KR20230140402A - 단일세포전사체를 통한 유전자 네트워크 구축방법 및 이를 이용한 분화에 핵심이 되는 유전자 발굴 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단일세포전사체를 통한 유전자 네트워크 구축방법 및 이를 이용한 분화에 핵심이 되는 유전자 발굴 방법, 이를 통해 발굴된 타겟을 이용한 대장암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵심 유전자의 유전자 네트워크 구축 방법은 단일 세포 전사체 데이터를 이용하므로 모든 단일세포 전사체 데이터에 적용이 가능하다. 대장세포에 적용했을 때 발굴된 MYB/HDAC2/FOXA2 조합은 대장암세포의 분화를 촉진하여 분화된 정상세포로 가역화하는 암치료 타겟이 될 수 있다.
Description
단일세포전사체를 통한 유전자 네트워크 구축방법 및 이를 이용한 분화에 핵심이 되는 유전자 발굴 방법, 이를 통해 발굴된 타겟을 이용한 대장암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
표적약물은 발암 유전자(oncogene) 또는 발암 경로(oncogenic pathway)를 직접 억제하여 암을 치료하는 것을 목표로 하지만 예기치 않은 약물 내성이 자주 나타난다. 복잡한 피드백 조절로 구성된 암 신호전달 네트워크의 복잡한 역학으로 인해, 암 세포는 약물 요법에 영향을 미쳐 약물 치료에 적응하여, 표적 요법(targeted therapies)의 근본적인 제한을 초래할 수 있다.
암세포는 정상세포에 비해서 줄기세포능(Stemness)이 높아지고 이는 암세포의 전이 및 약물에 대한 내성에 중요한 원인이 되고 있다. 이를 제어하는 많은 시도가 있었지만 아직까지 시스템 생물학적 접근방식은 존재하지 않고 있다.
단일세포 전사체 기술이 고도화되면서 다양한 분석 방법이 개발되고 있고 단일세포 전사체 데이터가 가지는 가상의 시계열에 따르는 로직이 있는 유전자 네트워크를 구축하는 기술의 연구가 있으나, 단일세포 전사체 데이터는 노이즈가 크고 단일세포 데이터에서 숨겨진 동역학을 통해서 로직을 추론하는 것이 힘들기 때문에 아직까지 로직이 있는 유전자 네트워크를 구축하는 기술의 개발이 부족한 실정이다.
상술한 기술적 배경하에, 본 발명자들은 단일세포 전사체 데이터에서 연구자의 개입이 없는(unsupervised) 로직이 있는 유전자 네트워크를 구축하였다. 그리고 이 유전자 네트워크를 제어하는 파이프라인을 발명하고, 이로부터 도출된 대장세포의 분화 시너지 타겟을 대장암 세포에 적용하여 대장암세포의 분화된 정상세포로의 가역화를 통한 암 치료법을 제안한다.
본 발명의 목적은 분화 과정을 모사하는 시뮬레이션 네트워크의 구축방법 을 제공하고, 이를 바탕으로 분화에 핵심이 되는 유전자를 발굴하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암 보조제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 전환 유도 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 a) 줄기세포능이 높은 상태의 세포에서 분화된 세포로 분화되어 가는 가상의 시계열(Pseudo time)에 따라 단일 세포를 정렬하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 정렬된 각각의 단일 세포를 단일세포 전사체 데이터를 이용하여 핵 내부의 immature RNA(nascent RNA) 및 세포질의 mature RNA(exonic RNA) 특성에 따라, 각각 유전자가 발현하는 turn on, 유전자가 발현하지 않는 turn off Pseudos-state로 분리하는 단계;
c) 상기 a) 단계에서 가상의 시계열(Pseudo time)에 따라 정렬된 단일 세포를 시간의 흐름에 따라 1 그룹 당 X개의 세포가 포함되도록 구간을 나누고 무빙 윈도우(Moving windows) 분석법을 이용하여 시간 흐름에 따른 유전자 간 조건부 상호정보(CMI; Conditional mutual information) 분석을 수행하여 상호 발현에 영향을 미치는 유전자 쌍을 도출하는 단계, 여기에서 X= 100 내지 500개;
d) 상기 c) 단계를 통해 도출된 유전자 쌍 중 직접적인 유전자 조절 쌍이 아닌 유전자 쌍을 Cistarget DB를 이용하여 제외하여 상호 피드백이 이루어지는 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 구축하는 단계;
e) 상기 단계 d)의 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 이진화(discretization)하여 작성된 진리표를 각 Pseudo-state의 모든 유전자의 짝(pair)에 적용하여 시뮬레이션 가능한 조절 관계 로직을 생성하는 단계; 및
f) 상기 단계 e)의 생성된 조절 관계 로직에 BNsimpleReduction 알고리즘을 사용하여 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟을 선발하는 단계 ;를 포함하는 핵심 유전자 네트워크를 구축하는 방법에 관한 것이다.
상기 단계 b)의 mature RNA(exonic RNA)는 조절인자(Regulator)인 전사인자의 양으로 간주하고, immature RNA(nascent RNA)를 상기 조절인자에 의해 조절되는 유전자로 간주하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계 c)의 조건부 상호정보(CMI) 분석은 400개의 세포가 포함되도록 구간을 나누고 무빙 윈도우(Moving windows) 분석을 반복 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계 d)의 이진화는 latent time에 따른 unspliced read/spliced read 수가 증가 곡선을 이루는 구간에 해당할 경우 유전자가 발현하는 turned on, State=1인 것으로 결정하고 나머지 구간에 해당할 경우 유전자가 발현하지 않은 turned off, State=0인 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계 e)의 진리표에서 mature RNA(exonic RNA)가 Input이 되고, immature RNA(nascent RNA)가 Output이 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계 f)의 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟은 네트워크의 안정상태 및 원하는 상태간 유사도(Similarity score)를 비교하여 유사도가 90% ~ 100% 이면서 조절 인자의 수가 적은 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2은 암세포 분화 과정의 핵심 조절 인자 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 억제제는 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 억제제는 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물은 암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 가역화를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 항암 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 in vitro에서 MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 대장암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 대장암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 전환 유도 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 대장암세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 후보 물질이 처리된 대장암세포에서 MYB, HDAC2 및 FOXA2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2 발현 수준이 후보 물질 미처리 대조군에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 대장암 치료용 제제로서 판정하는 단계;를 포함하는, 대장암 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 핵심 유전자의 유전자 네트워크 구축 방법은 단일 세포 전사체 데이터를 이용하므로 모든 단일세포 전사체 데이터에 적용이 가능하다. 대장세포에 적용했을 때 발굴된 MYB/HDAC2/FOXA2 조합은 대장암세포의 분화를 촉진하여 분화된 정상세포로 가역화하는 암치료 타겟이 될 수 있다.
도 1은 줄기세포능이 높은 상태에서 분화상태로 변화하는 과정의 단일 세포를 pseudo-time의 가상의 시계열적 상태로 정의하고, 가상 시점의 하나의 단일 세포를 물리적으로 구분된 pseudo-state 상태로 정의하는 과정을 나타낸 도이다.
Pseudo-state는 핵에서 발견되는 unspliced read 포함하는 read와 세포질 영역에서 발견되는 spliced read 를 포함하는 read로 구분된다. unspliced read 는 T=1 상태 (Output), spliced read 는 T=0 는 상태(Input)를 의미할 수 있다.
도 2는 가상의 시계열에 따라 나타낸 단일 세포 상태를 미리 정의된 세포수로 구간을 나누어 구축한 각 Moving windows에서 조건부 상호정보(CMI) 분석을 수행하고, 간접적으로 발현에 영향을 미치는 유전자 쌍을 Cistarget DB를 이용하여 제외함으로써, 상호 피드백 관계가 구축된 Moving window의 서브네트워크를 통합하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 유전자 활동 수준을 두 가지 상태, 즉 on(State=1)과 off(State=0)로 놓고 2종의 이진수 코드를 각각 서로 다른 그룹에 위치시키고, 그룹에 대한 로직을 생성하는 과정을 나타낸다.
도 4는 Boolean 논리 모델의 추론을 위한 전사 역학 모델 및 Quine-McCluskey 알고리즘을 이용한 입출력 관계 기반 논리 네트워크 모델을 나타낸다.
도 5는 구축된 네트워크 모델을 대장세포 소스에 적용하고, SCC(Strongly connected component)를 통해 상호 강하게 연관된 17개의 TF 유전자 네트워크가 생성된 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 17개의 유전자로 구성된 TF 유전자 네트워크에 본 발명자들이 개발한 BNsimpleReduction 알고리즘을 적용하여 도출된 13개의 유전자로 구성된 로직 네트워크의 시뮬레이션을 나타낸 도이다. 13개의 유전자로 구성된 로직 네트워크에서는 우측에 나타낸 바와 같이 각 유전자들의 on-off 상호작용을 시각화 할 수 있다.
