KR20230150177A - 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 및 이의 용도 - Google Patents
고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 계대배양 및 마우스 대뇌 접종 방법을 사용하여 생산한 고역가 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 및 이의 용도에 관한 것이다.
일본뇌염은 모기에 의해서 매개되는 감염증으로, 사람에서 고열, 혼수 등을 동반한 뇌염을 일으켜 결국 사망에 이르게 하는 치명적인 인수공통전염병이다. 일본뇌염은 한국과 일본에서는 작은 빨간 집모기(Culex. tritaeniorhynchus)에 의해 전파되는 것으로 알려져 있으나, 중국, 인도를 비롯한 동남아시아 지역에서는 Culex. annulus, Culex. pipiens, Culex. gelidus 및 Anopheles spp. 모기도 일본뇌염 바이러스를 매개하는 것으로 알려져 있다. 불현성 감염을 나타내는 성인과는 달리 14세 이하의 어린이나 노약자가 일본뇌염에 감염되면 고열, 두통, 지각이상, 의식 장애, 혼수 및 사망을 일으키며, 회복기에는 언어 장애, 판단 능력 저하 등의 후유증이 나타난다. 돼지, 말, 소, 양, 염소를 포함한 가축과 비둘기, 왜가리 등과 같은 야생조류, 파충류가 이 병에 감수성이 있으며, 특히 돼지는 일본뇌염 바이러스의 증폭 숙주로 알려져 있어, 공중 보건학적으로 중요한 면역 대상 동물이다. 모기에 의해 일본뇌염 바이러스가 성돈과 비육돈에 감염되면 바이러스 혈증을 일으켜도 불현성 임상증상을 나타내지만, 임신돈이 일본뇌염에 감염되면 조산, 미이라 태아 등 유사산 증상과 신경 증상을 동반하는 허약 자돈을 분만하는 번식 장애 질병을 유발한다. 웅돈에서는 생식기에 침입하여 정자 형성을 저해하며, 정자수의 감소, 기형 정자의 증가로 수태율을 떨어뜨린다.
우리나라에서 일본뇌염은 1950년도 이후로 부터 지속적으로 발생해 온 모기에 의해서 매개되는 인수공통 감염증이며, 중국, 일본, 한국을 포함한 동남아시아에서 주로 발생하였다. 그러나 아시아가 아닌 지역인 호주, 아프리카, 러시아 등지에서도 보고되고 있어 다시 부상하는 신종 전염병으로 인식하고 있으며, 사람의 경우 아시아 지역에서만 매년 67,900여 건이 보고되고 있으며, 그 중 약 5,000명이 사망하고 있다. 특히, 최근 지구온난화와 기후의 변화는, 농업 관계수로의 정비, 농업의 전업화 및 규모화와 더불어 질병 매개체인 모기의 생태환경을 변화시켜 일본뇌염의 전파에 큰 영향을 줄 수 있어 더욱 문제가 되고 있다. 또한, 돼지가 일본뇌염 바이러스에 감염되면 2 ~ 3일간의 바이러스 혈증을 나타내고, 이 시기에 모기들이 흡혈을 하면 대량의 바이러스가 모기에 옮겨지게 된다. 돼지로부터 옮겨진 일본뇌염 바이러스는 모기의 체내에서 약 10일이 경과되면, 모기의 타액선을 통하여 다른 동물 혹은 사람에 감염될 수 있다. 따라서 증폭숙주인 돼지에 대한 일본뇌염의 방역과 면역의 형성은 사람의 일본뇌염 관리에 매우 중요하다.
현재 국내 유행하는 일본뇌염바이러스는 유전형 1형이며, 백신은 유전형 3형으로 접종이 시행되고 있다. 지난 2015년 우리나라에서 일본뇌염바이러스 감염된 환자로부터 유전형 5형이 최초 분리(분리주명 K15P38)되었고, 기존 유행 바이러스가 치환되는 우려가 제기되고 있다. 따라서 새로운 유전형(5형) 치환에 대한 대비가 필요하며, 본 발명은 환자로부터 분리된 유전형5형 바이러스를 이용하여 백신 후보물질을 개발하고자 하였다.
한국등록특허 제1642705호는 순화된 유전자 1형 일본뇌염 바이러스를 포함하는 돼지 일본뇌염 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 순화된 유전자 1형 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus) KV1899-120P(수탁번호 KCTC18347P) 및 이를 포함하는 백신 조성물을 개시하고 있고, 한국등록특허 제1484605호는 ＢＥＩ로 불활화된 일본뇌염 바이러스 ＫＶ1899주 항원 및 돼지의 ＧＭ－ＣＳＦ 재조합 단백질을 포함하는 일본뇌염 불활화 백신 조성물을 개시하고 있다.
그러나, 본 발명의 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 및 이의 용도에 관한 내용은 개시된 바 없다.
Emerg Infect Dis. 2020 May;26(5):1002-1006.
Virology. 1999 May 10;257(2):363-72.
Vaccine. 2010 May 7;28(21):3635-41.
상기의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 새로운 일본뇌염바이러스 유전형인 5형 유행에 대비하기 위하여, 국내 일본뇌염 환자로부터 확보된 바이러스를 이용하여 세포에서의 증식율이 향상된 고역가바이러스를 확보하고 이를 백신후보물질로 개발하고자 하는것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH을 제공한다.
