KR20230140263A - 신규한 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이의 제조방법, 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

신규한 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이의 제조방법, 이를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이의 제조방법, 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다.

Description

신규한 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이의 제조방법, 이를 포함하는 약제학적 조성물{Novel GnRH analogue conjugated with fatty acid and preparing method thereof and a pharmaceutical composition comprising thereof}
본 발명은 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; 이하 'GnRH' 이라 합니다.)의 비침습적 제형 설계를 위하여 자가 조립 나노입자(Self-assembled nanoparticles)를 형성할 수 있는 신규한 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이의 제조방법, 그리고 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
하기 구조를 갖는 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)는 GnRH의 합성 9잔기 펩타이드 유사체이다. 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)는 뇌하수체에 존재하는 황체형성 호르몬(Luteinizing hormone; LH)과 난포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone; FSH)을 자극하여 난소 및 고환 스테로이드 생성을 증가시켜 여성의 경우 에스트로겐(estrogen)을 증가시키고 남성의 경우 테스토스테론(testosterone) 및 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)을 증가시킨다.
주로 자궁 내막증(Endometriosis), 자궁 평활근종(uterine leiomyomas), 진성 성조숙증(Central precocious puberty), 전립선암(Prostate cancer)과 같은 성호르몬 의존성 질환(sex hormone dependent disease)의 치료제로 사용된다. 이 약을 투여 받는 자궁 내막증 환자의 목표는 자궁내막 병변을 줄이고 골반통/압통 및 월경통을 개선하는 것이다. 자궁근종의 경우 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)는 수술 전 빈혈을 치료하고, 근종의 크기를 줄이며, 수술 없이 증상을 개선함으로써 수술 중 출혈을 감소시킬 수 있다. 조숙한 사춘기에 이차 성징의 진행을 늦추는 역할을 한다. 이외에도 다모증(hypertrichosis), 수면 무호흡증(sleep apnea syndrome), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome), 불임(infertility) 등의 치료에 이용될 수 있다.
그러나 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)의 고농도 투여를 통한 치료(자궁 내막증, 전립선암 등)는 주사 부위의 통증, 작열감, 따끔거림 등의 단점이 있으며, 두통, 메스꺼움, 안면 홍조, 식은 땀 등 환자 중심적으로 올바르지 못한다.
특히, 주사에 대한 순응도가 성인에 비해 낮은 소아 환자에서 더 큰 문제이다. 예를 들어 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)의 경우, 대부분 성조숙증 소아에게 주사로 투여되어 통증 유발과 함께 투여 거부감을 일으키는 등 환자 친화적인 투여 제형이라 할 수 없다.
그뿐만 아니라, 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)의 생체 이용률은 낮은 친유성(lipophilic) 및 프로테아제(protease) 및 페티다아제(peptidase)로부터의 제한된 장 흡수로 인해 생물학적 막을 통한 낮은 투과성으로 인해 제한되며, 키모트립신(Chymotrypsin)에 의해 빠르게 분해되고 반감기가 짧다.
이러한 부작용(side effect)를 최소화하기 위해, 여러 연구가 진행 중에 있으며, 널리 시판되는 제품으로 루프론® 데포(Lupron® Depot, Abbvie)이 있다. 이는 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 활성물질로 하여 PLGA[poly(latic-co-gylcolice acid)] 미립구 안에 캡슐화(encaplsulaion) 시킴으로써 체내에서 장기간 약물이 서서히 방출되도록 설계된 제품이다. 그러나, 미립구 제제 특성상 생분해성 중합체로 젤라틴(Gelatin)이 함유되어 아나필락시스(Anaphylaxis) 등 치명적인 부작용 위험이 내포되어 있으며, 낮은 흡수율로 인하여 수개월 동안 덩어리(1ump)가 남아 염증으로 이어지는 문제가 발생하며, 복잡하고 비효율적인 공정으로 인한 경제적 비용 증가. 보관의 어려움 등의 단점이 있다.
추가로 루프론® 데포의 단점을 보완하기 위해 엘리가드주®(Eligard Inj®, Tolmar Pharmaceuticals)가 추가로 개발되었으나, 초기 약물 방출 현상을 가지거나, 혼합 용액 상에서의 낮은 안정성의 단점을 지니고 있다. 초산 루프로라이드(Leuproldie acetate) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)를 통한 페길화(Pegylation) 기술의 활용 연구도 진행되고 있으나, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG) 함유 액포의 면역원성 등의 잠재적인 위험이 있다.
본 특허는 이러한 문제점들을 다양한 소수성 지방산 및 지방산 유도체와 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)의 알코올기(-OH) 혹은 구아니딘(-NH) 부위와 공유적으로 결합하여 펩타이드(Peptide)와 지방산이 가지고 있는 생체 적합 특성을 그대로 유지하는 신규한 양친매성 컨쥬게이트 생체 물질을 합성하고 자가조립 나노입자 (self-assembly nanoparticles)를 형성함으로써 주사제가 아닌 비침습적 제제를 개발하는 나노약물 전달체로 응용하는 기술이다. 지방산에 의해 지용성 증가로 인한 낮은 생체이용률, 흡수 및 안정성에 문제를 해결하고자 한다.
본 특허는 환자친화적인 기술로 대체함으로써 국내 바이오베터 및 개량신약 개발 역량을 한 단계 도약시킬 수 있을 것으로 기대한다.
한국등록특허 제10-2294171호
본 발명은 GnRH 호르몬 성분인 루프로라이드를 지방산 또는 지방산 유도체로 건쥬게이션시켜 자가조립 나노입자의 형성 능력을 부여하고, 약물의 친유성을 증가시키고 물리화학적 특성을 개선함으로써 생물학적 막을 통한 낮은 투과성의 개선과 장기지속형 약물을 방출함으로써 기존의 침습적인 주사 제형을 대체할 수 있는 제제 개발을 위한 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명자는 천연형 상태에서 순환 반감기가 2 내지 4분 정도에 불과한 GnRH의 생체 이용률과 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 신규의 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체를 합성하고자 하였다.
다양한 포화 지방산 길이(라우르산 (C12, 포화), 팔미트산 (C16, 포화), 스테아르산 (C18, 포화))와 불포화 지방산(올레산(C18;1), 리놀레산(C18;2)의 특성을 반영하여 패티게이션(fattigation) 기술에 의한 나노 특성(자가조립 나노특성, 입자크기, 형상변화 특성 등)과 결합 의약품 특성(안정성, 방출속도 등)을 최적화하는 지방산 또는 지방산 유도체 선정 전략을 제공한다.
본 발명은 약물의 친유성을 증가시키고 물리화학적 특성을 개선함으로써 생물학적 막을 통한 낮은 투과성의 개선과 장기지속형 약물을 방출할 수 있다.
도 1은 실시예 1 내지 3에 따른 Hydrxoyl group target 합성법에서 루프로라이드-지방산 접합 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 4 내지 6에 따른 Amine group target 합성법에서 루프로라이드-지방산 접합 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 3a는 초산 루프로라이드(LEU), 지방산(Stearic acid, Oleic acid, Linoleic acid), 초산 루프로라이드와 지방산의 물리적 혼합물, 및 실시예 1~3에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체(LSC, LOC, LLC)의 FT-IR 분석을 나타낸 도면이다.
도 3b는 초산 루프로라이드(LEU), 지방산(Lauric acid, Palmitic acid, Stearic acid), 초산 루프로라이드와 지방산의 물리적 혼합물, 및 실시예 4~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체(LLC, LPC, LSC)의 FT-IR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4a는 초산루프로라이드의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4b는 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4c는 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4d는 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4e는 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4f는 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 4g는 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 1H-NMR 분석을 나타낸 도면이다.
도 5a는 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 MALDI-TOF 분석을 나타낸 도면이다.
도 5b는 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 MALDI-TOF 분석을 나타낸 도면이다.
도 5c는 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 MALDI-TOF 분석을 나타낸 도면이다.
도 5d는 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 MALDI-TOF 분석을 나타낸 도면이다.
도 5e는 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 MALDI-TOF 분석을 나타낸 도면이다.
도 5f는 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 MALDI-TOF 분석을 나타낸 도면이다.
