KR20230134133A - Cd7을 표적화하는 조작된 면역 세포, 키메라 항원 수용체,cd7 차단 분자 및 용도 - Google Patents

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Abstract

CD7을 표적화하는 조작된 면역 세포, 키메라 항원 수용체, CD7 차단 분자 및 용도를 공개한다. 인간 유래 CD7의 천연 리간드를 이용하여 항체 서열을 치환하여 CD7 특이적 CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 항원 인식 도메인으로 사용한다. CD7 특이적 CAR에서 인간 유래 CD7을 항원 인식 도메인으로 사용하는 것은 숙주에서 발생하는 세포 및 체액 반응을 방지하여, CAR-T 세포의 장기 지속성과 더 나은 치료 효능을 구현할 수 있다는 장점이 있다.

Description

CD7을 표적화하는 조작된 면역 세포, 키메라 항원 수용체, CD7 차단 분자 및 용도
본 발명은 세포 면역 치료 기술 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD7을 표적화하는 면역 치료 방법에 관한 것이며, 특히 CD7를 표적화하는 조작된 면역 세포, 키메라 항원 수용체, CD7 차단 분자 및 용도에 관한 것이다.
T 세포 악성 종양은 이질성이 매우 강한 클론성 성장 및 T 세포 기능 장애 질환으로, 주로 T 세포 림프종(T-cell lymphomas, TCL)과 T 세포 백혈병으로 분류되며, 성숙 및 전구체 아형이 있다. 이러한 질병은 매우 악성인 혈액 계통 암을 대표하는 것으로, 어린이와 성인 모두에서 높은 재발률과 사망률을 보이며, 현재 효과적이거나 표적화된 치료법이 없다. 종래 기술에 이미 많은 화학요법이 있지만, T세포 급성 림프구성 백혈병(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL) 환자 중에서, 성인의 50% 미만 및 어린이의 75% 미만만이 5년 이상 생존할 수 있다. 초기 치료 후 재발한 환자의 경우, 구제적 화학요법은 20 내지 40%의 사례에서만 관해를 유도할 수 있다. 재발성 또는 화학요법 난치성 T 세포 악성 종양 환자의 경우, 치료 예후가 비교적 떨어지며, 효과적이고 허용 가능한 치료법이 제한적이다. 구제적 화학요법 후 완전 관해(CR)된 환자의 10 내지 50%의 경우, 유일한 치료 옵션은 여전히 동종이계 줄기 세포 이식(allogeneic stem cell transplantation, ASCT)이다. 그러나, ASCT의 완치율은 여전히 30% 이하이며, 모든 CR 환자가 이식을 받을 수 있는 것은 아니다. 피부 및 말초 T 세포 림프종(각각 CTCL 및 PTCL)을 포함한 다른 T 세포 악성 종양은, 화학요법에 대한 초기 반응률이 낮고, 반응하는 환자들 사이에서도, 무진행 생존율이 여전히 40 내지 50%로 유지된다. 따라서, T 세포 악성 종양 치료 측면에서 진전이 있음에도 불구하고, 특히 재발 및 난치 환자의 경우, 예후를 개선하기 위해 새로운, 표적화된 치료법이 여전히 필요하다. T-ALL 및 T-NHL과 같은 T 세포 악성 종양 외에도, 20 내지 30%의 급성 골수성 백혈병(AML), 및 대다수의 NK 및 NKT 림프종과 같이, 여전히 효과적인 치료 및 표적화된 치료 옵션이 부족한 다른 CD7+ 혈액 악성 종양이 있음이 인식되어야 한다.
키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포는 가장 유망한 종양 면역 요법 중 하나로, B 림프구 악성 종양 환자에서 유의한 반응률을 생성할 수 있다. 따라서, CD19(B세포 백혈병과 림프종에서 널리 발현되는 항원)를 표적으로 하는 CAR-T 세포는 이미 최초로 허가된 암에 대한 T 세포 치료법이 되었다. 재발성 및 난치성 B 세포 악성 종양 치료 측면에서 CD19 CAR-T 세포의 성공은 다른 종양에 더 광범위하게 적용할 수 있게 되었다. B 림프구 악성 종양과 T 림프구 악성 종양 사이의 유사성을 고려할 때, CAR-T 세포 치료를 이러한 질병으로 확장하는 것은 간단해 보인다. 그러나, T 세포 악성 종양을 표적으로 하는 CAR-T 세포 치료는 개발 및 구현이 어려운 것으로 이미 입증되었다. 이는 주로 조작된 T 세포 상에서 표적 항원의 동시 발현이 제조 과정에서 CAR-T 세포가 상호 사멸을 유발할 수 있음과 동시에, CAR-T 세포 재주입 후 정상 말초 혈액 T 세포의 제거가 심각한 면역 결핍을 유발할 수 있다는 것이다.
CD7은 막관통 당단백질로, 통상적으로 대부분의 말초 혈액 T 세포와 NK 세포(NK 세포는 자연 살해 세포로, 골수림프성 줄기 세포에서 유래하며, 이의 분화와 발육은 골수 및 흉선 미세 환경에 의존하고, 주요 골수, 말초 혈액, 간, 비장, 폐 및 림프절에 분포하고; NK 세포는 T 세포, B 세포와 달리, 사전 감작 없이 종양 세포와 바이러스 감염 세포를 비특이적으로 사멸시킬 수 있는 림프구임) 및 그 전구체 세포 상에서 발현되며, 보조 T 세포 활성화 및 다른 면역 하위 집합과 상호 작용하는 공동자극 단백질로 사용된다. 95% 이상의 림프모구 백혈병과 림프종 및 일부 말초 T 세포 림프종은 CD7을 발현한다. 마우스 동물 모델에서, CD7이 결핍된 T 세포는 대체로 간섭 받지 않는 발육, 항상성 및 보호 기능을 나타낸다. CD7은 말초 혈액 T 세포 기능에 큰 영향을 미치지 않기 때문에, 이는 매우 유망한 CAR-T 세포 치료 표적이다. CD7은 단일 클론 항체(mAb) 표적으로서 면역 독소 요법을 사용한 T 세포 악성 종양 환자 치료 측면에서 평가되었다. 이러한 단일 클론 항체의 컨쥬게이트는 심각한 CD7 관련 독성 부작용을 발생시키지 않았으나, 항종양 반응이 유의하지 않았으며, 이는 환자 치료에서 마우스 유래 항체의 제한된 활성 때문일 수 있다.
종래 기술에서, CD7을 표적화하는 치료에 관한 연구는 다음과 같은 진전이 있었다:
i) CD7-CAR-T 세포 치료: 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포는 매우 유망한 종양 면역 치료 방법이다. 이러한 표적 치료는 B 세포 백혈병 및 림프종 환자의 관해, 심지어 장기간 무재발 생존을 달성하는 측면에서 엄청난 잠재력을 보여주었다. 최근 몇몇 연구진은 T 세포 악성 종양의 전임상 모델에서 CD7 특이적 CAR-T 세포 치료의 연구 진전을 보고하였다. 이러한 모든 연구에서는, T 세포 상에서 CD7-CAR의 발현은 심각한 자살 현상을 초래하여, CAR-T 세포가 생체외에서 확장할 수 없었다.
형질도입된 T 세포 상에서 표적 특이적 CAR의 발현은 지속적인 리간드 결합으로 인한 CAR 수용체 활성화를 야기할 수 있으며, 이는 형질도입된 T 세포의 자살을 유도하고 세포의 말단 분화를 가속화하여 생체내에서 장기간 생존할 수 없도록 한다. CD7은 범 T 세포 항원이기 때문에, 대부분의 T 세포 상에서 모두 발현된다. 따라서 CD7 항원 특이적 CAR-T 세포는 제조 과정에서 심각한 자살 현상이 발생하여, CAR-T 세포가 효과적으로 확장되지 못할 수 있다. 종래에는 두 가지 전략으로 이러한 자살 현상을 감소시켰다: 1) 게놈 편집 도구를 사용하여 CD7 표적 항원의 유전자를 녹아웃시킨다. 2) 소포체에 CD7 결합 도메인을 앵커링시키는 방법을 통해 CD7 단백질이 세포 내 발현 과정에서 세포 표면에 수송되는 것을 차단한다. 이러한 두 가지 방법은 모두 세포 표면에서 CD7의 발현을 효과적으로 감소시키고, CD7-CAR-T 세포 표적의 자살 현상을 최소화할 수 있다. 중요한 것은, CD7의 손실이 CAR-T 세포의 증식 및 단기 이펙터 기능에 영향을 미치지 않아, 높은 항종양 활성을 가진 기능성 CAR-T 세포의 확장이 가능해진다는 것이다.