K15P38-KNIH로 명명한 본 발명의 일본 뇌염 바이러스는 최근 국내에서 유행하고 있는 일본뇌염 바이러스에서 파생된 것으로, K15P38 바이러스주를 Vero 세포에서 계대배양하여 K15P38-V25 바이러스주를 수득하였고, 이를 마우스 대뇌에 접종하여 최종적으로 생성된 것이며, 유전체 염기서열 분석결과는 서열번호 1과 같다.
상기 일본뇌염 바이러스는 기탁번호 KCTC15027BP인 것일 수 있다.
상기 고역가는 1X108 pfu/mL 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 본 발명은 분리된 일본뇌염 바이러스를 마우스 대뇌에 접종하는 단계; 및 마우스 대뇌에서 일본뇌염 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 분리된 일본뇌염 바이러스는 일본뇌염 바이러스 유전형 5형인 것이고, Vero 세포에서 계대배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 접종은 2회 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 본 발명은 상기 일본뇌염 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신 조성물은 상기 바이러스 이외에도 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 비-수용액 담체의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는 물, 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제는 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.
또한, 상기 백신 조성물은 희석액의 형태로 어주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 어주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 어주번트로는 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 어주번트는 SEPPIC 사의 MONTANIDE IMS1313 어주번트이다.
본 발명의 목적을 위한 백신 조성물의 투여량은 투여대상의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 투여대상의 체중 1kg 당 001 내지 1㎖(105.0 TCID50/㎖ 이상), 바람직하게는 체중 1kg당 001 ~ 003㎖을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 백신 조성물은 경구, 근육, 피하, 복강, 정맥, 진피, 안구, 뇌내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 일본뇌염에 대한 예방 접종 방법을 제공한다.
본 발명은 백신개발을 위한 산업적 활용시 필수조건인 백신주의 증식율 개선을 위하여 인체분리주를 동물세포 및 마우스 뇌 접종 반복을 통해 고역가바이러스를 확보한 것으로서, 증식 개선주는 일부 유전자 변이가 있으나 원(original) 바이러스와 비교 시 면역원성을 유지함으로써 백신 후보주서의 활용도가 높을 것이다.
도 1은 일본뇌염바이러스 K15P38-V25와 K15P38-KNIH의 증식율 비교를 나타낸 것이다.
도 2는 일본뇌염바이러스 K15P38-V25 및 K15P38-KNIH 바이러스 면역원성 비교를 나타낸 것이다. 각 바이러스 접종 혈청 IgG ELISA. (A) original 일본뇌염 바이러스 부착, (B) K15P38-KNIH 바이러스 부착, 대조군(Ctrl)은 비면역 마우스 혈청.
도 3은 일본뇌염바이러스 K15P38-KNIH 접종혈청 중화항체능 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 일본뇌염바이러스 K15P38-V25 및 K15P38-KNIH 바이러스 면역원성 비교를 나타낸 것이다. 각 바이러스 접종 혈청 IgG ELISA. (A) original 일본뇌염 바이러스 부착, (B) K15P38-KNIH 바이러스 부착, 대조군(Ctrl)은 비면역 마우스 혈청.
도 3은 일본뇌염바이러스 K15P38-KNIH 접종혈청 중화항체능 분석결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 일본뇌염 바이러스주 제조방법
가. 계대배양주(K15P38-V25)
- 유전자 5형 일본뇌염 바이러스주인 K15P38로 고역가 바이러스를 제작하기 위해 Vero 세포에서 반복계대배양 실험을 수행하였다. K15P38 바이러스 주는 환자에서 분리된 original 바이러스이다. Vero(원숭이 신장상피세포 유래) 세포는 5x106 cells/75 flask에 접종하여 준비하였다. 24시간 후 DPBS를 사용하여 2회 세척 후 무혈청 MEM 3ml 배지에 200ul 접종 후 1시간 5% CO2에서 배양하였다. 총 배양액이 2% 혈청 MEM 6ml이 되게 추가 한 후 48시간 동안 5% CO2에서 배양하였다. 이 과정을 25계대 반복 수행하여 K15P38-V25를 제작하였다.
나. 마우스 대뇌 접종주(K15P38-KNIH)
- K15P38-V25 바이러스를 BALB/c 마우스의 대뇌 반복 투여를 통해 고역가바이러스 제작을 위한 본 실험을 수행하였다. 1set 당 5마리(암컷) 씩 준비 후 마취제(졸렐틸: 50㎕/kg, 럼푼: 10mg/kg 혼합)를 사용하여 근육주사 방법으로 마취시켰다. 머리 부위의 피부를 1cm 절개 후 소동물용 뇌심부 고정장치(Stereotaxic)에 마우스 머리를 고정하였다. 전정(bregma)을 확인후 해마 부위 우측 두개골을 뚫고 K15P38-V25을 2분(2.5㎕/min)에 걸쳐 5㎕를 투여하였다. 피부를 봉합하고 회복을 유도하였다. K15P38-V25 투여(0일)부터 5~6일차까지 병증 모니터링을 확인하였다. 이상증상(입모, 보행이상, 신전)이 발생하면 마우스 뇌조직을 적출하였다. 뇌조직에 1ml의 PBS를 넣고 조직 파쇄 후 원심분리(12,000rpm, 20분) 후 분리한 상층액을 다시 마우스에 접종하는 과정을 반복하였다.
