KR20230137238A - 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물 - Google Patents
시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물 Download PDFInfo
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N59/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing elements or inorganic compounds
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Abstract
본 발명은 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명의 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 종래 유청을 유효성분으로 포함함에 따라 부패가 쉬우며, 높은 점성으로 인하여 공급관을 막는 문제를 해결할 뿐 아니라, 식물 바이러스에 의한 병해를 효과적으로 방제할 수 있다.
Description
본 발명은 식물 바이러스 방제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물에 관한 것이다.
식물 바이러스는 식물 세포를 감염시키는 바이러스를 의미한다. 식물 바이러스는 완전한 생명체 단위의 균류와 달리 비세포로 구성되어 있고, 효소가 없어 스스로 물질 대사를 못하는 등의 비생물적 특징을 지닌다. 특히, 식물 바이러스는 숙주의 세포(host cell)를 이용하여 복제하기 때문에 다양한 식물 개체에게 피해를 입히며, 숙주 개체와 세포 과정(cellular process)을 공유하기 때문에 식물바이러스의 기능만을 저해하는데 어려움이 있다. 이와 같은 이유로 인해 식물바이러스는 1890년대에 존재가 밝혀졌음에도 불구하고 현재까지도 발병된 식물을 제거하거나 매개충을 방제하는 등 물리적 또는 간접적 방제 방법이 널리 쓰이고 있을 뿐, 식물바이러스 병에 대한 항바이러스제의 개발은 충분히 이루어지지 않고 있다.
한편, 고추 등 작물에 발생하는 바이러스는 60종 이상에 달하며 이중에서 전 세계적으로 발생하여 피해를 주는 바이러스 또한 20종이 넘는 것으로 알려져 있다. 특히, 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus, CMV)와 토바모바이러스(tobamovirus, PMMoV) 두 종류만 발생하였으나, 근래에는 이들을 포함하여 토마토모자이크바이러스(TSWV), 고추모틀바이러스(pepper mottle virus, PepMoV), 담배마일드그린모자이크바이러스(tobacco mild green mosaic virus, TMGMV), 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2, BBWV2) 등의 바이러스가 주로 발생하고 있다. 복합 감염으로는 오이모자이크바이러스와 고추모틀바이러스 등 위에서 언급한 바이러스 가운데 1종 또는 2종이 복합 감염되는 것으로 나타났다. 고추 바이러스병 피해에 가장 크게 관여하는 바이러스는 오이모자이크바이러스이다.
오이모자이크바이러스와 고추모틀바이러스는 주로 진딧물을 매개로 발병하며, 오이모자이크바이러스에 감염되면 식물체가 자라지 못하고 잎에 모자이크와 황화증상, 잎이 가늘어지고 과실은 작고 둥글어지는 증상이 나타나고, 고추모틀바이러스에 감염되면 잎에 요철이 수반되고 심한 모자이크 증상과 황색줄무늬가 생겨 기형을 나타낸다. 고추모틀바이러스의 단독 감염은 오이모자이크바이러스에 비해 피해가 비교적 작지만, 오이모자이크바이러스와 복합 감염은 그 병징에 상승효과가 빈번히 일어나고 재조합에 의한 바이러스 변이에도 영향을 주는 것으로 생각되고 있다.
이와 같은 식품 바이러스의 감염에 의한 피해가 매년 증가하고 있는 추세이며, 한번 감염되면 곰팡이나 세균병과는 달리 실질적으로 치료 약제가 없는 실정이다. 이와 같은 바이러스 병은 종자, 육묘, 성체 등 생육기간 동안 발생하고 해마다 반복적으로 악순환되고 있다.
한편 이와 같은 고추 등에 감염되는 식물 바이러스 방제용으로 유청을 활용한 기술이 공지되어 있으나, 유청은 부패가 쉽게 이루어지고, 점성이 높기 때문에 시비를 위한 공급관을 막는 문제가 발생하여 실제 식물 바이러스 방제용으로 활용하기에 어려움이 있었다.
본 발명의 목적은 종래 유청을 유효성분으로 포함함에 따라 부패가 쉬우며, 높은 점성으로 인하여 공급관을 막는 문제를 해결할 뿐 아니라, 식물 바이러스에 의한 병해를 효과적으로 방제할 수 있는 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면,
시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물이 제공된다.
상기 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드는, 상기 글라이코매크로펩타이드가 뉴라미니다제(Neuraminidase)에 의해 효소분해되어 시알산이 분리된 상태로 함유된 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드이거나, 또는 시알산이 분리되지 않은 상태로 함유된 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드 일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 미네랄을 추가로 포함할 수 있다.
상기 미네랄은 요오드(I)이거나 또는 요오드(I)/황(S) 복합물일 수 있다.
상기 미네랄은 우유 카제인, 키토산, 알긴산, 전분, 및 프로피닐 부틸 카바메이트(propynyl butyl carbamate), 및 메틸 톨릴설폰(methyl tolylsulfon) 중에서 선택된 어느 하나의 유기물 기질이 킬레이트 결합되어 유기태화된 유기태화 미네랄일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 혈분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 식물 바이러스는 토마토 황화잎 말림 바이러스(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus, CMV), 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus, TSWV), 잠두 위조 바이러스(broad bean wilt virus 2, BBWV2), 고추모틀 바이러스(pepper mottle virus, PepMoV), 호박황화모자이크 바이러스(ZYMV), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 및 박과진딧물 바이러스(CABYV) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 고추, 담배, 토마토, 오이, 멜론 및 수박 중에서 선택된 1종 이상의 식물 방제용일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 관주용 또는 엽면시비용으로 사용될 수 있다.
상기 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드는 작물 도장억제 용도를 추가로 포함할 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 식물 바이러스 병증을 억제하는 관리형 제제로 사용될 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 부형제가 추가로 포함될 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 에틸렌(ethylene), 자스몬산(Jasmonic acid) 및 PR(Pathogenesis-related) 단백질 중에서 선택된 어느 하나의 합성 관련 유전자의 발현 증가용일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,
(a) 반응기에 물, 염기 및 유청을 투입하고 최종 pH 8.50±0.3, 온도 47±2℃의 조건으로 조절하는 전처리 단계;
(b) 상기 반응기에 락토오스, 리파아제, 프로테아제를 순차적으로 투입하여 효소처리하는 단계; 및
(c) 상기 반응기 온도를 76±2℃로 승온시켜 실활시키는 단계;를 포함하는 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물의 제조방법이 제공된다.
단계 (c) 이후,
(d) 단계 (c)의 생성물인 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드를 뉴라미니다제(Neuraminidase)로 효소분해하는 단계;를 추가로 수행하여 시알산이 상기 글라이코매크로펩타이드로부터 효소분리된 상태로 포함되는 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,
상기 식물 바이러스 방제용 조성물을 이용한 식물 바이러스 병 방제방법이 제공된다.
