KR20230130538A - mRNA 전달 효율 증대를 위한 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은 이온화 지질(Ionizable lipid), 폴리에틸렌 글라이콜 지질(PEG lipid) 및 헬퍼 지질(Helper lipid)이 포함된 알코올과, DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water를 혼합하여 리포좀 형태의 지질 나노입자(Lipid Nanoparticles; LNPs)를 포함하는 지질 나노입자 용액을 형성하는 단계, 및 상기 지질 나노입자 용액을 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 압출하여 지질 나노입자의 크기를 재배열하는 단계를 포함할 수 있다.
Description
본 발명은 mRNA 전달 효율 증대를 위한 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. mRNA(messenger RNA)는 단백질을 합성하기 전 단계의 물질로서, 유전정보를 담고 있다. mRNA는 다양한 치료제로의 접근이 가능하여 예방용 또는 치료용 백신으로 활용 가능하며, 결여된 단백질도 mRNA를 통해 합성이 가능하다. mRNA 치료제의 장점은 DNA와 비교해 핵까지 전달되지 않아도 되며, 유전체에 삽입되는 것이 아니므로 영구적인 유전적 질병을 유발하지 않아 안전성이 높다. 또한, 단백질 치료제가 접근할 수 없는 세포 내부의 결여된 단백질까지 mRNA로 합성이 가능하다. mRNA는 발현하는 단백질에 따라 다양한 크기를 지닐 수 있으며, 단일 가닥으로 존재한다. DNA로부터 만들어진 mRNA는 핵에서 세포질로 빠져나와 라이보좀과 만나 단백질을 생성한다. mRNA는 차세대 유전자 치료제로 각광받고 있지만 단일가닥이기 때문에 안정성이 매우 낮아 혈중에서 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 신장을 통하여 빠르게 체외로 배설될 뿐 아니라, 강한 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다.
핵산을 비롯한 음이온성 약물을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체와 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다. 바이러스성 전달체의 경우 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
비바이러스성 전달체중 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스성 전달체보다는 덜하지만, 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다. 따라서, 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서, 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포 내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다.
한편, 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 나노입자의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다(한국등록특허 제0180334호). 그러나, 이러한 양친성 블록 공중합체는 내부에 소수성을 띄는 고분자 나노입자를 형성함으로써 소수성을 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만, 음이온을 띄는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 나노입자 내부에 봉입할 수 없으므로, 이들 핵산을 포함하는 음이온성 약물의 전달에는 적당하지 않다. 이에, 핵산과 양이온성 지질의 정전기적 상호작용에 의한 복합체를 형성하여 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되도록 하는 음이온성 약물 전달 조성물 및 다양한 제조 방법을 개시한 바 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2017-0032858호는 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체; 및 폴리락트산염을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 이와 같이 형성된 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물 및 그의 제조방법을 개시하고 있다. 상기 공개특허는 음이온성 약물로서 디옥시리보핵산, 리보핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산, 예를 들어 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 등 매우 다양한 물질을 언급하고, 구체적으로는 siRNA를 사용하고 있으나, mRNA에 대한 언급은 전혀 없다. 전달하고자 하는 핵산의 종류에 따라 상이한 전달체 및 제조방법이 요구되는바, mRNA 전달체로서 안정성 및 제조 수율이 증가된 제형 및 그 제조방법이 요구되어 왔다.
본 발명의 다양한 과제 중 하나는, 산성 환경에서 양이온성의 특성을 나타내는 이온화지질과 음이온성의 mRNA를 결합시켜 제조된 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다양한 과제 중 하나는, 미세 유체소자를 이용한 침전법 생산성의 한계를 극복하기 위해 멤브레인 유화법(Membrane Emulsification)을 응용한 새로운 고상 지질 나노입자(Solid Lipid Nanoparticles; SLNs) 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은 이온화지질이 포함된 알코올과 mRNA가 포함된 산성조건의 물을 혼합하여 리포좀 형태의 지질입자를 형성하는 단계; 및 상기 리포좀 형태의 지질입자를 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 압출하여 지질입자를 재배열하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 지질입자의 재배열 단계에서, 상기 멤브레인을 통해 압출된 지질입자는 상기 멤브레인을 통해 압출되기 이전의 지질입자보다 작은 크기를 가질 수 있다.
상기 지질입자의 재배열 단계는, 상기 이온화지질의 pKa보다 낮은 산성 조건에서 수행될 수 있다.
