-ALD5 int#6::P TDH3 -XYL1-T TDH3 |
| YE9 | Engineered strain expressing the heterologous xylose, L-arabinose, and D-galacturonic acid pathway genes |
| DY30 | The YE9 strain expressing the heterologous L-rhamnose pathway genes; YE9 int#1::rhtA int#11::LRA3-RHA1-LRA4-ALD5 int#12::LRA2 |
| -rhtA | DY30 AnrhtAΔ |
| -rha1 | DY30 Anrha1Δ |
| -lra2 | DY30 Pslra2Δ |
| -lra3 | DY30 Pslra3Δ |
| -lra4 | DY30 Pslra4Δ |
| -ald5 | DY30 Psald5Δ |
| DY31 | The DY30 expressing mGLK1 (A265G), mHXK1 (T916C), and mHXK2 (1364ΔC) |
| Plasmids | |
| pRS41K-Cas9 | A single-copy plasmid with a KanMX marker and Cas9 |
| pRS42H-cg#1 | pRS42H, hph marker, created guide RNA (cg#1**) |
| pRS42H-INT#1 | pRS42H, hph marker, guide RNA for integration#1 (INT#1) |
| pRS42H-INT#6 | pRS42H, hph marker, guide RNA for integration#6 (INT#6) |
| pRS42H-INT#11 | pRS42H, hph marker, guide RNA for integration#11 (INT#11) |
| pRS42H-INT#12 | pRS42H, hph marker, guide RNA for integration#12 (INT#12) |
| pRS42H-GLK1.1 | pRS42H, hph marker, guide RNA for mutation of GLK1 |
| pRS42H-HXK1.1 | pRS42H, hph marker, guide RNA for mutation of HXK1 |
| pRS42H-HXK2.1 | pRS42H, hph marker, guide RNA for mutation of HXK2 |
*PsXYL1, PsRHA1, PsLRA2, PsLRA3, PsLRA4 및 PsALD5는 Pichia stipitis에서 유래되었으며 AnrhtA는 Aspergillus niger CBS 120.49에서 유래되었다.
**23bp 랜덤 시퀀스(5'-GTACACCTACCCGTCACCGG AGG)를 사용하여 가이드 RNA(cg#1)를 생성하였다.
1-2. Cas9 기반 게놈 편집에 의한 재조합 균주 구축
모든 균주는 CRISPR/Cas9 시스템을 응용하여 생체 내 조립(in vivo assembly) 및 염색체(chromosome) 내 도입 기술(integration technology)에 의해 개량되었다. 요약해서, 균주 개량을 위해 3 종의 구성요소를 포함한다: 1) guide RNA(gRNA) 플라스미드 개발, 2) donor DNA 준비 및 3) 효모 형질전환(yeast transformation). 본 발명에서 사용된 가이드 RNA(gRNA) 플라스미드는 fast cloning 방법으로 제작되었으며, 본 발명에서 사용된 gRNA 플라스미드의 염기서열은 표 2에 나타내었다.
간략하게, pRS41N-Cas9 플라스미드로부터 Cas9 발현 카세트가 StuI에 의해 절단되었고, EcoRV에 의해 선형화 되고 CIP 처리에 의해 탈인산화된 pRS41K 벡터로 클로닝하였다. 생성된 pRS41K-Cas9 플라스미드를 LBK 한천 플레이트에서 선별하고 SalI로 확인하였다.
본 발명에서 새롭게 개발된 gRNA(cg#1)의 염기서열은 Sequence Manipulation Suite(http://www.bioinformatics.org/sms2)를 통해 gRNA 와 PAM 서열로 이루어진 23-bp 길이(gRNA 20 bp + NGG)로 설계되었으며, 구체적인 염기서열은 표 3에 나타내었다. 또한, 본 발명에서 설계된 gRNA는 S. cerevisiae S288C reference genome을 사용한 검색 엔진인 GGGenome(https://gggenome.dbcls.jp/sacCer3/)을 사용하여 off-target이 없음이 확인하고, 최종적으로 cg#1 서열을 5'-GTACACCTACCCGTCACCGG AGG로 선택하였다.
2개의 gRNA(INT#11 및 INT#12)는 게놈 통합을 위해 CHOPCHOP 소프트웨어(https://chopchop.cbu.uib.no/)에 의해 설계되었다. pRS42H-cg#1, pRS42H-INT#11, pRS42H-INT#12 gRNA 플라스미드를 제작하기 위해 pRS42H-INT#1 gRNA 플라스미드를 주형 플라스미드(Jeong et al., 2020a)로 하여 Kim191/Kim192, Kim700/Kim701 및 Kim702/Kim703 프라이머(표 2)를 각각 사용하여 PCR 증폭하였다. 그 후 PCR 산물을 DpnI로 처리하고 E. coli TOP10으로 형질전환시켰다. LBA 한천 플레이트에서 형질전환체를 선별하고, T3 프로모터용 유니버셜 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱으로 표적 서열 치환을 확인하였다.