본 발명의 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 종래 유청을 유효성분으로 포함함에 따라 부패가 쉬우며, 높은 점성으로 인하여 공급관을 막는 문제를 해결할 뿐 아니라, 식물 바이러스에 의한 병해를 효과적으로 방제할 수 있다.
도 1은 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP 제조의 각 단계의 사진이다.
도 2는 실험예 1에 따른 고추 기주 유전자 발현 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따른 에틸렌 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과이다.
도 4는 실험예 1에 따른 자스몬산 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과이다.
도 5는 실험예 1에 따른 PR 단백질 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과이다.
도 6은 실험예 2에 따른 바이러스 접종 10일 후 상엽의 사진이다.
도 7은 실험예 2에 따른 realtime RT-PCR에 따른 바이러스 증식 정량 분석 결과이다.
도 8은 실험예 2에 따른 바이러스 증식에 대한 직접적인 영향을 알아보기 위한 realtime RT-PCR 분석 결과이다.
도 9는 실험예 3의 현장실험 Ⅰ에 대한 사진이다.
도 10은 실험예 4의: 현장실험 Ⅱ에 대한 사진이다.
도 2는 실험예 1에 따른 고추 기주 유전자 발현 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따른 에틸렌 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과이다.
도 4는 실험예 1에 따른 자스몬산 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과이다.
도 5는 실험예 1에 따른 PR 단백질 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과이다.
도 6은 실험예 2에 따른 바이러스 접종 10일 후 상엽의 사진이다.
도 7은 실험예 2에 따른 realtime RT-PCR에 따른 바이러스 증식 정량 분석 결과이다.
도 8은 실험예 2에 따른 바이러스 증식에 대한 직접적인 영향을 알아보기 위한 realtime RT-PCR 분석 결과이다.
도 9는 실험예 3의 현장실험 Ⅰ에 대한 사진이다.
도 10은 실험예 4의: 현장실험 Ⅱ에 대한 사진이다.
이하, 본 발명의 식물 바이러스 방제용 조성물에 대해 설명하도록 한다.
본 발명의 식물 바이러스 방제용 조성물은 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
상기 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드는, 상기 글라이코매크로펩타이드가 뉴라미니다제(Neuraminidase)에 의해 효소분해되어 시알산이 분리된 상태로 함유된 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드이거나, 또는 시알산이 분리되지 않은 상태로 함유된 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드 일 수 있다.
상기 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드는 식물바이러스 방제에 유리하고, 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드는 고온기 식물 도장억제에 유리할 수 있다.
상기 시알산을 함유하는 글라이코매트로펩타이드는 유청의 효소분해물이다. 이때, 단백질 분해효소에 따라 생성되는 펩타이드는 식물 호르몬 유사 효과를 나타내고, 락토오스 분해물 중 포도당은 식물의 영양분이 될 수 있고, 갈락토오스는 토양 유산균과 방선균의 증식효과를 발휘할 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 미네랄을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 미네랄은 요오드(I)이거나 또는 요오드(I)/황(S) 복합물 일 수 있다.
바람직하게는 상기 미네랄은 식물 흡수 효율을 높이기 위하여 유기태화 미네랄로 포함될 수 있다.
상기 유기태화 미네랄은 유기물 기질이 상기 미네랄에 킬레이트 결합되어 유기태화된 것을 의미한다.
상기 유기물 기질은 우유 카제인, 키토산, 알긴산, 전분, 및 프로피닐 부틸 카바메이트(propynyl butyl carbamate), 및 메틸 톨릴설폰(methyl tolylsulfon) 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 유기태화 미네랄이 유기태화 요오드인 경우 상기 유기물 기질은 하기 화학식 1로 표시되는 프로피닐 부틸 카바메이트(propynyl butyl carbamate)를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이와 같은 경우 항바이러스 효능이 가장 우수하며, 방제 효율이 향상될 수 있다.
[화학식 1]
상기 유기태화 미네랄이 요오드(I)/황(S) 복합물인 경우 상기 유기물 기질은 하기 화학식 2로 표시되는 메틸 톨릴설폰(methyl tolylsulfon) 인 것이 더욱 바람직하다.
[화학식 2]
상기 방법에 따라 제조된 불용성 유기태화 요오드와 PEG(poly ethylen glycol)용매를 1:9 중량비로 혼합하여 유기태화 요오드 수용성 제제를 제조하였다.
바람직하게는 상기 상기 미네랄은 황(S)이 추가로 포함되어 유기태화 요오드(I)/황(S)을 형성할 수 있다.
이때, 상기 미네랄은 요오드(I)과 황(S)의 중량비가 10:0.5 내지 10:2 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10:1.0 내지 10:1.5 일 수 있다.
상기 유기태화 미네랄은 전체중량에서 상기 미네랄이 25 내지 60중량% 포함되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 35 내지 55 중량% 일 수 있다. 상기 최저 함량 미만인 경우에는 미네랄의 효능이 저하되어 목적하는 바이러스 방제의 효과가 저하될 수 있고, 상기 최고 함량을 초과하는 경우에는 킬레이트제에 의한 유기태화 비율이 저하되어 미네랄의 손실이 발생할 염려가 있다.
상기 식물 바이러스는 토마토 황화잎 말림 바이러스(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus, CMV), 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus, TSWV), 잠두 위조 바이러스(broad bean wilt virus 2, BBWV2), 고추모틀 바이러스(pepper mottle virus, PepMoV), 호박황화모자이크 바이러스(ZYMV), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 및 박과진딧물 바이러스(CABYV) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
필요에 따라 상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 혈분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 혈분은 식물 바이러스 방제용 영양제에 포함되는 추가 성분이며, 그외 영양제에 포함될 수 있는 다양한 성분이 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 요오드 또는 요오드/황의 유기태화 미네랄 원재를 포함하는 항바이러스용 영양제에는 질소, 수용성 인산, 수용성 칼리, 수용성 고토, 수용성 붕소, 수용성 철, 수용성 몰리브덴, 수용성 칼슘, 수용성 규산 등의 미네랄 성분이 포함될 수 있고, 아미노산, 락토페린(lactoferrin), 면역글로불린 A, D, E, M, 베타-락토글로블린, 알파-락토알부민, 지방, 락토오즈, 덱스트린 등 부형제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 가지과 식물 또는 박과 식물의 바이러스 방제용일 수 있고, 바람직하게는 가지과 식물인 고추, 담배, 토마토, 박과 식물인 멜론, 오이, 수박의 바이러스 방제용 일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 관주용 또는 엽면시비용으로 사용될 수 있고, 관주용은 분말형으로 제조되는 것이 바람직하며, 엽면시비용은 액상형으로 제조되는 것이 바람직하다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 에틸렌(ethylene), 자스몬산(Jasmonic acid) 및 PR(Pathogenesis-related) 단백질 중에서 선택된 어느 하나의 합성 관련 유전자의 발현 증가용일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 식물 바이러스 병의 발생을 예방하는 예방용 제제 또는 식물 바이러스 병이 발생한 후 병증을 억제하는 관리형 제제로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 관리형 제제로 사용되는 것이 더욱 효과적일 수 있다.
