KR20230142361A - 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 마커로서 ifi16 돌연변이 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 마커로서 ifi16 돌연변이 유전자 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 마커로서 IFI16((Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 NAFLD 및 NASH 환자 그룹을 대상으로 유전체 분석을 수행한 결과, rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940을 포함하는 IFI16 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)의 빈도가 증가하는 것을 확인하였고, 간질환 단계에 따라 IFI16 돌연변이 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 IFI16 SNV가 대식세포 유도 염증 과정에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였으며, IFI16 변이체가 야생형 IFI16보다 dsDNA에 더 강하게 결합하여 IFI16-PYCARD-CASP1 경로의 손상된 미토콘드리아 DNA 감지 반응 신호를 악화시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 IFI16 돌연변이 유전자는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측에 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 NAFLD 및 NASH 환자 그룹을 대상으로 유전체 분석을 수행한 결과, rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940을 포함하는 IFI16 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)의 빈도가 증가하는 것을 확인하였고, 간질환 단계에 따라 IFI16 돌연변이 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 IFI16 SNV가 대식세포 유도 염증 과정에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였으며, IFI16 변이체가 야생형 IFI16보다 dsDNA에 더 강하게 결합하여 IFI16-PYCARD-CASP1 경로의 손상된 미토콘드리아 DNA 감지 반응 신호를 악화시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 IFI16 돌연변이 유전자는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 마커로서 IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 IFI16 돌연변이 유전자를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물, 및 상기 바이오마커를 이용한 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트 및 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
만성 간질환으로 인한 국내의 사회경제적 부담은 2010년 기준 약 3조 7000억 원으로 가장 심각한 질환이다. 한국에서 발병빈도가 매우 높고 특히 40 ~ 50대의 경우 간암 및 간질환에 의한 사망률이 가장 높은 것으로 알려져 있다.
만성 간질환 중 하나인 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 단순한 지방증으로부터 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)에 이르는 범위의 진행성 간질환이다. 특히, 비-알코올성 지방간염(NASH)은 조직학적으로 알코올성 간염과 비슷한 지방산 축적, 간세포 손상 및 염증에 의해 특징화되는 간의 진행성 질환으로, 간 지방증으로부터 간경변증 및 간부전으로 확장되는 공정의 주요 단계이며, 최근 NASH의 발병이 최근 여러 해 동안 증가하고 있으며, NASH로 진행되는 환자는 간-관련된 유병율 및 사망률이 증가하고 있는 추세이다.
이런 NASH를 포함하는 만성 간질환의 활성, 단계 또는 중증도를 진단하기 위한 표준 방법으로 간생검(liver biopsy) 표본의 조직학적 검사를 사용하고 있으나, 간생검은 침습적 방법이라는 단점을 갖고 있다. 또한, 계속해서 증가하는 간 질환 환자들을 대상으로 모두 조직검사를 수행하는 것은 여러 가지 한계가 있고, 간생검은 통증, 출혈 및 아주 드문 경우 사망에 이를 수도 있는 부작용이 있다 (Rana L Smalling et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 305(5):G364-74, 2013; 대한민국공개특허 제 10-2020-0051676호).
이런 침습적인 간생검을 대체할 수 있는 신뢰할만한 진단방법의 개발이 진행되고 있으며, 간질환의 초기 진단 또는 만성간질환으로 진행 예측을 위해, 예측 또는 진단 마커가 될 수 있는 관련 유전자를 마이크로 어레이 방법을 사용하여 마커 유전자의 발현 패턴을 분석하는 방법을 통해 간질환을 진단하는 방법이 개발되었는데, 언수퍼바이즈드 클러스터링 알고리즘(unsupervised clustering algorithm) 및 수퍼바이즈드 알고리즘 방법이 있다. 언수퍼바이즈드 클러스터링 분석은 샘플 내에 존재하는 내재적인 생물학적 의미를 추출하는데 매우 유용하나, 그 측정결과의 통계적인 정확성을 제공하기 어려울 뿐 아니라, 측정되는 유전자의 수를 적절하게 조절하기 힘든 단점이 있다. 또한, 이러한 종래 방법의 경우, 간질환의 발병을 예측하는 확률이 정확하지 못한 단점이 있고, 예측 또는 진단 마커가 될수 있는 유전자들의 경우, 세포 내에서 암의 발생에 관여하는 신호 전달 체계가 하나의 유전자에 의해 조절되는 것이 아니라 수많은 유전자들이 복합적으로 관여하고 있어, 특정 유전자의 발현 패턴 분석을 통한 간질환 진단 역시 그 정확도가 미비한 단점이 있다.
따라서, 만성 간질환으로의 발전 가능성을 보다 정확하고 손쉽게 예측 및 진단할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명에서는 보다 효과적인 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커를 개발하기 위해 노력한 결과로, NAFLD 및 NASH 환자 그룹을 대상으로 통합유전체/전사체 분석을 수행한 결과, 간질환 단계에 IFI16 돌연변이(Single-nucleotide variant; SNV) 유전자 및 IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 IFI16 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 IFI16 돌연변이 유전자를 이용한 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 포함하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 IFI16 돌연변이 유전자는 IFI16 유전자의 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)일 수 있으며, 상기 IFI16 돌연변이 단백질은 서열번호 14로 구성된 아미노산 서열의 723 위치에 존재하는 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)일 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 상기 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질에 대한 검출 제제를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질에 대한 검출 제제를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 검출 제제는 돌연변이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드이거나, 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)일 수 있다.
또 다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (a) 환자의 생물학적 시료로 부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 FI16 돌연변이 유전자는 IFI16 유전자의 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)일 수 있으며, 상기 IFI16 돌연변이 단백질은 서열번호 14로 구성된 아미노산 서열의 723 위치에 존재하는 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 정보 제공방법은, IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출되거나 발현이 증가하면, 만성 간질환으로 진행 위험도가 높거나, 만성 간질환으로 진행되었거나, 만성 간질환에 대한 예후가 좋지 않은 것으로 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)일 수 있다.
본 발명에서 NAFLD 및 NASH 환자 그룹을 대상으로 유전체 분석을 수행한 결과, rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940을 포함하는 IFI16 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)의 빈도가 증가하는 것을 확인하였고, 간질환 단계에 따라 IFI16 돌연변이 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 IFI16 SNV가 침윤된 대식세포에서 크게 발현되어 대식세포 유도 염증 과정에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였으며, IFI16 변이체가 야생형 IFI16보다 dsDNA에 더 강하게 결합하여 IFI16-PYCARD-CASP1 경로의 손상된 미토콘드리아 DNA 감지 반응 신호를 악화시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 IFI16 돌연변이 유전자는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1a는 만성 간질환 진단을 위한 바이오마커 선별 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 통합된 NAFLD 전사체 데이터로부터 차등발현 유전자(DEG)를 선별하기 위해 컨센서스 클러스터(Consensus cluster)로 클래스(G1 ~ G3, subtype)를 분류한 후, 클래스에 따른 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 1c는 도 1b에서 구분된 클래스에 따른, 분석 그룹별에 따른 만성 간질환 단계별 비율(오른쪽)을 분석한 도면이다.
도 1d는 도 1b에서 구분된 클래스에 따른 성별 비율(왼쪽) 및 나이 비율(오른쪽)을 분석한 도면이다.
도 1f는 도 1b에서 구분된 클래스에 따른 섬유화 정도를 NCC 분석 그룹(왼쪽) 및 GSE135251 분석 그룹(오른쪽)으로 나누어 분석한 도면이다.
도 1e는 도 1b에서 클래스가 구분된 RNA-seq 데이터(n=460)을 이용하여 클래스 분류에 따른 과다발현 점수(enrichment score)를 비교분석한 도면이다.