| Plasmid name | Primers | Sequences (5’-) |
| pRS42H-cg#1 | Kim191 | CACCTACCCGTCACCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG |
| Kim192 | CGGTGACGGGTAGGTGTACGATCATTTATCTTTCACTGCG | |
| pRS42H-INT#11 | Kim700 | GACAAAATAGAATCCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG |
| Kim701 | TGGATTCTATTTTGTCACAGATCATTTATCTTTCACTGCG | |
| pRS42H-INT#12 | Kim702 | CATTGTGTAGAGCCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG |
| Kim703 | TTGGCTCTACACAATGTTTGATCATTTATCTTTCACTGCG | |
| pRS42H-cg#1 | Kim191 | CACCTACCCGTCACCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG |
| Kim192 | CGGTGACGGGTAGGTGTACGATCATTTATCTTTCACTGCG |
| gRNA | Target cut site | gRNA and PAM sequences (5’-) | Plasmid name |
| cg#1 | Non target cut site in S. cerevisiae | GTACACCTACCCGTCACCGG AGG | pRS42H-cg#1 |
| INT#1 | Intergenic region upstream of HIP1 | TCCCTTATCTATTAACTTTC CGG | pRS42H-INT#1 |
| INT#6 | Intergenic region upstream of ATG33 | CATGGTAGATTATTATCTGT GGG | pRS42H-INT#6 |
| INT#11 | Intergenic region downstream of CDI1 | TTGTCACAGTGTCACATCAG CGG | pRS42H-INT#11 |
| INT#12 | Intergenic region upstream of MSC1 | GATACTTATCATTAAGAAAA TGG | pRS42H-INT#12 |
| GLK1.1 | Mutation of GLK1 (A265G) | AACAGAACATATACGGAAAT TGG | pRS42H-GLK1.1 |
| HXK1.1 | Mutation of HXK1 (T916C) | TTCACCCAAGTAGTAACCGG AGG | pRS42H-HXK1.1 |
| HXK2.1 | Mutation of HXK2 (1364ΔC) | GTTCCTGCTGAAGATGGTTC CGG | pRS42H-HXK2.1 |
donor DNA 단편은 표 4 및 표 5에 기재된 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 제작하였다. 상동 재조합을 통한 생체 내 조립(in vivo assembly) 및 염색체 내 도입되기 위하여 donor DNA 단편의 양쪽에 30-50 bp 길이의 염기서열로 구축하여 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나도록 유도하였다. 발현 카세트(expression cassette) DNA 단편(int#1::PCCW12-cg#1-TCYC1, int#1::PCCW12-cg#1-TADH2, int#6::PTDH3-cg#1-TTDH3, int#1::PFBA1-cg#1-TFBA1 및 int#1::PTEF1-cg#1-TTEF1)을 구성하기 위한 donor DNA는 표 4에 기재된 프라이머 세트와 유전자 간 영역(int#1, 6 또는 7)에 통합된 게놈을 사용하여 S. cerevisiae D452-2 균주(Jeong et al., 2020b) 게놈을 주형 DNA(template DNA)로 PCR 증폭되었다. 예를 들어, 발현 카세트(PCCW12-cg#1-TCYC1)에 대한 두 개의 donor DNA(PCCW12 및 TCYC1)는 각각 Kim209/Kim210 및 Kim211/Kim212 프라이머에 의해 PCR 증폭되었고, D452-2 균주의 유전자 영역 #1(int#1)에서 염색체 내 도입(genome-integrated)되었다.
| Expression cassette* | Intergenic region* | Promoter/ | Primers | Sequences (5’-)*** |
| Terminator** | ||||
| int#1::PCCW12-cg#1-TCYC1 | INT#1 | PCCW12 | Kim209 | GAGAAGTTTTTTTACCCCTCTCCACAGATC CACGCAAAAGAAAACCTT |
| Kim210 | TGAcctCCGGTGACGGGTAGGTGTAC TATTGATATAGTGTTTAAGCGAAT | |||
| TADH2 | Kim211 | AATAGTACACCTACCCGTCACCGGaggTCATGTAATTAGTTATGTCACGC | ||
| Kim212 | CCGGGTAGATTTTTCCGTAACCTTGGTGTC GGCCGCAAATTAAAGCCTTC | |||
| int#1::PCCW12-cg#1-TADH2 | INT#1 | PCCW12 | Kim209 | GAGAAGTTTTTTTACCCCTCTCCACAGATC CACGCAAAAGAAAACCTT |
| Kim938 | CGCcctCCGGTGACGGGTAGGTGTAC TATTGATATAGTGTTTAAGCGAAT | |||
| TADH2 | Kim939 | AATAGTACACCTACCCGTCACCGGaggGCG GATCTCTTATGTCTTTAC | ||
| Kim940 | CCGGGTAGATTTTTCCGTAACCTTGGTGTC ATGAGAAATATCGAGGGAGAC | |||
| int#6::PTDH3-cg#1-TTDH3 | INT#6 | PTDH3 | Kim710 | CGGAGGAGACCGCTATAACCGGTTTGAATTTA CTATTTTCGAGGACCTTGTC |
| Kim055 | ACTcctCCGGTGACGGGTAGGTGTAC TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATT | |||
| TTDH3 | Kim056 | CAAAGTACACCTACCCGTCACCGGaggAGT GAATTTACTTTAAATCTTGC | ||
| Kim711 | ATGAACTTGCTTGCTGTCAAACTTCTGAGTTG TCCTGGCGGAAAAAATTC | |||
| int#1::PFBA1-cg#1-TFBA1 | INT#1 | PFBA1 | Kim718 | GAGAAGTTTTTTTACCCCTCTCCACAGATC TGAACAACAATACCAGCC |
| Kim719 | AACcctCCGGTGACGGGTAGGTGTAC TTTGAATATGTATTACTTGGTTATG | |||
| TFBA1 | Kim720 | CAAAGTACACCTACCCGTCACCGGaggGTT AATTCAAATTAATTGATATAG | ||
| Kim721 | CCGGGTAGATTTTTCCGTAACCTTGGTGTC AATGAGCTATCAAAAACG | |||
| int#1::PTEF1-cg#1-TTEF1 | INT#1 | PTEF1 | Kim722 | GAGAAGTTTTTTTACCCCTCTCCACAGATC GAAGGTTCACGAAATCTTTAATG |
| Kim723 | TCCcctCCGGTGACGGGTAGGTGTAC TTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTG | |||
| TTEF1 | Kim724 | CAAAGTACACCTACCCGTCACCGGaggGGA GATTGATAAGACTTTTCTAG | ||
| Kim725 | CCGGGTAGATTTTTCCGTAACCTTGGTGTC AAAAGACCAAACGGTGAC |
*생성된 가이드 RNA(cg#1) : 5'-GTACACCTACCCGTCACG AGG
**주형 DNA: Saccharomyces cerevisiae D452-2의 게놈 DNA.
***flanking region에 밑줄이 그어져 있다.
이종 진균 L-rhamnose 대사 경로 유전자의 발현 카세트를 구축하기 위해 Aspergillus niger CBS120.49 유래 rhtA 유전자와 Pichia stipitis 유래 RHA1, LRA2, LRA3, LRA4, ALD5 유전자를 Kim847/Kim848, Kim726/Kim727, Kim750/Kim751, Kim728/Kim729, Kim730/Kim731 및 Kim732/Kim733 프라이머로 PCR 증폭 후 각각을 발현 카세트 균주의 게놈 cg#1 영역으로 도입하였다. 각각의 진균 L-람노스 발현 카세트 단편은 표 5에 나열된 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되었고, D452 또는 YE9 균주에 게놈 통합되어 각각 DY29 및 DY3 균주가 생성되었다. 유전자 내 도입 여부 및 삽입 위치는 표 6에 나열된 프라이머 세트를 사용하여 효모 콜로니 PCR에 의해 확인되었다. Cas9 유전자 가위 기술을 이용한 효모의 형질전환(yeast transformation)은 lithium acetate/single-stranded carrier DNA-polyethylene glycol 방법(R.D. Gietz et al., 2007)을 일부 수정하여 실시하였다. 상기에서 개발한 gRNA 플라스미드 및 donor DNA 단편과 Cas9 단백질 발현 플라스미드(pRS41K-Cas9 plasmid)를 S. cerevisiae 에 도입시켰으며, 300 μg/mL G418 sulfate과 300 μg/mL hygromysin B를 함유한 YPD 고체 배지에서 선택 및 배양되었다.