<실시예 2> 세포 계대배양 및 마우스 대뇌 반복 접종에 따른 바이러스 역가 확인
가. Plaque assay 실험법을 통한 바이러스 역가 확인
- Vero 세포를 이용한 계대배양 및 vero 세포 계대배양 후 대뇌 반복 접종을 통해 확보한 바이러스의 역가를 비교하였음. 일본뇌염 유전형5형 분리주를 세포에서만 계대배양 반복한 결과(도 1. 검은색 블록) 세포 계대배양 1회, 20회, 25회 반복한 결과 최대 역가는 6.5×106 pfu/ml 이었으나, 마우스 뇌 반복 접종 후 다시 vero 세포에 1회, 3회, 5회 계대배양(도 1. 흰색 블록)으로 증식율이 개선되었으며 역가는 1.15×108 pfu/ml 임을 확인하였음.
- 임상검체 분리주(K15P38) 바이러스를 Vero 세포에서 계대배양한 (명칭 K15P38-V25) 경우 증식율 개선이 어려웠으나, 이후 마우스 뇌접종을 거친 (명칭 K15P38-KNIH, 기탁번호 KCTC 15027BP) 바이러스는 증식율이 개선되어 높은 역가값이 도출됨을 확인함. 세포에서 계대배양된 역가보다 마우스 대뇌에서 반복 계대 접종 후 세포에서 짧은 계대배양으로도 고역가 바이러스를 확인할 수 있었음(도 1).
<실시예 3> K15P38-V25 및 K15P38-KNIH 바이러스의 유전자 변이 확인
가. 일본뇌염바이러스 전장유전자 변이 분석
- Vero 세포 계대배양(passage 1과 25)과 고역가바이러스를 확보하기 위해 대뇌 반복 접종 한 일본뇌염바이러스의 염기서열 분석을 위해 Blast 2 sequence를 이용하여 전장유전자 변이를 분석함. 분석 결과 일본뇌염바이러스 DNA identites는 98%(10925/10945)로 일부 유전자 변이가 있음을 확인하였음(표 1). 최종 확보된 바이러스주(K15P38-KNIH)의 서열은 하기 서열번호 1과 같다.
| Virus 종류 | Sequence No. | |||||||||
| 231 | 238 | 283 | 289 | 290 | 539 | 757 | 1338 | 1628 | 1817 | |
| 환자분리주 Origin (K15P38) |
G | G | G | G | G | C | C | A | C | A |
| 세포계대 (K15P38-V25) |
G | G | G | G | G | C | C | A | T | A |
| 마우스 (K15P38-KNIH) |
T | T | T | A | A | G | T | C | C | G |
| 3552 | 3583 | 4067 | 4998 | 5004 | 5005 | 5010 | 5013 | 8361 | 10097 | |
| 환자분리주 Origin (K15P38) |
T | - | - | C | C | A | C | T | T | G |
| 세포계대 (K15P38-V25) |
T | - | - | T | T | T | T | A | T | A |
| 마우스 (K15P38-KNIH) |
G | A | A | C | C | A | C | T | C | G |
[서열번호 1] K15P38-KNIH 전장유전체 서열
TAGAAGTTTATCTGTGTGAACTTCTTGGCTTAGTATTGTTGAGAGGAATCGAGAGATTAGTGCAGTTTAAACAGTTTTTTAGAACGGAAGAAAACCATGA 100
CTAAAAAACCAGGAGGGCCCGGTAAAAACCGGGCTATCAATATGCTGAAACGCGGCATACCCCGCGTATCCCCACTTGTGGGGGTGAAGAGGGTAATTAT 200
GAACTTGCTCGACGGCAGAGGGCCAATACGATTCGTTTTGGCTCTCTTGGCGTTTTTCAATTTCACATCACTAGCCCCGACCAAGGCACTCGTTAGCCGA 300
TGGAAGGCAGTATAGAAAAACGTTGCAATGAAACATCTCACCAGTTTCAAAAAGGAACTGGGAACGCTCATCAACGCTGTAAATAAGAGGGGCAAAAAAC 400
AAAACAAAAGAGGAGGAAGTAATGGGACAGTCATCTGGATAATGGGCTTGGCAGTTGTGGTTGCCAGTGTGAGTGCAATCAAGCTGTCAAATTTTCAAGG 500
CAAGGTGCTGATGACAATCAACAACACCGATGTGGCTGATGTGATCACCATTCCCACCTCAAAAGGGAGTAATAGATGTTGGGTCCGAGCTATAGATGTG 600
GGACACATGTGCGAGGACACAATCACTTATGAATGCCCAAAGCTTGACGCTGGCAACGACCCGGAGGACATTGACTGCTGGTGCGACAAACAAGCCGTGT 700
ATGTCCAGTATGGACGTTGCACTAGGACCAGGCACTCCAGGAGAAGTAGAAGATCTGTGTCAGTGCAAACCCACGGAGAAAGTTCTTTAGTGAACAAAAA 800
AGAAGCCTGGATGGATTCGACGAAAGCCACTCGGTATCTCATGAAAACAGAGAATTGGATCATACGGAATCCAGGCTATGCTCTTGTGGCAGTGGCACTT 900
GGATGGATGCTTGGTAGCAACAACGGCCAGCGTGTGGTATTCACAATTCTCTTGCTGTTGGTCGCACCCGCATATAGCTTCAACTGCTTAGGTATGGGAA 1000
ATCGTGACTTCATCGAAGGAGTCAGTGGAGCGACGTGGGTGGACCTGGTGCTGGAAGGAGACAGTTGCCTCACCATCATGGCGAACGACAAACCAACATT 1100
