KR20230124894A - 중합체/핵산 복합체 용액의 제조 - Google Patents

중합체/핵산 복합체 용액의 제조 Download PDF

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옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
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Abstract

본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 제조 및 세포의 형질감염 방법에서의 이러한 용액의 용도에 관한 것이다.

Description

중합체/핵산 복합체 용액의 제조
본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 제조, 및 세포 형질감염 방법에서의 이러한 용액의 용도에 관한 것이다.
형질감염은 핵산을 진핵 세포에 의도적으로 도입하는 과정이다. 다양한 유형의 외인성 핵산을 진핵 세포에 도입하는 것이 바람직하거나 유리할 수 있는 많은 상황이 있다. 일반적으로 사용되는 외인성 핵산은 플라스미드 DNA, RNA, siRNA 및 올리고뉴클레오티드이다. 일단 세포 내로 전달되면 핵산은 관심 유전자의 과발현 또는 침묵(silencing)을 유도함으로써 유전자 발현을 조절한다.
유전자 과발현은 관심 유전자의 역할 이해(유전자 연구, 고처리량 스크리닝)로부터 생물학적 제제의 생산, 예컨대 항체(단백질 생산) 및 재조합 바이러스 입자의 생산, 특히 치료적 목적을 위한 것의 생산(예를 들어 유전자 및 세포 요법을 위한 바이러스 생산)에 이르기까지의 여러 응용 분야를 위한 필수불가결한 도구이다.
유전자 침묵은 관심 유전자의 발현을 방지하는 데 사용되는 방법이다. 유전자의 발현은 부분적으로 감소되거나(유전자 녹다운) 완전히 차단될 수 있다(유전자 녹아웃). 임의의 유전자가 잠재적으로 표적화될 수 있기 때문에 유전자 침묵은 단일유전자 병리, 암에 대한 유전자-기반 요법의 개발 및 면역요법 전략에 사용되는 일반적인 기술이다. 형질감염이 다수의 상이한 응용 분야에서 많은 유용성을 가지고 있음을 알 수 있다. 특히 흥미로운 것은 발현 벡터로 세포를 형질감염시키는 것인데, 이는 재조합 단백질 및 바이러스 벡터를 포함한 생물학적 제제의 생산에 널리 사용된다. 예를 들어, 바이러스 벡터를 제조하는 일반적인 방법은 벡터 DNA 성분을 이용한 일차 세포 또는 포유동물/곤충 세포주의 형질감염, 이어서 제한된 인큐베이션 기간 및 그 후 배양 배지 및/또는 세포로부터의 조 벡터의 수확을 포함한다(문헌[Merten, O-W. et al., 2014, Pharmaceutical Bioprocessing, 2:183-203]). 렌티바이러스 벡터 제조의 효율은 전형적으로, [1] 사용된 바이러스 혈청형/슈도타입(pseudotype), [2] 트랜스제닉 서열의 구성 및 크기, [3] 배지의 구성/가스 발생/pH, [4] 형질감염 시약/공정, [5] 화학적 유도 및 벡터 수확 타이밍, [6] 세포 취약성/생존성, [7] 생물반응기 전단력 및 [8] 불순물을 포함한 '상류 단계'에서의 여러 요인에 의해 영향을 받는다. 분명히 '하류' 정제/농축 단계 동안 고려해야 할 다른 요인이 있다(문헌[Merten, O-W. et al., 2014, Pharmaceutical Bioprocessing, 2:237-251]).
임상 시험에서의 바이러스 벡터 접근법의 성공이 규제 승인 및 상업화를 향해 구축되기 시작하면서 양호 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practice; GMP) 등급 벡터 물질의 대량 생산에서 나타나는 병목 현상에 관심이 집중되었다(문헌[Van der Loo JCM, Wright JF., 2016, Human Molecular Genetics, 25(R1):R42-R52]). 유사한 병목 현상이 GMP 등급 재조합 단백질의 생산에서 존재한다.
이 난제를 극복하는 방법은 바이러스 벡터 또는 재조합 단백질의 생산 중에 형질감염 효율을 극대화하는 새로운 방법을 찾는 것이다. 따라서, 당업계에서는 예를 들어, 바이러스 벡터 및 기타 생물학적 제제의 생산에 사용하기 위한 대안적이고 개선된 형질감염 방법을 제공할 필요가 있는데, 이는 GMP 등급 벡터 물질과 같은 GMP 등급 물질의 대량 생산과 관련된 알려진 쟁점을 해결하는 데 도움이 된다.
본 발명자들은 중합체/핵산 복합체가 형질감염 효율에 부정적인 영향을 미치기 전에 염의 존재 하에 짧은 시간 동안만 안정하다는 것을 보여주었다. 이것은 생물학적 제제의 대량 생산에서 양이온성 중합체의 사용을 제한하며, 그 이유는 대규모 GMP 생산에서 실제로 가능하기에는 최적 인큐베이션 기간이 너무 짧기 때문이다.
본 발명은 개선된 세포 형질감염 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 놀랍게도, 실질적 무염 수성 용액(예를 들어, 물)에서 핵산 및 양이온성 중합체를 혼합하고, 이어서 염을 첨가하여 중합체/핵산 복합체 성숙을 유도함으로써 제조되는 중합체/핵산 복합체가 최적의 중합체/핵산 복합체 성숙을 위한 시간을 연장하고 높은 형질감염 효율을 제공함을 알아냈다. 따라서, 최적의 염 농도를 사용하여 최적의 중합체/핵산 복합체 성숙을 위한 시간(즉, 인큐베이션 시간)을 연장할 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도, 중합체/핵산 복합체의 성장이 감소될 수 있고 복합체가 중합체/핵산 복합체 용액의 희석(이에 의해 염을 희석)에 의해 안정화되어 인큐베이션 시간을 더 연장할 수 있다는 것을 추가로 알아냈다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 중합체/핵산 복합체 성숙의 개시 및/또는 종료를 제어하는 능력을 제공하므로 유리하다. 이는 다시, 형질감염 공정의 쟁점인 시간 제약을 제거하기 때문에, 즉 제조 공정 유연성을 향상시키기 때문에 GMP 등급 물질의 대량 생산에 매우 유리하다.
본 발명자들은 놀랍게도, 감소된 세포 독성과 조합된 중합체/핵산 복합체 성숙의 개시 및/또는 종료의 제어 능력이, 형질감염 동안 세포수에 의해 중합체/핵산 복합체의 제조를 스케일링하는 능력을 제공하기 때문에 유리하다는 것을 알아냈다. 이는 다시, 형질감염 공정에 더 높은 세포 밀도(예를 들어 관류 배양을 사용하여 달성된 세포 밀도)의 사용을 가능하게 하기 때문에, 즉 제조 공정 용량 및 수율을 향상시키기 때문에 GMP 등급 물질의 대량 생산에 매우 유리하다.
본 발명은 이러한 중합체/핵산 복합체 용액의 제조 방법 및 예를 들어 렌티바이러스 벡터의 생산에서 세포의 형질감염을 위한 용액의 용도에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
상기 염은 발프로산 염, 이소부티르산 염 또는 이소발레르산 염 이외의 것인, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
상기 염은 중합체/핵산 복합체 용액을 세포와 접촉시키기 전에만 첨가되는, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
단계 b)에서의 최종 염 농도는 약 10 mM 내지 약 100 mM인, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
상기 염은 실질적 무염 수성 용액에서 0.95 이상의 해리도를 갖는, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 중합체/핵산 복합체 용액을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 및 염을 포함하는 용액을 제공하며, 여기서, 염 농도는 약 10 mM 내지 약 100 mM이다.
추가 양태에서, 본 발명은 핵산으로 세포를 형질감염시키기 위한 본 발명의 중합체/핵산 복합체 용액의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 벡터의 생산 방법에서의 본 발명의 중합체/핵산 복합체 용액의 용도를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 핵산은 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드 분자 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 핵산은 DNA, 바람직하게는 플라스미드 DNA이다.
일부 실시 형태에서, 양이온성 중합체는 중합체-기반 형질감염 시약이다.
일부 실시 형태에서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI), 덴드리머, DEAE-덱스트란, 폴리프로필렌이민(PPI), 키토산[폴리-(β-1/4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루코피라노스], 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤)(PCL) 및 이들의 유도체로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 양이온성 중합체는 PEI 또는 이의 유도체이며, 바람직하게는 선형 PEI, 분지형 PEI, 페길화(PEGylated) PEI, JetPEI, PEIPro®, PEI MAX 및 PTG1+로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 염은 나트륨 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 포스페이트 염 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 염은 인산염 완충 식염수(PBS)이다.
