KR20230148543A - 형질전환 제브라피쉬를 이용한 탈수초성 질환 동물모델 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제브라피쉬 탈수초성 질환 동물모델 제조에 관한 것으로, QF2-QUAS system을 통하여 Myelin Basic Protein (MBP) promoter에 의해 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)에서 특이적으로 형광이 발현되는 형질전환 제브라피쉬를 제조하는 방법과 화학유전학 기법 중 하나인 enhanced potency nitroreductase (epNTR) / metronidazole (MTZ) system을 통하여 형질전환 제브라피쉬에서 선택적으로 희소돌기아교세포가 사멸된 탈수초성 질환 동물모델을 제조하는 방법 등에 관한 것으로서, 본 발명의 형질전환 제브라피쉬는 저농도의 MTZ를 단시간 처리를 통해 기존의 모델보다 강력한 수준으로 희소돌기아교세포의 사멸이 유발되어 효율적으로 탈수초화 질환 동물모델을 제조할 수 있으며, 본 발명의 탈수초화 질환 동물모델은 탈수초화 질환 치료제가 즉각적이고 강력하게 반응하는바 탈수초화 질환 치료제 스크리닝 플랫폼으로 제공될 수 있고, 탈수초화 질환의 기전, 수초화 및 재수초화 조절 물질의 작용 등의 연구 수행에 전체적인 효율성을 높여 연구 진행 속도의 가속화에 크게 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 제브라피쉬 탈수초성 질환 동물모델 제조에 관한 것으로, QF2-QUAS system을 통하여 Myelin Basic Protein (MBP) promoter에 의해 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)에서 특이적으로 형광이 발현되는 형질전환 제브라피쉬를 제조하는 방법과 화학유전학 기법 중 하나인 enhanced potency nitroreductase (epNTR) / metronidazole (MTZ) system을 통하여 형질전환 제브라피쉬에서 선택적으로 희소돌기아교세포가 사멸된 탈수초성 질환 동물모델을 제조하는 방법 등에 관한 것이다.
탈수초성 질환 (demyelinating disease)은 축색돌기를 둘러싼 수초가 손상되어 나타나는 신경계통 질환으로, 중추신경계의 탈수초성 질환인 다발성 경화증 (multiple sclerosis)은 유전적, 환경적 요인과 함께 바이러스의 감염 등으로 인하여 인체 내 면역 조절 기능에 문제가 발생하여 자신의 미엘린 수초 (myelin sheath)를 잘못 공격하여 파괴하는 일종의 자가 면역질환 (autoimmune disease)이다. 다발성 경화증은 전 세계적으로 약 250 만명 유병률을 가지며, 국내에는 약 2,500여명의 유병률을 보이고 있으나, 여전히 병인이 명확하지 않고, 기존 치료제의 효과나 사용 대상이 제한되어 있다. 또한, 현재 사용 중이거나 개발 중인 치료제들은 모두 자가면역반응 억제를 통한 면역반응의 조절에 초점이 맞추어져 있어 완전한 치료를 위해서는 기존의 방법인 자가면역반응의 억제와 더불어 이미 탈수초화가 진행된 질환의 발생부위에서 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에 의한 재수초화를 촉진할 수 있는 치료제 개발이 필요한 실정이다.
신경세포의 수초화(demyelination) 및 재수초화(remyelination)는 신경세포에서 분비되는 각종 신경 조절물질들의 작용에 의하여 정교하게 조절되는 과정으로, 신경 네트워크 형성에 매우 중요한 역할을 수행한다. 하지만, in vitro 연구뿐만 아니라, 마우스 등의 포유동물모델에서도 관련 유전자 발굴 및 기능 연구가 어려워 신경세포 유래 신경 조절물질에 의한 조절 기전 연구는 미비한 실정이다.
