KR20230141704A - 방사선 및/또는 항암 치료 보조 요법으로 아데노신 디포스페이트 리보오스의 활용 - Google Patents

방사선 및/또는 항암 치료 보조 요법으로 아데노신 디포스페이트 리보오스의 활용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아데노신 디포스페이트 리보오스(adenosine diphosphate ribose; ADP-Ribose)를 이용한 항암 요법에 관한 것으로, 구체적으로 ADP-리보오스의 단독 항암요법 및 항암제 또는 방사선과의 병용 요법 등에 관한 것이다.

Description

방사선 및/또는 항암 치료 보조 요법으로 아데노신 디포스페이트 리보오스의 활용{Use of adenosine diphosphate ribose for adjuvant therapy with radiation and/or anticancer drug}
본 발명은 아데노신 디포스페이트 리보오스(adenosine diphosphate ribose; ADP-Ribose)를 이용한 항암 요법에 관한 것으로, 구체적으로 ADP-리보오스의 단독 항암요법 및 항암제 또는 방사선과의 병용 요법 등에 관한 것이다.
방사선 요법은 엑스레이 등 강력한 에너지 빔을 사용하여 암세포를 죽이는 암 치료법이다. 방사선을 처리하는 동안 고 에너지 빔이 기기에서 나오며, 신체의 정확한 지점을 향해 빔을 조준하여 치료된다. 방사선 요법은 세포의 성장과 분열을 제어하는 유전 물질(DNA 등)을 파괴함으로써 세포를 손상시킨다. 방사선 요법의 궁극적인 목표는 가능한 정상적이고 건강한 조직을 피해 암 조직을 목표로 하여 파괴하는 것이다. 컴퓨터 기술의 발전으로 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 개발하여 정상적인 조직의 손상을 줄이기 위해 표적 종양을 정확하게 계산해낼 수 있다. 강도 조절 방사선 요법 및 양성자 빔 요법은 종양을 효율적으로 제거하고 정상 기관에 대한 손상을 최소화하기 위해 여러 방향으로 광자 및 양성자 빔을 적은 오차로 표적에 조준하는 방식으로 수행되며 이 방법을 통해 방사선 치료에 의한 부작용은 많이 감소하는 추세이다. 그러나 치료 기술의 개선에도 불구하고, 수많은 환자는 암 세포의 방사선에 대한 고유 내성으로 인해 치료 후 암이 쉽게 재발하는 문제점이 대두된다.
화학 요법은 암 세포를 죽이기 위해 약물을 사용하는 모든 항암제 치료를 일컫는다. 화학 요법은 단일 약물 또는 여러 약물의 조합으로 구성 될 수 있으며, 정맥, 근육, 피하를 통해 투여되거나, 체강 내로 주사되거나, 알약 형태로 경구로 전달 될 수 있다. 화학 요법은 암과 싸우는 약물이 혈액을 통해 퍼져서 원래 암과 먼 곳의 암 (전이성) 세포를 죽이거나 제거 할 수 있도록 신체 모든 부위를 순환한다는 점에서 수술이나 방사선 요법과 다르다. 암 진단을 받은 모든 사람의 절반 이상이 화학 요법을 받는다. 그러나 암 화학요법을 통한 치료 시 걸림돌 중 하나가 약물에 대한 부작용의 우려이다. 화학 요법은 신체에서 빠르게 성장하고 분열하는 모든 세포에 영향을 미칠 수 있으며 여기에는 골수의 새로운 혈액 세포 또는 입, 위, 피부, 모발 및 생식 기관의 세포를 포함한 정상 세포가 포함된다. 화학 요법이 정상 세포를 손상 시키면 부작용이 발생하는 것이다. 부작용 발생 여부와 그 심각도는 약물의 유형 및 첫 치료주기에서 다음 치료주기까지의 반응에 따라 다를 수 있지만 특히 약물의 용량과도 밀접한 관련이 있다. 부작용이 심해지면 치료가 즉시 중단 되어야 하며 정상적이고 건강한 세포가 회복된 후 부작용이 점진적으로 개선되는 경향이 있다. 때때로 화학 요법은 사라지지 않는 장기간의 부작용을 유발할 수 있으며 여기에는 심장, 폐, 신경, 신장 또는 생식 기관 손상이 포함될 수 있다.
진행성 암 환자들이 필수적으로 겪어야 하는 치료 과정에서 예기치 못한 내성으로 초기 치료의 실패를 경험하기도 하고 치료에 대한 내성 없이 방사선이나 항암 요법 등의 치료를 지속적으로 진행할 수 있다고 하더라도 감수해야 되는 여러 가지 크고 작은 다양한 부작용의 부담은 상당히 크다. 방사선 치료의 경우는 치료에 의해 유도되는 항암 효과를 지속적으로 유지하기 위한 방법으로 저 산소 환경에서 유도되는 암 특이적 유전자의 억제나 DNA를 복구에 활용 되는 다양한 분자생물학적, 유전적 요인들을 조절하기 위한 시도가 있어 왔으나 방사선 치료 효과를 증진시키거나 내성 극복을 위한 알려진 요법들은 방사선 치료와 병용할 때 기본적으로 방사선 치료에 의해 나타나는 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등의 부작용을 더 악화 시킬 수 있는 가능성이 공존하기 때문에 적극적인 사용에 제한이 있으며 근본적인 방사선 치료의 민감도 증진이나 내성 극복을 위한 요법으로 명확하게 인정받지 못했다. 화학 요법의 경우는 치료에서 효능 대비 감수해야 되는 부작용을 줄이기 위한 방법으로 투여 용량을 감소시키는 것이 가장 확실한 방법이나 요법의 특성상 부작용에 의해 용량을 감량 하는 것 자체가 치료의 실패로 여겨질 수 있다. 따라서 현재까지 알려진 방법을 통한 성적은 만족스럽지 못했고 이를 극복하기 위한 부분은 의학적으로 미 충족 수요 (unmet needs)에 충분히 해당되며 해결하기 상당히 어려운 과제로 남아있다.
아데노신 디포스페이트 리보오스 또는 ADP-리보오스는 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)에서 유래된 생체 물질로, 세포 내에서 ADP-리보실화(ribosylation)의 단위 분자로 번역후 변형(post-translational modification)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 외부 NAD의 악성 종양 또는 감염성 질환에 대한 용도는 WO 99/12951에 일부 개시되어 있고, 외부 ADP-리보오스의 아데노바이러스-관련 질환 또는 병태 또는 점막염에 대한 용도 역시 WO 2017/143113 또는 WO 03/099297에 일부 개시되어 있다. 그러나, 상기 문헌들은 ADP-리보오스의 구체적인 항암 용도 또는 항암 보조 용도를 개시하고 있지 않다.
본 발명의 목적은 아데노신 디포스페이트 리보오스(ADP-리보오스)를 활용하여 항암 요법의 효능을 개선하는 것이다.
상기 목적 달성을 위해 본 발명자들이 연구 노력한 결과, ADP-리보오스가 암 세포 내 축적되면 암세포 내 ADP-리보오스의 항상성이 무너지는 생화학 작용 교란으로 인해 항암 효과를 발휘할 수 있으며, 방사선 요법 및/또는 화학 요법에 대한 민감성이 현저히 향상될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 이에, 본 발명은 항암 치료를 위한 ADP-리보오스의 사용방법, 항암 치료를 위한 방사선 요법 및/또는 항암 요법과 ADP-리보오스의 병용 방법, 항암 치료를 위한 ADP-리보오스 제제 등을 제공한다.
1. 항암 치료를 위한 ADP-리보오스의 사용
본 발명자는 ADP-리보오스의 항암 효과를 다양한 고형암종에서 구체적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명은 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항암용 조성물, 치료적 유효량의 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법; 또는 항암제의 제조를 위한 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염
본 발명에서 ADP-리보오스 또는 아데노신 디포스페이트 리보오스는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
ADP-리보오스의 제조방법은 본 발명이 속한 기술 분야에 공지되어 있다. 일 실시양태에서, ADP-리보오스는 알칼리성 염기의 존재 하에 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 가수분해를 통해 합성될 수 있다. 또한, ADP-리보오스는 이에 상응하는 염기의 금속 이온의 일가 또는 이가염의 형태로 단리될 수 있다. 또는, ADP-리보오스는 정제된 원료로 상업적으로 입수할 수 있다(CAS Number: 68414-18-6).
본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 제약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온의 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산의 염이 있으며, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산의 염 등과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염이 있다. 또한 약학적인 반응, 정제 및 분리과정에서 사용될 수 있는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 테트라프로필 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 벤질 트리메틸 암모늄, 벤제토늄 등의 유기이온의 염이 있다. 다만, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에서 ADP-리보오스의 약학적으로 허용가능한 염은 ADP-리보오스의 리튬 염(모노 및 디-리튬염 포함)이 아니다.
본 발명에서 ADP-리보오스는 폴리-ADP-리보오스(Poly-ADPR)과 같은 ADP-리보오스의 전구약물 형태로 사용될 수 있다. 예컨대, ADP-리보오스의 전구약물은 화학식 1로 표시되는 ADP-리보오스 내 말단 리보오스 모이어티의 하나 이상의 히드록실기와 카복시산, 아미노산, 지방산 또는 이들의 조합이 축합되어 형성될 수 있다.
ADP-리보오스의 항암 효과
본 발명자는 본 발명의 항암 조성물이 암 세포 내 ADP-리보오스를 축적시키고 암 세포 생화학 작용의 교란을 유발함으로써 항암 효과를 발휘한다는 점을 발견하였다.
구체적으로, 본 발명자는 각종 고형암(뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암) 세포주에 ADP-리보오스(수 내지 수십 μM 농도)를 처리할 경우 암세포 내 ADP-리보오스 농도가 현저히 증가된다는 것을 확인하였다(실시예 1; 도 1). 특히, 항암 요법의 하나로 사용되는 방사선 조사 시 암세포 내 ADP-리보오스의 농도가 일시적으로만(수 시간) 증가하였으나, 외부 ADP-리보오스 처리 시 암세포 내의 ADP-리보오스 농도는 방사선 조사 시와 비교하여 현저히, 그리고 지속적으로 상승됨을 확인하였다(실시예 7; 도 16).