GGACGTGCGCATGATAAACATCGAGGCCACGGAACTGGCTGAGGTGCGAACCTACTGCTACCACGCCACAGTGGCTGACATCTCAACAGTGGCAAGATGC 1200
CCCACGACTGGAGAAGCCCATAACACGAAGCGAGCTGACAGCAGCTATGTCTGCAAGCAAGGCTACACTGATCGTGGATGGGGAAACGGATGTGGGTTGT 1300
TTGGGAAAGGCAGCATTGACACATGCGCTAAATTTGTTTGCAGCCACAAGGCCATTGGAAAGATAATCCAGCCAGAAAACATCAAATATGAAGTTGGAGT 1400
GTTTGTTCATGGAACCACAACAGCAGAGAACCACGGAAATTACACAGCCCAGATTGGGGCTTCCCAGGCTGCCAAGTTCACCATCACGCCCAATGCTCCT 1500
TCCATCACTCTGAAGCTTGGAGATTACGGAGAAGTCACGATGGATTGCGAGCCGCGTAGTGGATTTAATACTGAGGCATTTTACGTGCTGACCGTAGGGT 1600
CTAAGTCGTTCCTAGTCCACCGCGAATGGTTCAATGATCTTGCGCTTCCGTGGCTATCTCCATCTAGCACAAATTGGAGAAATAGAGAGATCCTGATGGA 1700
GTTCGAAGAGGCTCACGCGACAAAACAGTCTGTCGTCGCGCTTGGATCACAAGAGGGAGCCTTGCATCAGGCATTGGCTGGTGCCATAGTGGTGGAGTAC 1800
TCTAGCTCAGTGAAGTTGACATCTGGTCACCTCAAATGCAGACTAAGAATGGAGAAGTTGGCGTTGAAAGGGACCACCTATGGTATGTGCACAGAGAAGT 1900
TCTCTTTTTCCAAGAATCCAGCTGACACTGGTCATGGTACGGTTGTCATAGAATTGCAGTACACCGGCACTGACGGACCTTGCAAGATACCCATTTCTTC 2000
GGTGGCCAGTCTGAATGATTTAACTCCAGTTGGTAGATTGGTGACAGTCAATCCTTTTGTTGCCACATCCACCGCCAATTCGAAGGTTTTGGTAGAATTG 2100
GAACCACCATTTGGAGATTCATTCATTGTTGTCGGAAGAGGAGATAAGCAGATCAATCACCATTGGCACAAGGCTGGCAGTTCACTGGGAAAGGCTTTCA 2200
CGACTACTTTGAAAGGAGCTCAGAGGCTGGCAGCCCTTGGTGACACCGCTTGGGACTTTGGATCCATTGGAGGGGTTTTCAATTCCATTGGTAAGGCCGT 2300
GCACCAAGTGTTTGGAGGAGCTTTCAGAACCCTTTTTGGTGGCATGTCCTGGATAACACAAGGATTGATGGGAGCGCTGCTGCTGTGGATGGGTATCAAC 2400
GCACGAGATCGGTCGATTGCACTAGCTTTTCTTGCTACAGGAGGTGTGCTCTTGTTTCTGGCCACCAATGTCCACGCCGATACCGGCTGCGCCATCGATA 2500
TAACCAGAAAAGAAATGAGGTGTGGTAGTGGCATATTTGTGCACAATGACGTGGAGGCTTGGGTTGATAGATACAAGTATCTACCTGAGACTCCCAAGTC 2600
TTTAGCCAAAATAGTCCACAAAGCACACAAGGAAGGCATTTGTGGAGTGAGATCAGTCACCAGACTGGAACACCAAATGTGGGAGGCCGTCAGGGACGAG 2700
TTAAATGTCTTGTTGAAGGAGAATGCGGTAGATCTTAGTGTGGTGGTGGACAAACCATCAGGAAGATACCGACCAGCTCCATTGCGGTTGGCCATGACTC 2800
AGGAAAAGTTTGAGATGGGTTGGAAAGCATGGGGGAAGAGCATTCTCTTTGCGCCGGAACTGGCCAATTCCACGTTTGTGATCGACGGACCTGAAACCAA 2900
AGAGTGTCCAGATGAGCGTAGAGCATGGAACAGCATGCAGATTGAGGATTTTGGGTTTGGCATTACGTCGACTCGAGTGTGGTTGAAGATCAGGGAGGAG 3000
CGCACGAATGAATGTGATGGAGCCATCATCGGCACGGCTGTTAAAGGGAACATGGCAGTGCACAGTGACTTGTCATACTGGATTGAAAGCCATCTCAACG 3100
ACACCTGGAAGCTCGAGAGAGCTGTGTTTGGAGAGATAAAGTCTTGCACTTGGCCAGAAACACACACGCTCTGGGGAGATGGTGTTGAGGAAAGTGAGTT 3200
GATAATTCCACACACACTCGCTGGACCCAAAAGCAAGCATAACAGAAGAGAGGGTTACAAGACACAGAATCAGGGACCATGGGACGAGAGTGAGATCACT 3300
CTTGATTTTGACTACTGTCCAGGGACCACAGTCACCATTGCTGAGGGATGTGGGAAAAGGGGGCCCTCAATCAGGACCACCACTGATAGTGGAAAATTAA 3400
TCACTGATTGGTGTTGCAGGAGCTGCACTTTGCCGCCACTGAGGTTCAGGACAGCCAGTGGGTGCTGGTATGGAATGGAAATACGGCCCATGAAgCATGA 3500
TGAATCCACGCTCGTGAAATCACAAGTCAACGCGTTTAATGGGGAGATGATTGATCCTTTTCAGTTGGGCCTTCTGGTGATGTTTCTGGCCACCCAGGAG 3600