상기 지질입자의 재배열 단계는, pH 6 미만의 조건에서 수행될 수 있다.
상기 지질입자의 재배열 단계는, 상기 이온화지질의 pKa와 동일한 수준의 pH 조건에서 수행될 수 있다.
상기 지질입자의 재배열 단계는, pH 6의 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은 DNA가 포함된 RNAse free water를 알코올에 투입하여 지질 용액을 형성하는 사전 혼합 단계; 상기 지질 용액에 증류수(DW)를 추가하여 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)을 형성하는 단계; 및 상기 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)을 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 압출하여 지질입자를 재배열하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은 이온화 지질(Ionizable lipid), 폴리에틸렌 글라이콜 지질(PEG lipid) 및 헬퍼 지질(Helper lipid)이 포함된 알코올과, DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water를 혼합하여 리포좀 형태의 지질 나노입자(Lipid Nanoparticles; LNPs)를 포함하는 지질 나노입자 용액을 형성하는 단계; 및 상기 지질 나노입자 용액을 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 압출하여 지질 나노입자의 크기를 재배열하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 미세 기공의 직경 내지 사이즈는 400 nm 이하일 수 있다.
상기 RNase free water의 pH는 4 이하일 수 있다.
상기 알코올은 에탄올(EtOH)일 수 있다.
상기 리포좀 형태의 지질 나노입자를 형성하는 단계는, 상기 이온화 지질, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 지질 및 상기 헬퍼 지질에 대해 알코올을 첨가하고 혼합하여 지질 용액을 형성한 후, 상기 지질 용액에 대해 상기 DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water를 주입함으로써 수행될 수 있다.
상기 상기 DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water의 주입은 2분 이내의 시간동안 수행될 수 있다.
상기 이온화 지질은 ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)로 구성될 수 있고, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 지질은 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide 로 구성될 수 있으며, 상기 헬퍼 지질은 DSPC 및 Cholesterol로 구성될 수 있다.
상기 폴리에틸렌 글라이콜 지질은 상기 지질 나노입자 용액 내에서 1.6 mol% 내지 5 mol%로 포함될 수 있다.
((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate), 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide, DSPC 및 Cholesterol은 2.86 : 0.34 : 0.6 : 1.32 [mg/ml]의 함량비로 이루어질 수 있다.
상기 지질 나노입자 용액으로부터 알코올을 제거하기 위한 알코올 투석 단계;를 더 포함할 수 있으며, 상기 알코올 투석 단계는 상기 지질 나노입자의 크기의 재배열 단계 이전에 수행될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은, 유량을 미세하게 조절하여 mRNA 전달체용 지질 나노입자를 형성하는 종래 기술에 비해, 멤브레인을 이용한 압출을 통해 상대적으로 덜 민감한 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 따라 입자의 크기를 줄이고 균일도를 향상시키는 동시에 지질 나노입자의 형태적 변화가 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법에 의하면, 별다른 장비의 개발 없이 기존에 사용되는 유화 장비를 활용할 수 있으므로, 상용화가 빠르게 이루어질 수 있다는 효과도 있다.
또한, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법에 의해 제조된 mRNA 전달체용 지질 나노입자는, 리포좀 형태에 비해 mRNA 분해 가능성이 낮아질 수 있으며, 이에 따라 동일 투입량 대비 mRNA의 효율이 증대될 수 있다.
도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법을 설명하기 위한 순서도 및 모식도이다.
도 3은 압출 과정의 수행 전후 입자 크기를 나타낸 지질 나노입자의 강도(intensity)/크기 분포(size distribution) 곡선 그래프이다.
도 4는 압출 과정의 수행 전후 입자 크기를 나타낸 지질 나노입자의 강도(intensity)/크기 분포(size distribution) 막대 그래프이다.
도 5는 압출 과정의 수행 전후의 지질 나노입자 크기를 도시한 TEM 분석 사진이다.
도 6 및 도 7은 서로 다른 크기의 미세 기공을 가지는 멤브레인을 이용한 압출 과정의 수행 전후 지질 나노입자 크기를 나타낸 곡선 그래프들이다.
도 8은 지질 용액에 대해 물을 주입하여 지질 나노입자 용액을 형성할 때 물의 주입 속도에 따른 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 그래프들이다.
도 9는 알코올 투석 단계를 수행함에 따른 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 그래프들이다.