도 6a는 초산 루프로라이드, 지방산(Stearic acid), 초산 루프로라이드와 지방산(Stearic acid)의 물리적 혼합물, 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 DSC 분석을 나타낸 도면이다.
도 6b는 초산 루프로라이드, 지방산(Oleic acid), 초산 루프로라이드와 지방산(Oleic acid)의 물리적 혼합물, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 DSC 분석을 나타낸 도면이다.
도 6c는 초산 루프로라이드, 지방산(Linoleic acid), 초산 루프로라이드와 지방산(Linoleic acid)의 물리적 혼합물, 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 DSC 분석을 나타낸 도면이다.
도 6d는 초산 루프로라이드, 지방산(Lauric acid), 초산 루프로라이드와 지방산(Lauric acid)의 물리적 혼합물, 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 DSC 분석을 나타낸 도면이다.
도 6e는 초산 루프로라이드, 지방산(Palmitic acid), 초산 루프로라이드와 지방산(Palmitic acid)의 물리적 혼합물, 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 DSC 분석을 나타낸 도면이다.
도 6f는 초산 루프로라이드, 지방산(Stearic acid), 초산 루프로라이드와 지방산(Stearic acid)의 물리적 혼합물, 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 DSC 분석을 나타낸 도면이다.
도 7a는 실시예 7~9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LSN, LON, LLN)의 DLS 측정값을 나타낸 도면이다.
도 7b는 실시예 10~12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LLN, LPN, LSN)의 DLS 측정값을 나타낸 도면이다.
도 8a는 초산 루프로라이드, 실시예 7~9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LSN, LON, LLN)의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 8b는 초산 루프로라이드, 실시예 10~12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LLN, LPN, LSN)의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 9a 및 도 9b는 루프로라이드와 실시예 1~3에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체(LSC, LOC, LLC)의 붕해실험 및 방출 결과를 나타낸 도면이다.
도 9c 및 도 9d는 루프로라이드와 실시예 4~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체(LLC, LPC, LSC)의 붕해실험 및 방출 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 초산 루프로라이드의 투과실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 10b는 실시예 7~9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LSN, LON, LLN)의 투과실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 10c는 실시예 10~12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LLN, LPN, LSN)의 투과실험 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 발명의 발명자들은 생체 이용률과 친유성을 증가시킬 수 있는 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체를 제조하였으며, 이는 생물학적 막 투과성을 향상시켜 약물제제로 활용될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
신규한 GnRH 유도체
본 발명은 친수성의 루프로라이드; 및 결합을 통해 상기 루프로라이드와 콘쥬게이션된 소수성의 지방산을 포함하는 신규한 GnRH 유도체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 결합은 에스터(-C(=O)O) 또는 아미드(-(C=O)NH-) 결합 중 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)의 알코올기(-OH) 혹은 구아니딘(-NH) 부위와 지방산과의 공유 결합이 형성된다.
본 발명에 있어서, 상기 지방산은 포화 지방산 또는 불포화 지방산 중 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 포화 지방산은 이중 결합없이 단일결합으로 이루어진 것을 의미하며, 불포화 지방산은 이중 결합을 포함하고 있는 것을 의미하며, 포화 지방산 또는 불포화 지방산은 탄소 길이 또한 다를 수 있다.
또한, 에스터 형태에서 지방산은 동물에서 중요한 에너지원이며, 세포의 구조적 구성 성분이므로 생체 내에 널리 존재하는 지방산의 일종으로 독성 및 부작용이 거의 없어 장기간 복용해도 안심하고 사용할 수 있기 때문에 본 발명에 따라 제조된 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체는 생체적합하며, 생분해성 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포화 지방산은 카프릴산(Caprylic acid), 카프르산(Capric acid), 라우르산(Lauric acid), 미리스트산(Myristic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 스테아르산(Stearic acid), 아라키드산(Arachidic acid), 비헨산(Behenic acid), 리그노세르산(Lignoceric acid) 및 세로트산(Cerotic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 불포화 지방산으로는 시스(cis) 입체 배치는 이중 결합에 인접한 두 개의 수소 원자가 사슬의 같은 측면에 위치하고 있는 지방산과 대조적으로 트랜스 입체 배치는 이중 결합에 인접한 두 개의 수소 원자가 사슬의 서로 반대 측면에 위치하고 있 트랜스(trans) 지방산으로 구별된다.
구체적으로, 상기 불포화 지방산은 미리스톨레산(Myristoleic acid), 팔미톨레산(Palmitoleic acid), 사피엔산(Sapienic acid), 올레산(Oleic acid), 엘라이드산(Elaidic acid), 박센산(Vaccenic acid), 리놀레산(Linoleic acid), 리노엘라이드산(Linoelaidic acid), 아라키돈산(Arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid), 에루크산(Erucic acid) 및 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신규한 GnRH 유도체는 루프로라이드와 지방산이1:1 내지 10 의 몰비로 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 포화도에 따른 지방산으로 스테아르산[Stearic acid(C18,0π)], 올레산[Oleic acid(C18,1π)] 및 리놀레산[Linoleic acid(C18,2π)]를 선정하여 루프로라이드에 존재하는 수산기에 접합하였으며, 길이에 따른 지방산으로 라우르산[Lauric acid(C12)], 팔미트산[Palmitic acid(C16)] 및 스테아르산[Stearic acid(C18)]을 선정하여 루프로라이드에 존재하는 구아니딘(Guanidine)의 아민기에 접합하였다.
본 발명에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 하기 화학식 I로 이루어진 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
R1은 C7-C31 알킬기 또는 C11-C31 알케닐기이고,
R2는 임.
본 발명에 있어서, 상기 R1은 C13-C21 알킬기 또는 C13-C21 알케닐기일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 GnRH 유도체는 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
<단계 1>
상기 <단계 1>은, 출발물질인 지방산 (R1은 위에서 설명한 바와 같다.)과 트리에틸아민과의 산 염기 반응을 통해 카르복실레이트 를 합성하는 단계이다.
<단계 2>
상기 <단계 2>는, 상기 <단계 1>에서의 카르복실레이트인 와 벤조일 클로라이드인 를 반응시켜 산무수물 을 합성하는 단계이다.
<단계 3>
상기 <단계 3>은 상기 <단계 2>의 산무수물인 과 (DMAP)의 아실치환반응(acyl substitution reaction)을 통해 를 합성하는 단계이다.
<단계 4>
상기 <단계 4>는 상기 <단계 3>의 와 루프로라이드를 간략히 표시한 의 알코올기(-OH) (R2는 위에서 설명한 바와 같다.)와의 반응을 통해 를 합성하는 단계이다.
<단계 5>
상기 <단계 5>는 상기 <단계 4>의 와 (DMAP)의 산염기 반응을 통해 화학식 I로 표시되는 GnRH 유도체를 합성하는 단계이다.
위와 같은 화학식 I로 표시되는 GnRH 유도체를 합성하는 단계는 도 1에 상세히 기술하였는 바, 이를 참조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 GnRH 유도체는 하기 화학식 I-1, I-2 또는 I-3 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 I-1]
[화학식 I-2]
[화학식 I-3]
본 발명에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 하기 화학식 II로 이루어진 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 II]
상기 화학식 II에서,
R3는 C7-C31 알킬기 또는 C11-C31 알케닐기이고,
R4는 임.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 II로 표시되는 GnRH 유도체는 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
<단계 1>
상기 <단계 1>은 상기 루프로라이드를 간략히 표기한 의 구아니딘(-NH) 부위 (R4는 위에서 설명한 바와 같다.)와 N-하이드로석신이미드와 지방산의 반응을 통해 합성된 지방산 유도체 (R3는 위에서 설명한 바와 같다.)와의 반응을 통해 중간체인 를 거쳐 화학식 II로 표시되는 GnRH 유도체를 합성하는 단계이다.