제브라피쉬는 인간 유전체와 높은 유전학적 및 기능적 유사성을 가진 척추동물로서, 신경계 및 각종 기관형성과정이 사람과 매우 유사하기에 인간의 질환연구를 위하여 세계적으로 많은 연구가 이루어지고 있는 중요한 동물모델이다. 이와 함께 제브라피쉬는 유전자 조작이 용이해 형질전환 모델 개발이 가능하며, 발생과정 중 배아가 투명하기 때문에 희소돌기아교세포 및 수초 특이적으로 형광단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 이용할 경우, 생체 내에서 신경세포의 수초화 및 탈수초화 과정을 손쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있다. 또한 대량의 배아 확보가 가능하기 때문에 질환 치료제 후보물질의 스크리닝에 매우 탁월한 모델이기도 하다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고 제브라피쉬를 이용한 탈수초성 질환 동물모델 제조 연구와 탈수초성 질환 분석 방법에 대한 연구는 거의 이루어져 있지 않다.
기존의 연구에서 질환 발병을 위한 형질전환 제브라피쉬 모델 제조 시, 특정 유전자를 과발현 시킬 수 있는 Gal4-UAS (upstream activating sequence) system을 활용하였으나, 더 강력하게 유전자 발현을 유도할 수 있는 Q (QF2-QUAS) system을 활용할 경우, 더 높은 효율로 발병이 유발된 질환 모델이 제조되어 치료제 개발을 위한 약물의 유효성 검증에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 형질전환 제브라피쉬 모델에서 희소돌기아교세포만을 특이적으로 사멸시켜 탈수초화를 유도하기 위해서는 특정 세포만을 특이적으로 사멸시키는데 사용되는 화학유전학 기법 중 하나인 nitroreductase (NTR) / metronidazole (MTZ) system을 활용해야 한다. NTR/MTZ system은 박테리아에서 유래된 NTR이 전구 약물 (pro-drug) 상태의 MTZ를 환원 (reduction)시켜 세포독성 (cytotoxin)을 나타내는 물질로 전환시킴으로써, 특정 세포의 사멸을 유발하는 chemogenetic ablation system이다. 현재, 이러한 시스템을 통하여 제브라피쉬의 희소돌기아교세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 모델은 존재하나, 탈수초화를 유도하기 위한 희소돌기아교세포의 사멸을 위해서는 장시간 고농도의 MTZ 처리가 요구되는 실정이다. 따라서 NTR의 단점을 보완함과 동시에 제브라피쉬 모델에 최적화되어 개량된 형태인 enhanced potency nitroreductase (epNTR)를 활용할 경우, 단시간 저농도의 MTZ 처리만으로도 더 높은 효율의 세포사멸이 가능하나, 현재까지 이러한 시스템을 통해 희소돌기아교세포를 선택적으로 사멸시켜 탈수초화를 유도할 수 있는 제브라피쉬 모델은 없는 실정이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 형질전환 제브라피쉬 및 이의 제조방법과, 상기 형질전환 제브라피쉬를 이용한 탈수초화 질환 동물모델과 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 탈수초화 질환 동물모델을 이용한 탈수초화 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (1) MBP(myelin basic protein) 프로모터 하에서 작동하는 QF2 유전자; 및 (2) QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR(enhanced potency nitroreductase) 및 리포터 유전자;가 도입된 형질전환 제브라피쉬를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 epNTR과 리포터 유전자는 자가 절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 암호화하는 유전자로 연결된 것일 수 있으며, 상기 자가 절단 펩타이드는 P2A일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있고, 상기 형광 단백질은 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescentprotein; EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP), 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 형질전환 제브라피쉬의 제조방법을 제공한다:
(a) MBP(myelin basic protein) 프로모터 하에서 작동하는 QF2 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 제조단계;
(b) QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR(enhanced potency nitroreductase) 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 제조단계;
(c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 각 플라스미드 벡터를 제브라피쉬 수정란에 형질전환하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 제브라피쉬 수정란을 배양하여 성체(F0)로 발달시키는 단계;