일부 실시 형태에서, 염은 PBS이고 PBS는 단계 b)에서 약 0.1X PBS 내지 약 1.0X PBS의 최종 농도까지 첨가되며, 바람직하게는 PBS는 약 0.1X PBS 내지 약 0.3X PBS의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 실시 형태에서, 염은 단계 b)에서 약 10 mM 내지 약 100 mM의 최종 농도까지 첨가되고, 바람직하게는 염은 단계 b)에서 약 20 mM 내지 약 100 mM의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 실시 형태에서, 단계 a)는 실질적 무염 수성 용액에서 복수의 핵산 분자와 복수의 양이온성 중합체 분자를 혼합하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 염 용액은 약 1분 내지 최대 약 2시간 동안 인큐베이션되며, 바람직하게는 염 용액은 약 20분 내지 약 90분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시 형태에서, 염 용액은 약 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 b)에서 생성된 염 용액 또는 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 염은 PBS이고 염 용액은 약 0.05X PBS 내지 약 0.15X PBS의 최종 농도까지 희석되며, 바람직하게는 염 용액은 약 0.1X PBS의 최종 농도까지 희석된다.
일부 실시 형태에서, 핵산은 레트로바이러스 벡터 구성요소를 코딩한다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna이다.
일부 실시 형태에서, 벡터 구성요소는 다음으로부터 선택된다:
a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
b) env 또는 이의 기능성 대체물;
c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
e) 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계;
f) 상기 전 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
g) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
h) 선택적으로, 게놈 내에 통합된 핵산(들)을 갖는 포유동물 세포를 선발하는 단계;
i) 선택적으로, 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계;
j) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
k) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 배양은 관류 배양에 의한 것이다.
일부 실시 형태에서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계는 약 10시간 내지 약 96시간 동안 수행된다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 포유동물 세포를 배양하는 단계 전에 포유동물 세포를 세포 배양 용기(예를 들어, 생물반응기)에 접종하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 세포를 접종하는 단계 후 및 세포를 형질감염시키는 단계 전에 신속한 배지 교환을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 적합하게는, 포유동물 세포를 배양하는 단계는 적어도 하나의 신속한 배지 교환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포는 현탁-적응 포유동물 세포이다.
일부 실시 형태에서, 형질감염, 도입 및/또는 배양 단계(들)는 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염은 일시적 형질감염이다.
일부 실시 형태에서, 형질감염, 도입 및/또는 배양 단계(들)는 적어도 50 L의 부피로 수행되며, 바람직하게는 형질감염, 도입 및 배양 단계는 적어도 50 L의 부피로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산은 형질감염 또는 전기천공법에 의해 포유동물 세포에 도입된다.
일부 실시 형태에서, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산은 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산에 의해서는 코딩되지 않는, 다음으로부터 선택되는 임의의 바이러스 벡터 구성요소를 코딩한다:
a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
b) env 또는 이의 기능성 대체물;
c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 생산 방법을 제공한다:
a) 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계;
b) 본 발명의 중합체/핵산 복합체 용액 또는 본 발명의 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 하나 이상의 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
d) 선택적으로, 게놈 내에 통합된 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 포유동물 세포를 선발하는 단계; 및
e) 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계.
일부 실시 형태에서 배양은 관류 배양에 의한 것이다
일부 실시 형태에서, 관류 배양에서 세포를 배양하는 단계는 약 10시간 내지 약 96시간 동안 수행된다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna이다.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포는 현탁-적응 세포이다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 단계 a), 단계 b), 단계 c) 및/또는 단계 e)는 적어도 50 L의 부피로 수행되며, 바람직하게는 단계 a), 단계 b), 단계 c) 및 단계 e)는 적어도 50 L의 부피로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 핵산은 단계 c)에서 형질감염 또는 전기천공법에 의해 세포에 도입된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염은 일시적 형질감염이다.
일부 실시 형태에서, 단계 b)에서 포유동물 세포에 선택적으로 도입되는 상기 적어도 하나의 핵산은 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산에 의해서는 코딩되지 않는, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 렌티바이러스 벡터 구성요소에 의해 코딩된다:
(i) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
(ii) env 또는 이의 기능성 대체물;
(iii) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
(iv) rev 또는 이의 기능성 대체물;
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 포유동물 세포의 형질감염 방법을 제공한다:
a) 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
b) 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계.
일부 실시 형태에서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계는 약 10시간 내지 약 96시간 동안 수행된다.
적합하게는, 포유동물 세포는 본원에 기재된 바와 같은 포유동물 세포이다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 단계 a) 및/또는 단계 b)는 적어도 50 L의 부피로 수행되며, 바람직하게는 단계 a) 및 단계 b)는 적어도 50 L의 부피로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염은 일시적 형질감염이다.
도 1: 상이한 시간 간격으로 인큐베이션된 PEIPro® 형질감염 믹스를 사용하여 개별 진탕 플라스크를 형질감염시킨 진탕 플라스크 시간 코스 연구로부터의 기능적 역가(TU/mL) 결과. DNA/PEIPro® 복합체의 인큐베이션 기간은 후속적인 형질감염 및 렌티바이러스 벡터 생산에 상당한 영향을 준다. 데이터는 가장 높은 기능적 역가를 생성하는 최적 인큐베이션 시간이 3분이며, 인큐베이션 시간이 15분 또는 30분으로 연장되면 이것이 급격히 감소함을 보여준다.
도 2: 도 2는 물에서 형질감염 믹스를 제조하고 다양한 PBS 농도로 스파이킹하여 복합체 형성의 동역학적 특성을 변경할 수 있음을 보여준다. DNA/PEIpro 복합체는 무염 수성 용액(H2O)에서 제조되었고 복합체 성장은 PBS 스파이크에 의해 시작되었다. (도 2a) 형질감염 복합체를 1X PBS로 스파이킹한 경우 3분 인큐베이션 후 최적의 역가가 달성되었다. (도 2b) 형질감염 복합체를 더 낮은 농도의 PBS로 스파이킹하는 경우 인큐베이션 시간이 연장될 수 있다. 0.2X PBS는 최적의 인큐베이션 시간을 약 25분으로 연장시킨다. N.B. 음성 음성 대조군으로서 복합체를 물에서 제조한 다음 PBS로 스파이킹하지 않고서 세포를 형질감염시키는 데 사용하였다. 벡터는 생성되지 않았으며, 이는 복합체 성장을 시작하기 위해 PBS가 필요함을 입증하는 것이다.
도 3: 최대 12시간, 잠재적으로 최대 1주일 동안 염 농도를 감소시키기 위해(및 복합체 성장을 중지시키기 위해) 복합체를 희석시킨 후 형질감염 효율이 안정적이다. 형질감염 믹스를 0.2 X PBS로 스파이킹하여 복합체 성장을 시작한 다음 복합체의 최적 크기에 도달하도록 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 형질감염 믹스를 무염 수성 용액(예를 들어 H2O)을 사용하여 희석하여 PBS의 최종 농도가 0.1X가 되도록 하였다. 형질감염 믹스를 4℃에서 최대 1주 동안 보관하였다. 그 후, 형질감염 믹스의 분취물을 사용하여 GFP 렌티바이러스를 생성하고 생성된 기능적 역가를 측정하였다. 그래프는 12시간의 인큐베이션 후 형질감염 믹스가 여전히 렌티바이러스 벡터 생성에 효율적이며 "신선한" 형질감염 믹스에 비견되는 기능적 역가를 생성했음을 보여준다.
도 4: DNA:PEIpro 복합체를 H2O에서 제조하는 경우 복합체 성장이 관찰되지 않음을 보여주는 DLS 분석. 이것은 도 2b에 제시된 데이터와 상관관계가 있으며, 이는 물에서 제조되고 PBS로 스파이킹되지 않은 복합체가 벡터 생산으로 이어지지 않음을 입증하였다. 이는 80~86 nm 크기 범위 내의 복합체가 너무 작아 성공적인 형질감염으로 이어질 수 없음을 시사한다.
도 5: DNA/PEIpro 복합체를 물에서 제조하였으며 PBS(0.2X)를 첨가하여 입자 성장을 시작하였다. 복합체는 25분 동안 인큐베이션되었고, 그 이유는 이것이 가장 높은 기능적 역가를 달성하기 위한 최적의 시간에 상응하기 때문이었다(도 2b). 그 후 복합체를 2배 희석하여 0.1X의 최종 PBS 농도를 달성하였다. 그 후 복합체 크기를 추가로 45분 동안의 시간에 걸쳐 측정하였다. DLS 측정은 형질감염 믹스를 2배 희석하면 복합체의 성장이 정지되고 크기가 600~800 nm로 남아 있음을 보여준다. 이 데이터를 도 2 및 도 3에 표시된 데이터와 연관시키면 가장 높은 역가를 달성하는 최적 복합체 크기는 600~800 nm임이 암시된다.