YE9 균주 및 DY30 균주에서 3개의 헥소키나제 돌연변이(mGLK1, A265G; mHXK1, T916C; mHXK2,1364ΔC)를 이전에 보고된 것과 동일한 방법으로 수행하여(Lane et al., 2018) DY31 균주를 생성하였다. 구체적으로, 3개의 gRNA(GLK1.1, HXK1.1 및 HXK2.1)가 3개의 헥소키나제 돌연변이(mGLK1, A265G; mHXK1, T916C; mHXK2,1364ΔC)를 위해 사용되었다. 돌연변이 서열을 갖는 donor DNA는 표 5의 Kim516/Kim517, Kim520/Kim521 및 Kim518/Kim519 프라이머를 사용하여 각각 PCR 증폭하였다. gRNA 플라스미드 및 donor DNA 단편과 Cas9 단백질 발현 플라스미드(pRS41K-Cas9 plasmid)를 S. cerevisiae 에 도입시켰으며, 300 μg/mL G418 sulfate과 300 μg/mL hygromysin B를 함유한 YPD 고체 배지에서 선택 및 배양되었다.
| Template | Donor DNA | Primers | Sequences (5’-)*** |
| genomic DNA* | fragments | ||
| Construction of AnrhtA cassette ( int#1::P CCW12 -AnrhtA-T ADH2 ) | |||
| A. niger | AnrhtA | Kim847 | TCTTCTGTCATTCGCTTAAACACTATATCAATAAAAAATGTGGCGAAGACGCATCAC |
| Kim848 | TAAATCGTAAAGACATAAGAGATCCGCTTATTACGCAGCATTGATATTCTCCAC | ||
| Construction of PsRHA1 cassette ( int#6::P TDH3 -PsRHA1-T TDH3 ) | |||
| P. stipitis | PsRHA1 | Kim726 | GTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAAAAAATGACTGGATTGTTGAATGG |
| Kim727 | TAAATGCAAGATTTAAAGTAAATTCACTCTACTATTGTAAATTGACGAACAATCC | ||
| Construction of PsLRA2 cassette ( int#1::P TEF1 -PsLRA2-T TEF1 ) | |||
| P. stipitis | PsLRA2 | Kim750 | TAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAAAAAATGTCTAAGTACAAAATCTTGG |
| Kim751 | TATGCAACTAGAAAAGTCTTATCAATCTCCTTATTAGATATTGTACGCTTTAAATGC | ||
| Construction of PsLRA3 cassette ( int#1::P CCW12 -PsLRA3-T CYC1 ) | |||
| P. stipitis | PsLRA3 | Kim728 | GTCATTCGCTTAAACACTATATCAATAAAAAATGCTGGTAAAAGACTTCC |
| Kim729 | GTAAGCGTGACATAACTAATTACATGACTA CTAATGGCCATTCTTGATGG | ||
| Construction of PsLRA4 cassette ( int#1::P PGK1 -PsLRA4-T PGK1 ) | |||
| P. stipitis | PsLRA4 | Kim730 | CTACTTTTTACAACAAATATAAAACAAAAAATGACAATTTCAGCTGCC |
| Kim731 | GATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTATTATAATGTAGACTCAACACTGAC | ||
| Expression of PsLRA2 cassette in int#12 ( int#12::P TEF1 -PsLRA2-T TEF1 ) | |||
| D452 PsLRA2 | PsLRA3 cassette | Kim768 | TCTGCATCGGCGGCTAAATGGTATTCTTTTGAAGGTTCACGAAATCTTTAATG |
| Kim769 | TCCAAATCGGAAACACCGACGCTCAGCTTAATCTTGGTGTCAAAAGACCAAAC | ||
| Expression of AnrhtA-PsLRA2 cassette in int#1 ( int#1:: P CCW12 -AnrhtA-T ADH2 -P TEF1 -PsLRA2-T TEF1 ) | |||
| D452 AnrhtA | AnrhtA cassette | Kim144 | GTGAGTTCTCATAACCTCG |
| Kim1460 | TAAAGACCTCATTAAAGATTTCGTGAACCTTCATGAGAAATATCGAGGGAGAC | ||
| D452 PsLRA2 | PsLRA3 cassette | Kim1461 | CTCTGAATCGTCTCCCTCGATATTTCTCATGAAGGTTCACGAAATCTTTAATG |
| Kim1462 | CCGGGTAGATTTTTCCGTAACCTTGGTGTCCTTGGTGTCAAAAGACCAAAC | ||
| Expression of PsLRA3-PsRHA1-PsLRA4-PsALD5 cassette in int#1(int#1::PCCW12-PsLRA3-TCYC1-PTDH3-PsRHA1-TTDH3-PPGK1-PsLRA4-TPGK1-PFBA1-PsALD5-TFBA1) | |||
| D452 PsLRA3 | PsLRA3 cassette | Kim760 | TCCACTCCCCCATTTTTATCCGGATCTCTGCACGCAAAAGAAAACCTTCG |
| Kim761 | TGGGCTCAAGGTGACAAGGTCCTCGAAAATAGGGCCGCAAATTAAAGCCT | ||