본 발명자는 ADP-리보오스를 암세포 내부에 인위적으로 축적시킬 경우 암 세포에서 유지되는 ADP-리보오스의 생화학적 항상성을 붕괴시킴으로써 효과적인 항암 효과를 발휘할 수 있을 것으로 예상하였다. 이를 구체적으로 확인한 결과 ADP-리보오스가 저 농도(수 내지 수십 μM 농도)에서 각종 고형암(뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암)에 대해 현저한 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 2; 도 2 내지 8, 실시예 4; 도 11 내지 13).
이를 통해 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 암 치료를 위해 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서, 암은 악성 종양 또는 신생물로도 불리는 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 무너져 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 상태 또는 질병을 지칭한다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시킨다.
본 발명의 항암 조성물에 의해 완화, 경감 또는 치료될 수 있는 암은 생화학 작용과정의 교란에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 세포 내 ADP-리보오스 생화학 작용의 교란에 의해 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 고형암인 것이 바람직하다. 상기 고형암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 두경부암, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 결장암, 직장암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 편평상피세포암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 암은 특정 유전자가 돌연변이된 암일 수 있다. 바람직하게는, 상기 고형암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암 및 신장암으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이다.
본 발명에서, 암은 원발성 암과 전이성 암을 포함한다. 본 발명의 항암 조성물은 암 세포의 침투 및 전이 능력 억제에 효과적이다. 구체적으로, 본 발명자는 ADP-리보오스가 저농도(수 내지 수십 μM 농도)에서 전이암(췌장암, 유방암)에 대한 현저한 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 3; 도 9 내지 10). 따라서, 본 발명의 조성물은 고형암, 특히 전이성 고형암(예컨대, 전이성 췌장암, 유방암)의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
투여 경로, 용법 및 용량
본 발명에 따른 항암 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 투여 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 예컨대, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태 또는 활성 성분을 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강 내에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항암 조성물은 활성 성분이 표적 암 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
구체적으로 본 발명자는 마우스를 대상으로 하는 동물 실험을 통해 ADP-리보오스를 피하주사, 정맥주사 또는 구강 투여할 경우 각종 고형암(췌장암, 신장암, 췌장암)에 대해 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 4; 도 11 내지 13).
본 발명에 따른 항암 조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있으며, 이는 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미한다. 치료적 유효량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 항암 조성물은 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 항암 조성물은 단독 투여되거나 1 가지 이상의 항암 요법과 병용될 수 있다. 병용 투여될 경우, 상기 1 가지 이상의 항암 요법은 화학요법, 면역항암요법, 방사선요법, 수술, 나노의학, 또는 이들의 조합을 포함하며, ADP-리보오스의 항암 효과가 증진될 수 있는 항암 요법이라면 그 종류 및 횟수가 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 항암 조성물은 수술 전후 보조요법에 사용될 수 있으며, 후술되는 바와 같이 방사선 요법 및/또는 항암 요법과 동시에 또는 전후로 병용될 수 있다.
2. 항암 치료를 위한 방사선 요법과 ADP-리보오스의 병용
본 발명자는 방사선 요법과 ADP-리보오스를 병용할 경우 항암 치료의 효과가 현저히 상승함을 발견하였다. 따라서 본 발명은 방사선 요법과 병용되는 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항암 조성물, 치료적 유효량의 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것과 방사선 요법을 병용하는 암의 치료 방법, ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 방사선 요법의 항암 보조제 또는 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 방사선 민감화제를 제공한다.
본 발명에서 방사선 요법의 항암 보조제란 방사선 요법 전후로 투여될 경우 방사선 요법의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다.
방사선 요법
본 발명에서 용어, "방사선 요법"은 암 세포를 사멸시키기 위한 목적으로 암 세포 또는 종양 조직에 방사선을 조사하는 치료 행위를 말한다. 일반적으로 절개 불가능하거나 수술 불가능한 종양, 또는 종양 전이를 제어하기 위한 표준 치료법으로서 표적 부위로 전달된 방사선이 재생성 세포 (reproductive cell)의 사멸을 초래한다는 원리에 기초한다. 본 발명에서 방사선 항암 치료는 이온화 방사선 요법 (ionizing radiation therapy), 전자기 방사선 요법 (electromagnetic radiation), 근접 방사선 요법 (brachytherapy) 또는 외부 방사선 요법 (external beam radiation therapy)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 방사선 요법과 병용될 경우 상승적 항암 효과를 나타내므로 방사선 요법에 대한 항암 보조제 또는 방사선 민감도를 향상시키는 방사선 민감화제로 유용하게 활용될 수 있으며, 적용 가능한 암의 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일례로, 상기 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암 또는 신장암과 같은 고형암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태로서, 상기 고형암은 방사선 요법에 대해 내성을 나타내는 것일 수 있다. 방사선 치료의 항암 효과는 DNA 절단의 형성으로 나타나기 때문에 방사선 치료에 대한 내성은 일반적으로 방사선 치료에 의해 유도되는 DNA 손상을 복구할 수 있는 기전에 의해 결정된다. 방사선 치료의 항암 효능을 상승시키는 방법으로 DNA 복구 기전 억제를 위한 많은 시도가 있어 왔으며 파괴된 DNA 가닥의 수리가 차단되면 방사선 치료의 감도가 높아질 수 있다. DNA 손상의 두 가지 주요 형태는 SSB (Single Strand Breaks)와 DSB (Double Strand Breaks)다. 따라서, SSB 및 DSB를 대상으로 하는 두 가지 복구 경로의 범주로 설명할 수 있다. BER (Base Excision Repair)은 선택된 유형의 DNA SSB의 복구에 관여하는 여러 경로 중 하나다.
PARP1은 ADP-리보실화 (ribosylation)로 알려진 공정을 통해 DNA SSB의 BER에서 중요한 역할을 수행한다. 핵에서 PARP1은 SSB DNA의 손상을 감지하고 수리를 위해 SSB 부위에 ADP-리보실화를 통해 DNA 복구 복합체를 모집한다. PARP-1 활성에 의한 ADP-리보실화를 통해 합성된 폴리-ADP-리보오스의 과축적은 최종적으로 세포의 사멸로 이어지기 때문에, 암 세포는 이 현상을 막기 위해 PARG나 ARH3 등과 같은 프로테아좀을 통해 폴리-ADP-리보오스의 분해를 활성화하여 생존 신호전달 활동을 활성화한다. 본 발명자들은 암 세포 내 ADP-리보오스나 ADP-리보오스 중합체의 축적이 암 세포의 이러한 생화학적 생존 기전을 교란시킬 수 있는 매개체로 작용할 수 있어 방사선 치료 내성을 극복하는 중요한 항암 보조제로 활용될 수 있음에 착안하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 각기 다른 암 종에서 저선량의 방사선 조사와 함께 본 발명의 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 병용 처리한 경우, 모든 암 종에서 방사선 치료에 대한 반응성이 증진되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 방사선 치료의 반응을 증진시킬 수 있어 항암 보조 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 방사선을 내성 선량으로 조사하더라도 우수한 항암 활성을 가지므로 방사선으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.
구체적으로, 본 발명자는 각종 고형암에서 ADP-리보오스 처리에 의해 방사선 조사 시 상승하는 암세포 내 ADP-리보오스 농도 이상으로 세포내 ADP-리보오스 농도 상승을 유지시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 7; 도 16). 방사선 조사에 의한 항암 효과는 유전 물질의 손상에 의한 사멸 작용을 통해 기대할 수 있으나 암 세포는 이를 극복하기 위해 ADP-리보실화를 통해 DNA의 가닥을 지속적으로 복구한다. 그러나 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이 방사선 조사에 의해 파괴된 DNA 가닥의 복구 작용을 위해 일시적으로만 증가하는 ADP-리보오스를 지속적으로 축적되도록 보조하여주면 암 세포의 DNA 복구 과정에서 생화학적 교란을 일으켜 방사선 치료의 상승된 항암 효과를 기대할 수 있어 방사선 치료의 내성 극복 및 부작용 감소를 위한 감소된 선량으로의 항암 방사선 활용 가능성을 기대할 수 있다.
나아가, 본 발명자는 방사선 요법과 ADP-리보오스 투여와 방사선 병용시 각종 고형암(뇌암, 폐암, 췌장암, 유방암, 대장암, 신장암)에 대한 상승적 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 8; 도 17, 실시예 9; 도 18).
투여 경로, 용법 및 용량
방사선 조사 요법은 일반적으로 방사선 흡수선량(Gray; Gy), 시간 및 분류 면에서 정의되고 종양학자에 의해 조심스럽게 정의되어야 한다. 환자가 수용할 수 있는 방사선 양은 다양한 고려사항에 따라 좌우되나 두 가지 가장 중요한 것은 신체의 다른 결정적인 구조 또는 장기에 대한 종양의 위치 및 종양이 퍼진 정도이다. 방사선요법을 받고 있는 환자 치료의 전형적인 과정은 이제 제한되지 않으나 예컨대, 1 주일에 5 일 동안 1일 1회 선량을 약 1.8 내지 2.0 Gy 으로, 환자에게 투여된 총 선량이 10 내지 80 Gy 으로 하여 1 내지 6 주 기간에 걸친 치료 스케줄일 수 있고, 1-10 cGy 또는 5-40 cGy 수십회 등 낮은 농도의 방사선으로 다회 분획하는 치료 스케쥴일 수 있다.
본 발명자는 종양 마우스 모델을 대상으로 2 Gy 선량의 방사선 요법과 ADP-리보오스 투여를 병용할 경우 각종 고형암에 대한 상승적 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 8; 도 17, 실시예 9; 도 18). 그러나, 본 발명의 항암 조성물과 병용될 수 있는 방사선 요법의 방사선 흡수선량은 이에 제한되지 않으며, 1회 선량은 1 내지 10 Gy로, 총 선량을 약 1 내지 100 Gy로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예컨대 환자에게 조사되는 총 방사선량은 약 1 cGy 내지 약 100 Gy 또는 약 1 cGy 내지 약 50 Gy이 수 있다. 일부 구체예에서, 개체는 방사선 요법을 받고 있고 및/또는 받을 수 있다. 방사선 요법은 1주 내지 10주 동안 주당 5일 투여되는 하나 이상의 방사선 치료를 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 방사선 요법은 특정 기간(예를 들면, 1-10 주)에 걸칠 수 있고, 개체에게 연속적으로 투여되지 않고, 오히려 간헐적으로 투여될 수 있다.