도 3은 압출 과정의 수행 전후 입자 크기를 나타낸 지질 나노입자의 강도(intensity)/크기 분포(size distribution) 곡선 그래프이다.
도 4는 압출 과정의 수행 전후 입자 크기를 나타낸 지질 나노입자의 강도(intensity)/크기 분포(size distribution) 막대 그래프이다.
도 5는 압출 과정의 수행 전후의 지질 나노입자 크기를 도시한 TEM 분석 사진이다.
도 6 및 도 7은 서로 다른 크기의 미세 기공을 가지는 멤브레인을 이용한 압출 과정의 수행 전후 지질 나노입자 크기를 나타낸 곡선 그래프들이다.
도 8은 지질 용액에 대해 물을 주입하여 지질 나노입자 용액을 형성할 때 물의 주입 속도에 따른 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 그래프들이다.
도 9는 알코올 투석 단계를 수행함에 따른 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 그래프들이다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하기로 한다. 이하의 상세한 설명은 본 명세서에서 기술된 방법, 장치 및/또는 시스템에 대한 포괄적인 이해를 돕기 위해 제공된다. 그러나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예들을 설명함에 있어서, 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 상세한 설명에서 사용되는 용어는 단지 본 발명의 실시예들을 기술하기 위한 것이며, 결코 제한적이어서는 안 된다. 명확하게 달리 사용되지 않는 한, 단수 형태의 표현은 복수 형태의 의미를 포함한다. 본 설명에서, "포함" 또는 "구비"와 같은 표현은 어떤 특성들, 숫자들, 단계들, 동작들, 요소들, 이들의 일부 또는 조합을 가리키기 위한 것이며, 기술된 것 이외에 하나 또는 그 이상의 다른 특성, 숫자, 단계, 동작, 요소, 이들의 일부 또는 조합의 존재 또는 가능성을 배제하도록 해석되어서는 안 된다.
또한, 본 발명의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조 방법
도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법을 설명하기 위한 순서도 및 모식도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은 이온화 지질(Ionizable lipid), 폴리에틸렌 글라이콜 지질(PEG lipid) 및 헬퍼 지질(Helper lipid)을 알코올 용액과 혼합하여 지질 용액을 형성하는 단계(S1), 상기 지질 용액을 DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water 또는 탈이온수(Deionized water)를 혼합하여 리포좀 형태의 지질 나노입자 용액을 형성하는 단계(S2), 및 상기 지질 나노입자 용액에 포함된 알코올을 투석하는 단계(S3), 및 상기 리포좀 형태의 지질 나노입자를 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 압출하여 지질 나노입자를 재배열하는 단계(S4)를 포함할 수 있다.
이때, mRNA 전달체용 지질 입자를 만들고 활용하기 위해서는 이온화 지질을 어떻게 사용하는지가 중요한 요소로 작용하고 있는데, 본 발명에서 사용되어지는 이온화 지질은 산성환경에서 양이온성의 특성을 나타내게 되는 특성을 가질 수 있다.
위와 같은 양이온성 이온화 지질은 유도된 산성조건에서 음이온성의 mRNA와 빠르게 결합하여 1차적인 구조를 형성하게 되며 RNase에 의해 쉽게 분해 될 수 있는 mRNA를 주변 환경으로부터 보호하여 주는 기본적인 역할을 할 뿐만 아니라, 이후 세포 내에 도달하여서는 mRNA의 Endosome escape를 유발시키는 역할을 수행하게 된다.
예시적인 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 이온화 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 이온화 지질(Ionizable lipid)은 ALC-0315 즉, ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)일 수 있고, 폴리에틸렌 글라이콜 지질(PEG lipid)은 ALC-0159 즉, 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide일 수 있으며, 헬퍼 지질(Helper lipid)은 Distearoylphosphatidylcholine(DSPC) 및 콜레스테롤(Cholesterol)을 포함할 수 있다.
도 2를 참조하면, S1 단계를 통해 형성된 상기 지질 용액과 대량의 상기 DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water를 혼합함으로써 리포좀 형태의 지질 나노입자를 포함하는 상기 지질 나노입자 용액을 형성(S2)할 수 있으며, 이후 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 상기 지질 나노입자 용액을 압출하는 S4 단계를 통해 지질 나노입자의 크기가 재배열될 수 있다.