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 부형제는 미생물에 대한 독성이 없고， 농업용으로 사용이 가능한 것을 적용할 수 있으며， 분무기의 노즐 막힘이 없고， 수분함량을 조절할 수 있는 것이 바람직하다.
이와 같은 부형제는 탄수화물, 중합체, 지질 및 무기물 등을 사용할 수 있고, 그 예로서 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 벤토나이트， 카올린, 제올라이트, 전분, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 카복실메틸셀룰로즈, 알기네이트, 카라기난, 하이알루론산, 폴리아크릴산 등 항바이러스제의 효능을 저하시키 않고 사용상 장애가 발생하지 않는 한도 내에서 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 식물 바이러스 방제용 조성물은 당업계에 주지되어 있는 농약학적으로 허용되는 완충제, 희석제, 보조제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 완충제는 pH를 안정화시킬 목적의 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하는 것이고, 그 예로서 트리스, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, 타르트레이트, 카코딜레이트, 에탄올아민, 글리신, 이미다졸, 이미다졸락트산 등을 적용할 수 있다.
상기 희석제는 제제의 농도를 희석하는 것을 목적으로 혼합되는 것으로 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 옥수수 오일, 땅콩 오일, 면화씨 오일 또는 참깨 오일 등의 식물성 오일일 수 있다.
상기 보조제는 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 가해진 특정 화합물을 의미하는 것이다.
한편, 본 발명의 식물 바이러스 방제용 조성물은 상술한 분말형, 액상형 외에도 정제, 에어로졸제, 연고제 등과 같은 제형으로도 제조될 수 있고, 필요한 경우, 유화제, 현탁제, 전착제, 침투제, 습윤제, 안정제 등 당업계에 공지된 성분을 배합시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 식물 바이러스 방제용 조성물의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.
먼저, 반응기에 물, 염기 및 유청을 투입하고 최종 pH 8.50±0.3, 온도 47±2℃의 조건으로 조절하여 전처리한다(단계 a).
구체적으로 반응기에 물을 채운 후, 물을 교반하면서 온도를 55 내지 59℃로 승온시켜 유청의 용해가 잘 이루어지는 조건을 만든다. 이후, 수산화나트륨 등의 염기를 투입하고 pH 12±0.5 조건을 만든 후 유청을 투입하고, 최종 pH 8.50±0.3, 온도 47±2℃가 되도록 하여 이후 효소분해의 최적 조건을 형성할 수 있다.
다음으로, 상기 반응기에 락토오스, 리파아제, 프로테아제를 순차적으로 투입하여 효소처리한다(단계 b).
상기 효소처리시 온도는 47±2℃를 유지하는 것이 바람직하다.
상기 효소의 투입이 완료되면 1 내지 3시간 동안 교반하여 효소분해가 충분히 이루어질 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
이후, 상기 반응기 온도를 76±2℃로 승온시켜 실활시킨다(단계 c).
실활된 효소분해물은 겔상태로 되며, 색상은 진한 커피색을 띤다.
필요에 따라 효소분해물은 건조시켜 분말화할 수 있다.
이에 따라 유청으로부터 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드(GMP)를 수득할 수 있다.
단계 (c)의 생성물인 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드를 뉴라미니다제(Neuraminidase)로 효소분해한다(단계 d).
본 단계는 필요에 따라 수행될 수 있으며, 시알산이 상기 글라이코매크로펩타이드로부터 효소분리된 상태로 포함되는 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드를 제조하기 위하여 추가적으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물 바이러스 방제용 조성물을 이용한 식물 바이러스 병 방제방법을 제공한다.
본 발명의 식물 바이러스병 방제방법은 바이러스 병징 발현 전 또는 후에 관주처리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 식물 바이러스 방제 처리는 20 내지 40일 간격으로 1회 처리하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 25일 내지 35일 간격으로 1회 처리하 수 있다.
상기 1회 처리시 본 발명의 식물 바이러스 방제 용량은 물 1ton 당 0.5 내지 2kg 처리하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물 1ton 당 0.8 내지 1.5kg 로 처리할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
[실시예]
실시예 A-1: 시알산 미분리 GMP
(1) 전처리
20L 반응기에 RO 수 400kg을 투입하고, 교반하면서 57±2℃ 로 승온시켰다. 이후, 효소반응의 최적 pH 조성을 위하여, NaOH(98%) 4Kg 을 1 회 투입하여 pH 12±0.5, 온도 58±2℃가 되도록 하였다. 다음으로, 유청 400Kg 을 투입하고 30분 동안 교반하였다. 이때, 최종 pH 8.50±0.3, 온도 47±2℃로 조절하였다.
(2) 효소분해
47±2℃를 유지하면서 반응기에 락토오스 2800㎖를 투입하여 효소분해를 수행하고, 이어서 리파아제 80㎖를 투입하여 효소 분해, 프로테아제 600g을 투입하여 효소분해를 순차적으로 수행하고 교반하였다.
(3) 효소실활
반응기 온도를 76±2℃로 승온시키고, 반응물은 겔상태가 된다. 이후, 효소실활 추가 확인을 위하여 NaOH(98%) 12kg을 5분 간격으로 4회에 걸쳐 투입하고 교반하였다. pH가 점차 감소하고 색상은 진한 커피색으로 되며 pH 7 이하가 되면 반응을 종료하였다.
(4) 분말화
스프레이 드라이어에서 분말화하여 시알산 미분리된 글라이코매크로펩타이드(GMP)를 수득하였다(GMP 25g 기준 시알산 0.13g 포함).
실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP 제조의 각 단계의 사진을 도 1에 나타내었다.
실시예 A-2: 시알산 미분리 GMP 복합 제제
프로피닐 부틸카바메이트(propynyl butyl carbamate)를 킬레이팅 기질로 사용하여 유기태화 요오드(I)를 제조하였다.
실시예 A-1의 시알산 미분리된 GMP 25g, 상기 유기태화 요오드 7.5g(I: 3.3g 포함), 부형제(덱스트린) 25g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 A-3: 시알산 미분리 GMP 복합 제제
메틸설폰(Methyl tolylsulfon)을 킬레이팅 기질로 사용하여 유기태화 요오드(I):황(S)이 33:4의 중량비로 포함된 유기태화 요오드-황(I-S)을 제조하였다.