도 7은 도 6의 로직 네트워크를 사용된 단일세포 데이터의 동역학과 비교분석하여 검증한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 로직 네트워크를 사용된 단일세포 데이터에 랜덤으로 시뮬레이션한 결과, 구축된 유전자 네트워크 모델 동역학이 세포의 분화 과정을 거의 유사하게 모사함을 검증하였다. A: 각 세포 타입의 이진화 상태 결정, B: 시뮬레이션 과정이 pseudo-time 방향과 일치함, C: 가공 로직 네트워크의 상태가 실세 세포 상태와 유사함, D: 엔테로사이트 벡터와 시뮬레이션 결과의 거리 측정 결과 줄기세포 및 엔테로사이트 방향의 결과가 일치함을 나타낸다.
도 8은 BNSimpleReduction을 이용해서 축소된 네트워크로 도출된 유전자 네트워크에 제어타겟을 발굴하는 알고리즘을 적용하여 발굴된 5개 타겟 가운데 가능한 모든 조합을 시뮬레이션한 결과 MYB, HDAC2, FOXA2 3개 타겟을 동시 OFF하면 원하는 상태(enterocyte 고정점)와 가장 높은 유사도를 나타내는 것을 확인하였고 (A), 이를 유전자 네트워크의 형질지형(phenotype landscape)를 확인한 결과 3개 타겟의 동시 적용만이 유전자 네트워크 고정점들을 원하는 상태로 수렴시킬 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 (a) HCT 116 세포주, (b) HT 29 세포주, (c) CACO 2 세포주 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 세포의 증식(Proliferation)이 현저히 감소한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 (a) HCT 116 세포주, (b) HT 29 세포주, (c) CACO 2 세포주 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 세포의 증식(Proliferation)이 현저히 감소한 크리스탈 바이올렛 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 (a) HCT 116 세포주, (b) HT 29 세포주, (c) CACO 2 세포주 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 장세포 분화 마커의 발현이 증가하는 시너지 효과를 나타냄을 확인한 도이다.
도 12는 (a) shMYB/HDAC2/FOXA2를 처리한 HCT 116 세포주가 이식된 마우스, (b) shMYB/HDAC2/FOXA2를 처리한 HT 29 세포주가 이식된 마우스 모두 대조군 대비 종양의 형성 및 성장이 크게 억제된 시너지 효과를 나타낸 도이다.
Pseudo-state는 핵에서 발견되는 unspliced read 포함하는 read와 세포질 영역에서 발견되는 spliced read 를 포함하는 read로 구분된다. unspliced read 는 T=1 상태 (Output), spliced read 는 T=0 는 상태(Input)를 의미할 수 있다.
도 2는 가상의 시계열에 따라 나타낸 단일 세포 상태를 미리 정의된 세포수로 구간을 나누어 구축한 각 Moving windows에서 조건부 상호정보(CMI) 분석을 수행하고, 간접적으로 발현에 영향을 미치는 유전자 쌍을 Cistarget DB를 이용하여 제외함으로써, 상호 피드백 관계가 구축된 Moving window의 서브네트워크를 통합하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 유전자 활동 수준을 두 가지 상태, 즉 on(State=1)과 off(State=0)로 놓고 2종의 이진수 코드를 각각 서로 다른 그룹에 위치시키고, 그룹에 대한 로직을 생성하는 과정을 나타낸다.
도 4는 Boolean 논리 모델의 추론을 위한 전사 역학 모델 및 Quine-McCluskey 알고리즘을 이용한 입출력 관계 기반 논리 네트워크 모델을 나타낸다.
도 5는 구축된 네트워크 모델을 대장세포 소스에 적용하고, SCC(Strongly connected component)를 통해 상호 강하게 연관된 17개의 TF 유전자 네트워크가 생성된 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 17개의 유전자로 구성된 TF 유전자 네트워크에 본 발명자들이 개발한 BNsimpleReduction 알고리즘을 적용하여 도출된 13개의 유전자로 구성된 로직 네트워크의 시뮬레이션을 나타낸 도이다. 13개의 유전자로 구성된 로직 네트워크에서는 우측에 나타낸 바와 같이 각 유전자들의 on-off 상호작용을 시각화 할 수 있다.
도 7은 도 6의 로직 네트워크를 사용된 단일세포 데이터의 동역학과 비교분석하여 검증한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 로직 네트워크를 사용된 단일세포 데이터에 랜덤으로 시뮬레이션한 결과, 구축된 유전자 네트워크 모델 동역학이 세포의 분화 과정을 거의 유사하게 모사함을 검증하였다. A: 각 세포 타입의 이진화 상태 결정, B: 시뮬레이션 과정이 pseudo-time 방향과 일치함, C: 가공 로직 네트워크의 상태가 실세 세포 상태와 유사함, D: 엔테로사이트 벡터와 시뮬레이션 결과의 거리 측정 결과 줄기세포 및 엔테로사이트 방향의 결과가 일치함을 나타낸다.
도 8은 BNSimpleReduction을 이용해서 축소된 네트워크로 도출된 유전자 네트워크에 제어타겟을 발굴하는 알고리즘을 적용하여 발굴된 5개 타겟 가운데 가능한 모든 조합을 시뮬레이션한 결과 MYB, HDAC2, FOXA2 3개 타겟을 동시 OFF하면 원하는 상태(enterocyte 고정점)와 가장 높은 유사도를 나타내는 것을 확인하였고 (A), 이를 유전자 네트워크의 형질지형(phenotype landscape)를 확인한 결과 3개 타겟의 동시 적용만이 유전자 네트워크 고정점들을 원하는 상태로 수렴시킬 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 (a) HCT 116 세포주, (b) HT 29 세포주, (c) CACO 2 세포주 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 세포의 증식(Proliferation)이 현저히 감소한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 (a) HCT 116 세포주, (b) HT 29 세포주, (c) CACO 2 세포주 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 세포의 증식(Proliferation)이 현저히 감소한 크리스탈 바이올렛 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 (a) HCT 116 세포주, (b) HT 29 세포주, (c) CACO 2 세포주 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 장세포 분화 마커의 발현이 증가하는 시너지 효과를 나타냄을 확인한 도이다.
도 12는 (a) shMYB/HDAC2/FOXA2를 처리한 HCT 116 세포주가 이식된 마우스, (b) shMYB/HDAC2/FOXA2를 처리한 HT 29 세포주가 이식된 마우스 모두 대조군 대비 종양의 형성 및 성장이 크게 억제된 시너지 효과를 나타낸 도이다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고 있다.
일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 갖는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자들은 단일세포 전사체 데이터에서 연구자의 개입이 없는(unsupervised) 로직이 있는 유전자 네트워크를 구축하였다. 그리고 이 유전자 네트워크를 제어하는 파이프라인을 발명하고, 이로부터 도출된 대장세포의 분화 시너지 타겟을 대장암 세포에 적용하여 대장암세포의 분화된 정상세포로의 가역화를 통한 암 치료법을 제안한다.
본 발명은 a) 줄기세포능이 높은 상태의 세포에서 분화된 세포로 분화되어 가는 가상의 시계열(Pseudo time)에 따라 단일 세포를 정렬하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 정렬된 각각의 단일 세포를 단일세포 전사체 데이터를 이용하여 핵 내부의 immature RNA(nascent RNA) 및 세포질의 mature RNA(exonic RNA) 특성에 따라, 각각 유전자가 발현하는 turn on, 유전자가 발현하지 않는 turn off Pseudos-state로 분리하는 단계;
c) 상기 a) 단계에서 가상의 시계열(Pseudo time)에 따라 정렬된 단일 세포를 시간의 흐름에 따라 1 그룹 당 X개의 세포가 포함되도록 구간을 나누고 무빙 윈도우(Moving windows) 분석법을 이용하여 시간 흐름에 따른 유전자 간 조건부 상호정보(CMI; Conditional mutual information) 분석을 수행하여 상호 발현에 영향을 미치는 유전자 쌍을 도출하는 단계, 여기에서 X= 100 내지 500개;
d) 상기 c) 단계를 통해 도출된 유전자 쌍 중 직접적인 유전자 조절 쌍이 아닌 유전자 쌍을 Cistarget DB를 이용하여 제외하여 상호 피드백이 이루어지는 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 구축하는 단계;
e) 상기 단계 d)의 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 이진화(discretization)하여 작성된 진리표를 각 Pseudo-state의 모든 유전자의 짝(pair)에 적용하여 시뮬레이션 가능한 조절 관계 로직을 생성하는 단계; 및
f) 상기 단계 e)의 생성된 조절 관계 로직에 BNsimpleReduction 알고리즘을 사용하여 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟을 선발하는 단계; 를 포함하는 핵심 유전자 네트워크를 구축하는 방법에 관한 것이다.