GTCCTTCGCAAGAAGGTGGACGGCCAGACTGACGATTCCTGCGGTTTTGGGGGCCCTACTTGTTCTGATGCTTGGGGGCATCACCTACACTGATCTAGTG 3700
AGATATGTGGTGTTGGTGGCTGCTGCTTTCGCTGAAGCTAACAATGGAGGCGATGTAGTTCATTTGGCCCTGATTGCCGTATTTAAAATCCAACCGGCAT 3800
TCCTAGTCATGAGCATAGCAAGAACAAATTGGACAAACCAGGAAAACATTGCCCTAGTGCTAGGAGCTGCTTTCTTTCAGATGGCCTCAACAGACCTGGA 3900
GTTTGGTATCCATGGGCTGCTAAATGCAGCGGCGACGGCCTGGATGGTAGTGCGGGCGATCACGTTTCCCACGACCTCCACCATCACAATGCCCATACTA 4000
GCTTTGCTGGCGCCAGGAATGAGAGCTCTCCATCTTGACACCTACAGAATCTTTTTGCTTATCATCGGGGTCTGTGCTCTGCTGCATGAAAGGAGGAAAa 4100
aCCATGGCGAAGAAGAAAGGTGCTGTCCTTTTGGGTCTAGCCCTAAGTTCCACTGGGTGGTTTTCACCAGCCATTATGGCAGCTGGGCTCATGGCGTGCA 4200
ATCCAAACAAAAAGAGAGGATGGCCAGCGACAGAATTTCTGTCTGCGATTGGGTTGATGTTTGCTATTGTTGGGGGCCTGGCCGAGTTGGACATCGACTC 4300
TATGGCGATACCTTTCATGTTAGCTGGGCTTATGGCAGTGTCATATGTGGTATCAGGAAAAGCAACGGACATGTGGCTAGAACGTGCGGCCGACATTAGT 4400
TGGGAAGTGGATGCAGCGATCACAGGCAGCAGCCGAAGGTTGGACGTCAAACTAGATGATGATGGAGATTTCCACCTTATTGATGATCCAGGCGTCCCAT 4500
GGAAAATTTGGGTACTGCGCATGTCTTGCATAGGATTGGCGGCCTTCACACCATGGGCCATCATCCCAGCGGCTTTTGGATATTGGCTGACTTTGAAAAC 4600
CACAAAGAGAGGAGGCGTTTTTTGGGACACACCATCACCCAAAGTCTACGCAAAAGGGGACACAACCACAGGAGTGTACAGGATAATGGCTCGAGGGATC 4700
TTTGGCGTCTACCAAGCAGGTGTTGGAGTGATGTATGAGAACGTGTTCCACACTCTGTGGCACACGACCAGAGGAGCTGCCATAATGAGTGGAGAAGGAA 4800
AGTTGACGCCGTACTGGGGAAGCGTTAAGGAGGACCGCATAACTTATGGGGGCCCATGGAGATTCGATCGAAAATGGAATGGAGTGGATGACGTGCAAAT 4900
GATTGTAGTTGAACCAGGAAAAGCAGCTGTAAATGTCCAAACAAAGCCGGGAGTGTTTCGGACTCCACACGGAGAAATTGGAGCTGTTAGCCTGGATTAC 5000
CCTAGTGGGACATCGGGCTCACCCATCCTGGACATCAACGGTGATATCATTGGATTGTATGGGAACGGAGTTGAACTTGGAGATGGCTCATATGTGAGCG 5100
CCATTGTGCAGGGTGAACGGCAAGAAGAGCCCATCCCCGATGCATACAATCCAAACATGCTCAAGAAAAGGCAGCTGACCGTGTTGGACTTGCATCCAGG 5200
ATCTGGGAAAACAAGGAAAATCTTACCCCAAATCATCAAGGATGCCATTCAACAGCGTCTCAGAACAGCTGTTCTGGCGCCCACTCGGGTTGTTGCAGCT 5300
GAGATGGCAGAAGCTCTTAGAGGACTTCCCGTTAGATACCAAACTTCAGCGGTTCCGCGAGAACATCAGGGGAATGAGATAGTTGATGTCATGTGTCACG 5400
CCACCTTAACGCATAAGCTGATGTCACCAAATCGCGTCCCCAATTACAACTTGTTTGTCATGGATGAGGCCCATTTCACAGACCCAGCCAGCATCGCCGC 5500
TAGAGGATACATATCCACCAGAGTGGAATTGGGAGAAGCCGCGGCTATCTTCATGACTGCCACTCCACCAGGAACGACTGACCCCTTCCCTGACTCCAAC 5600
GCTCCCATTCATGATTTGCAGGACGAGATCCCTGACAGAGCATGGAGCAGTGGGTATGAATGGATAACTGAGTACTCTGGGAAGACAGTATGGTTTGTGG 5700
CGAGTGTGAAAATGGGCAACGAAATCGCAGTGTGTCTACAGAGAGCCGGAAAGAGAGTCATCCAGTTAAATCGGAAATCTTATGACACCGAGTACCCCAA 5800
ATGTAAGAATGGGGATTGGGATTTTGTCATCACCACGGACATTTCTGAAATGGGGGCCAACTTTGGAGCGAGCAGAGTGATTGATTGTAGGAAGAGTGTG 5900
AAACCCACCATTCTGGAAGAAGGAGAAGGAAGAGTCATTCTCAGCAACCCATCGCCTATCACCAGTGCGAGTGCAGCCCAGCGGAGAGGCAGAGTGGGCA 6000