(e) 상기 형질전환된 성체 제브라피쉬와 야생형 제브라피쉬를 교배하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 교배 후 확보된 제브라피쉬 중에서 리포터 유전자를 발현하는 제브라피쉬(F1)을 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (c) 단계는 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 각 플라스미드 벡터를 제브라피쉬 수정란 1세포기에 유전자전이효소 (transposase)와 함께 미세주입 (microinjection)하여 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 형질전환 제브라피쉬에 MTZ를 처리하는 단계를 포함하는 탈수초성 질환 동물모델 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 MTZ 처리는 형질전환 제브라피쉬(F1) 수정 후 3-6일 째에 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 수정 후 5일째에 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 MTZ의 처리는 0.5 ~ 10 mM MTZ를 10~60 시간 동안 처리하는 것일 수 있고, 바람직하게는 2 mM MTZ를 18시간 동안 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 탈수초성 질환(demyelinating disease)은 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth dis- ease; CMT)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 탈수초성 질환 유도의 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 탈수초성 질환 유도의 동물모델을 이용한 탈수초성 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
(가) 상기 탈수초성 질환 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(나) 상기 후보물질을 처리한 동물과 후보물질을 처리하지 않은 탈수초성 질환 동물의 탈수초성 질환이 회복되는 시간을 비교하는 단계; 및
(다) 상기 후보물질을 처리한 동물이 후보물질을 처리하지 않은 동물보다 탈수초성 질환이 회복되는 시간이 짧은 경우 상기 후보물질을 탈수초성 질환의 치료 물질로 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 탈수초성 질환의 회복은 각 동물의 운동성 회복 또는 희소돌기아교세포의 재생을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (나) 단계는 후보물질을 처리한 동물과 후보물질을 처리하지 않은 동물의 운동성을 측정하여 탈수초화를 유도하지 않은 상기 형질전환 제브라피쉬(F1) 또는 야생형 제브라피쉬 수준으로 운동성이 회복되는 시간을 비교하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (나) 단계는 후보물질을 처리한 동물과 후보물질을 처리하지 않은 동물의 희소돌기아교세포가 재생되는 시간을 비교하는 것일 수 있으며, 상기 희소돌기아교세포의 재생 수준은 리포터 유전자 발현 세포를 관찰하는 것으로서 확인할 수 있다.
본 발명의 형질전환 제브라피쉬는 저농도의 MTZ를 단시간 처리를 통해 기존의 모델보다 강력한 수준으로 희소돌기아교세포의 사멸이 유발되어 효율적으로 탈수초화 질환 동물모델을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 탈수초화 질환 동물모델은 탈수초화 질환 치료제가 즉각적이고 강력하게 반응하는바 탈수초화 질환 치료제 스크리닝 플랫폼으로 제공될 수 있고, 탈수초화 질환의 기전, 수초화 및 재수초화 조절 물질의 작용 등의 연구 수행에 전체적인 효율성을 높여 연구 진행 속도의 가속화에 기여할 수 있다.
도 1은 타크린(tacrine) 처리에 따른 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델에서의 운동성 변화 확인을 위한 실험 모식도(A)와 실험의 결과이다(B).
도 2는 타크린(tacrine) 처리에 따른 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델에서의 회소돌기아교세포의 사멸 및 재생 확인을 위한 실험 모식도(A)와 실험의 결과이다(B).
도 3은 탈수초성 질환 치료제 후보물질 중 10종의 kinase inhibitor에 대한 유효성 평가를 위한 실험 모식도(A)와 상기 10종 약물을 처리한 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델의 운동성 변화를 확인한 결과(B) 및 희소돌기아교세포의 사멸 및 재생을 확인한 결과(C)이다.
도 4는 본 발명의 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델과 종래의 형질전환 동물모델의 MTZ 처리 농도 및 시간에 따른 탈수초성 질환 유도 효율을 형광의 발현 빈도, 세기 및 지속 시간을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 타크린(tacrine) 처리에 따른 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델에서의 회소돌기아교세포의 사멸 및 재생 확인을 위한 실험 모식도(A)와 실험의 결과이다(B).
도 3은 탈수초성 질환 치료제 후보물질 중 10종의 kinase inhibitor에 대한 유효성 평가를 위한 실험 모식도(A)와 상기 10종 약물을 처리한 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델의 운동성 변화를 확인한 결과(B) 및 희소돌기아교세포의 사멸 및 재생을 확인한 결과(C)이다.
도 4는 본 발명의 탈수초성 질환 제브라피쉬 모델과 종래의 형질전환 동물모델의 MTZ 처리 농도 및 시간에 따른 탈수초성 질환 유도 효율을 형광의 발현 빈도, 세기 및 지속 시간을 통해 확인한 결과이다.