암세포는 정상세포에 비해서 줄기세포능(Stemness)이 높아지고 이는 암세포의 전이 및 약물에 대한 내성에 중요한 원인이 되고 있다. 이러한 암세포를 정상세포 또는 정상 유사세포로의 가역화를 유도하는 과정에 관여하는 유전자의 상호작용 로직을 추론할 수 있는 방법을 도출하였다.
암세포의 분화 과정은 줄기세포능이 높은 상태에서 분화 상태로 변화하는 과정이며, 이 과정에서 유전자 발현이 변화한다. 상기 분화 상태는 세포가 엔테로사이트(Enterocyte) 상태가 되는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어'가상의 시계열(Pseudo time)'이란 세포의 진행 상황을 측정하는 잠재(관찰되지 않은) 차원을 의미한다. 가상의 시계열 추론은 scRNA-seq로 측정한 세포의 유전자 발현 프로필을 기반으로 혈통을 따라 세포의 순서를 추론하는 것을 목표로 할 수 있다.
단일세포 전사체를 이용한 유전자 조절 네트워크를 구축하는 기존의 과정은 가상의 시계열 추론에 따라서 줄 세워진 단일 세포의 앞과 뒤를 비교해서 각 단일 세포에서 변하는 과정을 확인하고, 이 과정을 여러 세포의 짝 (pair)를 관찰하여 그 사실을 바탕으로 유전자 조절 네트워크를 구축하였다. 하지만 지금까지 방법은 그 과정에서 변하는 시간에 따른 유전자의 차이를 확인함에도 불구하고 각 상태의 변하는 시간의 크기가 달라서 각각의 짝 (pair)에서 유전자의 변화를 찾는 것이 부정확했다. 세포가 변하는 과정에서 변화량 값을 계산하여 세포가 움직이는 메커니즘을 추측하는 방법은 세포가 변하는 과정의 간격이 동일하다는 전제하에 가능한데, 세포들이 다이나믹하게 움직이는 경우 간격은 커지고 포착되지 못하는 세포들이 발생하면서 세포가 변하는 과정에서의 유전자 다이나믹스가 반영이 안되는 문제점이 생긴다.
따라서 본 발명자들은 이러한 단점을 보완하고자 가상의 시계열에 따라 정렬된 단일세포를 단일세포 전사체 데이터를 이용하여 각각의 변화의 짝(pair)을 세포간이 아닌 세포내부에서 유전자가 유전자 조절인자에 의해서 변하는 상태를 물리적으로 구분된 핵과 세포질 두개를 두개의 세포처럼 나누었고, 이를 바탕으로 각 세포에서 핵 내부에서 만들어지기 시작하는 RNA 즉, nascent RNA(immature RNA)에서 mature RNA 로 변하는 과정의 변화를 중심으로 유전자의 다이나믹스를 표현하는 로직을 추론하는 방법을 개발했다. 이 방법은 기존에 전혀 개발되지 않았던 방법이며, 이를 통해서 우리는 단일 세포 전사체 데이터로부터 더 정확한 유전자 네트워크를 구축할 수 있다.
상기 단일세포 전사체 데이터는 RNAseq로부터 얻어진 시계열 전사체 정보(time series transcriptome data)일 수 있으며, 이에 제한되지는는 않는다.
본 발명에서 용어 'Pseudo-state'란 가상의 시간에 따른 세포의 상태를 의미할 수 있다. 세포의 변화 과정에서 물리적으로 구분된 핵과 세포질, 즉 핵 내부에서 만들어지기 시작하는 nascent RNA 및 세포질의 실제 단백질로 번역되는 mature mRNA로 특징될 수 있으며, 본 발명에서는 이렇게 각각 특징이 다른 두 개의 mRNA의 특징을 기준으로 각각의 가상의 세포를 설정하고 이를 Pseudo-state라고 명명하였다.
Pseudo-state중 mature RNA은 조절 인자(Regulator), 즉 전사인자(TF)의 양으로 간주할 수 있다. 이를 바탕으로 TF 가 결합하여 발현을 유도하는 mRNA 양을 추측할 수 있으며, 각 세포의 핵 내부에서 만들어지기 시작하는 nascent RNA (immature RNA)는 앞서 추론한 전사인자(TF)에 의해서 조절되는 유전자로 가정한다.
이를 바탕으로 각 세포의 핵 내부에서 만들어지기 시작하는 nascent RNA 즉, immature RNA가 전사인자에 의해서 전사되는 과정을 심으로 유전자의 다이나믹스를 표현하는 로직을 추론하고 이를 시스템 수준에서 집합하여 유전자 네트워크를 구축하고 이 네트워크를 분석하여 타겟 유전자의 후보 조절인자를 찾을 수 있다.
상기 각 Pseudo-state의 유전자 간 상호 발현에 영향을 미치는 유전자 쌍을 추론하는 과정은 조건부 상호정보(CMI; Conditional mutual information) 분석을 이용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
조건부 상호정보(CMI)를 계산하는 방법은 보편적으로 사용되는 다른 네트워크 구축 방법들에 비해, 단위시간 이후 자연적으로 변화할 target 유전자 발현의 변화량을 고려해 source 유전자가 실제 target 유전자의 mature RNA 발현량 변화에 미치는 조절관계의 영향을 더욱 정확하게 계산해줄 수 있으며, 방향성이 있는 조절 인과관계를 추론할 수 있다.
상기 조건부 상호정보(CMI) 분석은 100 내지 500개의 세포가 포함되도록, 바람직하게는 400개의 세포가 포함되도록 구간을 나누고 각 구간별로 구축된 네트워크로 통합하는 무빙 윈도우(Moving windows)를 통해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
각 구간은 이전 및 이후 구간과 일부 세포를 공유한다. 이 과정에서 각 구간별로 구축된 n개의 네트워크를 하나의 네트워크로 병합하여 사용한다. 이렇게 구축된 네트워크는 전체 네트워크에서 일관적으로 나타나는 조절관계만이 아니라 각 구간에서 특징적으로 나타나는 조절관계를 전부 포함하게 된다. 즉, 유전자가 어떤 세포의 상태를 결정할 때 초반과 후반에 일어나는 유전자의 조절 관계가 모두 중요한데, 구간을 나누지 않고 전체에 대해 CMI를 분석할 경우 유전자 조절 관계의 피드백 상관관계가 제대로 반영되지 않는 문제점을 해결할 수 있다.
상기 조건부 상호정보(CMI) 분석으로 도출된 유전자 쌍 중 직접적인 유전자 조절 쌍이 아닌 유전자 쌍을 Cistarget DB를 이용하여 제외하고 상호 피드백이 이루어지는 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 구축할 수 있다.
상기 타겟 유전자의 후보 조절인자는 상호 발현을 조절하는 직접 링크를 갖는 유전자 쌍으로, 이렇게 구축된 데이터는 걸러지지 않은 간접 링크를 갖는 유전자들을 분리(isolate)하고 강한 연결성을 갖는 유전자 쌍 데이터를 재구축할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 SCC(Strongly connected component)를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사용하는 단일 세포 전사체 데이터에 따라 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 네트워크를 적절히 선택할 수 있다.
다음 과정으로 상기 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 이진화(discretization)하여 작성된 진리표를 각 Pseudo-state의 모든 유전자의 짝(pair)에 적용하여 시뮬레이션 가능한 조절 관계 로직을 생성할 수 있다.
상기 진리표에서 mature RNA(exonic RNA)가 Input이 되고, immature RNA(nascent RNA)가 Output이 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
진리표 작성시 input은 같으나 다른 output을 가진 행이 빈번하게 발생할 수 있으나 그 수가 적은 행은 노이즈(noise)로 여길 수 있기 때문에 다수에 해당하는 input-output 행을 선택하여 진리표를 완성하였다. 진리표의 각 행 안의 Boolean 변수(variable)를 ‘AND'로 묶고 각 행을 'OR'로 묶으면 간단하게 Boolean 함수를 만들 수 있지만, 이렇게 할 경우 길이가 매우 길어지기 때문에 Boolean 식(expression)을 축소(reduction)하는 알고리즘인 QM 알고리즘을 통해 최소 형태의 Boolean 식을 만들어 결국 최종 Boolean 함수를 만들 수 있다.
