KR20230145475A - 식물 기반 생성물의 수율을 증가시키는 방법 - Google Patents

식물 기반 생성물의 수율을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

프로테아제 추출 중 온도, 인큐베이션 시간 및 단백질분해를 극적으로 줄임으로써 기존 프로테아제 추출 기술과 연관된 문제를 해결하기 위해 박테리아 또는 진균 메탈로프로테아제 및 트립신을 사용하는 방법이다. 본 개시내용은 밀링된 식물 재료의 섬유성 폐기물 부분으로부터 영양소를 추출함으로써 식물 또는 기타 재료로부터의 수율을 증가시키는 한편, 식품으로 사용하기 위해 추출된 물질의 영양적 및 기능적 품질을 보존하기 위한 프로테아제 처리에 관한 것이다. 이 공정은 추출 중 저온 및 최소의 프로테아제 활성 및 분해 시간을 활용함으로써, 베타 글루칸 및 단백질을 포함하는 추출된 물질의 품질을 보존한다.

Description

식물 기반 생성물의 수율을 증가시키는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2021년 2월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 제63/151,321호의 우선권을 주장하며, 이 문헌은 본 명세서에 전문이 원용된다.
기술분야
본 개시내용은 식물 기반 밀크를 포함하는, 식물 기반 식품 및 음료의 생산 동안 식물의 영양소 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
곡물, 견과류 또는 종자로부터 식물 기반 밀크를 생산하는 동안 식물 재료의 특정 백분율은 폐기물로서 폐기될 수 있다. 이 폐기물에는 특히 희석 후에도 식물 기반 밀크 가공 중에 메쉬 필터를 통과하기가 어렵거나 불가능한 점성, 불용성, 섬유성 잔류물 또는 슬러리가 포함될 수 있다. 섬유성 슬러리는 주로 겨 및 종피와 같은 섬유 세포벽 물질을 포함하고, 이는 종종 가치 있는 영양소를 함유한다. 이 물질은 세포벽에 더 높은 양으로 존재하는 베타 글루칸, 단백질, 생물활성 페놀 및 항산화제를 함유할 수 있다. 따라서, 섬유성 슬러리를 활용하는 것은 이를 버리는 것보다 매우 바람직하다.
현재, 겨 또는 겨 유사 물질의 주요 용도는 인간 및 동물 소비용의 저가 성분이다. 식품 성분으로서 비교적 더 낮은 사용은 겨 및 겨 추출물의 감각적 속성 및 질감, 및 영양소 추출 방법의 낮은 효율과 관련이 있다. 예를 들어, 겨 영양소 추출물은 특정 단백질 분해 산물 또는 산화 시 산패되는 지질의 존재와 관련된 쓴 맛 및 특정 식품 매트릭스와의 불화합성을 가질 수 있다.
곡물로부터 섬유 물질을 활용하기 위해서는 섬유 사이의 상호작용을 붕괴시켜 점도를 감소시키고 질감을 개선하기 위해 섬유 물질을 추가로 가공할 필요가 종종 있다. 이러한 상호작용은 세포벽 물질을 분해하고 분리하는 효소를 사용하는 처리를 통해 붕괴될 수 있다. 예를 들어, 밀 가공에서, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제, 아밀라아제 및 자일라나제를 포함한 효소는 곡물 재료의 분리를 촉진하기 위해 사용되었다(WO2008132238A1). 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 자일라나제는 세포벽의 주요 성분에 직접 작용하여 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제는 세포벽의 주요 성분이 아닌 전분, 지방 및 단백질에 작용하지만, 이들의 효소 분해는 세포벽 성분 간의 일부 상호작용을 붕괴시킬 수 있다.
양조 산업에서 자일라나제는 양조에 사용되는 곡물의 세포벽 물질을 분해하여 가공을 촉진하고 수율을 높이는 데 사용된다(Novozymes®, 2013). 자일라나제는 곡물의 세포벽 물질의 주요 성분인 자일란을 분해한다. 프로테아제 Neutrase®는 양조 공정에서 자일라나제와 함께 사용되어, 단백질 가수분해 중에 방출되는 유리 아미노 질소(FAN)를 증가시켜 효모가 FAN을 활용하여 성장을 촉진할 수 있도록 한다(Novozymes®, 2013). Neutrase®는 또한 세포벽 안정성을 촉진할 수 있는 매트릭스의 일부인 단백질을 분해하는 것으로 생각될 수도 있다(Novozymes®, 2013). 자일라나제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제는 섬유성 곡물 폐기물의 점도를 감소시키는 데 효과적이지만, 최종 식품 및 부산물로서 당 생성을 포함한 추가 가공 동안 바람직하지 않은 부작용을 가질 수 있다. 리파아제, 아밀라아제 및 프로테아제도 최종 생성물에 바람직하지 않은 영향을 미칠 수도 있지만, 이러한 영향은 자일라나제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제에 의한 효과와 다를 수 있다.
프로테아제 단독은 곡물 재료의 점도를 감소시키기 위해 통상적으로 사용되지 않는다. 양조 업계의 간행물에서 상업용 효소의 선두 제조업체인 Novozymes®는 점도 감소에 사용하기 위한 자일라나제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 베타 글루카나제뿐만 아니라, 알파-아밀라아제를 열거하는 한편, 단백질 분해를 통한 발효 향상에 사용하기 위한 Neutrase®를 열거한다(Novozymes® Brewing Manual, pg. 40). Novozymes®는 귀리 가공에 사용되는 뉴트라제(Neutrase)를 이의 "Neutrase® for Oats" 제품으로 판매하며, "Neutrase®는 약간의 가수분해를 제공하는 고품질의 광범위한 엔도 프로테아제이다. 이는 단백질 가용성을 개선시키는 데 사용될 수 있다."고 진술하고 있다(Novozymes®, 2021). Novozymes®은 귀리용 Neutrase®의 작동 온도 범위를 30 내지 65℃, 작동 pH 범위를 6 내지 9로 열거한다(Novozymes®, 2021). 효소 공급업체인 BIOCAT은 제품 정보 시트에서 NEUTRAL PROTEASE L(Neutrase® 버전)이 “생선 또는 닭고기 부산물의 점도를 감소시킨다”(BIOCAT, 2019)고 개시한다. BIOCAT은 30℃ 내지 70℃의 온도 범위 및 최적 온도 55℃를 개시한다. BIOCAT은 5.5-9.0의 pH 범위, 및 최적 pH 6.5를 개시한다. BIOCAT은 전형적인 가수분해를 위한 사용률이 용도에 따라 달라지며 전형적인 범위는 0.1% 내지 1.0%임을 개시한다(BIOCAT, 2019).
곡물 재료에서 점도 감소를 위한 프로테아제의 사용은 일반적이지 않지만, 영양소가 분리되고 정제되는 경우, 프로테아제 추출은 곡물을 포함하는 섬유성 식물 재료로부터 영양소 수율을 증가시키는 잘 알려진 방법이다. 프로테아제 추출에는 일반적으로 단백질 내의 펩타이드 결합을 절단하는 엔도프로테아제가 수반된다. 그러나, 프로테아제 추출 동안 펩타이드 결합의 절단은 단백질 및 다른 영양소의 기능을 손상시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 단백질 또는 천연 상태에 가까운 단백질은 더 나은 관능적 특성 및 발포성뿐만 아니라, 다른 특성을 가질 수 있다.
단백질 기능성에 미치는 단백질 가수분해의 효과는 pH, 온도, 가수분해 지속기간, 효소 선택, 효소 및 기질 농도를 포함하는 가수분해 조건에 크게 의존한다. (Wouters, 등 2016). 일부 연구는 단백질 가수분해가 온전한 단백질과 비교할 때 겔 강도에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다(Lamsal 등, 2007; Fan 등, 2005; Pinterits and Arntfield, 2007).
단백질 가수분해물의 맛과 향 측면은 최종 제품의 품질에 영향을 미친다. 대두 단백질의 경우, 가수분해물의 콩비린내 및 풀 맛이 문제이다(Rackis 등, 1979; Wansink and Chan, 2001; Wansink and Park, 2002; Damodaran and Arora 2013). 또한, 단백질 가수분해는 종종 쓴맛을 유도한다(Guigoz and Solms, 1976; Maehashi and Huang, 2009).
프로테아제 처리는 전형적으로 대략 30℃ 내지 65℃ 사이의 온도에서 수행되며, 여기서 효소 활성은 최적이거나 최적에 가깝지만, 이는 효소, 효소 공급원 및 용도에 따라 달라질 수 있다. 위에 개시된 바와 같이, Novozymes®는 Neutrase® for Oats™의 작동 온도 범위를 30 내지 65℃, 작동 pH 범위를 6 내지 9(Novozymes®, 2021), 활성에 최적 온도를 대략 42℃라고 열거한다. Novozymes® 매뉴얼에 따르면, Neutrase® 처리의 최적 pH는 대략 6이며, 대략 4.3의 pH에서 활성이 급격히 0으로 떨어진다.
곡물의 Neutrase® 분해 동안 사용된 온도와 관련하여, Conrad의 미국 특허 제4,377,602호는 밀링된 통곡물로부터 프로테아제를 사용하여 가수분해된 생성물을 제조하는 공정을 개시한다. Conrad의 공정은 불수용성 단백질을 수용성 생성물로 전환시켜 곡물 슬러리로부터 단백질 및 당을 함유하는 생성물을 생성했다. Conrad에 따르면 50℃에서 1시간 후에 모든 단백질은 수용성 생성물로 전환되었다. 이러한 조건은 비교적 고도의 가수분해 및 단백질 변성을 갖는 생성물을 야기한다. 이는 질감과 식감이 떨어지는 저점도 밀크를 초래했다.
섬유성 물질로부터 단백질 및 다른 영양소의 프로테아제 추출은 효과적이었지만, 제한이 있다. 프로테아제 처리는 일반적으로 단백질을 어느 정도 가수분해하여 온전한 단백질을 더 작은 단편으로 부순다. 이는 단백질의 기능성에 영향을 미쳐 단백질에 쓴맛을 주고 유화 특성, 소화율 및 점도에 영향을 미친다. 또한, 겨 및 다른 불용성 물질로부터의 프로테아제 추출은 비교적 높은 온도, 전형적으로 대략 30℃ 내지 65℃ 범위에서 수행되고 일반적으로 장기간에 걸쳐 수행되는 것으로 교시되어 있다. 대부분의 효소와 마찬가지로 프로테아제도 이들이 효과적인 시간 및 온도의 최적 범위를 가지고 있다. 겨에서 영양소 추출에 사용된 프로테아제의 경우 시간 및 온도는 전형적으로 30℃ 내지 65℃ 및 1 내지 24시간 범위이다.
Janse의 미국 특허 공개 제20150257411호는 또한 섬유성 쌀겨로부터 단백질을 추출하기 위해 Neutrase®-유사 프로테아제를 사용하는 것을 개시한다. Janse는 일반적으로 가수분해물의 분자량을 500kDa 초과로 유지하기 위해 단백질의 가수분해도를 제한하면서 쌀겨로부터 단백질의 수율을 증가시켰다. Janse는 쌀겨와 프로테아제를 45℃ 및 65℃에서 대략 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하는 것을 교시하며, 또는 더욱 바람직하게는 인큐베이션 온도는 48℃ 내지 55℃ 사이이고, 최적의 메탈로엔도프로테아제 추출은 pH 7.0 및 50℃에서임을 교시한다. Janse는 청구된 공정에서 10 내지 16% 사이의 비교적 낮은 가수분해도(DH)를 주장했다.
유사하게, Hettiarachchy의 미국 특허 제8,575,310호는 반응 조건이 pH 8.0에서 1시간 동안 50℃에서 최적화되는, 쌀겨로부터의 제한된 가수분해 프로테아제 추출을 교시한다. Janse 및 Hettiarachchy는 일반적으로 대략 10%와 25% 사이인, 비교적 낮은 DH를 개시했다. Nielsen의 미국 특허 제5,716,801호는 식물 기반 단백질로부터 맛 및 관능적으로 허용되는 단백질 가수분해물을 생성하기 위한 프로테아제의 사용을 개시한다. Nielsen은 15 내지 35%의 DH를 개시하고 55℃에서 18시간 동안 프로테아제 처리를 교시하며, 여기서 pH는 Alcalase 처리 시 8.5이고 Neutrase 처리 시 최적으로는 7.0이다. 프로테아제는 18시간 후 단백질분해를 종결시키기 위해 30% HCl을 사용하여 pH를 4.2로 낮추어 불활성화시켰다.
Orts는 "생물활성 화합물인 이소플라본 및 펩타이드가 풍부한 대두 펄프 추출물을 수득하기 위한 프로테아제 기술"이라는 제목의 논문에서 통상적으로 폐기물로 버려지는 대두 펄프에서 생물활성 성분을 추출하는 공정을 개시한다(Orts 등 2019 ). Orts는 프로테아제를 사용하여 대두 펄프에서 단백질 단편 및 이소플라본을 포함한 특정 영양소를 추출하는 공정을 개발했다. Orts는 55℃에서 대략 2시간 동안의 최적 프로테아제 추출 조건을 교시한다.
Hanmoungjai 등(2001)은 "미강에서 오일 및 단백질을 추출하기 위한 효소 공정"이라는 제목의 논문에서 상업용 프로테아제(Alcalase)를 사용하여 오일 및 단백질을 효소적으로 추출하는 방법을 개시한다. Hanmoungjai는 각각 1 내지 3시간, 및 40 내지 60℃의 추출 조건을 교시한다. Arte 등 (2016)은 "밀기울 세포벽 온전성 및 단백질 가용성에 대한 가수분해 효소의 효과"라는 제목의 논문에서 밀기울을 프로테아제로 처리하여 단백질을 추출하는 공정을 개시했다. Arte는 35℃에서 3시간의 최적화된 프로테아제 처리를 교시한다. Santo Domingo 등(2015)은 섬유를 추출하는 불용성 식물 섬유 폐기물의 프로테아제 처리 방법을 개시한다. Santo Domingo는 5시간 동안 40℃의 최적의 프로테아제 조건을 교시한다.
Abdulkarim 등 (2006)은 "모링가 올레이페라 종자유의 수성 추출 중 오일 회수를 향상시키기 위한 효소의 사용"이라는 제목의 논문에서 모링가 올레이페라 종자유의 프로테아제 추출 방법을 개시한다. Abdulkarim은 pH 6.8에서 2시간 인큐베이션 시간 동안 45℃ 조건에서 Neutrase를 사용한 최적의 프로테아제 추출을 교시한다.
식물 영양소의 프로테아제 추출에 관한 문헌 논평에서 Yussof 등 (2014)은 통상적인 최적 반응 조건을 개시했다:
Rui 등 (2009)에 따르면, 효소 가수분해를 위한 최적 온도 범위는 40 내지 55℃ 사이이고, 이에 따라 많은 저자들은 이 범위에 속하는 AEE(수성 효소 추출) 온도를 사용한다. 실제로는, 종종 적절한 활성을 산출하는 가능한 가장 낮은 온도를 사용하는 것이 바람직하다(Passos 등 2009). 올리브 열매의 경우, 특히 오일 품질을 보존하기 위해 30℃의 낮은 온도가 유리한 것으로 밝혀졌다(Aliakbarian 등 2008; De Faveri 등 2008; Ranalli 등 2003; Garcia 등 2001; Ranalli 등 1999). Gros 등 (2003)도 아마인유 추출에 비슷한 이유로 34℃의 온도를 사용했다. 오일 수율에 온도의 유의미한 영향은 Sharma 등(2002)에 의해 보고되었고, 여기서 최고의 땅콩유 수율은 40℃에서 관찰되었지만, 온도가 37℃로 낮아지면 유의미하게 감소했다.
Yussof 등 (2014)은 인큐베이션 시간이 식물 재료로부터 영양소를 효소적으로 추출하는 데 제한이 될 수 있는 또 다른 요인이며, 여기서 배양 시간이 길수록 식물 재료에서 추출되는 영양소의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 지적했다:
Jiang 등 (2010), Abdulkarim 등 (2006), Santos 및 Ferrari(2005), 및 Dominguez 등 (1996)에 따르면, 인큐베이션 시간을 연장함으로써 세포벽 성분의 분해가 향상될 수 있다. Passos 등 (2009)도 120 시간 동안 셀룰라아제, 프로테아제, 자일라나제, 및 펙티나제의 효소 혼합물의 사용이 24 시간의 인큐베이션 시간에 비해 3.8% 더 높은 수율을 초래했음을 보고했다. 하지만, 이 시간 기간(즉, 120시간)은 실제로 허용되기에는 너무 길고(Passos 등 2009), 더 낮은 오일 품질을 초래할 수 있고(Jiang 등 2010), 높은 에너지 사용 및 바람직하지 않은 생성물의 생산을 야기한다(Abdulkarim 등 2006).
Mwaurah 등 (2020)의 논평은 종자를 포함한 식물 재료로부터 오일 추출에 대한 알려진 기술을 비교했다. 효소 추출과 관련하여 Mwaurah는 "연구에 따르면 효소 대 기질 비율 1% 내지 8%, 온도 40 내지 55℃, pH 4 내지 8이 여러 오일시드로부터 오일의 효소적 추출에 전형적인 것으로 드러난다"고 진술한다(Mwaurah 등 2020).
Mwaurah에 따르면, 곡물로부터 오일 추출은 단백질분해 활성에 의존적이며, 단백질분해 활성은 온도 및 pH에 민감하다. 프로테아제의 온도 민감성으로 인해, Mwaurah는 "모든 오일 추출 기술에 관한 한 온도가 중요한 요인 중 하나이다"라고 쓰고 있다.
또한, 프로테아제 추출은 특히 귀리 및 보리와 같은 곡물뿐만 아니라 다른 베타 글루칸 공급원으로부터 베타 글루칸을 추출하는 데에도 사용되었다. 베타 글루칸은 귀리 및 보리를 포함한 곡류 곡물뿐만 아니라 박테리아, 진균, 효모, 조류 및 지의류에서도 발견된다. 베타 글루칸은 특히 기능성 식품 등 여러 분야에서 활용되고 있다. 베타 글루칸은 특히 면역성 및 콜레스테롤 감소와 관련하여 의학적 이점이 있는 것으로 밝혀져 있다.