본 발명자들은 신경세포의 수초화 및 재수초화에 작용하는 신경 조절물질과 이의 기전을 연구하기 위하여 빠르고 효율적으로 탈수초화 질환을 유도할 수 있는 동물모델을 제조하고, 탈수초화가 진행된 질환의 발생 부위에서 희소돌기아교세포에 의한 재수초화를 촉진할 수 있는 치료제 개발을 위한 약물 후보물질의 유효성 검증에 상기 동물모델이 효과적으로 작동함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 형질전환 제브라피쉬는 MBP 프로모터 하에서 작동하는 QF2 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터(구체적으로, mbpa:QF2pA plasmid)와 QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터(구체적으로, QUAS:epNTR-p2a-mCherry plasmid)를 제브라피쉬의 수정란에 유전자전이효소 (transposase)와 함께 미세주입 (microinjection) 후 성체(F0)로 키운 후 야생형 제브라피쉬와 교배 후 확보된 제브라피쉬에서 형광 단백질을 발현하는 제브라피쉬(F1)을 선별함으로써 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 탈수초성 질환 동물모델은 상기 본 발명의 형질전환 제브라피쉬에 MTZ(metronidazole)를 처리함으로써 제조될 수 있다.
종래의 Gal4-UAS system을 이용하여 개발된 형질전환 제브라피쉬는 고농도의 MTZ (10 mM)를 60시간의 장시간 처리를 통해 희소돌기아교세포의 사멸이 유발되는 반면 본 발명의 상술한 형질전환 제브라피쉬는 저농도의 MTZ (2 mM)를 18시간의 단시간 처리를 통해 기존의 모델보다 강력한 수준으로 희소돌기아교세포의 사멸이 유발됨을 확인할 수 있었다. 본 발명의 형질전환 제브라피쉬는 종래의 그것보다 약물 사용량을 1/5 감소시킬 수 있으며, 1/3.3 감소된 시간 안에 효율적으로 탈수초화 질환을 유발할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법으로 제조된 탈수초성 질환 동물모델에 다발성 경화증의 치료 효과가있는 것으로 알려진 타크린(tacrine)을 처리한 결과 운동성 회복 속도와 희소돌기아교세포의 재생 속도가 빠름을 확인하였고, 탈수초성 질환 치료제 후보물질 중 10종의 kinase inhibitor에 대한 유효성 평가를 통해 본 발명의 동물모델이 탈수초성 질환 치료 물질 개발 플랫폼으로서 이용될 수 있음을 검증하였다.
이에, 본 발명은 본 발명의 탈수초성 질환 동물모델을 이용한 탈수초성 질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 제브라피쉬는 MBP 프로모터 하에서 작동하는 QF2 유전자와 QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR 및 리포터 유전자가 도입된 것으로서, 상기 epNTR 유전자와 리포터 유전자는 자가 절단 펩타이드 유전자로 연결된 것일 수 있다.
MBP 프로모터는 희소돌기아교세포에서 특이적으로 작동하여 희소돌기아교세포에서 특이적인 QF2 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 희소돌기아교세포에서 특이적으로 발현되는 QF2는 QUAS 프로모터를 작동시켜 epNTR 및 리포터 유전자의 발현을 유도한다. QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR 및 리포터 유전자는 자가 절단 펩타이드 유전자로 연결되어 발현 후 epNTR과 리포터 단백질로 각각 분리되어 개별적 기능을 수행한다.
본 발명에서 사용된 용어, “리포터 유전자”는 본 발명의 일 예에 따른 벡터의 도입 여부 또는 epNTR/MTZ chemogenetic ablation system의 작동을 모니터링하기 위해 사용되는 단백질을 암호화하는 유전자로서 형질전환된 세포 또는 조직의 손상이 없이 모니터링할 수 있는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescentprotein; EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP), 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)일 수 있다. 본 발명자들은 구체적인 실험에서 리포터 유전자로서 mRFP인 mCherry를 이용하였다.
본 발명에서 사용된 용어, “벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 포함된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소, 즉 프로모터 등을 포함하는 유전자 구조물을 말한다.