위와 같은 화학식 II로 표시되는 GnRH 유도체를 합성하는 단계는 도 2에 상세히 기술하였는 바, 이를 참조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 R3은 C11-C17 알킬기일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 II로 표시되는 GnRH 유도체는 하기 화학식 II-1, II-2 또는 II-3 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 II-1]
[화학식 II-2]
[화학식 II-3]
본 발명에 따른 GnRH 유도체는 친수성 환경에서 자가조립을 통해 나노입자를 형성하며, 지방산과 지방산 유도체에 따라 흡수과정에서 형상변화(deformable)의 영향으로 양친매성 생체물질 약품 특성을 갖는다.
확인한 본 발명의 GnRH 유도체는 생분해성 중합체의 우월한 생체 반감기를 갖는다. 이는 특히 소아에 사용하는 경우 유리하며, 임플란트(implant)와 침습적 방법으로 사용하는 제형으로의 가능성을 보일 수 있다.
GnRH 유도체의 제조방법
본 발명은 초산 루프로라이드를 물에 용해시킨 후 염기 화합물을 첨가하여 루프로라이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 및 상기 루프로라이드를 포함하는 수용액에, 지방산 또는 지방산 유도체를 포함하는 용액을 첨가하는 단계를 포함하는 것인 루프로라이드에 콘쥬게이션된 지방산을 포함하는 GnRH 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 지방산 또는 지방산 유도체를 포함하는 용액을 첨가하는 단계 이후에 하기 단계를 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용액을 동결 건조하여 분말을 제조하는 단계; 및
분말의 합성물을 정제하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 지방산 유도체는 지방산과 반응기가 에스터 결합을 통해 형성된 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 반응기는 N-하이드로석신이미드일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 초산 루프로라이드와 지방산 또는 지방산 유도체는 1:1 내지 10 의 몰비로 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 루프로라이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계에서, 염기촉매제를 첨가하여 초산을 탈착(Desorption)하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 염기촉매제는 N,N-디메틸아미노피리미딘일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 초산 루프로라이드의 Hydroxyl group target의 경우, 우수한 친핵성 염기촉매제로 N,N-디메틸아미노피리미딘(DMAP)을 첨가함으로써 알코올과의 빠른 반응을 가능하게 한다. 새로 형성된 중간체는 방해를 덜 받고 아실기는 여전히 극성이며 에스테르의 생성과 동시에 카르복실산이 부생하게 된다.
위에서 기술된 신규한 GnRH 유도체에 관한 내용은 서로 모순되지 않는 한 GnRH 유도체의 제조방법에서 모두 적용될 수 있다.
자가조립 나노입자
본 발명은 지방산을 포함하는 소수성 코어; 및 상기 코어의 외부에 위치하며 상기 지방산과 결합된 루프로라이드를 포함하는 친수성의 쉘을 포함하는 자가조립 나노입자를 제공한다.
위에서 기술된 신규한 GnRH 유도체에 관한 내용은 서로 모순되지 않는 한 자가조립 나노입자에서 모두 적용될 수 있다.
자가조립 나노입자 제조방법
본 발명은 상기 GnRH 유도체를 용매에 첨가하여 용액을 제조하는 단계; 및 상기 용액을 교반하는 단계를 포함하는 것인 코어-쉘 구조의 자가조립 나노입자 제조방법을 제공한다.
위에서 기술된 신규한 GnRH 유도체에 관한 내용은 서로 모순되지 않는 한 자가조립 나노입자의 제조방법에서 모두 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예
실시예 1~3 : Hydroxyl group target 합성법을 통한 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 제조
실시예 1: 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체의 제조(GnRH anologe with conjugated Leprolide and stearic acid); LSC
실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 합성법은 Yamaguchi esterification 화학반응을 활용하였다.
먼저, 127 mg (0.1 mM)의 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 6 mL 탈이온수에 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 그런 다음, 아세테이트 탈착(Desorption)을 위해 14 μL 트리에틸아민을(Triethylamine)을 상기 탈이온수에 용해시키고 교반시켜주었다.
다른 용액으로 4 mL 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF) 용액에 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)와 동일한 농도로 28.45 mg (0.1 mM) 스테아르산(stearic acid)이 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. 그 다음 염화벤조일(Benzoyl chloride) 12 μL 및 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine; DAMP) 1.222 mg을 THF 용액에 용해시켜 산 무수물을 만들어 주었다. 상기 탈이온수와 THF 용액을 1시간씩 교반시켜준 뒤, THF 용액을 0.45 μm 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene; PTFE) 필터 주사기(Whatman, England)를 사용하여 탈이온수 용액에 주입하고 3시간 동안 교반한 뒤, 이 용액을 탈이온수에 대해 막(1,000 Da MWCO)을 사용하여 24시간 동안 투석하였다.
마지막으로 채취한 투석 용액을 동결 건조(조건: -80℃)시켜 분말을 채취하였다. 이 분말들은 펩타이드의 정화에 가장 일반적으로 사용되는 기술인 분취-고성능 액체 크로마토그래피(preparative-High Performance Liquid Chromatography; Prep-HPLC)에 의해 정제하여 상기 화학식의 구조를 갖는 고순도 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체를 합성하였다.
모든 실험은 상온(20~25℃)에서 진행하였으며, 교반속도는 700 rpm으로 수행하였다.
<Prep-HPLC의 Gradient 용매 비율>
실시예 2: 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체의 제조(GnRH anologe with conjugated Leprolide and oleic acid); LOC
실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체 합성법 역시 Yamaguchi esterification 화학반응을 활용하였다.
먼저, 127 mg (0.1 mM)의 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 6 mL 탈이온수에 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 그런 다음, 아세테이트 탈착(Desorption)을 위해 14 μL 트리에틸아민을(Triethylamine)을 상기 탈이온수에 용해시키고 교반시켜주었다.
다른 용액으로 4 mL 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF) 용액에 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)와 동일한 농도로 28.25 mg (0.1 mM) 올레산(oleic acid)이 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. 그 다음 염화벤조일(Benzoyl chloride) 12 μL 및 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine; DAMP) 1.222 mg을 THF 용액에 용해시켜 산 무수물을 만들어 주었다. 상기 탈이온수와 THF 용액을 1시간씩 교반시켜준 뒤, THF 용액을 0.45 μm 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene; PTFE) 필터 주사기(Whatman, England)를 사용하여 탈이온수 용액에 주입하고 3시간 동안 교반한 뒤, 이 용액을 탈이온수에 대해 막(1,000 Da MWCO)을 사용하여 24시간 동안 투석하였다.
마지막으로 채취한 투석 용액을 동결 건조(조건: -80℃)시켜 분말을 채취하였다. 이 분말들은 펩타이드의 정화에 가장 일반적으로 사용되는 기술인 분취-고성능 액체 크로마토그래피(preparative-High Performance Liquid Chromatography; Prep-HPLC)에 의해 정제하여 (Prep-HPLC의 Gradient 용매 비율은 실시예 1과 동일함) 상기 화학식의 구조를 갖는 고순도 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체를 합성하였다.
모든 실험은 상온(20~25℃)에서 진행하였으며, 교반속도는 700 rpm으로 수행하였다.
실시예 3: 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체의 제조(GnRH anologe with conjugated Leprolide and linoleic acid); LLC
실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체 합성법 역시 Yamaguchi esterification 화학반응을 활용하였다.
먼저, 127 mg (0.1 mM)의 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 6 mL 탈이온수에 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 그런 다음, 아세테이트 탈착(Desorption)을 위해 14 μL 트리에틸아민을(Triethylamine)을 상기 탈이온수에 용해시키고 교반시켜주었다.
다른 용액으로 4 mL 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF) 용액에 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)와 동일한 농도로 28.04 mg (0.1 mM) 리놀레산(linoleic acid)이 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. 그 다음 염화벤조일(Benzoyl chloride) 12 μL 및 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine; DAMP) 1.222 mg을 THF 용액에 용해시켜 산 무수물을 만들어 주었다. 상기 탈이온수와 THF 용액을 1시간씩 교반시켜준 뒤, THF 용액을 0.45 μm 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene; PTFE) 필터 주사기(Whatman, England)를 사용하여 탈이온수 용액에 주입하고 3시간 동안 교반한 뒤, 이 용액을 탈이온수에 대해 막(1,000 Da MWCO)을 사용하여 24시간 동안 투석하였다.