베타 글루칸은 곡류 곡물의 세포벽의 중요한 구조적 성분이며 일반적으로 이러한 식물 산물로부터 추출하기가 어렵다. 통상적인 베타 글루칸 추출 방법은 산 또는 알칼리 용액의 사용을 포함하며, 이는 종종 베타 글루칸 중합체의 분해를 초래하여 이의 생물활성 및 결과적인 건강상의 이점을 감소시킨다. "베타 글루칸으로 분해되는 것으로 생각되는 알칼리-산 방법을 피하기 위해, 일부 연구자들은 강한 화학 용매를 사용한 처리의 대안으로서 효소적 추출을 도입했다." (Avramia and Amariei, 2021). 하지만, 세포벽 물질에서 베타 글루칸을 추출하기 위해 프로테아제 처리를 사용하는 경우, 일반적으로 긴 처리 시간과 고온이 사용되며, 예를 들어 pH = 10.5 및 45℃에서 5시간 동안 세포벽을 처리한 후 침전물을 아세톤 또는 에탄올로 연속적으로 세척하는 것을 포함한다. (Avramia and Amariei, 2021). 하지만, 이러한 조건은 심각한 단백질 분해를 야기하며, 베타 글루칸 추출만을 목적으로 하는 경우에는 단백질 분해가 문제가 되지 않으므로 이러한 조건이 허용될 수 있다. 식물 기반 밀크와 같이, 천연 베타 글루칸 및 천연 단백질의 추출을 원하는 적용예에서는 프로테아제를 이용한 통상적인 베타 글루칸 추출 방법은 바람직하지 않다.
상기 인용된 참고문헌은 최적 또는 통상적인 조건 하에서 프로테아제를 사용하여 식물 재료로부터 영양소를 추출하는 것이 추출된 영양소의 품질에 해로운 영향을 미칠 수 있음을 입증한다. 최적 또는 통상적인 조건 하에서 프로테아제 처리는 단백질 분해를 유발할 수 있고, 이는 단백질의 기능성을 저하시킬 수 있다. 또한, 통상적인 조건 하에 프로테아제 처리는 빠른 미생물 성장을 조장하는 온도를 활용한다. 또한, 통상적인 프로테아제 반응 인큐베이션 조건은 리파아제 활성을 촉진하여 오일의 산화를 유발하고, 맛에 부정적인 영향을 미친다. 추가적으로, 단백질 구조는 표준 프로테아제 반응 조건 하에서 열 또는 높은 DH에 의해 변경될 수 있어 단백질의 기능적 특성에 영향을 줄 수 있다. 요약하면, 식물 재료로부터 영양소를 프로테아제 추출하는 동안에는, 특히 식물 기반 밀크와 같은 적용예에 사용하기 위한 경우에는 더 낮은 온도 및 더 짧은 인큐베이션 시간이 바람직하다.
본 개시내용은 프로테아제 추출 동안 온도, 인큐베이션 시간 및 단백질분해를 극적으로 감소시킴으로써 기존의 프로테아제 추출 기술과 연관된 문제를 해결한다. 본 개시내용은 밀링된 식물 재료의 섬유성 폐기물 부분으로부터 영양소를 추출함으로써 식물 또는 다른 재료로부터의 수율을 증가시키는 한편, 식품으로 사용하기 위해 추출된 물질의 영양적 및 기능적 품질을 보존하는 프로테아제 처리에 관한 것이다. 이 공정은 추출 중 낮은 온도와 최소한의 프로테아제 활성 및 분해 시간을 활용함으로써, 베타 글루칸 및 단백질을 포함한 추출된 물질의 품질을 보존한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 공정은 식물 또는 미생물 기반 밀크 또는 액체를 생성하기 위한 수성 습식 밀링과 조합으로 사용된다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 생곡물로부터의 총 영양소 수율은 대략 5-10% 이상 증가할 수 있으며, 귀리의 베타 글루칸을 포함하는 특별히 원하는 영양소의 경우에는 최대 또는 대략 80% 초과의 수율 증가를 초래할 수 있어, 최종 제품 내 곡물 유래의 총 베타 글루칸이 대략 80% 또는 그 이상에 가까운 수율을 제공할 수 있다.
한 실시형태에서, 귀리 곡물은 수성 습식 밀링되고 저온에서 여과되어 1차 식물 기반 밀크를 생성한다. 여과 후, 섬유성 슬러리 또는 잔류물이 1차 밀크로부터 분리된다. 섬유성 슬러리는 희석 후에도 물질이 메쉬 필터를 통과하는 것을 방지하는 점도 및 질감을 갖고 있다. 본 명세서에서 체질이라고도 지칭될 수 있는 여과 후, 총 고형분이 대략 40%일 수 있는 섬유성 슬러리는 이어서 대략 5-15%의 총 고형분으로 희석되고 순간 밀링될 수 있다. 일 실시형태에서, 공정 전반에 걸쳐, 희석된 섬유성 잔류물 또는 섬유성 슬러리는 0℃보다 약간 높은 저온에서 유지된다. 그 다음, 섬유성 슬러리는 탱크로 이송되어 저온에서 유지될 수 있다. 희석된 섬유성 슬러리는 대략 0℃ 내지 5℃ 사이의 저온에서의 반응을 위해, 바람직하게는 Neutrase® 또는 등가물일 수 있는 프로테아제, 또는 미생물 트립신으로 처리될 수 있다. 단백질분해 활성이 무시할 수 있거나 검출 불가능한 저온 반응은 단백질의 천연 구조를 보호하여 천연 단백질의 기능성을 유지한다.
놀랍게도, 섬유성 슬러리에 Neutrase®의 첨가는 점도의 빠르고 실질적인 감소를 초래한다. 표준 사용률 이하로 첨가될 수 있는 Neutrase®로부터의 점도 감소는 기질인 섬유성 슬러리의 저온을 고려할 때, 실질적이고 예상치 못한 것이다. 일부 실시형태에서, 10분 미만의 효소 반응 시간 후의 점도 감소는 잔류물을 여과하여 상업화 가능한 2차 식물 기반 밀크를 생산하도록 하는 데 충분하다. 효소 처리 없이 희석된 섬유성 슬러리는 높은 점성 및 점액성을 유지하고, 실질적인 면에서 식물 기반 밀크 생산을 포함한 대부분의 적용예를 위해 가공 불가능하다.
Neutrase® 처리에 이은 여과는 2차 밀크를 생성한다. 일부 실시형태에서 2차 밀크는 원료 곡물 재료의 총 고형분의 대략 10%로 포함될 수 있다. 본 개시내용의 공정의 낮은 비용을 고려하면, 10%는 유의미하고 상업적으로 적절한 수율 증가이다.
2차 밀크는 포장하기 전에, 먼저 열 처리되어 프로테아제 또는 프로테아제 외에 가공 중에 사용될 수 있는 임의의 다른 효소를 불활성화해야 한다. 열처리는 일반적으로 효소를 변성시키는 온도로의 급속 가열을 포함하며, 현재의 경우에는 대략 75℃ 내지 90℃일 수 있다. 효소 비활성화 동안 급속 가열은 불활성화 단계 동안 유의미한 프로테아제 활성 및 단백질분해를 방지하고 단백질의 열 변성뿐만 아니라, 미생물 성장을 제한한다. 일부 적용예에서, 효소를 비활성화하기 위한 열처리는 일부 적용예에서 포장 후 최종 제품 내 미생물 성장을 방지하기 위한 2차 열처리가 후속될 수 있다.
열 비활성화 단계 동안, 곡물 생성물의 점도는 일반적으로 전분의 젤라틴화 또는 다른 상호작용으로 인해 증가할 것이다. 놀랍게도, 본 개시내용에서 효소를 비활성화하기 위해 Neutrase® 처리된 섬유성 슬러리를 가열하는 것은 점도의 유의미한 증가를 유발하지 않았다. 젤라틴화는 전분 과립을 함유한 생성물이 전분 내 분자 결합의 붕괴를 유발하는 온도로 가열될 때 발생하여, 물의 흡수 및 점도의 증가를 야기한다. 본 개시내용의 귀리 섬유성 슬러리 중 전분의 양은 1차 귀리 밀크에 비해 비교적 낮지만, 젤라틴화가 점도의 유의미한 증가를 유발하여 이러한 놀라운 결과를 야기할 것으로 예상되었다.
프로테아제 비활성화 동안 유의미한 점도 증가의 예상치 못한 부재는 본 개시내용에 따른 2차 밀크의 추가 가공에 중요한 의미를 갖는다. 일반적으로, 아밀라아제는 액화 동안 식물 기반 밀크에 첨가된다. 아밀라아제는 전형적으로 젤라틴화 중에 전분을 분해하여 점도를 줄이고 생성물을 액화하는 데 필요하다. 액화는 식물 기반 밀크가 프로세서의 파이프를 막지 않고 높은 열에서 가공되도록 한다.
Neutrase® 처리 및 효소 불활성화 후, 열 비활성화된 2차 밀크의 비교적 낮은 점도는 아밀라아제 또는 다른 액화 효소를 사용하지 않고도 2차 밀크를 완전히 가공할 수 있게 한다. 생성물에 아밀라아제의 필요성을 없애거나 감소시키는 것은 비용 및 소비자 수요 측면에서 유의미한 이점이다. 아밀라아제 처리는 점도 감소에 사용되는 다른 많은 효소에 의한 처리와 마찬가지로, 당의 생성을 초래하며, 이는 일부 생성물에서 바람직하지 않을 수 있다. 또한, 아밀라아제 처리는 일부 경우에, 풍미에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 또한, 클린 라벨 제품에 대한 소비자 수요가 증가하고 있으며, 효소와 같은 성분의 제거는 제품, 특히 귀리 밀크와 같은 식물 기반 제품에 대한 소비자 인식을 향상시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 귀리와 같은 곡물로부터의 총 밀크 수율은 대략 9-10% 증가하고 아몬드와 같은 견과류로부터는 대략 5% 증가한다. 공정은 곡물 또는 견과류로부터 단백질, 지방, 섬유, 탄수화물 및 회분의 수율을 증가시킨다. 귀리와 같은 곡물의 경우 섬유성 슬러리는 건강상의 이점이 잘 알려진 영양소인 베타 글루칸 함량이 특히 높다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 공정은 일반적으로 베타 글루칸의 천연 구조를 보존하면서 베타 글루칸의 수율을 최대 80% 이상 증가시킬 수 있다. 베타 글루칸의 천연 구조의 보존은 분자의 완전한 기능성 및 건강상의 이점을 유지하는 데 중요하다.
본 개시내용의 저온 가공은 또한 특히 섬유성 슬러리의 프로테아제 처리 동안 미생물 성장을 방지한다. 저온은 또한 프로테아제 처리 중 단백질의 단백질분해를 최소화하거나 없앤다. 섬유성 슬러리의 점도를 빠르게 감소시키는 화학적 메커니즘은 명확하지 않지만, 프로테아제 처리 후 가수분해도는 놀랍게도 실질적으로 0이거나 그에 매우 가깝다. 원료 식물 재료로부터 수율 증가, 미생물 성장 방지, 최소의 단백질분해 또는 영양소 구조 변화뿐만 아니라, 고온 가공 중 아밀라아제 또는 다른 효소의 필요성 제거를 포함하는 본 공정의 이점은 기존 기술에 비해 유의미한 개선이다.
도 1은 본 개시내용에 따른 공정의 일 실시형태를 예시하는 흐름도를 보여준다;
도 2는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 온도에 대한 Neutral Protease L™의 상대 활성을 예시하는 차트를 보여준다;
도 3은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, pH에 대한 Neutral Protease L™의 상대 활성을 예시하는 차트를 보여준다;
도 4는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 단백질 크기 및 가수분해도를 나타내는 환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다;
도 5A는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 단백질 크기 및 가수분해도를 나타내는 비환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다;
도 5B는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 단백질 크기 및 가수분해도를 나타내는 환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다;
도 6은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 저온에서 귀리 섬유성 슬러리의 점도 증가 그래프를 보여준다;
도 7은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 효소 처리 후 저온에서 귀리 섬유성 슬러리의 점도 변화 그래프를 보여준다;
도 8은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 여러 효소 농도에서 Neutral Protease L™ 처리 후 저온에서 귀리 섬유성 슬러리의 점도 변화 그래프를 보여준다;
도 9는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 여러 효소 농도에서 트립신 처리 후 저온에서 귀리 섬유성 슬러리의 점도 변화 그래프를 보여준다.
이하의 설명에서 본 개시내용의 다양한 실시형태가 상세히 설명될 것이다. 다만, 그러한 세부사항은 본 개시내용의 이해를 용이하게 하고 본 개시내용을 구현하기 위한 예시적인 실시형태를 설명하기 위해 포함된다. 이러한 세부사항은 본 개시내용의 범위 내에서 다른 변형 및 실시형태가 가능하기 때문에, 본 개시내용을 기술된 특정 실시형태로 제한하는 데 사용되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 명시적으로 포함된다. 결과는 관련 기술분야의 기술자가 예상하는 바와 같이 상이한 실험으로부터 다소 변동될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 아래에 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서를 따를 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐 제한하려는 의도는 아니다. 달리 명시하지 않는 한, 백분율에 대한 모든 언급은 중량 기준이다. 본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 첨부 도면 및 이하의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 구체적인 내용, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
더욱이, 본 개시내용의 철저한 이해를 제공하기 위해 수많은 세부사항이 제시되지만, 본 개시내용을 실시하기 위해 이러한 특정 세부 사항이 요구되는 것은 아님은 관련 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 경우에는 잘 알려진 방법, 데이터 유형, 프로토콜, 절차, 공정 등과 같은 세부사항은 상세하게 설명되지 않는다.
본 개시내용은 밀링된 식물 재료의 섬유성 폐기물 부분 또는 섬유성 슬러리로부터 영양소를 추출함으로써 식물 재료로부터의 수율을 증가시키는 한편, 식품으로 사용하기 위해 추출된 물질의 영양적 및 기능적 품질을 보존하기 위한 프로테아제 처리에 관한 것이다. 공정은 추출 중 낮은 온도와 최소한의 프로테아제 활성 및 분해 시간을 활용하여 추출된 물질의 품질을 보존한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 공정은 식물 기반 밀크를 생산하기 위한 수성 습식 밀링 공정과 조합으로 사용된다. 본 개시내용의 공정의 일부 실시형태에서, 습식 밀링된 곡물로부터의 총 영양소 수율은 대략 8 내지 10% 증가될 수 있다.
공정은 1차 밀크 생성물에 첨가될 수 있는 2차 밀크 생성물을 초래하고, 이에 의해 일부 실시형태에서는 귀리와 같은 곡물로부터 총 밀크 수율이 약 9 내지 10% 증가하고, 아몬드와 같은 견과류로부터는 약 5% 증가한다. 이러한 수치는 이러한 공정의 상업적 사용이 산업용 여과 및 분쇄 시스템을 활용하여 달성될 수 있는 산업적 환경에서 증가될 수 있을 것으로 여겨진다. 공정은 곡물이나 견과류로부터 단백질, 지방, 섬유, 탄수화물 및 회분의 수율을 증가시킨다.
도 1에 도시된 바와 같은 공정(10)의 일 실시형태에서, 수성 습식 밀링된 귀리 곡물은 저온에서 여과되어 1차 식물 기반 밀크를 생성한다. 이 단계는 냉수에서 습식 밀링하여 1차 슬러리를 형성한 후, 생성된 1차 슬러리를 메쉬를 통해 체질함으로써 곡물, 견과류 또는 종자의 크기 감소를 수반한다. 섬유성 슬러리(150)는 잔류물로서 필터 상에 남는다. 섬유성 슬러리는 또한 섬유성 잔류물 또는 섬유 분획이라고도 지칭될 수 있다. 본 개시내용에 따른 가공 전반에 걸쳐, 섬유성 슬러리(150)는 0℃보다 약간 높은 저온에서 유지될 수 있다. 이어서, 섬유성 슬러리(150)는 탱크로 이송되어 저온에서 유지될 수 있다. 희석된 섬유성 슬러리(150) 또는 잔류물은 그 다음 바람직하게는 NEUTB일 수 있는 프로테아제로 처리되는데, 이는 그 다음 대략 0℃ 내지 5℃ 사이의 저온에서의 반응을 위해 희석된 섬유성 슬러리에 첨가될 수 있다. 단백질분해 활성이 무시할 수 있거나 검출 불가능한 저온 반응은 단백질의 천연 구조를 보호하여 천연 단백질의 기능성을 유지한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 곡물, 견과류 또는 종자를 포함할 수 있는 원료(100)는 7℃일 수 있는 냉수(102)에 첨가되고, 분쇄 또는 밀링(104)되어 원료(100)의 크기를 감소시킬 수 있다. 크기는, 일부 실시형태에서, 7℃에서 1mm 미만으로 감소될 수 있다. 분쇄(104)는 원료 슬러리(106)를 생성한다. 여과 후, 섬유성 슬러리(150)는 1차 밀크로부터 분리된다. 섬유성 슬러리는 메쉬 필터를 통과하는 물질의 통과를 막는 점도 및 질감을 갖고 있다. 원료 슬러리(106)는 10℃에서 #60-400 메쉬를 통해, 더 바람직하게는 #80-160 메쉬를 통해, 더 바람직하게는 #100-140 메쉬를 통해, 더 바람직하게는 대략 US #120 메쉬를 통해 체질(108)되어, 주로 전분질의 백색 연질 배유 구성성분으로 구성될 수 있는 1차 밀크(110) 분획을 섬유성 슬러리(150) 분획으로부터 분리한다.
체질 단계는 1차 슬러리의 점성이고 거칠고 일반적으로 불용성인 분획(잔류물)으로부터 1차 밀크(여과액)를 분리한다. 체질은 또한 본 개시내용에서 여과와 상호교환적으로 지칭될 수도 있다. 1차 밀크는 주로 전분질의 백색 연질 배유 구성성분으로 구성된다. 점성 잔류물은 아마도 주로 호분층과 아호분층 또는 겨 및 단단하고 투명한 배유의 일부의 섬유-단백질 응집체 및 구조적 종자 성분으로 구성된다.
대략 40% 총 고형분일 수 있는 섬유성 슬러리는 그 다음 대략 5 내지 15% 총 고형분으로 냉수로 희석될 수 있고, 효소 처리 전에 순간 혼합되거나 밀링될 수 있다. 섬유성 슬러리(150) 원료의 분쇄, 또는 밀링(104) 및 원료 체질(108)은 일반적으로 단백질 변성 온도 미만에서 수행된다. 원료 체질(108)은 1차 밀크(110) 및 섬유성 슬러리(150)를 초래한다.