방사선 요법과 병용되는 ADP-리보오스의 투여 경로, 용법 및 용량은 상술한 바와 같고, 직접적인 방사선 요법 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이 화학 요법을 병용할 수 있다.
3. 항암 치료를 위한 화학 요법과 ADP-리보오스의 병용
본 발명자는 화학 요법과 ADP-리보오스를 병용할 경우 항암 치료의 효과가 현저히 상승함을 발견하였다. 따라서 본 발명은 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 화학 요법의 항암 보조제 또는 민감화제; (i) ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 (ii) 제2 항암제를 포함하는 항암용 조성물 또는 조합물; 치료적 유효량의 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 제2 항암제를 병용 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명은 화학 요법의 항암 보조제는 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제로서, 항암제와 함께 사용될 경우 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다.
ADP-리보오스와 병용될 수 있는 항암제
본 발명에서, 화학요법은 1종 이상의 화학 요법제를 항암제로 사용하는 암 치료 방법이다. 본 발명에서 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 병용될 수 있는 제2 항암제는 암의 종류와 진행 정도에 따라 암의 완치, 조절, 증상 완화를 위해 적절한 종류를 선택할 수 있으며, 예컨대, 세포독성 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제, 대사 항암제 또는 이들의 조합에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서, 세포독성 항암제는 정상 세포에 비해 빠른 속도로 무분별하게 분열하는 암세포를 공격하여 항암효과를 나타내는 약물로, 그 의미는 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같다. 상기 세포독성 항암제는 알킬화제, 항 대사제 (antimetabolite), 천연물 항암제를 포함한다.
상기 알킬화제는 질소 머스타드(예컨대, 시클로포스파미드, 클로르메틴, 우라머스틴, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 벤다머스틴 등), 알킬 설포네이트(예컨대, 부설판, 프로카바진 등), 니트로소우레아(예컨대, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신 등), 백금 기반 알킬화제(예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 디시클로플라틴, 엡타플라틴, 로바플라틴, 미리플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 피코플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트 등)을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 알킬화제는 암 세포 내 DNA에 결합하여 DNA 구조를 손상시킴으로써 암 세포의 파괴를 유발할 수 있다.
상기 항 대사제(antimetabolite)는 피리미딘 유도체(예컨대, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 시스타라빈, 젬시타빈, 플루다라빈 등), 폴레이트 유도체(예컨대, 메토트렉세이트, 페메트렉시드 등), 퓨린 유도체(예컨대, 머캅토퓨린 등)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항 대사제는 DNA 복제 및 세포 생존에 필요한 대사를 억제함으로써 암 세포 사멸을 유도할 수 있다.
상기 천연물 항암제로는 토포이소머라제 억제제(캄프토테신, 에피포도필로톡신, 탁산 계열 약물), 항생제(예컨대, 닥티노마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 마이토마이신, 플레오마이신, 이다루비신, 미톡산트론 HCl 등)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 표적 항암제는 암의 성장에 관여하는 타겟 단백질(수용체 또는 효소)를 억제함으로써 암 세포의 사멸을 유도하는 항암제로, 그 의미는 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같다. 상기 세포독성 항암제는 표적 단백질(티로신 키나아제 등) 억제 저분자 화합물 및 단클론항체를 포함한다.
본 발명에서, 표적 항암제는 VEGF/VEGFR, EGFR, 및 HER2로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 타겟을 표적하는 수용체 티로신 키나아제 억제제일 수 있다.
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 VEGF/VEGFR 억제제이다. 본 발명에서, VEGF/VEGFR 억제제는 악시티닙(axitinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 라파티닙(lapatinib), 렌바티닙(lenvatinib), 파조파닙(pazopanib), 레고라페닙(regorafenib), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 반데타닙(vandetanib)과 같은 저분자 화합물과 함께 베바시주맙(bevacizumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab)과 같은 단클론 항체를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 ADP-리보오스와 VEGF/VEGFR 억제제의 병용 투여에 의해 치료될 수 있는 암은 고형암이고, 바람직하게는 뇌암 또는 간암이다.
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 EGFR 억제제이다. 본 발명에서, EGFR 억제제는 오시머티닙(osimertinib), 제피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 아파티닙(afatinib), 브리가티닙(brigatinib), 이코티닙(icotinib), 반데타닙(vandetanib)과 같은 저분자 화합물과 함께 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 마투주맙(matuzumab)과 같은 단클론 항체를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 ADP-리보오스와 EGFR 억제제의 병용 투여에 의해 치료될 수 있는 암은 고형암이고, 바람직하게는 폐암이다.
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 HER2 억제제이다. 본 발명에서, HER2 억제제는 라파니팁(lapatinib), 네라티닙(neratinib), 아파티닙(afatinib)과 같은 저분자 화합물과 함께 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 마르게툭시맙(margetuximab)과 같은 단클론 항체를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 ADP-리보오스와 HER2 억제제의 병용 투여에 의해 치료될 수 있는 암은 고형암이고, 바람직하게는 유방암이다.
이외에도 본 발명의 표적 항암제는 또한, 이매티닙(imatinib), 다사티닙(dasatinib), 닐로티닙(nilotinib)과 같은 Bcr-Abl 표적 항암제; 보수티닙(bosutinib)과 같은 Src 표적 항암제; 레스타우르티닙(lestaurtinib), 룩소리티닙(ruxolitinib), 파크리티닙(pacritinib)과 같은 JAK 표적 항암제; 코비메티닙(cobimethinib, selumetinib, trametinib, binimetinib)과 같은 MAP2 Kinase 표적 항암제; 세리티빈(ceritibin), 크리조티닙(crizotinib)과 같은 MEL4-ALK 표적 항암제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 항암제는 1종 이상의 세포 독성 항암제 및/또는 표적 항암제의 조합일 수 있으며, 이들은 동시에 또는 이시에 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 제2 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 면역항암요법(cancer immunotherapy)은 면역항암제를 통해 인체의 면역체계를 활성화시켜 암세포와 싸우게 하는 암 치료방법이다. 본 발명에서 면역항암제는 면역체크포인트 억제제, 면역세포치료제, 항암백신, 항체-약물접합체를 포함하며, 암의 종류와 진행 정도에 따라 암의 완치, 조절, 증상 완화를 위해 적절한 종류를 선택할 수 있다.
일 실시양태에서, 면역항암제는 면역체크포인트 억제제일 수 있으며, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, CD28 항체, KIR 항체, TCR 항체, LAG-3 항체, TIM-3 항체, TIGIT 항체, A2aR 항체, ICOS 항체, OX40 항체, 4-1BB 항체 및 GITR 항체로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 면역체크포인트 억제제는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 세미플리맙(cemiplimab), 피딜리주맙(pidilizumab), 토리팔리맙(toripalimab)과 같은 PD-1 항체; 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 두랄루맙(duralumab)과 같은 PD-L1 항체; 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab)과 같은 CTLA-4 항체이거나 이들 모두일 수 있다.
일 실시양태에서, 면역항암제는 세포치료제일 수 있으며, 티사젠레클류셀(tisagenlecleucel), 악시캅타젠 실로류셀(ciloleucel)과 같은 CAR-T 치료제 또는 CAR-NK 치료제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 대사 항암제는 암 세포에 영양을 공급하는 등 암 세포의 성장 및 생존에 관여하거나 필수적인 여러 대사작용에 관여하여 암 세포를 사멸시키는 약물을 말한다. 상기 대사항암제는 예컨대 IM-156, 3-브로모피루브산 (3BP), NYH817100, WZB117, GNE-140, AZ93, AZD3965, CPI-613, MKT-077, CB-839, CB-1158, CPI-444, TVB-2640, NDI-010976, TCD-717, ADI-PEG20, 에파카도스탯 (Epacadostat), 인독시모드 (Indoximod), PX478, CPI-0610, RTA402, APO866, GMX1778, AG-221 또는 AG-120 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 ADP-리보오스는 제2 항암제와 독립적으로 존재하는 형태로 병용투여될 수 있을 뿐만 아니라, 목적에 따라 공지된 임의의 방법으로 제2 항암제와 물리/화학적인 결합을 형성한 상태에서 투여될 수 있다. 예컨대, ADP-리보오스는 제2 항암제와 직접 결합된 상태로 사용되거나, 또는 공지의 링커를 통해 제2 항암제와 연결된 상태로 사용될 수 있으며, 본 발명의 ADP-리보오스가 제2 항암제와 함께 작용하여 상승된 항암 효과를 나타내는 한 그 적용 방법에 특별히 제한되지 않는다.
항암제와 병용된 ADP-리보오스의 상승적 항암 효과
본 발명에 따른 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 화학 요법과 병용될 경우 상승적 항암 효과를 나타내므로 화학 요법에 대한 항암 보조제 또는 항암 요법 민감화제로 유용하게 활용될 수 있다. 상기 항암 보조제 또는 화학 요법 민감화제에서 암은 상술한 고형암일 수 있다. 상기 고형암은 방사선 요법에 대해 내성을 나타내는 고형암일 수 있다.
기존 항암제에 의한 암 세포 생존의 감소 등으로 대표되는 항암 효과는 ADP-리보오스의 신호에 의해 유도될 수 있으며 기존 항암제에 의한 사멸 과정에서 ADP-리보오스를 적극적으로 활용할 수 있도록 유도하여 주면 기존 항암제를 필요 농도 이하로 처리하더라도 상승된 항암 효과를 기대할 수 있다. 구체적으로, 본 발명자는 ADP-리보오스와 제2 활성제의 병용 투여 시 각종 고형암(뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암)에 대해 상승적 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 5; 도 14, 실시예 6; 도 15).