마지막으로 채취한 투석 용액을 동결 건조(조건: -80℃)시켜 분말을 채취하였다. 이 분말들은 펩타이드의 정화에 가장 일반적으로 사용되는 기술인 분취-고성능 액체 크로마토그래피(preparative-High Performance Liquid Chromatography; Prep-HPLC)에 의해 정제하여 (Prep-HPLC의 Gradient 용매 비율은 실시예 1과 동일함) 상기 화학식의 구조를 갖는 고순도 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체를 합성하였다.
모든 실험은 상온(20~25℃)에서 진행하였으며, 교반속도는 700 rpm으로 수행하였다.
실시예 4~6 : Amine group target 합성법을 통한 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 제조
실시예 4: 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체의 제조(GnRH anologe with conjugated Leprolide and lauric acid); LLC
실시예 4에 따른 루프로라이드- 라우르산 합성법은 N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 접합 화학반응을 활용하였다.
먼저, 127 mg (0.1mM) 의 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 10 mL의 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 7.4 용액에 용해하였다.
그리고 실험실 온도(20~25℃℃)에서 500 rpm으로 3시간 동안 아세테이트가 탈착된(Desorption) 루프로라이드가 침전할 때까지 교반하였다.
이와 동시에, 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)와 동일한 농도로 29.74 mg (0.1 mM) 라우르산-NHS 에스터 시약을 10 mL의 THF에 용해하였다.
그 후 루프로라이드와 라우르산의 결합을 위해 상기 PBS 용액과 THF 용액을 50℃에서 500 rpm으로 4시간 동안 교반하여 혼합하였고, 혼합 용액을 탈이온수에 막(1,000 Da MW)을 사용하여 24시간 동안 투석하였다.
마지막으로 채취한 투석 용액을 50 mL 튜브(tube)에 동결 건조(조건: -80℃)시켜 분말을 채취하였다. 건조하여 얻은 분말을 분취-고성능 액체 크로마토그래피(preparative-High Performance Liquid Chromatography; Prep-HPLC)를 통해 정제하여 상기 화학식의 구조를 갖는 고순도 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체를 합성하였다.
<Prep-HPLC의 Gradient 용매 비율>
실시예 5: 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체의 제조(GnRH anologe with conjugated Leprolide and palmitic acid); LPC
실시예 5에 따른 루프로라이드- 팔미트산 합성법은 N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 접합 화학반응을 활용하였다.
먼저, 127 mg (0.1mM) 의 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 10 mL의 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 7.4 용액에 용해하였다.
그리고 실험실 온도(20-25℃℃)에서 500 rpm으로 3시간 동안 아세테이트가 탈착된(Desorption) 루프로라이드가 침전할 때까지 교반하였다.
이와 동시에, 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)와 동일한 농도로 35.35 mg (0.1 mM) 팔미트산-NHS 에스터 시약을 10 mL의 THF에 용해하였다.
그 후 루프로라이드와 팔미트산의 결합을 위해 상기 PBS 용액과 THF 용액을 50℃에서 500 rpm으로 4시간 동안 교반하여 혼합하였고, 혼합 용액을 탈이온수에 막(1,000 Da MW)을 사용하여 24시간 동안 투석하였다.
마지막으로 채취한 투석 용액을 50 mL 튜브(tube)에 동결 건조(조건: -80℃)시켜 분말을 채취하였다. 건조하여 얻은 분말을 분취-고성능 액체 크로마토그래피(preparative-High Performance Liquid Chromatography; Prep-HPLC)를 통해 정제하여(Prep-HPLC의 Gradient 용매 비율은 실시예 4와 동일함) 상기 화학식의 구조를 갖는 고순도 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체를 합성하였다.
실시예 6: 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체의 제조(GnRH anologe with conjugated Leprolide and stearic acid); LSC
실시예 6에 따른 루프로라이드- 스테아르산 합성법은 N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 접합 화학반응을 활용하였다.
먼저, 127 mg (0.1mM) 의 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 10 mL의 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 7.4 용액에 용해하였다.
그리고 실험실 온도(20-25℃℃)에서 500 rpm으로 3시간 동안 아세테이트가 탈착된(Desorption) 루프로라이드가 침전할 때까지 교반하였다.
이와 동시에, 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)와 동일한 농도로 38.16 mg (0.1 mM) 스테아르산-NHS 에스터 시약을 10 mL의 THF에 용해하였다.
그 후 루프로라이드와 스테아르산의 결합을 위해 상기 PBS 용액과 THF 용액을 50℃에서 500 rpm으로 4시간 동안 교반하여 혼합하였고, 혼합 용액을 탈이온수에 막(1,000 Da MW)을 사용하여 24시간 동안 투석하였다.
마지막으로 채취한 투석 용액을 50 mL 튜브(tube)에 동결 건조(조건: -80℃)시켜 분말을 채취하였다. 건조하여 얻은 분말을 분취-고성능 액체 크로마토그래피(preparative-High Performance Liquid Chromatography; Prep-HPLC)를 통해 정제하여(Prep-HPLC의 Gradient 용매 비율은 실시예 4와 동일함) 상기 화학식의 구조를 갖는 고순도 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체를 합성하였다.
실시예 7~9: Hydroxyl group target 합성법에 따른 실시예 1~3의 신규한 GnRH 유도체의 나노화 조성물 제조
실시예 7: 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체의 나노화 조성물의 제조; LSN
실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체의 자가 조립 나노 입자는 재침전법 방식으로 준비되었다.
구체적으로, 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 약 10 mg을 1 mL 에탄올에 녹인 후 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액 10 mL를 서서히 주입하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해 하루 동안 교반하여 나노화를 수행함으로써 자가 조립 나노 입자를 제조하였다.
실시예 8: 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체의 나노화 조성물의 제조; LON
실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체의 자가 조립 나노 에멀젼은 재침전법 방식으로 준비되었다.
구체적으로, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체 약 10 mg을 1 mL 에탄올에 녹인 후 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액 10 mL를 서서히 주입하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해 하루 동안 교반하여 나노화를 수행함으로써 자가 조립 나노 입자를 제조하였다.
실시예 9: 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체의 나노화 조성물의 제조; LLN
실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체의 자가 조립 나노 에멀젼은 재침전법 방식으로 준비되었다.
구체적으로, 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체 약 10 mg을 1 mL 에탄올에 녹인 후 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액 10 mL를 서서히 주입하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해 하루 동안 교반하여 나노화를 수행함으로써 자가 조립 나노 입자를 제조하였다.
실시예 10~12: Amine group target 합성법 에 따른 실시예 4~6의 신규한 GnRH 유도체의 나노화 조성물 제조
실시예 10: 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체의 나노화 조성물의 제조
실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체의 자가 조립 나노 에멀젼은 재침전법 방식으로 준비되었다.
구체적으로, 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체 약 10 mg을 1 mL 에탄올에 녹인 후 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액 10 mL를 서서히 주입하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해 하루 동안 교반하여 나노화를 수행함으로써 자가 조립 나노 입자를 제조하였다.
실시예 11: 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체의 나노화 조성물의 제조; LPN
실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체의 자가 조립 나노 에멀젼은 재침전법 방식으로 준비되었다.
구체적으로, 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체 약 10 mg을 1 mL 에탄올에 녹인 후 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액 10 mL를 서서히 주입하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해 하루 동안 교반하여 나노화를 수행함으로써 자가 조립 나노 입자를 제조하였다.
실시예 12: 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체의 나노화 조성물의 제조; LSN
실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체의 자가 조립 나노 에멀젼은 재침전법 방식으로 준비되었다.
구체적으로, 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 약 10 mg을 1 mL 에탄올에 녹인 후 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액 10 mL를 서서히 주입하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해 하루 동안 교반하여 나노화를 수행함으로써 자가 조립 나노 입자를 제조하였다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실험예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실험예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실험예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실험예
실험예 1. 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 동정 및 물리화학적 특성 확인
1. 분석방법
(1) 푸리에 변환-적외선(FT-IR) 분광계 분석
실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 분말 및 각 지방산 분말을 FT-IR 분광계(Nicolet iS50, Thermo, Japan)로 조사하였다. 루프로라이드와 지방산 사이의 결합 합성을 확인하는데 사용되었다. 분석시 샘플의 1 mg을 건조 브로민화 칼륨(KBr) 200 mg과 혼합했다. 압축된 혼합물 펠릿은 400 ~ 2000 cm-1의 파장 설정에서 2 cm-1의 해상도로 스캔하였다.