도 2a는 NCC 환자 그룹의 전체엑솜염기서열분석(WES)을 통해 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)을 가지는 유전자 선별과정을 나타낸 모식도이다.
도 2b는 도 2a의 과정을 통해 선별된 유전자의 돌연변이율을 클래스별로 분석한 도면이다 (White : Missing (Low depth), Gray : WT, Green : MUT).
도 2c는 GSE135251, GSE167523 및 국립암센터(NCC)의 RNA-seq (n=460) 데이터세트를 이용하여 클래스별 IFI16 유전자의 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 2d는 IFI16 rs6940 SNV 유전형에 따른 IFI16 유전자의 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 2e 위쪽은 NCC 환자 그룹의 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 대한 전장유전체분석(WGS)을 수행하였을 때, IFI16유전자에 존재하는 4개의 DE-DSNV인 rs2276404(Promoter), rs73021847(Enhancer), rs7532207(Enhancer) 및 rs6940(Missesnse variants)의 변형 패턴을 분석한 도면이다.
도 2e 하단은 4개 SNV 및 매치되는 환자들의 RNA-seq 발현량값을 이용하여 4개 SNV 유전형(WT vs Mut)에 따른 발현량값의 차이를 분석한 도면이다.
도 2f는 IFI16 SNV인 rs6940의 야생형(A/A), 이형접합 돌연변이(A/T) 및 동형접합 돌연변이(T/T)에 따른 발현 정도를 클래스별로 분석한 도면이다.
도 2g는 검증세트에서, 클래스에 따른 IFI16 유전자의 발현 패턴(상단) 및 IFI16 SNV인 rs6940의 야생형(A/A), 이형접합 돌연변이(A/T) 및 동형접합 돌연변이(T/T)에 따른 발현 정도(하단)를 클래스별로 분석한 도면이다.
도 2h는 IFI16 SNV에 대한 롤리팝 플롯(Lolipop plot) 도면이다.
도 3a는 인간 간세포의 단일세포 RNA 서열분석(scRNA-Seq)을 통한 NAFLD/NASH 특이적 세포 타입 선별과정을 나타낸 모식도이다.
도 3b는 도 3a에서 선별된 세포 타입에 따른 세포수량 정도를 나타낸 도면이다.
도 3c는 각 세포 타입의 증식정도를 도 1b의 클래스별로 분석한 도면이다.
도 3d는 도 1b의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)에서 대식세포와 유전자 발현 패턴의 상관관계를 분석하여, 대식세포 비율 및 유전자 발현과 상관관계가 있는 유전자를 대식세포 표지자와 비대식세포 표지자로 구분하여 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 3e는 도 1b의 클래스별 차등발현 유전자(DEG) 및 도 3d의 대식세포 관련 유전자 데이터를 이용하여 클래스별 차등발현 유전자를 3가지 유형(macrophage signatures, Marker/Non-markers, Mac-independent signatures)으로 구분한 도면이다.
도 3f는 도 1b의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)를 이용하여, IFI16 유전자 및 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량간 상관관계(왼쪽), 클래스별 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량(가운데) 및 IFI16 rs6940 돌연변이 유무에 따른 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량(오른쪽)을 분석한 도면이다.
도 4a는 NAFLD 진행 동안 미토콘드리아 관련 유전자의 발현 및 ROS 활성 정도를 클래스(상단) 및 IFI16 rs6940 유전형(하단)으로 분석한 데이터이다.
도 4b는 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자의 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 4c는 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자의 발현 패턴을 클래스(상단) 및 IFI16 rs6940 유전형(하단)으로 분석한 데이터이다.
도 4d는 IFI16, PYCARD 및 CASP1 발현 패턴을 클래스(상단) 및 IFI16 rs6940 유전형(하단)으로 분석한 데이터이다.
도 4e는 mtDAMP(NLRP3 및 NLRC4) 및 mtRNA(TLR3, TLR7 및 TLR8) 관련 유전자의 발현 패턴을 클래스 및 IFI16 rs6940 유전형으로 분석한 데이터이다.
도 5a는 IFI16 단백질의 구조적 모델링으로 나타낸 모식도이다.
도 5b는 변이체 IFI16S723가 HINb-DNA 결합의 전반적인 안정성에 어떻게 영향을 미치는지 입증하기 위해, 시간함수로 dsDNA에 결합된 두 개의 HINb 도메인의 형태 변화를 모니터링하는 분자 역학 시뮬레이션을 수행한 데이터이다.
도 5c는 야생형 IFI16T723의 HINb에 있는 불안정한 OB2 도메인이 dsDNA와 함께 L732와 L759 사이의 중요한 염다리(salt bridge)를 끊는 과정을 구조적 모델링으로 나타낸 모식도이다.
도 5d는 변이형 IFI16S723은 염다리 유지 상태를 구조적 모델링으로 나타낸 모식도이다.
도 5e는 HINbS723-dsDNA 및 HINbT723-dsDNA 결합의 안정성 분석하기 위해, RNSD 점수 및 수소결합의 수를 확인한 데이터이다.
도 5f는 결합 자유 에너지 섭동 분석을 수행하여 IFI16S723이 IFI16T723의 반데르발스(van der Waals: vdW), 정전기 에너지 및 전체 DNA 결합 에너지를 분석한 데이터이다.
도 1b는 통합된 NAFLD 전사체 데이터로부터 차등발현 유전자(DEG)를 선별하기 위해 컨센서스 클러스터(Consensus cluster)로 클래스(G1 ~ G3, subtype)를 분류한 후, 클래스에 따른 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 1c는 도 1b에서 구분된 클래스에 따른, 분석 그룹별에 따른 만성 간질환 단계별 비율(오른쪽)을 분석한 도면이다.
도 1d는 도 1b에서 구분된 클래스에 따른 성별 비율(왼쪽) 및 나이 비율(오른쪽)을 분석한 도면이다.
도 1f는 도 1b에서 구분된 클래스에 따른 섬유화 정도를 NCC 분석 그룹(왼쪽) 및 GSE135251 분석 그룹(오른쪽)으로 나누어 분석한 도면이다.
도 1e는 도 1b에서 클래스가 구분된 RNA-seq 데이터(n=460)을 이용하여 클래스 분류에 따른 과다발현 점수(enrichment score)를 비교분석한 도면이다.
도 2a는 NCC 환자 그룹의 전체엑솜염기서열분석(WES)을 통해 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)을 가지는 유전자 선별과정을 나타낸 모식도이다.
도 2b는 도 2a의 과정을 통해 선별된 유전자의 돌연변이율을 클래스별로 분석한 도면이다 (White : Missing (Low depth), Gray : WT, Green : MUT).
도 2c는 GSE135251, GSE167523 및 국립암센터(NCC)의 RNA-seq (n=460) 데이터세트를 이용하여 클래스별 IFI16 유전자의 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 2d는 IFI16 rs6940 SNV 유전형에 따른 IFI16 유전자의 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 2e 위쪽은 NCC 환자 그룹의 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 대한 전장유전체분석(WGS)을 수행하였을 때, IFI16유전자에 존재하는 4개의 DE-DSNV인 rs2276404(Promoter), rs73021847(Enhancer), rs7532207(Enhancer) 및 rs6940(Missesnse variants)의 변형 패턴을 분석한 도면이다.
도 2e 하단은 4개 SNV 및 매치되는 환자들의 RNA-seq 발현량값을 이용하여 4개 SNV 유전형(WT vs Mut)에 따른 발현량값의 차이를 분석한 도면이다.