1차 밀크(110)는, 일부 실시형태에서, 공지된 방법에 따라 생산 및 가공될 수 있으며, 그 예는 Mitchell의 미국 특허 제7,678,403호에 기술되어 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 1차 밀크(110)는 분당 6℃의 속도로 99℃까지 가열될 수 있다(112). 다음 단계에서, 1차 밀크(110)는 그 다음 71℃까지 빠르게 냉각(114)될 수 있다. 냉각(114)은 가공된 1차 밀크(116)를 생성한다.
1차 밀크(110) 외에도, 앞서 설명한 바와 같은 원료 슬러리의 체질(108)은 섬유성 슬러리(150) 잔류물을 생성한다. 일부 실시형태에서, 주로 겨 물질로 구성될 수 있는 섬유성 슬러리(150)는 효소-보조 추출로 처리되어 섬유성 슬러리(150)로부터 영양소가 추출된다. 프로테아제 처리 전에, 섬유성 슬러리(150)는 희석될 수 있다. 본 개시내용에 따른 프로테아제 추출(154)은 일부 실시형태에서 박테리아 또는 진균의 중성 메탈로엔도프로테아제 또는 약어로 "중성 프로테아제"(중성 프로테아제는 본원에서 Neutrase® 또는 Neutral Protease L™과 상호 교환적으로 사용될 수 있음)일 수 있는, 프로테아제(154)를 첨가함으로써 섬유성 슬러리(150)를 처리하는 것을 포함한다.
프로테아제 추출을 위해, 일반적으로 대략 0 내지 25℃의 냉수(152)가 섬유성 슬러리(150)에 첨가될 수 있고, 이후 중성 프로테아제(154)가 첨가될 수 있다. 이어서 프로테아제를 함유하는 섬유성 슬러리(150)는 저속으로 교반(156)될 수 있다. 중요하게도, 프로테아제 추출(154)은 일반적으로 프로테아제에 대해 확립된 작업 온도 또는 pH 범위보다 낮은 준최적(suboptimal)의 조건, 바람직하게는 0℃ 내지 15℃, 더 바람직하게는 0℃ 내지 5℃에서 수행된다. 추가로, 일부 실시형태에서, 섬유성 슬러리(150)로부터의 프로테아제 추출(154)은 단기간 동안 수행될 수 있고, 이는 일부 실시형태에서 10℃에서 10분만큼 짧을 수 있다.
이전에 논의된 바와 같이, 기존의 영양소의 프로테아제 추출은 전형적으로 최적 또는 거의 최적의 프로테아제 활성 조건 하에서 수행된다. 그러나, 최적의 프로테아제 활성 조건은 영양소 및 식물 밀크 생성물을 이상적인 상태에서 보존하기에 최적이지 않다. 온도가 높고 인큐베이션 시간이 길어질수록 영양소는 분해하여 품질이 떨어진다.
도 2는 BIOCAT으로부터의 Neutral Protease L(NEUTB)의 활성에 대한 온도의 영향을 보여준다. 도 2에 도시된 바와 같이, NEUTB는 10℃에서 최소로 활성화될 것으로 예상된다. 이 그래프와 함께 BIOCAT은 30℃ 내지 70℃의 온도 범위를 최적 온도 55℃와 함께 열거한다. 또한 BIOCAT에 의해 공개된 도 3은 NEUTB가 pH<5.0에서 실질적으로 비활성일 것으로 예상된다는 것을 보여준다. 이 그래프와 함께 BIOCAT은 최적 pH 6.5와 함께 pH 범위 5.5 내지 9.0을 열거한다. Novozymes®는 Neutrase®의 활성에 대해 유사한 데이터를 공개했다. 따라서, 본 명세서에 제시된 데이터를 기반으로 하고 이론에 얽매임이 없이, 엄격하게 준최적의 조건에서 유의미한 비정형의 프로테아제 활성이 추출을 유발하고, 상응하는 영양소 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 가정될 수 있다. 이러한 비정형 활성은 프로테아제 활성을 통한 큰 단백질 분자의 더 작은 분자로의 가수분해 외의 다른 수단을 통한 세포 구조의 붕괴를 수반할 수 있었다.
도 4는 본 개시내용에 따른 프로테아제 추출이 고온 및 저온에서 섬유성 슬러리로부터 귀리 단백질의 분자 구조에 미치는 영향을 보여준다. 이러한 온도 조건은 실시예 6 및 표 10에 상세하게 추가로 설명되고 제시된 바와 같이, 도 4의 SDS-PAGE 겔에 표시된 샘플이 처리된 조건에 상응한다.
도 5A 및 도 5B는 본 개시내용에 따른 프로테아제 추출이 다양한 조건 하에서 섬유성 슬러리로부터 귀리 단백질의 분자 구조에 미치는 효과를 추가로 보여준다. 표 13의 데이터는 본 개시내용에 따른 프로테아제 분해된 귀리 섬유성 슬러리 샘플의 SDS-PAGE를 보여주는 도 5A 및 도 5B의 데이터로부터 취한 것이다. 테스트 샘플과 대조군이 표시되며, 여기서 테스트 샘플은 환원 및 비환원 조건 하에서 다양한 프로테아제 또는 알파 아밀라아제로 처리되었다. 레인 162는 ALKP로 처리되고, 레인 264는 NEUTB로 처리되며, 레인 391은 TRY1로 처리되고, 레인 527은 PAPN으로 처리되고, 레인 650은 무효소 대조군이고, 레인 903은 AAMY로 처리된다. 도 5A 및 도 5B로부터의 데이터는 실시예 9에서 더 자세히 논의되고 데이터는 표 13에 제시된다. 가수분해도(DH)는 이전에 기재된 바와 같이 계산되었고, SDS-PAGE는 일반적으로 본원에서 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다.
도 6은 2℃에서 저장된 귀리 섬유성 슬러리의 시간 경과에 따른 점도 변화를 보여준다. 습식 분쇄 또는 습식 밀링 및 메쉬를 사용한 초기 여과 후, 잔류물인 섬유성 슬러리는 저장 동안 시간 경과에 따라 점성이 더욱 높아질 것이다. 도 6에 도시된 데이터는 2℃에서 저장된 귀리 섬유성 슬러리에 대한 것으로서, 이 온도는 본 개시내용에 따라 프로테아제로 처리하기 전과 처리하는 동안 미생물 성장을 피하고 영양소 구조를 유지하기에 바람직한 온도이기 때문이다. 일반적으로, 본 개시내용의 범위 내에서 다른 실시형태가 고려되기는 하지만, 프로테아제를 첨가하기 전에 점도가 안정기에 도달하는 공정이 본 명세서에서 테스트되었다.
도 7은 2℃에서 프로테아제로 처리되기 전에, 귀리 섬유성 슬러리를 2℃에서 100분 동안 저장한 후 다양한 프로테아제로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 점도 변화를 보여준다. 도 7의 범례에서, 1= NONE709, 2=BRML652, 3=FLZM137, 4=TRY5595, 5=AAMY711, 6=ALKP270, 7=TRY1790, 8=NEUTN570, 및 9=NEUTB352이다. 도 7은 아래의 실시예 10 및 표 14에 더 자세히 설명되어 있는 더 큰 데이터 세트로부터의 대표적인 테스트 샘플을 보여준다. 실시예 10은 귀리 섬유성 슬러리의 점도에 대한 매우 다양한 프로테아제의 효과를 개시한다. 표 14는 2℃에서 다양한 효소로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 보여준다. 점도 감소는 섬유성 슬러리의 가공을 촉진하는 데 있어서 주요 요인이며, 일반적으로 본 개시내용에 따른 수율 증가와 상관관계가 있다.
도 8은 2℃에서 프로테아제로 처리하기 전에, 섬유성 슬러리를 2℃에서 100분 동안 저장한 후 상이한 프로테아제 농도의 NEUTB로 처리한 귀리 섬유성 슬러리의 점도 변화를 보여준다. 도 8의 범례에서, 1=NEUTB0005, 2=NEUTB0025, 3=NEUTB005, 4=NEUTB01, 및 5=NEUTB05이다. 도 8의 데이터는 2℃에서 상이한 효소 농도의 Neutral Protease L(NEUTB)로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 개시하는 실시예 11 및 표 15에 더 자세히 논의되어 있다.
도 9는 2℃에서 프로테아제로 처리되기 전에, 섬유성 슬러리를 2℃에서 100분 동안 저장한 후 상이한 프로테아제 농도의 미생물 트립신으로 처리한 귀리 섬유성 슬러리의 점도 변화를 보여준다. 도 9의 범례에서, 1=TRY1005, 2=TRY10025, 3=TRY1005, 4=TRY101, 및 5=TRY105이다. 도 9의 데이터는 2℃에서 상이한 효소 농도의 TRY1로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 개시하는 실시예 12 및 표 16에서 더 자세히 논의되어 있다.
종합하면, 데이터는 놀랍게도 섬유성 슬러리(150)에 특정 프로테아제의 첨가가 매우 낮은 온도 및 극한 pH에서 점도의 빠르고 실질적인 감소를 초래한다는 것을 보여준다. 표준 사용률 이하로 첨가될 수 있는 NEUTB로부터의 점도 감소는 기질 섬유성 슬러리(150)의 저온을 고려할 때, 상당하고 예상치 못한 것이다. 일부 실시형태에서, 효소 반응 시간 10분 미만 후 점도 감소는 잔류물을 여과시켜 고유한 영양소 프로필을 갖는 2차 식물 기반 밀크를 생산하기에 충분하다. 효소 처리 없이 희석된 섬유성 슬러리는 높은 점성 및 점액성이고, 실질적인 면에서, 식물 기반 밀크의 생산을 포함한 대부분의 적용예에서 가공이 불가능한 상태이다.
놀랍게도, 본 개시내용의 공정에 따르면, 섬유성 슬러리(150)에 존재하는 영양소의 대부분 또는 상당 부분은 본 개시내용에 정의된 바와 같은 준최적, 또는 엄격하게 준최적인 프로테아제 활성 조건, 즉 프로테아제가 최소 활성 또는 완전히 비활성일 것으로 예상되는 조건 하의 저온에서 효율적으로 추출될 수 있다. 본 개시내용의 인큐베이션 온도는 일 실시형태에서 제한 없이 0℃ 내지 25℃ 범위일 수 있지만, 더 낮은 온도가 바람직할 수 있다. 저온 추출 동안 인큐베이션 시간은 일 실시형태에서 제한 없이 1분 내지 1시간, 더 바람직하게는 2분 내지 30분 범위일 수 있다. 프로테아제 활성에 대해 예상되는 최소값보다 낮은 pH, 예를 들어 pH 5.0 미만에서의 프로테아제 처리는 또한 놀랍게도 매우 낮은 온도에서도 섬유성 슬러리(150)로부터 상당한 양의 영양소 추출을 초래했다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 NEUTB 또는 트립신으로의 처리(154)에 의해 유발된 2℃에서의 점도의 빠른 감소는 상업적 가공 동안 상이한 시점에서 수집된 섬유성 슬러리(150)의 다중 배치에 대한 빠른 조합 가공을 가능하게 한다. 본 개시내용에 따른 프로테아제 처리(154)를 위한 저온에서의 적은 인큐베이션 시간은 섬유성 슬러리(150)의 초기 배취가 저장되어 있는 동안 미생물 성장을 방지하고, 조합된 배취가 연장된 저장수명 또는 무균 제품을 위한 고온 가공하기 전에 처리될 때 점도의 빠른 감소를 허용한다.
많은 효소와 같이 프로테아제는 1종보다 많은 반응 유형을 촉매할 수 있다. 일부 제2 활성은 상이한 조건 하에서 발생하며 제1 효소 활성에 비해 상이한 온도 및 pH의 작동 범위를 가질 수 있다. 예를 들어, 많은 프로테아제는 프로테아제 활성 외에도 플라스테인 형성 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. (Sun 등 2021; Xu 등 2014). 이론에 얽매이지 않고, Neutrase® 및 트립신은 저온 및 낮은 pH에서 관찰된 빠른 점도 감소의 원인이 되는 제2 활성을 가질 가능성이 있다.
프로테아제 추출 다음으로 단백질의 최소 내지 중간 정도의 분해/가수분해가 뒤따른다. 일부 실시형태에서, 프로테아제 처리는 아밀라아제와 같은 다른 효소와 조합되어 세포벽 다당류와 같이 강력하게 결합된 다른 구조적 종자 성분으로부터 단백질을 효과적이고 철저하게 가수분해하고 해리할 수 있다. 선택적으로, 아밀라아제 또는 아밀라아제 혼합물은 섬유성 슬러리(150)에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 섬유성 슬러리(150)는 프로테아제 처리(154) 전에 냉수로 1-2× 희석(152)될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소를 불활성화하기 위해, 섬유성 슬러리(150)는 160℃ 내지 99℃로 가열될 수 있거나, 일부 실시형태에서는 분당 6℃의 속도로 75℃ 내지 99℃ 사이로 가열될 수 있다. 일부 실시형태에서 열 비활성화는 신속한 비활성화를 위한 직접 또는 간접 증기 처리에 의해 이루어질 수 있다. 그 다음, 섬유성 슬러리(150)는 82℃로 빠르게 냉각되어 처리된 섬유성 슬러리(164)를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가열(160)은 프로테아제가 활성인 온도 범위에서 유의미한 인큐베이션 시간 없이 효소가 실질적으로 불활성화되도록 급속일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 증기 주입을 포함할 수 있는 증기 가열, 또는 직접 및 간접 증기 가열에 의해 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 바와 같이, 마이크로파를 포함하는 빠른 가열의 대안적인 방법이 사용될 수도 있다.
처리된 섬유성 슬러리(164)는 그 다음 #60-400 스크린을 통해 체질되어(166), 표에서 2차 밀크 또는 2nd 밀크로도 지칭될 수 있는 가공된 2차 밀크(170) 및 클린 섬유(168)를 생성할 수 있다. 이 공정으로부터 생성된 클린 섬유(168)에는 단백질 및 지방과 같은 거대 영양소가 실질적으로 없을 수 있으며, 주로 불용성 섬유로 이루어질 수 있다. 클린 섬유(168)는 본 개시내용의 공정의 부산물이며, 식품 및 기타 적용예에서 가치가 있을 수 있다.
가공된 2차 밀크(170)는 가공된 1차 밀크(116)와 조합되어 조합된 밀크(120) 또는 조합된 밀크 제품(120)을 생성할 수 있다. 대안적으로, 가공된 1차 밀크(116) 및 가공된 2차 밀크(170)인 밀크는 별도로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 공정에 따라 섬유성 슬러리(150)로부터 유래된 가공된 2차 밀크(170)는 섬유성 슬러리에서 발견되는 상당량의 단백질, 지방, 회분 및 탄수화물을 함유한다. 섬유성 슬러리(150)에서 단백질, 섬유, 지방 및 탄수화물의 분리는 이들 성분이 물에 분산 및 가용화되도록 하여 가공된 2차 밀크(170)를 형성하도록 함으로써 수율을 증가시킨다. 또한, 프로테아제에 의한 점도 감소는 체질(166) 동안 메쉬를 통한 영양소 물질의 흐름을 증가시킬 수 있어, 가공된 2차 밀크(170) 내 증가된 영양소 수율을 야기한다.
가공된 2차 밀크(170)는 가공된 1차 밀크(116)와 조합되거나 별도로 사용될 수 있다. 가공된 1차 밀크(116)와 가공된 2차 밀크(170)가 조합되는 경우, 조합 밀크(120)는 더 높은 수율을 갖고, 일부 경우에는 기능성이 향상되며, 곡물의 섬유성 부분 및 견과류의 섬유성 집합체에 주로 존재할 수 있는 추가 영양소를 갖는다. 이하 실시예 및 표는 Conrad가 설명한 바와 같이, 착유 전 단백질 가수분해 공정이 기계적 공정만 사용한 것과 비교하여 귀리의 수율을 유의미하게 개선시켰음을 보여준다.
본 개시내용에 따라 생성된 밀크는 쓴맛이 없는 반면, Conrad 공정에 따라 생성된 식물 기반 밀크는 쓴 뒷맛을 가졌다. 또한, Conrad 공정에 의해 생성된 식물 기반 밀크는 습식 밀링된 기계적 공정 및 본 개시내용의 공정과 비교할 때 발포성 및 거품 안정성과 관련하여 손상된 기능성을 나타냈다.
본 개시내용의 공정은 모든 테스트된 생성물에서 밀크의 수율을 개선시켰지만, 그 영향은 특정 재료에서 더 컸다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 공정은 대부분의 가용성의 중소 분자량 단백질을 1차 밀크 분획으로 효과적으로 분리시키고, 호분층과 아호분층에서 세포벽 구성성분에 단단히 결합된 단백질을 2차 밀크로 격리시키는 것으로 나타난다. 따라서, 본 개시내용은 모든 밀링된 식물 재료를 프로테아제로 처리하는 경우의 바람직하지 않은 영향을 최소화하면서, 선행 기술과 비교하여 밀크 수율을 유의미하게 개선시킨다.
또한, 본 개시내용은 생성물의 바람직하지 않은 감각 특성을 생성하는 유리 아미노산 및 펩타이드와 소 분자량의 단백질 분자의 생성을 제한한다. 본 개시내용은 1차, 2차 및 3차 반응물(즉, 갈변)이 종자 내의 다른 구성성분과 반응하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 본 개시내용에 따른 공정은 식품 및 기타 적용예에 사용될 수 있는 클린 섬유(168) 부산물을 생성한다.
본 발명에 따른 공정의 추가적인 이점은 추출을 위한 짧은 가공 시간을 포함하며, 이는 산업 환경에서 수익성을 증가시킨다. 또한, 저온 및 낮은 pH는 가공 중 미생물 성장을 방지한다.