본 발명에서 “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하는 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 본 발명에서 각 구성은 직접적 연결인 것으로 명시하지 않는한 서로 작동 가능하게 연결된 것으로 보며, 본 명세서에서 특정 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자 삽입물은 '특정 프로모터와 작동가능하게 연결된' 또는 '특정 프로모터 하에서 작동하는' 것으로 기술한다.
본 발명에서 유전자 삽입물, 즉 전이유전자(transgene)와 프로모터의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “프로모터”라는 용어는 DNA의 일부분으로 전사를 개시할 수 있도록 RNA 중합효소의 결합에 관여한다. 일반적으로 표적 유전자에 인접하여 이의 상류에 위치하며, RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 유도하는 단백질인 전사 인자(transcription factor)가 결합하는 자리로서 상기 효소 또는 단백질이 올바른 전사 시작 부위에 위치하도록 유도할 수 있다. 즉, 센스 가닥(sense strand)에서 전사하고자 하는 유전자의 5' 부위에 위치하여 RNA 중합효소가 직접 또는 전사인자를 통해 해당 위치에 결합하여 전이유전자에 대한 mRNA 합성을 개시하도록 유도하는 것으로 특정한 유전자 서열을 갖는다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1 : 제브라피쉬 사육 및 관리
본 연구의 모든 실험 과정은 고려대학교 의과대학 동물실험 윤리위원회 (Korea University Institutional Animal Care & Use Committee, IACUC)의 승인을 받았으며, 국립수의과학 검역원의 동물 실험 규정에 따라 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 야생형 제브라피쉬, Tg(mbpa:QF2), Tg(QUAS:epNTR-p2a-mCherry) 형질전환 제브라피쉬가 사용되었으며, 성체 (adult) 및 배아 (embryo) 제브라피쉬는 명암주기 14:10 시간, 수온 28.5℃가 유지되는 시스템에서 사육되었다. 형태학적 특징을 정의하기 위하여 제브라피쉬 배아와 치어 (larvae)의 단계는 수정 후 며칠 (days post-fertilization, dpf)로 사용되었다.
실시예 2 : Plasmid DNA 및 형질전환 제브라피쉬 제조
희소돌기아교세포 특이적으로 epNTR을 발현하는 형질전환 제브라피쉬를 제조하기 위하여 attB1과 attB2 시퀀스가 포함된 epNTR 유전자 특이적 프라이머를 제조 및 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이를 통해 확보된 중합효소 연쇄반응 산물은 BP 클론 반응 효소 (BP clonase, Invitrogen)로부터 중간 진입 벡터 (middle entry vector)에 클로닝 되었다. 다음으로는 mbpa:QF2, QUAS:epNTR-p2a-mCherry plasmid construct를 제작하기 위하여 multi-site gateway LR 반응을 수행하였다. mbpa promoter가 포함된 5'-진입 벡터, QF2가 포함된 중간 진입 벡터, poly A 서열이 포함된 3'-진압 벡터, 그리고 목적 벡터 (destination vector)들을 LR 클론 반응 효소 (LR Ⅱ clonase, Invitrogen)와 반응시켜 mbpa:QF2pA plasmid를 제작하였다. 또한, QUAS promoter가 삽입된 5'-진입 벡터, epNTR 유전자가 삽입된 중간 진입 벡터, P2A 펩타이드가 결합된 적색 형광단백질 (mCherry) 유전자가 삽입된 3'-진입 벡터 그리고 목적 벡터들을 LR 클론 반응 효소와 반응시켜 QUAS:epNTR-p2a-mCherry plamid를 제작하였다. 이렇게 만들어진 plasmid DNA는 제브라피쉬 수정란 1세포기에 유전자전이효소 (transposase)와 함께 미세주입 (microinjection) 후, 성체 (Founder, F0)로 키웠고, 야생형 제브라피쉬와 교배하여 적색 형광단백질을 발현하는 제브라피쉬 (F1)를 선별하여 형질전환 제브라피쉬를 제조하였다. Plasmid DNA 제조에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
attB1_epNTR_F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGATATTATTAGTGTGGCCCTGAAGAG
attB1_epNTR_R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGCCACCTCTGTCAGTGTGATGTTCTGA
실시예 3 : 희소돌기아교세포 사멸 유도
MTZ (2 mM, Sigma-Aldrich)는 0.08% 다이메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)가 포함된 배아 배지에 용해시켜 제조하였고, 형질전환 제브라피쉬 수정 후, 5일째 (5 dpf) 치어에 2 mM MTZ를 18시간 동안 처리하여 희소돌기아교세포의 사멸을 유도하였다.