상기 이진화는 latent time에 따른 unspliced read/spliced read 수가 증가 곡선을 이루는 구간에 해당할 경우 유전자가 발현하는 turned on, State=1인 것으로 결정하고 나머지 구간에 해당할 경우 유전자가 발현하지 않은 turned off, State= 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
RNA가 발현 또는 발현하지 않는 순간에 관여하는 전사인자(TF)들마다 이진수 변환을 수행하고 1 또는 0으로 표현되는 TF들의 패턴에 따라 유전자가 발현하면 1, 발현하지 않으면 0 인 로직 형태를 구성할 수 있으며, 이를 통해 어떤 종류의 TF 가 존재할 때 유전자가 발현(1) 또는 발현되지 않는지 (0) 패턴을 도출한다. 이는 약 2000 개 이상의 짝(pair)에 대해 수행할 때 99% 정확도로 각 전사인자의 패턴에 따른 유전자 발현 유무를 확인할 수 있다.
위 과정을 각 Pseudo-state의 모든 유전자들에 대해서 반복해서 모든 짝(pair)에 대해서 적용하고 이 과정에 세포의 원하는 상태를 고정하여 BNsimpleReduction 알고리즘을 적용하면 원하는 상태에 긴밀히 관여하는 유전자들의 조절 관계 로직을 생성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 네트워크 구축 방법에 따라 대장세포 샘플의 단일세포 전사체 데이터로 적용한 결과 13개의 유전자로 구성된 조절 관계 로직 네트워크 모델이 구축되었다. 이렇게 구축된 네트워크 모델 동역학을 사용된 단일세포 데이터의 동역학과 비교했을 때 네트워크 모델의 단일 초기상태(initial state)로부터 안정상태(attractor)로 수렴하는 동역학(transient dynamics)으로 잘 반영됨을 확인하였다.
이러한 결과는 구축된 네트워크 모델이 원하는 상태로 가는 핵심 유전자 조절인자의 조합을 시뮬레이션할 수 있음을 의미한다.
따라서 본 발명에 따른 핵심 유전자 시뮬레이션 네트워크 구축 방법으로 구축된 네트워크 모델은 컴퓨터를 통해 수행되는 in silico에서 어떤 유전자의 조합을 0과 1로 고정했을 때 원하는 상태를 달성하는지 시뮬레이션할 수 있다.
다음 과정으로 상기 생성된 조절 관계 로직에 BNsimpleReduction 알고리즘을 사용하여 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟을 선발할 수 있다.
본 발명에서 용어 '전역 안정화'란 네트워크를 가능한 모든 초기 상태에 대해 지정된 특정한 안정상태로 수렴하게 하는 네트워크 제어 전략을 의미한다.
상기 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟은 네트워크의 안정상태 및 원하는 상태간 유사도(Similarity score)를 비교하여 유사도가 90% ~ 100% 이면서 조절 인자의 수가 적은 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 '네트워크의 안정상태'란 네트워크가 업데이트 규칙에 따른 상태천이를 통해 최종적으로 수렴하는 안정적인 상태를 의미한다
본 발명에서 용어 '원하는 상태'란 네트워크상에 존재하면서 본 특허를 사용하는 연구자가 원하는 세포의 상태를 의미한다. 본 발명에서는 장세포의 엔테로사이트로 분화한 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, BNSimpleReduction을 이용해서 축소된 네트워크로 도출된 유전자 네트워크에 제어타겟을 발굴하는 알고리즘을 적용하여 발굴된 5개 타겟 가운데 이들의 가능한 모든 조합을 적용한 각 시뮬레이션 결과 네트워크의 안정상태와 원하는 상태(enterocyte 고정점)간 유사도를 계산하여 보았을 때, 최적의 3개 타겟(MYB, HDAC2, FOXA2)을 OFF 하는 것으로 약 95% 이상의 유사도를 달성하였다.
최적의 3개 타겟 조합에 대해 그 개수를 늘려가며 네트워크의 형질지형(phenotype landscape)를 확인한 결과 도 8B에서 보는 바와 같이, 단일 혹은 두 개 조합으로는 원하는 상태(enterocyte 고정점)로의 수렴이 일어나지 않았고, MYB, HDAC2, FOXA2 3개 타겟의 동시 적용만이 분화가 되지 않은 네트워크 고정점들을 원하는 상태(enterocyte 고정점)로 수렴시킴을 확인하였다.
상기 과정을 거쳐 MYB/HDAC2/FOXA2 분화 조절 타겟을 발굴하였고 세포 실험 및 동물 실험을 통해 MYB/HDAC2/FOXA2 분화 조절 타겟을 동시에 억제한 경우 암세포의 증식 억제, 장세포 분화 마커의 증가, 종양의 형성 또는 성장을 억제하는 효능이 나타남을 검증하였다.
따라서 본 발명은 다른 관점에서 MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2은 암세포 분화 과정의 핵심 조절 인자 조합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, MYB, HDAC2 및 FOXA2의 발현이 동시에 억제된 대장암 세포주의 증식이 억제되고 장세포 분화 마커의 발현이 증가하는 효과를 확인하고, 상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2 조합이 동시에 억제된 대장암 세포주를 이식한 동물 모델은 종양이 형성되지 않거나, 종양의 성장이 억제된 효과를 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 대장암의 예방 또는 치료 용도로 제공될 수 있다.
본 발명의 억제제는, 본 발명의 목적, 즉, 암세포에서의 상기 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 발현 수준 또는 활성을 감소시킬 수 있는 한, 당업계에 공지된 임의의 제제 또는 수단을 이용할 수 있다.
바람직하게는 상기 억제제는 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "안티센스 핵산"이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 상기 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다. 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 상기 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다.
본 발명에서 "siRNA"란 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(타겟 유전자인 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1 및 2로 표시되는 si-MYB, 서열번호 3 및 4 로 표시되는 si-HDAC2, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 si-FOXA2을 사용하였으며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "shRNA"란 small hairpin RNA 혹은 short hairpin RNA으로 불리며, RNA 간섭으로 유전자를 침묵시킬 수 있는 용도로 사용되는 것이다. 보통 벡터를 이용하여 목적 세포로 도입한다. 이러한 shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 다른 물질에 의하여 절단되어 siRNA가 되기도 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 35로 표시되는 sh-MYB, 서열번호 36으로 표시되는 sh-HDAC2, 서열번호 37로 표시되는 sh-FOXA2을 사용하였으며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 si-MYB, si-HDAC2, si-FOXA2, sh-MYB, sh-HDAC2 또는 sh-FOXA2가 갖는 염기서열의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과로, 상기 si-MYB, si-HDAC2, si-FOXA2, sh-MYB, sh-HDAC2 또는 sh-FOXA2가 갖는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 예컨대, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 변화를 언급하면서 이용된 용어, "가역화" 및 "전환"은, 본 발명에서 발굴된 타겟 유전자인 MYB, HDAC2 및 FOXA2를 암세포에서 억제했을 때, 암세포로부터 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로 분화되는 것을 의미하며, 이들은 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 있어서, 상기 "정상 유사 세포"란 암세포 유래 정상 세포의 전사체를 가진 세포를 의미하며, 정상 세포, 바람직하게는 정상 세포와 동일 또는 유사한 활성을 가진 세포를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 가역화는 정상세포 형태로의 변화, 정상 세포 기능 회복 또는 정상 세포로의 후성 유전학적 변화 유도일 수 있고, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 대장암세포에서 MYB, HDAC2 및 FOXA2을 억제하는 경우, 정상 세포 또는 정상 세포로의 가역화가 유도되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 MYB, HDAC2 및 FOXA2 억제는, 암세포를, 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로 리프로그래밍 또는 전환할 수 있음을 입증한다.
본 발명의 MYB, HDAC2 및 FOXA2 억제제는 암 세포를 사멸시키는 기존의 항암제와 달리, 암세포에 처리되었을 때, 대상 세포의 암세포적 특성, 예컨대 증식능, 성장능, 전이능, 침윤능 또는 이동능을 억제함과 동시에 대상 세포가 가진 본래의 형태 및 기능, 예컨대 정상 세포 형태로의 변화, 정상 세포 기능 회복 또는 정상 세포로의 변화 유도를 증진시켜, 암 세포가 다시 정상 또는 정상 유사 세포로 전환되어 정상 세포와 같은 기능을 발휘하도록 할 수 있다. 따라서 기존 세포 사멸만을 유도하는 항암제와 달리, 세포 사멸에 의한 부작용을 해소할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유효성분으로 포함하는"이란, 본 발명의 유효 성분인 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 소정의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양으로 포함하는 것을 의미한다. 상기 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제는 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 유효 용량수준은 개체의 종류 및 연령, 성별, 약물에 대한 민감도, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물 및 기타 의학적 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다.