즉, S2 단계를 통해 형성된 지질 나노입자 용액은 무작위한 크기의 리포좀 형태의 지질 나노입자를 포함하고 있으며, S4 단계를 통해 지질 나노입자의 크기가 보다 작은 크기로 재배열되어 균일도가 향상될 수 있다.
한편, 도면을 통해 도시하지는 않았으나, 지질 나노입자 용액을 형성하기 위한 S2 단계는, 상기 지질 나노입자 용액에 대해 대량의 증류수(DW)를 추가 혼합하여 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)을 형성하는 과정을 더 포함할 수 있다.
예시적인 실시예들에 있어서, S2 단계를 통해 형성된 상기 지질 나노입자 용액으로부터 알코올을 투석하는 단계(S3)가 더 수행될 수 있다. 이때, S3 단계는 형성된 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs) 용액을 약 pH 7.4의 인산완충생리식염수(PBS) 즉, 버퍼액으로 투석함으로써 인체에 유해할 수 있는 잔존 알코올을 제거하고 산성 환경을 중성 환경으로 전환하기 위해 수행될 수 있다. 즉, S3 단계는 최종적으로 제조된 지질 나노입자의 잔존 알코올의 제거 및 pH 조절을 위해 수행되는 과정일 수 있으며, 안정적인 extrusion 단계를 도입하기 위한 전처리 과정일 수 있다.
이후, 지질 나노입자를 재배열하는 단계(S4)는, 추가적인 압출(Extrusion) 과정을 통해 S2 단계에서 형성된 리포좀 형태의 지질 나노입자를의 크기를 감소시키며 균일도를 향상시키는 과정을 통해 수행될 수 있다. 즉, 지질입자의 재배열 단계(S4)에서, 상기 멤브레인을 통해 압출된 지질 나노입자는 상기 멤브레인을 통해 압출되기 이전의 지질입자보다 작은 크기를 가질 수 있다.
지질입자를 재배열하는 단계(S4)에서 압력을 주어 압출을 진행 시 멤브레인의 좁은 기공을 통과함에 따라 리포좀 형태의 지질입자 크기가 줄어들게 되며, 이때, 작아진 입자 크기 때문에 입자가 가져야 하는 표면적이 증가되게 되고, 이렇게 증가된 표면적을 안정화시키기 위하여 지질들의 재배열이 일어나게 된다.
지질입자의 재배열 단계(S4)에서 입자의 안정성을 위해 입자 내부에 있던 지질들이 추가적으로 입자의 표면으로 이동하여 지질층을 형성하는 과정과 함께 외부환경이 노출되게 되는데, 이때 노출된 pH 환경에 의해 지질 입자의 내부 구조체의 형태가 변화될 수 있다.
예시적인 실시예들에 있어서, 지질입자의 재배열 단계(S4)는 상기 이온화지질의 pKa보다 낮은 산성 조건에서 수행될 수 있다.
구체적으로, 압출 과정 시 주변환경이 이온화지질의 pKa보다 낮은 산성 조건을 유지하게 된다면 이온화지질이 강한 양이온성의 전하 특성을 가지게 되고 그에 따라 mRNA 와의 결합이 더 단단하게 재배열될 수 있다. 이때, 기존 외부에 존재하던 지질의 총량으로만 입자를 안정화시켜야 하기 때문에, 압출 과정이 수행된 후 입자의 크기가 더 줄어들게 되며, mRNA를 입자 내부로 밀어내어 mRNA 가 내부에 밀집된 nanoparticle 과 같은 형태를 만들게 된다. 일 실시예에 있어서, 지질입자의 재배열 단계(S4)는 pH 6 미만의 조건에서 수행될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 지질입자의 재배열 단계(S4)는 상기 이온화지질의 pKa와 동일한 수준의 pH 조건에서 수행될 수도 있다.
구체적으로, 이온화지질의 pKa 수준인 pH 6 수준의 환경에서 입자의 크기 조절로 인한 재배열이 진행되는 경우, mRNA와 결합된 이온화지질의 전하 특성이 줄어들어 결합이 약해지게 되고 mRNA로부터 이온화지질의 이탈이 유발될 수 있다. 따라서, 이 경우의 지질입자는 산성조건에서와 비교하면 mRNA의 밀접현상이 덜 나타나게 되며, 표면안정화에 사용될 이온화지질의 추가적 공급이 가능하기 때문에 기존 리포좀 형태를 유지할 수 있다.