실시예 A-1의 시알산 미분리된 GMP 25g, 상기 유기태화 요오드-황10.925g(I: 3.3g, S: 0.4g 포함), 부형제(덱스트린) 25g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 A-4: 시알산 미분리 GMP 복합 제제
실시예 A-1의 시알산 미분리된 GMP 17.5g(시알산 0.09g 포함), 실시예 A-2에서 제조된 유기태화 요오드(I) 7.5g, 혈분 7.5g(N: 1.07 g 포함), 부형제(덱스트린) 25g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 A-5: 시알산 미분리 GMP 복합 제제
실시예 A-1의 시알산 미분리된 GMP 17.5g(시알산 0.09g 포함), 실시예 A-3에서 제조된 유기태화 요오드-황(I-S) 10.925g(I: 3.3g, S: 0.4g 포함), 혈분 7.5g(N: 1.07 g 포함), 부형제(덱스트린) 17.5g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 B-1: 시알산 분리 GMP
실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP를 정제수에 7%(w/v)로 용해시킨 후 효소 뉴라미니다제(Neuraminidase)를 기질 대비 0.24%(w/v)로 혼합하여 57℃에서 7시간 동안 가수분해를 시켜 시알산을 분리하는 단계를 추가로 수행하여 시알산 + 시알산 분리된 GMP를 포함하는 복합 제제를 제조하였다.
실시예 B-2: 시알산 분리 GMP 복합 제제
실시예 B-1의 시알산+시알산 분리된 GMP 25g, 실시예 A-2에서 제조된 유기태화 요오드 7.5g(I: 3.3g 포함), 부형제(덱스트린) 25g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 B-3: 시알산 분리 GMP 복합 제제
실시예 B-1의 시알산+시알산 분리된 GMP 25g, 실시예 A-3에서 제조된 유기태화 요오드-황 10.925g(I: 3.3g, S: 0.4g 포함), 부형제(덱스트린) 25g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 B-4: 시알산 분리 GMP 복합 제제
실시예 B-1의 시알산+시알산 분리된 GMP 17.5g(시알산 0.09g 포함), 실시예 A-2에서 제조된 유기태화 요오드(I) 7.5g, 혈분 7.5g(N: 1.07 g 포함), 부형제(덱스트린) 25g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
실시예 B-5: 시알산 분리 GMP 복합 제제
실시예 B-1의 시알산+시알산 분리된 GMP 17.5g(시알산 0.09g 포함), 실시예 A-3에서 제조된 유기태화 요오드-황(I-S) 10.925g(I: 3.3g, S: 0.4g 포함), 혈분 7.5g(N: 1.07 g 포함), 부형제(덱스트린) 17.5g을 혼합하여 항바이러스 복합 제제를 제조하였다.
아래의 표 1에 실시예 A-1 내지 A-5, 및 실시예 B-1 내지 B-5의 항바이러스 제제의 성분을 비교하여 정리하였다.
| 구분 | 시알산 미분리 GMP | 시알산+시알산 분리 GMP | 혈분 | 유기태화 요오드(I) | 유기태화 요오드-황(I-S) | 부형제 (덱스트린) |
| 실시예 A-1 | 25g (Sialic acid : 013g) | - | - | - | - | 25g |
| 실시예 A-2 | 25g (Sialic acid : 0.13g) | - | - | 7.5g (I:3.3g) |
- | 25g |
| 실시예 A-3 | 25g (Sialic acid : 0.13g) | - | - | - | 10.925g (I:3.3g, S:0.4g ) |
25g |
| 실시예 A-4 | 17.5g (Sialic acid : 0.09g) | - | 7.5g (N:1.07g) |
7.5g (I:3.3g) |
- | 25g |
| 실시예 A-5 | 17.5g(Sialic acid : 0.09g) | - | 7.5g (N:1.07g) |
- | 10.925g (I:3.3g, S:0.4g ) |
17.5g |
| 실시예 B-1 | - | 25g (Sialic acid : 013g) |
- | - | - | 25g |
| 실시예 B-2 | - | 25g (Sialic acid : 0.13g) |
- | 7.5g (I:3.3g) |
- | 25g |
| 실시예 B-3 | - | 25g (Sialic acid : 0.13g) | - | - | 10.925g (I:3.3g, S:0.4g) |
25g |
| 실시예 B-4 | - | 17.5g (Sialic acid : 0.09g) | 7.5g (N:1.07g) |
7.5g (I:3.3g) |
- | 25g |
| 실시예 B-5 | - | 17.5g(Sialic acid : 0.09g) | 7.5g (N:1.07g) |
- | 10.925g (I:3.3g, S:0.4g) |
17.5g |
[실험예]
실험예 1: 항바이러스 작용기전 평가
실시예 A-4의 항바이러스 제제 및 실시예 A-5의 항바이러스 제제에 대하여 오이모자이크 바이러스 (cucumber mosaic virus, CMV)와 토마토반점위조바이러스 (tomato spotted wilt virus, TSWV) 발생 억제 작용 기전 구명용 전사체 분석 시료 확보하고, 총 27개의 전사체 로데이터(raw data) 파일을 확보하였다. 고추 cDNA 데이터베이스를 이용한 transcriptome mapping 및 유전자 발현 변화 분석을 위한 DEseq2 분석을 수행하였다. 또한, 각 조건별 발현 증가 및 억제 유전자의 기능 분석을 위한 GO term 분석 수행하였고, 식물 저항성 반응 관련 호르몬 경로(hormone pathway) 연관 유전자 발굴을 위한 mapman 분석을 수행하였다.
대상 작물인 고추는 CMV와 TSWV에 감염이 되는 청양 품종을 사용하였고, 식물 생장상에서 재배 후 전사체 분석 시료 확보를 위한 실험 방법을 아래의 표 2에 나타내었다.
| 1d | A4 and A5 1st treatment | 1 st sampling Mock_R1, Mock_R2, Mock_R3 A4_R1,A4_R2,A4_R3 A5_R1,A5_R2,A5_R3 2 nd and 3 rd sampling Mock_R1, Mock_R2, Mock_R3 A4_R1,A4_R2,A4_R3 A5_R1,A5_R2,A5_R3 TSWV_R1,TSWV_R2,TSWV_R3 A4+TSWV_R1,A4+TSWV_R2,A4+TSWV_R3 A5+TSWV_R1,A5+TSWV_R2,A5+TSWV_R3 CMV-P1_R1,CMV-P1_R2,CMV-P1_R3 A4+CMV-P1_R1,A4+CMV-P1_R2,A4+CMV-P1_R3 A5+CMV-P1_R1,A5+CMV-P1_R2,A5+CMV-P1_R3 |
|
| 2d | |||
| 3d | |||
| 4d | 1st sampling | ||
| 5d | CMV-P1, TSWV inoculation | ||
| 6d | |||
| 7d | |||
| 8d | 2nd sampling | ||
| 9d | |||
| 10d | |||
| 11d | A4 and A5 2nd treatment | ||
| 12d | |||
| 13d | |||
| 14d | 3rd sampling |
이에 따르면, 실시예 A-4 및 실시예 A-5 각각의 항바이러스 제제를 4엽기의 고추 식물에 처리 후 CMV와 TSWV 바이러스를 각각 즙액 접종하였다. 즙액 접종 후 바이러스 접종엽을 샘플링하여 total RNA를 추출하였으며 이를 이용하여 전사체 분석을 수행하였다. 바이러스 접종 전 실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제의 처리에 의한 기주 유전자 발현 변화에 대한 전사체 분석을 위하여 실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제의 전처리 시료(1st sampling)를 준비하였고, 실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제 처리 후 바이러스를 접종한 뒤 3일째 2차 처리 시료(2nd sampling)을 통하여 실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제 처리 유무와 CMV, TSWV 감염 간에 일어나는 기주 유전자의 발현변화에 대한 전사체 분석을 수행하였다. 각 시료에 대한 반복수는 3주의 고추를 1반복으로 간주하였으며 총 3반복 시료를 확보하여 전사체 분석을 수행하였다.