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 세포독성 항암제는 항 대사제 항암제일 수 있고, 구체적으로 피리미딘 유도체일 수 있으며, 보다 구체적으로 젬시타빈 또는 5-플루오로우라실일 수 있다. 이 경우, 상기 병용 요법에 따라 치료될 수 있는 암은 고형암이고, 구체적으로 췌장암 또는 대장암이다. 본 발명자는 ADP-리보오스와 젬시타빈의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과를 췌장암에서 확인하였고(실시예 5-3; 도 14C; 실시예 6-3; 도 15C), ADP-리보오스와 5-FU와 ADP-리보오스의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과를 대장암에서 확인하였다(실시예 5-6; 도 14F).
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 VEGF/VEGFR 억제제일 수 있고, 구체적으로 항-VEGF 단클론 항체일 수 있다. 이 경우, 치료 가능한 암은 고형암, 구체적으로 뇌암 또는 간암일 수 있다. 본 발명자는 본 발명자는 ADP-리보오스와 항-VEGF 단클론 항체인 베바시주맙의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과를 뇌암에서 확인하였고(실시예 5-1; 도 14A, 실시예 6-1; 도 15A), ADP-리보오스와 소라페닙의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과를 간암에서 확인하였다(실시예 5-4; 도 14D, 실시예 6-4 도 15D).
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 EGFR 억제제일 수 있고, 구체적으로 저분자 EGFR 억제제일 수 있다. 이 경우, 치료 가능한 암은 고형암, 구체적으로 폐암일 수 있다. 본 발명자는 ADP-리보오스와 EGFR 억제제인 오시머티닙의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과를 폐암에서 확인하였다(실시예 5-2; 도 14B, 실시예 6-2; 도 15B).
일 실시양태에서, ADP-리보오스와 병용 투여될 수 있는 표적 항암제는 HER2 억제제일 수 있고, 구체적으로 항-HER2 단클론 항체일 수 있다. 이 경우, 치료 가능한 암은 고형암, 구체적으로 유방암일 수 있다. 본 발명자는 ADP-리보오스와 항-HER2 단클론 항체인 트라스투주맙의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과를 폐암에서 확인하였다(실시예 5-5; 도 14E).
투여 경로, 용법 및 용량
본 발명의 항암 조성물 또는 조합물에서, ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 제2 항암제는 동시 또는 이시에 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 조성물 또는 조합물은 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제2 항암제의 항암 요법 전 또는 후에 투여될 수 있다. 각각의 요법은 투여 사이클을 1회 또는 수 회 반복하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 종양 마우스 모델을 대상으로 상승적 항암 효과를 확인한 제2 항암제와 ADP-리보오스의 투여 스케쥴(도 15)은 아래 표 1과 같으며, 본 발명의 항암 조성물과 제2 항암제의 바람직한 환자 투여 용량은 본 발명에서 구체적으로 확인된 최적의 마우스 투여 용량과 마우스-인간 간 용량-반응 관계(dose-response relationship) 및 NOAEL(No-observed-adverse-effect level) 등을 고려하여 환산될 수 있다.
[표 1]
본 발명에 따른 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 제2 항암제는 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 각각 투여될 수 있다. 각각의 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
4. 항암 치료를 위한 ADP-리보오스 제제
상술한 항암 조성물에 포함되는 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 중량%는 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 90 중량%, 구체적으로 0.001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
또한, 상기 항암 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 항암 조성물이 약학 조성물의 형태로 제조될 경우, 상기 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하여 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 투여경로의 제제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 경구투여용 제제로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 정제(예컨대, 구강붕해정, 추어블정, 발포정, 분산정, 용해정), 캡슐제(예컨대, 경질캡슐제, 연질캡슐제), 과립제(예컨대, 서방성과립제, 장용성 과립제, 발표과립제), 산제, 경구용 액제(예컨대, 엑릭서제, 현탁제, 유제, 레모네이드제, 방향수제, 전제 및 침제, 주정제, 틴크제), 시럽제, 경구용 젤리제, 다제, 엑스제(예컨대, 연조엑스제, 건조엑스제), 유동엑스제, 환제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 구강투여용 제제로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 구강용 정제(예컨대, 트로키제, 설하정, 박칼정, 부착정, 껌제), 구강용 액제(예컨대, 가글제), 구강용 스프레이제, 구강용 반고형제(예컨대, 구강용 크림제, 구강용 겔제, 구강용 연고제), 구강용해필름으로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다. 이 경우, 주사제는 앰플, 바이알, 프리필드실린지, 카트리지 형태 등으로 제조될 수 있고, 보다 구체적으로 수액제, 동결건조주사제, 분말주사제, 이식제, 지속성주사제), 투석 및 관류용 제제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 투석 및 관류용 제제로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 투석제(예컨대, 복막투석제, 혈액투석제), 관류제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 기관지, 폐 투여용 제제로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 흡입제(예컨대, 흡입분말제, 흡입액제, 흡입에어로솔제)로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 안구 투여용 제제로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 점안제, 안연고제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 코에 투여하는 제제(예컨대 점비분말제, 점비액제)로 제조되거나, 관장제, 직장 투여 제제(예컨대, 좌제, 직장용반고형제, 관장제)로 제조되거나, 질에 적용되는 제제(예컨대, 질정, 질용좌제), 피부 적용 제제(예컨대, 외용고형제, 외용액제, 에어로졸제, 연고제, 크림제, 겔제, 경피흡수제, 카타플라스마제, 첩부제, 페이스트제)로 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물이 경구 투여용으로 사용될 경우, 적절한 캡슐화(encapsulation), 장용 코팅(enteric coating), 폴리머의 배합 등을 통해 서방성 제제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서 상기 서방성 제제는 장기 작용성(long acting) 제제로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 장기 작용성 제제에는 폴리머와 지질이 적절한 비율로 혼합될 수 있다.
본 발명의 항암 조성물이 식품 조성물의 형태로 제조될 경우, 상기 식품 조성물은 식품에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품으로 제조될 수 있으며, 여기서 건강기능성 식품(functional food)이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 상기 건강기능성 식품은 암의 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 단독 또는 방사선 요법 및/또는 화학 요법과 병용되어 효과적인 항암 치료 효과를 나타낼 뿐 아니라 정상 세포에 대한 독성을 나타내지 않아, 항암 요법에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 각종 고형암(A: U-87MG, B: H1975, C: AsPC-1, D: Hep G2, E: MDA-MB-231, F: HCT116, G: Caki-1 세포주) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 세포내 ADP-리보오스가 축적된 것을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 뇌암(U-87MG) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 3은 폐암(H1975) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 4는 췌장암(AsPC-1) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 5는 간암(Hep G2) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 6은 유방암(MDA-MB-231) 세포에서 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 7은 대장암(HCT116) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 8은 신장암(Caki-1) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포 성장 억제 및 사멸 효과를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 9는 췌장암(AsPC-1) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포의 침투 및 전이 능력의 감소를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 10은 유방암(MDA-MB-231) 세포에 ADP-리보오스 처리 후 암세포의 침투 및 전이 능력의 감소를 확인한 현미경 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 11은 췌장암 세포주로 유발된 이종 이식 동물모델에서 ADP-리보오스 피하 주사(S.C) 후 종양 부피의 감소 효과를 나타낸 그래프(A) 및 현미경 사진(B)이다.
도 12는 신장암 세포주로 유발된 이종 이식 동물모델에서 ADP-리보오스 정맥 주사(I.V) 후 종양 부피의 감소 효과를 나타낸 그래프(A) 및 현미경 사진(B)이다.
도 13은 췌장암 세포주로 유발된 이종 이식 동물모델에서 ADP-리보오스 경구 투여(P.O) 후 종양 부피의 감소 효과를 나타낸 그래프(A) 및 현미경 사진(B)이다.
도 14는 각종 고형암(A: U-87MG, B: H1975, C: AsPC-1, D: Hep G2, E: MDA-MB-231, F: HCT116) 세포에 저용량의 항암제(A: 베바시주맙, B: 오시머티닙, C: 젬시타빈, D: 소라페닙, E: 허셉틴, F: 5-플루오로우라실)과 ADP-리보오스를 병용 처리하였을 때 상승적 세포 사멸 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 종양 유발 동물에 저용량의 항암제(A: 베바시주맙, B: 오시머티닙, C: 젬시타빈, D: 소라페닙)와 ADP-리보오스를 병용 투여하였을 때 상승적 종양 부피 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 고형암(A: U-87MG, B: Caki-1, C: AsPC-1, D: MDA-MB-231) 세포에 방사선을 조사했을 때와 ADP-리보오스를 처리했을 때 세포내 ADP-리보오스 축적량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 고형암(A: U-87MG, B: H1975, C: AsPC-1, D: Hep G2, E: MDA-MB-231, F: HCT116, G: Caki-1) 세포에 방사선 조사 내성을 보이는 선량과 ADP-리보오스를 병용 처리하였을 때 상승적 세포 사멸 효과를 확인한 그래프이다.
도 18은 종양 유발 동물에 저 선량의 방사선 조사와 ADP-리보오스를 병용 투여하였을 때 상승적 종양 부피 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 정상 세포(A, B: Human colon fibroblast, C, D: Human hair dermal papilla cell)에 ADP-리보오스를 투여한 후 세포 독성이 나타나는지 여부를 확인한 사진 및 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. ADP-리보오스 및 항암제 준비
ADP-리보오스 및 베바시주맙, 오시머티닙, 젬시타빈, 소라페닙, 허셉틴, 5-플루오로우라실 항암제들은 모두 Sigma 사에서 주문하였다 (St Luois, MO, USA). ADP-리보오스와 모든 항암제는 활용하기 전까지 -20℃ 냉동 보관하였다.
2. 세포주의 준비
뇌암(U-87MG), 폐암(H1975), 췌장암(Aspc-1), 간암(Hep G2), 유방암(MDA-MB-231), 대장암(HCT116), 신장암(Caki-1) 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)사에서 주문하였으며 연구에 활용 전까지 액체질소에 보관하였다.