도 6: 형질감염 믹스를 상이한 농도들의 PBS로 스파이킹하는 경우, 복합체가 형질감염에 바람직한 크기까지 성장하는 속도는 첨가된 PBS의 농도에 따라 달라진다. PBS의 농도가 너무 낮으면(≤0.1x PBS) 복합체 성장이 시작되지 않는다.
도 7: 임의의 염을 사용하여 복합체 성장을 시작할 수 있다. 더 빠른 복합체 성장 속도 및 더 낮은 염 농도가 복합체 성장을 촉발하는 데 필요하다. 그래프(도 7a)와 표 2는 5가지의 상이한 농도의 NaCl(10 mM; 20 mM; 50 mM; 80 mM 및 100 mM)로 형질감염 믹스를 스파이킹한 영향을 보여준다. 80 mM 및 100 mM의 농도만이 유의한 복합체 성장을 시작하였다. 그래프(도 7b)와 표 3은 5가지의 농도의 MgCl2(10 mM; 20 mM; 50 mM; 80 mM; 100 mM)로 형질감염 믹스를 스파이킹한 영향을 보여준다.
도 8: 도 8은 5 L 생물반응기 규모에서 생산 후 치료용 벡터의 기능적 역가를 보여준다. 이 결과는 "aqPEIPro" 형질감염 방법이 확장가능하고 양이온성 지질 기반 형질감염 방법을 사용하여 달성된 것과 동등한 렌티바이러스 벡터 역가를 입증함을 보여준다. "aqPEIPro" 형질감염 방법의 경우 n = 2이고 양이온성 지질 기반 형질감염 방법의 경우 n = 4이다.
중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법을 제공한다:
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계.
외인성 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며 다양한 바이러스 및 비-바이러스 형질감염 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 형질감염은 음으로 하전된 막을 갖는 세포에 음으로 하전된 분자(예를 들어 DNA 및 RNA의 포스페이트 백본)를 도입하는 고유한 난제를 극복한다. 형질감염 시약은 화학적 시약, 양이온성 지질 및 물리적 방법의 세 가지 부류로 나눌 수 있다.
화학적 시약은 양이온성 중합체인 DEAE-덱스트란을 포함하며, 이는 배양된 포유동물 세포를 형질감염시키는 데 사용된 최초의 화학적 시약 중 하나였다(문헌[Vaheri and Pagano, 1965]; 문헌[McCutchan and Pagano, 1968]). 폴리브렌(문헌[Kawai and Nishizawa, 1984]), 폴리에틸렌이민(문헌[Boussif et al. 1995]) 및 덴드리머(문헌[Haensler and Szoka, 1993]; 문헌[Kukowska-Latallo et al. 1996])를 포함하는 다른 합성 양이온성 중합체가 DNA를 세포 내로 전달하는 데 사용되었다. 형질감염 방법으로서의 인산칼슘 공침전이 1970년대 초에 도입되었으며(문헌[Graham and van der Eb, 1973]), 이는 또 다른 화학적 형질감염 시약을 대표한다.
리포펙타민과 같은 양이온성 지질은 외래 유전 물질을 세포에 도입하는 가장 보편적인 방법 중 하나를 나타낸다. "리포좀"이라는 용어는 수성 매질에서 콜로이드 입자를 형성하는 지질 이중층을 지칭한다(문헌[Sessa and Weissmann, 1968]). 인공 리포좀은 1980년에 DNA를 세포로 전달하기 위해 처음 사용되었다(문헌[Fraley et al. 1980]). 리포좀 비히클의 다음 발전은 합성 양이온성 지질의 개발이었다(문헌[Felgner et al. 1987]). 지질 화합물의 양이온성 헤드 기는 핵산 상의 음으로 하전된 포스페이트와 회합한다. 리포좀-매개 전달은 상대적으로 높은 유전자 전달 효율, 인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란에 내성이 있는 특정 세포 유형을 형질감염시키는 능력, 시험관 내 및 생체 내에서의 적용, 올리고뉴클레오티드로부터 효모 인공 염색체까지의 모든 크기의 DNA의 성공적인 전달, RNA 전달 및 단백질 전달과 같은 장점을 제공한다(문헌[Kim and Eberwine, 2010]; 문헌[Stewart　et al.　2016]에서 검토). 비리포좀 시약은 리포좀-매개 형질감염 방법에 대한 대안을 제공한다. 지질 나노입자는 임상 연구 및 치료적 응용 분야에서 소분자 약물의 전달에 특히 적합한 이 형질감염 방법의 확장을 나타낸다(문헌[Cullis and Hope, 2017]에서 검토).
유전자 전달을 위한 물리적 방법은 1980년대 초에 개발되었으며 처음에는 배양된 세포 또는 핵에 직접 미세주입하는 것을 포함하였다(문헌[Cappechi, 1980]). 최근에 미세주입은 유전자 편집 응용 분야에서 다시 인기를 얻었으며 CRISPR-Cas9 DNA를 콘쥬게이트 전핵에 전달하여 녹아웃 돼지를 만드는 데 사용되었다(문헌[Chuang et al. 2017]). 전기천공법은 또 다른 물리적 방법을 나타내며 마우스 세포에서 유전자 전달 연구를 위해 처음 보고되었다(문헌[Wong and Neumann, 1982]). 이 메커니즘은 전기 펄스를 사용하여 세포막을 교란시키고 핵산이 세포 내로 통과할 수 있도록 하는 일시적 구멍을 형성하는 것을 기반으로 한다(문헌[Shigekawa and Dower, 1988]).
가장 널리 사용되는 비바이러스 형질감염 시약은 지질 기반 시약, 예컨대 리포펙타민 및 양이온성 중합체, 예컨대 PEI를 포함한다. 다수의 형질감염 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973), Virology, 52: 456]; 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York]; 문헌[Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, 및 문헌[Chu et al. (1981), Gene, 13:197] 참조). 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 핵산을 적합한 숙주 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염" 및 "형질도입"은 외인성 핵산(예를 들어 DNA 플라스미드)을 숙주 세포로 도입하는 것을 지칭한다. 따라서, 용어 "형질감염" 및 "형질도입"은 외인성 핵산(예를 들어 DNA 플라스미드)을 숙주 세포에 도입하는 과정을 지칭한다. 외인성 핵산이 세포막 내부에 도입되었을 때 세포는 "형질도입" 또는 "형질감염"된 것이다. 숙주 세포에 도입된 외인성 핵산은 숙주 세포의 게놈 내에 안정적으로 통합되거나 염색체외의 것일 수 있다. 통합된 핵산은 그 세포에서 유지되고 자손 세포에 의해 유전될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포에 도입된 외인성 핵산은 일시적으로 숙주 세포에 존재할 수 있다.
따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질도입/형질감염된 세포"는 외인성 핵산이 도입된 세포 또는 외인성 핵산이 존재하는 이의 자손을 지칭한다. 형질도입/형질감염된 세포는 배양(즉, 증식)되고 도입된 외인성 핵산은 전사되고/되거나 단백질이 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염 시약"은 핵산에 의한 세포 형질도입/형질감염을 촉진하는 바이러스 또는 비-바이러스 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중합체/핵산 복합체", "다가양이온/핵산 복합체" 및 "복합체"는 양이온성 중합체 및 핵산의 응집체를 지칭한다. 이러한 복합체는 또한 당업계에서 중합체-축합 핵산으로 공지되어 있으며, 광범위한 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
특정 조건 하에 이온의 존재 하에 양이온성 중합체와 핵산을 혼합하면 양이온성 중합체와 핵산 사이의 정전기적 상호작용으로 인해 중합체/핵산 복합체가 성숙된다. 따라서, 본 발명은 임의의 양이온성 중합체 및 임의의 핵산을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 임의의 생물학적 제제, 예를 들어 재조합 단백질 또는 렌티바이러스 벡터의 생산 동안 임의의 외인성 핵산으로 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
양이온성 중합체를 이용한 형질감염은 핵산의 응축 및 세포 내로의 외인성 핵산의 후속적인 방출을 수반한다. 따라서, 양이온성 중합체를 사용한 형질감염의 효율은 중합체의 핵산 결합 및 해리와 관련이 있다.