한 실시형태에서, 본 개시내용은, 특히 본 개시내용에 효과적인 중성 프로테아제를 사용하는 경우, 산화된 귀리 곡물과 같이 낮거나 높은 pH 기질에 효과적일 수 있다. 귀리 가공 중에 장기간 저장된 귀리는 산화되는 경향이 있어 더 낮은 pH를 갖고, 이는 pH의 완전한 1 포인트 감소를 유발할 수 있다. 대부분의 곡물은 살아 있거나, 곡물의 pH를 저하시키는 반응을 초래하는 불활성화된 곡물에서 특정 효소가 여전히 활성이다. 또한, 다양한 이유로 가공 중에 pH 조정이 발생할 수 있으며, 낮은 pH 및 높은 pH에서의 본 개시내용의 효능은 특정 실시형태에서 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폐보리 곡물, 또는 더 높거나 더 낮은 pH를 갖는 기타 폐기물과 같은 폐기물은 본 개시내용에 의해 처리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 온도 범위는 0℃와 본 개시내용에 효과적인 프로테아제의 상위 변성 온도 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 온도는 0℃와 본 개시내용에 효과적인 프로테아제의 상위 활성 범위 사이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 온도는 준최적 온도일 수 있고, 여기서 준최적은 단백질 공급업체의 간행물 또는 기타 간행물에서 제공된 제안된 범위 미만, 또는 관련 기술분야의 기술자에 의해 사용될 것으로 예상된 범위 미만을 의미하는 것으로 정의된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 온도 범위는 0℃ 내지 80℃, 또는 0℃ 내지 70℃, 또는 0℃ 내지 60℃, 또는 0℃ 내지 50℃, 또는 0℃ 내지 40℃, 또는 0℃ 내지 35℃, 또는 0℃ 내지 30℃, 또는 0℃ 내지 25℃, 또는 0℃ 내지 20℃, 또는 0℃ 내지 15℃, 또는 0℃ 내지 12℃, 또는 0℃ 내지 10℃, 또는 0℃ 내지 9℃, 또는 0℃ 내지 8℃, 또는 0℃ 내지 7℃, 또는 0℃ 내지 6℃, 또는 0℃ 내지 5℃, 또는 0℃ 내지 4℃, 또는 0℃ 내지 3℃, 또는 0℃ 내지 2℃, 또는 0℃ 내지 1℃ 사이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 효소 불활성화 또는 미생물 감소를 위해 이러한 물질을 의도적으로 가열하는 경우가 아닐 때, 본 개시내용에 따라 사용되는 물질을 유지하기에 효과적인 온도 범위는 0℃ 내지 50℃, 또는 0℃ 내지 40℃, 또는 0℃ 내지 35℃, 또는 0℃ 내지 30℃, 또는 0℃ 내지 25℃, 또는 0℃ 내지 20℃, 또는 0℃ 내지 15℃, 또는 0℃ 내지 12℃, 또는 0℃ 내지 10℃, 또는 0℃ 내지 9℃, 또는 0℃ 내지 8℃, 또는 0℃ 내지 7℃, 또는 0℃ 내지 6℃, 또는 0℃ 내지 5℃, 또는 0℃ 내지 4℃, 또는 0℃ 내지 3℃, 또는 0℃ 내지 2℃, 또는 0℃ 내지 1℃ 사이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 pH 범위는 대략 3.5 내지 12, 또는 대략 4 내지 12, 또는 대략 4.5 내지 12, 또는 대략 3.5 내지 11, 또는 대략 4 내지 11, 또는 대략 4.5 내지 11, 또는 대략 4.5 내지 10, 또는 대략 4.5 내지 9, 또는 대략 4.5 내지 8, 또는 대략 4.5 내지 7, 또는 대략 4.5 내지 6.5, 또는 대략 5 내지 8, 또는 대략 5 내지 7, 또는 대략 5 내지 6, 또는 대략 6 내지 7, 또는 대략 6 내지 8 사이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 10분, 또는 2분 내지 10분, 또는 5분 내지 10분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 20분, 또는 2분 내지 20분, 또는 5분 내지 20분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 30분, 또는 2분 내지 30분, 또는 5분 내지 30분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 45분, 또는 2분 내지 45분, 또는 5분 내지 45분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 60분, 또는 2분 내지 60분, 또는 5분 내지 60분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 90분, 또는 2분 내지 90분, 또는 5분 내지 90분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 1분 내지 120분, 또는 2분 내지 120분, 또는 5분 내지 120분 사이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 프로테아제 반응에 효과적인 인큐베이션 기간은 10초 내지 4시간 사이일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 프로테아제 반응에 효과적인 조건은 제한된 단백질 가수분해, 또는 본 개시내용에 정의된 바와 같은 낮은 가수분해도(DH)를 초래하는 조건이며, 이는 또한 이전에 본 명세서에 설명된 바와 같이, 단백질 분해 계수라고 지칭될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 공정에 충분한 낮은 DH는 최종 제품의 맛에 눈에 띄는, 또는 유의미한, 또는 부정적인, 또는 실질적으로 부정적인 변화를 초래하지 않는 DH이며, 여기서 맛의 변화는 단백질분해에 의해 유발되고; 일부 실시형태에서 최종 제품은 2차 식물 기반 밀크일 수 있거나, 일부 실시형태에서는 1차 식물 기반 밀크 및 2차 식물 기반 밀크의 조합, 또는 2차 밀크, 또는 2차 밀크의 건조 또는 농축 버전 및 임의의 다른 식품의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 정의된 바와 같은 허용되는 DH는 5% 미만, 또는 1% 미만, 또는 2% 미만, 또는 3% 미만 또는 4% 미만, 또는 6% 미만, 또는 7% 미만, 또는 8% 미만, 또는 9% 미만, 또는 10% 미만, 또는 11% 미만, 또는 12% 미만, 또는 13% 미만, 또는 14% 미만, 또는 15% 미만일 수 있다.
실시예에 개시된 것 외에 효과적일 수 있는 프로테아제에는 중성 메탈로프로테아제(M4 클래스)가 포함된다. 일부 실시형태에서, 관련 기술분야에 공지된 열에 불안정한 중성 박테리아 프로테아제는 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 열에 불안정하다는 것은 관련 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이 효소가 비교적 적당한 온도에서 비가역적 불활성화에 민감하다는 것을 의미한다. P1 = Leu, Val 또는 Phe 잔기로서 정의되는 기질 절단 특이성을 갖는 효소가 사용될 수 있으며, 여기서 P1은 절단되기 쉬운 결합의 N-말단 측에 있는 잔기이다. 적합한 열에 불안정한 박테리아 중성 프로테아제로는 바실러스 종(Bacillus spp.), 특히 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 방법은 NovoZymes®에서 상표명 Neutrase®, 특히 Neutrase 0.5 L로 시판되는 중성 프로테아제, 또는 유사한 특성을 갖는 효소의 사용을 포함한다. 특정 측면에서, 이 효소는 BIOCAT에서 시판되는 NEUTB일 수 있다. 일부 실시형태에서, 메탈로엔도프로테아제(EC. 3.4.24)는 Neutrase® 또는 Maxazyme NNP DS®(EC. 3.4.24.28; 바실로라이신)일 수 있다.
Neutrase®는 프로테아제에 대해 Novozymes Biopharma US Inc.가 소유한 상표명이다. Neutrase®는 현재 Novozymes에 의해 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(바실러스 서브틸리스에서 유래되는 것으로도 알려짐)로부터 유래된 메탈로프로테아제이다. 뉴트라제는 CAS 번호: 9080-56-2를 가질 수 있다. 뉴트라제는 주로 류신 및 페닐알라닌에 대한 특이성이 있다(Kunst, 2003). 중성 프로테아제는 중성, 약산성 또는 약알칼리성 환경에서 촉매로서 작용하는 프로테아제 클래스를 지칭한다. 최적의 pH는 6.0 내지 7.5 사이이며 단백질의 펩타이드 결합의 가수분해를 촉진하여 아미노산 또는 펩타이드를 방출할 수 있다.
중성 프로테아제는 종종 반응 속도가 빠르고 반응 조건에 넓은 적응성이 있다는 장점이 있다. Novozymes에 따르면 동물 단백질 추출용 Neutrase®는 고품질의 광범위한 스펙트럼의 엔도프로테아제이다. 이는 온화한 가수분해를 제공한다. 이는 종종 가수분해 과정에서 단독으로 사용되는 경우가 많지만, 뛰어난 풍미 이점을 위해 엑소프로테아제와 조합될 수도 있다. 사용 가능한 강도(범위) 0.8 내지 1.5 AU-N/g. 가수분해 작용: 덜 공격적. 펩타이드 또는 단일 아미노산의 생성: 펩타이드. 쓴맛 제거: 아니오. 향긋한 풍미 생성: 예. 작동 pH 범위*: 6 내지 9. 작동 온도 범위(℃)*: 30 내지 65. 품질 등급: 식품 등급. (https://biosolutions.novozymes.com/en/animal-protein/products/neutrase).
NEUTB는 버지니아주 22974 쓰리 노치 로드 트로이 9117에 소재하는 BIOCAT(https://www.bio-cat.com/)에 의해 제공된다. BIOCAT에서는 Neutral Protease L(NPL 또는 NEUTB)이 동물 및 식물 단백질 가수분해 둘 모두에 유용하다고 기술한다. BIOCAT은 NPL에 대한 제품 정보 페이지에서 NPL이 생선 또는 닭고기 부산물의 점도를 감소시키는 데 유용한 것으로서 NPL을 추가로 설명한다. BIOCAT은 알칼리성 프로테아제에 비해 쓴맛이 감소된 가수분해물을 생산하며 NPL이 식품 등급임을 명시한다. 제품 정보 시트에 따르면, BIOCAT NPL은 CAS # 76774-43-1 및 EC # 3.4.24.28을 갖는다. NIH 웹사이트에 따르면, CAS #76774-43-1의 물질명은 프로테이나제, 바실러스 중성이다. (https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/76774-43-1). EC # 3.4.24.28은 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics)의 스위스 생물정보학 자원 포털인 Expasy에 바실로라이신(Bacillolysin), 및 대안적으로 바실러스 메탈로엔도펩티다제(Bacillus metalloendopeptidase), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테이나제 및 메가테리오펩티다제로 열거되어 있다. 촉매된 반응은 써모리신과 유사하지만 동일하지는 않은 것으로 열거되어 있다. 이 효소의 변이체는 B. 서브틸리스, B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 메가테리움, B.메센테리쿠스, B.세레우스 및 B.스테아로써모필러스를 포함한 바실러스 종에서 발견되었다. 이 효소는 펩티다제 패밀리 M4에 속한다. 이전 EC 3.4.24.4. NEUTB는 활성 범위가 NLT 1,600 AZO/g일 수 있다. NEUTB의 공급원은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로서 일부 간행물에 열거되어 있다. NEUTB의 형태는 액체이다.
Neutrase®(Novozymes®) 및 BIOCAT은 바실러스 아밀로퀘파시엔스에서 유래된 중성 프로테아제의 하위그룹인 메탈로프로테아제이며, 프로테아제의 M4 써모라이신 계열의 구성원이다. 메탈로프로테아제는 2가 금속 양이온의 존재에 의존적이며 투석이나 금속 킬레이트에 의해 비활성화될 수 있다. X선 결정학 연구에 따르면 대부분의 메탈로속프로테아제는 결정 형성 동안 효소 구조 내 금속 결합을 위한 부위를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 금속 양이온은 일반적으로 Zn2+이며, Mg2+ 및 Cu2+와 같은 다른 금속 양이온일 수도 있다. 효소의 활성 부위에 있는 금속 이온은 EDTA와 같은 킬레이트제에 의해 킬레이트화될 수 있어, 효소는 이의 부분 활성 또는 전체 활성을 상실한다. 이 과정은 일반적으로 가역적이며 금속 이온을 다시 첨가하면 효소 활성이 회복될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 프로테아제는 이의 공급원에 따라 박테리아 중성 메탈로프로테아제 또는 진균 중성 메탈로프로테아제일 수 있다.
박테리아 중성 프로테아제는 시장에서 가장 일반적으로 사용되는 중성 프로테아제이며, 특히 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포미스와 같은 바실러스에 의해 생성된 것이다. 박테리아 중성 프로테아제의 효소 활성은 주로 Mg2+, Zn2+ 및 Ca2+와 같은 2가 양이온에 의존적이다. 박테리아 프로테아제는 가수분해 능력이 강하고 반응 속도가 빠르며, 가수분해된 생성물은 쓴맛이 적어 식품 산업에서 널리 사용되고 있다.
진균 중성 프로테아제 공급원은 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 라이조푸스(Rhizopus) 및 뮤코(Mucor)를 포함한다. 진균 프로테아제의 촉매성 pH는 광범위하다(보통 4 내지 11). 아스퍼질러스 오리제는 산성 프로테아제, 중성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제를 생성할 수 있다. 진균 프로테아제의 생성은 주로 고상 발효를 통해 이루어진다. 이들의 프로테아제 활성은 금속 킬레이트에 의해 영향을 받을 수 있는 2가 양이온에 주로 의존적이다. 일반적으로, 진균 프로테아제의 반응 속도 및 안정성은 박테리아 프로테아제보다 비교적 낮다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 특정 트립신 프로테아제가 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, 일반적으로, 여기에는 박테리아 및 진균 트립신이 포함된다. 아스퍼질러스 멜레우스(Aspergillus melleus) 및 바실러스 서브틸리스는 본 개시내용에 효과적인 트립신의 공급원일 수 있다. 박테리아 및 진균 트립신은 키모트립신 패밀리 S1에 포함된다. 트립신의 다른 공급원도 효과적일 수 있으므로, 본 개시내용에 효과적인 임의의 박테리아 또는 진균 트립신은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
일반적으로, 본 개시내용에서 청구되는 프로테아제는 본 개시내용에 열거되지 않았지만 관련 기술분야의 기술자에게 알려져 있거나 발견될 수 있는 다른 프로테아제와 유사하거나 동등한 효과를 가질 수 있으며, 본 개시내용의 목적상 유사하거나 동등한 효과를 갖는 임의의 이들 프로테아제는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 효과적인 프로테아제는 다른 효소와 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 조합은 본 개시내용에 따라 독립적으로 효과적인 효소들 간에 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 조합은 본 개시내용에 따라 독립적으로 효과적인 프로테아제인 하나의 효소와 본 개시내용에 따라 효과적이지 않을 수 있는 보충 효소를 포함할 수 있다. 보충 효소로는 아밀라아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나제, 리파아제, 피타제 또는 기타 효소를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 처리되는 재료는 식물 기반이 아닐 수 있다. 일부 실시형태에서, 처리되는 재료는 하수일 수 있다. 일부 실시형태에서, 처리되는 재료는 육류일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재료는 식물 기반 식품 외에 다른 식품 재료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재료는 애완동물 사료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 처리되는 재료는 베타 글루칸 함유 미생물 유기체 또는 진균일 수 있다. 출원 전반에 걸쳐, 밀크라는 용어의 사용은 생성물이 식용 가능한지 여부에 관계없이 본 개시내용의 공정에 따라 생성된 임의의 액체를 포함해야 한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 공정은 미생물 오염을 감소시키거나 제거하기 위해 프로테아제 처리된 물질의 열 처리를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 열 처리는 무균 처리일 수 있다. 일부 실시형태에서, 열처리는 초고온 처리(UHT)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 열처리는 저온살균에 충분한 온도에서 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 열처리는 연장된 저장수명(ESL) 제품을 생성하기에 충분할 수 있다.
일부 실시형태에서, 효소 불활성화를 위한 열 처리는 대략 90℃, 대략 85℃, 대략 80℃, 대략 75℃, 또는 대략 70℃일 수 있고; 여기서, 일부 실시형태에서, 효소 불활성화를 위한 열 처리는 처리된 물질이 파이프 또는 열 교환기를 포함하는 가공 장비의 요소를 막힘 없이 미생물 감소 또는 제거를 위한 고열로 가공될 수 있도록 처리된 물질의 충분한 액화를 초래할 것이며; 여기서, 일부 실시형태에서 불활성화되는 프로테아제는 NEUTB를 포함하는, 본 개시내용에 효과적인 것으로 밝혀진 중성 프로테아제이고; 일부 실시형태에서 추가 가공에 충분한 액화를 위해 알파 아밀라아제 또는 임의의 비프로테아제 효소는 필요하지 않다.
한 실시형태에서, 본 개시내용은 베타 글루칸 및 단백질 분자의 천연 구조의 보호를 최대화하면서, 귀리 및 보리와 같은 곡류 곡물, 및 잠재적으로 다른 베타 글루칸 함유 유기체로부터 베타 글루칸 및 단백질을 효과적으로 추출하는 공정을 고려할 수 있다. 고점도의 섬유성 물질이 폐기되는, 영양소 음료 또는 식물 기반 밀크를 생성하기 위해 귀리 또는 보리를 습식 밀링 또는 건식 밀링하는 공지된 방법과 비교할 때, 본 개시내용은 이 물질을 활용하여, 표 11에 제시된 바와 같이 곡물로부터 베타 글루칸 수율의 양을 두 배보다 높게 할 수 있는 한편, 표 8에 제시된 바와 같이 곡물로부터 단백질 수율을 거의 두 배가 되게 할 수 있다. 베타 글루칸 및 단백질 외에도, 본 발명의 공정은 곡물의 섬유성 부분으로부터 다른 가치 있는 영양소를 추출하기도 하며, 이들 중 다수는 이 물질에서만 발견되는 것이다. 2차 밀크에는 전분이 낮고, 이는 저탄수화물 음료로서 유리할 수 있다.
실시예
본 개시내용의 실시예에 사용된 재료 및 방법은 아래에 개시되어 있다.
섬유성 슬러리 제조
섬유성 슬러리는 일반적으로 적용 가능한 경우 아래의 각 실시예에 대해 본원에 기술된 바와 같이 제조된다. 일반적으로, 곡물, 견과류 또는 종자를 포함한 원료의 대략 100g, 200g, 250g 또는 300g을 계량하고, 대략 2배 양의 빙냉수(즉, 곡물 200g의 경우 400mL)로 세척한 후, 스트레이너(strainer)를 통해 물을 배출했다.
세척된 원료는 습식 블레이드가 있는 64oz Vitamix® 블렌더 컵, 모델 VM0135(Vitamix® Corp., 미국 오하이오주 클리브랜드 소재)에 넣었다. 세척된 원료에 4배량의 빙냉수(즉, 원료 200g에 대해 765g), 계산된 양의 CaCl2, CaCO3 및/또는 알파-아밀라아제(DSM, 미국 뉴저지주 파시파니 소재)를 블렌더 컵에 첨가했다. 그런 다음, 혼합물을 Vitamix® TurboBlend 4500(모델 VM0197, Vitamix® Corp., 미국 오하이오주 클리브랜드 소재)을 이용하여 2분 동안 고속(10/10 설정)으로 블렌딩했다.