세포 표면 상으로부터 CD7을 제거한 후, CD7-CAR-T 세포는 생체외 및 생체내에서 원발성 CD7 양성 T-ALL 및 림프종에 대해 비교적 강한 항종양 활성을 갖는다. CD7-CAR-T 세포는 말초 혈액 CD7 양성 T 세포 및 NK 세포에 대해도 세포 독성이 있으며, 이는 이러한 세포 하위 집합도 CD7-CAR-T 세포의 표적이 될 수도 있음을 시사한다.
자가 세포를 사용하여 입양 세포 치료를 수행하는 것은 무의식중에 말초 혈액의 악성 종양 세포도 동시에 유전자 변형된다는 위험이 있다. CAR을 이용하여 유전자 변형한 악성 T 세포가, 상황에 따라, 유전자 편집을 수행하여 표적 분자의 발현을 감소시키도록 허용한다는 것은 실제로 존재하는 위험일 수 있으므로, 이러한 치료의 사용에 대한 정보를 동의서에서 설명해야 한다. 그러나, 제조 과정에서 악성 종양 세포의 생존률과 증식성이 비교적 떨어지는 점을 고려하면, 이러한 불필요한 악성 세포의 유전자 변형은 더 낮은 빈도로 발생해야 한다. 또한, 유전자 편집이 결핍되어 표적 항원 발현이 감소하는 경우, 표적 항원을 발현하는 악성 종양 세포는 형질도입 후 및 환자 체내에 주입되기 전에 CAR-T 세포 상호 사멸에 의해 제거될 수 있다. 동시에, 건강한 기증자에 의해 생산된 동종이계 CD7-CAR-T 세포는 재발성 및 난치성 T 세포 악성 종양을 치료하는 데 사용되어, 환자를 조혈모 세포 이식으로 연결하는 목적을 달성하거나, 조혈모 세포 이식 후 재발하는 T 세포 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이식편 대 숙주의 부작용을 적절하게 제어할 수 있다면, 동종이계 CD7-CAR-T 세포 치료의 장점은 건강한 기증자가 제공한 T 세포 외에도, 이식편 대 백혈병의 효과를 나타낼 수도 있다. 종래의 동종이계 T 세포 또는 NK 세포를 수송 도구로 사용하면, 악성 세포의 유전자 변형의 위험을 완전히 피할 수 있다. 이러한 세포 산물은 건강한 기증자로부터 생성되기 때문에, 환자 유래의 T 세포 사용을 피할 수 있는데, 이러한 T 세포는 종종 억제성 종양 미세 환경에 오래 노출되거나 이전의 집중 치료로 인해 기능이 저하된다.
ii) CD7을 표적화하는 면역 독소: CD7은 T 세포 상에서 고밀도(약 60,000mol/cell)로 발현되며, 1가 항체 단편에 의해 결합되더라도, CD7은 빠르게 내재화된다. 따라서, 이는 면역 독소가 T 세포 종양 치료를 매개하는 이상적인 표적 항원이다. 현재, 항-CD7 면역 독소는 주로 항-CD7 단일 클론 항체와 독소가 컨쥬게이트되어 형성된다. 마우스 항-인간 CD7 단일 클론 항체(WTI)를 사용하여 리신 A와 결합하는 항-CD7 면역 독소는 생체외에서 종양 세포를 제거하여 T 세포 악성 종양 환자의 자가 골수 이식을 수행하는 데 사용된다. 면역 독소 DA7은 화학적 방법을 통해 마우스 IgG2b 항-CD7(3AlE) 단일 클론 항체와 탈당화 리신 A 사슬을 연결하여 구성되며, SCID 동물 모델에서 인간의 T-ALL을 치료하는 데 사용되었는데, 이는 예후가 좋지 않은 T 세포 백혈병에 잠재적인 치료 효과가 있음을 시사한다. DA7의 임상 1상에서, 불안정성과 혈관 독성의 한계에도 불구하고, 최대 내약 용량에서 객관적인 임상 반응을 보였다. 항-인간 CD7 단일 클론 항체 TH69도 재조합 면역 독소를 구성하는 데 사용되었는데, 해당 항체는 유전자 재조합의 방법을 통해 단일 가닥 항체 단편(scFv)과 절단된 슈도모나스 외독소 A 단편을 서로 연결한다.
iii) 유전자 녹아웃: 입양 면역 치료의 임상에서 유전자 편집 T 세포 표적화의 타당성은 이미 잘 입증되었다. 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하여 CD4 양성 T 세포에서 HIV 보조수용체 CCR5에 대해 유전자 녹아웃을 수행함으로써, 이러한 세포가 HIV 감염에 저항력을 갖도록 하고, CCR5 음성의 T 세포가 HIV 감염 환자에게 이식되어 지속적으로 존재할 수 있도록 한다. TALENs를 사용하여 CD19 CAR-T 세포에서 T 세포 수용체(TCR) 유전자에 대해 녹아웃을 수행하여, 제3자 T 세포가 B 세포 백혈병 환자를 성공적으로 치료할 수 있도록 하였으며, 이는 "범용" 기존 T 세포 제품에 대한 하나의 놀랄만한 이정표로서, 이식편 대 숙주병의 위험을 크게 감소시켰다. 해당 연구에서, CD52 유전자는 재주입된 CAR-T 세포에서도 녹아웃되어, 알렘투주맙에 대해 약물 내성을 일으켰다. 최근, CRISPR/Cas9 시스템은 CD7 녹아웃 또는 CD7 및 T 세포 수용체의 α 사슬 동시 녹아웃에 사용되었으며, 이 새로운 유전자 편집 시스템은 T 세포에서 표적 유전자를 빠르고 효과적으로 녹아웃시킬 수 있다.
iv) 세포 내 단백질 발현 차단 기술: 많은 생화학 및 면역 시스템에서는, 통상적으로 일부 특정 분자의 역할을 판단하기가 매우 어렵지만, 한 가지 방법은 유전자 발현을 억제하여 그 기능적 효과를 찾는 것이다. 상동 재조합 또는 최근 발전된 유전자 편집 기술, 예를 들어 Zince Finger 뉴클레아제, TALENs 및 CRISPR/Cas9을 통해 유전자 녹아웃을 수행한다. 이러한 기술은 매우 강력하지만, 실제로는 많은 결함 또는 기술적 어려움이 존재한다. 따라서 간단하고 효과적이며, 분자 제거를 제어할 수 있는 기술을 발전시키는 것이 매우 시급하다.
이미 수많은 연구에서 세포내 항체를 사용하여 세포내의 중요 분자를 표적화하고 불활성화 할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 중쇄 및 경쇄를 구축하여 포유동물 세포를 형질감염시키고, 그 리더 서열을 간단하게 변형함으로써, 항체 서열을 3개의 주요한 세포내 영역, 즉 소포체(ER)/골지체, 세포질 및 세포핵에 엥커링시킬 수 있다. 최초의 세포내 항체 연구는 전체 IgG를 사용하였으나, 최근 연구에서는 Fab' 및 단일 가닥 항체(scFv) 상에 집중한다. 단일 가닥 항체 분자는 매우 작으며(약 30kDa), 짧은 펩티드 서열을 통해 중쇄와 경쇄의 가변 영역을 연결하여 구성된다. 이러한 구성 산물은 세포내 항체로서 많은 장점이 있는데, 주로 이들은 2개의 독립된 항체 사슬을 결합하여 항원 결합 부위를 형성할 필요가 없다는 것이다.