통상적으로, 형질감염 복합체(예를 들어 중합체/핵산 복합체)는 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, 염화나트륨(NaCl) 용액 또는 배지에서 희석하여 제조된 핵산 성분 및 형질감염 시약(리포좀/중합체) 둘 모두로 생성된다. 상기 성분들이 혼합되면 형질감염 복합체(형질감염 시약/핵산 복합체)의 "성숙" 기간이 있으며, 이는 일반적으로 형질감염을 위한 최적의 크기까지의 이러한 복합체의 물리적 성장과 관련된다. 이 최적 복합체 크기를 넘어서면 너무 작은 복합체는 세포에 충분한 핵산을 전달하지 못하고 너무 큰 복합체는 엔도사이토시스를 방해하기 때문에 세포 형질감염의 효율이 감소한다. 형질감염 복합체 성숙의 동적 과정은 최적 크기 생성에 걸리는 시간이 대규모 제조 환경에서 사용하기에 부적절할 수 있다는 점에서 문제가 될 수 있다. 종종 대량의 DNA와 형질주입 시약을 물리적으로 혼합하는 데 걸리는 시간은 복합체 성숙을 위한 최적의 시간을 초과할 수 있으며 복합체를 생산용 생물반응기로 전달하는 데 걸리는 시간도 형질주입 프로토콜에 고려해야 한다.
본 발명자들은 중합체/핵산 복합체가 형질감염 효율에 부정적인 영향을 미치기 전에 염의 존재 하에 짧은 시간 동안만 안정하다는 것을 보여주었다. 이것은 또한 다른 사람들에 의해 보고된 바 있다. 예를 들어, 제조업체는 양호한 형질감염 효율을 보장하기 위해 양이온성 중합체 PEIPro®를 DNA와 함께 인큐베이션하는 시간이 30분을 초과하지 않아야 한다고 권장한다(Polyplus transfection PEIPro® DNA transfection kit for virus production protocol CPT115 vL (July 2020): https://fnkprddata.blob.core.windows.net/domestic/data/datasheet/PPU/115-01K.pdf 참조). 이는 생물학적 제제, 예를 들어 재조합 단백질 또는 렌티바이러스 벡터의 대량 생산에서의 양이온성 중합체의 사용을 제한하며, 그 이유는 최적 인큐베이션 기간이 너무 짧아 대규모 GMP 생산에서, 예를 들어 200 L 규모에서 실질적으로 가능하지 않기 때문이다.
본 발명자들은 놀랍게도 다음을 알아냈다:
1. 실질적 무염 용액(예를 들어 물)에서 중합체/핵산 복합체를 혼합하고, 이어서 염으로 스파이킹하여 중합체/핵산 복합체 성숙을 유도하면 양호한 형질감염 효율을 제공하는 중합체/핵산 복합체 용액이 제공되고, 이에 의해 양호한 기능적 렌티바이러스 벡터 역가가 제공된다. 환언하면, 최적의 염 농도를 사용하여 최적의 중합체/핵산 복합체 성숙을 위한 시간(즉, 인큐베이션 시간)을 연장할 수 있다.
2. 중합체/핵산 복합체의 성장은 억제될 수 있고 복합체는 중합체/핵산 복합체 용액의 희석(이로 인해 염을 희석함)에 의해 안정화되어 인큐베이션 시간을 추가로 연장할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 중합체/핵산 복합체 성숙의 개시 및 종료 둘 모두를 제어하는 능력을 제공하므로 유리하다. 이는 다시, 형질감염 공정의 쟁점으로서의 시간 제약을 제거하므로, 즉, 제조 공정 유연성을 향상시키므로 GMP 규모에서 매우 유리하다.
실질적 무염 수성 용액(예를 들어 물)에서 중합체/핵산 복합체를 제조하는 것도 종래의 공정에 비해 장점을 제공한다. 예를 들어, 이것은, 복합체가 염의 존재 하에(예를 들어 매질에서) 제조되는 경우 가능한 것보다 더 높은 농도로 중합체/핵산 복합체가 제조될 수 있게 하는데, 이는 생물반응기에 첨가되는 중합체/핵산 복합체 용액의 부피를 상당히 감소시킨다. 이것은 또한, 형질감염 단계에서 생물반응기의 총 세포수를 증가시키는데, 이는 생산성을 증가시킬 것으로 예상된다. 따라서, 유리하게는, 본 발명의 방법은 형질감염 단계 전에 관류 세포 배양 단계와 함께 사용될 수 있다. 관류 세포 배양의 사용은 생물반응기에서 세포 밀도, 즉 세포의 수를 유리하게 증가시킬 수 있다.
추가 예로서, 본 발명자들은 실질적 무염 수성 용액(예를 들어 물)에서 혼합되는 경우 중합체 및 핵산이 복합체의 성장/응집을 나타내지 않으며 전형적으로 직경이 100 nM 미만인 복합체를 생성함을 보여주었다. 따라서, 상기 둘 모두의 성분 및/또는 혼합물은 복합체화(즉, 복합체의 성숙) 및 후속적인 첨가(생산 공정 동안) 전에 효율적으로 살균 여과될 수 있다. 이는 생산 공정에 첨가하기 전에(예를 들어 생물반응기에 첨가하기 전에) 복합체의 무균성을 보장할 수 있으므로 임의의 제조 공정에서 매우 가치 있는 안전성 단계를 추가할 것이다.
다른 추가의 예로서, 본 발명자들은 또한, 일단 실질적 무염 수성 용액(예를 들어, 물)에서 성숙되고/되거나 복합체 성숙 후에 희석되면, 중합체/핵산 복합체가 수 일 및 실제로 수 주 동안 안정하다는 것을 보여주었다. 이것은 형질감염 단계보다 훨씬 앞서 복합체를 제조하는 것을 허용하고, 이는 제조 중 이 단계와 관련된 작업량을 크게 줄이고 공정 유연성을 증가시킨다. 이것은 또한 제조에 사용하기 전에 복합체의 형질감염 효율을 소규모로 테스트할 수 있게 한다.
다른 추가의 예로서, 본 발명자들은 실질적 무염 수성 용액(예를 들어 물)에서 중합체/핵산 복합체의 성숙에 대한 제어가 형질감염될 세포의 수에 비례하여 복합체의 제조(즉, 형질감염될 세포의 수에 따라 중합체/핵산 복합체의 제조의 부피 및/또는 농도를 스케일링)를 가능하게 한다는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명의 중합체/핵산 복합체와 관련된 독성이 없기 때문에 특정한 통상적인 형질감염 시약(예를 들어 리포펙타민)에 비해 증가된 농도로 이를 사용할 수 있다. 이는 생산성을 증가시킬 것으로 예상되는 생물반응기에서 더 많은 총 세포수의 형질감염을 허용한다. 이는 또한 형질감염 단계를 위해 생물반응기에서 총 세포수를 증가시키기 위해 관류 배양을 사용하여 형질감염을 위한 세포를 준비하는 것을 허용한다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 물질의 대규모 GMP 생산에 사용하기에 적절할 뿐만 아니라 이러한 생산 공정에서도 장점을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "대규모"는 표준 생물반응기 크기, 예를 들어 50 L, 200 L, 500 L, 1000 L 및 10,000 L를 포함한다.
형질감염 성능 및 예를 들어 유전자 발현을 향상시키기 위한 형질감염 증강제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 형질감염 증강제는 부티르산, 발프로산, 이소부티르산 및 이소발레르산, 또는 이들의 염을 포함한다. 부티르산, 발프로산, 이소부티르산 및 이소발레르산의 염은 나트륨 염 또는 칼륨 염(예를 들어 부티르산나트륨)과 같은 임의의 염일 수 있다. 형질감염 증강제는 전형적으로, 형질감염 단계 후 세포 배양 동안 첨가된다. 그러나, 이러한 제제는 형질감염 단계 전 또는 형질감염 단계 동안, 즉 형질감염 믹스를 세포와 접촉시키기 전 또는 상기 접촉 동안 첨가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염 증강제"는 핵산으로 세포 형질도입/형질감염을 증가시키는 화합물을 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 상기 염은 형질감염 증강제가 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 염은 부티르산 염, 발프로산 염, 이소부티르산 염 또는 이소발레르산 염이 아니다. 바람직하게는, 상기 염은 발프로산 염, 이소부티르산 염 또는 이소발레르산 염이 아니다. 바람직하게는, 상기 염은 부티르산나트륨이 아니다.
일부 실시 형태에서, 염은 형질감염 단계 동안 또는 그 이후에, 즉 형질감염 믹스(예를 들어, 중합체/핵산 복합체 용액)를 세포와 접촉시키는 동안 또는 상기 접촉 이후에 첨가되지 않는다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 염은 중합체/핵산 복합체 용액을 세포와 접촉시키기 전에만 첨가된다. 따라서, 염을 실질적 무염 용액에서 제조된 양이온성 중합체 및 핵산의 혼합물에 첨가하여 복합체 성숙 및 성장을 시작하여, 후속적으로 형질감염에 사용될 수 있는 중합체/핵산 복합체 용액을 제공할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 염의 최종 농도는 약 10 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 염의 최종 농도는 약 50 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 실시 형태에서, 염은 PBS이고 PBS는 약 0.1X PBS 내지 약 3X PBS의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 실시 형태에서, 염의 최종 농도는 약 20 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시 형태에서, 염은 PBS이고 PBS는 약 0.15X PBS 내지 약 0.3X PBS의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 실시 형태에서, 염은 실질적 무염 용액에서 적어도 0.90(적합하게는, 적어도 0.95, 적어도 0.96, 적어도 0.97, 적어도 0.98, 적어도 0.99 또는 1)의 해리도를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "해리도"는 실질적 무염 용액에서 이온으로 해리된 염 분자의 분율을 지칭한다. 해리도는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 계산될 수 있다(예를 들어 문헌[ Basic Physical Chemistry: A Complete Introduction on Bachelor of Science Level (1st Ed. 2014) p. 109, Bookboon, ISBN 978-87-403-0669-9]).