1차 슬러리는 5.5"x3.75" 직선 에지의 플라스틱 보울 스크래퍼를 사용하여 US #120 메쉬 스크린을 통해 여과했다. 스크래퍼를 체 표면에 대해 30 내지 40° 각도로 원형 운동으로 움직여 대부분의 밀크를 여과시켰고, 스크래퍼를 이용하여 섬유에 편평하게 부드러운 압력을 가하여, 잔류 고체 함량이 대략 35%가 될 때까지 잔류물로부터 밀크를 끝까지 짜냈다. 일부 실험에서, 상이한 슬러리의 필요에 따라 세척, 블렌딩 및 체질을 포함하는 착유 공정이 반복되었다. 일부 실시형태에서, 1차 밀크의 수율은 귀리의 경우 건조 물질 기준으로 대략 67%로 계산되었다.
대략 125g의 섬유성 슬러리(즉, 200g 귀리 곡물 유래)에 300mL(초기 곡물 중량의 1.5X) 빙냉수를 첨가했다. 슬러리 혼합물을 다시 Vitamix® 블렌더 컵에 넣고, Vitamix® TurboBlend 4500을 사용하여 고속(10/10)으로 30초 동안 블렌딩했다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 희석된 블렌딩된 섬유성 슬러리는 총 고형분(즉, 귀리)이 대략 10.8%였다. 일부 실시형태에서, 400mL(초기 곡물 중량의 2X) 빙냉수를 첨가했다. 일부 실시형태에서, 총 고형분이 대략 8%인 희석된 섬유성 슬러리에 2X 물을 첨가했다.
섬유성 슬러리의 점도 변화 및 효소 활성에 대한 pH의 영향이 결정된 일부 실시형태에서, 섬유성 슬러리의 pH는 냉장고(1.7℃)에서 100분 보관하기 전에 블렌딩된 슬러리에 무수 구연산 또는 50% KOH 용액을 첨가하여 조정했다.
슬러리를 비이커에 넣어, 덮고 추가 질감, 점도 및 기타 분석이 이루어질 때까지 냉장고(1.7℃)에서 100분 동안 방치했다.
효소 비활성화
일부 경우에, 달리 지시되지 않는 한, 1차 밀크에 대한 효소 비활성화는 일반적으로 수조에서 15 내지 20분 동안 77℃로 가열한 후 마이크로웨이브에서 비등 가열하여 수행했다. 대안적으로, 일부 경우, 효소는 Nuova Simonelli Appia II V GR1을 사용하여 고압 증기를 80℃로 1분간 주입한 후, 마이크로웨이브에서 비등 가열함으로써 비활성화시켰다.
처리된 섬유성 슬러리 여과
섬유성 슬러리의 프로테아제 처리 후, 처리된 섬유성 슬러리는 1차 밀크를 여과하기 위해 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 메쉬를 통해 여과했다.
질감 분석
질감 분석은 일반적으로, 적용 가능한 경우 각각의 실시예에 대해, 이하에 기술된 바와 같이 수행했다. 섬유성 슬러리는 대형 냉장실에 100분(곡물 또는 견과류 슬러리) 또는 30분(닭 껍질 슬러리) 동안 보관했고, 그 다음 휴대용 블렌더(Oster, PN:181439 Rev B)를 사용하여 속도 설정 1/저속으로 10초 동안 혼합한 뒤, 아크릴 역압출 컵(25mm(i.d.) x 100mm 높이, 미국 매사추세츠주 사우스 해밀턴에 소재하는 Texture Technologies Corp.)에 넣었다.
일백오십 그램(150g)의 섬유성 슬러리를 아크릴 역압출 컵에 넣었다. 아크릴 역압출 컵 중 섬유성 슬러리 일백오십 그램(150g)의 높이는 대략 72mm였다.
총 고형분, 효소 첨가 전 pH 및 점도를 측정했다.
샘플이 담긴 압출 컵은 질감 분석을 위해 1.8℃ 빙수조에 두었다. 그런 다음, 테스트 시작 직전에 미리 계산된 양의 효소를 슬러리 상부로 첨가했다. 닭껍질 실험의 경우에는 온수(49℃) 또는 열수(60℃)조를 사용했다.
점도 변화 측정 동안 압축 및 혼합을 얻기 위해 40mm 디스크(Texture Technologies, Inc., 미국 매사추세츠주 사우스 해밀턴 소재)를 구비한 역압출 장치를 사용했다.
Exponent Connect 버전 8.0.7.0 소프트웨어로 작동되는 Texture Technologies Co.(미국 매사추세츠주 사우스 해밀턴 소재)의 TA.XTPlus C 질감 분석기를 사용하여 귀리 섬유 슬러리를 압축하는 힘을 측정했다.
귀리 슬러리를 20 mm/초의 속도로 70mm에서 5mm로 압축하기 위한 최대 힘은 5kg 리드 셀을 사용하여 측정했다. 데이터 수집은 최대 200 사이클까지 지속했고, 각 피크에 대한 최대 압축력을 측정하여 효소 처리로부터의 점도 변화 및 속도에 접근하기 위해 사용했다.
원시 데이터로부터 각 사이클에 대한 최대 압축력만을 추출하여 추가 분석에 사용했다.
귀리 잔류물 슬러리의 경우, 슬러리의 점도는 최대 약 100분까지 지속적으로 증가하는 것으로 관찰되었다(도 5). 따라서, 곡물/견과류 잔류물 슬러리에 대한 질감 분석기를 사용한 임의의 질감 변화 측정은 슬러리를 대형 냉장실(1.7℃)에서 100분 동안 보관한 후 수행했다. 각 효소를 테스트하기 위해 곡물/견과류로부터 신선한 슬러리를 제조하고 100분 동안 저장한 후, 적절한 테스트 매개변수를 적용하고 질감 변화를 질감 분석기로 측정했다.
질감 분석을 위해, 일부 실시형태에서 슬러리는 곡물 및 견과류 슬러리의 경우 100분 동안, 닭 껍질 슬러리의 경우 30분 동안, 또는 단백질 분리물 및 농축물 슬러리의 경우 하룻밤 동안 대형 냉장실에 보관했다.
점도 측정:
점도 측정은 일반적으로 적용 가능한 경우, 하기의 각 실시예에 대해 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행했다. 얼음 수조에서 1 내지 2℃로 냉각되거나 대형 냉장실에서 유지된, 곡물/견과류 잔류물 슬러리, 닭껍질 슬러리, 및 착유 베이스를 비이커에 옮겨 1.7℃ 얼음-수조에 넣고, 샘플과 얼음-조 온도가 평형을 이루도록 10분 동안 조에 방치했다. 얼음조 온도를 모니터링하고 물이나 얼음을 추가하여 일정한 온도를 유지했다.
샘플 비이커를 샘플 얼음-얼음 조에서 한 번에 하나씩 꺼내어, 점도계 하에 1.7℃로 유지되는 또 다른 얼음-수조에 넣었다. 그런 다음, 샘플 튜브가 얼음-수조에 있는 동안 #3, 4 또는 5 라운드의 디스크 프로브가 장착된 Brookfield RVT 시리즈 점도계(Brookfield Engineering Laboratories Inc., 매사추세츠주 미들보로 소재)를 사용하여 샘플 혼합물의 점도를 측정했다. 점도계 속도는 50 또는 100rpm이었으며, 점도계 제조사에서 제공한 표를 이용하여 점도를 센티푸아즈(cPs)로 환산했다. 3개의 판독값을 수집하여 점도에 대해 평균을 냈다.
샘플 사이의 변동을 최소화하고 냉장 샘플을 더 높은 온도(즉, 실온, 21℃)로 가온하는 동안 점도 변동, 특히 속도 변동을 최소화하기 위해 얼음 수조 중 1.7℃에서 점도를 측정했다.
밀크 및 기타 생성물의 관능적 평가
대략 30mL의 밀크 또는 기타 생성물을 지정된 3자리 난수로 지정하고, 3oz Solo 컵에 넣었다. 전문가 패널 구성원(들)은 9점 품질 척도를 사용하여 밀크 및 생성물의 전반적인 품질을 평가하고 등급을 매겼다.
최하 품질 - 냄새, 쓴맛, 신맛, 짠맛, 떫은맛, 목 스크래칭, 더 어둡거나 상이한 색상, 점액성, 점성 질감 등과 같은 많은 이취 및 맛 측면으로 인해 매우 허용되지 않음. 또한, 이는 단맛이 적거나 전혀 없고 의도한 풍미(예: 귀리 밀크의 귀리 맛)가 부족한 샘플을 포함한다. 중간 품질: 허용 가능하거나 또는 허용 불가능하지도 않음. 최상 품질: 이질감(off note) 없이 높은 허용도, 의도한 풍미의 높은 강도, 적절한 수준의 단맛, 식감 및 양호한 색상.
샘플 사이에 패널 구성원은 자신의 미각을 증류수, 무염 염분 크래커로 씻고, 이전 샘플 평가에서 남은 이질감 없이 미각이 깨끗해질 때까지 최소 3분 동안 기다렸다.
일부 경우에 관능 품질은 9점 품질 척도를 사용하여 평가했다. 1점은 많은 이질감 및 품질이 좋지 않은 최하 품질의 생성물을 나타내고, 9점은 이질감이 없고 의도한 풍미의 강도가 높으며, 원하는 수준의 단맛과 식감, 및 양호한 색상을 갖는 최고 품질의 생성물에 부여된다.
단백질 분리물 및 단백질 농축물 분석
분석에 사용된 단백질 분리물 및 농축물은 어떠한 변형 없이 사용했다. 적절한 양의 단백질 분말과 차가운 빙수의 무게를 측정하여 대략 10% 또는 20%의 고체 슬러리를 생성했다. 물과 단백질 분말 혼합물을 Vita-Mix TurboBlend 4500을 사용하여 2분 동안 고속(10/10 설정)으로 블렌딩/혼합했다. 슬러리를 대형 냉장실(1.7℃)에 밤새(최소 16시간) 두어, 단백질을 완전히 수화시켰다.
단백질 가수분해도(DH)
단백질 가수분해도, 또는 단백질 분해 계수(CPD)는 일반적으로 하기 각각의 실시예에서 적용 가능한 경우 본원에 기술된 바와 같이 측정했다. 샘플의 총 고체 및 단백질 함량은 Ohaus MB90 수분 분석기(뉴저지주 파시파니)를 사용하고, NDA 701 Dumas 질소 분석기(Velp Scientific, Inc., 뉴욕주 보헤미아)를 사용하여 Dumas 방법에 의해 변환 계수 6.25를 사용하여 측정했다.
샘플은 4 mg/mL의 단백질 농도로 희석한 다음, 2-머캅토에탄올(2-ME)이 있거나 없이 동량의 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 샘플 완충액에 용해시키고, 끓는 물에서 3분간 가열했다.
샘플을 실온으로 냉각한 후, 용액을 2000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 비단백질 입자를 제거했다.
Bio-Rad Lab.(미국 캘리포니아주 허큘레스)에서 구입한 사전주조된 겔 또는 확립된 절차에 따라 제조된 SDS-PAGE 겔(분리 겔: 12% 아크릴아미드; 스태킹 겔: 5% 아크릴아미드)을 사용했다. 전기영동은 SDS-PAGE 분석을 수행한 제3자 실험실에서 개발된 절차에 따라 수행했다.
분자량 표준물은 Sigma-Aldrich Co.에서 구입했다. 모든 화학 시약 및 유기 용매는 Sigma-Aldrich에서 구입했다. 개별 단백질 밴드의 정량(픽셀 및 %)은 디지털화 분석 소프트웨어를 사용하여 SDS-PAGE 이미지에서 수행했다.
귀리 밀크의 가수분해도는 2-머캅토에탄올을 함유한 환원 SDS-PAGE 겔에서 25kDa 미만의 분자량을 갖는 펩타이드 양의 상대적 양 변화(증가 %)로부터 결정했다.
물질의 계산
모든 물질 측정값은 달리 특정되지 않는 한 건조 물질 베이스(DSB)에 대해 계산했다.
거품 품질
거품 품질은 일반적으로 이하의 실시예 각각에서 적용 가능한 경우 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정했다. pH 측정된 최종 밀크는 증류수를 첨가하여 10% 고형물 밀크로 희석하고 블렌딩했다.
각 밀크 일백 그램(100g)을 네스프레소 밀크 거품기(Nespresso USA Inc., 뉴욕주 뉴욕시)에 넣고, 거품을 냈다.
따뜻한 거품 샘플을 400mL 눈금 비이커에 넣고, 거품의 부피와 품질을 관찰하고 기록했다.
거품/액체의 부피와 거품의 품질로부터, 거품 품질을 변환시켜 1 내지 5 사이로 등급을 매겼다.
(1) 거품 품질 불량 : 거품을 낸 후의 밀크/거품 혼합물의 부피가 100 내지 120mL이고 버블의 크기가 크고 빠르게 붕괴한다.
(2) 평균 이하 : 거품을 낸 후의 밀크/거품 혼합물의 부피가 120 내지 150mL이고, 버블의 크기가 크고 빠르게 붕괴한다.
(3) 평균 : 거품을 낸 후 밀크/거품 혼합물의 부피가 125 내지 175mL이고, 큰 마이크로 버블의 혼합물이며 중간 속도로 붕괴한다.
(4) 평균 이상: 거품을 낸 후 밀크/거품 혼합물의 부피가 150 내지 200mL이며 주로분 미세 거품이 발생하고 느리게 붕괴한다.
(5) 우수함: 거품을 낸 후 밀크/거품 혼합물의 부피가 200mL를 초과하고 주로 미세 거품이며 느리게 붕괴한다.
재료
본 개시내용에 사용된 재료는 이하에 열거된다.
알칼리-프로테아제(Bacillus licheniformis), 브로멜라인(Ananas comosus, 파인애플), 진균 프로테아제 A(Aspergillus niger), 진균 프로테아제 A2(Aspergillus niger), 진균 프로테아제 HU(Aspergillus oryzae), Neutral Protease L™(Bacillus amyloliquefaciens), Opti-Ziome NPL 일명 중성 프로테아제(Bacillus subtilis), OPTI-Ziome Pro-ST, 파파인(Carica papaya(파파야), 프로테아제 AM(Aspergillus melleus), 트립신 미생물(Aspergillus melleus & Bacillus subtilis), 및 자일라나제(Trichoderma longibrachiatum))는 Bio-Cat(버지니아주 트로이)에서 수득했다. 박테리아 아밀라아제는 DSM(뉴저지주 파시파니)에서 구입했다. α-키모트립신(소 췌장), 카복시펩티다제 A(소 췌장), 프로테이나제 K(Tritirachium album), 써모라이신(Geobacillus stearothermophilus), 트립신 I형(소 췌장) 및 트립신 II-S형(돼지 췌장)는 MilliporeSigma(미국 매사추세츠주 버링톤)에서 구입했다. 플라버자임(Bacillus licheniformis 및 amyloliquefaciens) 및 뉴트라제(Bacillus amyloliquefaciens)는 Novozymes(미국 노스캐롤라이나주 프랭클린턴)에서 수득했다. 탄산칼슘(CaCO3)은 Specialty Minerals Inc.(매사추세츠주 아담스)에서 구입했다. 무수 구연산은 Fisher Chemical(뉴저지주 페어 론)에서 구입했다. 염화칼슘(CaCl2)은 Avantor Performance Material Inc.(펜실베니아주 센터 밸리)에서 구입했다. 수산화칼륨(KOH)은 Mallinckrodt Pharmaceuticals(뉴저지주 햄프톤)에서 수득했다. 병아리콩 단백질 분리물(Plantec, 품목 SP24000)은 미국 일리노이주 에반스톤의 Socius Ingredient LLC에서 수득했다. 완두콩 단백질(Puris 870MV)은 World Food Processing LLC(미국 위스콘신주 터틀레이크)에서 수득했고, 80% 분리물(YPVCP-80C)은 Yantai T Full Biotech Co.(중국 산둥성 자오위안)에서 수득했다.
표 1은 약어, 공급업체 및 추가 정보를 포함하는, 본 개시내용에 사용된 효소의 목록을 포함한다.
실시예 1
실시예 1과 관련하여, 구체적으로 200g의 다양한 식물 재료를 표 1 내지 3에 제시된 같이 1배량의 빙냉수로 세척한 후, 손으로 혼합하고, 스트레이너를 통해 배출시켰다. 세척을 추가 2회 반복했다. 식물 재료를 블렌더 컵(Vitamix®)에 넣었다. 600 내지 800mL의 빙냉수, 100 내지 400 마이크로리터의 알파-아밀라아제(AAMY, DSM), 60mg 또는 CaCl2 및 100 내지 200mg의 CaCO3를 첨가했다. 혼합물을 2분 동안 고속(10/10 설정)으로 블렌딩하여 1차 슬러리를 형성시켰다.
1차 슬러리를 #100 또는 #120 메쉬 스크린을 통해 여과하여 섬유성 슬러리 잔류물로부터 1차 밀크를 분리했다. 1차 밀크는 뚜껑을 덮어 냉장고에 보관했다. 섬유성 슬러리 부분을 블렌더 컵으로 옮겼다. 섬유성 슬러리에 냉수(2℃) 333mL 내지 400mL 및 Neutral Protease L(NEUTB, BioCat) 66mg을 첨가했다. 혼합물을 고속(10/10)으로 30초 동안 블렌딩하고 냉장고(2℃)에 0.5 내지 1시간 동안 두었다.
프로테아제와 슬러리 혼합물을 냉장 보관한 후, 50 내지 200 마이크로리터의 알파-아밀라아제(AAMY, DSM)를 첨가했다(아밀라아제는 일부 실시형태에서 선택 사항임). 1차 밀크 및 처리된 섬유성 슬러리는 별도로 수조에서 15 내지 20분 동안 76.7℃까지(분당 약 6℃) 가열했고, 효소 비활성화를 위해 마이크로웨이브에서 추가로 비등 가열했다. 1차 밀크는 수조에서 71℃까지 감온시킨 후, 수조(60℃)에서 따뜻하게 유지했다. 귀리의 경우, 곡물 200g과 물 800g으로부터 대략 775g의 1차 밀크가 수집되었으며 판매된 1차 밀크 고형분 함량은 15%였다(나머지 225g은 섬유성 슬러리 잔류물에 있음). 이 계산은 약 58%의 수율을 보여준다. 추가적인 세척 및 분쇄 사이클(도 1의 (108))은 결과를 변동시킬 수 있지만, 추가적인 세척 및 분쇄 사이클은 시간 및 에너지 증가로 인해 비용을 추가하고 실제적인 측면에서 바람직하지 않을 수 있다. 본 개시내용의 공정은 추가적인 세척 및 분쇄 사이클의 필요성을 감소시키고 효율을 개선시킨다.