실시예 4 : 제브라피쉬의 운동성 분석
5 dpf에 2 mM MTZ에 18시간 노출된 형질전환 제브라피쉬는 3일 동안 배아 배지에서 회복기를 가진 후, 9 dpf 시기에 운동성 측정을 수행하였다. 운동성 측정을 위하여, 9 dpf 형질전환 제브라피쉬는 48-well plate에 1마리씩 (500 μl/well) 분주되어 행동실험실에서 2시간 동안의 적응시간이 주어졌으며, 2시간 후, 48-well plate를 DanioVision (BOM-DV-SYS-EDU, Noldus)로 옮겨 장비 안에서 30분의 적응시간을 주었다. 적응이 완료된 후, 5분 동안 장비에 연결된 카메라와 EthoVision XT software를 통해 제브라피쉬의 움직임이 촬영 및 분석되었으며, 운동성은 1분마다 총 5분간 측정하여, 최종적으로 1분간 움직인 거리 (distance moved, 단위 mm)의 평균치로 대조군과 실험군을 비교하였다.
실시예 5 : 희소돌기아교세포 이미징
5 dpf에 2 mM MTZ에 18시간 노출된 형질전환 제브라피쉬는 6일 동안 배아 배지에서 회복기를 가진 후, 12 dpf 시기에 희소돌기아교세포의 세포사멸 및 재생 관찰을 위한 이미징을 수행하였다. 이미징을 위해 12 dpf 형질전환 제브라피쉬는 glass-bottomed 35-㎜ dish (MatTek)에서 0.03% tricaine (Sigma-Aldrich)로 마취시킨 후, 0.8% low-melting-point agarose (SeaPlaque™ GTG™ Agarose)로 고정시켰다. 희소돌기아교세포는 Nikon A1Si laser-scanning confocal microscope (Nikon)을 이용하여 20x 배율, 568 ㎚ 레이저에서 NIS-Elements AR Analysis 4.30 software (Nikon)의 Z-Stack 기능을 통해 0.9 ㎛의 간격으로 20-25장 정도 촬영하였다. 촬영된 이미지들은 software를 통해 합쳐 하나의 이미지로 만들었으며, 살아있는 희소돌기아교세포 수를 측정하여 대조군과 실험군을 비교하였다.
실시예 6 : 통계적 분석
운동성 및 탈수초화의 정량적 분석을 위해서 대조군 및 실험군 두 그룹간의 비교분석은 t-Test를 수행하였고, 약물 처리군이 추가될 시, 세 그룹 이상의 비교분석은 one-way analysis of variance (ANOVA)와 post-hoc Tukey's Multiple Comparison Test를 수행하였다. 모든 데이터에서 통계적 유의성은 P 양측 검정 (two-tailed probability) 값이 0.05 미만일 때 유효성을 가지는 것으로 판단하였으며, 모든 통계분석은 GraphPad Prism 7 software를 통해 분석하였다.
[실험예]
실험예 1. 약물 스크리닝 플랫폼으로서 탈수초성 질환 제브라피쉬의 유효성 확인
탈수초성 질환 제브라피쉬 모델에서의 운동성 변화 관찰 및 이에 대한 tacrine (Tocris)의 효능을 확인하기 위하여 실험을 진행하였으며, 실험 모식도는 도 1A에 나타내었다.
5 dpf 형질전환 제브라피쉬는 대조군과 MTZ 처리 후, 배아 배지 (E3)에서 회복시킨 그룹, MTZ 처리 후, 250 nM tacrine에서 회복시킨 3 그룹으로 분리하였다. 대조군은 배아 배지에서 유지되었고, 나머지 두 실험군은 2 mM MTZ를 18시간 동안 처리 후, 배아 배지로 옮겨 회복기를 주었다. 두 실험군 중 한 실험군은 회복기 2일째에 250 nM tacrine이 포함된 배아 배지로 옮겨 유지되었다. 3 그룹 모두 회복기 1일째부터 1일 간격으로 운동성 측정을 하였으며, MTZ가 처리된 그룹에서는 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 운동성이 감소됨을 확인하였다. 또한, 두 실험군이 대조군 수준으로 운동성이 회복되는 시간을 확인한 결과, MTZ에 의해 감소된 운동성이 대조군 수준으로 회복되는데 있어, 배아 배지에서 회복된 그룹 (6일) 보다 tacrine이 포함된 배아 배지에서 회복된 그룹 (4일)이 2일 더 빠르게 회복됨을 확인하였다 (도 1B).