해리 상수는 물질 MxNy가 용액(종종 수성)에서 더 작은 구성요소 M 및 N으로 가역적으로 해리(분리)되는 경향을 지정한다:
.
해리 상수는 Kd로 표시되며 다음에 의해 계산된다:
여기서, α는 화학종의 활성을 나타내고, [M], [N] 및 [MxNy]는 엔티티 M, N 및 MxNy의 몰 농도이다(https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Physical_and_Theoretical_Chemistry_Textbook_Maps/Supplemental_Modules_(Physical_and_Theoretical_Chemistry)/Equilibria/Chemical_Equilibria/Dissociation_Constant). 물이 용매이고 용액이 묽다고 가정하기 때문에 물은 순수하다고 가정하고 순수한 물의 활성도는 1로 정의된다. 용질의 활성도는 몰농도로 근사화된다. 해리 상수는 보다 일반적인 방식으로 평형을 설명하는 질량 작용의 법칙의 즉각적인 결과이다. 때때로 해리 상수는 염에 적용되는 경우 이온화 상수라고도 한다.
해리도는 해리된 원래 용질 분자의 분율이다. 이것은 일반적으로 그리스 기호 α로 표시된다. 보다 정확하게는 해리도는 몰당 이온 또는 라디칼로 해리된 용질의 양을 지칭한다. 매우 강한 산 및 염기의 경우 해리도는 1에 가깝다. 덜 강력한 산 및 염기는 더 작은 해리도를 갖는다. 이 파라미터와 반트 호프 계수(van't Hoff factor) i 사이에는 간단한 관계가 있다. 용질 물질이 n개의 이온으로 해리되면
이다.
예를 들어, 다음 해리의 경우:
n = 2이므로 i = 1 + α가 된다(문헌[Atkins P. and de Paula J.　Physical Chemistry　(8th ed. W.H.Freeman 2006) p.763,　ISBN　978-0-7167-8759-4]).
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
상기 염은 발프로산 염, 이소부티르산 염 또는 이소발레르산 염 이외의 것인, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
상기 염은 중합체/핵산 복합체 용액을 세포와 접촉시키기 전에만 첨가되는, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
단계 b)의 최종 염 농도는 약 10 mM 내지 약 100 mM인, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
상기 염은 실질적 무염 수성 용액에서 0.95 이상의 해리도를 갖는, 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법을 제공한다:
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법을 제공한다:
a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
c) 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계.
일부 실시 형태에서, 단계 a)는 실질적 무염 수성 용액에서 복수의 핵산 분자와 복수의 양이온성 중합체 분자를 혼합하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적 무염"은 수성 용액이 염을 함유하지 않거나 단지 미량의 염을 함유한다는 것을 의미한다. 수성 용액의 염 함량은 예를 들어 약 10 mM 미만(적합하게는 약 7.5 mM 미만, 약 5 mM 미만, 약 2.5 mM 미만, 약 1 mM 미만, 약 0.5 mM 미만 또는 약 0.1 mM 미만))일 수 있다. 실질적 무염 수성 용액은 약 1 mM 미만의 염, 적합하게는 약 0.5 mM 미만의 염을 포함할 수 있다. 실질적 무염 수성 용액의 염 농도는 중합체/핵산 복합체 성숙을 시작하기에는 너무 낮을 수 있으며, 즉 중합체/핵산 복합체 형성은 수성 용액에서 시작되지 않는다. 수성 용액의 염 농도는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 염도 측정기를 사용하여 결정될 수 있다. 염 농도는 일반적으로 광학 굴절계를 사용하는 직접적 방법을 사용하여 측정하거나 전도도 측정기에 의한 간접적 방법에 따라 결정된다. 다양한 상업적 옵션을 사용할 수 있다(https://www.pce-instruments.com/english/measuring-instruments/test-meters/salt-meter-kat_40093.htm).
적합하게는 물 중 고체의 용해도를 계산하기 위해 다음 절차를 사용할 수 있다:
1) 정확히 100 cm3의 물을 측정하여 비커에 첨가함
2) 더 이상 용해될 수 없을 때까지 소량의 용질을 첨가함
3) 증발 디쉬의 질량을 기록함
4) 혼합물을 여과시켜 미용해 고체가 남게 하고 용액이 증발 디쉬에 있게 함
5) 가열 또는 증발에 의해 수분을 제거함
6) 용질이 들어 있는 증발 디쉬를 칭량하고 용해된 용질의 질량을 계산함(https://www.bbc.co.uk/bitesize/guides/z4s48min/revision/1).
일부 바람직한 실시 형태에서, 단계 a)는 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 것을 포함한다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 실질적 무염 수성 용액은 물이다. 따라서, 단계 a)는 물에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드를 포함하여 모든 형태의 핵산을 지칭한다. 따라서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA, 억제 DNA 또는 RNA(예를 들어 RNAi, 마이크로RNA(miRNA), 짧은 간섭 (si)RNA, 짧은 헤어핀 (sh)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 안티센스 RNA 또는 안티센스 DNA), 자연 발생, 합성 및 의도적으로 변형되거나 변경된 서열(예를 들어 변이형 핵산))을 포함한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 핵산은 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드 분자 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 바람직하게는 핵산은 DNA, 더욱 바람직하게는 플라스미드 DNA이다.
일부 실시 형태에서, 양이온성 중합체는 중합체-기반 형질감염 시약이다. 양이온성 중합체-기반 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민(PEI), 덴드리머, DEAE-덱스트란, 폴리프로필렌이민(PPI), 키토산[폴리-(β-1/4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루코피라노스], L-라이신(PLL), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤)(PCL) 및 이들의 유도체를 포함한다. 유도체는 양이온성 중합체의 화학적으로 변형된 변이체, 예를 들어 페길화 변이체 또는 히스티디닐화 변이체일 수 있다.
양이온성 중합체는 물, 중성 용액/완충액 또는 산성 용액과 같은 실질적 무염 수성 용액으로 제공될 수 있다. 양이온성 중합체는 양이온성 중합체를 수성 용매, 중성 용매/완충액 또는 산성 용매에 용해시켜 제조할 수 있다. 중성 양이온성 중합체 용액은 전형적으로 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0(적합하게는, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.2, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.2)의 pH를 갖는다. 산성 양이온성 중합체 용액은 전형적으로 약 pH 0 내지 약 pH 3.0(적합하게는 약 pH 0.5 내지 약 pH 2.0)의 pH를 갖는다. 중성 용매/완충액의 예에는 트리스(트리즈마 염기) 및 HEPES가 포함된다. 완충액 농도는 약 1 mM 내지 약 100 mM(적합하게는 약 2 mM 내지 약 50 mM 또는 약 5 mM 내지 약 20 mM)의 범위일 수 있다. 예시적인 산성 용매는 무기 산(예를 들어 염산) 또는 유기 산(예를 들어 글리신-염산 용액)을 포함한다. 양이온성 중합체의 형질감염 활성을 감소시키지 않으면서 적합한 범위 내에서 양이온성 중합체 용액의 pH를 확립하거나 유지하기 위해 임의의 용매 또는 완충액이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 양이온성 중합체 용액에는 실질적으로 염이 없을 수 있다.
PEI는 포유동물 세포에 외인성 DNA를 도입하기 위한 가장 높은 형질감염 효율 중 하나를 제공하는 양이온성 중합체이며, 따라서 당업계에서 가장 널리 사용되는 비-바이러스 형질감염 시약 중 하나이다. PEI는 선형 PEI 또는 분지형 PEI일 수 있다. PEI는 약 4 kDa 내지 약 160 kDa(적합하게는, 약 4 kDa 내지 약 160 kDa, 약 40 kDa 또는 약 25 kDa)의 범위의 분자량을 가질 수 있다. 선형 PEI, 분지형 PEI 및 이들의 유도체는 구매가능하다. 특히, 40 kDa 선형 PEI 및 25 kDa 선형 PEI가 구매가능하다. 구매가능한 형태의 PEI에는 선형 PEI, 분지형 PEI, 페길화 PEI, JetPEI, PEIPro®, PEI MAX 및 PTG1+가 포함된다.