(2) 양성자 핵자기공명(1H-NMR) 분석
루프로라이드와 지방산 결합 및 각 지방산 분말을 12 mg/0.6 mL 농도의 용매로 DMSO에 용해하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 25℃(96개 스캔)에서 Bruker ADVANCE Ⅱ400 MHz 분광계를 사용하여 기록하였다.
(3) 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI-TOF/TOF) 분석
주파수 200 Hz의 Autoflex maX TOF/TOF (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) 를 사용하여 MALDI TOF/TOF MS에 의해 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 분자량을 확인하였다.
α-cyano-4-하이드록시신남산(CHCA, MW189.04 Da), MW <10,000Da인 펩타이드 보정 시약에 적합한 매트릭스 선택하였고. 2,5-다이하이드록시벤조산(2,5-DHB, MW 154.03 Da)은 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 분석에 사용되었다.
prep-HPLC로 정제된 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 샘플을 사용했다. 샘플은 75% ACN 용액이므로 20 nl 샘플과 20 nl 2,5-DHB 매트릭스의 혼합물을 1:1 비율로 준비하였고, 동결 건조된 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 2 mg을 1.0 mL 메탄올에 용해시켰다. 시료는 Template (MTP 384 Target Plate Ground Steel BC, Bruker, DE)에 적재한 후 진공건조기로 유기용매를 건조시킨 후 측정하였다.
(4) 시차주사열량계(DSC) 분석
DSC 200 F3 Maia(Netzsch, Germany)를 이용하여 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate) 와 지방산의 물리적 혼합물 및 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 열변화량을 통한 물리화학적 특성을 확인하였다. 각 샘플을 5 mg씩 칭량하여 -20 ℃에서 180 ℃까지 10 ℃/min의 가열 속도로 가열하고 퍼지 프로세스(purge process)에 사용된 질소 가스로 분석했다. 온도 보정 및 열 흐름은 인듐(indium)을 사용하여 수행하였다.
2. 분석결과
(1) 푸리에 변환-적외선(FT-IR) 분광계 분석 결과
도 3a를 참조하면, 초산 루프로라이드의 결과, O-H 결합 피크는 3274 cm-1에서 나타났고, C=O stretch 피크는 1624 cm-1에서 나타났다. 스테아르산, 올레산, 리놀레산의 순서로 CH2 피크는 2845,2914 cm-1, 2853,2922 cm-1, 2853, 2923, 3008 cm-1, 카복실기의 경우 1695 cm-1,1707.93cm-1, 1707.75cm-1에서 피크값을 나타낸다. 이 값은 에스터화를 통한 접합으로 피크 이동을 보여준다. 기존 O-H 결합은 피크 시프트를 통해 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 경우 3,285cm-1, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 경우 3,282cm-1, 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 경우 3,286cm-1로 변경되었다. 에스터화 반응은 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)의 C=O stretch site에서도 발생했는데, 이는 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)와 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 경우 1,651cm-1, 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 경우 1,645cm-1임을 시사한다. 마지막으로 기존 지방산의 CH2 stretch 역시 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 경우 2,853, 2,924 cm-1, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 경우 2,855, 2,927 cm-1, 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 경우 2,860, 2,930, 3,015 cm-1의 피크 이동을 보였다. 이를 통해 초산 루프로라이드와 지방산(스테아르산, 올레산 및 리놀레산)의 결합을 통해 물리화학적 성질이 변화함을 확인하였다.
도 3b를 참조하면, 1,624.45 cm-1의 피크는 초산 루프로라이드의 아미노기와 지방산 사이에 아미드 결합이 형성되었음을 나타낸다. 또한 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체(LFC)는 파수에 변화를 일으켰다. 약 1,711 cm-1의 피크는 접합 후 N-H 형성에 기인하며, (-CH2-)n 그룹 및 지방산 사슬 길이와 관련하여 2,850-2,909 cm-1에서 특징적인 흡수 피크가 감지되었다. 이를 통해 초산 루프로라이드와 지방산(라우르산, 팔미트산 및 스테아르산)의 결합을 통해 물리화학적 성질이 변화함을 확인하였다.
(2) 양성자 핵자기공명(1H-NMR) 분석 결과
도 4a를 참조하면, 초산 루프로라이드의 1H-NMR 분석결과의 경우, 2.5 ppm에서는 용매 DMSO-d6에 대한 peak값을 확인하였으며, 6.5 - 9 ppm사이에서는 초산 루프로라이드의 고유 방향족 그룹의 peak값을 확인하였다.
도 4b를 참조하면, 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 1H-NMR 분석결과의 경우. 0.8 ppm에서 스테아르산의 CH3 peak값과 1.2 ppm에서 스테아르산의 CH2 peak값이 온전하며, 12 ppm 부근에서의 스테아르산의 카르복실산 peak값이 사라짐을 확인하였다. 또한 3.65ppm에서 메틸 에스테르 메톡시기 peak 생성을 통해 루프로라이드와 지방산의 결합을 통한 에스터화 반응을 확인하였다.
도 4c를 참조하면, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 1H-NMR 분석결과의 경우. 0.8 ppm에서 올레산의 CH3 peak값과 1.2 ppm에서 올레산의 CH2 peak값과 5.3 ppm에서의 이중결합 peak값이 온전하며, 12 ppm 부근에서의 올레산의 카르복실산 peak값이 사라짐을 확인하였다. 또한 3.65 ppm에서 메틸 에스테르 메톡시기 peak 생성을 통해 루프로라이드와 지방산의 결합을 통한 에스터화 반응을 확인하였다.
도 4d를 참조하면, 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 1H-NMR 분석결과의 경우. 0.8 ppm에서 리놀레산의 CH3 peak값과 1.2 ppm에서 리올레산의 CH2 peak값과 5.3 ppm에서의 이중결합 peak값이 온전하며, 12 ppm 부근에서의 리올레산의 카르복실산 peak값이 사라짐을 확인하였다. 또한 3.65 ppm에서 메틸 에스테르 메톡시기 peak 생성을 통해 루프로라이드와 리놀레산의 결합을 통한 에스터화 반응을 확인하였다.
도 4e를 참조하면, 초산 루프로라이드의 스펙트럼에서 10.82 ppm의 피크는 이미다졸 고리의 Ha에 할당된다. 이미다졸일(Imidazolyl) 그룹에 결합하면 피크가 아래쪽으로 이동하는 경향이 있지만 확인되지 않았다. 또한, 초산 루프로라이드의 6.76 및 7.50 ppm 피크는 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 7.22 및 7.82 ppm으로 이동했다. 이는 구아니딘기에 부착된 양성자의 변화로 추정할 수 있다. 또한, 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 1H NMR 스펙트럼은 1.2-1.3ppm에서 라우르산 피크를 확인하였다. 이러한 피크는 지방산의 (-CH2-)n 사슬을 온전하게 유지하며 결합이 일어남을 확인하였다.
도 4f를 참조하면, 초산 루프로라이드의 스펙트럼에서 10.82 ppm의 피크는 이미다졸 고리의 Ha에 할당된다. 이미다졸일(Imidazolyl) 그룹에 결합하면 피크가 아래쪽으로 이동하는 경향이 있지만 확인되지 않았다. 또한, 초산 루프로라이드의 6.76 및 7.50 ppm 피크는 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 7.22 및 7.82 ppm으로 이동했다. 이는 구아니딘기에 부착된 양성자의 변화로 추정할 수 있다. 또한, 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 1H NMR 스펙트럼은 1.2-1.3 ppm에서 팔미트산 피크를 확인하였다. 이러한 피크는 지방산의 (-CH2-)n 사슬을 온전하게 유지하며 결합이 일어남을 확인하였다.