현재까지, 세포내 항체가 세포 소포체에서 HIV gp160에서 gp130으로의 처리를 방지하고; IL-2 수용체 α 사슬의 발현을 차단하고; 효모, 제노푸스 난모 세포 및 인간 유래 T 세포주에서의 세포액 효소를 억제하고, 형질전환 식물에서 바이러스 활성을 억제하는 데 사용될 수 있는 것으로 연구에서 밝혀졌다. Marasco 및 그 동료의 연구에 따르면, 단일 가닥 항체는 ER에서 작용할 수 있다. Greenman 등의 연구에 따르면, 세포내 단일 가닥 항체는 세포막 단백질의 발현을 방지하는 데 사용될 수 있으며, 그들이 사용한 것은 T 림프구 표면 항원 CD2의 고친화력 단일 클론 항체와 하나의 ER 잔류 신호(KDEL)를 결합할 수 있는 것이다.
항원 인식 도메인은 CAR 구조의 중요 구성 부분이며, 종양 세포 표면 항원과의 결합을 담당한다. 현재, CD7 특이적 CAR-T 세포 치료의 항원 인식 도메인은 대부분 마우스 또는 알파카 유래 항체의 가변 영역으로 구성된다. 일단 환자 체내에 재주입되면, 이종 항원 인식 도메인을 휴대하는 이러한 CAR-T 세포는 매우 강한 숙주 세포 및 체액 반응을 유도할 수 있으며, 재주입된 CAR-T 세포는 숙주 면역에 의해 신속하게 제거되어, 체내에서 CAR-T 세포의 지속성에 심각한 영향을 미치고, 최종적으로 질병의 난치성 및 재발성을 유발한다. 본 발명은 천연 인간 유래 CD7 리간드를 CAR의 항원 인식 도메인으로 채택하며, 이렇게 구축된 CD7-CAR-T 표적화는 숙주의 면역 반응이 나타나도록 유도하지 않고, 체내에서 장시간 생존하여, 보다 우수한 치료 효능을 나타낼 수 있다는 장점이 있다.
종래 기술의 결점을 보완하기 위하여, 본 발명은 CD7 표적화된 조작된 면역 세포, 키메라 항원 수용체, CD7 차단 분자 및 응용을 제공하는 데에 목적이 있다.
본 발명의 목적은 다음과 같은 방식으로 구현된다:
본 발명의 제1 양상은 조작된 면역 세포를 제공하며, 여기에는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 포함되고, 상기 키메라 항원 수용체는 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 포함한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 힌지 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인 및 세포내 1차 자극 도메인을 더 포함한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 힌지 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 α 사슬, β 사슬, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ 사슬, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD22, CD28, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD137, ICOS, CD154, FAS, FGFR2B, OX40 또는 VEGFR2의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 힌지 막관통 도메인은 CD8α에서 유래한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 힌지 막관통 도메인 CD8α의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 세포내 공동자극 도메인은 CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD27, CD28, CD30, CD40, 4-1BB(CD137), ICOS, OX40, LIGHT(CD258) 또는 NKG2C 중 적어도 하나로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 세포내 공동자극 도메인은 4-1BB에서 유래한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 세포내 공동자극 도메인 4-1BB의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 힌지 막관통 도메인과 세포내 공동자극 도메인은 CD28에서 유래한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 힌지 막관통 도메인과 세포내 공동자극 도메인 CD28의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3으로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체 내에서 세포내 1차 자극 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, FcRβ, FcRγ, CD5, CD66, CD22, CD79a 또는 CD79b 중 적어도 하나로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 세포내 1차 자극 도메인은 CD3ζ에서 유래한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 세포내 1차 자극 도메인 CD3ζ의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인은 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 일부 또는 전체 서열이거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 조작된 면역 세포 내에는 CD7 차단 분자가 더 포함되며, CD7 차단 분자는 CD7 결합 도메인 및 세포내 앵커링 도메인을 포함하고, CD7 차단 분자는 세포 표면에서 CD7 단백질의 수송과 발현을 차단할 수 있다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CD7 차단 분자는 구체적으로 CD7 결합 도메인을 통해 세포내 앵커링 도메인을 연결하여 CD7 단백질이 세포 표면으로 수송되는 것을 차단한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 세포내 앵커링 도메인은 소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 또는 프로테아좀 위치화 도메인의 아미노산 서열이다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 세포내 앵커링 도메인은 소포체 잔류 도메인이다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 세포내 앵커링 도메인 소포체 잔류 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.6 또는 SEQ ID NO.7로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CD7 결합 도메인은 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 일부 또는 전체 서열이거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CD7 결합 도메인은 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv이다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인은 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv이거나, 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.8로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 조작된 면역 세포 내에는 CD7 차단 분자가 더 포함되며, CD7 차단 분자는 세포 표면에서 CD7 단백질의 수송과 발현을 차단할 수 있다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CD7 차단 분자는 CD7 결합 도메인을 통해 세포내 앵커링 도메인을 연결하여 CD7 단백질이 세포 표면으로 수송되는 것을 차단한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 세포내 앵커링 도메인은 소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 또는 프로테아좀 위치화 도메인의 아미노산 서열이다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CD7 결합 도메인은 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 일부 또는 전체 서열이거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 조작된 면역 세포는 유전자 녹아웃 기술을 통해 CD7의 유전자 발현을 제거한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 녹아웃 기술에 사용되는 게놈 편집 도구는 TALENs 또는 CRISPR/cas9이다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 세포는 T 세포, γδT 세포, NK 또는 NKT 세포 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)가 분화된 T 세포, γδT 세포, NK 또는 NKT 세포이다.
본 발명의 제2 양상은 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화한 항원 인식 도메인을 제공하며, 상기 항원 인식 도메인의 서열은 일부 또는 전체 서열의 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인을 포함하거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며; 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시된다.
본 발명의 제3 양상은 항-CD7 양성 혈액 악성 종양의 면역 독소의 제조에서 상술한 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인의 응용을 제공한다.
본 발명의 제4 양상은 상술한 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 CD7BB-002이고, 상기 CD7BB-002의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.9로 표시된다.
본 발명의 제5 양상은 재조합 벡터를 제공하며, 여기에는 상술한 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자가 포함된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 트랜스포존으로부터 선택된다.
본 발명의 제6 양상은 조작된 면역 세포의 제조에서 상술한 재조합 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 제7 양상은 상술한 조작된 면역 세포 제조용 CD7 차단 분자를 제공하며, 상기 CD7 차단 분자의 CD7 결합 도메인은 일부 또는 전체 서열의 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인, 또는 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다.
본 발명의 제8 양상은 상술한 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CD7 차단 분자의 핵산 서열은 CD7-L-ER2.1이고, 상기 CD7-L-ER2.1의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.10으로 표시된다.
본 발명의 제9 양상은 상기 제1 양상에 따른 조작된 면역 세포 제조용 CD7 차단 분자를 더 제공하며, 상기 CD7 차단 분자의 CD7 결합 도메인은 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv이거나, 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 단백질이다.
본 발명의 제10 양상은 제9 양상에 따른 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 상기 CD7 차단 분자의 핵산 분자의 암호화 서열은 TH69-ER2.1이고, 상기 TH69-ER2.1의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.11로 표시된다.
본 발명의 제11 양상은 재조합 벡터를 제공하며, 여기에는 제8 양상 또는 제10 양상에 따른 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열이 포함된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 트랜스포존으로부터 선택된다.