따라서, 일부 바람직한 실시 형태에서, 양이온성 중합체는 PEI(분지형 또는 선형 PEI) 또는 이의 유도체이다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 양이온성 중합체는 선형 PEI, 분지형 PEI, 페길화 PEI, JetPEI, PEIPro®, PEI MAX 및 PTG1+로부터 선택된다.
양이온성 중합체 및 핵산은 용액에서 혼합될 수 있다. 혼합은 양이온성 중합체-기반 세포 형질도입과 양립가능한 임의의 용액에서 일어날 수 있다. 적합한 용액의 비제한적인 예가 본원에 기재되어 있다. 핵산 대 양이온성 중합체의 몰비 또는 중량비는 제한되지 않으며, 전형적인 비는 약 100:1 내지 약 1:100(적합하게는 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:1 내지 약 1:5, 약 1:2 내지 약 1:4)의 몰비 및 약 1:10 내지 약 5:1(적합하게는 약 1:1 내지 약 5:1)의 중량비를 포함한다. 핵산 및 양이온성 중합체의 양은 또한 양이온성 중합체 중 총 질소(N) 대 핵산 중 포스페이트(P)의 몰비로 표현될 수 있으며, 이것도 제한되지 않는다. 전형적인 N:P 비는 약 1:1 내지 약 50:1(적합하게는 약 1:1 내지 약 10:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6 :1 또는 약 5:1)을 포함한다.
염은 세포 배양에 사용하기에 적합할 수 있다. 당업자는 염이 낮은 독성을 가져야 함을 이해할 것이다. 세포 배양과 양립가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 염은 단순 염일 수도 있고 단순 염들의 혼합물일 수도 있다. 염은 나트륨(Na) 염, 칼륨(K) 염, 마그네슘(Mg) 염, 칼슘(Ca) 염, 포스페이트(PO4) 염 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 염은 NaCl, MgCl2, NaNO3; PBS 또는 이들의 조합일 수 있다. 당업자는 적합한 염이 강염기의 양이온(예를 들어, K, Na, Ca, Mg, Ba와 같은 주기율표의 1족 및 2족으로부터 선택됨) 및/또는 강산의 음이온(예를 들어 Cl-, NO3 - , SO4 2-)을 갖는 것을 포함함을 알 것이다.
일부 실시 형태에서, 염은 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물에(즉 단계 b)에서) 약 40 mM 내지 약 500 mM(적합하게는, 약 50 mM 내지 약 450 mM, 약 50 mM 내지 약 400 mM, 약 60 mM 내지 약 350 mM, 약 70 mM 내지 약 300 mM, 약 75 mM 내지 약 250 mM 또는 약 80 mM 내지 200 mM)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 염은 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물에(즉 단계 b)에서) 약 10 mM 내지 약 100 mM(적합하게는, 약 30 mM 내지 약 100 mM 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 염은 약 500 mM 미만(적합하게는, 약 450 mM 미만, 약 400 mM 미만, 약 350 mM 미만, 약 300 mM 미만, 약 250 mM 미만, 약 200 mM 미만, 약 150 mM 미만, 약 100 mM 미만, 약 80 mM 미만 또는 약 50 mM 미만)의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 실시 형태에서, 염은 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물에(즉 단계 b)에서) 약 0.01 mM 내지 약 49 mM(적합하게는, 약 0.1 mM 내지 약 45 mM, 약 5 mM 내지 약 45 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 20 mM 내지 약 35 mM)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 염은 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물에(즉 단계 b)에서) 약 27.5 mM의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 염은 약 49 mM 미만(적합하게는, 약 45 mM 미만, 약 40 mM 미만, 약 35 mM 미만, 약 32 mM 미만, 약 30 mM 미만, 약 25 mM 미만 또는 약 20 mM 미만))의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 염은 인산염 완충 식염수(PBS)이다. 일부 실시 형태에서, PBS는 단계 b)에서 약 0.2X PBS 내지 약 10X PBS(적합하게는, 약 0.2X PBS 내지 약 7.5X PBS 또는 약 0.2X PBS 내지 약 5X PBS)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, PBS는 단계 b)에서 약 10X PBS 미만(적합하게는 약 9X PBS 미만, 약 8X PBS 미만, 약 7X PBS 미만, 약 6X PBS 미만, 약 5X PBS 또는 약 4X PBS 미만)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, PBS는 단계 b)에서 약 0.2X PBS 내지 약 3X PBS(적합하게는, 약 0.2X PBS 내지 약 2.5X PBS, 약 0.2X PBS 내지 약 2X PBS, 약 0.2X PBS 내지 약 1X PBS 또는 약 0.2X PBS 내지 약 0.5X PBS)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 바람직한 실시 형태에서, PBS는 약 0.2X PBS 내지 약 1X PBS의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, PBS는 단계 b)에서 약 3X PBS 미만(적합하게는, 약 2.5X PBS 미만, 약 2X PBS 미만, 약 1X PBS 미만 또는 약 0.5X PBS 미만)의 최종 농도까지 첨가된다.
일부 바람직한 실시 형태에서, PBS는 단계 b)에서 약 0.15X PBS 내지 약 0.35X PBS(적합하게는, 약 0.20X PBS 내지 약 0.30X PBS)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, PBS는 약 0.45X PBS 미만(적합하게는, 약 0.40X PBS 미만, 약 0.35X PBS 미만, 약 0.30X PBS 미만 또는 약 0.25X PBS 미만)의 최종 농도까지 첨가된다. 일부 실시 형태에서, PBS는 단계 b)에서 약 0.2X PBS(적합하게는 약 0.25X PBS, 약 0.3X PBS 또는 약 0.35X PBS)의 최종 농도까지 첨가된다.
양이온성 중합체와 핵산의 혼합물은 이온의 존재 하에, 예를 들어 염 용액에서, 중합체/핵산 복합체 형성을 시작하고 복합체를 효율적인 형질감염을 위한 최적의 크기로 성장시키기 위해 원하는 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물은 염의 존재 하에 인큐베이션된다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 본 방법은 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 핵산 및 양이온성 중합체의 혼합물(즉, 단계 b)에서 생성된 염 용액)은 약 10초 내지 약 4시간 동안(적합하게는, 약 30초 내지 약 3시간 동안, 약 1분 내지 약 2시간 동안, 약 5분 내지 약 90분 동안, 약 10분 내지 약 75분 동안, 약 20분 내지 약 60분 동안 또는 약 30분 내지 약 45분 동안) 인큐베이션될 수 있다. 핵산 및 양이온성 중합체의 혼합물(즉, 단계 b)에서 생성된 염 용액)은 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분 또는 약 75분 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 단계 b)에서 생성된 염 용액은 약 20분 내지 약 60분 동안, 바람직하게는 약 60분 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션은 중합체/핵산 복합체의 형성 및/또는 성장에 적합한 임의의 온도, 예를 들어 실온에서 일어날 수 있다.
이온의 존재 하의, 예를 들어 염 용액 중의 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물을, 혼합물의 인큐베이션의 존재 또는 부재 하에 희석시켜 중합체/핵산 복합체를 예를 들어 보관을 위해 그리고 나중에 사용하기 위해 안정화할 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물은 희석된다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 양이온성 중합체와 핵산의 혼합물은 인큐베이션 단계 후에 희석된다. 따라서, 일부 바람직한 실시 형태에서, 중합체/핵산 복합체 용액은 인큐베이션 단계 후에 희석된다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 b)에서 생성된 염 용액 또는 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 본 방법은 단계 c)의 인큐베이션 후에 염 용액을 희석하는 단계를 포함한다. 희석제는 본원에 기재된 바와 같이 실질적 무염 용액 또는 무염 용액, 예를 들어 물일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 염 용액은 약 0.05X PBS 내지 약 0.15X PBS의 최종 농도까지 희석되고, 바람직하게는 상기 염 용액은 약 0.10X PBS의 최종 농도까지 희석된다.
일부 실시 형태에서, 상기 염 용액은 약 5 mM 내지 약 50 mM(적합하게는, 약 10 mM 내지 약 40 mM 또는 약 15 mM 내지 약 30 mM)의 최종 농도까지 희석된다. 일부 실시 형태에서, 상기 염 용액은 약 50 mM 미만, 약 40 mM 미만, 약 30 mM 미만 또는 약 20 mM 미만의 최종 농도까지 희석된다.
중합체/핵산 복합체 용액은, 예를 들어 형질감염을 위해 사용하기 전에 희석된 후, 예를 들어 4℃에서 보관될 수 있다.
복합체 형성을 시작하기에 적합한 염 농도 또는 복합체 형성을 안정화시키기 위한 희석에 적합한 염 농도는 사용되는 염의 이온 강도에 따라 달라진다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 공지된 이온 강도의 특정 염에 대해 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적절한 염 농도의 선택은 당업자의 능력 내에 있다.