일 실시예에 있어서. 지질입자의 재배열 단계(S2)는 약 pH 6의 조건에서 수행될 수 있다.
실험예 1
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법에 사용된 이온화지질의 종류와 함량비는 다음과 같다.
ALC-0315 : ALC-0159 : DSPC : CHOL = 2.86: 0.34: 0.6: 1.32 [mg/ml]
이때, ALC-0315는 화학식이 ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)인 물질을 사용하였으며, ALC-1059는 화학식이 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide인 물질을 사용하였다.
상기 함량비와 중량을 가지는 지질들을 에탄올(EtOH)에 혼합시켜 1,000 μl의 지질 용액(Lipid Solution)을 형성하고(S1 단계), 200 μl의 DNA가 포함된 RNAse free water를 투입한 후 300 rpm의 교반 속도로 교반하여 지질 나노입자를 형성하였으며(S2 단계), 이후 2.8 mL의 탈이온수(DI water)를 더 첨가하여 고밀도의 지질 나노입자 용액을 형성한 후, 상기 지질 나노입자 용액으로부터 알코올을 제거하기 위한 알코올 투석 단계(S3 단계)를 수행하고, 상기 고밀도의 지질 나노입자 용액을 100 nm의 미세 기공을 가지는 멤브레인에 압출시킴으로써 지질입자를 재배열하는 단계를 수행하였다(S4 단계).
도 3은 압출 과정의 수행 전후 입자 크기를 나타낸 지질 나노입자의 강도(intensity)/크기 분포(size distribution) 곡선 그래프이고, 도 4는 압출 과정의 수행 전후 입자 크기를 나타낸 지질 나노입자의 강도(intensity)/크기 분포(size distribution) 막대 그래프이며, 도 5는 압출 과정의 수행 전후의 지질 나노입자 크기를 도시한 TEM 분석 사진이다. 이때, 도 4(a) 및 도 5(a)는 각각 100 nm의 미세 기공을 가지는 멤브레인을 이용하여 5회의 압출 과정을 수행하기 이전의 막대 그래프 및 TEM 분석 사진이며, 도 4(b) 및 도 5(b)는 각각 100 nm의 미세 기공을 가지는 멤브레인을 이용하여 5회의 압출 과정을 수행하기 이후의 막대 그래프 및 TEM 분석 사진이다.
도 3을 참조하면, 상기 리포좀 형태의 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)을 100 nm의 미세 기공을 가지는 멤브레인에 압출시킴으로써 지질입자를 재배열하는 단계(S4 단계)를 수행한 결과, 압출 이전의 지질 나노입자의 평균 크기는 약 447 nm로 확인되었으며, 압출 이후의 지질 나노입자입자 평균 크기는 약 200 nm로 확인되었다.
도 4(a) 도 4(b), 도 5(a) 및 도 5(b)를 함께 참조하면, 상기 리포좀 형태의 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)을 100 nm의 미세 기공을 가지는 멤브레인에 압출시킴으로써 지질입자를 재배열하는 단계(S2 단계)를 수행한 결과, 500 nm 이상의 입자 크기를 가지는 지질 나노입자가 존재하지 않는 것을 확인하였으며, 500 nm 미만의 입자 크기를 가지는 지질 나노입자의 intensity가 증가한 것을 확인하였다.
실험예 2 및 실험예 3
한편, S2 단계를 수행할 때, 상기 지질 용액에 대해 주입되는 DNA가 포함된 RNAse free water의 주입 속도는 동일하게 적용하되 교반 속도를 달리 적용함으로써 지질 용액을 형성하였다. 구체적으로, 상기 지질 용액에 DNA가 포함된 RNAse free water를 주입시킨 후 각각 500 rpm의 교반 속도(실험예 2)와 700 rom의 교반 속도(실험예 3)로 교반하여 지질 나노입자를 형성하는 단계를 수행하였으며. 상기 실험에 따른 지질 나노입자의 크기와 다분산성을 측정한 결과는 아래 그림 1과 같다.