본 발명의 제12 양상은 조작된 면역 세포의 제조에서 제11 양상에 따른 재조합 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 제13 양상은 제2 양상에 따른 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인 및 CD7 차단 분자(제7 양상 또는 제9 양상에 따른 CD7 차단 분자)를 동시에 함유하는 암호화 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제14 양상은 재조합 벡터를 제공하며, 여기에는 제13 양상에 따른 핵산 분자가 포함된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 트랜스포존으로부터 선택된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 재조합 벡터는 CD7BB-BL4-002 또는 CD7BB-BL6-002의 서열을 포함하며, 상기 재조합 벡터 CD7BB-BL4-002 또는 CD7BB-BL6-002의 벡터 서열 개략도는 각각 도 5의 A 및 B에 도시된 바와 같다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 재조합 벡터 CD7BB-BL4-002는 CD7BB-002와 TH69-ER2.1이 T2A를 통해 연결되며, 상기 재조합 벡터의 서열 구조도는 도 5의 A (1) 및 (2)에 도시된 바와 같고, 상기 T2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.16으로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 재조합 벡터 CD7BB-BL6-002는 TH69BB-002와 CD7-L-ER2.1이 T2A를 통해 연결되며, 상기 재조합 벡터의 서열 구조도는 도 5의 B (3) 및 (4)에 도시된 바와 같고, 상기 T2A의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.16으로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 CD8α 신호 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.12로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 신호 펩티드는 GM-CSF-R로부터 유래한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 GM-CSF-R 신호 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.13으로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 scFv의 경쇄 및 중쇄는 (GGGGS)3 연결 펩티드에 의해 서로 연결되고, 상기 연결 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.14로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 scFv의 경쇄 및 중쇄는 Whitlow 연결 펩티드에 의해 서로 연결되고, 상기 연결 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.15로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터에서 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자 및 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 분자는 내부 리보솜 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 또는 리보솜 코돈 A 스키핑 부위(a ribosomal codon skipping site)에 의해 연결된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 내부 리보솜 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES)는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 또는 엔테로바이러스(Enterovirus)로부터 유래된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 리보솜 코돈 스키핑 부위는 2A 자가절단 펩티드를 포함하고, 2A 자가절단 펩티드는 구제역 바이러스 F2A 펩티드(foot-and-mouth disease virus 2A peptide), 말 비염 A 바이러스 E2A 펩티드(equine rhinitis A virus 2A peptide), 돼지 테스코바이러스 P2A 펩티드(porcine teschovirus-1 2A peptide) 또는 T2A 펩티드(thosea asigna virus 2A)로부터 선택될 수 있다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 2A 자가절단 펩티드는 T2A로부터 유도된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 T2A 자가절단 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.16으로 표시된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 2A 자가절단 펩티드는 F2A로부터 유도된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 벡터의 F2A 자가절단 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.17로 표시된다.
본 발명의 제15 양상은 조작된 면역 세포의 제조에서 제14 양상에 따른 재조합 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 제16 양상은 시약 조합을 제공하며, 상기 조합은 (1) 상기 제5 양상에 따른 재조합 벡터, 및 (2) 상기 제11 양상에 따른 벡터를 포함한다.
본 발명의 제17 양상은 CD7 양성 혈액 악성 종양을 치료하는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 제조에서 제16 양상에 따른 시약 조합의 용도를 제공한다.
본 발명의 제18 양상은 시약 조합을 제공하며, 상기 조합은 (1) 상기 제5 양상에 따른 벡터, 및 (2) 세포에서 CD7 유전자를 녹아웃시킬 수 있는 유전자 편집 도구를 포함한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집 도구는 TALENs 또는 CRISPR/cas9이다.
본 발명의 제19 양상은 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인 서열을 제공하며, 상기 서열은 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv이거나, 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.8로 표시된다.
본 발명의 제20 양상은 제19 양상에 따른 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 제20 양상에 따른 핵산 분자 암호화 서열은 TH69BB-002이고, 상기 TH69BB-002의 핵산 분자 서열은 SEQ ID NO.18로 표시된다.
본 발명의 제21 양상은 재조합 벡터를 제공하며, 여기에는 제20 양상에 따른 핵산 분자의 서열이 포함된다.
다른 하나의 바람직한 예에서, 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 트랜스포존으로부터 선택된다.
본 발명의 제22 양상은 시약 조합을 제공하며, 상기 조합은:
(1) 제21 양상에 따른 재조합 벡터, 및
(2) 제8 양상에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 세포에서 CD7 유전자를 녹아웃시킬 수 있는 유전자 편집 도구로 이루어진 군에서 선택되는 하나를 포함한다.
본 발명의 제23 양상은 CD7 양성 혈액 악성 종양을 치료하는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 제조에서 제22 양상에 따른 시약 조합의 용도를 제공한다.
종래 기술에 비해, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다: 본 발명은 인간 유래 CD7-L로 항체를 치환하여 CD 특이적 CAR-T 세포의 항원 인식 도메인으로 사용하며, CD7을 표적화하는 CAR에서 인간 유래 CD7-L을 항원 인식 도메인으로 사용하면 숙주에 의해 생성되는 세포 및 체액 반응을 방지하여, 재주입 후 생체내에서 CAR-T 세포의 장기 생존과 더 나은 치료 효능을 구현할 수 있다는 장점이 있다.
CD7은 막관통 당단백질로, 통상적으로 대부분의 말초 혈액 T 세포와 NK 세포 및 그 전구체에서 발현된다. 병변이 있는 T 세포와 NK 세포 자체는 CD7을 고밀도로 발현하고, CD7가 결핍된 T 세포는 대체로 간섭을 받지 않은 발육, 항상성 및 보호 기능을 나타내며, CD7은 말초 혈액 T 세포의 기능에 대한 영향이 유의하지 않기 때문에, CAR-T는 유망한 CAR-T 세포 치료 표적이다. 정상 및 병변 T 세포 자체는 모두 CD7을 발현할 수 있으므로, 상기 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR) T 세포를 제조할 때, 동시에 두 가지 측면의 요소를 고려해야 한다: 1. 정상 T 세포에 대해 유전자 변형을 수행하여, T 세포가 CD7을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR-T)를 발현하여, CD7 양성의 병변 T 세포를 사멸시키고; 2. CAR-T 세포가 상호 인식으로 인해 발생시키는 자살 현상을 방지하기 위하여, CAR-T 세포 자체의 CD7 발현을 차단해야 한다. 따라서, 본 발명의 기술적 해결책은 정상 T 세포에 대해 유전자 변형을 수행하여 T 세포가 CD7 특이적 CAR을 발현하도록 할 뿐만 아니라, 동시에 정상 T 세포 내부의 CD7 발현 차단을 고려하였다. 본 발명의 출원인은 많은 실험을 거쳐, 실험 매개변수를 지속적으로 수정 및 검증하여, 최종적으로 본 발명의 기술적 해결책을 얻었으며, 본 발명의 기술적 해결책은 정상 T 세포에 대해 유전자 변형을 수행하여 T 세포가 CD7 특이적 CAR을 발현함과 동시에, 정상 T세포의 CD7 발현을 차단하여, 예상치 못한 기술적 효과를 구현할 수 있었다.
이하의 첨부도면을 참조하여 비제한적 실시예를 상세하게 설명하며, 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 이를 통해 더욱 명확해질 것이다.
도 1은 CD7을 발현하는 K562 및 HeLa 세포주의 구축을 도시하였다. CD7 cDNA를 휴대하는 렌티바이러스 벡터를 채택하여 K562 및 HeLa 세포주를 형질도입하고, 유동 선별을 통해 K562-CD7 및 HeLa-CD7을 획득하였다. 이는 K562 및 HeLa 세포주 상에서 유세포 분석으로 검출된 CD7의 발현을 도시한 것이다.
도 2는 CD7-CAR 및 CD7 차단 분자의 벡터 구조도이다. A와 B는 두 가지의 2세대 CD7 특이적 CAR이다. 여기에서, A: CD7BB-002의 항원 인식 영역은 CD7-L이고; B: TH69BB-002의 항원 인식 영역은 단일 클론 항체 TH69의 scFv이고; 두 가지 CAR 벡터는 동일한 CD8a 힌지 막관통 영역을 가지며, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ는 T 세포 자극 도메인이다. 단일 클론 항체 TH69의 scFv는 CD8α 신호 펩티드를 채택하였으며, 이의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역의 연결 펩티드는 (GGGGS)3이다. C와 D는 두 가지 CD7 차단 분자이다. 여기에서, C: CD7-L-ER2.1의 CD7 결합 도메인은 CD7-L이고; D: TH69-ER2.1의 CD7 결합 도메인은 TH69의 scFv이고, 여기에는 CD8α 신호 펩티드를 채택하였고, 이의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 가변 영역의 연결 펩티드는 (GGGGS)3이며, 두 가지 CD7 차단 분자는 동일한 ER 소포체 잔류 도메인을 갖는다.
도 3은 CD7-CAR-T 세포의 유세포 분석 검출 및 생체외 사멸 실험 결과도이다. A: CD7BB-002 및 TH69BB-002 두 가지의 CD7을 표적화하는 CAR의 T 세포 상에서의 발현을 유세포 분석으로 검출한 것이고; B: iCELLigenceTM 실시간 세포 분석기(Agilent Biosciences, Inc.)를 채택하여 체외 사멸 실험을 수행한 것이고; "T 세포 대조군"은 형질도입되지 않은 T 세포 대조군이고, "CD7BB-002"는 CD7BB-002를 발현하는 CAR-T 세포이고, "TH69BB-002"는 TH69BB-002를 발현하는 CAR-T 세포이다. 결과는 이 두 가지 CAR-T 세포가 모두 CD7을 표적화하여 종양 세포 사멸을 수행할 수 있음을 보여주었다. CD7-CAR-T 세포의 유세포 분석 검출 시약은 CD7-CAR-GREEN이며; 세포 체외 사멸 실험에 채택되는 표적 세포는 HeLa-CD7이다.