GAAATCCAAATCAGGTTGGAGATGAGTACCATTACGGAGGGGTCACAAGTGAAGATGACACCAACCTAGCACACTGGACAGAAGCCAAGATCATGTTGGA 6100
CAACATCCACCTGCCAAATGGGTTGGTAGCTCAGCTCTATGGACCTGAAAGGGAAAAGGCCTTCACAATGGACGGTGAGTATCGATTGAGGGGTGAAGAA 6200
AAGAAGAACTTTCTGGAGTTAATCAGAACAGCCGACCTCCCCGTATGGCTAGCTTACAAAGTGGCTTCAAATGGAATACAGTACACCGATAGGAGATGGT 6300
GTTTTGATGGACCTCGGACGAATGCTATCTTAGAAGACAGCACTGAAGTAGAGATAATCACCAGAACGGGAGAAAGGAAAATTCTAAAACCAAGATGGCT 6400
GGACGCACGGGTGTACGCAGATCACCAGGCTTTGAAGTGGTTTAAGGACTTCGCAGCAGGAAAGAGATCAGCTGTCAGTTTTCTAGAGGTGCTTGGGCGC 6500
ATGCCAGAGCACTTCATGGGGAAAACGCGTGAAGCTCTTGATACAATGTACCTGGTTGCCACGGCAGAAAAAGGGGGAAAAGCTCACCGAATGGCCCTGG 6600
AGGAACTGCCAGATGCACTGGAGACGGTGACACTCATCGCAGCGCTTGCCGTGATGACAGGTGGGTTCTTTCTACTCATGATGCAACGAAAGGGCATAGG 6700
AAAAATGGGCCTCGGGGCTCTCGTGCTCACCCTGGCCACTTTCTTCTTGTGGATGGCAGAGGTCTCAGGGACGAAAATAGCCGGGACCTTACTCATAGCG 6800
TTGCTGCTTATGGTGGTACTCATCCCGGAGCCGGAGAAGCAAAGATCCCAAACGGACAACCAGTTGGCCGTGTTTCTGATCTGCGTCCTCACCGTAGTGG 6900
GAATTGTGGCTGCTAATGAGTATGGCATGCTCGAAAAGACCAAGGAAGACATAAGGAATGTGTTTGGTAACAAGGTTCAGACATCCAATGCACCTGGAAG 7000
CCTATCAAGTCTGGCGCTCGATCTACGACCAGCAACGGCTTGGGCCTTATATGGAGGTAGTACAGTGATTTTAACTCCACTGCTGAAACATTTGATCACC 7100
TCTGAGTATGTGACAACATCACTAGCTTCAATCAACTCACAGGCCGGCTCACTTTTTGTTTTGCCAAAAGGCATGCCTTTCACGGATTTGGATCTGACGG 7200
TTGGACTCGTCTTTCTGGGTTGTTGGGGGCAAATCACTCTCACCACTTTTCTGACAGCTGGAGTGTTAGTAGTTCTGCATTACGGCTATATGCTCCCTGG 7300
CTGGCAAGCTGAAGCCCTGAGGGCAGCTCAGAGACGAACAGCTGCGGGTATCATGAAGAACGCCGTTGTGGATGGGATGGTTGCCACTGATGTGCCTGAA 7400
TTGGAAAGAACAACACCCCTAATGCAGAAGAAGGTGGGGCAAGTGTTGCTAATAGGAGTCAGTATAGCAGCTTTTCTTGTCAATCCCAATGTCACCACCG 7500
TGCGAGAAGCCGGTGTGCTGGTGACCGCTGCTACGCTCACCCTATGGGATAATGGAGCAAGTGCCGTCTGGAATTCAACTACAGCCACAGGACTCTGCCA 7600
CGTCATGCGAGGCAGTTACTTGGCTGGTGGTTCAATAGCTTGGACTCTCATCAAGAATGTTGATAAACCATCCTTGAAAAGAGGAAGGCCTGGAGGAAGA 7700
ACGCTGGGTGAGCAATGGAAAGAAAAATTGAACGCCATGAACAAAGAAGAGTTTTTCAGGTACAGGAAAGAAGCCATAGTTGAGGTGGACCGCACAGAGG 7800
CACGCAGGGCTAGACGAGAGAATAACAAAGTGGGAGGTCATCCCGTGTCACGAGGTTCAGCAAAGCTCCGATGGATGGTGGAGAAAGGGTTTGTCTCCCC 7900
TGTTGGAAAGGTTGTGGACCTTGGCTGTGGGCGGGGAGGATGGTGCTATTATGCTGCCACTCTGAAAAAAGTGCAAGAAGTTAAAGGTTATACAAAAGGA 8000
GGGGCCGGACATGAGGAACCGATGCTGATGCAAAGCTATGGTTGGAATCTGGTCACGATGAAGAGTGGAGTGGATGTGTTCTACAGACCTTCAGAGCCTA 8100
GTGACACCCTGCTCTGTGACATAGGGGAGTCTTCTCCAAGTCCAGACGTCGAGGAGCAACGCACTCTGCGGGTTCTGGAAATGGCATCAGAGTGGCTACA 8200
CCGAGGACCCAGAGAATTCTGCATTAAAGTTTTGTGTCCATACATGCCAAAGGTGATAGAAAAGATGGAAACGCTACAACGTCGCTTTGGAGGCGGACTG 8300
GTGCGCGTTCCCCTGTCACGCAACTCAAATCACGAAATGTACTGGGTTAGTGGGGCTGCTGGGAACGTGGTACATGCTGTAAACATGACCAGTCAAGTTT 8400
TGCTGGGGCGAATGGACCGACCAGTCTGGAGAGGACCCAAATATGAAGAAGATGTCAACTTGGGAAGCGGGACCAGAGCTGTAGGGAAAGGTGAGGTTCA 8500