섬유성 슬러리는 82℃로 감온시키고 #100 또는 #120 메쉬 스크린을 통해 여과했다(세척). 세척된 섬유성 슬러리 부분에 냉수 333 또는 400mL를 추가로 첨가하고 혼합물을 30초 동안 블렌딩했다. 블렌딩된 혼합물을 #100 또는 #120 메쉬 스크린을 통해 여과하여 2차 밀크를 생성했다. 귀리 2차 밀크의 경우, 곡물 200g에서 기계적인 공정을 거쳐 그 양은 640g이었고, 밀크 내 고형분은 각각 5%였다. Neutral Protease L(NEUTB) 처리 공정(본 발명)에 의한 곡물 200g으로부터의 귀리 2차 밀크의 경우, 그 양은 600g이었고 밀크 중 고형분은 각각 8%였다(설명을 필요로 함/논의 요망). (불활성화하기 위한 가열은 증기 증발에 의한 수분 손실을 유발하여, 이전 샘플의 640g에 비해 600g을 제공함).
생성된 2차 밀크를 1차 밀크와 혼합했다. 조합된 밀크는 60℃에서 GEA Niro Sovavi™ 균질기를 사용하여 2000 PSI(1단계에서는 1500psi, 2단계에서는 500psi)로 균질화하고 냉장고에 두었다. 균질화된 밀크의 pH 및 총 고형분 함량을 측정했다. 밀크 및 바리스타, 크리머, 라떼(표 5)를 포함한 밀크 함유 최종 제품의 관능적 및 기타 기능적 특성은 표 4에 제시된 바와 같이 평가되었다. 메쉬 스크린에 남아 있는 섬유 분획은 건조 팬에 놓고 오븐에서 건조될 때까지(<10% 수분 함량) 대략 16시간 동안 93.3℃로 건조했다.
표 2는 귀리 착유 절차 프로토콜 및 밀크 수율을 개시한다. 섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 테스트 샘플 1 및 2는 기계적 공정만을 사용하여 제조했다. 테스트 샘플 2 및 3에는 효소가 첨가되었고 분리하지 않았다. 테스트 샘플 5 및 6에는 효소가 첨가되었고 분리되었다. 측정값은 초기 원료 중량을 기준으로 계산했다. 수율은 건조 물질 기준으로 측정한다.
표 3은 병아리콩 착유 절차 프로토콜 및 밀크 수율을 개시한다. 섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 테스트 샘플 1 및 2는 기계적 공정을 사용하여 제조했다. 테스트 샘플 2 및 3에는 효소가 첨가되었고 분리하지 않았다. 테스트 샘플 5 및 6에는 효소가 첨가되었고 분리되었다. 측정값은 초기 원료 중량을 기준으로 계산되었다. 수율은 건조 물질 기준으로 측정된다.
표 4는 아몬드 착유 절차 프로토콜 및 밀크 수율을 개시한다. 섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 테스트 샘플 1 및 2는 기계적 공정을 사용하여 제조했다. 테스트 샘플 2 및 3에는 효소가 첨가되었고 분리하지 않았다. 테스트 샘플 5 및 6에는 효소가 첨가되었고 분리되었다. 귀리 크리머는 pH 5.11의 뜨거운 커피에서 평가되었다. 바리스타 기반은 거품기에서 평가되었다. 아몬드 라떼는 바리스타 베이스와 커피로 만들었다. 측정값은 초기 원료 중량을 기준으로 계산했다. 수율은 건조 물질 기준으로 측정된다.
표 5는 밀크 및 착유 베이스로 만든 제품의 감각적 및 기능적 특성을 개시한다. 섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 테스트 샘플 1과 2는 기계적 공정만을 사용하여 제조되었다. 테스트 샘플 2와 3에는 효소를 첨가하고 분리하지 않았다. 테스트 샘플 5 및 6에는 효소를 첨가하고 분리했다. 귀리 크리머는 pH 5.11의 뜨거운 커피에서 평가되었다. 바리스타 기반은 거품기에서 평가되었다. 아몬드 라떼를 바리스타 베이스와 커피로 만들었다.
실시예 1은 섬유성 슬러리로부터 영양소의 프로테아제 회수가 10℃ 미만에서 상당하며 관능적 특성이 일부 경우에 본 개시내용의 공정에 의해 개선될 수 있음을 보여주었다.
실시예 2
표 6에 제시된 바와 같이, 본 개시내용의 방법에 따라 귀리 밀크의 수율을 증가시키는 능력에 대해 섬유성 슬러리를 사용하여 다양한 효소 그룹을 테스트했다. 프로테아제, 아밀라아제 및 자일라나제는 준최적의 효소 활성 온도인 10℃에서 테스트했다. 알파 아밀라아제(AAMY), Neutral Protease L(NEUTB) 및 자일라나제(XYL)를 알파 아밀라아제만 사용한 대조군과 비교했다. 표 6은 최적 활성 온도 미만(10℃)에서 다양한 효소 처리된 섬유성 슬러리로부터의 귀리 밀크 회수율을 보여준다.
대조군을 위해 귀리 곡물 200g을 빙냉수로 3회 세척하고 물을 배출시켰다. 세척된 곡물을 빙냉수 800mL, 알파 아밀라아제(DSM, AAMY) 100ul, CaCl2 60mg 및 CaCO3 100mg과 블렌더 컵(Vitamix®)에서 조합했다. 혼합물을 2분 동안 고속(10/10 설정) 으로 블렌딩하여 1차 슬러리를 생성했다. 대조군은 물로 3회 세척했다. 대조군 샘플은 테스트 샘플에 사용된 습식 밀링 및 기계적 추출 공정을 실질적으로 재현했다.
테스트 샘플 1에서는 추가로 알파-아밀라아제 60mg, 또는 초기 곡물 중량의 0.03%를 샘플에 첨가했다. 테스트 샘플 2에서는 Neutral Protease L(BIOCAT) 66mg, 또는 초기 곡물 중량의 0.033%를 샘플에 첨가했다. 테스트 샘플 3에서는 자일라나제(XYL, BIO-CAT) 66mg, 또는 초기 곡물 중량의 0.033%를 첨가했다.
테스트 슬러리를 때때로 교반하면서 2시간 동안 냉수조에서 10℃로 인큐베이션했다. 2시간 동안 인큐베이션한 후, 슬러리를 수조에서 79.5℃로 15 내지 20분 동안 가열했고, 마이크로웨이브 오븐에서 끓을 때까지 추가로 가열했다. 가열된 섬유 슬러리는 뜨거울 때, 대략 82℃에서 US #120 메쉬 스크린을 통해 여과하여 세척하고, 물 400mL로 다시 세척하고 Vitamix®에서 30초 동안 블렌딩했다. 2차 밀크를 1차 밀크에 첨가했다. 세척 후 잔류물 중 섬유 부분은 폐기했다. 밀크 내 총 고형물의 양을 측정하고 기록하여 전체 밀크 수율을 계산했다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 대조군 샘플은 추출을 위해 기계적 공정만을 사용했다. 효소 약어는 별도의 표에 열거된다.
실시예 2는 10℃에서 섬유성 슬러리의 중성 프로테아제 및 아밀라아제 조합 처리로 인한 수율 증가가 높은 반면, 동일한 조건 하에서 아밀라아제 단독 처리, 또는 자일라나제와 조합된 아밀라아제 처리는 상대적으로 낮은 수율 증가를 초래한다는 것을 보여주었다.
실시예 3
그러나 실시예 3에서는 샘플을 중성 프로테아제 처리만으로, 아밀라아제 없이, 다양한 준최적의 활성 온도에서 테스트했다. 인큐베이션 시간도 다양했다. 표 7에 제시된 바와 같이, 샘플을 대략 4℃, 7℃ 및 10℃에서 인큐베이션했다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 대조군 샘플은 추출을 위해 기계적 공정만 사용했다. 중량%는 건조 물질 기준으로 측정했다. 테스트 샘플 1에는 NEUTB(BIOCAT) 34mg을 첨가했는데, 이는 초기 곡물 중량의 0.173%이다. 테스트 샘플 2, 3, 및 4에서는 Neutral Protease L(BIOCAT) 66mg을 사용했으며, 이는 초기 곡물 중량의 0.033%이다. 표 6에 제시된 바와 같이, 테스트 샘플 슬러리는 가끔 교반하면서 다른 온도에서 다른 시간 동안 인큐베이션했다.
실시예 3은 섬유성 슬러리에 NEUTB를 첨가하면 다양한 온도, Neutral Protease L의 양 및 인큐베이션 시간을 포함한 모든 다른 테스트 조건에 걸쳐 수율을 유의미하게 증가시켰음을 보여주었다. 이전에 관찰된 바와 같이, 섬유성 슬러리의 점도는 4.4 내지 10℃ 사이의 온도에서 인큐베이션 수 분 이내에 빠르고 유의미하게 감소했다. 섬유성 슬러리를 가열해도 점도는 증가하지 않았으며, 섬유성 슬러리로부터 여과를 통해 2차 밀크가 쉽게 분리되었다. 테스트 샘플 3(66mg NEUTB, 10℃, 60분)으로부터의 섬유 슬러리는 가장 건조했고 점액성 질감이 가장 적은 것으로 관찰되었다.
NEUTB는 상이한 효소 농도, 온도 및 인큐베이션 시간에서 섬유성 슬러리의 점도를 감소시키는 데 효과적이었다. 매우 낮은 인큐베이션 온도(4.4℃) 및 짧은 인큐베이션 시간(10분)으로부터의 수율 증가는 대조군 샘플보다 유의미하게 높았다.
실시예 3에 따르면, 표 7의 테스트 4 레인에서 나타나는 바와 같이, 10℃에서 10분 동안 Neutral Protease L 처리를 활용하는 본 개시내용의 공정은 표 6에 제시된 귀리 곡물에서 총 고형분의 대략 7 내지 8% 수율을 증가시켰다. 10℃에서 1시간 동안 본 개시내용의 공정은 총 고형분의 대략 9 내지 10%의 수율 증가를 제공했다.
실시예 4
표 8에 제시된 바와 같이, 효소 활성 pH 미만 및 저온(10℃)에서 NEUTB 처리된 섬유성 슬러리로부터의 수율을 테스트했다. NEUTB에서 프로테아제 활성 이외의 활성이 수율에 대한 본 개시내용의 효과에 연루될 수 있는지를 추가로 조사하기 위해, 공정을 대략 4.96 내지 5.3의 pH에서 수행했다. 이 테스트의 결과는 표 8에 제시된다. 효소 공급업체인 BIOCAT(도 3에 도시됨)이 제공한 공개된 효소 활성 곡선을 고려하면, pH 4.5에서 NEUTB는 비활성이거나 최소 활성일 것으로 예상된다. 표 7에 제시된 낮은 pH와 저온의 조합은 본질적으로 NEUTB를 비활성화해야 한다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 대조군 섬유성 슬러리에 α-아밀라아제를 첨가한 반면, 테스트 샘플에는 Neutral Protease L(NEUTB)을 첨가했다.
인큐베이션 완료 후 테스트 샘플 2의 pH는 5.3이었다. NEUTB 함유 슬러리(테스트 1 및 테스트 2)는 첨가 몇 분 후에 유의미한 점도 감소를 보여주었다. pH가 조정되지 않은 NEUTB 샘플(테스트 1)의 점도 감소는 pH 조정된 샘플(테스트 샘플 2)보다 더 빨랐다. 그러나 알파 아밀라아제 첨가 샘플(대조군)에서는 점도 감소가 관찰되지 않았다. 또한, NEUTB 처리된 샘플(테스트 1 및 테스트 2)은 인큐베이션 동안 섬유의 분리 및 침전을 보여주었다(상단에 밀크의 분리를 보여줌). NEUTB 처리된 섬유성 슬러리에서, 슬러리는 덜 균질해졌고, 상부 층은 더 하얗고 하부 층은 더 어두웠다. 반면 알파 아밀라아제 처리된 섬유성 슬러리는 균질성 및 균일한 색상을 유지했다. 이 효과는 생성물을 분리하는 데 기계적 힘이 거의 필요 없기 때문에 NEUTB 처리된 생성물의 여과 용이성과 상관관련이 있다; 중력만으로도 생성물을 여과하기에 충분할 수 있다. 일부 실시형태, 특히 상업적인 실시형태에서, 여과는 연속적인 기계적 체에 의해 수행될 수 있다. 본 개시내용에 따른 NEUTB 처리를 사용하면, 섬유성 슬러리를 여과하기 위해 더 적은 시간과 에너지가 체에 필요할 수 있거나, 일부 경우에는 연속 기계적 체가 필요하지 않을 수 있다.
실시예 4는 프로테아제 활성을 방지하거나 심각하게 저해할 것으로 생각되는 pH 및 온도 조건에서도 영양소 추출이 높다는 것을 보여준다. 아밀라아제 대조군 샘플의 수율은 섬유성 슬러리의 총 고형분의 40.36%였다. NEUTB 처리된 샘플로부터의 수율은 테스트 샘플 1과 2 각각에서 섬유성 슬러리의 52.88%와 49.81%였다.
실시예 5
표 9는 효소 활성 pH 미만 및 저온(10℃)에서 NEUTB 처리된 섬유성 슬러리로부터의 착유 귀리 회수를 보여준다. NEUTB에서 프로테아제 활성 이외의 활성이 관찰된 수율 증가에 연루될 수 있는지를 추가로 조사하기 위해 본 공정은 대략 pH 4.5에서 수행했다. 도 3에 도시된 바와 같이 pH 4.5에서, 중성 프로테아제는 비활성이거나 최소 활성일 것으로 예상된다. 낮은 pH와 저온의 조합은 이론적으로 중성 프로테아제를 비활성화해야 한다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 표 8에서 밀크 수율 %는 2차 밀크와 1차 밀크를 합친 것이 아니라 2차 밀크에 포함된 섬유성 슬러리의 총 고형분의 백분율로서 계산했다.
NEUTB 첨가된 슬러리는 프로테아제 첨가 후 몇 분 후에 유의미한 점도 감소를 보여주었다: 공정 동안의 육안 관찰에 기초하여 테스트 1의 경우 2분, 테스트 2의 경우 3분, 테스트 3의 경우 5분. 중성 프로테아제로 처리된 귀리 섬유성 슬러리에서 유의미한 점도 감소는 2℃의 저온에서 잔류물에 효소를 첨가한 후 5분 이내에 발생했다는 관찰이 질감 분석기를 사용한 이후 실시예에서 검증되었다. 중성의 조정되지 않은 NEUTB 샘플의 점도 감소는 pH 조정된 샘플에서보다 더 빨랐다. 알파-아밀라아제 대조군 샘플에서는 점도 감소가 관찰되지 않았다. 염기성 pH 샘플의 점도는 매우 느린 점도 감소를 보였지만, 분해가 끝날 무렵에 점도가 빠르게 떨어졌다. 테스트 샘플 3의 점도의 급감은 인큐베이션 동안 pH가 10 아래로 이동하는 것과 관련이 있을 수 있다.
표 7 및 표 8의 산성 pH 조정된 샘플은 수율 증가의 차이를 보였고, 여기서 수율 증가는 표 8의 조건에 대해 41.4%와 비교하여 표 7의 조건에 대해 49.81%였다. 이러한 차이는 분해 동안 미소한 pH 변화와 관련이 있을 수 있다. 표 7에 제시된 실험의 경우, 낮은 pH 섬유성 슬러리의 pH는 인큐베이션 기간의 시작 시 5.0 미만(4.96)에서 인큐베이션 기간의 종료 시 5.0보다 약간 높았다(5.3; 데이터는 미제시); 반면, 표 8의 실험의 pH는 섬유성 슬러리의 효소 분해 전체에 걸쳐 5.0 미만(4.62 내지 4.99)으로 유지되었다.
NEUTB는 도 2에 도시된 바와 같이 10℃에서 최소 활성일 것으로 예상되고, 도 3에 도시된 바와 같이, 중성 프로테아제는 pH<5.0에서 실질적으로 비활성일 것으로 예상된다. 따라서, 추출을 유발하고 이에 상응하는 영양소 수율을 증가시키는 상당한 비정형의 프로테아제 활성이 있음이 가정될 수 있다. 이러한 비정형적 활성은 프로테아제 활성을 통해 큰 단백질 분자를 더 작은 분자로 가수분해하는 것 이외의 수단을 통한 세포 구조의 파괴를 수반할 수 있다.
표 7에 나타낸 바와 같은 낮은 pH 처리의 일부에서 그랬던 것처럼, pH가 5.0을 초과하면, 낮은 pH 섬유성 슬러리 샘플에서 단백질분해는 활성화거나 더 활성화되어 추정되는 비단백질분해 활성과 잠재적인 상승 효과를 생성할 수 있다. 상승 효과는 표 7에 제시된 바와 같이 NEUTB의 추정상의 비단백질분해 활성으로 인한 수율 증가에 추가로 관찰되는 수율 증가를 설명할 수 있다. NEUTB를 사용하여 낮은 pH 및 저온에서 관찰되는 비단백질분해 활성은 이론적으로 중성 프로테아제의 알려진 활성인 플라스테인 활성과 같은 제2 효소 활성과 관련이 있을 수 있다. 제2 활성과 조합하여, 프로테아제의 단백질분해 활성은 프로테아제 및 비프로테아제 활성 사이의 잠재적인 상승 효과의 결과로서 수율을 상승적으로 증가시킬 수 있다.
표 8의 저온, 낮은 pH 실험 데이터는 5.0 미만의 pH 및 10℃에서의 수율 증가가 공정이 최적 pH에서 수행되었을 때의 수율 증가의 약 80%였음을 보여주었다. 따라서, 낮은 프로테아제 활성(10℃)과 추정상의 무시할 수 있는 프로테아제 활성(10℃, pH < 5) 사이의 조건 간의 차이는 약 20%였다. 이 결과는 수율 증가의 큰 부분이 비단백질분해 효소 활성과 관련이 있을 수 있음을 시사한다.