이에 따른 실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제 처리에 따른 고추 기주 유전자 발현 변화 양상을 도 2에 나타내었다. 이에 따르면, CMV와 TSWV 바이러스의 감염이 없는 상태에서 실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제를 각각 처리한 시료에서는 1910개의 유전자 발현이 실시예 A-4 제제 처리에 의하여 증가하였으며 1551개 유전자의 발현은 감소하였다. 실시예 A-5 제제를 처리한 처리구에서는 126개의 유전자 발현이 증가되었으며 20개의 유전자 발현이 감소되었다. 실시예 A-4 제제의 전처리 후 CMV를 접종한 처리구에서는 2003개의 유전자 발현이 증가하였으며 2243개 유전자 발현이 감소함이 확인되었다. 또한, A-4 제제 처리 후 TSWV 접종한 식물에서는 2796개의 유전자 발현이 증가되었고 3218개 유전자의 발현이 감소하였다. 실시예 A-5 제제를 처리한 후 CMV를 감염시킨 식물에서는 2015개 유전자 발현이 증가되었으며 2083개의 유전자 발현이 감소되었다. 실시예 A-5 제제 처리 후 TSWV를 접종한 처리구에서는 2169개의 유전자 발현이 증가되었고 2403개의 유전자 발현이 감소되었다.
한편, 발현이 증가되거나 감소된 유전자에 대한 GO(Gene Ontology) term analysis를 수행하여 유전자 온톨로지(gene ontㄴology) 결과를 이용한 유전자 기능 분석을 수행하였다.
CMV의 감염에 따라 발현이 증가된 유전자들을 대상으로 수행한 GO term analysis 결과 실시예 A-4 제제 처리 후 CMV 감염 시 특이적으로 발현이 증가되는 유전자 136개를 확보하였으며 비생물적 자극(abiotic stimulus), 단일 유기체(single-organism) 및 대사과정(metabolic process)과 관련 기능을 갖는 유전자 (biological process)이며 세포 구성요소(cellular component)는 세포질(cytoplasm), 세포부분(cell part)에 위치하는 유전자들로 밝혀졌다. 또한, 실시예 A-5 제제가 처리된 고추식물에 CMV가 감염되었을 때 특이적으로 발현되는 276개의 유전자에 대하여 유전자 온톨로지 분석한 결과, 자극에 대한 반응(response to stimulus), 단일 유기체 프로세스(single-organism process), 스트레스에 대한 반응(response to stress)에 대한 기능을 가지고 있는 유전자의 발현이 증가하였고 유전자들의 molecular function을 보면 촉매 활성(catalytic activity), 산화환원효소 활성(oxidoreductase activity)을 갖는 유전자들의 발현량이 증가하였다. 해당유전자들의 분자 기능(molecular function)을 분석해보면 세포 주변(cell periphery), 원형질막(plasma membrane), 막(membrane)에 위치하는 유전자임이 밝혀졌다.
한편, A-4 제제 처리 후 CMV가 감염되었을 때 특이적으로 발현이 억제되는 106개의 유전자의 GO term 분석 결과 광합성에 관련된 유전자였으며, 해당 유전자의 세포 구성요소(cellular component)는 광계(photosystem), 광합성막(photosynthetic membrane), 색소체 틸라코이드 막(plastid thylakoid membrane)에 위치하고 있음을 확인하였다. 실시예 A-5 제제를 처리한 후 CMV를 감염시켰을 때는 92개의 유전자가 특이적으로 발현이 억제되었으며 해당유전자는 단일 유기체 생합성 과정(single-organism biosynthetic process)과 관련한 유전자로 엽록체(chloroplast), 색소체(plastid)에 위치하는 유전자임이 확인되었다.
실시예 A-4 제제를 처리한 고추식물에 TSWV를 감염시켰을 때 특이적으로 발현이 증가하는 736개의 유전자에 대하여 GO term 분석 결과, 해당 유전자의 biological process 기능으로는 단일 유기체 대사 과정(single-organism metabolic process), 소분자 대사 과정(small molecule metabolic process), 카르복실산 이화 과정(carboxylic acid catabolic process) 기능을 갖는 유전자들이었고 이들은 촉매 활성(catalytic activity), 단백질 세린/트래오닌 키나아제 활성(protein serine/threonin kinase activity, phosphotransferase activity) 기능 갖는 유전자이다. 해당 유전자들의 세포 내 위치는 막(membrane), 세포막(plasma membrane)에 위치하고 있음이 확인되었다.
또한, 실시예 A-5 제제를 처리하고 TSWV를 감염하였을 때 특이적으로 발현이 증가되는 유전자 20개에 대한 GO term 분석 결과 생물학적 프로세스(biological process), 분자 기능(molecular function)에 관한 유의미한 기능적 분석은 발견되지 않았으며 해당 유전자들은 색소체(plastid)와 엽록체(chloroplast)에 위치하는 유전자임이 확인되었다. 또한, 실시예 A-5 제제를 처리한 후 TSWV를 감염하였을 때 특이적으로 발현이 억제되는 유전자는 4개로 확인되었으며 적은 수의 유전자로 인하여 유의미한 GO term 분석은 수행할 수 없었다.
실시예 A-4 및 실시예 A-5 제제를 전처리 후 CMV와 TSWV가 감염된 각각의 고추 식물체에서 발현 변화가 일어나는 기주 유전자 중 식물 호르몬 및 저항성 반응과 관련한 유전자 분석을 위하여 mapman를 이용한 유전자 분석을 수행하였다.