도 2f는 IFI16 SNV인 rs6940의 야생형(A/A), 이형접합 돌연변이(A/T) 및 동형접합 돌연변이(T/T)에 따른 발현 정도를 클래스별로 분석한 도면이다.
도 2g는 검증세트에서, 클래스에 따른 IFI16 유전자의 발현 패턴(상단) 및 IFI16 SNV인 rs6940의 야생형(A/A), 이형접합 돌연변이(A/T) 및 동형접합 돌연변이(T/T)에 따른 발현 정도(하단)를 클래스별로 분석한 도면이다.
도 2h는 IFI16 SNV에 대한 롤리팝 플롯(Lolipop plot) 도면이다.
도 3a는 인간 간세포의 단일세포 RNA 서열분석(scRNA-Seq)을 통한 NAFLD/NASH 특이적 세포 타입 선별과정을 나타낸 모식도이다.
도 3b는 도 3a에서 선별된 세포 타입에 따른 세포수량 정도를 나타낸 도면이다.
도 3c는 각 세포 타입의 증식정도를 도 1b의 클래스별로 분석한 도면이다.
도 3d는 도 1b의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)에서 대식세포와 유전자 발현 패턴의 상관관계를 분석하여, 대식세포 비율 및 유전자 발현과 상관관계가 있는 유전자를 대식세포 표지자와 비대식세포 표지자로 구분하여 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 3e는 도 1b의 클래스별 차등발현 유전자(DEG) 및 도 3d의 대식세포 관련 유전자 데이터를 이용하여 클래스별 차등발현 유전자를 3가지 유형(macrophage signatures, Marker/Non-markers, Mac-independent signatures)으로 구분한 도면이다.
도 3f는 도 1b의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)를 이용하여, IFI16 유전자 및 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량간 상관관계(왼쪽), 클래스별 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량(가운데) 및 IFI16 rs6940 돌연변이 유무에 따른 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량(오른쪽)을 분석한 도면이다.
도 4a는 NAFLD 진행 동안 미토콘드리아 관련 유전자의 발현 및 ROS 활성 정도를 클래스(상단) 및 IFI16 rs6940 유전형(하단)으로 분석한 데이터이다.
도 4b는 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자의 발현 패턴을 분석한 도면이다.
도 4c는 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자의 발현 패턴을 클래스(상단) 및 IFI16 rs6940 유전형(하단)으로 분석한 데이터이다.
도 4d는 IFI16, PYCARD 및 CASP1 발현 패턴을 클래스(상단) 및 IFI16 rs6940 유전형(하단)으로 분석한 데이터이다.
도 4e는 mtDAMP(NLRP3 및 NLRC4) 및 mtRNA(TLR3, TLR7 및 TLR8) 관련 유전자의 발현 패턴을 클래스 및 IFI16 rs6940 유전형으로 분석한 데이터이다.
도 5a는 IFI16 단백질의 구조적 모델링으로 나타낸 모식도이다.
도 5b는 변이체 IFI16S723가 HINb-DNA 결합의 전반적인 안정성에 어떻게 영향을 미치는지 입증하기 위해, 시간함수로 dsDNA에 결합된 두 개의 HINb 도메인의 형태 변화를 모니터링하는 분자 역학 시뮬레이션을 수행한 데이터이다.
도 5c는 야생형 IFI16T723의 HINb에 있는 불안정한 OB2 도메인이 dsDNA와 함께 L732와 L759 사이의 중요한 염다리(salt bridge)를 끊는 과정을 구조적 모델링으로 나타낸 모식도이다.
도 5d는 변이형 IFI16S723은 염다리 유지 상태를 구조적 모델링으로 나타낸 모식도이다.
도 5e는 HINbS723-dsDNA 및 HINbT723-dsDNA 결합의 안정성 분석하기 위해, RNSD 점수 및 수소결합의 수를 확인한 데이터이다.
도 5f는 결합 자유 에너지 섭동 분석을 수행하여 IFI16S723이 IFI16T723의 반데르발스(van der Waals: vdW), 정전기 에너지 및 전체 DNA 결합 에너지를 분석한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
만성간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물
본 발명은 일관점에서, IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 포함하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "위험도 예측"은 만성 간질환의 진행 가능성이 있는지, 만성 간질환이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 이미 만성 간질환으로 진행되었는지 여부를 예측 또는 진단하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 예측 또는 진단은 만성 간질환, 특히, 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH) 여부 또는 진행가능성을 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "예후"는 만성 간질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 것으로, 보다 구체적으로, 예후 예측은 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 질환의 경과 및 결과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 바이오마커"란 정상 대조군에 비해 만성 간질환이 진행된 개체에 비해, 특정 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함하며, 본 발명에서는 바람직하게 IFI16 돌연변이 유전자를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "돌연변이(mutant)"는 해당 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 염기 치환, 결실, 삽입, 증폭 및 재배열된 것을 포함하고, 뉴클레오티드 변이는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열의 변화(예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 역위 또는 치환)을 지칭한다. 바람직하게는 SNP(Single Nucleotide polymorphism) 또는 SNV(Single-nucleotide variant)를 지칭하며, 이로 인해 돌연변이가 발생한 단백질을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 상기 IFI16 돌연변이 유전자는 IFI16 유전자의 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)일 수 있으며, 상기 IFI16 돌연변이 단백질은 서열번호 14로 구성된 아미노산 서열의 723 위치에 존재하는 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)일 수 있다.
상기 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출되거나 발현이 증가하면 만성 간질환으로의 진행가능성이 높거나, 이미 만성 간질환인 것으로 볼 수 있으며, 만성 간질환에 대한 예후가 나쁜 것으로 볼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 도 1a에 나타난 모식도와 같은 방법으로 NAFLD/NASH 환자 그룹의 조직 또는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)의 RNA 발현패턴 분석, 전체엑솜염기서열분석(WES) 및 전장유전체분석(WGS)을 통해 유전자를 선별하였다.
또한, GSE135251, GSE167523 및 NCC-RSEQ에 대한 통합된 NAFLD 전사체 데이터(RSEQ)로부터 컨센서스 클러스터(Consensus cluster)를 G1 ~ G3 클래스로 구분하고, 이후 클래스별 차등발현 유전자(Differentially Expressed Gene:DEG)를 분석한 결과, 클래스에 따라 NAFLD에서 NASH로의 진행 비율 및 섬유화의 정도가 증가한 것으로 분석되었다 (도 1b ~ 도 1e). 나아가, G1 클래스에 비해 G2 클래스에서 ECM(ECM receptor interaction)이 증가하였으며, G2 클래스에 비해 G3 클래스에서 염증 반응(inflammatory response)이 증가하는 것으로 확인되어 만성간질환의 임상증상과 유사했다(도 1f).
즉, 본 발명의 IFI16 돌연변이 유전자 발현 패턴 분석을 통해 G3 클래스로 분류되는 경우, NASH로의 진행 및 간 섬유화 정도가 증가하는 것으로 예측 또는 진단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, 도 2a에 나타난 모식도와 같은 방법으로 NAFLD 환자 그룹 조직의 전체엑솜염기서열분석(WES)을 통해 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)을 가지는 5종의 유전자를 선별하고, 선별된 유전자의 돌연변이율을 도 1b의 클래스별로 분석하여 클래스에 따라 발현이 증가하는 IFI16 유전자를 최종적으로 선별하였다 (도 2b).
또한, GSE135251, GSE167523 및 국립암센터(NCC) NAFLD 환자 그룹 모두 G3 클래스에서 조직 내 IFI16 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(도 2c), 조직에서 정상 IFI16 유전자와 IFI16 돌연변이 유전자의 발현 패턴을 분석한 결과, IFI16 돌연변이 발현율이 증가한 것을 확인하였다 (도 2d).