예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출률, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중㎏/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중㎏/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 대상 적응증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 포함하는, 항암 보조제에 관한 것이다.
본 발명에서 항암 보조제는, 항암제 투여시 항암제와 병용하여 투여함으로써, 항암제의 항암 효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 항암 보조제는 처리농도에 따라 항암제 또는 항암보조제로서 사용할 수 있으며, 항암제의 감수성을 증진시킬 수도 있다.
본 발명의 상기 보조제는 항암약물과 동시에(simutaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 항암 보조제의 투여 순서 즉, 항암제와 항암 보조제 중에서 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다. 상기 항암 보조제는 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병용하여 투여될 수 있다. 이에 있어, 공지의 화합물과 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
상기 공지의 화합물은 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 5-FU(5-fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 이리노테칸(Irinotecan), 카보플라틴(Carboplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 젬시타빈(Gemcitabin) 및 보테조밉(Bortezomib)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항암제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 포함하는, 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 건강보조식품(health supplement) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 분말제, 정제, 캡슐제, 환제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 형태로 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제 자체를 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취하거나 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명의 SETMAR 억제제를 암의 예방, 개선 또는 치료 활성이 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어, 상기 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제는 바람직하게 식품 조성물 대비 0.00001~50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
또한, 본 발명의 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 음료로 제조될 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 있어서, "건강보조식품" 또는 "건강기능식품(health functional food)"이란 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 포함하는, 암 세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 전환용 조성물 및 In vitro에서 상기 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 전환 유도 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음 단계를 포함하는, 대장암 치료용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 대장암세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 후보 물질이 처리된 대장암세포에서 MYB, HDAC2 및 FOXA2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2 발현 수준이 후보 물질 미처리 대조군에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 대장암 치료용 제제로서 판정하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 암 세포에 분석하고자 하는 후보 물질을 접촉시킬 수 있다. 상기 후보물질은 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다.
상기 후보 물질은 화학물질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA, shRNA, miRNA, 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 MYB, HDAC2 또는 FOXA2에 특이적인 siRNA, shRNA, miRNA 또는 항체를 포함할 수 있다.
이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 후보 물질은 암을 치료 또는 예방할 수 있는 제제로 사용할 수 있을 것으로 판정할 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 "생물학적 시료"란 암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 관점에서 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대장암 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, "대상"은 암 질환을 가지고 있는 개체로서, 바람직하게는 암 질환을 가지고 있는 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 개 등의 포유동물을 의미하나, 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명의 방법은 상술한 MYB 억제제, HDAC2 억제제 및 FOXA2 억제제를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세포의 분화 과정의 핵심 유전자 네트워크 구축
세포는 줄기세포능이 높은 상태에서 분화 상태로 변화하게 되며, 이 과정에서 유전자 발현이 변화한다. 세포 분화 과정에서 변화되는 단일세포 전사체 데이터를 가상의 시계열 분석을 통해 분석하여, 유전자 네트워크의 구조 정보를 추론하고, 분화 과정에 관여하는 유전자의 상호작용 로직을 추론할 수 있는 방법을 도출하였다.
세포가 엔테로사이트(Enterocyte)로 분화되어가는 가상의 시계열(Pseudo-time)에 해당되는 세포 그룹을 이용하여 로직 네트워크로 구축하고 시뮬레이션을 통해 세포 분화 과정의 핵심 조절 인자를 발굴한다.
Pseudo-time 및 Pseudo-state
도 1은 분화 과정의 단일 세포들을 가상의 시계열에 따라서 줄 세우고, 각각의 변화의 pair를 줄 세워진 단일 세포의 앞과 뒤가 아닌, 하나의 단일 세포 내부에서 유전자가 유전자 조절인자에 의해 변하는 상태를 물리적으로 구분된 핵과 세포질에서 나타나는 mRNA의 특징을 기준으로 2개의 상태로 나누는 과정을 나타낸 모식도이다.
구체적으로 세포가 줄기세포능이 높은 상태에서 분화 상태(Enterocyte)로 변화하는 과정에 해당하는 가상의 시간에 따라서 정렬된 하나의 세포를 두 개의 상태 즉, Pseudos-state로 분리하는 과정을 거친다.
각각의 Pseudos-state는 다음과 같은 방법으로 구분된다.
단일세포 RNA seq 데이터를 생산하게 되면, 각각의 세포에서 대략 15% 정도의 리드는 intron 부분에 위치한다(Unspliced read). 이렇게 위치된 유전자는 immature RNA에서 유래한 것이며 이는 공간적으로 구분되어 핵 안에서만 존재한다는 것이 알려져 있다. 이는 새롭게 생성되는 중인 nascent RNA이며, 각 전사인자에서 활성 정도를 측정하는 기준으로 사용되었다. 이러한 상태는 T=1 로 표시될 수 있고, 유전자가 turn on 된 상태에 대응된다.
나머지 리드(Spliced read)가 위치하는 세포질의 exonic RNA로 구성된 값은 실제 mature mRNA로 구성되어 있으며 이는 곧 단백질로 번역된다. 이러한 상태는 T=0 로 표시될 수 있고, 유전자가 turn off 된 상태에 대응될 수 있다.
이렇게 각각 특징이 다른 두 개의 RNA를 기준으로 각각의 가상의 세포를 설정하고 이를 Pseudo-state라고 명명하였다.
핵 안의 immature RNA가 marture form으로 바뀌면서 세포질로 나와 단백질로 번역되므로 세포질로 나온 mature RNA는 전사인자들과 동일한 양으로 등치할 수 있다. 즉 전사인자들이 발현시키는 mRNA의 양을 추측할 수 있다. 이를 바탕으로 각 세포의 핵 내부에서 만들어지기 시작하는 nascent RNA 즉, immature RNA가 전사인자에 의해서 전사되는 과정을 심으로 유전자의 다이나믹스를 표현하는 로직을 추론하고 이를 시스템 수준에서 집합하여 유전자 네트워크를 구축하고 이 네트워크를 분석하여 타겟 유전자의 후보 조절인자를 찾을 수 있다.
각 유전자에 대한 잠재적 조절인자 추론
전사인자-유전자쌍을 도출하기 위한 방법을 수행하였다. 각 유전자의 유전자 조절인자를 추론하는 과정은 위에서 정의한 두개의 유전자 State 즉, Pseudo-state 사이를 pseudo-time order에 따라서 비교하면서, 하나의 유전자(source)와 다른 유전자(target)의 짝(pair)에 대해서 조건부 상호정보(Conditional mutual information)를 계산하여 유전자의 후보 조절인자를 찾는 과정을 포함한다.
상기 과정에서, 본 발명자들은 무빙 윈도우(Moving window)라는 개념을 적용하였다. 이 개념은 단일 세포의 변화에 따라 정렬될 때 초반에 일어나는 유전자 네트워크와 후반에 일어나는 유전자 네트워크를 총 망라해서 분석하기 위해 가상의 시간에 따라서 나열된 단일 세포들을 400개로 묶은 구간에 대해 반복해 유전자 네트워크를 구축하였다.
구간은 사용하는 단일 세포 소스의 전체 개수를 400개로 나눈 개수(n개)가 된다. 각 구간은 이전 및 이후 구간과 일부 세포를 공유한다. 이 과정에서 각 구간별로 구축된 n개의 네트워크를 하나의 네트워크로 병합하여 사용한다. 이렇게 구축된 네트워크는 전체 네트워크에서 일관적으로 나타나는 조절관계만이 아니라 각 구간에서 특징적으로 나타나는 조절관계를 전부 포함하게 된다. 즉, 유전자가 어떤 세포의 상태를 결정할 때 초반과 후반에 일어나는 유전자의 조절 관계가 모두 중요한데, 구간을 나누지 않고 전체에 대해 CMI를 분석할 경우 유전자 조절 관계의 피드백 상관관계가 제대로 반영되지 않는 문제점을 해결할 수 있다.
도 2는 구간별로 구축된 각 구간에서 source 유전자(G1)가 실제 target 유전자(G2)의 mature RNA 발현량 즉, 핵에서 세포질로의 변화량(ΔT=nuclear to cytosol)에 미치는 영향에 대해 조건부 상호정보(CMI) 분석으로 후보 조절인자를 도출하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 하나의 상태로 고정했을 때 source 유전자(G1)이 증가할 때, target 유전자(G2)가 증가하는 관계성을 통해, 해당 source 유전자(G1) 이 target 유전자(G2)를 조절하는 것으로 간주할 수 있다. 이 과정에서 source 유전자(G1)가 target 유전자(G2)를 직접 조절하지 않고 indirect로 조절하는 케이스를 제거하기 위하여, 공공 데이터베이스인 Rcistargt 데이터베이스를 이용하였다. Rcistargt 데이터베이스는 이들의 연결관계 중 전사인자의 결합 모티프 정보와 유전자의 DNA 염기서열을 기반으로 직접 결합할 수 없는 유전자를 필터링하여 제거할 수 있다. 이러한 과정을 거쳐 무빙 윈도우의 서브네트워크를 통합하여 상호 피드백이 이루어지는 유전자 후보 조절인자 데이터를 구축하였다.