도 4g를 참조하면, 실시예 6에 따른 초산루프로라이드의 스펙트럼에서 10.82 ppm의 피크는 이미다졸 고리의 Ha에 할당된다. 이미다졸일(Imidazolyl) 그룹에 결합하면 피크가 아래쪽으로 이동하는 경향이 있지만 확인되지 않았다. 또한, 초산 루프로라이드의 6.76 및 7.50 ppm 피크는 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 7.22 및 7.82 ppm으로 이동했다. 이는 구아니딘기에 부착된 양성자의 변화로 추정할 수 있다. 또한, 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 1H NMR 스펙트럼은 1.2-1.3 ppm에서 스테아르산 피크를 확인하였다. 이러한 피크는 지방산의 (-CH2-)n 사슬을 온전하게 유지하며 결합이 일어남을 확인하였다.
(3) 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI-TOF/TOF) 분석 결과
도 5a를 참조하면, PREP-HPLC 정제과정을 통한 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 MALDI-TOF 분석결과이다. 초산 루프로라이드는 TEA에 의한 탈착으로 인해 아세테이트 구조를 잃으며. 스테아르산과의 접합이 일어나면 에스터화 반응에서 탈수반응이 일어난다. 이러한 점을 고려하여 이론 분자량을 계산하면 1,475.8 g/mol이다. [도 5a]에 도시된 바와 같이 분자량은 이론 분자량값과 일치하게 나타남을 확인하였다.
도 5b를 참조하면, PREP-HPLC 정제과정을 통한 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 MALDI-TOF 분석결과이다. 초산 루프로라이드는 TEA에 의한 탈착으로 인해 아세테이트 구조를 잃으며. 올레산과의 접합이 일어나면 에스터화 반응에서 탈수반응이 일어난다. 이러한 점을 고려하여 이론 분자량을 계산하면 1,473.8 g/mol이다. [도 5b]에 도시된 바와 같이 분자량은 이론 분자량값과 일치하게 나타남을 확인하였다.
도 5c를 참조하면, PREP-HPLC 정제과정을 통한 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 MALDI-TOF 분석결과이다. 초산 루프로라이드는 TEA에 의한 탈착으로 인해 아세테이트 구조를 잃으며. 리놀레산과의 접합이 일어나면 에스터화 반응에서 탈수반응이 일어난다. 이러한 점을 고려하여 이론 분자량을 계산하면 1,471.78 g/mol이다. [도 5c]에 도시된 바와 같이 분자량은 이론 분자량값과 일치하게 나타남을 확인하였다.
도 5d를 참조하면, PREP-HPLC 정제과정을 통한 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 MALDI-TOF 분석결과이다. 초산 루프로라이드는 PBS pH 7.4용액에 의한 탈착으로 인해 아세테이트 구조를 잃으며. 라우르산과의 접합이 일어나면 에스터화 반응에서 탈수반응이 일어난다. 이러한 점을 고려하여 이론 분자량을 계산하면 1,391.7 g/mol이다. [도 5d]에 도시된 바와 같이 분자량은 이론 분자량값과 일치하게 나타남을 확인하였다.
도 5e를 참조하면, PREP-HPLC 정제과정을 통한 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 MALDI-TOF 분석결과이다. 초산 루프로라이드는 PBS pH 7.4용액에 의한 탈착으로 인해 아세테이트 구조를 잃으며. 팔미트산과의 접합이 일어나면 에스터화 반응에서 탈수반응이 일어난다. 이러한 점을 고려하여 이론 분자량을 계산하면 1,447.99 g/mol이다. [도 5e]에 도시된 바와 같이 분자량은 이론 분자량값과 일치하게 나타남을 확인하였다.
도 5f를 참조하면, PREP-HPLC 정제과정을 통한 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 MALDI-TOF 분석결과이다. 초산 루프로라이드는 PBS pH 7.4용액에 의한 탈착으로 인해 아세테이트 구조를 잃으며. 스테아르산과의 접합이 일어나면 에스터화 반응에서 탈수반응이 일어난다. 이러한 점을 고려하여 이론 분자량을 계산하면 1,475.94 g/mol이다. [도 5f]에 도시된 바와 같이 분자량은 이론 분자량값과 일치하게 나타남을 확인하였다.
(4) 시차주사열량계(DSC) 분석 결과
도 6a를 참조하면, 초산 루프로라이드의 흡열 피크는 76.4℃와 162.5℃, 스테아르산의 흡열 피크는 73.1℃에서 특성화되었다. 초산 루프로라이드와 스테아르산과 물리적 혼합물 사이의 흡열 피크에는 스테아르산과 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)는 초산 루프로라이드와 유사한 패턴을 보였으나 흡열 피크 이동이 발생함을 알 수 있었다. 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 경우 66.7℃와 147.2℃로 피크 시프트가 나타남을 확인하였다.
도 6b를 참조하면, 초산 루프로라이드의 흡열 피크는 76.4℃와 162.5℃, 올레산의 흡열 피크는 17℃에서 특성화되었다. 초산 루프로라이드와 올레산과 물리적 혼합물 사이의 흡열 피크에는 올레산과 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)는 초산 루프로라이드와 유사한 패턴을 보였으나 흡열 피크 이동이 발생함을 알 수 있었다. 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)의 경우 81℃와 126℃로 피크 시프트가 나타남을 확인하였다.
도 6c를 참조하면, 초산 루프로라이드의 흡열 피크는 76.4℃와 162.5℃, 리놀레산의 흡열 피크는 -6.1℃에서 특성화되었다. 초산 루프로라이드와 리놀레산과 물리적 혼합물 사이의 흡열 피크에는 리놀레산과 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 초산 루프로라이드와 유사한 패턴을 보였으나 흡열 피크 이동이 발생함을 알 수 있었다. 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 경우 76.6℃와 120.4℃로 피크 시프트가 나타남을 확인하였다. 불포화도가 높은 지방산과의 접합시, 흡열피크 사이의 간격이 좁아지는 것을 확인하였다.
도 6d를 참조하면, 초산 루프로라이드의 흡열 피크는 76.4℃와 162.5, 라우르산-NHS 에스터의 흡열 피크는 80.4℃에서 특성화되었다. 초산 루프로라이드와 라우르산-NHS 에스터의 물리적 혼합물 사이의 흡열 피크에는 라우르산-NHS 에스터와 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 DSC 써모그램에서 모든 피크들이 사라짐을 확인할 수 있었다. 따라서 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 결합 후 비정질 상태로 나타난다.
도 6e를 참조하면, 초산 루프로라이드의 흡열 피크는 76.4℃와 162.5℃, 팔미트산-NHS 에스터의 흡열 피크는 92.8℃에서 특성화되었다. 초산 루프로라이드와 팔미트산-NHS 에스터의 물리적 혼합물 사이의 흡열 피크에는 팔미트산-NHS 에스터와 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)는 DSC 써모그램에서 모든 피크들이 사라짐을 확인할 수 있었다. 따라서 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)는 결합 후 비정질 상태로 나타난다.
도 6f를 참조하면, 초산 루프로라이드의 흡열 피크는 76.4℃와 162.5℃, 스테아르산-NHS 에스터의 흡열 피크는 90.2℃에서 특성화되었다. 초산 루프로라이드와 스테아르산-NHS 에스터의 물리적 혼합물 사이의 흡열 피크에는 스테아르산-NHS 에스터와 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)는 DSC 써모그램에서 모든 피크들이 사라짐을 확인할 수 있었다. 따라서 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)는 결합 후 비정질 상태로 나타난다.
실험예 2. 실시예 7~12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 자가조립 나노입자의 나노 성상 확인
1. 분석방법
(1) 동적광산란광도계(DLS) 분석
실시예 7~12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 자가조립 나노입자의 크기, 분포, 표면 제타전위는 Otsuka Electronics 사의 ELSZ-2000 장비를 이용하여 측정하였다. 5 mg의 샘플을 1.2 mL 20% 에탄올(Hydroxyl group target) 또는 THF(Amine group target)에 용해시키고 밤새 실온에서 교반하여 유기용매를 증발시켜주었다. 각 샘플은 3회 반복하여 분석하였다.