도 4는 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택하여 세포막 상에서 CD7의 발현을 차단한 결과의 개략도이다. CD7와 결합될 수 있는 리간드를 운반하는 CD7-L 또는 TH69 scFV cDNA를 채택하고, ER 잔류 도메인을 연결하는 렌티바이러스 벡터 CD7-L-ER2.1 및 TH69-ER2.1을 K562-CD7 세포주(A) 또는 T 세포(B)로 형질도입하며, CD7의 유세포 분석 검출을 수행하였다. 결과는 이 두 가지 CD7 발현 차단 분자가 모두 세포 표면에서 CD7의 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여주었다.
도 5는 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택하여 CD7 CAR을 표적화하는 렌티바이러스 벡터를 구축하는 구조도이다. A와 B는 두 가지의 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택하여 구축한 CD7 CAR 렌티바이러스 벡터이다. 여기에서, A: CD7BB-BL4-002, (1)은 CD7을 표적화하는 키메라 항원 수용체 개략도이며, 이의 항원 인식 영역은 CD7-L이고; (2)는 CD7 차단 분자 개략도이며, CD7 발현 차단 작용을 하는 CD7 결합 도메인은 단일 클론 항체 TH69의 scFv이고; B: CD7BB-BL6-002, (3)은 CD7을 표적화하는 키메라 항원 수용체 개략도이며, 이의 항원 인식 영역은 단일 클론 항체 TH69의 ScFv이고; (4)는 CD7 차단 분자 개략도이며, CD7 발현 차단 작용을 하는 CD7 결합 도메인은 CD7-L이고; 두 가지 CAR 벡터는 동일한 CD8α 힌지 막관통 영역, 4-1BB 공동자극 도메인, CD3ζ T 세포 자극 도메인 및 소포체 잔류 도메인을 갖는다. 단일 클론 항체 TH69의 scFv는 CD8α 신호 펩티드를 채택하였으며, 이의 경쇄와 중쇄 가변 영역의 연결 펩티드는 (GGGGS)3이다.
도 6에서 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택한 후 CD7-CAR-T 세포가 자살 현상을 극복하고 표적 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있었다. (a)에서, A: CD7을 표적화하는 네 가지의 상이한 CAR의 T 세포 상에서의 발현을 유세포 분석 검출한 것이고; B: 상기 네 가지 상이한 CAR-T 세포 상에서의 CD7 발현을 유세포 분석 검출한 것이고; 사용된 벡터는 각각 CD7BB - 002, TH69BB-002 및 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술로 구축한 CD7BB-BL4-002 및 CD7BB-BL6-002이고; 점선은 형질도입되지 않은 T 세포 대조군이고, 실선은 CD7을 표적화하는 CAR이 형질도입된 T 세포이다. (b)에서, C: 체외 배양한 상기 네 가지 상이한 CAR-T 세포의 증식 관찰이고; D: iCELLigenceTM 실시간 세포 분석기(Agilent Biosciences, Inc.)를 채택하여 진행한 생체외 사멸 실험이다. T 세포 대조군은 형질도입되지 않은 T 세포 대조군이고, CD7BB-002, TH69BB-002, CD7BB-BL4-002 및 CD7BB-BL6-002는 모두 CD7을 표적화하는 CAR-T 세포이며, 여기에서 CD7BB-BL4-002 및 CD7BB-BL6-002는 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택한 CD7-CAR-T 세포이다. CD7-CAR-T 세포의 유세포 분석 검출 시약은 CD7-CAR-GREEN이며; 세포 체외 사멸 실험에 채택되는 표적 세포는 HeLa-CD7이다.
도 7은 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택한 CD7-CAR-T 세포 생체내 종양 사멸 실험 결과도이다. 암컷 NSG 마우스를 사용하여, 0일에 종양 세포(루시퍼라제를 휴대하는 종양 세포주, CCRF-CEM-Luc, 5x10E5/mouse, iv)를 주사하였다. A: 1은 음성 대조군이고; 2 및 3은 각각 재주입 T 세포 대조군 및 CD7을 표적화하는 CD7BB-BL4-002 CAR-T 세포 치료군이다. 종양 세포 주사 후 3일에, T 세포 또는 CD7BB-BL4-002 CAR-T 세포(8x10E6/mouse)를 각각 정맥 주사한 후, 7일마다 마우스 생체 루시퍼라제 이미징 관찰을 수행하였다. B: T 세포가 재주입된 대조군(control group) 및 CD7BB-BL4-002 CAR-T 세포 치료군(treatment group) 마우스의 생존 곡선이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명에 대한 당업자의 이해를 돕기 위한 것이나, 이는 본 발명을 어떠한 형태로든 제한하지 않는다. 당업계에서 통상의 기술자는, 본 발명의 사상을 벗어나지 않고, 여러 변경 및 개선을 수행할 수 있음에 유의해야 한다. 이는 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명은 SECTM1(K12)의 세포외 도메인을 CD7의 항원 인식 도메인으로 사용하며, 이는 CD7 양성 혈액 악성 종양에 대한 CAR-T 세포 치료 및 면역 독소의 개발에 사용된다. 본 특허 출원에서는, SECTM1 또는 K12 대신 CD7-L을 사용하였다. CD7-L 유전자는 처음에 인간 17번 염색체 상의 CD7 유전자의 5' 말단으로 확인되었다. 인간 CD7-L 단백질은 주로 비장, 전립선, 고환, 소장 및 말초 혈액 백혈구에서 발현되며, CD7-L의 특징은 막관통 단백질을 암호화하며, 세포외 도메인이 면역글로불린 유사 도메인과 유사하다는 것이다. CD7-L은 2000년에 복제되었으며, 이는 CD7의 결합 단백질인 것으로 밝혀졌다.
CD7-L 단백질의 결합 작용을 결정하기 위해, 이전 연구에서는 CD7-L의 세포외 도메인(아미노산 1-145)과 인간 IgG1의 Fc 부분의 융합 단백질을 채택하였다. 유세포 분석 실험에 따르면, CD7-L-Fc 융합 단백질은 인간 유래 T 세포 및 NK 세포 상에서 높은 수준의 결합이 검출될 수 있다. CD7을 표적화하는 몇몇 항체는 상이한 정도로 CD7-L-Fc 융합 단백질과 세포의 결합을 차단하였다. 이와 반대로, CD7-L-Fc 융합 단백질은 이러한 CD7 단일 클론 항체와 CD7의 결합을 차단할 수 있으며, 이는 CD7-L-Fc가 세포 상의 CD7 수용체와 결합할 수 있음을 나타낸다. CD7-L-Fc 융합 단백질을 방사성 표지하고 결합 실험에 사용하여, 이와 Jurkat 세포(인간 T 세포 백혈병 세포주) 또는 KG-1 세포(인간 골수성 백혈병 세포주)의 친화력을 결정하는데, 위 두 가지 세포는 모두 CD7을 발현한다. 인간 CD7에 대한 CD7-L-Fc의 결합 친화력(Ka)은 약 1x108M-1 범위 내에 있다. CD7은 T 세포 악성 종양의 좋은 마커로 간주되기 때문에, 항-인간 CD7 단일 클론 항체에 리신이나 사포닌을 컨쥬게이트시켜 면역 독소를 생산하는 연구가 진행되어 왔다.
따라서, 본 특허 출원은 CD7을 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그 CD7의 차단 분자 구축에 CD7-L의 세포외 도메인을 사용하여, T 세포 악성 종양을 치료하기 위한 CD7-CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 발전에 사용된다. 동시에, 본 특허 출원은 CD7-L의 세포외 도메인을 독소와 결합하고, 이러한 접합체를 항-T 세포 악성 종양의 면역 독소로 사용하는데, 그 면역원성이 항체 기반의 접합체보다 낮기 때문에, 반감기가 더 길 수 있다.