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, IFI16 SNV인 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940의 발현 패턴을 분석한 결과, 4개의 IFI16 SNV 모두 간질환의 G3 클래스 특이적으로 돌연변이율 및 발현이 증가하는 것으로 확인되었다 (도 2e 상단 및 도 2e 하단). 특히, IFI16 rs6940(A>T) 유전자형의 빈도는 G1 ~ G3 클래스가 진행되는 동안 단계적으로 증가하였으며(G1에서 23.7%, G2에서 40%, G3에서 55.9%), IFI16 rs6940 유전자형은 야생형(A/A), 이형접합(A/T) 및 동형접합(T/T)으로 단계적으로 증가하는 것으로 나타났다 (도 2f).
또한, 검증세트인 RNA 발현 분석-전체엑솜염기서열분석(RSEQ-WES)에서도 클래스 단계에 따라 IFI16 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 정상 IFI16 유전자에 비해 IFI16 돌연변이 유전자 발현이 증가한 것을 확인하였다 (도 2g). IFI16 SNV에 대한 모식도 및 유전자 분석 종류에 따른 IFI16 SNV 돌연변이율은 도 2h에 나타내었다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, 도 3a의 나타난 모식도와 같은 방법으로 인간 간세포의 단일세포 RNA 서열분석(scRNA-Seq)을 통한 NAFLD/NASH 특이적 세포 타입을 선별하였으며, 각 세포 타입의 증식정도를 도 1b의 클래스 단계별로 분석한 결과, 클래스 그룹에 따라 대식세포(marophage) 증식이 증가하는 것을 확인하였다 (도 3b 및 도 3c).
도 1b의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)에서 대식세포와 유전자 발현 패턴의 상관관계를 분석하여, 대식세포 비율 및 유전자 발현과 상관관계가 있는 유전자를 대식세포 표지자와 비대식세포 표지자로 구분하여 발현패턴을 분석하였으며, 도 1b의 클래스별 차등발현 유전자(DEG) 및 도 3d의 대식세포 관련 유전자 데이터를 이용하여 클래스별 차등발현 유전자를 3가지 유형(macrophage signatures (Marker/Non-markers), Mac-independent signatures)으로 구분하였다 (도 3b 및 도 3e).
또한, 도 1b의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)를 이용하여, IFI16 유전자 및 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량간 상관관계, 클래스별 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량 및 IFI16 rs6940 돌연변이 유무에 따른 HPSE(Heparanase) 유전자 발현량을 분석한 결과, HPSE 유전자와 IFI16 유전자(돌연변이)와 관련이 있으며 HPSE 유전자 역시 G3 클래스에서 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, ROS 활성이 증가함에 따라 IFI16 rs6940 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(도 4a), IFI16 rs6940 돌연변이형(A/T 또는 T/T)은 포르밀 펩타이드 반응, 파이롭토시스(Pyroptosis) 및 핵산(NA) 센서 반응을 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자의 다운스트림 발현을 유도하며, IFI16-PYCARD-CASP1을 통해 mtDNA 감지 반응을 악화시키는 것으로 확인되었다 (도 4d ~ 도 4e).
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, 야생형 IFI16T723과 변이체 IFI16S723의 DNA 결합을 비교한 결과, IFI16의 rs6940 변이체가 HINb 도메인을 안정화하여 dsDNA에 대한 결합 친화성이 강화된 것을 확인하였다 (도 5a ~ 도 5e).
이러한 결과는, IFI16 SNV인 rs6940 유전자형의 발현이 증가하면, HINb 도메인이 안정화되어 dsDNA에 대한 결합 친화성이 강화된 변이체 IFI16S723에 의해, NAFLD에서 미토콘드리아 기능 장애가 발생하게 되고, 기능 장애가 발생한 미토콘드리아에서 방출된 면역원성 DNA에 의해 염증 반응이 악화된다는 것을 의미한다.
즉, 본 발명에서는 만성 간질환 환자의 유전자 분석을 통해 G1 ~ G3 클래스로 구분이 가능한 것을 확인하였으며, G1 ~ G3 클래스 특이적으로 IFI16 돌연변이 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 G3 클래스에서는 NAFLD 및 NASH 진행 비율, 및 간의 섬유화 정도가 증가하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 IFI16 돌연변이 유전자는 만성간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.
나아가, 본 발명에서는 IFI16 SNV가 침윤된 대식세포에서 크게 발현되어 대식세포 유도 염증 과정에 중용한 역할을 하는 것을 확인하였으며, 구조 모델링 분석 결과 IFI16 변이체가 야생형 IFI16보다 dsDNA에 더 강하게 결합하여 IFI16-PYCARD-CASP1 경로의 손상된 미토콘드리아 DNA 감지 반응 신호를 악화시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 IFI16 유전자의 돌연변이 분석을 통해 간질환의 염증 정도 및 섬유화 정도를 파악할 수 있고, IFI16 유전자의 돌연변이 검출 여부에 따라 적절한 만성 간질환의 치료방법을 제시할 수 있다.
만성간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물
본 발명은 다른 관점에서, 상기 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질에 대한 검출 제제를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출되거나 발현이 증가하면 만성 간질환으로의 진행가능성이 높거나, 이미 만성 간질환인 것으로 볼 수 있으며, 만성 간질환에 대한 예후가 나쁜 것으로 볼 수 있다.
상기 IFI16 돌연변이 유전자 검출 제제는 상기 IFI16 돌연변이 유전자의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에서는 필요에 따라 IFI16 돌연변이 단백질 발현 수준을 측정할 수도 있으며, 단백질 발현수준 측정을 위해, IFI16 돌연변이 유전자의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
만성간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 키트
본 발명은 또 다른 관점에서, IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질에 대한 검출 제제를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출 가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출 가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 키트를 이용할 수 있으며, 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.
만성간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측에 대한 정보 제공
본 발명은 다른 관점에서, (a) 환자의 생물학적 시료로 부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
상기 방법에서 "생물학적 시료(biological sample)"란 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미한다.
상기 만성 간질환 진단에 대한 정보 제공방법에서 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 검출 방법은 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 정보 제공방법은, IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출되거나 발현이 증가하면, 만성 간질환으로 진행 위험도가 높거나, 만성 간질환으로 진행되었거나, 만성 간질환에 대한 예후가 좋지 않은 것으로 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것으로 예측 또는 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 환자의 생물학적 시료로 부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 만성 간질환 치료를 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 정보 제공방법은, IFI16 유전자 또는 단백질의 돌연변이율에 따라 만성 간질환 치료 진행에 대한 정보를 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
만성 간질환 환자
유전자 그룹 또는 환자 선정
본 발명에서는 만성 간질환 진단을 위한 마커를 선별하기 위해, NAFLD/NASH 환자 유전자 그룹인 GSE135251(n= 216) 및 GSE167523(n=98)를 선별하여 분석에 사용하였으며, 실제 환자 그룹과 비교하기 위해 국립암센터(NCC) NAFLD/NASH 환자(n=146)를 선별하여 생체검사(Biopsy) 또는 수술 후 시료로부터 환자의 조직을 채취하였으며, 통합유전체/전사체분석을 수행하기 위해, 데이터를 통합하였다. 통합 데이터 세트는 정상(n=10), NAFL(n=168) 및 NASH(n=282)의 간 조직 샘플로 구성된다.
NAFLD 환자 그룹의 유전자 발현 패턴 분석
실시예 1의 GSE135251, GSE167523 및 NCC 환자 그룹을 도 1a에 나타난 모식도와 같은 방법으로 조직 또는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)의 RNA 발현패턴 분석, 전체엑솜염기서열분석(WES) 및 전장유전체분석(WGS)을 수행하였다.