(2) FE-SEM 분석
초산 루프로라이드와 실시예 7~12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자의 크기와 형태는 FE-SEM(JSM-7900F, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 샘플은 동적광산란광도계(DLS)와 같은 방법으로 준비를 하였으며, 샘플 한방울을(20μL) 쿠퍼 그리드(cooper grid-covered carbon tape)로 덮인 탄소 테이프 위에 놓았다. 용액 샘플을 실온에서 24시간 동안 진공건조에서 건조시킨 다음, 진공에서 60초 동안 백금(platinum)으로 코팅하여 분석하였다.
2. 분석결과
(1) 동적광산란광도계(DLS) 분석결과
도 7a를 참조하면, 나노입자 크기는 실시예 7에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LSN)는 180.11 ± 11.27 nm이고, 실시예 8에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LON)는 144.47 ± 7.49 nm이며, 실시예 9에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN)는 79.9 ± 0.40nm로 측정되었다. 불포화도가 높을수록 나노입자의 크기가 작아지는 것을 알 수 있다. 펩타이드 약물의 직경은 나노입자의 흡수에 상당한 영향을 미친다. 점막 관련 림프 조직의 특수 상피 세포인 M 세포는 작은(20 ~ 100 nm) 입자를 우선적으로 운반하지만 더 큰 크기(100 ~ 500 nm)에서도 입자를 운반하기도 한다. 제타 전위값은 실시예 7에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LSN)는 31.24 ± 4.12Mv이고, 실시예 8에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LON)는 57.13 ± 2.17mV이며, 실시예 9에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN)는 76.13 ± 1.32mV로 측정되었다. 제타 전위의 절대값이 높을수록 안정 상태가 높다고 하며. 모든 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 나노입자들은 안전성을 보였고, 불포화도가 높을수록 제타 전위 값이 높음을 확인하였다. 따라서 불포화도가 높은 지방산인 리놀레산과 결합한 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체가 자가조립을 형성된 실시예 9에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN)는 작은 나노입자 크기와 높은 제타 전위값으로 인해 구강 점막 내에서의 효과적인 약물전달이 가능함을 암시한다.
도 7b를 참조하면, 실시예 10에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN), 실시예 11에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LPN) 및 실시예 12에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LSN)의 입자 크기는 각각 68.2 ± 1.8 nm(PDI: 0.189 ± 0.012), 77.4 ± 2.1 nm(PDI: 0.174 ± 0.041) 및 102.0 ± 4.6(PDI: 0.234 ± 0.0)로 측정되었다. 실시예 10에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN)와 실시예 11에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LPN)의 형상은 실시예 12에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LSN)보다 균일함을 확인하였다. 소수성 지방산 부분으로 인해 지방산이 균일한 나노입자를 형성하기 어려웠을 것으로 추정된다. 이것은 입자 크기(nm)를 포함하여 용매의 소수성 지수에 따라 자가 조립된 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LFN)의 물리화학적 특성에 대한 지방산 유형의 영향을 제공한다. 나노입자의 크기와 같은 물리적 성질은 지방산의 사슬 길이에 의존한다고 보고되어 있다.
실시예 10에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN), 실시예 11에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LPN) 및 실시예 12에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LSN)의 제타 전위 값은 각각 41.93 ± 0.67 mV, 51.69 ± 0.39 mV 및 66.07 ± 2.23 mV로 측정되었다. 제타(ξ) 값이 -25 mV 보다 낮거나, 제타(ξ) 값이 25 mV 보다 클 경우 자가조립 나노입자의 제타 전위 값은 안정적이고 나머지 끝점은 불안정한 것으로 표시된다. 제타 전위 값의 분석은 더 긴 사슬 길이의 지방산이 더 양전하를 띠는 것으로 나타났으며, 이는 정전기 반발로 인한 전반적인 안정성을 나타낸다. 일반적으로 중성 또는 음성 나노입자보다 양성 나노입자가 세포막에 더 많이 흡수된다. 이것은 음전하를 띤 세포막과의 정전기적 상호작용이 유리하기 때문이다,
(2) FE-SEM 분석결과
도 8a를 참조하면, 본 발명의 실시예 1 내지 3 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체가 특정 조건내에서 실시예 7 내지 9에 따른 자가조립 나노입자를 형성하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 지방산에 따른 소수성으로 인한 응집의 차이를 확인할 수 있다. 구체적으로, 포화지방산은 높은 소수성으로 인한 높은 응집성을 보였고, 불포화지방산은 포화지방산에 비해 낮은 소수성으로 인한 상대적으로 응집성이 적은 것을 확인할 수 있었다. DLS와 SEM 나노입자 분석에서 자가조립 나노입자의 입자크기가 다른 것을 알 수 있는데, 이는 각 시료에 대한 전처리의 차이 때문이다.
도 8b를 참조하면, 초산루프로라이드는 직사각형 모양으로 구성되었니다. 또한, 실시예 10 내지 12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LFN)의 형태는 전반적으로 매끄럽고 구형이었다. 그러나, 구체적으로 살펴보면 실시예 12에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LSN)의 경우 작은 나노입자 사이에서 일부 큰 입자가 불규칙적으로 관찰되었다. 실시예 10에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LLN)와 실시예 11에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LPN)의 형상은 실시예 12에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체가 나노입자(LSN)보다 균일하였다. 소수성 지방산 부분으로 인해 지방산이 균일한 나노입자를 형성하기 어려웠을 것으로 추정된다. 이것은 입자 크기(nm)를 포함한 용매의 소수성 지수에 따라 자가 조립된 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 나노입자(LFN)의 물리화학적 특성에 대한 지방산 유형의 영향을 제공한다.
실험예 3. 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체를 이용한 분해시험
10 mg의 정제된 실시예 1~6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체와 루프로라이드(Leuprolide)를 500 μL DMSO에 용해하였다. 그런 다음 용액 100 μL를 항온수조(BS-06, JEIO TECH, Korea)에 들어있는 1.9 mL 인간 혈장(Human Plasma)에 주입하였다(37℃, 100 rpm). 지정된 시점에서 100 μL의 혼합물을 회수하고 900 μL의 차가운 메탄올을 첨가한 다음 1분 동안 와류시켜 가수분해 반응을 중지시켰다. 다음으로, 샘플을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상층액을 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 모든 실험은 n=3로 하여 수행하였다.
(1) Hydroxyl group target 합성법에 따른 실시예 1~3의 신규한 GnRH 유도체
도 9a는 인간혈장 내에서 실시예 1~3의 신규한 GnRH 유도체의 분해 후, 축적 지방산의 방출 결과를 나타낸 것으로서, 도 9a를 참조하면, 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 경우 5주째 99.93%, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)와 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 경우 4주째 99.56%, 99.48% 분해가 나타났다. 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)와 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 동일기간의 분해를 나타나지만 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)는 1.5일만에 접합 약물의 50%가 분해되는 반면 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 0.89일만에 50%가 분해되어 약 0.61일의 차이를 나타냈다. 반면 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)의 경우 약물의 50%가 분해되는데 까지 3.15일이 소요되어 느린 분해를 나타내었다.
도 9b는 인간혈장 내에서 실시예 1~3의 신규한 GnRH 유도체의 분해 후, 축적 초산 루프로라이드의 방출 결과를 나타낸 것으로서, 도 9b를 참조하면, 실시예 1에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)는 80.26%, 실시예 2에 따른 루프로라이드-올레산 결합 GnRH 유도체(LOC)와 실시예 3에 따른 루프로라이드-리놀레산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 83.43%, 85.5%의 축적방출을 나타내었다.
(2) Amine group target 합성법에 따른 실시예 4~6의 신규한 GnRH 유도체
도 9c는 인간혈장 내에서 실시예 4~6의 신규한 GnRH 유도체의 분해 후, 축적 지방산의 방출 결과를 나타낸 것으로서, 도 9c를 참조하면, 인간 혈장에서 실시예 4 내지 6에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체의 분해 프로파일을 보여주며, 특히 21일 이내에 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)의 경우 5.65 ± 5.30% 이고, 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)의 경우 8.99 ± 5.92% 이며, 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)는 10.23 ± 6.21%를 나타내었다.