실시예 1. CD7-L을 항원 인식 도메인으로 사용하는 CAR-T 세포는 CD7 종양 항원을 효과적으로 인식할 수 있다.
본 실시예는 먼저 CD7-L 또는 CD7 특이적 단일 클론 항체 TH69의 scFv를 항원 인식 영역으로 사용하는 두 가지 2세대 CAR 렌티바이러스 벡터인, CD7BB-002 및 TH69BB-002를 구축하였다(도 2A, B). CAR 렌티바이러스 벡터로 형질도입하여 CAR-T 세포를 획득하였으며, CD7과 리포터 유전자 eGFP 융합 단백질에 의해 생성된 CD7-CAR-T 세포의 유세포 분석 검출 시약(CD7-CAR-GREEN)을 사용하여 유세포 분석 검출을 수행하였다(도 3A). 결과에서 CD7-CAR-GREEN이 이 두 가지의 CD7을 표적화하는 CAR-T 세포를 검출하는 데 효과적으로 사용될 수 있음이 입증되었으며, 이는 CD7-L과 단일 클론 항체 TH69의 scFv가 모두 CAR-T 세포의 CD7 특이적 항원 인식 영역으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 2, CD7을 표적화하는 CAR-T 세포는 CD7 양성을 발현하는 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
본 실시예에서는 먼저 CD7 cDNA를 휴대하는 렌티바이러스 벡터로 K562 및 HeLa 세포주를 형질도입하고, 유동 선별을 통해 CD7을 발현하는 K562-CD7 및 HeLa-CD7 세포주를 획득하였다(도 1). CAR 렌티바이러스 벡터를 형질도입하여 CD7BB-002 및 TH69BB-002의 두 가지의 CD7을 표적화하는 CAR-T 세포를 획득하고, iCELLigenceTM실시간 세포 분석기(Agilent Biosciences, Inc.)를 사용하여 생체외 사멸 실험을 행하였다(도 3B). 결과에서 CD7-L을 항원 인식 영역으로 사용한 CD7BB-002와 단일 클론 항체 TH69 scFv를 항원 인식 영역으로 사용한 TH69BB-002가 모두 CD7 항원을 효과적으로 인식할 수 있으며, CD7 양성의 HeLa- CD7 표적 세포 사멸 측면에서 동일한 효과를 나타내는 것으로 입증되었다.
실시예 3, IntrablockTM CD7 발현 차단 기술은 세포막 상에서 CD7의 발현을 효과적으로 차단할 수 있다.
본 실시예에서는 먼저 CD7-L 또는 CD7 특이적 단일 클론 항체 TH69의 scFv를 CD7 결합 도메인으로 구축하고, ER 잔류 도메인의 렌티바이러스 벡터, CD7-L-ER2.1 및 TH69-ER2.1을 연결하였다(도 2C, D). 렌티바이러스 벡터로 K562-CD7 세포주 또는 1차 T 세포를 형질도입하고, 유세포 분석 검출을 통해 CD7 발현 차단 기술을 평가하였다. 그 결과 TH69-ER2.1과 CD7-L-ER2.1은 모두 K562-CD7 세포주(도 4A) 또는 T 세포(도 4B) 상의 CD7 발현을 효과적으로 차단할 수 있었으며, 이는 TH69-ER2.1과 CD7-L-ER2.1이 모두 세포 내에서 CD7과 결합하여 소포체에 잔류할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 이 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술은 세포 상에서 CD7의 발현을 차단하고, CD7을 표적화하는 CAR-T 세포의 자살 현상을 방지하는 데 사용할 수 있다.
실시예 4, IntrablockTM CD7 발현 차단 기술은 CD7-CAR-T 세포의 자살 현상을 극복하고 CD7 양성의 표적 세포를 효과적으로 사멸시키는 데 사용될 수 있다;
본 실시예에서는 먼저 IntrablockTM CD7 발현 차단 기능을 구비하는 동시에, CD7을 표적화하는 렌티바이러스 벡터, CD7BB-BL4-002 및 CD7BB-BL6-002를 구축하였다(도 5A, B). CAR-T 세포 제조에 사용되는 T 세포 상에서 자체적으로 CD7을 발현하기 때문에, CD7을 표적화하는 CAR-T 세포 제조 시 자살 현상이 발생하여, CAR-T 세포의 제조가 어려워질 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, CD7을 표적화하는 두 가지 CAR-T 세포인, CD7BB-002 및 TH69BB-002는 모두 CD7-CAR-GREEN에 의해 효과적으로 인식될 수 있으며(도 6A), CD7 양성의 HeLa-CD7 표적 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다(도 6D). 그러나, 이 두 가지의 CD7을 표적화하는 CAR-T 세포는 생체외 배양 과정에서 모두 심각한 자살 현상을 일으켜, 생체외에서 CAR-T 세포의 확장 및 제조에 어려움을 초래한다(도 6C). 실시예 3에 설명된 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택하여, CD7을 표적화하는 CD7BB-BL4-002 및 CD7BB-BL6-002 렌티바이러스 벡터를 구축하고, CAR-T 세포를 제조하는 데 사용하였다. 이 두 가지의 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술로 제조된 CAR-T 세포인, CD7BB-BL4-002 및 CD7BB-BL6-002는 모두 CD7-CAR-GREEN에 의해 효과적으로 인식되고(도 6A), HeLa-CD7 표적 세포의 사멸 능력을 유지할 수 있으며(도 6D), 동시에 CD7의 발현을 차단하고(도 6B), CAR-T 세포 제조에서 자살 현상을 극복하여(도 6C), 표적화된 CD7 특이적 CAR-T 세포의 생체외 확장과 제조를 가능하게 할 수 있다.
실시예 5. 동물 모델 상에서 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 이용한 CD7-CAR-T 세포의 생체내 종양 사멸 기능을 검증하였다.
본 실시예는 IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택한 CD7BB-BL4-002 CAR-T 세포를 사용하여 생체내 종양 사멸 실험을 수행하였다(도 7). 6 내지 8주령의 암컷 NSG 마우스를 사용하여, 0일에 루시퍼라제를 휴대한 종양 세포주, CCRF-CEM-Luc, 5x10E5/mouse, iv를 꼬리 정맥에 주사하였다. 종양 세포 주사 후 3일에, T 세포(T 세포 재주입 대조군) 또는 CD7BB-BL4-002 CAR-T 세포(8x10E6/mouse)(CAR-T 세포 치료군)를 각각 정맥 주사하였다. 0일 후 7일마다 마우스 생체 루시퍼라제 이미징 관찰을 수행하였다. 그 결과, IntrablockTM CD7 발현 차단 기술을 채택한 CD7BB-BL4-002 CAR-T 세포가 이 마우스 종양 모델에서 효과적으로 종양을 사멸시킬 수 있으며, CAR-T 세포 치료군 마우스의 생존 기간을 연장하였다는 것으로 나타났다(도 7에서 A 및 B에 도시된 바와 같음).
종래 기술에 비해, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다: 본 발명은 인간 유래 CD7-L로 항체를 치환하여 CD7 특이적 CAR-T 세포의 항원 인식 도메인으로 사용하며, CD7을 표적화하는 CAR에서 인간 유래 CD7-L을 항원 인식 도메인으로 사용하면 숙주에 의해 생성되는 세포 및 체액 반응을 방지하여, 재주입 후 생체내에서 CAR-T 세포의 장기 생존과 더 나은 치료 효능을 구현할 수 있다는 장점이 있다. CD7은 막관통 당단백질로, 통상적으로 대부분의 말초 혈액 T 세포와 NK 세포 및 그 전구체에서 발현된다. 병변이 있는 T 세포와 NK 세포 자체는 CD7을 고밀도로 발현하고; CD7가 결핍된 T 세포는 대체로 간섭을 받지 않은 발육, 항상성 및 보호 기능을 나타내며; CD7의 말초 혈액 T 세포의 기능에 대한 영향이 유의하지 않기 때문에, CD7은 유망한 CAR-T 세포 치료 표적이다. 정상 및 병변 T 세포 자체는 모두 CD7을 발현할 수 있으므로, 상기 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR) T 세포를 제조할 때, 동시에 두 가지 측면의 요소를 고려해야 한다: 1. 정상 T 세포에 대해 유전자 변형을 수행하여, T 세포가 CD7을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR-T)를 발현하여, CD7 양성의 병변 T 세포를 사멸시키고; 2. CAR-T 세포가 상호 인식으로 인해 발생시키는 자살 현상을 방지하기 위해서는, CAR-T 세포 자체의 CD7 발현을 차단해야 한다. 따라서, 본 발명의 기술적 해결책은 정상 T 세포에 대해 유전자 변형을 수행하여 T 세포가 CD7 특이적 CAR을 발현하도록 할 뿐만 아니라, 동시에 정상 T 세포 내부의 CD7 발현 차단을 고려하였다. 본 발명의 출원인은 많은 실험을 거쳐, 실험 매개변수를 지속적으로 수정 및 검증하여, 최종적으로 본 발명의 기술적 해결책을 얻었으며, 본 발명의 기술적 해결책은 정상 T 세포에 대해 유전자 변형을 수행하여 T 세포가 CD7 특이적 CAR을 발현함과 동시에, 정상 T세포의 CD7 발현을 차단하여, 예상치 못한 기술적 효과를 구현할 수 있었다.