[그림 1]
상기 그림 1에 의하면, S2 단계에서 300 rpm(실험예 1)보다 큰 교반 속도인 500 rpm(실험예 2)과 700 rpm(실험예 3)의 교반 속도로 교반하여 지질 나노입자를 형성하는 경우에도, 상기 리포좀 형태의 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)을 100 nm의 미세 기공을 가지는 멤브레인에 압출시키면 압출 이전에 비해 지질 나노입자의 평균 크기가 감소되고 균일도가 향상된 것을 확인하였다. 즉, S2 단계에서 교반 속도는 300 rpm 이상이면 충분하며, 너무 작은 교반 속도로 지질 용액을 형성하지만 않는다면 최종적으로 제조된 지질 나노입자의 크기 감소 효과와 균일도 향상 효과를 가질 수 있음을 확인하였다.
실험예 4 및 실험예 5
도 6 및 도 7은 서로 다른 크기의 기공을 가지는 멤브레인을 이용한 압출 과정의 수행 전후 지질 나노입자 크기를 나타낸 곡선 그래프이다. 이때, 도 6(a)는 S1 단계의 사전 혼합 과정을 수행한 결과를 나타낸 곡선 그래프이며, 도 6(b) 내지 도 6(d)는 각각 멤브레인의 미세 기공의 크기가 220 nm, 100 nm 및 50 nm인 경우의 압출 과정 결과를 나타낸 곡선 그래프들이다. 또한, 도 7은 도 6(a) 내지 도 6(d)의 결과를 종합하여 나타낸 곡선 그래프이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 100 nm의 기공 크기를 가지는 멤브레인을 이용하여 압출 과정을 수행한 실험예 1과 비교하기 위하여, 상기 리포좀 형태의 고밀도 지질 나노 입자들(LNPs)에 대해 각각 220 nm(실험예 4) 및 50 nm(실험예 5)의 미세 기공을 가지는 멤브레인에 압출시키는 과정을 수행하였으며, 구체적인 수치를 측정한 결과는 아래 그림 2와 같다.
[그림 2]
도 6(a) 내지 도 6(d)를 상기 그림 2와 함께 참조하면, 압출 과정을 수행하지 않은 사전 혼합 과정의 평균 입자 크기가 1,898 nm인 반면에, 미세 기공을 가지는 멤브레인을 이용하여 압출 과정을 수행한 실험예 1(100nm pore), 실험예 4(220nm pore) 및 실험예 5(50nm pore)에서 각각 재배열된 지질 나노입자의 평균 크기가 114 nm, 479 nm 및 226 nm로 감소되고 균일도가 향상된 것을 확인하였다.
실험예 6 내지 실험예 8
도 8은 지질 용액에 대해 물을 주입하여 지질 나노입자 용액을 형성할 때 물의 주입 속도에 따른 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 그래프들이다. 구체적으로, 도 8(a)는 지질 나노입자 용액을 형성하는 단계(S2)에서 DNA가 포함된 RNAse free water의 주입 속도를 달리했을 때 나타나는 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 직선 그래프이며, 도 8(b)는 지질 나노입자 용액을 형성하는 단계(S2)에서 DNA가 포함된 RNAse free water의 주입 속도를 달리했을 때 나타나는 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 곡선 그래프이다.
도 8(a) 및 도 8(b)를 참조하면, 100 nm의 기공 크기를 가지는 멤브레인을 이용하여 압출 과정을 수행한 실험예 1와 동일한 조성을 갖는 지질 나노입자 용액을 형성하되, pH 4의 DNA가 포함된 RNAse free water의 주입 시간을 5초(실험예 6), 30초(실험예 7) 및 2분(실험예 8)으로 각각 달리 적용하였다.
실험예 6, 실험예 7 및 실험예 8의 지질 나노입자 크기를 측정한 결과, 순차적으로 106.3 nm, 144.0 nm 및 200.3 nm의 크기를 갖는 것을 확인하였으며, 이에 따라 pH4의 DNA가 포함된 RNAse free water가 EtOH 기반의 지질 용액에 빠르게 주입될수록 보다 작은 사이즈의 LNPs가 형성되는 것을 알 수 있었다. 즉, EtOH major 환경에서 Water major 환경으로의 전환이 빠를수록 LNPs의 자기조립이 보다 빠르게 유도되어, 최종적으로 제조된 지질 나노입자의 크기가 작아진 것을 확인하였다.
실험예 9 및 실험예 10
도 9는 알코올 투석 단계를 수행함에 따른 지질 나노입자의 크기 변화를 나타낸 그래프들이다. 구체적으로, 도 9(a)는 지질 나노입자 용액에 대해 압출 단계(S4)를 수행한 후 알코올을 투석하는 단계(S3)를 수행했을 때의 지질 나노입자 크기 변화를 나타낸 곡선 그래프이며, 도 9(b)는 지질 나노입자 용액에 대해 압출 단계(S4)를 수행하기 이전에 알코올을 투석하는 단계(S3)를 수행했을 때의 지질 나노입자 크기 변화를 나타낸 곡선 그래프이다.