이후 도출된 유전자 후보 조절인자 데이터로부터 Boolean 함수를 이용해 네트워크 모델을 구성한다.
유전자 발현 수준의 이진수 변환
RNA sequencing 데이터는 연속형 값(continuous value)이므로 진리표(Truth table) 작성을 위해서는 이 값이 이진화(binarization)될 필요가 있다.
도 3은 유전자 활동 수준을 두 가지 상태, 즉 on(State=1)과 off(State=0)로 놓고 2종의 이진수 코드를 각각 서로 다른 그룹에 위치시키고, 그룹에 대한 이진화 과정을 나타낸다.
유전자가 발현하는 것을 turned on, 유전자가 발현하지 않는 것을 turned off로 결정하는데 이러한 유전자 활동 수준의 결정은 latent time에 따른 그래프(가운데 이미지)상에서 리드 (U/S) 수 그래프가 증가 곡선을 이루는 지점까지만 유전자가 발현한 것으로 결정하고(Gene on, turn on), 나머지 지점들은 유전자가 발현하지 않은 것으로 결정한다(Gene off, turn off). 앞서 도 1에서 설명한 바와 같이, unspliced RNA 가 존재하면 전사인자가 결합하여 RNA 전사가 이루어지고 있는 것이므로, 유전자가 발현하는 turn on (T=1)으로 구분할 수 있다. 반면 RNA 가 존재하지만 unspliced RNA 가 존재하지 않는 경우는, 유전자는 turn off 되었음에도 기존에 전사된 RNA 가 남아있는 것으로 보아, turn off(T=0)으로 구분할 수 있다.
이러한 과정을 거쳐 유전자의 on/off 상태를 반영하여 전사인자(TF)를 포함하는 모든 유전자에 대해 1 또는 0으로의 이진화를 수행한다. 도 3의 하단은 latent time에 따른 모든 단일 세포의 유전자들에서의 RNA 시퀀싱 데이터가 1 또는 0으로 변환된 것을 나타낸다.
Boolean 함수 식별 및 Boolean 네트워크 모델의 재구성
세포질에 존재하는 mature RNA는 전사-번역 과정을 거쳐서 조절 인자(Regulator)의 양과 비슷하다고 가정할 수 있다. 따라서 Pseudo-state중 mature RNA은 조절 인자(Regulator), 즉 전사인자(TF)의 양으로 간주할 수 있다. 이를 바탕으로 TF 가 결합하여 발현을 유도하는 mRNA 양을 추측할 수 있으며, 각 세포의 핵 내부에서 만들어지기 시작하는 nascent RNA (immature RNA)는 앞서 추론한 조절 인자(Regulator) TF에 의해서 조절되는 유전자로 가정한다.
그리고 이렇게 변화된 값을 중심으로 Input(Regulator) - Output(nascent RNA) 짝(pair)을 모두 합쳐서 이 짝으로부터 Quine-McCluskey 알고리즘을 이용하여 시뮬레이션 가능한 Boolean 함수(Boolean function)를 만든다.
도 4는 Boolean 논리 모델의 추론을 위한 전사 역학 모델 및 Quine-McCluskey 알고리즘을 이용한 입출력 관계 기반 논리 네트워크 모델을 나타낸다.
Pseudo-state에서 T=0에 해당하는 mature RNA(exonic RNA), TF가 진리표(Truth table)상의 input이 되고 T=1에 해당하는 immature RNA(intronic RNA)가 output이 된다.
진리표 작성시 input은 같으나 다른 output을 가진 행이 빈번하게 발생할 수 있으나 그 수가 적은 행은 노이즈(noise)로 여길 수 있기 때문에 다수에 해당하는 input-output 행을 선택하여 진리표를 완성하고 Boolean 식(expression)을 축소(reduction)하는 알고리즘인 QM 알고리즘을 통해 최소 형태의 Boolean 식을 만들어 최종 Boolean 함수를 만들었다.
도 4를 살펴보면, 세포질에 존재하는 Spliced read가 단백질로 전사되는 부분에서 전사인자(TF)로 존재할 수 있는 TF 모티프를 하나의 유전자를 온/오프 할 수 있는 하나의 머시너리로 가정할 때, 머시너리에서 유전자가 turn on 되어 RNA가 전사되어 있으면 Unspliced read가 있을 것이고, 유전자는 turn on 되었으나, 기존에 전사된 RNA 가 남은 경우라면 Unspliced read는 없을 수 있다. 따라서 Boolean state는 Unspliced read가 존재하면 1이 되고, 존재하지 않으면 0이 된다.
RNA가 발현 또는 발현하지 않는 순간에 관여하는 전사인자(TF)들마다 이러한 이진수 변환을 수행하고 1 또는 0으로 표현되는 TF들의 패턴에 따라 유전자가 발현하면 1, 발현하지 않으면 0 인 로직 형태를 구성할 수 있으며, 이를 통해 어떤 종류의 TF 가 존재할 때 유전자가 발현(1) 또는 발현되지 않는지 (0) 패턴을 도출한다. 이는 약 2000 개 이상의 짝(pair)에 대해 수행할 때 99% 정확도로 각 전사인자의 패턴에 따른 유전자 발현 유무를 확인할 수 있다.
예를 들면, TF1은 TF1;또는 TF3 및 TF4 결합 및 TF5 비결합과 같은 조절 쌍을 통해서 발현(1)될 수 있다. Boolean 식을 살펴보면 TF2 및 TF3은 동시에(and) 1 이어야 하고 TF5는 0 이어야 TF1이 발현된다.
위 과정을 각 Pseudo-state의 모든 유전자들에 대해서 반복해서 모든 짝(pair)에 대해서 적용하고 이 과정에 세포의 원하는 상태를 고정하여 BNsimpleReduction 알고리즘을 적용하면 세포의 목적 상태에 긴밀히 관여하는 소스 유전자 및 타겟 유전자들의 조절 관계 로직을 생성할 수 있다.
구축된 유전자 네트워크는 이후 수학적 조절관계 추론 단계에서 각 유전자의 전사인자(TF)를 찾는 데에 사용된다.
이 과정에서 계산의 효율을 최적화하기 위해서 병렬 컴퓨팅 방법을 적용하였다. 병렬 컴퓨팅이란 대규모 데이터 집합을 처리하거나 복잡한 계산을 수행해야 할 때 유용한 것으로서, 컴퓨터의 중앙처리장치의 각 코어(core)에 각각의 작업을 할당하여 여러 계산을 병렬화하는 것을 의미한다. 이러한 방법을 적용하여 각 CPU마다 조절 관계 로직을 계산하도록 할당하여 병렬화하였고 로직 추론 시간을 크게 단축하였다.
실시예2: 대장세포의 MYB/HDAC2/FOXA2 분화 조절 타겟 발굴
실시예 1에서 구축된 핵심 유전자 네트워크를 대장세포 샘플의 단일세포 전사체 데이터를 이용하여 시뮬레이션하였다.
구체적으로 장 종양으로 진단받은 6명의 환자로부터 수집된 샘플에서(Y Wang, 2019, Cited by 174, J Exp Med (2020) 217 (2): e20191130) 2개의 결장(colon) 샘플 및 2개의 직장(rectum) 샘플에서 얻은 단일 세포 중 흡수 경로 세포에 해당하는 엔테로사이트(Enterocyte) 부분의 총 4252개의 단일세포 데이터를 소스로 사용하였다.
도 5를 살펴보면, 줄기세포능이 높은 세포(Stem cell)에서 분화된 세포(Enterocyte)로 변화하는 가상의 시계열에 따라 정렬된 단일 세포를 400개로 묶어 총 20개의 구간(윈도우)에 대해 조건부 상호정보(CMI) 분석을 수행한 결과 522개의 유전자로 구성된 핵심 유전자 네트워크가 구축되었다. 이 때 걸러지지 않은 간접 링크를 갖는 유전자들을 분리(isolate)하기 위해 SCC(Strongly connected component)를 이용하여 17개의 유전자로 구성된 TF 유전자 네트워크를 재구축하였다.