도 9d는 인간혈장 내에서 실시예 4~6의 신규한 GnRH 유도체의 분해 후, 축적 초산 루프로라이드의 방출 결과를 나타낸 것으로서, 도 9d를 참조하면, 가장 짧은 길이의 탄소 길이를 갖는 실시예 4에 따른 루프로라이드-라우르산 결합 GnRH 유도체(LLC)는 21일 이내에 95.5 ± 6.09%의 비율로 활성 루프로라이드(LEU)로 빠르게 전환되었다. 그리고 실시예 5에 따른 루프로라이드-팔미트산 결합 GnRH 유도체(LPC)와 실시예 6에 따른 루프로라이드-스테아르산 결합 GnRH 유도체(LSC)는 각각 21일과 28일 이내에 활성 루프로라이드(LEU)로 92.42 ± 6.47%, 90.74 ± 7.74% 전환되었다.
실험예 4. 루프로라이드-지방산 자가조립 나노입자 조성물으로부터의 체외 투과시험
루프로라이드는 각각 5 mg 및 10 mg의 루프로라이드를 10 mL 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline; PBS) pH 6.8 용액에 용해시켜 만들었다 (농도: 0.5 mg/mL 및 1.0 mg/mL). 그리고 실시예 7~9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자를 준비하였다(농도: 1.0 mg/mL). 그리고, 막 활성화를 위한 전처리로 삼투 베리어 막(Permeation Barrier-Membrane; PB-M)을 이소프로필 미리스테이트 용액에 밤새 담가두었다.
체외 투과 연구는 확산 면적이 3.8 cm2인 표준 확산 셀(DHC-6TD, Logan, USA)에서 수행되었다. 삼투 베리어 막(Permeation Barrier-Membrane; PB-M)은 도너 셀과 억셉터 구획 사이에 고정되었다. 도너 셀(300 μL)은 PBS pH 6.8 용액으로 채우고 억셉터 구획(5 mL)은 0.5% Tween 80이 포함된 PBS pH 7.4 용액으로 채우고 자기 교반기를 사용하여 600 rpm으로 계속 교반했다. 억셉터 구획(5 mL)을 자기 교반기를 사용하여 600 rpm에서 연속적으로 교반하였다. 전체 장치는 세포를 둘러싸는 재킷에 의해 37℃로 유지되었다. 샘플은 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480, 600 및 720분에 500 μL에서 회수하고, 500 μL의 37℃ 억셉터 구획 용액으로 재충전했다. 회수된 용액은 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 모든 실험은 n=3로 하여 수행하였다.
(1) 루프로라이드의 농도별 투과성 실험 결과
도 10a에 나타나 있는 루프로라이드의 농도별 투과성 실험 결과를 참조하면, 0.5 mg/mL의 경우 12시간 동안 17.8%의 투과율을 보였고, 1mg/mL의 경우 24.26%의 투과도로 약 6.46%의 투과도 차이를 보였다.
(2) Hydroxyl group target 합성법에 따른 실시예 7~9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자의 투과성 실험 결과
실시예 7에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LSN) 1 mg/mL는 12시간 동안 17.61%로 기존 약물인 루푸라이드에 비해 약 6.75% 낮은 수치를 나타내었다. 반면 불포화 지방산과의 콘쥬게이션된 실시예 8에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LON) 및 실시예 9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LLN)는 37.85%, 44.85%의 투과도를 나타내며 루프라이드의 투과율과 비교하면 LON의 경우 약 1.56배, LLN의 경우 1.85배 증가하였다. 도 7a(DLS 결과) 참고시, 자가조립 나노입자의 크기가 작을수록 피부 투과 효율을 높일 수 있어 결과에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
(3) Amine group target 합성법에 따른 실시예 7~9에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자의 투과성 실험 결과
실시예 10에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LLN) 투과율과 실시예 11에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LPN)의 투과율은 동일한 농도의 LEU 용액(1,000ppm) 대비 1.90배, 1.49배의 높은 투과율을 보였다. 하지만, 실시예 12에 따른 루프로라이드-지방산 결합 GnRH 유도체 자가조립 나노입자(LSN)는 80.13%까지 침투가 저해되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.

Claims (19)

  1. 친수성의 루프로라이드; 및
    결합을 통해 상기 루프로라이드와 콘쥬게이션된 소수성의 지방산 또는 지방산 유도체를 포함하는 신규한 GnRH 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합은 에스터(-C(=O)O) 또는 아미드(-(C=O)NH-) 결합 중 어느 하나인 것인 신규한 GnRH 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 포화 지방산 또는 불포화 지방산 중 어느 하나 인 것인 신규한 GnRH 유도체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포화 지방산은 카프릴산(Caprylic acid), 카프르산(Capric acid), 라우르산(Lauric acid), 미리스트산(Myristic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 스테아르산(Stearic acid), 아라키드산(Arachidic acid), 비헨산(Behenic acid), 리그노세르산(Lignoceric acid) 및 세로트산(Cerotic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 신규한 GnRH 유도체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 미리스톨레산(Myristoleic acid), 팔미톨레산(Palmitoleic acid), 사피엔산(Sapienic acid), 올레산(Oleic acid), 엘라이드산(Elaidic acid), 박센산(Vaccenic acid), 리놀레산(Linoleic acid), 리노엘라이드산(Linoelaidic acid), 아라키돈산(Arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid), 에루크산(Erucic acid) 및 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 신규한 GnRH 유도체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 하기 화학식 I로 이루어진 것인 신규한 GnRH 유도체:
    [화학식 I]

    상기 화학식 I에서,
    R1은 C7-C31 알킬기 또는 C11-C31 알케닐기이고,
    R2는 임.
  7. 제6항에 있어서, 상기 R1은 C13-C21 알킬기 또는 C13-C21 알케닐기인 것인 신규한 GnRH 유도체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 GnRH 유도체는 하기 화학식 I-1, I-2 또는 I-3 중 어느 하나로 표시되는 것인 신규한 GnRH 유도체:
    [화학식 I-1]

    [화학식 I-2]

    [화학식 I-3]
  9. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 하기 화학식 II로 이루어진 것인 신규한 GnRH 유도체:
    [화학식 II]

    상기 화학식 II에서,
    R3는 C7-C31 알킬기 또는 C11-C31 알케닐기이고,
    R4는 임.
  10. 제9항에 있어서, 상기 R3은 C11-C17 알킬기인 것인 신규한 GnRH 유도체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 화학식 II로 표시되는 GnRH 유도체는 하기 화학식 II-1, II-2 또는 II-3 중 어느 하나로 표시되는 것인 신규한 GnRH 유도체:
    [화학식 II-1]

    [화학식 II-2]

    [화학식 II-3]
  12. 초산 루프로라이드를 물에 용해시킨 후 염기 화합물을 첨가하여 루프로라이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계; 및
    상기 루프로라이드를 포함하는 수용액에, 지방산 또는 지방산 유도체를 포함하는 용액을 첨가하는 단계를
    포함하는 것인 루프로라이드에 콘쥬게이션된 지방산을 포함하는 GnRH 유도체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 지방산 유도체는 지방산과 반응기가 에스터 결합을 통해 형성된 것인 GnRH 유도체의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 반응기는 N-하이드로석신이미드인 것인 GnRH 유도체의 제조방법.
  15. 제12항에 있어서, 초산 루프로라이드와 지방산 또는 지방산 유도체는 1:1 내지 10 의 몰비로 포함되는 것인 GnRH 유도체의 제조방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 루프로라이드를 포함하는 수용액을 제조하는 단계에서, 염기촉매제를 첨가하여 초산을 탈착(Desorption)하는 것인 GnRH 유도체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 염기촉매제는 N,N-디메틸아미노피리미딘인 것인 GnRH 유도체의 제조방법.
  18. 지방산을 포함하는 소수성 코어; 및
    상기 코어의 외부에 위치하며 상기 지방산과 결합된 루프로라이드를 포함하는 친수성의 쉘을 포함하는 자가조립 나노입자.
  19. 제1항에 따른 GnRH 유도체를 용매에 첨가하여 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 용액을 교반하는 단계를 포함하는 것인 코어-쉘 구조의 자가조립 나노입자 제조방법.
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