실시예 A-4 제제를 먼저 처리하고 CMV와 TSWV를 감염시킨 고추 식물의 식물 호르몬 관련 유전자 발현 변화를 분석한 결과 CMV와 TSWV 감염에 반응하여 에틸렌(ethylene) 및 자스몬산(Jasmonic acid) 관련 유전자의 발현이 강하게 증가하였고 이에 따른 신호전달 경로(signaling pathway), PR(Pathogenesis-related) 단백질 관련 유전자의 발현 또한 증가함이 확인되었다. 또한, 실시예 A-5 제제를 처리하고 CMV와 TSWV를 감염한 고추 식물에서도 실시예 A-4 제제 처리 식물과 마찬가지로 에틸렌(ethylene) 및 자스몬산(Jasmonic acid) 관련 유전자의 발현이 강하게 증가하였으며 PR 단백질 관련 유전자의 발현도 증가함이 확인되었다. 이에 따른 에틸렌 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과를 도 3에 나타내었고, 자스몬산 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과를 도 4에 나타내었고, PR 단백질 관련 유전자의 발현 변화 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
실험예 2: 항바이러스 효능 평가
실시예 A-5 제제의 처리 농도는 2000배로 희석하여 항바이러스 효능평가를 위한 대상바이러스는 토마토반점 위조 바이러스(TSWV)로 선발하였으며 고추 식물을 대상 작물로 사용하였고, 품종은 청양품종을 이용하였다. 해당 바이러스 접종 3일전 처리를 위해 고추 생육기간 중 6엽기 초기에 실시예 A-5의 제제를 경엽 및 관주 처리하고 토마토반점 위조 바이러스(TSWV)는 즙액 접종하여 항바이러스 효능평가를 수행하였다. 바이러스 접종 10일 후 상엽에서 나타나는 병징을 관찰하였고, total RNA를 추출하여 바이러스 증식 여부를 realtime RT-PCR을 통하여 정량 분석하였다. 병징을 관찰한 사진을 도 6에 나타내었고, 정량 분석 결과를 도 7에 나타내었다. 이에 따르면, 실시예 A-5 제제를 처리한 고추 식물에서 TSWV의 증식이 대조군에 비해 약 40% 억제되어 유의미하게 감소한 것으로 나타났다.
한편, 실시예 A-5 제제의 바이러스 입자의 안정성에 대한 직접적인 영향을 확인하기 위하여 실시예 A-5 제제의 2000배 희석액을 TSWV 즙액 접종원과 1:1 비율로 혼합하여 상온에 1시간 동안 저장 후 청양 고추 식물에 접종하였다. 바이러스 즙액을 접종한 접종엽(inoculated leaves)과 바이러스 접종 10일 후에 병징이 나타나는 상엽(systemic leaves)에서 각각 잎을 취하여 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA를 이용하여 TSWV specific primer를 이용하여 Realtime RT-PCR을 수행하여 바이러스의 증식량에 대한 변화를 정량분석하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이에 따르면, 실시예 A-5 제제와 혼합된 바이러스 접종원의 바이러스 증식 변화는 대조군과 비교시 유의미한 차이가 확인되지 않았다. 즉, 실시예 A-5 제제에 의한 바이러스 입자에 직접적인 영향을 미쳐 바이러스를 사멸하는 것이 아니라, 앞서 살펴본 바와 같이 유전자 발현의 변화를 통하여 항바이러스 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 3: 현장 실험 Ⅰ
현장실험에 대한 평가는 아래와 같은 방법에 따라 수행하였으며, 참고로 현장 재배 실험 현장에 대한 사진을 도 9에 나타내었다.
(1) 공시작물 및 시험조건: 고추(PR백두홍) - 역병 및 바이러스 저항성 종자
(2) 자연감염 바이러스: BBWV2, PMMoV 복합감염 대상
(3) 현장사용 항바이러스 제제 시비방법: 1월 1회, 관주시비, 500배 희석 사용
(4) 방제가(%): 살포 종료 후 14일 경과 시 결과 비교
(5) 도장억제인자: 절간장 (cm)을 기준으로 하고, 초장(cm), 주경장 (cm) 및 분지수(개)를 조사하여 최종 유의성 평가 실시
(1) 시알산 함유 GMP에 대한 바이러스 감염 예방 효능 분석
제제별로 정식단계 (약제별 침지 후 정식) 및 전기간 동안 단용 및 교호시비 종료 후, 일정별 방제가 증감결과를 토대로 감염예방 및 약효유효시간을 평가하였다. 평가결과를 토대로 최종 생화학농약 등록형 후보제제와 효능표기형 유기농자재류를 선발함에 목표를 두었으며, 전체 평가결과는 다음과 같다. 실시예 A-1의 시알한 미분리 GMP와 실시예 B-1의 시알산 분리 GMP를 대상으로 항바이러스 효능에 대한 현장 검증을 수행한 결과는 다음과 같다(유의성 검토: Duncan grouping 분석법, P>0.1, 0.05 및 0.01).
- 작물바이러스 감염 예방형 방제효과 비교결과, 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP의 방제가는 72.6%, 실시예 B-1의 시알산 분리 GMP의 방제가는 46.2%으로 나타나 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP가 유의하게 높은 방제가를 나타내었다.
- 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP는 약제살포 중단 7일후 방제가는 62.8%에서 14일이 경과하면 72.65%로 급격히 증가하다가 25일이 경과하면 58.2%로 감소하는 패턴을 보였다(P>0.01). 그러나, 실시예 B-1의 시알산 분리 GMP는 동일평가 일정에서 21.9%, 46.2% 그리고 39.9%로 조사되어 실시예 A-1에 비하여 유의적으로 낮은 방제 효과를 나타내었다. 따라서 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP이 바이러스 감염예방 효과에 있어 보다 우수함이 인정되었으며, 또한 유기농자재 등록 요건을 충족하였다(P>0.01).
- 약효지속시간은 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP는 25일, 실시예 B-1의 시알산 분리 GMP는 15일의 패턴을 나타내므로, 약제를 25일 단위로 지속적 공급시는 목표 방제가 또한 지속적으로 유지될 것으로 평가되었다.
- 이와 같은 결과를 통하여 효소처리에 따라 GMP로부터 분리된 시알산은 바이러스와 물리적 접촉에 의해 불활성화 효능이 없음이 확인되었으며, 오히려 방제가를 감소시키는 결과를 보였다. 즉, 항바이러스 방제효과는 시알산을 분리하지 않고 함유한 GMP에 의해 발현된 것으로 확인되었다. 따라서 시알산 미분리 GMP를 전기간 지속적으로 공급 시 높은 방제가를 기대할 수 있으며, 동시에 다종 구성성분들이 복합적으로 작물생리활성을 증진시킴으로서 방제가를 더욱 높이는 것으로 조사되었다.
(2) 시알산 함유 GMP에 대한 바이러스 억제능 분석
실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP와 실시예 B-1의 시알산 분리 GMP 고추작물의 생육에 미치는 영향 즉 바이러스 억제능을 분석하기 위하여 무처리구 대비 평가를 수행하였다. 도장억제의 주요인자인 절간장 (cm) 은 실시예 A-1 및 실시예 B-1 처리군에서 동일하게 94.8%, 초장(cm)은 96%와 92.5% 수준으로 감소하는 패턴을 보였다. 고추수확량 증감에 미치는 결과로서, 무처리 (432.8±23.4g) 대비 86.3%~90% 수준으로 다소 감소하는 결과를 보였다(P>0.05). 따라서 결론적으로, 관주용 항바이러스 방제제로서는 실시예 A-1의 시알산 미분리 GMP이 효능표기형 유기농업자재 등록 기준(방제가 50% 이상)에 적합한 것으로 평가하였다.