먼저, GSE135251, GSE167523 및 NCC-RSEQ에 대한 통합된 NAFLD 전사체 데이터(RSEQ)로부터 컨센서스 클러스터(Consensus cluster)를 통해 서브타입인 클래스(G1 ~ G3)를 구분하고, 이후 클래스별 차등발현 유전자(Differentially Expressed Gene:DEG)를 선별(permutation t-test)하였다 (도 1b).
도 1b에서 구분된 발현 패턴을 G1, G2 및 G3 클래스로 나누어서 분석한 결과, G1 ~ G3 클래스로 진행될 때 NASH로의 진행 비율 및 섬유화의 정도가 증가한 것으로 분석되었다 (도 1c, 도 1d, 도 1f 및 도 1e).
또한, 도 1b에서 클래스가 구분된 RNA-seq 데이터(n=460)을 이용하여 GSEA(Gene set enrichment analysis) 분석(MsigDB Hallmark inflammatory response 및 KEGG ECM gene set)을 수행한 결과, G1 클래스에 비해 G2 클래스에서 ECM(ECM receptor interaction)이 증가하였으며, G2 클래스에 비해 G3 클래스로 갈수록 염증 반응(inflammatory response)이 증가하는 것으로 확인되어 간질환의 진행에 따른 영향을 확인할 수 있었다.
G1 ~ G3 클래스는 환자의 성별과 유의하게 연관되어 G1(76.7%), G2(74.1%), G3(46.9%)에서 남성 환자의 비율이 더 높게 나타났으며, 평균 연령(> 47세) 이상의 환자는 G1보다 G2/G3에서 더 많이 발생한 것으로 나타났다 (도 1d). 이러한 결과는 본 발명의 클래스(G1-G3) 유형이 데이터 코호트와 독립적으로 NAFLD 진행의 임상 병리학적 특징을 잘 반영하는 것을 의미한다.
만성 간질환 예측 또는 진단용 바이오마커 선별 및 발현 패턴 분석
도 2a에 나타난 모식도와 같은 방법으로 NAFLD 환자 그룹 조직의 전체엑솜염기서열분석(WES)을 통해 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)을 가진 유전자를 선별하였다.
먼저, 환자의 조직으로부터 얻은 WES 데이터(n=132)를 이용하여 분석을 수행하였으며, 하기의 단계를 이용하여 분석하였다.
<GATK best practice를 이용한 Variants call>
1 단계: QC (FastQC)
2 단계: Trimming (Trim_galore)
3 단계: Alignment (BWA-mem)
4 단계: Rmdu (Picard)
5 단계: BQSR (GATK)
6 단계: Variant call (GATK)
7 단계: Wild type call (GATK Depth of coverage) (Row depth인 variants의 경우 Missing 처리)
<Screening>
1 단계: 7,242,615 개의 SNV 선별
2 단계(LOF_MS SNVs): Functional filter step(Missense SNV & Loss function SNVs select)
3 단계(DSNVs): Class Differential SNVs (fisher p<0.05 & Mutation frequency 증가 or 감소)
4 단계(DE-DSNVs): 각각의 DSNVs의 유무에 따른 발현량(Expression) 차이 확인 (perm.t-test p<0.05 & Fold change > 0.2)
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이 클래스 별로 유의하게 차이가 나는 5개의 유전자(DE-DSNVs)를 선별하였으며, 선별된 유전자의 돌연변이율의 증가에 따라 클래스별로 발현이 유의하게 증가하는 IFI16 유전자를 최종적으로 선별하였다 (도 2b, 표 1).
| symbol | avsnp150 | fisher.p |
| IFI16 | rs6940 | 0.004665112 |
| FHL5 | rs2273621 | 0.020326558 |
| PSPH | rs74445297 | 0.024991669 |
| VSTM4 | rs13088 | 0.011662779 |
| GNB1L | rs2073770 | 0.025991336 |
또한, GSE135251, GSE167523 및 국립암센터(NCC)의 RNA-seq (n=460) 데이터세트를 도 1b의 클래스로 분석한 결과, 분석 그룹 모두 G3 그룹에서 조직 내 IFI16 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2c, 표 2).
| Batch | ANOVA p |
| GSE135251 | 1.11 e-15 |
| GSE167523 | 7.79 e-7 |
| NCC | 9.76 e-10 |
특히 NCC의 데이터 set에서 RSEQ 및 WES (n=132) 일치 데이터를 이용하여 조직에서 IFI16 rs6940 SNV 유전형에 따른 IFI16 유전자의 발현량을 확인한 결과, IFI16 돌연변이 발현율이 증가한 것을 확인하였다 (p-value : 0.0004399) (도 2d).
분석의 정확도를 높이기 위해 NCC PBMC 전체 게놈 데이터(NCC PBMC Whole Genome Seq, n=94)를 추가로 이용하여 NCC_WES과 동일한 Variants call 파이프라인 및 Screening 파이프라인 적용하여 분석하였으며, WGS 특성 감안하여 ENCODE cCREs(candidate regulatory sequence) 및 UCSC CpG Island 단계를 Functional filter step에 추가하였다. 이를 통해 IFI16 유전자에 존재하는 4개의 DE-DSNVs인 rs2276404(Promoter), rs73021847(Enhancer), rs7532207(Enhancer) 및 rs6940(Missesnse variants)의 유전자변형이 클래스별로 증가하는 것을 다시 한번 확인하였다 (도 2e 상단, 표 3).
| symbol | avsnp150 | fisher.p |
| IFI16 | rs2276404 | 0.018327224 |
| IFI16 | rs73021847 | 0.003665445 |
| IFI16 | rs7532207 | 0.017327557 |
| IFI16 | rs6940 | 0.016327891 |
이들 또한, 도 2e 상단의 4개 SNV 및 매치되는 환자들의 RNA-seq 발현량값을 이용하여 4개 SNV 유전형(WT vs Mut)에 따른 발현량값의 차이를 분석한 결과, 모두 돌연변이 그룹에서 IFI16 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 2e 하단, 표 4).
| avsnp150 | perm.t p |
| rs2276404 | 0.0001076 |
| rs73021847 | 0.0000437 |
| rs7532207 | 0.002112 |
| rs6940 | 0.002757 |
특히, 도 2f에 나타난 바와 같이, IFI16 rs6940(A>T) 유전자형의 빈도는 G1 ~ G3 클래스가 진행되는 동안 단계적으로 증가하였으며(G1에서 23.7%, G2에서 40%, G3에서 55.9%), IFI16 rs6940 유전자형은 야생형(A/A), 이형접합(A/T) 및 동형접합(T/T)으로 단계적으로 증가하는 것으로 나타났다.
검증세트를 이용한 IFI16 유전자 발현 패턴 분석
데이터 검증을 위해, 도 1의 Tier 2에 해당하는 RNA-seq(n=61)을 이용하여 NTP prediction 기법을 사용하여 검증 세트(validation set)의 RNA-seq 데이터를 분석하였다.
도 1b의 클래스에 따라 분석한 결과, 검증세트에서도 G3 그룹에서 IFI16 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였으며(도 2g, 상단 왼쪽), IFI16 rs6940 유전형에 따른 발현 차이를 분석한 결과, 돌연변이군에서 IFI16 발현이 정상대조군에 비해 증가한 것을 확인하였다 (도 2g, 상단 오른쪽).
또한, 검증세트에서도 도 2f와 마찬가지로 IFI16 rs6940 유전자형은 야생형(A/A), 이형접합(A/T) 및 동형접합(T/T)으로 단계적으로 증가하는 것으로 나타났다 (도 2g 하단). 즉, IFI16 rs6940(A>T)의 돌연변이형이 IFI16 발현을 향상시켜 NAFLD의 진행을 촉진시킬 수 있다.