상기에서는 본 발명의 구체적인 실시예를 설명하였다. 본 발명은 상기 특정 실시방식에 한정되지 않으며, 당업자는 청구범위의 범위 내에서 다양한 변경 또는 수정을 수행할 수 있고, 본 발명의 실질적인 내용에 영향을 미치지 않음을 이해해야 한다. Intrablock은 상표 로고이며, 본 발명의 기술적 해결책을 제한하거나 축소하지 않는다. 충돌되지 않는 한, 본 출원의 실시예와 실시예의 특징은 서로 임의로 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI YAKE BIOTECHNOLOGY LTD. <120> CD7-TARGETED ENGINEERED IMMUNE CELL, CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR, CD7 BLOCKING MOLECULE AND USE THEREOF <130> DD12447P <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge and transmembrane domain <400> 1 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB <400> 2 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge, transmembrane domain and intracellular co-stimulatory domain <400> 3 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 65 70 75 80 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 85 90 95 Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 100 105 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> intracellular primary stimulatory domain <400> 4 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 5 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD7-L extracellular domain <400> 5 Met Gln Thr Cys Pro Leu Ala Phe Pro Gly His Val Ser Gln Ala Leu 1 5 10 15 Gly Thr Leu Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Ser Ala Gln Asn Glu Gly 20 25 30 Trp Asp Ser Pro Ile Cys Thr Glu Gly Val Val Ser Val Ser Trp Gly 35 40 45 Glu Asn Thr Val Met Ser Cys Asn Ile Ser Asn Ala Phe Ser His Val 50 55 60 Asn Ile Lys Leu Arg Ala His Gly Gln Glu Ser Ala Ile Phe Asn Glu 65 70 75 80 Val Ala Pro Gly Tyr Phe Ser Arg Asp Gly Trp Gln Leu Gln Val Gln 85 90 95 Gly Gly Val Ala Gln Leu Val Ile Lys Gly Ala Arg Asp Ser His Ala 100 105 110 Gly Leu Tyr Met Trp His Leu Val Gly His Gln Arg Asn Asn Arg Gln 115 120 125 Val Thr Leu Glu Val Ser Gly Ala Glu Pro Gln Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Gly 145 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> endoplasmic reticulum retention domain <400> 6 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> endoplasmic reticulum retention domain <400> 7 Ser Glu Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 8 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TH69 scFv <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser 165 170 175 Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Glu Val Arg 210 215 220 Gly Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 <210> 9 <211> 1116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD7BB-002 <400> 9 atgcagacct gccccctggc attccctggc cacgtttccc aggcccttgg gaccctcctg 60 tttttggctg cctccttgag tgctcagaat gaaggctggg acagccccat ctgcacagag 120 ggggtagtct ctgtgtcttg gggcgagaac accgtcatgt cctgcaacat ctccaacgcc 180 ttctcccatg tcaacatcaa gctgcgtgcc cacgggcagg agagcgccat cttcaatgag 240 gtggctccag gctacttctc ccgggacggc tggcagctcc aggttcaggg aggcgtggca 300 cagctggtga tcaaaggcgc ccgggactcc catgctgggc tgtacatgtg gcacctcgtg 360 ggacaccaga gaaataacag acaagtcacg ctggaggttt caggtgcaga accccagtcc 420 gcccccgaca ctggggcggc cgcaacaact accccagcac ctcgaccacc aacaccagca 480 cccactattg ctagtcagcc actgtcactg cgaccagaag catgccgacc tgcagctgga 540 ggcgctgtgc acacccgggg cctggacttt gcctgcgaca tctatatttg ggctcctctg 600 gcaggaacct gtggagtgct gctgctgagc ctggtcatca cactgtattg taagcgaggg 660 cggaagaaac tgctctacat tttcaaacag ccttttatga gaccagtgca gacaactcag 720 gaggaagacg gctgctcctg taggttccca gaggaagagg aagggggatg cgagctgaga 780 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 840 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 900 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 960 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1020 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1080 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 1116 <210> 10 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD7-L-ER2.1 <400> 10 atgcagacct gccccctggc attccctggc cacgtttccc aggcccttgg gaccctcctg 60 tttttggctg cctccttgag tgctcagaat gaaggctggg acagccccat ctgcacagag 120 ggggtagtct ctgtgtcttg gggcgagaac accgtcatgt cctgcaacat ctccaacgcc 180 ttctcccatg tcaacatcaa gctgcgtgcc cacgggcagg agagcgccat cttcaatgag 240 gtggctccag gctacttctc ccgggacggc tggcagctcc aggttcaggg aggcgtggca 300 cagctggtga tcaaaggcgc ccgggactcc catgctgggc tgtacatgtg gcacctcgtg 360 ggacaccaga gaaataacag acaagtcacg ctggaggttt caggtgcaga accccagtcc 420 gcccccgaca ctggggatat cagcgaaaag gacgagctgt aa 462 <210> 11 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TH69-ER2.1 <400> 11 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120 accatcagtt gcagtgcaag tcagggcatt agcaattatt taaactggta tcagcagaaa 180 ccagatggaa ctgttaaact cctgatctat tacacatcaa gtttacactc aggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gattattctc tcaccatcag caacctggaa 300 cctgaagata ttgccactta ttattgtcag cagtatagca agcttccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggaaat aaaacgtgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctgga 420 ggaggcgggt ctgaggtgca gctggtcgaa tctggaggag gactggtgaa gccaggagga 480 tctctgaaac tgagttgtgc cgcttcaggc ctgaccttct caagctacgc catgagctgg 540 gtgcgacaga cacctgagaa gcggctggaa tgggtcgcta gcatctcctc tggcgggttc 600 acatactatc cagactccgt gaaaggcaga tttactatct ctcgggataa cgcaagaaat 660 attctgtacc tgcagatgag ttcactgagg agcgaggaca ccgcaatgta ctattgtgcc 720 agggacgaag tgcgcggcta tctggatgtc tggggagctg gcactaccgt caccgtctcc 780 agcgatatca gcgaaaagga cgagctgtaa 810 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 12 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signal peptide <400> 13 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> connecting peptide <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> connecting peptide <400> 15 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T2A <400> 16 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> F2A <400> 17 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 18 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TH69BB-002 <400> 18 atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcaaga 60 cccgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120 accatcagtt gcagtgcaag tcagggcatt agcaattatt taaactggta tcagcagaaa 180 ccagatggaa ctgttaaact cctgatctat tacacatcaa gtttacactc aggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gattattctc tcaccatcag caacctggaa 300 cctgaagata ttgccactta ttattgtcag cagtatagca agcttccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggaaat aaaacgtgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctgga 420 ggaggcgggt ctgaggtgca gctggtcgaa tctggaggag gactggtgaa gccaggagga 480 tctctgaaac tgagttgtgc cgcttcaggc ctgaccttct caagctacgc catgagctgg 540 gtgcgacaga cacctgagaa gcggctggaa tgggtcgcta gcatctcctc tggcgggttc 600 acatactatc cagactccgt gaaaggcaga tttactatct ctcgggataa cgcaagaaat 660 attctgtacc tgcagatgag ttcactgagg agcgaggaca ccgcaatgta ctattgtgcc 720 agggacgaag tgcgcggcta tctggatgtc tggggagctg gcactaccgt caccgtctcc 780 agcgcggccg caacaactac cccagcacct cgaccaccaa caccagcacc cactattgct 840 agtcagccac tgtcactgcg accagaagca tgccgacctg cagctggagg cgctgtgcac 900 acccggggcc tggactttgc ctgcgacatc tatatttggg ctcctctggc aggaacctgt 960 ggagtgctgc tgctgagcct ggtcatcaca ctgtattgta agcgagggcg gaagaaactg 1020 ctctacattt tcaaacagcc ttttatgaga ccagtgcaga caactcagga ggaagacggc 1080 tgctcctgta ggttcccaga ggaagaggaa gggggatgcg agctgagagt gaagttcagc 1140 aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440 atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1464

Claims (52)

  1. 조작된 면역 세포로서,