(3) 시알산 함유 GMP 복합제제의 바이러스 감염 예방 효능 평가
실시예 A-1, A-2, A-3의 시알산 미분리 GMP 제제, 및 실시예 B-1, B-2, B-3의 시알산 분리 GMP 제제에 대하여 식물 바이러스 감염 예방 효능을 비교 평가하였고, 그 결과는 다음과 같다.
- 무처리구 대비 실시예 A-1, A-2, A-3의 시알산 미분리 GMP 제제, 및 실시예 B-1, B-2, B-3의 시알산 분리 GMP 제제는 전체적으로 높은 방제가를 나타내었다(P>0.01).
- 시알산 분리형 GMP 제제인 실시예 B-1, B-2, B-3 는 항바이러스 방제가 범위가 24.3 ~ 46.2%으로 나타났으나, 시알산 미분리형 GMP 제제인 실시예 A-1, A-2, A-3은 효능표기형 유기농자재 등록 조건인 방제가 50% 충족시키는 수준인 61.1 ~ 72.6% 범위로 유의하게 높게 나타났다(P>0.01).
- 실시예 A-1과 B-1과 비교하여 항바이러스 유효성분인 요오드(I)를 추가한 실시예 A-2, B-2, 요오드/황(I/S)을 추가한 실시예 A-3, B-3 약제살포 중단 후 14일 경과 시 기준으로 방제가는 다음과 같았다. 실시예 A-1의 방제가 (72.6%) 대비하여 볼 때 실시예 A-2의 방제가는 84.2%, 실시예 A-3의 방제가는 101% 수준으로 나타났다. 또한, 실시예 B-1의 방제가 46.2%와 비교하여 실시예 B-2의 방제가는 24.3%, 실시예 B-3의 방제가는 33.2%로 오히려 감소하는 결과를 보였다(P>0.01). 또한, 실시예 A-1, A-2, A-3의 시알산 미분리 GMP 제제, 및 실시예 B-1, B-2, B-3의 시알산 분리 GMP 제제 모두 약효지속시간은 15 내지 25일로 나타났다.
상기 결과에 따라 살펴보면, GMP 제제의 항바이러스 효능은 효소 분리된 시알산의 물리적 접촉으로 인한 것이 아니라, 오히려 시알산이 분리되지 않은 상태로 함유된 GMP가 항바이러스 효능을 발휘하는 것으로 평가된다. 즉, 효소처리로 시알산이 GMP에서 분리되는 동시에 펩타이드 형태로 전환되면서 항바이러스 효능이 상실되는 것으로 보인다. 또한, GMP 유래 펩타이드는 요오드나 요오드/황이 결합함에 따라 오히려 유기태화 요오드 또는 유기태화 요오드/황이 가지는 항바이러스 효능도 감소시키는 것으로 보인다.
(4) 시알산 함유 GMP 복합제제의 바이러스 억제능 효능 평가
실시예 A-1, A-2, A-3의 시알산 미분리 GMP 제제, 및 실시예 B-1, B-2, B-3의 시알산 분리 GMP 제제에 대하여 식물 바이러스 감염에 따른 고추작물의 생육에 미치는 영향 즉, 바이러스 억제능을 무처리구 대비 평가하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
- 도장억제의 주요인자인 절간장(cm)은 실시예 A-2는 91.4% 억제율, 실시예 A-3은 94.8% 억제율을 나타내었다. 실시예 B-1은 86.2%, 실시예 B-2는 87.9%, 실시예 B-3은 84.5%의 억제율을 나타내었다.
- 항바이러스 제제로서 실시예 A-1, A-3의 제제가 적합한 것으로 보이고, 활용면에서는 실시예 A-1이 효능표기형 유기농업자재류, 작물 생리활성증진용 영양공급원형으로 적용하고 실시예 A-3은 제품형 작물바이러스 방제제로 적용할 수 있을 것으로 보인다. 전체 처리구에서 84.5% 내지 94.8%의 절간생장을 억제하는 효과를 보였으며, 시알산 미분리형 GMP 제제인 A형 실시예 보다 시알산 분리형 GMP 제제인 B형 실시예, 그중 요오드/황이 동시 포함된 실시예 B-3의 바이러스 억제 효과가 유의적으로 높은 것으로 나타났다(P>0.01).
(5) 혈분 포함 시알산 함유 GMP 복합제제의 바이러스 예방 효능 분석
실시예 A-4, B-4 및 실시예 A-5, B-5의 혈분포함 시알산 함유 GMP 복합제제에 대하여 바이러스 감염 예방형 방제효과를 검정하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
- 무처리구 대비 평가 결과, 실시예 B-1는 방제가는 46.2% 였음에 비하여 실시예 A-1 제제의 방제가는 72.6%로 시알산 미분리시에 유의하게 높은 방제가를 보였다(P>0.01).
- 시알산 분리형 GMP 제제인 실시예 B-2, B-3은 24.3 ~ 33.02% 의 방제가, 시알산 미분리형 GMP 제제인 실시예 A-2, A-3은 61.1 ~ 73.4% 의 방제가를 나타내어 시알산 미분리형 GMP 제제가 유의하게 높은 방제가를 나타내었다(P>0.01).
- 혈분을 추가로 포함하는 시알산 미분리 GMP 복합제제인 실시예 A-4, B-4, 시알산 분리 GMP 복합제제인 실시예 A-5, B-5를 무처리구 대비 감염 예방형 바이러스 방제효과를 약제살포 종료 후 14일 경과 기준으로 생육효과 및 수확량을 비교하여, 최종적으로 생화학농약등록 조건(방제가 80% 이상)이 충족하는 방제제를 선발하였다.
그 결과, 실시예 A-4와 B-4의 방제가는 61.1%와 59,7%, 실시예 A-5와 B-5는 92.0%와 46.2%의 방제가를 나타내었다(P>0.01). 이와 같은 결과는 혈분 포함여부와는 별개로 시알산 미분리 GMP의 항바이러스 효능이 우수함을 검증하는 것이다. 또한, 실시예 A-5가 실시예 A-4에 비하여 방제 효과가 더 우수한 것으로 나타났다(P>0.01).
(6) 혈분 포함 시알산 함유 GMP 복합제제의 바이러스 억제능 효능 분석
혈분 포함 시알산 함유 GMP 제제의 고추작물의 생육에 미치는 영향을 무처리구 대비 평가하여 그 결과를 아래에 나타내었다.