IFI16 SNV 분석
본 발명에서는 도 1의 Tier1 WES(n=132), Tier1 WGS_BD(n=94) 및 Tier2 WES (n=61) 데이터를 이용하여 R package(rtracklayer, trackViewer 및 Gviz) 분석을 수행하였으며, gene(IFI16-203 / ENST00000359709.7) 유전자정보를 사용하여 IFI16 롤리팝 플롯(Lolipop plot)을 도 2h에 나타내었다. 위치 정보에 의하면, 1개의 SNV는 기능상의 손실을 야기하는 missense mutation이며, 3개는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터와 인핸서 부위에 있는 것으로 나타나, 이들이 유전자의 발현을 조절할 수 있다는 것을 다시 한번 확인해주었다.
또한, 각 IFI16 SNV의 서열정보를 하기 표 5에, IFI16 SNV의 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 위한 프라이머 서열은 표 6에 나타내었다. 표 5에서 굵게 표시된 부분은 프라이머에 의해 증폭(target sequence)되는 부분이며, 밑줄친 부분은 돌연변이가 발생한 부분을 의미한다.
| rsID | Position (GRCh38) | Region (dbSNP) | Regulatory region (ENCODE Screen) | Sequence | 서열번호 |
| rs2276404 | chr1:159010160_A>G | 5' UTR | Promoter like | >hg38_dna range=chr1:159009910-159010410 5'pad=2503'pad=250strand=+ repeatMasking=none TTCTCTGGGGCAATAGCAGAATAGGAGCAAGCCAGCACTAGTCAGCTAACTAAGTGACTCAACCAAGGCCTTTTTTCCTTGTTATCTTTGCAGATACTTCATTTTCTTAGCGTTTCTGGAGATTACAACATCCTGCGGTTCCGTTTCTGGGAACTTTACTGATTTATCTCCCCCCTCACACAAATAAGCATTGATTCCTGCATTTCTGAAGATCTCAAGATCTGGACTACTGTTGAAAAAATTTCCAGTG A GGTGAGTACTGTTCCTGATTTTGTAAATATGATCTTGTTCCTTCCTTGAAGTCCCCAGAATCACAAGGGGACAATCAGTATTGGTTATTCAGGGTCATGGGATGATGGGAGTAGGGCTGAGTATTCAGAAAAGTGAAAACTGAGTTGCTTGATATGAATCCTTCATTTACTTAGGAAGATAACAGGCATCTTCTATTCCACCACAACTGAGGACTGAACAAGAGAAAATGCATTTTGACCGTTGCAGATT |
1 |
| rs73021847 | chr1:159011084_T>C | Intron | Enhancer like | >hg38_dna range=chr1:159010784-159011384 5'pad=3003'pad=300strand=+ repeatMasking=none CTCTGCCCTCCTGAAAGTTAATGATTTTTTTTTTCCTTGTGGCAAGGTATAGGGGAGTGGAGGGGAAGGCAGTTAGGAAAAGGTTACTATTGTTTACTTTTCAAATTTTTAAAAGATGTTTTCTATAGCCTGGTACAATATTTCATGTGTGCTTAAATGGAATGTGAGATTCTTAAATGTTGTTTTCAGAATTTTATTAGATAAATGTTGTTAATTACGTTGTTCAAATTTATTATATCATTACAGATTTTTTCACCTTGTTCATTTAGTAATTGAAGCATAAACTGAAATCTCCTATTA T AAAGTTTGCTTTTTTGGCCGGGCACAGAGGTTCATGCCTGTAATCCCAGTACTTTGGGGGAGACCAAGGCGAGCGGATCACTTGACGTCAGGAGTTCCAGACCAGCCTGGCCAGCATGGCGAAACCCTGTCTCTATTAAAAATACAATAATTAGCCGGGTATGGTCATGTGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGACTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCAGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGACTGTGCCACTACACTCCAGCCTGGGTGACAGAGCAAGGCTCTGTCTCAA |
2 |
| rs7532207 | chr1:159054634_A>T | Intron | Enhancer like | >hg38_dna range=chr1:159054384-159054884 5'pad=2503'pad=250strand=+ repeatMasking=none CATGCTCTCAGATTGCTCCAGTTCTCAGGACCAGCAGTCAAACATTTCAAACCTTCTTTGATAGCAATTGCACCAGGAATACCTTTTGTACTCTCCCCCTTCCTTCTGCCCAATGAAAACCCTCTCCTCAACTCTTGTCATTGGGTGCACCAGCTCCTTTCTCTCTCCTGTTGTTCCCTGACATCTCCTGCTCTTTCACTTGCACTCATGCTGAGTAGGAGTGAATATCTCATTTCACGGTCCAAATTAA A CAGAGAGGCATGACTCAAAGGTCAAGAATTTATTAAGGGAGATAGATGAGAGCGAGAAAAGAATCATTTAGAAAGGAATAGGGGAAGAGATATGGTGCAGGGGGAGGAGATACAGTGTGATTGAAGGGAGAAATGTAGGATCATCAGCATCTCAACTGGTCTGTCTTTATCTCTTTCTCCTTCAAGGTCATCAAGACCAGGAAAAACAAGAAAGACATACTCAATCCTGATTCAAGTATGGAAACTTCAC |
3 |
| rs6940 | chr1:159054878_A>T | Exon | MS/LOF | >hg38_dna range=chr1:159054628-159055128 5'pad=2503'pad=250strand=+ repeatMasking=none AATTAAACAGAGAGGCATGACTCAAAGGTCAAGAATTTATTAAGGGAGATAGATGAGAGCGAGAAAAGAATCATTTAGAAAGGAATAGGGGAAGAGATATGGTGCAGGGGGAGGAGATACAGTGTGATTGAAGGGAGAAATGTAGGATCATCAGCATCTCAACTGGTCTGTCTTTATCTCTTTCTCCTTCAAGGTCATCAAGACCAGGAAAAACAAGAAAGACATACTCAATCCTGATTCAAGTATGGAA A CTTCACCAGACTTTTTCTTCTAAAATCTGGATGTCATTGACGATAATGTTTATGGAGATAAGGTCTAAGTGCCTAAAAAAATGTACATATACCTGGTTGAAATACAACACTATACATACACACCACCATATATACTAGCTGTTAATCCTATGGAATGGGGTATTGGGAGTGCTTTTTTAATTTTTCATAGTTTTTTTTTAATAAAATGGCATATTTTGCATCTACAACTTCTATAATTTGAAAAAATAAA |
4 |
| rsID | Target Sequence (+-10bp) | Sequence (5'->3') | 서열번호 |
| rs2276404 | ATTTCCAGTGAGGTGAGTACT | F : GGGCAATAGCAGAATAGGAGC | 5 |
| R : TCTCTTGTTCAGTCCTCAGTTGT | 6 | ||
| rs73021847 | TCTCCTATTATAAAGTTTGCT | F : TGGCAAGGTATAGGGGAGTG | 7 |
| R : GCTGGAGTGTAGTGGCACAG | 8 | ||
| rs7532207 | TCCAAATTAAACAGAGAGGCA | F : CATGCTCTCAGATTGCTCCAG | 9 |
| R : TTTCCTGGTCTTGATGACCTTG | 10 | ||
| rs6940 | AAGTATGGAAACTTCACCAGA | F : GCAGGGGGAGGAGATACAG | 11 |
| R : CCCATTCCATAGGATTAACAGC | 12 |
만성 간질환 특이적 세포 타입 선별 및 유전자 발현 패턴 분석
도 3a의 나타난 모식도와 같은 방법으로 인간 간세포의 단일세포 RNA 서열분석(scRNA-Seq)을 통한 NAFLD/NASH 특이적 세포 타입을 선별하였으며, 각 세포 타입의 증식정도를 분석하였다.