    키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체가 힌지 막관통 도메인, 세포내 공동자극 도메인 및 세포내 1차 자극 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체의 힌지 막관통 도메인은, T 세포 수용체 유래의 α 사슬, β 사슬, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ 사슬, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD9, CD16, CD22, CD28, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD137, ICOS, CD154, FAS, FGFR2B, OX40 또는 VEGFR2의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  4. 제2항에 있어서,
    키메라 항원 수용체의 세포내 공동자극 도메인은 CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD27, CD28, CD30, CD40, 4-1BB(CD137), ICOS, OX40, LIGHT(CD258) 또는 NKG2C로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  5. 제2항에 있어서,
    키메라 항원 수용체의 세포내 1차 자극 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, FcRβ, FcRγ, CD5, CD66d, CD22, CD79a 또는 CD79b로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체에서 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인이 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 일부 또는 전체 서열이거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포 내에 CD7 차단 분자가 더 포함되고, CD7 차단 분자는 세포 표면에서 CD7 단백질의 수송과 발현을 차단할 수 있는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 CD7 차단 분자는 구체적으로 CD7 결합 도메인을 통해 세포내 앵커링 도메인을 연결하여 CD7 단백질이 세포 표면으로 수송되는 것을 차단하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포내 앵커링 도메인은 소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 또는 프로테아좀 위치화 도메인의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 CD7 결합 도메인이 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 일부 또는 전체 서열이거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 단백질이며, 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 CD7 결합 도메인이 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv인 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인이 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv이거나, 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.8로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포 내에 CD7 차단 분자가 더 포함되고, CD7 차단 분자는 세포 표면에서 CD7 단백질의 수송과 발현을 차단할 수 있는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 CD7 차단 분자는 CD7 결합 도메인을 통해 세포내 앵커링 도메인을 연결하여 CD7 단백질이 세포 표면으로 수송되는 것을 차단하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포내 앵커링 도메인은 소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 또는 프로테아좀 위치화 도메인의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 CD7 결합 도메인이 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 일부 또는 전체 서열이거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  17. 제6항 또는 제12항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포는 유전자 녹아웃 기술을 통해 CD7의 유전자 발현을 제거하는 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 녹아웃 기술에 사용되는 게놈 편집 도구가 TALENs 또는 CRISPR/cas9인 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  19. 제1항 내지 제16항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포가 T 세포, γδT 세포, NK 또는 NKT 세포, 및 유도 만능 줄기 세포에서 분화된 T 세포, γδT 세포, NK 또는 NKT 세포인 것을 특징으로 하는, 조작된 면역 세포.
  20. 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화한 항원 인식 도메인으로서,
    상기 항원 인식 도메인의 서열이 일부 또는 전체 서열의 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인을 포함하거나, 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며; 상기 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 것을 특징으로 하는, 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화한 항원 인식 도메인.
  21. 항-CD7 양성 혈액 악성 종양의 면역 독소의 제조에서 제20항에 따른 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인의 용도.
  22. 제20항에 따른 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 핵산 분자 암호화 서열은 CD7BB-002이고, 상기 CD7BB-002의 핵산 분자 서열은 SEQ ID NO.9로 표시되는 것을 것을 특징으로 하는, 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자.
  24. 재조합 벡터로서,
    제22항에 따른 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  25. 제24항에 있어서,
    백터가 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 트랜스포존으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  26. 조작된 면역 세포의 제조에서 제24항에 따른 재조합 벡터의 용도.
  27. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포 제조용 CD7 차단 분자로서,
    상기 CD7 차단 분자의 CD7 결합 도메인이 일부 또는 전체 서열의 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인, 또는 인간 유래 CD7-L 세포외 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, CD7 차단 분자.
  28. 제27항에 따른 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 CD7-L-ER2.1이고, 상기 CD7-L-ER2.1의 핵산 분자 서열은SEQ ID NO.10으로 표시되는 것을 것을 특징으로 하는, CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열.
  30. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포 제조용 CD7 차단 분자로서,
    상기 CD7 차단 분자의 CD7 결합 도메인이 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv이거나, 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는, CD7 차단 분자.
  31. 제30항에 따른 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열로서,
    상기 CD7 차단 분자의 핵산 분자의 암호화 서열은 TH69-ER2.1이고, 상기 TH69-ER2.1 핵산 분자 서열은 SEQ ID NO.11로 표시되는 것을 특징으로 하는, 핵산 서열.
  32. 제29항 또는 제31항에 따른 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 백터가 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 트랜스포존으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  34. 조작된 면역 세포의 제조에서 제32항에 따른 재조합 벡터의 용도.
  35. 핵산 분자로서,
    (1) 제20항에 따른 항원 인식 도메인 서열을 암호화하는 핵산 서열; 및
    (2) 제27항 또는 제30항에 따른 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
  36. 제35항에 따른 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 백터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 트랜스포존으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  38. 제36항에 있어서,
    상기 벡터의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자 및 CD7 차단 분자를 암호화하는 핵산 분자는 내부 리보솜 진입 부위 또는 리보솜 코돈 스키핑 부위에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  39. 제36항에 있어서,
    상기 벡터의 내부 리보솜 진입 부위는 뇌심근염 바이러스 또는 엔테로바이러스 유래인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  40. 제36항에 있어서,
    상기 벡터의 리보솜 코돈 스키핑 부위는 2A 자가절단 펩티드를 포함하고, 상기 2A 자가절단 펩티드는 구제역 바이러스 F2A 펩티드, 말 비염 A 바이러스 E2A 펩디드, 돼지 테스코바이러스 P2A 펩티드 또는 T2A 펩티드로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  41. 조작된 면역 세포의 제조에서 제36항에 따른 재조합 벡터의 용도.
  42. 시약 조합으로서,
    상기 조합은, (1) 제24항에 따른 재조합 벡터, 및 (2) 제32항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시약 조합.
  43. CD7 양성 혈액 악성 종양을 치료하는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 제조에서 제42항에 따른 시약 조합의 용도.
  44. 시약 조합으로서,
    상기 조합은, (1) 제24항에 따른 재조합 벡터, 및 (2) 세포에서 CD7 유전자를 녹아웃시킬 수 있는 유전자 편집 도구를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시약 조합.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 유전자 편집 도구가 TALENs 또는 CRISPR/cas9인 것을 특징으로 하는, 시약 조합.
  46. 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인 서열로서,
    상기 서열이 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv이거나, 항-CD7의 단일 클론 항체 TH69의 scFv와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지며, 상기 항-CD7 단일 클론 항체 TH69의 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.8로 표시되는 것을 특징으로 하는, 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인 서열.
  47. 제46항에 따른 키메라 항원 수용체의 CD7을 표적화하는 항원 인식 도메인 서열을 암호화하는 핵산 분자.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 핵산 분자 암호화 서열이 TH69BB-002이고, 상기 TH69BB-002의 핵산 분자 서열이 SEQ ID NO.18로 표시되는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
  49. 제47항에 따른 핵산 분자의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  50. 제49항에 있어서,
    백터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 트랜스포존으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  51. 시약 조합으로서,
    상기 조합은,
    (1) 제49항에 따른 재조합 벡터, 및
    (2) 제29항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 세포에서 CD7 유전자를 녹아웃시킬 수 있는 유전자 편집 도구로 이루어진 군에서 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시약 조합.
  52. CD7 양성 혈액 악성 종양을 치료하는 CAR-T 또는 CAR-NK 세포의 제조에서 제51항에 따른 시약 조합의 용도.
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