3. ADP-리보오스 정량 분석
5×105개의 뇌암(U-87MG), 폐암(H1975), 췌장암(Aspc-1), 간암(Hep G2), 유방암(MDA-MB-231), 대장암(HCT116), 신장암(Caki-1) 세포를 각각의 적정 배지에 10% 우태아 혈청+100 units/ml 페니실린+100 μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 아무것도 처리하지 않은 그룹, ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 인산완충생리식염수로 세포를 세척한 후 RIPA buffer를 넣고 20분간 얼음 위에 방치하였다. 세포를 긁어모은 후 원심분리기 튜브에 넣고 10,000g, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 획득하여 1%의 SDS를 첨가한 뒤 100℃에서 5분간 끓여주고 얼음에 식혔다. 상층액을 10,000g, 4℃ 조건에서 10분간 재 원심분리 하여 최종 상층액을 획득하였고 ELISA 분석 키트를 (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA) 활용하여 ADP-리보오스를 정량 분석하여 비교하였다.
4. 암세포 사멸 검증
96-웰 플레이트에 3×103개의 뇌암(U-87MG), 폐암(H1975), 췌장암(Aspc-1), 간암(Hep G2), 유방암(MDA-MB-231), 대장암(HCT116), 신장암(Caki-1) 세포를 각각 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 각 농도의 ADP-리보오스를 각각의 암 세포에 처리하였다. 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 처리하지 않은 세포 대비 반수치사율 및 최대치사율의 농도를 구하였다.
5. 암세포 전이 및 침투능 억제 검증
8.0μm 기공 크기 폴리카보네이트 막 필터를 갖는 트란스웰을 사용하여 암세포의 전이 및 침투능을 분석하였다. 트란스웰을 24-웰 플레이트에 넣고, 각 웰에 췌장암(Aspc-1) 및 유방암(MDA-MB-231) 세포를 각 웰당 3.5×105 세포의 밀도로 삽입물의 상면에 뿌리고 아무것도 처리하지 않은 그룹과 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나눠 37℃, 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 트란스웰을 멸균수로 조심스럽게 세척 한 다음, 100% 메탄올에 넣어 붙어있는 세포를 고정시켰다. 고정 후, 세포를 관찰하기 위해 헤마톡실린 및 에오신 시약으로 염색하였으며 아무것도 처리하지 않은 그룹 대비 삽입물의 상면을 투과하여 하면으로 전이 및 침투한 세포의 비율을 구하였다.
6. 동물의 준비
5주령의 BALB/c nude 마우스를 Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA)에서 주문하였다. 사육시설은 특정 병소가 없는 환경으로 온도는 22-25℃, 주야 사이클은 12시간 주기로 (오전 8시 전등 점등) 유지하였으며, 사료와 음수는 자율 배식하였다. 모든 동물 연구는 동물연구윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.
7. 이종이식 모델에서 ADP-리보오스의 투약 경로 및 농도에 따른 항암 효능 검증
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 췌장암(AsPC-1) 또는 신장암(caki-1) 세포 (1 × 107개)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 종양 부피의 약 150 mm3까지 성장 시켰다. 그리고 3가지 농도의 ADP-리보오스를 주 3회 피하 주사, 정맥 주사, 구강 투여하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 6일 간격으로 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 각 군별로 비교하였다.
8. 암 세포에서 항암제 병용에 따른 사멸 검증
96-웰 플레이트에 3×103개의 뇌암(U-87MG), 폐암(H1975), 췌장암(Aspc-1), 간암(Hep G2), 유방암(MDA-MB-231), 대장암(HCT116) 세포를 각각 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 뇌암(U-87MG)을 대상으로 15mM의 베바시주맙, 폐암(H1975)을 대상으로 1nM의 오시머티닙, 췌장암(Aspc-1)을 대상으로 1μM의 젬시타빈, 간암(Hep G2)을 대상으로 1μM의 소라페닙, 유방암(MDA-MB-231)을 대상으로 2.5μM의 허셉틴, 그리고 대장암(HCT116)을 대상으로 10μM의 5-플루오로우라실을 단독 또는 ADP-리보오스와 병용 처리하였다. 처리 후 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 사멸 정도를 비교하였다.
9. 이종이식 모델에서 항암제 병용에 따른 항암 효능 검증
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 뇌암(U-87MG), 폐암(H1975), 췌장암(AsPC-1), 또는 간암(Hep G2) 세포 (1 × 107개)를 각각 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 종양의 부피가 약 150 mm3로 성장하는 시점에서 대조군 (Control), 항암제 단독처리군, 병용처리군 으로 분류하였다. 뇌암(U-87MG) 연구를 위해 25mg/kg 저 용량의 베바시주맙을 주 2회 복강으로, 폐암(H1975)연구를 위해 1mg/kg 저 용량의 오시머티닙을 주 2회 구강으로, 췌장암(AsPC-1)연구를 위해 50mg/kg 저 용량의 젬시타빈을 주 2회 복강으로, 간암(Hep G2) 연구를 위해 10mg/kg 저 용량의 소라페닙을 주 5회 구강으로 단독 또는 기 서술된 각각의 항암제와 10mg/kg의 ADP-리보오스 (피하투여, 주 3회)를 병용 투여하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 6일 간격으로 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
10. 암 세포에서 방사선 병용에 따른 ADP-리보오스 정량 분석
6-웰 플레이트에 뇌암(U-87MG), 신장암(Caki-1), 췌장암(AsPC-1), 또는 유방암(MDA-MB-231) 세포를 각각 배양하여 아무것도 처리하지 않은 그룹, 방사선을 처리한 그룹, ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 분류하였다. 방사선 조사는 X-Rad 320 조사기 (Precision X-ray, North Branford, CT, USA)를 활용하여 수행하였으며, 12.5mA 및 2.0mm Al로 구성된 X선 빔 필터를 사용하여 300kVp, 150cGy/min의 선량률로 총 1, 2, 5 Gy를 각각 암 세포에 처리하였다. 처리 전 및 처리 후 4, 8, 16, 24 시간에 배지를 제거하고 인산완충생리식염수로 세포를 세척한 후 RIPA buffer를 넣고 20분간 얼음 위에 방치하였다. 세포를 긁어모은 후 원심분리기 튜브에 넣고 10,000g, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 획득하여 1%의 SDS를 첨가한 뒤 100℃에서 5분간 끓여주고 얼음에 식혔다. 상층액을 10,000g, 4℃ 조건에서 10분간 재 원심분리 하여 최종 상층액을 획득하였고 ELISA 분석 키트를 활용하여 (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA) ADP-리보오스를 정량 분석하였다.
11. 암 세포에서 방사선 조사 병용에 따른 사멸 검증
96-웰 플레이트에 3×103개의 뇌암(U-87MG), 폐암(H1975), 췌장암(Aspc-1), 간암(Hep G2), 유방암(MDA-MB-231), 대장암(HCT116), 신장암(Caki-1) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 ADP-리보오스나 2, 5 Gy 선량의 방사선을 단독 또는 ADP-리보오스와 2 Gy선량의 방사선을 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 사멸정도를 비교하였다.
12. 이종이식 모델에서 방사선 조사 병용에 따른 항암 효능 검증
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 뇌암(U-87MG), 췌장암(AsPC-1), 유방암(MDA-MB-231) 또는 신장암(Caki-1) 세포 (1 × 107개)를 각각 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 종양의 부피가 약 150 mm3로 성장하는 시점에서 대조군(Control), 2 Gy 선량의 방사선 단독, 2 Gy 선량 방사선 + 10 mg/kg의 ADP-리보오스 (피하투여, 주 3회)를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 마우스에 방사선 조사는 X-Rad 320 조사기 (Precision X-ray, North Branford, CT, USA)를 통해 수행되었으며 정해진 방사선량을 조사하기 위해 방사선원에서 적정 거리를 유지하여 마우스를 배치하였다. 마우스의 암 발생부위 외 다른 신체 부위나 장기에 방사선의 피폭으로부터 보호하기 위해 납 차폐물이 사용되었다. 12.5mA 및 2.0mm Al로 구성된 X선 빔 필터를 사용하여 300kVp, 150cGy/min의 선량률로 총 2 Gy의 방사선을 1 Gy 2회 분획하여 (2 일간) 조사하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 6일 간격으로 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
13. 통계적 유의성 분석
모든 그래프는 평균±표준 편차로 구해진 값으로 표시되었다. 통계적 유의성은 데이터가 정규화 되었는지 여부에 따라 Student's t-test 분석을 사용하여 분석되었다. P<0.05 이상의 차이를 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였으며, 통계적 유의성 분석을 위해 Systat Software 사의 프로그램을 활용하였다 (Sigmastat ver. 3.5, Systat Software Inc., Chicago, IL, USA).
실시예 1: 암 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
실시예 1-1: U-87MG 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 U-87MG 세포를 Eagle's Minimum Essential Medium배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 8 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 뇌암 세포(U-87MG)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 A).
실시예 1-2: H1975 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 H1975 세포를 RPMI-1640배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 4 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 폐암 세포(H1975)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 B).
실시예 1-3: AsPC-1 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 AsPC-1 세포를 RPMI-1640배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 8 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 췌장암 세포(AsPC-1)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 C).
실시예 1-4: Hep G2 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 Hep G2 세포를 Eagle's Minimum Essential Medium배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 8 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 간암 세포(Hep G2)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 D).
실시예 1-5: MDA-MB-231 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 MDA-MB-231 세포를 Leibovitz's L-15 배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 16 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 유방암 세포(MDA-MB-231)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 E).
실시예 1-6: HCT116 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 HCT116 세포를 McCoy’s 5A 배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 8 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 대장암 세포(HCT116)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 F).
실시예 1-7: Caki-1 세포 내 ADP-리보오스 수준의 변화
5×105개의 Caki-1 세포를 McCoy’s 5A 배지에 10% 우태아 혈청+100units/ml 페니실린+100μg/ml 스트렙토마이신을 섞어 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하지 않은 그룹, 16 μM의 ADP-리보오스를 처리한 그룹으로 나누어 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 준비된 상층액을 ELISA 분석에 활용하여 ADP-리보오스를 검출 분석하였다.
그 결과, 신장암 세포(Caki-1)에 ADP-리보오스 처리 시 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게(P<0.001) ADP-리보오스의 양이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 1의 G).
이상을 정리하면 실시예 1을 통해 각종 고형암(뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암) 세포에서 외부 ADP-리보오스 처리에 의해 세포내 ADP-리보오스 농도를 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 1).