CAGTGACCAAGGAAAAATCAAGAAGCGGATAGAGAAGCTGAAAGAAGAGTATGCAGCGACGTGGCACGAGGACCCTGAACATCCATACCGCACTTGGACA 8600
TACCATGGAAGCTATGAAGTGAAGGCCACCGGTTCAGCCAGCTCCCTTGTCAACGGAGTGGTTAAGCTCATGAGTAAACCTTGGGATGCCATCACTAGTG 8700
TCACCACCATGGCCATGACTGACACTACTCCCTTTGGTCAGCAGAGAGTCTTCAAAGAAAAAGTTGACACCAAGGCGCCTGAGCCACCTGCAGGAGTTCG 8800
GGAAGTGCTGGACGAAACTACCAACTGGCTGTGGGCCTACTTGTCAAGAGAGAAAAGACCTCGCTTGTGTACGAGAGAGGAGTTCATCCGGAAAGTCAAC 8900
AGCAACGCAGCTCTTGGAGCCATGTTTGCCGAGCAAAATCAGTGGAGCTCAGCCAGGGAGGCTGTTAGTGACCCGGCCTTCTGGAACATGGTCGACATTG 9000
AAAGAGAGAACCACCTACGAGGGGAGTGCCACACCTGCATCTACAACATGATGGGAAAAAGAGAAAAGAAACCTGGTGAGTTTGGGAAGGCTAAAGGAAG 9100
CAGAGCTATCTGGTTCATGTGGCTCGGAGCCCGCTACCTGGAATTCGAGGCACTCGGGTTCCTGAACGAGGACCATTGGCTGAGCAGGGAGAACTCTGGA 9200
GGAGGAGTGGAAGGCTCAGGCATACAGAAGCTAGGGTACATTTTGCGAGACATCTCAACGAAATCTGGAGGGAAAATGTATGCTGATGACACCGCAGGCT 9300
GGGACACTAGGATCACAAGGGTTGATCTGGACAATGAGGCAAAGGTGCTGGAACTTCTGGATGGGGAGCACAGGATGTTGGCCCGTGCTATTATAGAATT 9400
GACTTACAAACACAAAGTTGTCAAAGTAATGAGGCCAGCAGTAGGTGGAAAGACCGTGATGGATGTGATCTCTAGAGAAGATCAAAGAGGGAGTGGGCAA 9500
GTGGTCACATATGCTCTCAACACCTTCACAAACATAGCTGTCCAGCTAGTGAGGTTGATGGAGGCTGAAGGGGTTGTCGGTCCACAGGATGTGGAGCAGC 9600
TCCCCAGGAAAACCAAATTCGCAGTCAGGACATGGCTTTTTGAAAATGGAGAAGAGAGAGTCACCAGAATGGCAGTGAGTGGGGATGACTGCGTTGTCAA 9700
ACCTTTGGATGACAGATTCGCGCATGCTTTACACTTCTTGAATGCGATGTCAAAGGTGAGGAAAGACATACAAGAATGGAAGCCATCTCAAGGCTGGCAC 9800
GACTGGCAGCAAGTCCCTTTCTGCTCGAACCACTTTCAGGAGATTGTGATGAAGGATGGTAGAAGCCTTGTTGTGCCCtGCCGGGGACAGGATGAGTTAA 9900
TAGGCAGGGCCCGGATTTCACCAGGAGCAGGATGGAATGTGAGAGACACAGCCTGCCTAGCTAAGGCCTACGCCCAAATGTGGCTCCTCCTCTACTTTCA 10000
CCGGAGAGACTTGCGCCTTATGGCCAACGCGATCTGCTCAGCCGTTCCGGTAGACTGGGTACCCACAGGTAGGACATCATGGTCGATACACTCAAAAGGA 10100
GAGTGGATGACAACAGAAGACATGCTGCAGGTGTGGAACAGGGTATGGATTGAGGAGAATGAATGGATGAGAGACAAAACCCCCGTCGCCAGTTGGACCG 10200
ACGTCCCATACGTCGGAAAGAGGGAAGACATCTGGTGCGGCAGCTTGATCGGAACGCGGACAAGGGCCACCTGGGCAGAAAACATCTATGCAGCAATAAA 10300
CCAAGTGAGAGCAATAATTGGAAATGAAAAGTATGTGGACTACATGACATCACTTAGGAGGTATGAAGACACTTTGGTCCAGGAAGATAGAGTAATTTAA 10400
AAAACTTTTGGTAATGAGTGTAAATAGTAGTATTTATTGTAAATAGTGTAAATAAACAAATTTAAATAGGAAGTCAGGCCGACGTAAGTCGCCACCGGAT 10500
GCTGAGTAGACGGTGCTGCCTGCGCCTCAGCCCCAGGAGGACTGGGTTAACAAATCTGACAACCGAAGGTAGGAAAGCCCTCAAAACCGTCTCGGAAGAA 10600
GGTCCCTGCTTACTGGAGGTTGGAAGACCGTGTCAGGCCACGCAAGTGCCACTTCGCTGAGGAGTGCAGCCTGTACAGCCCCGGGAGGACCGGGTAAACA 10700
AAGCCGATGAGGCCCCCACGGCCCAAACCTCATCCAGGATGCAATGGATGAGGCGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCGTGGAAAAGAAAATGCGG 10800
CCCAAACTCTTTcGAAGCTGTAGAAGGAGTGGAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCGCATTTGCATCAAAACAGCATATTGACACCTGGGATTAGACT 10900