- 도장억제의 주요인자인 절간장(cm)은 실시예 A-2와 A-3에서 91.4% ~ 94.8% 억제능, 혈분 포함 실시예 A-4와 A-5는 94.8%와 93.1%의 범위의 억제효과를 보였다. 또한, 실시예 B-1는 86.2%, 실시예 B-4와 B-5는 각각 84.5%와 82.8% 수준으로 보다 높은 수치의 억제효과를 보였다(P>0.01).
- 고추 수확량 증감에 미치는 결과로서, 무처리 (432.8±23.4g) 대비 실시예 A-5 처리군은 약 107%의 높은 수치를 보였으나, 실시예 A-4, B-4, B-5는 다소 감소하는 결과를 보였다(>0.05).
(7) 고온기 항바이러스 및 도장억제 동시효능 발현 제제 선발
고추작물에 전체 항바이러스 후보제제 시비 후 생육결과를 토대로 항바이러스와 고온기 도장억제 효능이 동시에 발현되는 제제를 선발하였고, 그 결과는 아래와 같다.
- 항바이러스 방제효과와 더불어 도장억제에 미치는 평가인자를 절간장 (cm)을 기준으로 하고, 초장(cm), 주경장 (cm) 및 분지수(개)를 조사하여 실시예 A-1 내지 A-5, 및 실시예 B-1 내지 B-5의 제제 처리군에 대하여 최종 유의성 평가를 실시하였다. 시알산 미분리형 GMP 복합 제제인 B-2 내지 B-5만이 특이하게 생육초기부터 전기간 동안 지속적으로 고온기 도장 억제제로서 효능이 나타났다(P>0.01). 구체적으로, 무처리 대비 도장억제 효능 평가에 있어 주요인자인 절간장은 84.5 ~ 86.2%, 초장은 88.5 ~ 91.1% 수준의 유의적인 억제 효과를 나타냈다(P>0.01).
- 실시예 B-1 대비 실시예 B-2와 실시예 B-3 복합 제제 처리군은 각각 87.9%와 84.5%, 초장은 89.5%와 91.1% 수준의 유의한 억제효과를 나타내었다 (P>0.01). 실시예 B-4와 실시예 B-5 제제는 동일하게 84.5% 였으며, 초장의 경우는 각각 89.4%와 88.5% 로 유의적인 억제효과를 보였다(P>0.01).
- 고온기 항바이러스와 작물 도장억제가 고추수확량 증감에 미치는 결과로서, 무처리 (432.8±23.4g) 대비 실시예 B-4를 제외하고는 실시예 B-1는 90.1%, 실시예 B-2는 84.2%, 실시예 B-3는 81.8%, 실시예 B-5는 89.1%로 감소하는 결과를 보였다(P>0.05).
실험예 4: 현장 실험 Ⅱ
실시예 A-4 항바이러스 제제와 실시예 A-1 항바이러스 제제에 대하여 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus, TSWV)에 대한 항바이러스 효능을 확인하기 위하여 고추(칼타이탄)을 대상으로 현장 실험을 수행하였다. 매월 1일경 실시예 A-4 항바이러스 제제(물 1ton당, 1kg) 관수처리하고 실시예 A-1 항바이러스 제제를 매월 21 ~ 25일경(물 1ton당, 1kg) 관수처리하였다. 자연감염조건에서 약제 처리 전 및 후의 방제가 검정은 immunostrip법으로 검정하였고, 수확량이 감소된 바이러스 감염 작물의 최종 고추 수확량을 측정하여 최종 방제가를 결정하였다. 통계처리는 SAS 프로그램 (Ver. 8.0), 유의성 검토는 Duncan grouping 분석법, 유의성 검정 평가수준은 P>0.1, 0.05 및 0.01로 하였다. 이에 따르면, 방제가가 90% 이상으로 나타났다. 참고로 현장 실험에 대한 사진을 도 10에 나타내었다.
한편, 실시예 A-5 제제에 대하여 상기와 동일한 방법으로 관수처리하여 재배한 결과 TSWV 방제가는 90% 이상으로 나타났다.
Claims (12)
- 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드는, 상기 글라이코매크로펩타이드가 뉴라미니다제(Neuraminidase)에 의해 효소분해되어 시알산이 분리된 상태로 함유된 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드이거나, 또는 시알산이 분리되지 않은 상태로 함유된 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드인 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 미네랄 및/또는 혈분을 추가로 포함하고, 상기 미네랄은 요오드(I)이거나 또는 요오드(I)/황(S) 복합물인 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 미네랄은 우유 카제인, 키토산, 알긴산, 전분, 및 프로피닐 부틸 카바메이트(propynyl butyl carbamate), 및 메틸 톨릴설폰(methyl tolylsulfon) 중에서 선택된 어느 하나의 유기물 기질이 킬레이트 결합되어 유기태화된 유기태화 미네랄인 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 식물 바이러스는 토마토 황화잎 말림 바이러스(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus, CMV), 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus, TSWV), 잠두 위조 바이러스(broad bean wilt virus 2, BBWV2), 고추모틀 바이러스(pepper mottle virus, PepMoV), 호박황화모자이크 바이러스(ZYMV), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 및 박과진딧물 바이러스(CABYV) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 고추, 담배, 토마토, 오이, 멜론 및 수박 중에서 선택된 1종 이상의 식물 방제용인 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 관주용 또는 엽면시비용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드는 작물 도장억제 용도를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물. - 상기 식물 바이러스 방제용 조성물은 에틸렌(ethylene), 자스몬산(Jasmonic acid) 및 PR(Pathogenesis-related) 단백질 중에서 선택된 어느 하나의 합성 관련 유전자의 발현 증가용인 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물.
- (a) 반응기에 물, 염기 및 유청을 투입하고 최종 pH 8.50±0.3, 온도 47±2℃의 조건으로 조절하는 전처리 단계;
(b) 상기 반응기에 락토오스, 리파아제, 프로테아제를 순차적으로 투입하여 효소처리하는 단계; 및
(c) 상기 반응기 온도를 76±2℃로 승온시켜 실활시키는 단계;를 포함하는 시알산을 함유하는 글라이코매크로펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물의 제조방법. - 제10항에 있어서,
단계 (c) 이후,
(d) 단계 (c)의 생성물인 시알산 미분리형 글라이코매크로펩타이드를 뉴라미니다제(Neuraminidase)로 효소분해하는 단계;를 추가로 수행하여 시알산이 상기 글라이코매크로펩타이드로부터 효소분리된 상태로 포함되는 시알산 분리형 글라이코매크로펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제용 조성물의 제조방법. - 제1항 내지 제9항 중에서 선택된 어느 한 항의 식물 바이러스 방제용 조성물을 이용한 식물 바이러스 병의 방제방법.
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| KR20190031802A (ko) | 2017-09-18 | 2019-03-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | 유청을 활용한 고추 바이러스 감염병 방제 방법 |
-
2023
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