상기 17개의 유전자 데이터를 도 3의 방법에 따라 이진화하고 각 state의 mature RNA를 Input으로 진리표를 작성한 후 QM 알고리즘을 통해 최소 형태의 최종 Boolean 함수를 생성하였다. 이 후 본 발명자들이 개발한 BNsimpleReduction 알고리즘을 적용하면 강한 조절 관계를 갖는 13개의 유전자로 구성된 로직이 있는 핵심 유전자 조절 네트워크가 구축된다(도 6).
구축된 유전자 네트워크 모델 동역학을 사용된 단일세포 데이터의 동역학과 비교 분석하여 검증하였다(도 7).
먼저 네트워크에 포함된 각 유전자의 이진화된 단일세포 데이터를 pseudo-time에 따라 나타내어 각 유전자의 ON 및 OFF 상태 변화를 확인하였다. 또한 각 세포 타입에 해당하는 이진화 상태를 정의하기 위해, 단일세포 처리 단계에서 분류된 Stem cell과 Late enterocyte(pseudo-time 상의 마지막 300개 세포)의 각 유전자별 평균 활성도를 계산하였으며, 이를 전체 세포의 유전자별 평균 활성도와 비교하여 각 세포 타입에 해당하는 이진화 상태를 결정하였다(도 7A).
이후, 네트워크 모델의 단일 초기상태(initial state)로부터 안정상태(attractor)로 수렴하는 동역학을 비교하였다. Stem cell에 해당하는 초기상태로부터 시뮬레이션을 실시하여 변화하는 상태를 가장 가까운 세포 상태와 대응시켜 맵핑시킨 결과, 초기상태로부터 안정상태로 수렴하는 동역학이 본래 단일세포 데이터와 연관성이 있음을 확인하여, 본래 데이터의 동역학이 유전자 네트워크 모델의 수렴 과정의 동역학(transient dynamics)으로 잘 반영됨을 확인하였다. 도 7B를 보면 시뮬레이션 과정이 pseudo-time 방향과 일치하는 것을 알 수 있다.
또한, 유전자 네트워크 모델이 가지는 모든 고정점(point attractor)을 확인하고, 각 고정점과 가장 가까운 세포 상태와 대응시켜 맵핑시킨 결과, 도 7C를 보면, 고정점들이 전체 데이터에 넓게 분포하고 있으며, 상대적 안정성 (relative basin) 또한 비교적 고르게 분포하고 있다. 또한 가장 가까운 세포 상태와의 거리가 대부분 0 또는 1로, 이는 1개 유전자 내외만이 차이를 보임을 의미해 네트워크의 상태가 실제 세포 상태와 매우 유사하므로 맵핑에 정당성을 부여한다.
추가로, 앞서 결정한 각 세포 타입의 상태와 고정점 간의 유사도를 계산해 맵핑하여, Pseudo-time 변화에 따라 Stem cell의 유사도는 감소, enterocyte의 유사도는 증가함을 확인하였다(도 7D).
이러한 결과는 유전자 네트워크 모델의 안정상태 동역학(Steady state dynamics)이 실제 단일세포 데이터의 동역학을 잘 반영함을 뒷받침한다.
이러한 결과로, 구축된 유전자 네트워크 모델이 원하는 상태로 가는 핵심 유전자 조절인자의 조합을 시뮬레이션할 수 있음이 검증되었다.
BNsimpleReduction은 Boolean 네트워크에서 하나의 원하는 끌개 상태에 대한 다이나믹스 정보를 보존하는데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 노드와 링크만 남기고 나머지는 제거하는 방식으로 네트워크를 축소한 후 모든 끌개 상태로 제어할 수 있다고 알려진 FVS를 적용하여 타겟 컨트롤을 발굴하는 효율적인 전역 안정화 알고리즘이다.
BNsimpleReduction 알고리즘으로 찾은 타겟의 수가 많을 경우에는 모든 조합에 대해 각각 섭동 한 후 끌개 시뮬레이션을 진행하여 얻어낸 평균 활성도를 원하는 상태와 비교하여 similarity score가 높으면서도 그 수가 적은 조합을 최종 타겟으로 발굴한다.
상기 도출된 13개의 유전자로 구성된 유전자 네트워크에서 BNsimpleReduction 알고리즘으로 총 5개의 타겟이 전역 안정화를 위해 도출되었다.
도 8A를 살펴보면, 상기 13개의 유전자로 구성된 네트워크가 축소되고 최소 피드백 세트가 식별된다. 구체적으로 총 5개의 타겟이 탐색되어 이들의 가능한 모든 조합을 적용한 각 시뮬레이션 결과 네트워크의 안정상태와 원하는 상태(enterocyte 고정점)간 유사도를 계산하여 보았을 때, 최적의 3개 타겟(MYB, HDAC2, FOXA2)을 OFF 하는 것으로 약 95% 이상의 유사도를 달성하였다.
최적의 3개 타겟 조합에 대해 그 개수를 늘려가며 네트워크의 형질지형(phenotype landscape)를 확인한 결과 도 8B에서 보는 바와 같이, 단일 혹은 두 개 조합으로는 원하는 상태(enterocyte 고정점)로의 수렴이 일어나지 않았고, MYB, HDAC2, FOXA2 3개 타겟의 동시 적용만이 분화가 되지 않은 네트워크 고정점들을 원하는 상태(enterocyte 고정점)로 수렴시킴을 확인하였다.
상기 과정을 거쳐 MYB/HDAC2/FOXA2 분화 조절 타겟을 발굴하였고 후술하는 실험을 통해 MYB/HDAC2/FOXA2 분화 조절 타겟의 기능을 검증하였다.
실시예 3: MYB/HDAC2/FOXA2 제어에 따른 암세포의 가역화
3-1. 암세포 증식 억제 효과
실시예 2에서 선발된 세포 분화 조절자 MYB, HDAC2 또는 FOXA2의 제어에 따른 암세포주의 증식(Proliferation) 능력 감소 여부를 관찰하였다.
먼저 대장암 세포주 HCT 116, HT 29 및 CACO 2를 이용해 Invitrogen RNAi MAX Forward Transfection 방법으로 형질감염하였다.
구체적으로 각각의 세포주를 24well에 1 x 105의 수로 시딩하고 다음날 형질감염 혼합물을 만들어 각 well에 넣어주었다. 형질감염 혼합물은 다음과 같은 방법으로 만들었다. Opti-MEM 50ul에 각 siRNA를 최종농도가 10nM이 되도록 넣어주고 섞어준다. Opti-MEM 50ul에 RNAi MAX를 1uL 넣어주고 섞어준 다음, 희석된 siRNA와 RNAi max를 섞고 실온에 10분정도 incubation 한다. 각 well에 mixture를 100uL씩 한 방울씩 떨어뜨려 주듯이 넣어주면 최종 부피가 600uL가 되고 최종농도가 10nM이 된다.
MYB, HDAC2, FOXA2 억제에 사용된 siRNA는 표 1에 나타냈다.
형질감염된 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 넉다운 세포주를 24시간이 지난 후 96well로 옮겨서 실시간 세포주 관측장비(InCucyte; inCu saFe, Panasoic)에 넣어주고 3시간 간격으로 사진을 찍어 세포 증식(Proliferation)을 측정하여 도 7에 나타냈다.
도 9a ~ 도 9c를 살펴보면, HCT 116 세포주(a), HT 29 세포주(b), CACO 2 세포주(c) 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 세포의 증식(Proliferation)이 현저히 감소하는 시너지 효과를 나타냈다.
또한 형질감염 후 5일이 지난 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 넉다운 세포주를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 찍은 이미지를 도 10에 나타냈다.
도 10a ~도 10c를 살펴보면, HCT 116 세포주(a), HT 29 세포주(b), CACO 2 세포주(c) 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 세포수가 현저히 감소하여 증식(Proliferation) 억제 시너지 효과를 나타냈으며, 특히 CACO 2 세포주에서 시너지 효과가 우수하였다.
실시예 4: MYB/HDAC2/FOXA2 제어에 따른 암세포의 가역화
실시예 2에서 선발된 세포 분화 조절자 MYB, HDAC2 또는 FOXA2의 제어에 따른 암세포주의 가역화를 확인하였다.
4-2. 암세포의 분화능 증가 효과
MYB, HDAC2 또는 FOXA2 넉다운 세포주에서 장세포 분화 마커의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. 각 마커의 발현을 확인하는 qRT-PCR에 사용한 프라이머의 서열은 표 2에 나타냈다.