AGGAGATCTTCTGATCTATCTCAACATCAGCTACAAGGCACAGAGCGCCGAAATATGTAGCTGGTGGTGGGGAAGAACACAGGATCT 10987
<실시예 4> K15P38 및 K15P38-KNIH 면역원성 확인
가. ELISA 분석법을 이용한 면역원성 분석
- K15P38 및 K15P38-KNIH 바이러스를 각각 마우스에 면역한 후 혈청을 확보하였음. 각 바이러스를 면역 후 얻은 혈청을 이용하여 각 바이러스에 대하여 혈청의 immunoglobulin G(IgG) 생성 및 교차반응 면역원성을 확인하기 위한 ELISA법을 수행하였음. 세포계대 전 original 일본뇌염바이러스(K15P38) 또는 K15P38-KNIH 바이러스를 ELISA plate에 부착(coating) 후 각 세포계대 바이러스(K15P38-V25) 또는 마우스 뇌 계대 바이러스(K15P38-KNIH) 면역 혈청의 바이러스 특이 immunoglobulin G(IgG) 생성을 비교한 결과 세포계대 및 뇌 계대 바이러스의 면역원성은 차이가 없음을 확인하였음(도 2).
- Original 분리주에 대한 항체 반응이 두 계대배양 방법에 따른 차이가 없었으며(도 2A), 뇌 계대 접종 바이러스에 대한 면역원성 역시 큰 차이 없이 유사함을 확인함(도 2B).
나. PRNT(Plaque Reduction Neutralization Test) 분석법을 이용한 중화항체 형성 분석
- 일본뇌염바이러스 K15P38-KNIH 로 면역된 마우스 혈청을 이용하여 original 바이러스(K15P38) 및 고역가바이러스(K15P38-KNIH)에 대한 중화항체 역가 (ND50, Karber formula)를 비교함.
- K15P38-KNIH 바이러스주를 면역 후 얻은 마우스 혈청이 original 바이러스에 대해서도 고역가바이러스와 유사한 정도의 효과적인 중화능이 있음을 확인하였음(도 3).
- 고역가바이러스(K15P38-KNIH) 면역 후 생성된 중화항체가 original 분리주 및 고역가바이러스에 대해서 효과적인 중화능을 확인할 수 있었으며, 일부 유전자 변이가 면역원성에 큰 영향이 없음을 확인하였음.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH.
- 제1항에 있어서, 상기 일본뇌염 바이러스는 서열번호 1의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH.
- 제1항에 있어서, 상기 일본뇌염 바이러스는 마우스 대뇌 접종을 통해 생성된 것을 특징으로 하는 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH.
- 제1항에 있어서, 상기 일본뇌염 바이러스는 기탁번호 KCTC15027BP인 것을 특징으로 하는 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH.
- 제1항에 있어서, 상기 고역가는 1X108 pfu/mL 이상인 것을 특징으로 하는 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH.
- 분리된 일본뇌염 바이러스를 마우스 대뇌에 접종하는 단계; 및
마우스 대뇌에서 일본뇌염 바이러스를 수득하는 단계;를 포함하는
고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH를 제조하는 방법 - 제6항에 있어서, 상기 분리된 일본뇌염 바이러스는 일본뇌염 바이러스 유전형 5형인 것을 특징으로 하는 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH를 제조하는 방법
- 제6항에 있어서, Vero 세포에서 계대배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH를 제조하는 방법
- 제6항에 있어서, 상기 접종은 2회 이상인 것을 특징으로 하는 고역가 일본뇌염 바이러스 유전형 5형 K15P38-KNIH를 제조하는 방법
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 일본뇌염 바이러스를 포함하는 백신 조성물
- 제10항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물
- 제10항의 백신 조성물을 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 일본뇌염에 대한 예방 접종 방법
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-
2022
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| KR101642705B1 (ko) | 2015-03-05 | 2016-07-28 | 대한민국 | 순화된 유전자 1형 일본뇌염 바이러스를 포함하는 돼지 일본뇌염 예방용 백신 조성물 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Emerg Infect Dis. 2020 May;26(5):1002-1006. |
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| Virology. 1999 May 10;257(2):363-72. |
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