| D452 PsRHA1 | PsRHA1 cassette | Kim762 | TGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCCTATTTTCGAGGACCTTGTC |
| Kim763 | ATGCGATAGTTCCTCACTCTTTCCTTACTCAC CTTCTGAGTTGTCCTGGC | ||
| D452 PsLRA4 | PsLRA4 cassette | Kim764 | TGAATTTTTTCCGCCAGGACAACTCAGAAGGTGAGTAAGGAAAGAGTGAG |
| Kim765 | CAGAAGTTGGAAGGCTGGTATTGTTGTTCAGTAACCTTGGTGTCAAATAATATCC | ||
| D452 PsALD5 | PsALD5 cassette | Kim766 | TCGAGAAGGATATTATTTGACACCAAGGTTACTGAACAACAATACCAGCC |
| Kim767 | CTGGCAAACGGCGCTCTCCAAGGCACAAACTTCTTGGTGTCAATGAGCTATC | ||
| Expression of PsLRA3-PsLRA4-PsALD5 cassette in int#1 ( int#1::P CCW12 -PsLRA3-T CYC1 -P PGK1 -PsLRA4-T PGK1 -P FBA1 -PsALD5-T FBA1 ) | |||
| D452 PsLRA3 | PsLRA3 cassette | Kim760 | TCCACTCCCCCATTTTTATCCGGATCTCTGCACGCAAAAGAAAACCTTCG |
| Kim1123 | ATGCGATAGTTCCTCACTCTTTCCTTACTCACGGCCGCAAATTAAAGCCT | ||
| D452 PsLRA4 | PsLRA4 cassette | Kim1124 | GGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGG |
| Kim765 | CAGAAGTTGGAAGGCTGGTATTGTTGTTCAGTAACCTTGGTGTCAAATAATATCC | ||
| D452 PsALD5 | PsALD5 cassette | Kim766 | TCGAGAAGGATATTATTTGACACCAAGGTTACTGAACAACAATACCAGCC |
| Kim767 | CTGGCAAACGGCGCTCTCCAAGGCACAAACTTCTTGGTGTCAATGAGCTATC | ||
| Expression of PsRHA1-PsLRA4-PsALD5 cassette in int#1 ( int#1::P TDH3 -PsRHA1-T TDH3 -P PGK1 -PsLRA4-T PGK1 -P FBA1 -PsALD5-T FBA1 ) | |||
| D452 PsRHA1 | PsRHA1 cassette | Kim714 | TCCACTCCCCCATTTTTATCCGGATCTCTGCTATTTTCGAGGACCTTGTC |
| Kim763 | ATGCGATAGTTCCTCACTCTTTCCTTACTCAC CTTCTGAGTTGTCCTGGC | ||
| D452 PsLRA4 | PsLRA4 cassette | Kim764 | TGAATTTTTTCCGCCAGGACAACTCAGAAGGTGAGTAAGGAAAGAGTGAG |
| Kim765 | CAGAAGTTGGAAGGCTGGTATTGTTGTTCAGTAACCTTGGTGTCAAATAATATCC | ||
| D452 PsALD5 | PsALD5 cassette | Kim766 | TCGAGAAGGATATTATTTGACACCAAGGTTACTGAACAACAATACCAGCC |
| Kim767 | CTGGCAAACGGCGCTCTCCAAGGCACAAACTTCTTGGTGTCAATGAGCTATC | ||
| Expression of PsRHA1-PsLRA3-PsALD5 cassette in int#1 ( int#1::P CCW12 -PsLRA3-T CYC1 -P TDH3 -PsRHA1-T TDH3 -P FBA1 -PsALD5-T FBA1 ) | |||
| D452 PsLRA3 | PsLRA3 cassette | Kim760 | TCCACTCCCCCATTTTTATCCGGATCTCTGCACGCAAAAGAAAACCTTCG |
| Kim761 | TGGGCTCAAGGTGACAAGGTCCTCGAAAATAGGGCCGCAAATTAAAGCCT | ||
| D452 PsRHA1 | PsRHA1 cassette | Kim762 | TGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCCTATTTTCGAGGACCTTGTC |
| Kim1497 | CAGAAGTTGGAAGGCTGGTATTGTTGTTCACTTCTGAGTTGTCCTGGC | ||
| D452 PsALD5 | PsALD5 cassette | Kim1498 | TGAATTTTTTCCGCCAGGACAACTCAGAAGTGAACAACAATACCAGCC |
| Kim767 | CTGGCAAACGGCGCTCTCCAAGGCACAAACTTCTTGGTGTCAATGAGCTATC | ||
| Expression of PsRHA1-PsLRA3-PsLRA4 cassette in int#1 ( int#1::P CCW12 -PsLRA3-T CYC1 -P TDH3 -PsRHA1-T TDH3 -P PGK1 -PsLRA4-T PGK1 ) | |||
| D452 PsLRA3 | PsLRA3 cassette | Kim760 | TCCACTCCCCCATTTTTATCCGGATCTCTGCACGCAAAAGAAAACCTTCG |
| Kim761 | TGGGCTCAAGGTGACAAGGTCCTCGAAAATAGGGCCGCAAATTAAAGCCT | ||
| D452 PsRHA1 | PsRHA1 cassette | Kim762 | TGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCCTATTTTCGAGGACCTTGTC |