실시예 2: ADP-리보오스 농도에 따른 암 세포 생존률의 변화
실시예 2-1: U-87MG 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 U-87MG 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 최종 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 뇌암 세포(U-87MG)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 뇌암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 2의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 8μM의 농도에서 뇌암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 거의 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 2의 B).
실시예 2-2: H1975 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 H1975 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 폐암 세포(H1975)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 폐암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 3의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 2μM의 농도에서 폐암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 거의 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 3의 B).
실시예 2-3: AsPC-1 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 AsPC-1 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 췌장암 세포(AsPC-1)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 췌장암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 4의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 2μM의 농도에서 췌장암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 거의 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 4의 B).
실시예 2-4: Hep G2 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 Hep G2 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 간암 세포(Hep G2)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 간암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 5의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 4μM의 농도에서 간암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 5의 B).
실시예 2-5: MDA-MB-231 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 MDA-MB-231 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 유방암 세포(MDA-MB-231)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 유방암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 6의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 16μM의 농도에서 유방암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 거의 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 6의 B).
실시예 2-6: HCT116 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 HCT116 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 대장암 세포(HCT116)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 대장암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 7의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 8μM의 농도에서 대장암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 거의 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 7의 B).
실시예 2-7: Caki-1 세포에서 ADP-리보오스 농도 증가에 따른 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 Caki-1 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32μM 농도의 ADP-리보오스를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, ADP-리보오스를 처리하지 않은 대조군에서는 신장암 세포(Caki-1)가 급격히 성장하고 있는 형태를 현미경으로 관찰한 반면, ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 신장암 세포의 성장이 억제되고 사멸하는 것을 확인하였다(도 8의 A). ADP-리보오스 처리 농도에 따른 반수치사량 및 최대치사량을 정량적으로 측정한 결과, 16μM의 농도에서 신장암 세포의 절반 정도가 사멸되고, 32μM에서는 거의 모든 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 8의 B).
이상을 정리하면 실시예 2의 세포 실험을 통해 ADP-리보오스가 각종 고형암(뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암, 신장암) 세포에 대한 항암 효과가 있음을 확인하였다(도 2 내지 8).
실시예 3: ADP-리보오스에 의한 전이 암 세포 전이 및 침투 능력의 변화
암 세포의 성장이 억제되고 사멸이 유도되면 암 세포의 전이 능력이나 침투능력에도 영향을 받을 수 있다. 상기 실시예 2와 같이 ADP-리보오스의 처리에 의해 암 세포의 성장 억제 및 사멸 유도의 효과를 명확히 관찰하였으므로 ADP-리보오스의 처리가 암 세포의 전이 및 침투 능력의 감소를 유도할 것으로 기대할 수 있다.
실시예 3-1: AsPC-1 세포에서 ADP-리보오스에 의한 전이 및 침투 능력의 변화
8.0μm 기공 크기 폴리카보네이트 막 필터를 갖는 트란스웰을 사용하여 분석이 수행되었다. 트란스웰을 24-웰 플레이트에 넣고, 각 웰에 AsPC-1 세포를 각 웰당 3.5×105 세포의 밀도로 삽입물의 상면에 뿌리고 37℃, 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양 하였다. 배양 후, 트란스웰을 멸균수로 조심스럽게 세척 한 다음, 100% 메탄올에 넣어 붙어있는 세포를 고정시켰다. 고정 후, 세포를 관찰하기 위해 헤마톡실린 및 에오신 시약으로 염색하였다.
그 결과, 대조군에서는 트란스웰 상부에서 하부로의 췌장암 세포(AsPC-1) 침투 및 전이가 쉽게 관찰되는 반면, 16 μM의 ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 췌장암 세포의 침투 및 전이가 현저히 억제되었음을 확인하였다(도 9의 A). ADP-리보오스의 췌장암 세포에 대한 전이 및 침투 억제 효과를 정량적으로 측정한 결과, 대조군 대비 유의성 있게(P<0.001) 전이 및 침투 능력이 현저히 감소하였음을 확인하였다(도 9의 B).
실시예 3-2: MDA-MB-231 세포에서 ADP-리보오스에 의한 전이 및 침투 능력의 변화
8.0μm 기공 크기 폴리카보네이트 막 필터를 갖는 트란스웰을 사용하여 분석이 수행되었다. 트란스웰을 24-웰 플레이트에 넣고, 각 웰에 MDA-MB-231 세포를 각 웰당 3.5×105 세포의 밀도로 삽입물의 상면에 뿌리고 37℃, 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양 하였다. 배양 후, 트란스웰을 멸균수로 조심스럽게 세척 한 다음, 100% 메탄올에 넣어 붙어있는 세포를 고정시켰다. 고정 후, 세포를 관찰하기 위해 헤마톡실린 및 에오신 시약으로 염색하였다.
그 결과, 대조군에서는 트란스웰 상부에서 하부로의 유방암 세포(MDA-MB-231) 침투 및 전이가 쉽게 관찰되는 반면, 32 μM의 ADP-리보오스를 처리한 실험군에서는 유방암 세포의 침투 및 전이가 현저히 억제되었음을 확인하였다(도 10의 A). ADP-리보오스의 유방암 세포에 대한 전이 및 침투 억제 효과를 정량적으로 측정한 결과, 대조군 대비 유의성 있게(P<0.001) 전이 및 침투 능력이 현저히 감소하였음을 확인하였다(도 10의 B).
이상을 정리하면 실시예 3을 통해 ADP-리보오스가 고형암(췌장암, 유방암) 세포의 전이 및 침투 능력을 억제함으로써, 전이성 암에 대한 치료 효과가 우수하다는 점을 확인하였다(도 9 내지 10).
실시예 4: 동물모델을 이용한 ADP-리보오스의 농도 및 투여 경로에 따른 항암 효능효과 비교 및 검증
실시예 4-1: 다양한 농도의 ADP-리보오스를 피하 경로로 주사한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 췌장암(AsPC-1) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 2, 20, 및 40 mg/kg의 ADP-리보오스를 피하 경로로 주사하는 4가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150 mm3까지 성장 했을 때, 각 농도의 ADP-리보오스를 주 3회 피하 주사했다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 주사된 췌장암의 부피를 측정한 결과, 최종 투약 후 대조군 종양의 최종 부피는 약 2155.8mm3 이었으며 2, 20, 및 40mg/kg의 ADP-리보오스를 피하 경로로 주사한 군의 최종 종양 부피는 각각 1015.8mm3, 496.6mm3, 336.2mm3으로 모든 투약 그룹에서 대조군 대비 통계적으로 유의성 있게 (P<0.001) 종양의 부피가 감소하였다. 구체적으로, 2mg/kg의 ADP-리보오스를 피하 주사한 군과 대비하여 20mg/kg의 ADP-리보오스를 피하 주사한 군의 종양의 부피가 유의성 있게 (P<0.001) 감소되어 있었고 40mg/kg의 ADP-리보오스를 피하 주사한 군의 종양의 부피가 제일 작았으며 2 mg/kg ADP-리보오스를 피하 주사한 군과 대비하여 통계적 유의성 있는 (P<0.001) 감소를 나타냈다(도 11의 A, B).
실시예 4-2: 다양한 농도의 ADP-리보오스를 정맥 주사한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 신장암(caki-1) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 2, 10, 및 20 mg/kg의 ADP-리보오스를 정맥 주사하는 4가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150 mm3까지 성장 했을 때, 각 농도의 ADP-리보오스를 주 3회 정맥 주사했다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 주사된 신장암의 부피를 측정한 결과, 최종 투약 후 대조군 종양의 최종 부피는 약 2074.9mm3 이었으며 2, 10, 및 20mg/kg의 ADP-리보오스를 정맥 주사한 군의 최종 종양 부피는 706.7mm3, 331.7mm3, 227.2mm3으로 모든 주사 그룹에서 대조군 대비 통계적으로 유의성 있게 (P<0.001) 종양의 부피가 감소하였다. 구체적으로, 2mg/kg의 ADP-리보오스를 정맥 주사한 군과 대비하여 20mg/kg의 ADP-리보오스를 정맥 주사한 군의 종양의 부피가 유의성 있게 (P<0.001) 감소되어 있었고 20mg/kg의 ADP-리보오스를 정맥 주사한 군의 종양의 부피가 제일 작았으며 2mg/kg ADP-리보오스를 정맥 주사한 군과 대비하여 통계적 유의성 있는 (P<0.001) 감소를 나타냈다(도 12의 A, B).
실시예 4-3: 다양한 농도의 ADP-리보오스를 구강 투여한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 췌장암(AsPC-1) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 10, 40, 및 80 mg/kg의 ADP-리보오스를 구강 투여하는 4가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150 mm3까지 성장 했을 때, 각 농도의 ADP-리보오스를 주 5회 구강 투여했다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 주사된 췌장암의 부피를 측정한 결과, 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 3194.3mm3 이었으며 10, 40, 및 80mg/kg의 ADP-리보오스를 구강 투여한 군의 최종 종양 부피는 1798.6mm3, 1175.9mm3, 1056.9mm3으로 모든 구강 투여 그룹에서 대조군 대비 통계적으로 유의성 있게 (P<0.001) 종양의 부피가 감소하였다. 10 mg/kg의 ADP-리보오스를 구강 투여한 군과 대비하여 40 및 80mg/kg의 ADP-리보오스를 구강 주사한 군의 종양의 부피가 유의성 있게 (P<0.001) 감소되어 있었다(도 13의 A, B).
이상을 정리하면, 세포실험 결과인 실시예 2, 3에 이어 실시예 4의 동물실험을 통해 ADP-리보오스가 각종 고형암에 대한 항암 효과가 있음을 재확인하였다(도 11 내지 13).
실시예 5: ADP-리보오스와 항암제 저 농도 병용 처리에 의한 암 세포 생존률의 변화
실시예 5-1: U-87MG 세포에서 ADP-리보오스와 저 농도 베바시주맙의 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 뇌암(U-87MG) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 1.6 μM 농도의 ADP-리보오스와 15 mM의 베바시주맙을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 뇌암 세포에 베바시주맙을 단독으로 처리하였을 때에는 전체 암 세포의 약 68%가 생존하였으나, ADP-리보오스와 병용 처리할 경우 암 세포의 생존률이 약 18%로 (P<0.001) 현저히 감소됨을 확인하였다(도 14의 A).