도 9(a) 및 도 9(b)를 참조하면, S2 단계를 통해 형성된 지질 나노입자 용액에 대해 압출 단계(S4)를 수행한 후 알코올을 투석하는 단계(S3)를 수행하는 경우, 최종적으로 제조된 지질 나노입자의 평균 크기가 163.3 nm인 것을 확인할 수 있는 반면에, S2 단계를 통해 형성된 지질 나노입자 용액에 대해 알코올을 투석하는 단계(S3)를 수행한 후 압출 단계(S4)를 수행하는 경우, 최종적으로 제조된 지질 나노입자의 평균 크기가 137.3 nm인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 지질 나노입자 용액에 대한 멤브레인 압출(Membrane Extrusion) 과정(S4)을 수행하기 이전에 알코올을 제거하기 위한 투석 과정(S3)을 수행하는 경우, 최종적으로 제조된 지질 나노입자의 크기가 보다 작게 형성된 것을 확인하였다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법은, 유량을 미세하게 조절하여 mRNA 전달체용 지질 나노입자를 형성하는 종래 기술에 비해, 멤브레인을 이용한 압출을 통해 상대적으로 덜 민감한 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 따라 입자의 크기를 줄이고 균일도를 향상시키는 동시에 지질 나노입자의 형태적 변화가 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법에 의하면, 별다른 장비의 개발 없이 기존에 사용되는 유화 장비를 활용할 수 있으므로, 상용화가 빠르게 이루어질 수 있다는 효과도 있다.
또한, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법에 의해 제조된 mRNA 전달체용 지질 나노입자는, 리포좀 형태에 비해 mRNA 분해 가능성이 낮아질 수 있으며, 이에 따라 동일 투입량 대비 mRNA의 효율이 증대될 수 있다.
다만, 본 발명의 개념은 반드시 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 방법은 전술한 기술분야 이외에도 다양한 기술분야에 적용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 다양한 실시예들을 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
Claims (12)
- 이온화 지질(Ionizable lipid), 폴리에틸렌 글라이콜 지질(PEG lipid) 및 헬퍼 지질(Helper lipid)이 포함된 알코올과, DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water를 혼합하여 리포좀 형태의 지질 나노입자(Lipid Nanoparticles; LNPs)를 포함하는 지질 나노입자 용액을 형성하는 단계; 및
상기 지질 나노입자 용액을 미세 기공을 가지는 멤브레인을 통해 압출하여 지질 나노입자의 크기를 재배열하는 단계;를 포함하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 미세 기공의 직경 내지 사이즈는 400 nm 이하인 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 RNase free water의 pH는 4 이하인 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 알코올은 에탄올(EtOH)인 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 지질입자의 재배열 단계는, pH 6 미만의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 지질입자의 재배열 단계는, 상기 이온화지질의 pKa와 동일한 수준의 pH 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 리포좀 형태의 지질 나노입자를 형성하는 단계는, 상기 이온화 지질, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 지질 및 상기 헬퍼 지질에 대해 알코올을 첨가하고 혼합하여 지질 용액을 형성한 후, 상기 지질 용액에 대해 상기 DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water를 주입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 DNA가 포함된 산성조건의 RNase free water의 주입은 2분 이내의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 이온화 지질은 ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)로 구성되고, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 지질은 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide로 구성되며, 상기 헬퍼 지질은 DSPC 및 Cholesterol로 구성된 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제9항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글라이콜 지질은 상기 지질 나노입자 용액 내에서 1.6 mol% 내지 5 mol%로 포함된 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제9항에 있어서,
((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate), 2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide, DSPC 및 Cholesterol은 2.86 : 0.34 : 0.6 : 1.32 [mg/ml]의 함량비로 이루어진 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 지질 나노입자 용액으로부터 알코올을 제거하기 위한 알코올 투석 단계;를 더 포함하며,
상기 알코올 투석 단계는 상기 지질 나노입자의 크기의 재배열 단계 이전에 수행되는 것을 특징으로 하는 mRNA 전달체용 지질 나노입자의 제조방법.
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