| Kim763 | ATGCGATAGTTCCTCACTCTTTCCTTACTCAC CTTCTGAGTTGTCCTGGC | ||
| D452 PsLRA4 | PsLRA4 cassette | Kim764 | TGAATTTTTTCCGCCAGGACAACTCAGAAGGTGAGTAAGGAAAGAGTGAG |
| Kim1499 | CTGGCAAACGGCGCTCTCCAAGGCACAAACTTGTAACCTTGGTGTCAAATAATATCC | ||
| Expression of XYL1 cassette into INT#6 ( int#6:: P TDH3 -XYL1-T TDH3 ) | |||
| YE9 | PsXYL1 cassette | Kim710 | CGGAGGAGACCGCTATAACCGGTTTGAATTTACTATTTTCGAGGACCTTGTC |
| Kim711 | ATGAACTTGCTTGCTGTCAAACTTCTGAGTTGTCCTGGCGGAAAAAATTC | ||
| Mutation of GLK1 ( mGLK1; A265G) | |||
| No template DNA | A265G of GLK1 | Kim516 | GGAGCGCGGTGTTTTACTAGCCGCCGACCTGGGTGGTgCtAATTTCCGTATATGTTCTGT |
| Kim517 | CATTTGCTCCATGGAGAAAGTATGATCTCCATGCAAGTTAACAGAACATATACGGAAATT | ||
| Mutation of HXK1 ( mHXK1; T916C) | |||
| No template DNA | A265G of GLK1 | Kim520 | ATCTCCAAGACCTGGTCAACAAGCTTTTGAAAAGATGACtcCaGGTTACTACTTGGGTGA |
| Kim521 | GCCCTTCTCGTTTAATTCAAGTAACACTAGACGCAACAATTCACCCAAGTAGTAACCtGg | ||
| Mutation of HXK1 ( mHXK2; 1364ΔC) | |||
| No template DNA | 1364ΔC of HXK2 | Kim518 | GACGACTACCCAATCAAGATTGTTCTGCTGAAGATGGTTCCaGTGCTGGTGCCGCTGTTA |
| Kim519 | GACTTACCTTCAGCAATTCTTTTTTGGGCCAAAGCAGCAATAACAGCGGCACCAGCACtG | ||
*생성된 가이드 RNA(cg#1) : 5'-GTACACCTACCCGTCACG AGG
**주형 DNA: Saccharomyces cerevisiae D452-2, Aspergillus niger CBS 120.49 및 Pichia stifitis의 게놈 DNA
***flanking region에 밑줄이 그어져 있다.
| Primers | Sequences (5’-) | Description |
| Kim144 | GTGAGTTCTCATAACCTCG | Conf_INT#1_F |
| Kim143 | CATTATACGCACCCTAAGGGAC | Conf_INT#1_R |
| Kim326 | GGTTCTGACTCCTACTGAGC | Conf_INT#6_F |
| Kim327 | AGCATCGAGTACGGCAGTTC | Conf_INT#6_R |
| Kim706 | AGGAGTGAGAATGTGCGTTAGC | Conf_INT#11_F |
| Kim707 | GGCAATGCAAATTCTTCCAGAC | Conf_INT#11_R |
| Kim708 | GTAACTTTGACACTACCTTCGACC | Conf_INT#12_F |
| Kim709 | ATTTACACCAATGTGCCCTACG | Conf_INT#12_R |
| Kim1443 | GGGACTGAAGAACGTGCAATG | Conf_AnrhtA_F |
| Kim779 | GTGGAGGGCTTTGGCAATTC | Conf_PsLRA2_F |
| Kim780 | GGTCTTGCATCCAGATGACTTTG | Conf_PsLRA3_F |
| Kim781 | CAAGGTACGGTAGATGCTCTCTG | Conf_PsLRA4_F |
| Kim782 | AGGTCACTTTGGAATTGGGTGG | Conf_PsALD5_F |
| Kim549 | GCATCCTTTGCCTCCGTTC | Conf_PCCW12_F |
| Kim551 | ACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTG | Conf_PTDH3_F |
| Kim522 | GGC ATGTCATTCGACGACTTACACAA | Conf_GLK1_F |
| Kim523 | GGC TCATGCTACAAGCGCACACA | Conf_GLK1_R |
| Kim526 | GCC GCTTCCCAAAACAAGATTAACG | Conf_HXK1_F |
| Kim527 | GCC CTCTGGTACCGATCAATTCACA | Conf_HXK1_R |
| Kim524 | GGC AGGAAGATCCATTCGAGAACC | Conf_HXK2_F |
| Kim525 | GGC GAGGAAGTGTAGAGAGGGTT | Conf_HXK2_R |
1-3. 플라스크 발효 실험(Flask fermentation experiments)
YPD 배지에서 250 rpm으로 24시간 동안 전배양한 후 효모 세포를 3,134 ×g, 4℃에서 5분간 원심분리하여 수확하고 증류수로 세척하였다. 초기 세포 농도는 600 nm(OD600)에서 1.0의 광학 밀도(OD600 1.0 = 0.5 g의 건조 세포 중량/L)로 조정하고, 세포 펠릿을 10 g/L 단독 탄소원으로서의 L-rhamnose 또는 10g/L L-rhamnose 및 40g/L 보조 기질(glucose 또는 xylose)의 혼합물을 첨가한 10mL YP배지에 접종하였다. 본 배양은 산소 제한 조건(130 rpm)에서 50 mL 삼각 플라스크에서 30℃에서 수행하였다.
1-4. L-락트알데히드 환원효소 활성 측정
모든 효모 세포는 YPD 액체배지에서 지수기(exponential phase)까지 배양하였으며 15,928 × g 및 4°C에서 1분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세척된 세포(1.4 × 108 세포)를 1 mL Y-PERTM 효모 단백질 추출 시약(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 현탁하고 균질기로 분해하였다. 원심분리하여 cell debris를 완전히 제거한 후 상등액을 효소 활성 측정을 위한 조추출물로 사용하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology, Cramlington, UK)로 측정하였다.
L-락트알데히드 환원효소(L-lactaldehyde reductase)의 활성은 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 10mM L-lactaldehyde, 2mM NADH 또는 NADPH 보조인자 및 세포 추출물을 함유하는 반응 혼합물에서 측정되었다. NADH 및 NADPH의 형성은 340 nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. L-락트알데히드 환원효소 활성의 1단위(1U)는 분당 1μmol NAD+ 또는 NADP+의 전환으로 정의된다.
1-5. 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liqui Chromatography, HPLC)를 활용한 세포외 대사물질 분석
세포 외 대사물질(glucose, xylose, L-rhamnose, L-lactate, 1,2-propandiol 및 ethanol)의 정량은 RI 검출기 및 Rezex-ROA 유기산 H+(8%)(150mm × 4.6mm) 컬럼(Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC; Agilent Technologies, 1260 series, USA) 장비를 이용하여 수행하였다. 컬럼은 0.6 mL/min로 50℃에서 0.005 N H2SO4로 용출되었다. Glucose, xylose, L-rhamnose, L-lactate, 1,2-propandiol 및 ethanol의 머무름 시간(retention time)은 각각 4.963, 5.286, 5.543, 6.744, 8.806, 11.098분이었다.