실시예 5-2: H1975 세포에서 ADP-리보오스와 저 농도 오시머티닙의 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 폐암(H1975) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 1.6 μM 농도의 ADP-리보오스와 1nM의 오시머티닙을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 폐암 세포에 오시머티닙을 단독으로 처리하였을 때에는 전체 암 세포의 약 50%가 생존하였으나, ADP-리보오스와 병용 처리할 경우 암 세포의 생존률이 약 0.9%로 (P<0.001) 현저히 감소됨을 확인하였다(도 14의 B).
실시예 5-3: AsPC-1 세포에서 ADP-리보오스와 저 농도 젬시타빈의 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 췌장암(AsPC-1) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 1.6 μM 농도의 ADP-리보오스와 1μM의 젬시타빈을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 췌장암 세포에 젬시타빈을 단독으로 처리하였을 때에는 전체 암 세포의 약 54%가 생존하였으나, ADP-리보오스와 병용 처리할 경우 암 세포의 생존률이 약 1%로 (P<0.001) 현저히 감소됨을 확인하였다(도 14의 C).
실시예 5-4: Hep G2 세포에서 ADP-리보오스와 저 농도 소라페닙의 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 간암(Hep G2) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 1.6 μM 농도의 ADP-리보오스와 1μM의 소라페닙을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 간암 세포에 1μM의 소라페닙을 단독으로 처리하였을 때에는 전체 암 세포의 약 49%가 생존하였으나, ADP-리보오스와 병용 처리할 경우 암 세포의 생존률이 약 0.9%로 (P<0.001) 현저히 감소됨을 확인하였다(도 14의 D).
실시예 5-5: MDA-MB-231 세포에서 ADP-리보오스와 저 농도 허셉틴의 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 유방암(MDA-MB-231) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 3.2 μM 농도의 ADP-리보오스와 2.5μM의 허셉틴을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 유방암 세포에 2.5μM의 허셉틴을 단독으로 처리하였을 때에는 허셉틴 내성으로 인해 전체 암 세포의 무려 81%가 생존하였으나, ADP-리보오스와 병용 처리할 경우 암 세포의 생존률이 약 20%로 (P<0.001) 현저히 감소됨을 확인하였다(도 14의 E).
실시예 5-6: HCT116 세포에서 ADP-리보오스와 저 농도 5-플루오로우라실의 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 대장암(HCT116) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 1.6 μM/100 μl 농도의 ADP-리보오스와 10μM의 5-플루오로우라실을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 200μl의 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, 대장암 세포에 10μM의 5-플루오로우라실을 단독으로 처리하였을 때에는 전체 암 세포의 약 51%가 생존하였으나, ADP-리보오스와 병용 처리할 경우 암 세포의 생존률이 약 12%로 (P<0.001) 현저히 감소됨을 확인하였다(도 14의 F).
이상을 정리하면, 실시예 5를 통해 ADP-리보오스와 기존 항암제의 병용 투여시 고형암에 대한 상승적 항암 효과를 나타내며, ADP-리보오스가 고형암에 대한 항암제로 활용될 수 있을 뿐 아니라 기존 항암제의 항암 보조제로 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다(도 14).
실시예 6: ADP-리보오스와 저 농도 항암제를 병용 투여한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
실시예 6-1: ADP-리보오스와 저 농도 베바시주맙을 병용 투여한 뇌암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 뇌암(U-87MG) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 아바스틴(성분명 베바시주맙) 25mg/kg의 단독 복강 투여, 아바스틴 + 10mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 아바스틴은 주 2회 복강으로 투여되었고, 10mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 뇌암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과, 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2527.1mm3 이었으며 아바스틴을 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 1598.9mm3로 대조군 대비 약 37% 감소에 그친 반면 아바스틴과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 334.5mm3 으로 대조군 대비 약 87%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 아바스틴을 단독 처리한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 79% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 15의 A).
실시예 6-2: ADP-리보오스와 저 농도 오시머티닙을 병용 투여한 폐암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 폐암(H1975) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 오시머티닙인 1mg/kg의 단독 구강 투여, 오시머티닙 + 10mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 오시머티닙은 주 2회 구강으로 투여되었고, 10mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 폐암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과, 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2265.5mm3 이었으며 오시머티닙을 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 1881.9mm3로 대조군 대비 약 17% 감소에 그친 반면 오시머티닙과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 424.7mm3 으로 대조군 대비 약 81%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 오시머티닙을 단독 처리한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 77% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 15의 B).
실시예 6-3: ADP-리보오스와 저 농도 젬시타빈을 병용 투여한 췌장암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 췌장암(AsPC-1) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 젬시타빈인 50mg/kg의 단독 복강 투여, 젬시타빈 + 10mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 젬시타빈은 주 2회 복강으로 투여되었고, 10mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 췌장암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과, 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2174.3mm3 이었으며 젬시타빈을 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 1815.3mm3로 대조군 대비 약 17% 감소에 그친 반면 젬시타빈과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 444.3mm3 으로 대조군 대비 약 80%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 젬시타빈을 단독 처리한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 76% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 15의 C).
실시예 6-4: ADP-리보오스와 저 농도 소라페닙을 병용 투여한 간암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 간암(Hep G2) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 소라페닙인 10mg/kg의 단독 구강 투여, 소라페닙 + 10mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 소라페닙은 주 5회 구강으로 투여되었고, 10mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
시간의 경과에 따라 간암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과로 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2322.4 mm3 이었으며 소라페닙을 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 1849.8 mm3로 대조군 대비 약 20% 감소에 그친 반면 소라페닙과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 546 mm3 으로 대조군 대비 약 76%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 소라페닙을 단독 처리한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 70% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 15의 D).
이상을 정리하면, 실시예 5의 세포실험에 이어 실시예 6의 동물실험을 통해 ADP-리보오스와 기존 항암제의 병용 투여시 낮은 농도로 투여하더라도 고형암에 대한 상승적 항암 효과를 나타내며, ADP-리보오스가 고형암에 항암제로 활용될 수 있을 뿐 아니라 기존 항암제의 항암 보조제로도 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다(도 15).
실시예 7: 방사선 및 ADP-리보오스 처리에 의한 ADP-리보오스의 암 세포내 변화
실시예 7-1: U-87MG 세포 내 다양한 선량의 방사선 및 ADP-리보오스의 처리에 의한 ADP-리보오스의 시간에 따른 변화
U-87MG 세포를 아무것도 처리하지 않거나 (Control), 1, 2, 5Gy의 방사선을 처리하거나, ADP-리보오스를 처리한 5개의 그룹으로 나누어 0, 4, 8, 16, 24시간 동안 각각 6-웰 plate에 배양한 후 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 상층액을 준비하였다. 준비된 상층액은 ADP-리보오스의 검출을 위한 ELISA 분석에 활용하였다.
도 16의 A는 U-87MG 세포에서 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량 및 8 μM의 ADP-리보오스 처리에 따라 대조군 그룹과 대비하여 ADP-리보오스의 세포 내 증가량을 %로 나타낸 그래프로 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량을 활용한 그룹은 ADP-리보오스의 양이 4시간에 최고로 증가하였다가 8시간부터 감소하기 시작하여 24시간에 처리하지 않은 그룹과 거의 동일한 양으로 복구되고 있으나 ADP-리보오스를 처리한 그룹은 24시간이 지나더라도 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게 (P<0.001) 세포 내 ADP-리보오스의 양이 증가되어 유지되고 있음을 확인하였다(도 16의 A).
실시예 7-2: Caki-1 세포 내 다양한 선량의 방사선 및 ADP-리보오스의 처리에 의한 ADP-리보오스의 시간에 따른 변화
Caki-1 세포를 아무것도 처리하지 않거나 (Control), 1, 2, 5Gy의 방사선을 처리하거나, ADP-리보오스를 처리한 5개의 그룹으로 나누어 0, 4, 8, 16, 24시간 동안 각각 6-웰 plate에 배양한 후 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 상층액을 준비하였다. 준비된 상층액은 ADP-리보오스의 검출을 위한 ELISA 분석에 활용하였다.
도 16의 B는 Caki-1 세포에서 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량 및 16 μM의 ADP-리보오스 처리에 따라 대조군 그룹과 대비하여 ADP-리보오스의 세포 내 증가량을 %로 나타낸 그래프로 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량을 활용한 그룹은 ADP-리보오스의 양이 4시간에 최고로 증가하였다가 8시간부터 처리하지 않은 그룹과 거의 동일한 양으로 복구되고 있으나 ADP-리보오스를 처리한 그룹은 24시간이 지나더라도 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게 (P<0.001) 세포 내 ADP-리보오스의 양이 증가되어 유지되고 있음을 확인하였다(도 16의 B).
실시예 7-3: AsPC-1 세포 내 다양한 선량의 방사선 및 ADP-리보오스의 처리에 의한 ADP-리보오스의 시간에 따른 변화
AsPC-1 세포를 아무것도 처리하지 않거나 (Control), 1, 2, 5Gy의 방사선을 처리하거나, ADP-리보오스를 처리한 5개의 그룹으로 나누어 0, 4, 8, 16, 24시간 동안 각각 6-웰 plate에 배양한 후 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 상층액을 준비하였다. 준비된 상층액은 ADP-리보오스의 검출을 위한 ELISA 분석에 활용하였다.
도 16의 C는 AsPC-1 세포에서 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량 및 2 μM의 ADP-리보오스 처리에 따라 대조군 그룹과 대비하여 ADP-리보오스의 세포 내 증가량을 %로 나타낸 그래프로 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량을 활용한 그룹은 ADP-리보오스의 양이 4시간에 최고로 증가하였다가 16시간부터 처리하지 않은 그룹과 거의 동일한 양으로 복구되고 있으나 ADP-리보오스를 처리한 그룹은 24시간이 지나더라도 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게 (P<0.001) 세포 내 ADP-리보오스의 양이 증가되어 유지되고 있음을 확인하였다(도 16의 C).