먼저, 실시예 1(도 1b)의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)의 GSE115469 Single cell RNA-seq 데이터(Human normal liver)를 MuSiC deconvolution package를 이용하여 분석하였다. (도 3b)
상기에서 측정된 세포 타입별 세포 증식정도를 세포 타입에 따른 박스플롯(Boxplot) 및 컨센서스 클래스(Consensus Class)로 분석한 결과, 클래스 단계에 따라 대식세포(marophage) 증식이 증가하는 것을 확인하였다 (도 3c).
실시예 1(도 1b)의 Pooled RSEQ 데이터(n=460)에서 대식세포와 유전자 발현 패턴의 상관관계를 분석하여, 대식세포 비율 및 유전자 발현과 상관관계가 있는 유전자(MAC_Sig)를 대식세포 표지자와 비대식세포 표지자로 구분하여 발현패턴을 분석하였으며, MAC_Sig는 대식세포 마커(n=24)와 비대식세포 마커(n=37)로 구성된다 (도 3d).
도 1b의 클래스별 차등발현 유전자(DEG) 및 도 3d의 대식세포 관련 유전자 데이터를 이용하여 클래스별 차등발현 유전자를 3가지 유형(macrophage signatures (Marker/Non-markers), Mac-independent signatures)으로 구분하였다 (도 3e).
이 때 유의하게 발현이 변화한 유전자들 중, HPSE(Heparanase) 유전자가 IFI16의 유전자 발현과 매우 유의하게 연관되어 있는 것으로 나타났으며, 클래스의 변화에 따라 발현이 변하는 것을 확인하였다 (도 3f, 표 7).
| IFI16 및 HPSE 상관관계 (도 3f 왼쪽) |
- pooled eset(n=460) - corr.p: 2.08e-36 - corr.r: 0.54 |
| 클래스별 HPSE 발현량 (도 3f 가운데) |
- pooled eset(n=460) - ANOVA.p: 2.22 e-16 |
| IFI16 rs6940에 따른 HPSE 발현량 (3f 오른쪽) |
- NCC Tissue WES/RSEQ (n=132) - perm.t p : 0.0002668 |
NAFLD에서 IFI16 SNV에 의한 미토콘드리아 장애 유도 효과 확인
NAFLD에서 대식세포의 침윤은 소포체 스트레스 및 미토콘드리아 손상을 유발하여 간의 지방증, 염증 및 간세포 손상을 촉진하고 사이토카인 및 반응성 산소종(ROS)의 과도한 생산을 촉진할 수 있다. 결과적으로 과도한 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아 손상은 미토콘드리아 DNA(mtDNA), 미토콘드리아 손상 관련 분자 패턴(mtDAMPs) 및 면역원성 핵산 종의 세포질 방출을 촉진한다 (Azzimato, Jager, et al. Sci Transl Med, 2020).
IFI16은 반응 염증 신호를 매개하는 바이러스, 박테리아, 미토콘드리아 및 핵 기원의 dsDNA를 인식하는 DNA 센서로, IFI16에 의한 DNA 감지가 대식세포에서 미토콘드리아 기능 장애 및 ROS 생산에 의해 조절될 수 있다.
이에, 본 발명에서는 ATP 유도, 파이롭토시스(Pyroptosis), mtDAMP(Mitochondrial DAMP), 염증소체(inflammasome), 핵산(NA) 센서 및 사이토카인을 포함하여 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자(n = 91)의 발현을 평가하였으며, 신호 경로 및 기능에 따라 수동으로 수집하고 11개 범주로 분류하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, NAFLD 진행 동안 미토콘드리아 관련 유전자의 발현 증가와 ROS 활성이 관찰되었다. 특히, ROS 활성이 증가함에 따라 IFI16 SNV인 IFI16 rs6940(A>T) 발현이 증가하였으며, G1 ~ G3 클래스가 진행되는 동안 이형접합(A/T) 및 동형접합(T/T) 발현이 단계적으로 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 도 4b 및 도 4c에 나타난 바와 같이, G3 클래스는 G1 클래스나 G2 클래스에 비해 포르밀 펩타이드 수용체(formyl peptide receptor) 및 파이롭토시스(pyroptosis) 관련 유전자의 발현은 높으나 ATP 합성 발현은 낮은 것으로 나타났으며, 이는 G3 클래스가 G2 클래스에 비해 미토콘드리아 스트레스가 가중됨을 의미한다. 특히, G2 클래스는 G3 클래스에 비해 포르밀 펩타이드 반응, 파이롭토시스(Pyroptosis), mt-DAMP, 핵산(NA) 센서 및 TLR2/TLR4의 발현이 낮으며, 이는 G2 클래스가 산화적 스트레스의 상승에 맞서 싸우는 상태임을 의미한다.
한편, NLRP1, NLRP4 및 NLRC4와 같은 염증소체(inflammasome) 관련 유전자는 G3 클래스에 비해 G2 클래스에서 억제되지 않았으며, 이는 이러한 경로가 미토콘드리아 스트레스 관련 DAMP가 아닌 일반적인 DAMP에 의해 조절됨을 나타낸다. 핵산(NA) 센서는 G3 클래스에서 현저하게 발현되었으며, 이는 미토콘드리아 막이 투과되고 면역원성 NA 종은 세포질로 누출됨을 나타낸다. 전반적으로, 이러한 결과는 미토콘드리아 스트레스가 G2 클래스에서는 낮지만 G3 클래스에서는 높기 때문에 IFI16 발현이 G2 클래스에서는 낮지만 G3 클래스에서는 높은 것을 나타낸다.
또한, IFI16 SNV에 의해 다운스트림 신호가 변경되는지 분석한 결과, 도 4d에 나타난 바와 같이, IFI16 rs6940 야생형 A/A와 비교하여 IFI16 돌연변이형(A/T 또는 T/T)은 포르밀 펩타이드 반응, 파이롭토시스(Pyroptosis) 및 핵산(NA) 센서 반응을 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 유전자의 다운스트림 발현을 유도하는 것으로 확인되었다.
IFI16 및 AIM2는 PYD-PYD 도메인(Pyrin Domain) 상호작용을 통해 PYCARD 어댑터를 직접 모집함으로써 IRF3 경로 및 CASP1 경로를 통해 IFN-I를 유도한다. 도 4e에 나타난 바와 같이, PYCARD 및 CASP1(Caspase 1)의 발현 수준은 IFI16 SNV rs6940 A/A 유전자형보다 A/T 또는 T/T 유전자형에서 더 높았으며, 이는 IFI16 SNV가 아마도 PYCARD-CASP1의 IFI16 다운스트림 경로에 적응하는 것을 의미한다. PYCARD-CASP1 경로는 AIM2, NLRP3 및 NLRC4를 포함한 다른 염증소체(inflammasome)의 영향을 받으나, 이들은 G1 ~ G3 클래스나 IFI16 SNV과 연관되지 않았다.
mtDNA 외에도 미토콘드리아 기능 장애는 mtDAMP 및 mtRNA의 누출로 이어지며, 이는 각각 IFI16이 아니라 NLRP1/3-NLRC4 및 TLR/RLR에 의해 감지된다. 예상대로 mtDAMP(예: NLRP1, NLRP3 및 NLRC4) 및 mtRNA(예: TLR3, TLR7 및 TLR8)에 대한 이러한 센서의 발현은 이들은 G1 ~ G3 클래스나 IFI16 SNV과 연관되지 않았다 (도 4e).