구체적으로, 실시예 3에서 HCT 116, HT 29 및 CACO 2 세포주를 형질감염한 후 48시간이 지난 뒤 Total RNA Extraction kit(iNtRON)을 사용하여 RNA를 추출했다. Solgent RTase kit로 추출한 RNA 각 1ug을 사용하여 역전사를 진행해 cDNA를 합성하였다.
cDNA 합성 방법은 RNA 1ug에 총 부피가 10 uL가 되게 증류수를 넣어준다. 50 uM 올리고 dT 프라이머와 50 Um 랜덤 핵사머 프라이머를 섞은 프라이머 혼합물을 1uL 넣어주고 65℃에서 5분 인큐베이션한다. 5분후 혼합물을 얼음에 넣고 2분 이상 식혀준다. 5xRT 반응 완충액(10mM dNTP 포함) 4uL, 8mM DTT 1uL, DiaStar-TM RTase 1uL를 넣고 총 부피 9uL가 되게 증류수를 넣어준다. 이렇게 제조된 RTase 혼합물을 얼음에 식힌 튜브에 넣어준 후 42℃에서 1시간 역전사를 진행하였다.
합성한 cDNA로 표 2의 장세포 분화 마커들의 발현을 확인하기 위해 qRT-PCR을 진행하였다. 합성된 cDNA를 1/10로 희석한 후 희석된 cDNA를 1 uL씩 qRT-PCR 전용 96well에 넣은 다음 2xCYBER GREEN과 프라이머 0.2uM를 넣어주고 총 부피가 20 uL가 되도록 증류수를 넣어준 후 어닐링 온도 65℃에서 진행하고, delta Ct값을 이용해 그린 그래프를 도 11에 나타냈다.
도 11a ~ 도 11c를 살펴보면, HCT 116 세포주(a), HT 29 세포주(b), CACO 2 세포주(c) 모두 MYB, HDAC2 및 FOXA2이 동시에 억제된 경우(siMYB/HDAC2/FOXA2) 장세포 분화 마커의 발현이 증가하는 시너지 효과를 나타났다.
이러한 결과로, 분화 조절 타겟 MYB/HDAC2/FOXA2 조합의 동시 억제에 의해 대장암 세포의 정상 세포로의 분화가 이루어지는 암세포의 가역화를 확인하였다.
실시예 5: MYB/HDAC2/FOXA2 제어에 따른
in vivo
상에서의 암화 억제 효과
동물실험은 한국과학기술원 동물 윤리 위원회에서 승인받은 방법으로 실험이 진행되었으며, 대장암 세포를 이식한 동물 모델을 통해서 MYB, HDAC2 및 FOXA2 억제에 따른 종양의 형성을 관찰하였다.
MYB/HDAC2/FOXA2 억제에 사용된 shRNA는 표 3에 나타낸 바와 같다.
구체적으로, 표 3의 shRNA를 대장암 세포주 HCT 116 및 CACO 2에 형질도입해 MYB, HDAC2 및 FOXA2를 동시에 제어하여 발현을 억제하였다.
발현이 억제된 2종의 세포주를 면역능력이 없는 누드마우스에 왼쪽 등에는 MYB/HDAC2/FOXA2 조합이 정상 발현하는 대장암 세포주(5X106)를, 오른쪽 등에는 MYB/HDAC2/FOXA2 조합의 발현이 억제된 대장암 세포주(5X106)를 이식하였다.
이식 후 7일후부터 이틀 간격으로 생성된 종양의 크기를 측정하였다. 크기는 가장 길이가 긴 곳을 장축으로 짧은 곳을 단축으로 정하고, 각 암세포의 부피(0.5 x 장축 x 단축)를 측정하였다. 이렇게 23-25일을 측정한 결과를 도 12에 나타냈다.
도 12a의 HCT 116 세포주가 이식된 마우스, 도 12b의 CACO 2 세포주가 이식된 마우스 모두, MYB/HDAC2/FOXA2 조합이 정상 발현하는 세포주를 이식받은 Control 대비 MYB/HDAC2/FOXA2 조합의 발현이 억제된 세포주를 이식받은 Triple knockdown 실험군에서 종양의 부피가 크게 억제된 것을 확인하였다(*** : p < 0.001, Wilcoxon rank sum test).
특히 도 12a를 살펴보면, 세번째, 네번째 마우스의 경우 종양이 형성되지 않았음을 확인할 수 있다.
이러한 결과로, 본 발명자들이 구축한 핵심 유전자 네트워크를 통해 발굴한 분화 조절 타겟 MYB/HDAC2/FOXA2 조합의 억제는 시너지를 발휘하여 암세포의 정상 세포로의 분화로 가역화하는 특성으로, 종양의 형성 또는 성장을 현저히 억제할 있음을 확인하였다.
Claims (15)
- a) 줄기세포능이 높은 상태의 세포에서 분화된 세포로 분화되어 가는 가상의 시계열(Pseudo time)에 따라 단일 세포를 정렬하는 단계; b) 상기 단계 a)의 정렬된 각각의 단일 세포를 단일세포 전사체 데이터를 이용하여 핵 내부의 immature RNA(nascent RNA) 및 세포질의 mature RNA(exonic RNA) 특성에 따라, 각각 유전자가 발현하는 turn on, 유전자가 발현하지 않는 turn off Pseudos-state로 분리하는 단계;
c) 상기 a) 단계에서 가상의 시계열(Pseudo time)에 따라 정렬된 단일 세포를 시간의 흐름에 따라 1 그룹 당 X개의 세포가 포함되도록 구간을 나누고 무빙 윈도우(Moving windows) 분석법을 이용하여 시간 흐름에 따른 유전자 간 조건부 상호정보(CMI; Conditional mutual information) 분석을 수행하여 상호 발현에 영향을 미치는 유전자 쌍을 도출하는 단계, 여기에서 X= 100 내지 500개;
d) 상기 c) 단계를 통해 도출된 유전자 쌍 중 직접적인 유전자 조절 쌍이 아닌 유전자 쌍을 Cistarget DB 를 이용하여 제외하여 상호 피드백이 이루어지는 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 구축하는 단계;
e) 상기 단계 d)의 타겟 유전자의 후보 조절인자 데이터를 이진화(discretization)하여 작성된 진리표를 각 Pseudo-state의 모든 유전자의 짝(pair)에 적용하여 시뮬레이션 가능한 조절 관계 로직을 생성하는 단계; 및
f) 상기 단계 e)의 생성된 조절 관계 로직에 BNsimpleReduction 알고리즘을 사용하여 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟을 선발하는 단계; 를 포함하는 핵심 유전자 네트워크를 구축하는 방법에 관한 것이다.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 b)의 mature RNA(exonic RNA)는 조절인자(Regulator)인 전사인자의 양으로 간주하고, immature RNA(nascent RNA)를 상기 조절인자에 의해 조절되는 유전자로 간주하는 것을 특징으로 하는, 방법
- 제1항에 있어서,
상기 단계 c)의 조건부 상호정보(CMI) 분석은 400개의 세포가 포함되도록 구간을 나누고 무빙 윈도우(Moving windows) 분석을 반복 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법
- 제1항에 있어서,
상기 단계 e)의 이진화는 latent time에 따른 unspliced read/spliced read 수가 증가 곡선을 이루는 구간에 해당할 경우 유전자가 발현하는 turned on, State=1인 것으로 결정하고 나머지 구간에 해당할 경우 유전자가 발현하지 않은 turned off, State=0인 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법
- 제1항에 있어서,
상기 단계 e)의 진리표에서 mature RNA(exonic RNA)가 Input이 되고, immature RNA(nascent RNA)가 Output이 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 f)의 전역 안정화를 달성하는 최종 타겟은 네트워크의 안정상태 및 원하는 상태간 유사도(Similarity score)를 비교하여 유사도가 90% ~ 100% 이면서 조절 인자의 수가 적은 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
- MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2은 암세포의 분화 시너지를 유도하는 핵심 조절 인자 조합인 것인, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 억제제는 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것인, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 억제제는 MYB, HDAC2 또는 FOXA2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상 것인, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 가역화를 유도하는 것인, 대장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 항암 보조제.
- MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 포함하는, 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- In vitro에서 MYB 억제제, HDAC2(Histone deacetylase 2) 억제제 및 FOXA2(Forkhead box protein A2) 억제제를 대장암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 대장암세포의 분화된 정상세포 또는 정상 유사 세포로의 전환 유도 방법.
- 다음 단계를 포함하는, 대장암 치료용 제제의 스크리닝 방법:
(a) 대장암세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
(b) 후보 물질이 처리된 대장암세포에서 MYB, HDAC2 및 FOXA2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 MYB, HDAC2 및 FOXA2 발현 수준이 후보 물질 미처리 대조군에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 대장암 치료용 제제로서 판정하는 단계.
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