중성 프로테아제는 10℃에서 고도로 활성인 플라스테인 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며(Xu 등 2014), Dermiki 및 Fitzgerald(2020)는 플라스테인 합성에 일반적으로 3.0 내지 7.0 범위의 pH가 필요하다고 보고한다. 이론에 얽매이지 않고 플라스테인 반응은 10℃ 및 pH 약 4.8에서 효율적인 추출에 대한 가능한 설명이다. 플라스테인은 단백질 분자를 응집시키는 것으로 알려져 있기 때문에 플라스테인 활성은 단백질을 끌어당겨 섬유성 물질로부터 단백질이 분리되도록 할 수 있다.
NEUTB 또는 Neutrase®의 다른 알려지지 않았거나 식별되지 않은 활성도 관찰된 수율 증가에 연루될 수 있다. 예를 들어, 기질은 반응이 베타 글루칸이나 세포벽의 다른 섬유성 분자와 같은 단백질-섬유 상호작용을 수반할 수 있도록, 관찰된 효과에서 중요한 요인일 수 있다. 메커니즘에 관계없이, 테스트된 조건 및 이러한 조건에서 알려진 NEUTB의 활성을 고려할 때 준최적의 조건에서 섬유성 슬러리의 수율 증가 수준은 예상치 못한 놀라운 것이다.
실시예 6
실시예 6은 고온 및 저온에서 섬유성 슬러리의 프로테아제 추출을 보여준다. 이러한 온도 조건은 도 4의 SDS-PAGE 겔에 표시된 샘플이 처리된 조건에 상응하는 것으로서, 표 10에 제시된 바와 같다. SDS-PAGE 겔의 테스트 레인은 프로테아제 처리 후 섬유성 슬러리 단백질의 단백질 크기를 나타낸다. 도 4 및 도 5의 SDS-PAGE 겔은 섬유성 슬러리로부터의 단백질의 가수분해도뿐만 아니라, 프로테아제 추출에 대한 작용 메커니즘의 약간의 이해를 보여준다.
실시예 6의 경우, 섬유성 슬러리는 이전에 설명한 바와 같이 제조했다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 대조군 레인에는 섬유성 슬러리에 효소를 첨가하지 않았다. 테스트 샘플 1은 첨가된 프로테아제가 고온에서 분해, 조리되지 않은 슬러리를 함유했다. 테스트 샘플 2는 첨가된 프로테아제가 저온에서 분해된, 조리되지 않은 슬러리를 함유했다. 테스트 샘플 3은 프로테아제 첨가 전 조리된 슬러리를 함유하며 고온에서 분해되었다. 가수분해도는 이전에 설명한 대로 결정되었다. 수율 증가는 2차 밀크만의 총 고형분에 기초하여 계산했다.
프로테아제 처리된 섬유성 슬러리의 가수분해도가 관찰된 수율 증가와 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해, 프로테아제 처리된 슬러리에 대한 수율 증가 수준을 고온(57℃), 저온(10℃) 및 섬유성 슬러리가 이전에 비등처리된 적이 있는 고온(55℃)에서 측정했다. 그런 다음 이러한 조건을 SDS-PAGE 분석을 위해 반복했다.
표 10과 관련하여, 귀리 섬유성 슬러리 샘플은 NEUTB(BIO-CAT)로 분해했다. 섬유성 슬러리로부터의 영양소 수율을 측정했다. 저온(10℃)에서 프로테아제 분해에 대한 수율 증가는 고온(57℃)에서의 수율 증가 및 샘플이 1차 비등처리된 경우인 조리된 고온(비등처리 후 57℃)에서의 수율 증가와 유사했다. 결과는 저온 및 낮은 가수분해도에서 놀라울 정도로 높은 프로테아제 추출을 보여준다.
세척 횟수는 아밀라아제 처리 시의 수율과 관련이 있다. 2회 세척으로부터의 추출은 세척/분쇄 과정만으로도 일부 영양소를 추출할 것이기 때문에 아밀라아제 처리 대조군에 의한 수율 증가를 나타낼 것이다. 3회 세척 후에는 세척만으로는 아무것도 제거되지 않을 것이다. 2회 세척한 생성물은 1차 밀크로 들어갈 것이다. 3차 세척은 추출 측면에서 어떤 결과도 생산하지 않을 것이다. 따라서, 본 개시내용의 공정에서, 프로테아제 추출을 위해 분리된 섬유성 슬러리는 2차 세척 후 남은 것이다. 표 9의 대조군 레인에 제시된 것은 3차 세척에서 물로 추출된 것이다.
SDS-PAGE 겔 전기영동은 도 4에 제시된 바와 같이 섬유성 슬러리 내 단백질의 크기에 대한 프로테아제 처리 효과를 보여주기 위해 수행했다. 레인 #812는 조리된 샘플을 함유하며, 마이크로웨이브에서 비등처리되고 NEUTB로 처리된 섬유성 슬러리로부터의 단백질을 보여준다. 레인 #752는 프로테아제로 처리되지 않은 섬유성 슬러리로부터의 단백질을 보여주는 대조군 샘플이다. 레인 #243은 더 높은(최적) 온도에서 프로테아제로 처리된 섬유성 슬러리로부터의 단백질을 보여주며, NEUTB에 대한 최적 온도는 2시간 동안 57℃이다. 레인 #277은 저온, 10℃에서 1시간 동안 프로테아제로 처리된 단백질을 보여준다.
레인 #812의 조리된 샘플 대조군은 높은 프로테아제 가수분해도를 보여주었다. 대조군 레인 #752는 프로테아제에 의해 처리되지 않은 섬유성 슬러리의 온전한 단백질을 보여주었다. 주요 밴드는 35kDA와 22kDa에 존재하며, 이 둘 사이에 소(minor) 밴드가 존재한다. 섬유성 귀리 슬러리로부터 조리 및 프로테아제 처리된 단백질을 보여주는 레인 #812는 높은 가수분해도(DH)를 보여주었고, 35kDA의 큰 밴드는 프로테아제에 의해 완전히 가수분해되고, 아마도 35 kDa 밴드의 가수분해 생성물을 나타내는 14kDa 및 12kDa에서 밴드 강도가 증가했고, 0 내지 12kDa 사이의 가수분해 생성물을 증가시켰다.
레인 #243에 표시된 2시간 동안 57℃의 더 높은 반응 온도 조건은 대조군과 비교했을 때 35 kDa 밴드의 유의미한 가수분해를 보여주었다. 아마도 35kDa 밴드의 가수분해 생성물을 나타내는 14kDa 및 12kDa에서 밴드의 약간의 증가도 관찰되었다. 최적의 온도에서 프로테아제 가수분해에 대해 35kDa 밴드의 강도 감소가 예상된다. 더 높은 온도의 프로테아제 분해는 0 내지 12kDa 사이에서 분해 산물의 약간 증가를 초래했다.
저온 프로테아제 처리는 레인 #277에 표시된다. 이 샘플은 최적의 프로테아제 조건에서 처리한 것과 유사한 높은 수준의 영양소 수율 증가를 보여주었다. 그러나, 고온 처리된 섬유성 슬러리(#243)와 대조적으로, 저온 처리된 섬유성 슬러리(#277)는 #243 샘플의 관능적 특성에 부정적인 영향을 미치지 않았으며, 미생물 성장 또는 단백질 변성을 야기할 수 있는 조건으로 처리되지 않았고, 대조군 레인 #752에 비해 유의미한 가수분해의 증거를 보이지 않았다. 요약하면, #277 샘플은 놀랍게도 매우 낮은 DH를 보여주었지만, 수율은 유의미한 정도로 증가했는데, 낮은 DH는 긍정적인 관능적 및 맛 품질에 기여할 가능성이 높다.
실시예 7
표 11은 10℃ 이하에서 NEUTB 처리된 섬유성 슬러리로부터 얻은 귀리 밀크에 포함된 총 식이섬유 및 베타-글루칸의 양을 보여준다. 표 6에 개시된 조합 샘플을 사용하여 섬유성 슬러리로부터 회수된 베타 글루칸의 양을 결정했다.
실시예 7에서는 베타 글루칸 함량 분석에 충분한 물질을 제공하기 위해 10℃ 이하에서 상이한 인큐베이션 시간 동안 Neutral Protease L(NEUTB)로 처리된 섬유성 슬러리의 다중 테스트 샘플을 조합했다. 베타 글루칸 함량 분석은 Medallion Labs(미국 미네소타주 미네아폴리스)에서 수행했다. 대조군 샘플은 효소를 첨가하지 않고 기계적 공정만으로 처리했다. 테스트 샘플에는 다양한 인큐베이션 시간 동안 10℃ 이하에서 Neutral Protease L(NEUTB)로 처리된 섬유성 슬러리가 포함되었다. 백분율 계산은 건조 물질을 기반으로 이루어졌다. 초기에 1차 밀크는 대략 1%의 베타 글루칸을 갖고, 0.6%는 섬유성 슬러리의 다수 세척에 의해 첨가될 수 있다. 그러나, 섬유성 슬러리의 프로테아제 처리는 표 11에서 조합된 1차 및 2차 밀크 데이터에서 보여지는 바와 같이, 베타 글루칸을 두 배 넘게 증가시킬 수 있다.
실시예 8
실시예 8은 2℃에서 Neutral Protease L(NEUTB) 처리된 섬유성 슬러리로부터의 2차 귀리 밀크의 대략적인 조성 및 수율에 관한 것이다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 대조군 샘플에는 효소 첨가가 포함되지 않았다. NEUTB 샘플에는 2℃에서 120분 동안 NEUTB로 처리된 섬유성 슬러리가 함유되었다. 테스트 잔류물에 대한 효소 비활성화는 원유를 수조에서 77℃로 7분간 가열한 후 마이크로웨이브에서 비등 가열하여 수행했다. 측정은 건조 물질 기준으로 이루어졌다. 총 밀크 수율은 1차 밀크와 2차 밀크의 조합으로 측정되었다. 2차 밀크는 잠재적으로 1차 귀리 밀크보다 전분 함량이 최대 35% 이하일 것으로 예측되며, 이는 탄수화물이 낮거나 감소된 식물 기반 밀크에 유리할 수 있다.
10℃에서 2시간 동안 NEUTB를 처리하여 개별 영양소의 수율 증가를 측정하기 위해 설계된 별도의 예비 실험에서 총 수율의 증가에 대한 명세는 단백질 대략 10%, 지방 15%, 회분 9%였고, 섬유 측정은 추가 테스트를 필요로 했다. 2차 밀크는 1차 밀크보다 더욱 귀리 같은 것으로서 기술되는 양호한 맛, 및 양호한 질감을 가졌다. 섬유성 슬러리에 존재하는 다량의 베타 글루칸은 2차 밀크로 추출되어 2차 밀크 풀바디에 기여할 가능성이 있다. 본 개시내용의 공정에 의해 생성된 2차 밀크는 높은 단백질 가수분해도와 연관된 쓴맛을 갖지 않았다. 1차 밀크에 2차 밀크의 첨가는 1차 밀크의 전체적인 맛이나 질감을 손상시키지 않았다.
실시예 9
실시예 9는 상이한 프로테아제로 처리된 섬유성 슬러리로부터의 수율, 밀크 품질 및 단백질 가수분해도(DH)를 개시한다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 중량%는 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 수율은 1차 및 2차 귀리 밀크를 합한 양으로부터 결정했다. 수율은 건조 물질 기준으로 측정했다. 1차 밀크에 대한 효소 비활성화는 수조에서 77℃까지 15 내지 20분 동안 가열한 후, 마이크로웨이브에서 비등 가열하여 수행했다. 2차 밀크를 생산하기 위한 섬유성 슬러리에서의 효소 비활성화는 이전에 설명한 스팀 방법을 사용하여 수행했다. 거품 품질, 관능적 품질 및 DH는 이전에 설명한 대로 결정했다.
표 13의 데이터는 본 개시내용에 따른 프로테아제 분해된 귀리 섬유성 슬러리 샘플의 SDS-PAGE를 보여주는 도 5A 및 도 5B의 데이터로부터 취한 것이다. 대조군에 상대적인 수율 증가는 본 개시내용에 따라 저온에서 NEUTB로 처리된 섬유성 슬러리에서 가장 높았고, 그 다음은 트립신으로 처리된 섬유성 슬러리에서 높았다. 프로테아제인 파파인과 알칼리성 프로테아제는 실질적으로 더 낮은 수율 증가를 보여주었다. 아밀라아제는 가장 낮은 수율 증가를 보였다. 다른 실험 데이터는 점도 및 수율 증가에 대한 NEUTB의 효과가 Neutrase®와 유사하다(데이터는 표시되지 않음)는 것을 보여주었다.
테스트된 프로테아제 중 DH는 NEUTB 및 트립신에 대해 가장 낮았으며, 여기서 이전에 설명한 대로 계산된 DH는 대략 2%였다. 파파인의 DH는 NEUTB 및 트립신보다 대략 4배 더 컸고, 알칼리성 프로테아제의 DH는 NEUTB 및 트립신보다 대략 3배 더 컸다.
결과는 DH가 수율 증가와 상관관계가 없으며, NPL과 트립신은 가수분해도가 훨씬 낮아도, 더 큰 수율 증가를 유발한다는 것을 보여준다. 이 결과는 일반적으로 단백질 또는 다른 유기 분자의 가수분해가 점도의 더 큰 감소를 야기한다고 생각되기 때문에, 예상치 못한 것이었다. 낮은 분자량은 일반적으로 낮은 점도 용액과 상관관계가 있다. 단백질 분해를 최소화하면서 섬유성 슬러리로부터 수율 증가를 최대화하는 것은 단백질 기능적 특성을 유지하고 관능적 특성의 변화를 최소화하므로 본 개시내용에 중대한 것이다. 테스트된 모든 프로테아제 중에서 본원에 개시된 중성 프로테아제 및 트립신은 이러한 측면에서 본 개시내용의 요건을 충족시키는 유일한 2가지였다.
실시예 10
실시예 10은 귀리 섬유성 슬러리의 점도에 대한 매우 다양한 프로테아제의 효과를 개시한다. 점도 감소는 섬유상 슬러리의 가공을 허용한다는 데에 있어서 주요 요인이다. 표 14는 2℃에서 다양한 효소로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 바와 같이 제조했다. 질감 분석은 효소 처리 후 섬유성 슬러리의 점도 변화를 측정하는 데 사용되었다. 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다. 질감 분석은 점도 변화를 측정하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 질감 분석기가 시간 경과에 따른 반응의 압축력 변화를 측정한다. 질감 분석기로 측정된 바와 같이 시간 경과에 따른 압축력 감소는 시간 경과에 따른 점도 감소와 관련이 있다.
이전에 개시된 바와 같이 질감 분석을 위한 섬유성 슬러리의 제조 후 초기 점도는 1.0으로 설정된다. 효소를 첨가한 후 질감 분석기는 효소 활성이 발생함에 따라 샘플에 가해지는 압축력을 지속적으로 측정한다. 표 14의 최종 측정값은 특정 시점, 여기서는 10분에서의 점도 감소량을 보여준다.
표 14는 본원에서 테스트된 중성 프로테아제인 NEUTB 및 Neutrase®가 2℃에서 귀리 섬유성 슬러리의 점도를 감소시키는 데 가장 효과적이라는 것을 보여준다. 트립신은 더 적은 정도이지만 섬유성 슬러리의 점도를 실질적으로 감소시키는 데에도 효과적이다. 진균 프로테아제 FGPTA2 및 FGPTHU는 점도를 더 적은 정도로 감소시킨다. 진균 프로테아제는 효소의 복합 혼합물이고, 본 개시내용의 중성 프로테아제 및 트립신을 다른 효소와 함께 포함할 수 있다.
일반적으로, 테스트된 다른 모든 프로테아제 또는 효소는 NPL, Neutrase® 및 트립신에 비해 점도 감소 수준이 낮았다. 표 14의 중성 프로테아제 및 트립신 이외의 효소에 의해 유발된 더 낮은 점도 감소 수준은 본 개시내용의 목적에 만족스럽지 못했다. 점도 감소가 일반적으로 섬유성 슬러리로부터의 수율 증가와 상관관계가 있다는 점을 고려할 때, 중성 프로테아제 및 트립신은 본 개시내용의 목적에 효과적인 것으로 결정된 반면, 다른 프로테아제는 실질적으로 효과적이지 않았다.
실시예 11
실시예 11은 2℃에서 상이한 효소 농도의 Neutral Protease L(NEUTB)로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 개시한다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 효소 농도는 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 점도 감소를 측정하기 위한 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다.
NPL의 매우 낮은 농도에서도 실질적인 점도 감소가 분명했다. 이는 극히 낮은 수준의 NPL 또는 Neutrase®이 본 개시내용의 따른 섬유성 슬러리로부터 수율 증가를 달성하기에 충분하다는 것을 나타낸다.
실시예 12
실시예 12는 2℃에서 상이한 효소 농도의 미생물 트립신(TRY1)으로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 개시한다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 효소 농도는 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 점도 감소를 측정하기 위한 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다.
실질적인 점도 감소는 특히 매우 낮은 농도의 트립신에서도 분명했지만, NPL과 비교할 때, 트립신의 점도 감소는 농도 의존성이 더 큰 것으로 나타난다. 일반적으로, 이들 결과는 낮은 수준의 트립신이 본 개시내용에 따른 섬유성 슬러리로부터 수율 증가를 달성하기에 충분하다는 것을 나타낸다.
실시예 13
실시예 13은 2℃에서 효소 첨가 없이 다양한 pH에서의 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 효소는 첨가하지 않았다. pH는 무수 구연산과 50% KOH 용액을 사용하여 조정했다. 점도 감소를 측정하기 위한 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다.
질감 분석 전에 용액의 pH를 조정했다. 중성 또는 조정되지 않은 pH도 테스트되었다. 기계적 중단으로 인한 것일 수 있는 pH의 초기 작은 저하 후에, 모든 샘플은 점차적으로 1.0 쪽으로 증가했다. 산성 pH에서 10분 후 섬유성 슬러리의 점도는 실질적으로 변하지 않았다. 염기성 pH에서 10분 후 섬유성 슬러리의 점도는 대략 10% 감소했다. 이러한 결과에 따르면 pH는 테스트된 수준에서 점도에 큰 영향을 미치지는 않는다.