일부 실시 형태에서, 핵산은 레트로바이러스 벡터 구성요소를 코딩한다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna이다. 렌티바이러스 벡터는 복제 결함 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 벡터 구성요소는 다음으로부터 선택된다:
a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
b) env 또는 이의 기능성 대체물;
c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
벡터 / 발현 카세트
벡터는 한 환경에서 다른 환경으로 엔터티를 전달하는 것을 허용하거나 용이하게 하는 도구이다. 본 발명에 따르면, 그리고 예로서, 재조합 핵산 기술에 사용되는 일부 벡터는 핵산의 절편(예를 들어 이종 cDNA 절편와 같은 이종 DNA 절편)과 같은 엔터티가 표적 세포 내로 전달되어 표적 세포에 의해 발현되게 한다. 벡터는 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 통합을 용이하게 하여 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 표적 세포 내에서의 그의 발현을 유지할 수 있다.
벡터는 발현 카세트(발현 구축물이라고도 함)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트는 전사될 수 있는 서열을 함유하는 핵산 영역을 포함한다. 따라서, mRNA, tRNA 및 rRNA를 코딩하는 서열은 이 정의 내에 포함된다.
벡터는 하나 이상의 선발가능한 마커 유전자(예를 들어 네오마이신 내성 유전자) 및/또는 추적가능한 마커 유전자(들)(예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 유전자)를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어 표적 세포의 감염 및/또는 형질도입에 사용될 수 있다. 벡터는 벡터가 당해 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 조건부로 복제되는 종양 용해성 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "카세트"("콘쥬게이트", "구축물" 및 "하이브리드"와 같은 용어와 동의어임)는 프로모터에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 발현 카세트는 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로, 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 조절자를 포함한다. 바람직하게는 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
발현 카세트, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지 벡터의 선택은 종종 그것이 도입되는 숙주 세포에 의존할 것이다. 발현 카세트는 DNA 플라스미드(슈퍼코일(supercoiled), 닉(nicked) 또는 선형), 미니서클 DNA(선형 또는 슈퍼코일), 제한 효소 절단 및 정제에 의해 플라스미드 백본을 제거하여 관심 영역만을 포함하는 플라스미드 DNA, 효소적 DNA 증폭 플랫폼, 예를 들어 도기본(doggybone) DNA(dbDNA™)를 사용하여 생성된 DNA(여기서, 사용된 최종 DNA는 폐쇄되고 라이게이션된 형태이거나 개방형 절단 말단을 갖도록 제조됨(예를 들어 제한 효소 절단))일 수 있다.
레트로바이러스 벡터 생산 시스템 및 세포
레트로바이러스 벡터 생산 시스템(예를 들어 렌티바이러스 벡터 생산 시스템)은 레트로바이러스 벡터(예를 들어 렌티바이러스 벡터) 생산에 필요한 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 세트를 포함한다. 따라서, 벡터 생산 시스템은 레트로바이러스 벡터 입자(예를 들어 렌티바이러스 벡터 입자)를 생성하는 데 필요한 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 세트를 포함한다.
"바이러스 벡터 생산 시스템" 또는 "벡터 생산 시스템" 또는 "생산 시스템"은 렌티바이러스 벡터 생산에 필요한 구성요소를 포함하는 시스템으로 이해되어야 한다.
일 실시 형태에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 Gag 및 Gag/Pol 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 Env 단백질 및 벡터 게놈 서열을 포함한다. 생산 시스템은 선택적으로, Rev 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능성 대체물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서 적어도 하나의 트랜스진 구성요소는 반전되거나 역방향일 수 있다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 트랜스진 구성요소는 벡터 게놈 RNA의 5'-3' 방향성에 대해 반전되거나 역방향일 수 있다. 트랜스진 카세트가 반전된, 즉 전사 단위가 벡터 게놈 카세트를 구동시키는 프로모터에 반대되는 렌티바이러스 벡터 게놈이 이용될 수 있다. 또한,트랜스진 카세트의 한 구성요소가 역방향이고 다른 구성요소가 정방향일 수 있는 경우가 있을 수 있다( 예를 들어 양방향 트랜스진 카세트 또는 다중 개별 카세트의 사용).
일 실시 형태에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 모듈식 핵산 구축물(모듈형 구축물)을 포함한다. 모듈형 구축물은 렌티바이러스 벡터 생산에 사용되는 2가지 이상의 핵산을 포함하는 DNA 발현 구축물이다. 모듈형 구축물은 렌티바이러스 벡터의 생산에 사용되는 2가지 이상의 핵산을 포함하는 DNA 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 박테리아 플라스미드일 수 있다. 핵산은 예를 들어 gag-pol, rev, env, 벡터 게놈을 코딩할 수 있다. 또한, 패키징 및 생산자 세포주의 생성을 위해 설계된 모듈형 구축물은 추가로, 전사 조절 단백질(예를 들어 TetR, CymR) 및/또는 번역 억제 단백질(예를 들어 TRAP) 및 선발가능한 마커(예를 들어 Zeocin™, 하이그로마이신, 블라스티시딘, 퓨로마이신, 네오마이신 내성 유전자)를 코딩할 필요가 있을 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 모듈형 구축물은 EP 3502260에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 모듈형 구축물은 하나의 구축물에 2개 이상의 레트로바이러스 구성요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하므로, 이러한 모듈형 구축물의 안전성 프로파일이 고려되었고 추가적인 안전성 특징부가 구축물로 직접적으로 엔지니어링되었다. 이러한 특징부는 레트로바이러스 벡터 구성요소의 다중 오픈 리딩 프레임에 대한 인슐레이터의 사용 및/또는 모듈형 구축물에서의 레트로바이러스 유전자의 특정 방향 및 배열을 포함한다. 이러한 특징부를 사용하면 복제-적격 바이러스 입자를 생성하기 위한 직접적 리드-스루(read-through)가 방지될 것으로 믿어진다.
바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 핵산 서열은 모듈형 구축물에서 역방향 및/또는 교대 전사 방향일 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 핵산 서열은 동일한 5'→3' 방향으로 제시되지 않아서, 바이러스 벡터 구성요소는 동일한 mRNA 분자로부터 생성될 수 없다. 역방향은 상이한 벡터 구성요소들에 대한 적어도 2개의 코딩 서열이 '헤드-투-헤드' 및 '테일-투-테일' 전사 방향으로 제시됨을 의미할 수 있다. 이것은 모듈형 구축물의 하나의 가닥 상에 하나의 벡터 구성요소, 예를 들어 env의 코딩 서열을 제공하고 반대 가닥 상에 다른 벡터 구성요소, 예를 들어 rev의 코딩 서열을 제공함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 2개 초과의 벡터 구성요소에 대한 코딩 서열들이 모듈형 구축물에 존재하는 경우, 상기 코딩 서열들 중 적어도 2개는 역전사 방향으로 존재한다. 따라서, 2개 초과의 벡터 구성요소에 대한 코딩 서열이 모듈형 구축물에 존재하는 경우, 각 구성요소는 인접한 다른 벡터 구성요소에 대한 모든 인접 코딩 서열(들)에 대해 반대 5'→3' 방향으로 존재하도록 배향될 수 있다(즉 각 코딩 서열에 대해 교대 5'→3'(또는 전사) 방향이 사용될 수 있다).
본 발명에 따라 사용하기 위한 모듈형 구축물은 하기 벡터 구성요소 중 2개 이상을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다: gag-pol, rev, env, 벡터 게놈. 모듈형 구축물은 벡터 구성요소의 임의의 조합을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 모듈형 구축물은 다음을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다:
i) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 및 rev, 또는 이의 기능성 대체물;
ii) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 및 gag-pol;
iii) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 및 env;
iv) gag-pol 및 rev, 또는 이의 기능성 대체물;
v) gag-pol 및 env;
vi) env 및 rev, 또는 이의 기능성 대체물;
vii) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈, rev, 또는 이의 기능성 대체물, 및 gag-pol;
viii) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈, rev, 또는 이의 기능성 대체물, 및 env;
ix) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈, gag-pol 및 env; 또는
x) gag-pol, rev, 또는 이의 기능성 대체물, 및 env
(여기서, 핵산 서열은 역방향 및/또는 교대 방향임).
일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 세포는 상기 조합 i) 내지 x) 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 핵산 서열은 동일한 유전자좌에 위치하고 역방향 및/또는 교대 방향이다. 동일한 유전자좌는 세포 내의 단일 염색체외 유전자좌, 예를 들어 단일 플라스미드 또는 세포 게놈의 단일 유전자좌(즉, 단일 삽입 부위)를 지칭할 수 있다. 세포는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 안정하거나 일시적인 세포일 수 있다.