실시예 7-4: MDA-MB-231 세포 내 다양한 선량의 방사선 및 ADP-리보오스의 처리에 의한 ADP-리보오스의 시간에 따른 변화
MDA-MB-231 세포를 아무것도 처리하지 않거나 (Control), 1, 2, 5Gy의 방사선을 처리하거나, ADP-리보오스를 처리한 5개의 그룹으로 나누어 0, 4, 8, 16, 24시간 동안 각각 6-웰 plate에 배양한 후 배지를 제거하고 RIPA 버퍼 및 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 처리하여 상층액을 준비하였다. 준비된 상층액은 ADP-리보오스의 검출을 위한 ELISA 분석에 활용하였다.
도 16의 D는 MDA-MB-231 세포에서 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량 및 16 μM의 ADP-리보오스 처리에 따라 대조군 그룹과 대비하여 ADP-리보오스의 세포 내 증가량을 %로 나타낸 그래프로 1, 2, 5Gy의 증가하는 방사선 선량을 활용한 그룹은 ADP-리보오스의 양이 4시간에 최고로 증가하였다가 16시간부터 처리하지 않은 그룹과 거의 동일한 양으로 복구되고 있으나 ADP-리보오스를 처리한 그룹은 24시간이 지나더라도 대조군 그룹과 대비하여 유의성 있게 (P<0.001) 세포 내 ADP-리보오스의 양이 증가되어 유지되고 있음을 확인하였다(도 16의 D).
이상을 정리하면 실시예 7을 통해, 각종 고형암 세포에서 외부 ADP-리보오스 처리에 의해 방사선 조사 시 상승하는 암세포 내 ADP-리보오스 농도 이상으로 세포내 ADP-리보오스 농도 상승을 유지시킬 수 있음을 확인하였다(도 16). 방사선 조사에 의한 항암 효과는 유전 물질의 손상에 의한 사멸 작용을 통해 기대할 수 있으나 암 세포는 이를 극복하기 위해 아데노신 디포스페이트 리보실화로 알려진 공정을 통해 DNA의 가닥을 지속적으로 복구한다. 그러나 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이 방사선 조사에 의한 복구 작용으로 일시적으로만 증가하는 ADP-리보오스를 지속적으로 축적되도록 보조하여주면 생화학 작용의 교란으로 인해 방사선 치료의 상승된 항암 효과를 기대할 수 있어 ADP-리보오스를 병용함으로써 방사선 치료의 내성 극복 및 부작용 감소를 위한 감소된 선량으로의 항암 방사선 활용 가능성을 기대할 수 있다.
실시예 8: ADP-리보오스와 방사선 병용 처리에 의한 암 세포 생존률의 변화
실시예 8-1: U-87MG 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 U-87MG 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 8 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, U-87MG 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 88%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약 12.3%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 A).
실시예 8-2: H1975 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 H1975 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 2 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, H1975 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 75%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약 8%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 B).
실시예 8-3: AsPC-1 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 AsPC-1 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 2 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, AsPC-1 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 87.3%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약 8%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 C).
실시예 8-4: Hep G2 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 Hep G2 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 4 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, Hep G2 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 82.3%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약7.3%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 D).
실시예 8-5: MDA-MB-231 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 MDA-MB-231 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 16 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, MDA-MB-231 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 90.6%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약 11.3%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 E).
실시예 8-6: HCT116 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 HCT116 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 16 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, HCT116 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 90.3%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약 14%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 F).
실시예 8-7: Caki-1 세포에서 ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선 병용 처리에 의한 생존률의 변화
96-웰 플레이트에 3×103개의 Caki-1 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양 후 16 μM의 ADP-리보오스와 2, 5Gy 선량의 방사선을 각각 또는 병용 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 다시 24시간 배양한 후 10μl의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 시약을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시킨다. 반응을 마친 시약을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 각 웰에 200μl씩 넣은 뒤 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 확인하였다.
그 결과, Caki-1 세포에 2Gy 선량의 방사선을 단독으로 처리하였을 때 처리하지 않은 그룹(Control) 대비 암 세포의 약 94.7%가 생존하는 내성을 보이고 있으나 ADP-리보오스와 병용 처리하면 2Gy 선량의 방사선을 활용하더라도 암 세포의 생존률은 약 22.7%로 유의성 있게 (P<0.001) 감소함을 확인하였다(도 17의 F).
이상을 정리하면, 실시예 8을 통해 ADP-리보오스와 방사선 병용 투여 시 고형암에 대한 상승적 항암 효과를 나타내며, ADP-리보오스가 고형암에 항암제로 활용될 수 있을 뿐 아니라 방사선 요법의 항암 보조제로도 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다(도 17).
실시예 9: ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선을 병용 처리한 동물 모델에서 종양 부피의 변화
실시예 9-1: ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선을 병용 처리한 뇌암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 뇌암(U-87MG) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 2Gy 선량의 방사선 단독, 2Gy 선량 방사선 + 10mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 2Gy 선량의 방사선은 1Gy씩 2회 조사되었고, 10mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
도 18의 A는 시간의 경과에 따라 뇌암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과로 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2545.2mm3 였으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군의 최종 종양 부피는 약 1472.1mm3로 대조군 대비 약 42% 감소한 반면 2Gy 선량의 방사선과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 725.2mm3 으로 대조군 대비 약 71.5%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 50.7% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 18의 A).
실시예 9-2: ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선을 병용 처리한 췌장암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 췌장암(AsPC-1) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 2Gy 선량의 방사선 단독, 2Gy 선량 방사선 + 10mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 2Gy 선량의 방사선은 1Gy씩 2회 조사되었고, 10mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
도 18의 B는 시간의 경과에 따라 췌장암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과로 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2384.3mm3 였으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군의 최종 종양 부피는 약 1725.5mm3로 대조군 대비 약 27.6% 감소한 반면 2Gy 선량의 방사선과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 736.2mm3 으로 대조군 대비 약 69.1%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 57.3% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 18의 B).
실시예 9-3: ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선을 병용 처리한 유방암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 유방암(MDA-MB-231) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 2 Gy 선량의 방사선 단독, 2 Gy 선량 방사선 + 20mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 2Gy 선량의 방사선은 1Gy씩 2회 조사되었고, 20mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
도 18의 C는 시간의 경과에 따라 유방암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과로 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2336.1mm3 였으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군의 최종 종양 부피는 약 1459.6mm3로 대조군 대비 약 37.5% 감소한 반면 2Gy 선량의 방사선과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 640.4mm3 으로 대조군 대비 약 72.6%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 56.1% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다.
실시예 9-4: ADP-리보오스와 내성 선량의 방사선을 병용 처리한 신장암 동물 모델에서 종양 부피의 변화
5 주령의 BALB/c 누드 마우스에 신장암(Caki-1) 세포 (1 × 107)를 마우스의 옆구리 뒤쪽에 접종 하고 대조군(Control)과 2Gy 선량의 방사선 단독, 2Gy 선량 방사선 + 20mg/kg의 ADP-리보오스를 병용 투여하는 3가지 군으로 분류하였다. 종양의 부피가 약 150mm3까지 성장 했을 때, 2Gy 선량의 방사선은 1Gy씩 2회 조사되었고, 20mg/kg의 ADP-리보오스는 피하로 주 3회 주사되었다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하여 종양 부피의 변화 결과를 군 별로 비교하였다.
도 18의 D는 시간의 경과에 따라 신장암의 부피를 측정하고 이를 비교한 결과로 최종 투약 후 대조군(Control) 종양의 최종 부피는 약 2620.5mm3 였으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군의 최종 종양 부피는 약 2454.5mm3로 대조군 대비 약 6.3% 감소에 그친 반면 2Gy 선량의 방사선과 ADP-리보오스를 병용 투여한 군의 최종 종양 부피는 약 786.4mm3 으로 대조군 대비 약 70%의 유의성 있는 감소 (P<0.001) 결과를 나타냈으며 2Gy 선량의 방사선을 단독 조사한 군과 대비하더라도 병용투여군의 종양 부피가 약 68% 유의성 있게 감소 (P<0.001)하는 결과를 나타냈다(도 18의 D).
이상을 정리하면, 실시예 8의 세포실험에 이어 실시예 9의 동물실험을 통해 ADP-리보오스와 방사선 병용 투여 시 고형암에 대한 상승적 항암 효과를 나타내며, ADP-리보오스가 고형암에 항암제로 활용될 수 있을 뿐 아니라 방사선 요법의 항암 보조제로도 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다(도 18).
실시예 10: ADP-리보오스의 정상 세포 처리시 독성 여부 확인
항암제의 경우 정상세포에 대해서는 독성을 나타내지 않으면서 암세포에 특이적으로 독성을 나타내는 것이 중요하다. 때문에, 본 발명에 따라서 ADP-리보오스가 정상세포에 대해 독성을 나타내는지 여부를 평가하였다.
정상 세포로 human colon fibroblast (CCD-18Co)와 human dermal papilla cell (HDPC) 세포를 활용하였다. 먼저, 96-well 플레이트에 5×103개의 각 정상 세포를 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 그 다음, ADP-리보오스를 처리하지 않은 그룹 (Untreated) 및 처리한 그룹으로 구분 (25, 50, 100 ul 농도별로 증량 처리) 총 4 그룹으로 구분하였다. 약물 처리 24, 48, 72시간 후 MTT assay 로 세포 생존률을 비교하였다.
그 결과, 정상 세포(도 19의 A, B: CCD-18Co, 도 19의 C, D: HDPC) 모두에서 ADP-리보오스 처리시 독성이 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, 상술한 실시예 실험결과와 함께, 본 실시예는 ADP-리보오스가 암세포 특이적으로 작용하여, 항암제로서 유용하게 활용될 수 있음을 보여준다.

Claims (7)

  1. 방사선 요법과 병용되는 ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항암 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 대장암 및 신장암으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고형암인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 암은 전이성 암인 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 방사선 민감도를 향상시키는 것인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 방사선 요법은 이온화 방사선 요법 (ionizing radiation therapy), 전자기 방사선 요법 (electromagnetic radiation), 근접 방사선 요법 (brachytherapy) 및 외부 방사선 요법 (external beam radiation therapy)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.
  6. ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 방사선 요법의 항암 보조제.
  7. ADP-리보오스 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암에 대한 방사선 치료의 민감도 개선 또는 증진용 조성물.
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