1-6. 기체 크로마토그래피 질량분석기(Gas Chromatography/Mass Spectrometry, GC/MS)를 활용한 세포 내 대사산물(intracellular metabolites) 분석
대사체 추출 및 유도체화는 이전에 기술된 방법을 일부 수정하여 수행하였다(Kim et al., 2013). 간략하게, 발효 개시 후 0시간 (IP, Initial phase) 및 48시간(SP, Starvation phase)에서 1mL의 세포 배양물을 5mL의 60%(v/v) 차가운 메탄올(10mM HEPES, pH 7.1, -80℃)로 퀀칭(quenching)하였다. 세포는 3,134 g, -20℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액은 세포 외 대사산물의 오염(contamination)을 피하기 위해 완전히 폐기하였다. 75%(v/v) 끓는 에탄올(10mM HEPES, pH 7.1) 1mL를 사용하여 80℃에서 5분간 세포 내 대사산물을 추출하였다. 15,928 g, 4℃에서 1분간 원심분리한 후, 상등액 200 μL를 speed vacuum concentrator(Labconco, Kansas City, MO, USA)를 사용하여 4시간 동안 진공 건조하였다. 분석 전에 진공 건조된 샘플을 피리딘(40 mg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 포함된 10 μL의 메톡시아민 염산염 및 40 μL의 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 각각 30°C에서 90분 및 37°C에서 30분 동안 처리하였다.
GC/MS 분석은 Agilent 5973 질량 선택 검출기(MSD) 및 RTX-5Sil MS 컬럼(30m × 0.25mm, 필름 두께 0.25μm, Restek, Bellefonte, PA)이 장착된 Agilent 6890 가스 크로마토그래프(GC)를 사용하여 수행되었다. 헬륨을 운반 가스(1.0mL/분)를 사용하여 분할 모드(split mode, 51:1)로 시료 1μl를 GC에 주입하였다. 오븐 온도는 50°C에서 1분 동안 유지하고 분당 20°C씩 증가시킨 다음 330°C에서 5분 동안 유지하도록 조건을 설정하였다. 이온 소스(ion source) 및 전달라인(transfer line)은 각각 250℃, 290℃의 온도로 설정하였다. 이온화를 위해 70eV의 전자 충격이 사용되었고 검출기는 50-550m/z의 질량 범위로 스캔 모드에서 작동되었다.
1-7. EFM(Elementary Flux Mode) 분석에 의한
In-silico
디자인
L-rhamnose 대사에 대한 공동 기질로서 xylose의 추가적인 효과를 예측하기 위해 이전에 설명한 대로 EFM 분석을 수행하였다(Quarterman et al., 2015). 구체적으로, S. cerevisiae genome 규모 대사 모델 iND750이 사용되었으며 COBRA (constraint-based reconstruction analysis) tool box를 이용하여 세포 대사 예측이 수행되었다. S. cerevisiae의 64개 반응, 53개의 내부 대사산물 및 10개의 외부 대사산물로 구성된 대사 네트워크를 사용하여 xylose, rhamnose 및 xylose 와 rhamnose 혼합 조건에서의 EFM을 분석하였다. Xylose, L-rhamnose 및 xylose와 L-rhamnose의 혼합물로부터의 생성물 수율(바이오매스와 에탄올)은 각 EFM으로부터 계산되었다.
<실시예 2>
Saccharomyces cerevisiae
의 L-rhamnose 대사경로 구축
L-락트알데히드(L-lactaldehyde)는 락트알데하이드 탈수소효소(lactaldehyde dehydrogenase) 또는 락트알데하이드 환원효소(lactaldehyde reductase)에 의해 L-락테이트(L-lactate)와 1,2-프로판디올(1,2-propanediol)로 전환된다(도 1 참조).
L-rhamnose를 탄소원으로 발효하는 균주를 개발하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 P. stipitis에서 유래한 이종 L-rhamnose 진균 경로 유전자(RHA1, LRA2, LRA3, LRA4 및 ALD5)와 A. niger에서 유래한 L-rhamnose 트랜스포터 유전자(rhtA)의 발현 카세트를 S. cerevisiae D452-2 균주 내에 구축하였으며, 최종적으로 6개의 발현 카세트가 도입된 효모 S. cerevisiae DY29 균주를 개발하였다. RHA1는 L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, LRA1은 L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, LRA2는 L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자, LRA3은 L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase)를 코딩하는 유전자, LRA4는 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자, ALD5는 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, rhtA는 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter gene)를 코딩하는 유전자이다.
이 후, S. cerevisiae에서 L-rhamnose 대사에 필수적인 이종 효소를 조사하기 위해 이종 자일로스, L-아라비노스, D-갈락투론산 및 이종 L-람노스 대사경로 관련 유전자가 도입된 S. cerevisiae DY30 균주에서 L-rhamnose 대사 경로와 관련된 유전자를 녹아웃(knockout)하여 각각의 L-rhamnose 대사 관련 유전자가 제거된 균주(-rhtA, -rha1, -lra2, -lra3, -lra4 및 -ald5 균주)를 제작하였다(표 1 참조).
상기 6종의 재조합 균주 및 야생형 균주(D452-2)는 초기 세포 밀도(starting cell density)가 0.5g/L인 혐기조건에서 10g/L L-rhamnose를 포함하는 YP 배지에서 30℃, 130rpm의 배양조건으로 48시간 동안 배양하였다.
그 결과, DY30 균주 및 -ald5(Psald5 delted-strain) 균주가 약 1.5g/L의 L-rhamnose를 소비하면서 성장할 수 있는 반면, 야생형(D452-2) 및 -ald5 균주를 제외한 불완전 L-rhamnose 대사 균주(-rhtA, -rha1, -lra2, -lra3 및 -lra4 균주)들은 L-rhamnose를 단독 탄소원으로 하여 성장하지 못했다(도 2).
이러한 결과는 모든 이종 L-rhamnose 이화 경로 유전자는 L-rhamnose의 완전한 대사에 필수적이라는 것이라는 것을 의미한다.
<실시예 3> 재조합 균주에 의한 L-rhamnose 및 xylose의 공동 소비
DY30 균주는 L-rhamnose를 12시간까지 소비하고 더 이상 소비하지 못했다(도 3). 1mol의 L-rhamnose를 완전히 대사하기 위해서는 1mol의 NAD+ 보조인자가 팔요하다(도 1a). 따라서 산화환원 불균형을 해결하기 위하여, 균주 내 XYL1, XYL2 및 XYL3가 도입되어 자일로스를 활용할 수 있는 YE9 균주에 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 L-람노스 대사경로가 구축된 DY30 균주를 개발하고, 초기 세포 밀도(starting cell density)가 0.5g/L인 혐기조건에서 10g/L L-rhamnose 및 40g/L xylose를 포함하는 YP 배지에서 30℃, 130rpm의 배양조건으로 배양하였다. XYL1는 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자, XYL2는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, XYL3는 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자를 말한다.