실시예 14
실시예 14는 귀리 섬유성 슬러리에서 점도를 감소시키는 NEUTB의 능력에 대한 pH의 영향을 보여준다. Neutral Protease L(NEUTB)로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화는 2℃에서 다양한 pH에서 측정했다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. pH는 무수 구연산과 50% KOH 용액을 사용하여 조정했다. 점도 감소를 측정하기 위한 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다. 표 18은 산 또는 염기를 첨가한 후, 및 0.05% 효소 첨가 전의 섬유성 슬러리의 pH를 보여준다.
실시예 15
실시예 15는 귀리 섬유성 슬러리의 점도를 감소시키는 미생물 트립신(TRY1)의 능력에 대한 pH의 영향을 보여준다. 미생물 트립신(TRY1)으로 처리된 귀리 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화는 2℃에서 다양한 pH에서 측정했다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. pH는 무수 구연산과 50% KOH 용액을 사용하여 조정했다. 점도 감소를 측정하기 위한 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다. 표 18은 산 또는 염기를 첨가한 후, 및 효소 첨가 전의 섬유성 슬러리의 pH를 보여준다.
실시예 16
실시예 16은 본 개시내용에 따라 2℃에서 Neutral Protease L(NEUTB) 또는 미생물 트립신(TRY1)으로 처리했을 때 다양한 기질을 갖는 섬유성 슬러리의 상대 점도 변화를 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. pH는 무수 구연산과 50% KOH 용액을 사용하여 조정했다. 점도 감소를 측정하기 위한 질감 분석은 이전에 설명한 대로 수행했다.
닭 껍질 테스트는 2℃, 49℃ 및 60℃에서 수행했다. 닭 껍질 점도 분석과 관련하여, 닭 껍질은 이하에 기재된 바와 같이 테스트했다. 닭 껍질 질감 분석의 경우, 신선한 닭 허벅지 사등분 부위에서 껍질을 근육으로부터 떼어내어 껍질을 수득했다. 껍질은 약 2배의 빙수(중량 기준)로 세척하고, 대형 냉각실(1.7℃)에서 날카로운 칼과 도마를 사용하여 대략 5x5mm 크기로 썰어서 잘랐다.
잘게 썬 껍질에 껍질 양의 2X 또는 3X 양의 얼음 + 냉증류수를 넣어 최종 고형분 함량을 대략 10%로 만들었다. 그런 다음, 혼합물을 Vita-Mix TurboBlend 4500을 사용하여 2분 동안 고속(10/10 설정)으로 블렌딩했다. 고농도 슬러리는 잘게 썬 껍질에 2X 빙수가 첨가되고 블렌딩된 닭의 경우에, 대략 15% 고형분을 가졌다. 고형분 농도가 낮은 경우에는 3X 빙수가 첨가되었고, 질감 분석을 위한 슬러리는 각각 대략 10% 고형분을 가졌다.
닭 껍질 테스트는 NEUTB에 대한 BIOCAT 제품 정보 시트가 다른 용도 중에서도 생선 및 닭고기 부산물의 점도 감소를 위해 뉴트라제의 사용을 제안하기 때문에 닭 껍질 테스트를 부분적으로 수행했다. 제품 정보 시트는 또한 NEUTB의 사용에 최적인 활성 조건에 대한 정보를 제공하며, 이는 55℃ 및 pH 6.5라고 열거되어 있다. BIOCAT에 의해 열거된 최적 온도는 본 개시내용에 사용된 온도보다 훨씬 높아서, 본 개시내용에 사용된 낮은 준최적의 온도가 BIOCAT 제품 정보 시트에서 제안하는 기질 중 하나인 닭 껍질을 사용하여 테스트했다. 표 20에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 범위 내의 온도(2℃)에서는 NEUTB(NEUTB)에 의한 점도 감소가 관찰되지 않았다.
닭 껍질 점도 측정을 위해, 닭 껍질 슬러리를 대형 냉장실에서 30분 동안 그대로 보관했고, 곡물 및 견과류의 질감 변화 측정 시와 동일한 매개변수를 적용하여 닭 껍질의 점도 변화를 측정했다. 2℃ 질감 분석 외에도 닭 껍질 슬러리는 효소 첨가 및 질감 분석 전에 49℃ 및 60℃로 가온했다. 질감 변화 분석 동안, 닭 껍질 슬러리의 온도는 질감 분석 전반에 걸쳐 질감 분석 컵을 냉빙수조, 온수 또는 열수조에 두어 초기 온도와 동일하게 유지했다.
표 20에 제시된 전반적인 데이터와 관련하여, 표 2 내지 4의 수율 데이터 및 표 20의 점도 감소는 질감 분석에서 밀크 수율 증가와 점도 감소 사이에 밀접한 관계(상관관계)가 있음을 보여주었다. 귀리 섬유성 슬러리의 경우, 점도 감소가 높았고, 이로써 본 개시내용의 공정으로부터 귀리 밀크의 수율 증가가 높았다; 반면 아몬드와 병아리콩의 점도 감소는 귀리만큼 높지 않았고, 마찬가지로 밀크 수율 증가도 낮았다. 따라서, 질감 분석기의 점도 감소는 식물 기반 밀크 수율 증가를 예측하는 데 유용하다. 표 20의 데이터에 기초하면, 본 개시내용에 따른 프로테아제 처리에 의해 유발된 점도 감소가 기질 물질 중 베타 글루칸의 존재와 상승작용적인 것으로 나타난다. 본 개시내용은 주로 저온 프로테아제 처리 공정으로서 설명되었지만, 일부 실시형태에서 이 공정은 또한 베타 글루칸을 함유하는 밀링된 곡류 곡물로부터 영양소를 추출하기 위해 더 높은 온도에서 적용될 수도 있다.
본 개시내용에서 테스트된 베타 글루칸-함유 기질인 귀리 및 보리는 심지어 대두와 같은 비-베타 글루칸 함유 기질의 출발 점도가 귀리 및 보리의 출발 점도와 유사한 경우에도 점도의 훨씬 더 큰 감소를 보여주었다. 표 20에 제시된 바와 같이, 보리의 경우, NEUTB(0.67) 및 트립신 처리(0.74)와 비교하여 10분째 대조군(0.90)의 상대 점도 감소가 나타났다.
실시예 17
실시예 17은 2℃에서 22분 동안 조리되지 않은 귀리 섬유성 슬러리에 대해 센티푸아즈(cPs) 단위로 측정된 점도 변화를 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 점도는 이전에 기술된 대로 점도계로 측정했다. 본 명세서에서 사용된 "전(Pre)"은 효소 첨가 전을 지칭하고, "후(Post)"는 효소 처리 완료 후를 지칭한다.
pH는 효소 처리 전과 후에 본질적으로 변하지 않았다. NPL 및 트립신은 유사한 점도 감소를 보였지만, NPL은 트립신보다 더 큰 점도 감소를 보였다.
실시예 18
실시예 18은 알파 아밀라아제와 함께 트립신 및 NPL로 2℃에서 2시간 동안 처리하고 효소를 더 느리게(비-증기) 불활성화한 경우, 섬유성 슬러리로부터 얻은 2차 귀리 밀크의 점도 및 디른 특성을 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 점도는 이전에 설명한 대로 점도계로 측정했다. 관능적 특성은 이전에 설명한 대로 평가했다. 이전에 설명한 대로 효소를 불활성화시키기 위해, 샘플을 열수조에서 최대 77℃까지 7분 동안 가열하고, 마이크로웨이브에서 2분 미만 동안 비등할 때까지 추가로 가열했다. 샘플 농도는 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 체질은 5점 척도를 사용하여 평가했다: (1) 체질하기가 매우 용이함, (3) 체질하기가 용이하거나 어렵지도 않음, 및 (5) 체질하기가 매우 어렵거나 불가능함. 실시예 18, 20 및 21의 샘플에서, 샘플 조합으로부터의 밀크를 합하여, 오븐 건조했고, β-글루칸은 Medallion labs에서 결정되었다.
실시예 19
실시예 19는 알파-아밀라아제와 함께 여러 효소로 2℃에서 2시간 동안 처리하고 효소를 느리게(비-증기) 열 불활성화한, 섬유성 슬러리로부터의 2차 귀리 밀크의 특성에 관한 것이다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 점도는 이전에 설명한 대로 점도계로 측정했다. 관능적 특성은 이전에 설명한 대로 평가했다. 이전에 설명한 대로 효소를 불활성화하기 위해 샘플을 열수조에서 최대 77℃로 7분 동안 가열하고, 마이크로웨이브에서 2분 미만 동안 비등할 때까지 추가로 가열했다. 샘플 농도는 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 체질은 5점 척도를 사용하여 평가했다: (1) 체질하기가 매우 용이함, (3) 체질하기가 용이하거나 어렵지도 않음, 및 (5) 체질하기가 매우 어렵거나 불가능함.
실시예 20
실시예 20은 α-아밀라아제 없이 여러 효소를 2℃에서 2시간 동안 이용하고 효소를 천천히(비-증기) 열 불활성화한, 2차 귀리 밀크 슬러리의 점도 및 기타 특성을 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 점도는 이전에 설명한 대로 점도계로 측정했다. Nuova Simonelli Appia II V GR1을 사용하여 슬러리에 증기를 직접 주입하여 샘플을 0.5분 후 80℃까지 가열했고, 이전에 설명한 대로 마이크로웨이브에서 1분 미만 동안 추가로 비등할 때까지 가열했다. 측정은 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 체질은 앞서 설명한 대로 5점 척도를 사용하여 평가했다: (1) 체질하기가 매우 용이함, (3) 체질하기가 용이하거나 어렵지도 않음, 및 (5) 체질하기가 매우 어렵거나 불가능함.
실시예 21
실시예 21은 2℃에서 2시간 동안 알파 아밀라아제 없이 트립신 및 NPL로 섬유성 슬러리를 처리한 2차 귀리 밀크의 점도 및 기타 특성에 대한 신속한(증기 처리된) 효소 불활성화의 효과를 보여준다.
섬유성 슬러리는 이전에 개시된 대로 제조했다. 점도는 이전에 설명한 대로 점도계로 측정했다. Nuova Simonelli Appia II V GR1을 사용하여 슬러리에 증기를 직접 주입하여 샘플을 0.5분 후 80℃까지 가열하고, 이전에 설명한 대로 마이크로웨이브에서 1분 미만 동안 추가로 비등할 때까지 가열했다. 측정은 초기 원료 중량을 기준으로 했다. 체질은 5점 척도를 사용하여 평가했다: (1) 체질하기가 매우 용이함, (3) 체질하기가 용이하거나 어렵지도 않음, 및 (5) 체질하기가 매우 어렵거나 불가능함.
실시예 22
실시예 22는 2℃에서 질감 분석을 위한 여러 재료의 미처리, 희석된 섬유성 슬러리에 대한 출발 점도, pH 및 고형분 함량을 보여준다. 증기 주입은 효소의 더 느린 열 불활성화에 비해 다소 우수한 제품을 제공했다. 표 25는 알파 아밀라아제의 부재 하에 NEUTB와 조합된 증기 불활성화(또는 신속한 불활성화)가 우수한 관능적 특성을 갖는 제품을 초래했고 체질하기가 더 쉽다는 것을 보여준다. 점도는 NEUTB에 의해 낮게 유지되었지만, 본 개시내용에서 달리 효과적인 트립신 프로테아제에 대해서는 그렇지 않았다. 본 개시내용에 따라 점도 및 수율을 감소시키는 데 있어서 메탈로프로테아제만큼 효과적이지는 않을지라도, 미생물 트립신은 효과적인 것으로 나타났지만, NEUTB 및 Neutrase®는 표 25에 제시된 바와 같이 일부 측면에서 더 효과적이었다.
섬유성 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 측정값은 평균 ± 표준 편차로 제시된다.
표 26의 데이터는 미처리된 섬유성 슬러리의 출발 농도를 보여준다. 이 데이터는 본 개시내용에서 제공된 다른 데이터에 대한 일반적인 참조로서 사용될 수 있다.
실시예 23
실시예 23은 2℃ 또는 50℃에서 상이한 효소로 처리된 10% 병아리콩 단백질 분리물 슬러리의 상대 점도 변화를 보여준다.
단백질 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 온도는 질감 분석 동안의 인큐베이션 온도이다. 효소 첨가 및 질감 분석 전의 초기 점도.
결과는 2℃에서 20분의 반응 시간 동안 귀리, 보리 및 기타 식물 재료의 점도 감소에 효과적인 본 개시내용의 중성 프로테아제 및 트립신이 10% 병아리콩 단백질 분리물 슬러리의 점도 감소에 어떠한 영향도 미치지 않았음을 보여준다. 50℃에서 NEUTB는 병아리콩 재료의 점도를 대략 25% 감소시켰다.
실시예 24
실시예 24는 2℃ 또는 50℃에서 상이한 효소로 처리된 21% 완두콩 단백질 분리물 슬러리의 상대 점도 변화를 개시한다.
단백질 슬러리는 이전에 설명한 대로 제조했다. 온도는 질감 분석 동안의 인큐베이션 온도이다. 효소 첨가 및 질감 분석 전의 초기 점도.
결과는 2℃에서 귀리, 보리 및 기타 식물 재료의 점도를 감소시키는 데 효과적인 본 개시내용의 중성 프로테아제 및 트립신이 완두콩 단백질 분리물 슬러리의 점도 감소에는 어떠한 영향도 미치지 않았음을 보여준다. 50℃에서 NEUTB는 20분 인큐베이션 후, 병아리콩 재료의 점도를 대략 8% 감소시켰다.
기타 실시형태
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 영역에 의해 정의되는 본 발명의 영역를 예시하기 위한 것이지 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다른 관점, 이점 및 수정은 다음 청구범위의 영역 내에 있다.

Claims (20)

  1. 방법으로서,
    식물 원료를 수성 습식 밀링하여 원료 슬러리를 생성하는 단계;
    상기 원료 슬러리를 체질하여 1차 밀크 및 섬유성 슬러리를 생성하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 밀링하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 메탈로엔도프로테아제 및 박테리아 트립신 및 진균 트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제로 처리하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 준최적의 프로테아제 활성 온도에서 상기 프로테아제로 처리하여, 처리된 섬유성 슬러리를 생성하는 단계; 및
    상기 처리된 섬유성 슬러리를 체질하여 2차 밀크 및 클린 섬유를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물 원료는 귀리 곡물 및 보리 곡물 중 적어도 하나인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 준최적의 활성 온도는 10℃ 미만이고, 상기 프로테아제로 처리하기 위한 인큐베이션 기간은 30분 미만인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 섬유성 슬러리를 준최적의 활성 pH에서 상기 프로테아제로 처리하여, 상기 처리된 섬유성 슬러리를 생성하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 처리된 섬유성 슬러리의 점도는 프로테아제 처리 인큐베이션 기간이 10분 미만일 때 상기 섬유성 슬러리의 점도보다 적어도 35% 더 낮은, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 분자량이 25kDa 미만인 펩타이드 양의 상대 증가가 5% 미만인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 분자량이 25kDa 미만인 펩타이드 양의 상대 증가가 2% 미만인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단백질 가수분해도가 미량인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 2차 밀크를 상기 1차 밀크와 조합하여 조합 밀크를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 2차 밀크 중 베타 글루칸의 농도는 건조 고체 기준으로 상기 1차 밀크 중 베타 글루칸 농도의 적어도 2배인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 조합 밀크가 건조 고체 기준으로 상기 식물 원료에 함유된 전체 베타 글루칸의 적어도 절반을 함유하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제는 Neutrase®, Neutral Protease L™, 바실러스 서브틸리스 유래의 메탈로엔도프로테아제 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 유래의 메탈로엔도프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 식물 원료로부터 식물 기반 밀크를 생산하는 동안 유의미한 미생물 성장이 방지되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 섬유성 슬러리를 상기 프로테아제로 처리하기 위한 인큐베이션 기간이 20분 미만인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 열 불활성화 동안 상당한 단백질 가수분해를 방지하기 위해 상기 섬유성 슬러리가 빠르게 가열되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 액화를 위한 추가 효소의 첨가 없이, 연장된 저장 수명 또는 무균 포장에 충분한 고온에서 상기 2차 밀크를 가공하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 프로테아제는 메탈로엔도프로테아제인, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제는 메탈로엔도프로테아제이고; 그리고
    상기 섬유성 슬러리는 직접 증기 처리 또는 간접 증기 처리에 의해 빠르게 가열되어 상기 메탈로엔도프로테아제를 열 비활성화시키고, 열 비활성화 동안 상당한 단백질 가수분해를 방지함으로써, 트립신-처리된 2차 밀크 및 더 느린 열 비활성화 방법을 사용하여 생성된 가공된 2차 밀크에 비해 증가된 체질 용이성 및 적어도 하나의 우수한 관능적 특성을 갖는 2차 밀크를 초래하는, 방법.
  18. 방법으로서,
    미가공 베타 글루칸 함유 곡류 곡물을 수성 습식 밀링하여 원료 슬러리를 생성하는 단계;
    상기 원료 슬러리를 체질하여 1차 밀크 및 섬유성 슬러리를 생성하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 밀링하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 메탈로엔도프로테아제 및 박테리아 트립신 및 진균 트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제로 처리하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 5℃ 미만의 온도에서 30분 미만의 인큐베이션 기간 동안 상기 프로테아제로 처리하여, 처리된 섬유성 슬러리를 생성하는 단계; 및
    상기 처리된 섬유성 슬러리를 체질하여 2차 밀크 및 클린 섬유를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 액화를 위한 추가 효소의 첨가 없이, 연장된 저장 수명 또는 무균 포장에 충분한 고온에서 상기 2차 밀크를 가공하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 프로테아제는 메탈로엔도프로테아제인, 방법.
  20. 방법으로서,
    미가공 베타 글루칸 함유 재료를 수성 습식 밀링하여 원료 슬러리를 생성하는 단계;
    상기 원료 슬러리를 체질하여 1차 액체 및 섬유성 슬러리를 생성하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 밀링하는 단계;
    상기 섬유성 슬러리를 메탈로엔도프로테아제 및 박테리아 트립신 및 진균 트립신으로 이루어진 군에서 선택되는 트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제로 처리하여, 처리된 섬유성 슬러리를 생성하고, 60분 미만의 인큐베이션 기간 동안 준최적의 프로테아제 활성 온도에서 인큐베이션하는 단계
    를 포함하되; 상기 처리된 섬유성 슬러리의 점도는 상기 섬유성 슬러리의 점도보다 적어도 30% 더 낮은, 방법.
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