즉, 본 발명의 IFI16 SNV rs6940(A/T 또는 T/T)가 IFI16-PYCARD-CASP1을 통해 mtDNA 감지 반응을 악화시킬 수 있지만 NAFLD 진행 동안 mtDAMP 또는 mtRNA 감지 반응을 악화시키지는 못하는 것을 확인하였다.
IFI16 SNV 구조적 형태 분석 및 DNA 감지 반응 확인
IFI16 SNV rs6940은 트레오닌(Threonine)을 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)이므로, 구조적 변화에 의해 IFI16-DNA 결합 친화도가 변경될 것으로 예상된다.
본 발명에서는 야생형 IFI16T723(서열번호 13; UniProtKB/Swiss-Prot: Q16666.3)과 변이체 IFI16S723(서열번호 14)의 DNA 결합을 비교하기 위해, RSCB-PDB의 IFI16 단백질 구조 데이터를 사용하여 구조 모델링 분석을 수하였다.
IFI16 단백질은 2개의 DNA 결합 HINa 및 HINb 도메인과 1개의 PYRIN 도메인을 포함하며, T723S 변이체는 DNA를 인식하는 HINb 도메인에 위치한다 (Tengchuan Jin et. al., Immunity, 36(4):561-571, 2012). 결정학 연구를 기반으로 IFI16 HINb-dsDNA 인터페이스는 음전하를 띤 당-인산 백본과 양전하를 띤 잔류물 사이의 정전기적 상호작용을 통해 확립된다. HINb 도메인의 N-말단은 DNA 결합 인터페이스에서 떨어져 있어 caspase-1 활성화와 같은 추가 다운스트림 처리를 위해 PYCARD와 같은 어댑터를 포함하는 다른 PYRIN 도메인과 PYRIN 도메인의 상호 작용을 잠재적으로 촉진한다.
도 5a에 나타난 바와 같이, IFI16의 HINb 도메인은 링커 나선(α2)을 통해 연결된 전형적인 올리고뉴클레오티드 결합 1(OB1) 및 OB2 접힘을 포함하며, 구조적 모델링은 IFI16이 OB1의 양전하 잔기, 링커 헬릭스 α2 및 OB2 도메인과 DNA의 백본 인산염 그룹 사이에 염 다리를 설정하여 dsDNA에 결합한다는 것을 확인하였다.
변이체 IFI16S723가 HINb-DNA 결합의 전반적인 안정성에 어떻게 영향을 미치는지 입증하기 위해, 시간함수로 dsDNA에 결합된 두 개의 HINb 도메인의 형태 변화를 모니터링하는 분자 역학 시뮬레이션을 수행하였다. 도 5b에 나타난 바와 같이, IFI16S723에서 S723의 OH기는 IFI16T723에는 없는 G701의 백본 산소(O)와 강한 수소 결합(l = 1.7Å & E = 1.2-1.7 kcal/mol)을 형성한다. G701은 OB2 도메인에서 llβ과 llβ사이의 힌지 루프에 위치한다.
또한 인터페이스 분석에서, 야생형 IFI16T723의 HINb에 있는 불안정한 OB2 도메인이 dsDNA와 함께 L732와 L759 사이의 중요한 염다리(salt bridge)를 끊는 반면(도 5c), 변이형 IFI16S723은 염다리를 그대로 유지하는 것으로 나타났다 (도 5d). 이는 OB2가 아닌 링커 나선과 OB1이 dsDNA(Kd = 0.034μM)와 강한 결합 AIM2에서 중요한 역할을 하는 위치를 설명할 수 있다.
또한, HINbS723-dsDNA 결합의 안정성은 RMSD(root-mean-square-deviation) 및 RMSF(root-mean-square-fluctuation) 점수의 매끄러운 형태적 거동에 의해 뒷받침될 수 있는 반면, HINbT723과 dsDNA 사이의 결합은 이 점수의 엄격한 변화를 보여주었다 (도 5e 왼쪽). HINb T723-dsDNA보다 HINbS723-dsDNA 결합에서 반데르발스(van der Waals: vdW) 힘과 수소 결합의 수가 안정적으로 유지됨을 입증하였다 (도 5e 오른쪽).
나아가, GROMACS v5.0에 구현된 MM-PBSA(Poisson-Boltzmann Surface Area)를 사용하여 결합 자유 에너지 섭동 분석을 수행한 결과, 도 5f에 나타난 바와 같이, IFI16S723이 IFI16T723보다 반데르발스(van der Waals: vdW) 및 정전기 에너지가 더 낮다는 것을 입증하였다. IFI16T723(10,616.73 kJ/mol)의 전체 DNA 결합 에너지도 IFI16S723(-10,978.48 kJ/mol)보다 상당히 낮은 것으로 나타났다.
즉, 상기 결과는 본 발명의 IFI16의 rs6940 변이체가 HINb 도메인을 안정화하여 dsDNA에 대한 결합 친화성을 강화시키고, 진행된 NAFLD에서 미토콘드리아 기능 장애 동안 방출된 면역원성 DNA에 의한 염증 반응을 악화시킨다고 볼 수 있다.
Claims (17)
- IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질을 포함하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 IFI16 돌연변이 유전자는 IFI16 유전자의 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 IFI16 돌연변이 단백질은 서열번호 14로 구성된 아미노산 서열의 723 위치에 존재하는 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- IFI16(Interferon Gamma Inducible Protein 16) 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질에 대한 검출 제제를 포함하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 IFI16 돌연변이 유전자의는 IFI16 유전자의 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 IFI16 돌연변이 단백질은 서열번호 14로 구성된 아미노산 서열의 723 위치에 존재하는 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 검출 제제는 돌연변이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드이거나,
돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
- 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 키트.
- (a) 환자의 생물학적 시료로 부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 추출된 게놈 DNA에 IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질의 검출 또는 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
- 제11항에 있어서,
상기 IFI16 돌연변이 유전자는 IFI16 유전자의 rs2276404, rs73021847, rs7532207 및 rs6940으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성(Single-nucleotide variant; SNV)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
- 제11항에 있어서,
상기 IFI16 돌연변이 단백질은 서열번호 14로 구성된 아미노산 서열의 723 위치에 존재하는 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 대체하는 미스센스 변이체(T723S)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
- 제11항에 있어서,
상기 정보 제공방법은, IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출 또는 발현이 증가하면 만성 간질환으로의 진행 위험도가 높은 것으로 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
- 제11항에 있어서,
상기 정보 제공방법은, IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출 또는 발현이 증가하면 만성 간질환인 것으로 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
- 제11항에 있어서,
상기 정보 제공방법은, IFI16 돌연변이 유전자 또는 IFI16 돌연변이 단백질이 검출 또는 발현이 증가하면 만성 간질환에 대한 예후가 좋지 않은 것으로 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
- 제11항에 있어서,
상기 만성 간질환은 비-알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 또는 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)인 것을 특징으로 하는, 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/004303 WO2023191555A1 (ko) | 2022-03-30 | 2023-03-30 | 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 마커로서 ifi16 돌연변이 유전자 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220039809 | 2022-03-30 | ||
| KR20220039809 | 2022-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230142361A true KR20230142361A (ko) | 2023-10-11 |
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ID=88295589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230042074A KR20230142361A (ko) | 2022-03-30 | 2023-03-30 | 만성 간질환 위험도 예측, 진단 또는 예후 예측용 마커로서 ifi16 돌연변이 유전자 및 이의 용도 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR20230142361A (ko) |
-
2023
- 2023-03-30 KR KR1020230042074A patent/KR20230142361A/ko unknown
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