그 결과, 대조군(YE9 균주)는 36시간 이내에 xylose를 완전히 소모하였지만 L-rhamnose는 거의 소모하지 않았다. 반면 DY30 균주는 36시간 이내에 xylose와 L-rhamnose를 동시에 소비함으로써 0.74 g/L의 L-lactic acid 및 13.7 g/L의 에탄올을 생산하여 에탄올 생산능이 대조군 균주보다 1.20배 향상되는 것을 확인하였다(도 4).
그러나 xylose와 L-rhamnose의 동시 섭취에도 불구하고 DY30 균주의 세포 성장은 감소하였다(도 4c). 이러한 결과는 효모 세포의 무분별한 효소 반응으로 인해 의도하지 않은 중간 대사산물이 축적되었을 수 있음을 시사한다.
<실시예 4> 자일로스 환원효소에 의한 L-락트알데히드의 1,2-프로판디올로의 전환
xylose와 L-rhamnose의 혼합당 발효 시 대사산물의 변화를 조사하고 확인하기 위해 HPLC와 GC/MS를 이용하여 대사체 분석을 수행하였다.
그 결과, DY30 균주가 xylose 및 L-rhamnose의 존재 하에 성장하는 동안, 미지의 화합물(RT 8.806 min)의 함량은 상당히 개선되는 것을 HPLC 분석을 통해 확인하였다(도 5a), L-rhamnose의 중간 대사산물인 1,2-프로판다이올(1,2-propanediol)은 GC/MS 분석을 통해 관찰하였다(도 5b).
이어서, L-락트알데하이드로부터 1,2-프로판디올을 생산하기 위한 L-락트알데히드 산화환원효소(L-lactaldehyde oxidoreductase)의 효소 반응이 내인성 알도-환원효소(aldo-reductase) 또는 DY30 균주의 P. stipitis(XYL1) 유래 이종 자일로스 환원효소(xylose reductase)의 대체 반응에 의해 촉매되는지 확인하기 위해, DY29 균주(이종 L-람노스 이화 경로를 발현하는 D452 균주)와 DY29 균주에 XYL1 유전자가 추가로 도입된 +XYL1 균주를 사용하여 제한된 환원효소 효소 반응 하에 NADH 및 NADPH 보조 인자에 대한 L-락트알데히드 환원효소 활성을 측정하였다.
그 결과, NADH를 보조인자로 사용한 내인성 알도-환원효소(aldo-reductase)와 이종 자일로스 환원효소(xylose reductase)의 활성을 확인하였으며, 특히 NADPH cofactor에서 매우 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다.
fucO에 의해 암호화된 대장균 유래 L-lactaldehyde oxidoreductase는 NADH 보조 인자를 필요로 하는 반면, XYL1에 의해 암호화된 자일로스 환원효소(xylose reductase)는 NAD(P)H 보조인자를 필요로 한다. 또한 P. stipitis에서 유래한 xylose reductase의 무분별한 효소 반응에 의해 대사경로가 전환될 수 있다고 알려져 있다.
따라서 DY30 균주는 xylose와 L-rhamnose 혼합당 발효에서 48시간 동안 2.5 g/L의 1,2-propanediol을 생산하였고(도 5d), xylose reductase의 무분별한 효소 반응에 의한 1,2-propandiol의 생산이 세포의 성장을 감소시킨 것으로 예상된다.
<실시예 5> L-람노스와 자일로스의 공동 소비에 의한 대사산물의 생산
상기 실시예 2 내지 4의 결과를 통해 L-rhamnose의 대사는 xylose를 보조기질로 함으로써 촉진되었고, 1,2-propandiol은 NADPH 의존성 heterologous xylose reductase의 무차별적 효소 활성에 의해 생성되었으나, 세포 성장을 감소시키는 것을 확인하였다.
xylose와 L-rhamnose의 공동 소비로부터 세포 성장과 대사산물 생산성이 향상될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 EFM 분석을 수행하여 수학적으로 실현 가능한 대사 반응을 예측하였다. EFM 분석을 위해 xylose, L-rhamnose 및 xylose와 L-rhamnose의 혼합물 조건에서 64개의 반응, 53개의 내부 대사산물 및 10개의 외부 대사산물로 구성된 효모의 핵심 대사 네트워크를 사용하였다.
그 결과, 중복 모델을 제거한 후 xylose, L-rhamnose 및 이들의 혼합 조건에서 각각 196, 93 및 120 EFM이 계산되었다. L-rhamnose와 xylose의 혼합 사용은 xylose를 유일한 탄소원으로 사용하는 것에 비해 세포 성장을 감소시켰지만(도 6), 완벽한 산화환원 균형이 달성되었고 에탄올 수율이 향상될 것으로 예측되었다(표 7). 이러한 결과는 L-rhamnose 및 xylose의 혼합당에 의한 발효가 에탄올(ethanol), L-락테이트(L-lactate) 및 1,2-프로판디올(1,2-propandiol)과 같은 다양한 부산물의 생성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 가설을 뒷받침하였다.