다음으로 위 3 그룹에서 동일한 방법으로 MTZ와 tacrine을 처리 후, 1일 간격으로 희소돌기아교세포의 사멸 및 재생을 관찰하였다 (도 2A). 그 결과, MTZ에 의해 희소돌기아교세포의 사멸이 유발되었으며, 대조군 수준으로 희소돌기아교세포가 재생되는 시간을 확인한 결과, 배아 배지에서 회복된 그룹 (11일) 보다 tacrine이 포함된 배아 배지에서 회복된 그룹 (8일)이 3일 더 빠르게 재생됨을 확인하였다 (도 2B).
실험예 2. 탈수초성 질환 제브라피쉬를 이용한 약물 스크리닝
실험예 1의 결과를 통해 본 기술을 통해 제조된 형질전환 제브라피쉬에서 탈수초성 질환 표현형이 명확히 나타남을 확인하였고, 약물의 효능 검증도 가능한 모델로 평가되어 탈수초성 질환 치료제 후보물질 중 10종의 kinase inhibitor에 대한 유효성 평가를 도 3A에 따라 수행하였고, 이 때 tacrine은 양성대조군으로 사용되었다.
10종의 kinase inhibitor에 대한 운동성 회복 효과를 확인한 결과, 총 5종의 약물에서 유효성이 확인되었으며 (도 3B), 이 5종의 약물에 대해서는 희소돌기아교세포 재생 촉진 효과에 대한 검증을 수행하였다. 그 결과, 2종의 약물이 유의하게 희소돌기아교세포 재생을 촉진시키는 것으로 확인되어 (도 3C) 실시예 2를 통해 제조된 동물 모델이 탈수초성 질환 치료제 개발을 위한 유효성 평가 연구에서 매우 유용하게 활용될 수 있는 모델임을 확인하였다.
실험예 3. 형질전환 제브라피쉬 모델별 탈수초성 질환 유도 효율 비교
실시예 2에서 제조한 형질전환 제브라피쉬의 탈수초화 질환 유도 효율을 확인하기 위하여 다양한 형질전환 제브라피쉬를 제조하고 MTZ를 처리 전/후로 희소돌기아교세포의 세포사멸 및 재생 관찰을 위한 이미징을 수행하였다. 실험은 하기 표 1의 MTZ 처리 농도 및 처리 시간에 따라 수행하였으며, 그 결과 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 실시예 2에서 제조한 형질전환 제브라피쉬는 종래의 형질전환 제브라피쉬보다 낮은 농도의 MTZ를 짧게 처리했음에도 불구하고 희소돌기아교세포의 세포사멸이 빠르게 유도되고 세포사멸 효율이 매우 높음을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 2에서 제조한 형질전환 제브라피쉬는 형광 발현의 비율 및 강도가 높고 그 발현의 지속력이 높음을 확인할 수 있었다(도 4).