| No | When xylose and L-rhamnose are anaerobically fermented: | Yield (g/g substrates)* | |||||
| Biomass | Ethanol | Xylitol | Glycerol | L-lactate | PDO | ||
| 1 | Xylose + L-rhamnose → 2.5 Ethanol + 3 CO2 + PDO | - | 0.37 | - | - | - | 0.46 |
| 2 | Xylose + 2 L-rhamnose → 3.7 Ethanol + 3.7 CO2 + PDO + Lactate | - | 0.35 | - | - | 0.19 | 0.23 |
| 3 | 2 Xylose + L-rhamnose → 3 Ethanol + 4 CO2 + PDO + Glycerol | - | 0.3 | - | 0.2 | - | 0.46 |
| 4 | 3 Xylose + 4 L-rhamnose → 7 Ethanol + 7 CO2 + PDO + 3 Lactate + 2 Glycerol | - | 0.29 | - | 0.17 | 0.24 | 0.12 |
| 5 | 4 Xylose + L-rhamnose → 3 Xylitol + 2 Ethanol + 4 CO2 + PDO | - | 0.29 | 0.76 | - | - | 0.46 |
| 6 | Xylose + L-rhamnose → Xylitol + Ethanol + CO2 + Lactate | - | 0.28 | 1.01 | - | 0.29 | - |
| 7 | 6 Xylose + 7 L-rhamnose → 12 Ethanol + 12 CO2 + PDO + 6 Lactate + 5 Glycerol | - | 0.27 | - | 0.22 | 0.26 | 0.07 |
| 8 | 4 Xylose + L-rhamnose → 4 Ethanol + 6 CO2 + PDO + 3 Glycerol | - | 0.24 | - | 0.36 | - | 0.46 |
| 9 | 7 Xylose + L-rhamnose → 3 Xylitol + 1.5 Ethanol + 5 CO2 + PDO | - | 0.22 | 0.87 | - | - | 0.46 |
| 10 | 8 Xylose + L-rhamnose → 6 Xylitol + 2 Ethanol + 6 CO2 + PDO | - | 0.2 | 0.76 | 0.07 | - | 0.46 |
<실시예 6> 글루코스의 이화대사물 억제 (catabolite repression) 완화를 통한 글루코스 및 L-람노스의 동시 소비
L-람노스(L-rhamnose)의 대사에서 공동 기질(co-substrate)의 첨가는 대사산물 생성을 위한 효율적인 기질이었으나 결과적으로 세포 성장을 감소시켰다. L-람노스 대사에서 에탄올(ethanol), L-락테이트(L-lactate) 및 1,2-프로판디올(1,2-propandiol)과 같은 대사산물의 소비 및 세포 성장을 향상시키기 위해 먼저 세 가지 헥소키나아제(hexokinase) 돌연변이(GLK1의 A265G, HXK1의 T916C 및 HXK2의 1364ΔC)를 DY30 균주에 도입하여 DY31 균주를 제작하고, 대조군(DY30 균주)과 DY31 균주를 초기 세포 밀도(starting cell density)가 0.5g/L인 혐기조건에서 10g/L L-rhamnose 및 40g/L glucose를 포함하는 YP 배지에서 30℃, 130rpm의 배양조건으로 배양하였다. GLK1은 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자, HXK1은 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자, HXK2는 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)를 코딩하는 유전자를 말한다.
그 결과, 대조군(DY30 균주)은 L-람노스를 소비하여 에탄올과 L-락테이트를 생산하였으나, 배양 12시간 이내에 글루코스의 고갈과 함께 L-람노스 소비가 억제되는 것이 관찰되었다. 반면, DY31 균주는 대조군과 비교하여 48시간 동안 세포 성장 및 L-락테이트, 1,2-프로판디올의 생성을 각각 1.1배, 3.0배 및 2.9배 향상시켰다(도 7).
이러한 결과는 글루코스의 이화대사물 억제 (catabolite repression) 메커니즘이 다양한 탄소원의 흡수나 A. niger에서 유래한 L-rhamnose 특이 수송체의 발현을 억제하였으나, S. cerevisiae에서 세 가지 헥소키나아제(hexokinase)를 돌연변이 시키는 경우 글루코스의 이화대사물 억제 (catabolite repression)를 완화시켜 글루코스의 소비 속도를 늦춤으로써 NAD(P)H 보조 인자의 지속적인 공급을 유도하여 지속적인 대사산물 생산 및 세포 성장을 가능하다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 기술을 통해 S. cerevisiae에서 곰팡이 유래 L-rhamnose 대사 경로를 성공적으로 구축하였으며 L-rhamnose 수송체를 포함한 6가지 효소 반응이 L-rhamnose의 완전한 대사를 위해 필요하다는 것을 확인하였다. 또한, L-rhamnose 이외에 자일로스를 공동기질로 사용하고 헥소키나아제(hexokinase)를 돌연변이 시킴으로써 산화환원 불균형을 해소하고 L-람노스 대사에서 발효 효율을 높일 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (16)
- L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자, L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자, L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase), 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자, 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자가 도입된, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자, L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자, L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase) 및 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래인 것을 특징으로 하는, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제2항에 있어서,
상기 L-람노스 수송체(L-rhamnose transporter)를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되고, L-람노스 탈수소효소(L-rhamnose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, L-람노노 락토나제(L-rhamnono lactonase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되고, L-람노네이트 탈수효소(L-rhamnonate dehydratase)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되고 및 2-케토-3-데옥시-L-람노네이트 알돌라제(2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Aspergillus niger 유래인 것을 특징으로 하는, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제4항에 있어서,
상기 알데히드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자는 Pichia Stipitis 유래인 것을 특징으로 하는, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 자일로스 환원효소(xylose reductase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 표시되고, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 표시되고 및 자일룰로키나제(xylulokinase)를 코딩하는 유전자는 오탄당 대사경로 관련 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자, 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자 및 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)를 코딩하는 유전자에 활성 감소 돌연변이(deleterious mutation)가 도입된 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제8항에 있어서,
상기 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 표시되고, 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 표시되고 및 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제9항에 있어서,
상기 글루코키나아제(Glucokinase)를 코딩하는 유전자는 256번째 염기서열이 아데닌(adenine)에서 구아닌(guanine)으로 치환된 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제9항에 있어서,
상기 헥소키나제 동종효소 1(Hexokinase isoenzyme 1)을 코딩하는 유전자는 916번째 염기서열이 티민(thymine)에서 시토신(cytosine)으로 치환된 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제9항에 있어서,
상기 헥소키나제 동종효소 2(Hexokinase isoenzyme 2)을 코딩하는 유전자는 1364번째 염기서열이 삭제된 것인, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서,
상기 미생물은 사카로미세스(Saccharomyces) 속 균주인 것을 특징으로 하는, L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제13항에 있어서,
상기 사카로미세스 속 균주는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 L-람노스 및 자일로스 소비능을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는, 에탄올 또는 1,2-프로판디올 생산용 조성물.
- L-람노스(L-rhamnose) 및 자일로스(xylose)를 포함하는 배지에서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 에탄올 또는 1,2-프로판디올 생산방법.
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