| Transgenic zebrafish | MTZ 처리 농도 | MTZ 처리 시간 | % of cell death | 촬영 시간 |
| MBP-mCherry | 10 mM - High | 60 시간 - Long | 0% | 15~20초 |
| MBP-NTR-mCherry | 10 mM - High | 60 시간 - Long | 약 47% - Weak | 50~70초 |
| MBP:Gal4;UAS:NTR-mCherry | 10 mM - High | 60 시간 - Long | 약 55% - Weak | 30~50초 |
| MBP:QF2;QUAS:epNTR-mCherry | 2 mM - Low | 18 시간 - Short | 약 93% - Strong | 5~10초 |
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Claims (17)
- (1) MBP(myelin basic protein) 프로모터 하에서 작동하는 QF2 유전자; 및
(2) QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR(enhanced potency nitroreductase) 및 리포터 유전자;가 도입된 형질전환 제브라피쉬. - 제1항에 있어서,
상기 epNTR과 리포터 유전자는 자가 절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 암호화하는 유전자로 연결된 것인, 형질전환 제브라피쉬. - 제2항에 있어서,
상기 자가 절단 펩타이드는 P2A인 것인, 형질전환 제브라피쉬. - 제1항에 있어서,
상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화하는 유전자인 것인, 형질전환 제브라피쉬. - 하기 단계를 포함하는 형질전환 제브라피쉬 제조방법:
(a) MBP(myelin basic protein) 프로모터 하에서 작동하는 QF2 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 제조단계;
(b) QUAS 프로모터 하에서 작동하는 epNTR(enhanced potency nitroreductase) 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 제조단계;
(c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 각 플라스미드 벡터를 제브라피쉬 수정란에 형질전환하는 단계;
(d) 상기 형질전환된 제브라피쉬 수정란을 배양하여 성체(F0)로 발달시키는 단계;
(e) 상기 형질전환된 성체 제브라피쉬와 야생형 제브라피쉬를 교배하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 교배 후 확보된 제브라피쉬 중에서 리포터 유전자를 발현하는 제브라피쉬(F1)을 선별하는 단계. - 제5항에 있어서,
상기 (c) 단계는 (a) 및 (b) 단계에서 제조한 각 플라스미드 벡터를 제브라피쉬 수정란 1세포기에 유전자전이효소 (transposase)와 함께 미세주입 (microinjection)하여 수행되는 것인, 형질전환 제브라피쉬 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 epNTR와 리포터 유전자는 자가 절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 암호화하는 유전자로 연결된 것인, 형질전환 제브라피쉬 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화하는 유전자인, 형질전환 제브라피쉬 제조방법. - 제5항의 방법으로 제조된 형질전환 제브라피쉬(F1)에 MTZ(metronidazole)를 처리하는 단계를 포함하는, 탈수초성 질환 동물모델 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 MTZ의 처리는 제5항의 방법으로 제조된 형질전환 제브라피쉬(F1) 수정 후 3-6일 째에 수행되는 것인, 탈수초성 질환 동물모델 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 MTZ의 처리는 0.5 ~ 10 mM MTZ를 10~60 시간 동안 처리하는 것인, 탈수초성 질환 동물모델 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 탈수초성 질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth dis- ease; CMT)인 것인, 탈수초성 질환 동물모델 제조방법. - 제9항의 방법으로 제조된 탈수초성 질환 동물모델.
- (가) 제13항의 탈수초성 질환 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(나) 상기 후보물질을 처리한 동물과 후보물질을 처리하지 않은 탈수초성 질환 동물의 탈수초성 질환이 회복되는 시간을 비교하는 단계; 및
(다) 상기 후보물질을 처리한 동물이 후보물질을 처리하지 않은 동물보다 탈수초성 질환이 회복되는 시간이 짧은 경우 상기 후보물질을 탈수초성 질환의 치료 물질로 선별하는 단계;를 포함하는 탈수초성 질환의 약물 스크리닝 방법. - 제14항에 있어서,
상기 (나) 단계의 탈수초성 질환의 회복은 각 동물의 운동성이 제5항의 방법으로 제조된 형질전환 제브라피쉬(F1) 또는 야생형 제브라피쉬 수준으로 회복되는 것인, 탈수초성 질환의 약물 스크리닝 방법. - 제14항에 있어서,
상기 (나) 단계의 각 동물의 탈수초성 질환이 회복되는 시간의 비교는 각 동물의 희소돌기아교세포가 재생되는 시간을 비교함으로써 달성되는 것인, 탈수초성 질환의 약물 스크리닝 방법. - 제16항에 있어서,
상기 희소돌기아교세포의 재생은 리포터 유전자 발현 세포의 증가를 통해 확인되는 것인, 탈수초성 질환의 약물 스크리닝 방법.
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Citations (1)
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| KR20090056692A (ko) | 2007-11-30 | 2009-06-03 | 고려대학교 산학협력단 | 광역 관찰창을 이용한 활성화 신호 검출 방법, 그 장치 및이를 기록한 기록매체 |
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2022
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