DNA 발현 구축물은 DNA 플라스미드(슈퍼코일, 닉 또는 선형), 미니서클 DNA(선형 또는 슈퍼코일), 제한 효소 절단 및 정제에 의해 플라스미드 백본을 제거하여 관심 영역만을 포함하는 플라스미드 DNA, 효소적 DNA 증폭 플랫폼, 예를 들어 도기본 DNA(dbDNA™)를 사용하여 생성된 DNA(여기서, 사용된 최종 DNA는 폐쇄되고 라이게이션된 형태이거나 개방형 절단 말단을 갖도록 제조됨(예를 들어 제한 효소 절단))일 수 있다.
일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna 렌티바이러스로부터 유래된다.
"바이러스 벡터 생산 세포", "벡터 생산 세포" 또는 "생산 세포"는 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포로 이해되어야 한다. 렌티바이러스 벡터 생산 세포는 "생산자 세포" 또는 "패키징 세포"일 수 있다. 바이러스 벡터 시스템의 하나 이상의 DNA 구축물은 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 안정적으로 통합되거나 에피솜으로 유지될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터 시스템의 모든 DNA 구성요소로 바이러스 벡터 생산 세포를 일시적으로 형질감염시킬 수 있다. 또 다른 대안에서, 구성요소 중 일부를 안정적으로 발현하는 생산 세포는 벡터 생산에 필요한 나머지 구성요소로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키징 세포"는 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 요소를 함유하지만 벡터 게놈이 결여된 세포를 지칭한다. 선택적으로, 이러한 패키징 세포는 바이러스 구조 단백질(예컨대 gag, gag/pol 및 env) 및 전형적으로 rev를 발현할 수 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다.
생산자 세포/패키징 세포는 임의의 적합한 세포 유형의 것일 수 있다. 생산자 세포는 일반적으로 포유동물 세포이지만, 예를 들어 곤충 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생산자 세포" 또는 "벡터 생산/생산자 세포"는 렌티바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 모든 요소를 포함하는 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 안정한 생산자 세포주이거나 일시적으로 유래될 수 있거나 또는 안정한 패키징 세포일 수 있으며, 여기서, 레트로바이러스 게놈은 일시적으로 발현된다.
벡터 생산 세포는 조직 배양 세포주와 같이 시험관 내에서 배양된 세포일 수 있다. 적합한 세포주는 뮤린 섬유아세포 유래 세포주 또는 인간 세포주와 같은 포유동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 벡터 생산 세포는 인간 세포주로부터 유래된다.
세포 및 생산 방법
본원에 기재된 바와 같은 시험관 내 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 중합체/핵산 복합체 용액 또는 본원에 기재된 바와 같은 중합체 핵산 복합체 용액은 세포의 형질감염에 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
e) 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계;
f) 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
g) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
h) 선택적으로, 게놈 내에 통합된 핵산(들)을 갖는 포유동물 세포를 선발하는 단계;
i) 선택적으로, 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계;
j) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
k) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계.
적합하게는, 단계 e)는 단계 a), b), c) 및/또는 d) 전에, 예컨대 단계 a) 내지 d) 전에 수행된다.
적합하게는, 단계 e)는 단계 a), b), c) 및/또는 d)와 동시에, 예컨대 단계 a) 내지 d)와 동시에 수행된다.
적합하게는, 단계 e)는 단계 a), b), c) 및/또는 d) 후에, 예를 들어 단계 a) 내지 d) 후에 수행된다.
추가 양태에서, 본 발명은 핵산으로 세포를 형질감염시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 벡터의 생산 방법에서 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 생산 방법을 제공한다:
a) 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계;
b) 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 하나 이상의 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
d) 선택적으로, 게놈 내에 통합된 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 포유동물 세포를 선발하는 단계; 및
e) 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 추가로 배양하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포의 생성 방법을 제공한다:
a) 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계;
b) 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 하나 이상의 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계; 및
d) 선택적으로, 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 포유동물 세포를 선발하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 안정한 생산 세포의 생성 방법을 제공한다:
a) 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계;
b) 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 하나 이상의 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계; 및
d) 게놈 내에 통합된 벡터 구성요소를 코딩하는 상기 핵산을 포함하는 세포를 선발하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 일시적 생산 세포의 생성 방법을 제공한다: 선택적으로, 포유동물 세포를 배양하는 단계, 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계, 및 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 하나 이상의 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 세포를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 안정한 생산 세포를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 일시적 생산 세포를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 중합체/핵산 복합체의 핵산은 레트로바이러스 벡터 구성요소를 코딩한다. 일부 실시 형태에서, 벡터 구성요소는 다음으로부터 선택된다:
a) 바이러스 벡터의 게놈;
b) env 또는 이의 기능성 대체물;
c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna이다.
일부 실시 형태에서, 벡터 구성요소는 다음으로부터 선택된다:
a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
b) env 또는 이의 기능성 대체물;
c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 포유동물 세포를 배양하는 단계는 배치 배양, 유가 배양, 농축 유가 배양 또는 관류 배양으로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배치 배양"은 영양분을 함유하는 배지의 제한된 공급이 세포에 제공되며, 즉 세포가 동일한 배지에서 배양되는(신선한 배지 및/또는 보충제의 첨가 없이 그리고 불순물을 함유하는 영양분-고갈 배지의 제거 없이), 바이러스 벡터 생산을 포함하는 생명공학 공정을 위한 운영 기술을 지칭한다. 따라서 영양소가 고갈되거나 폐기물(들) 또는 부산물(들) 생산과 같은 다른 요인이 제한적이 될 경우 배양이 감소된다. 전형적으로, 바이러스 벡터 생성물은 이 공정의 종료시에 수확된다. 배치 배양은 생체 재료 또는 세포 생성물, 예컨대 바이러스 벡터의 생산의 상류 프로세싱 기술이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유가 배양"은 세포 성장 및 바이러스 벡터 생산에 필요한 하나 이상의 영양분(예를 들어, 그렇지 않으면 제한적이 될 영양분)이 배양 동안 배양 용기, 예를 들어 생물반응기 내의 세포에 공급되는, 바이러스 벡터 생산을 포함하는 생명공학 공정을 위한 운영 기술을 지칭한다. 바이러스 벡터 생성물은 바이러스 벡터가 수확될 때 상기 공정의 실행이 종료될 때까지 배양 용기, 예를 들어 생물반응기에 남아 있다. 상기 하나 이상의 영양분은 불순물을 함유하는 영양분-고갈 배지의 제거 없이 적어도 하나의 공급 스트림을 통해 연속적으로 또는 주기적으로 공급될 수 있으며, 즉 상기 하나 이상의 영양분이 배치 공정에 추가된다. 공정 실행의 종료시에 세포가 생존가능한 상태로 남아 있으면 상기 공정이 반복될 수 있다. 유가 배양은 생체 재료 또는 세포 생성물, 예컨대 바이러스 벡터의 생산의 상류 프로세싱 기술이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "농축 유가 배양"은 교번 접선 유동(ATF) 또는 접선 유동 여과(TFF)일 수 있는 관류 배양 시스템이 한외여과막과 함께 사용되는, 바이러스 벡터 생산을 포함하는 생명공학 공정을 위한 운영 기술을 지칭한다. 농축 유가 배양에서 세포는 배양 용기, 예를 들어 생물반응기 내부에 보유되는 한편, 불순물을 함유하는 영양분-고갈 배지는 제거되고 신선한 배지가 세포에 공급된다. 이 공정은 통상적인 유가 배양과 같이 공정 실행이 종료될 때까지 배양 용기, 예를 들어 생물반응기 내에 생성물을 보유하지만, 배양 용기 내에서 더 높은 세포 및 생성물 농도를 수득한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관류 배양"("연속 관류 배양" 또는 "관류"로도 알려짐)은 세포가 배양 용기, 예를 들어 생물반응기 내부에 보유되는 한편, 불순물을 함유하는 영양분-고갈된 배지는 계속 제거되고 신선한 배지가 세포에 계속 제공되는, 바이러스 벡터 생산을 포함하는 생명공학 공정을 위한 운영 기술을 지칭한다. 전형적으로 신선한 배지는 불순물을 함유하는 영양분-고갈 배지가 제거되는 것과 동일한 속도로 세포에 제공된다. 따라서 연속 관류는 소량의 생물반응기 작업 부피를 계속 제거하고 전형적으로 제거된 배지와 동등한 부피의 신선한 배지를 생물반응기에 도입하는 것을 포함한다. 관류 배양은 생체 재료 또는 세포 생성물, 예컨대 바이러스 벡터의 생산에서 상류 연속 프로세싱 기술이다. 바이러스 벡터 생성물은 바이러스 벡터가 수확될 때 공정 실행이 종료될 때까지 배양 용기, 예를 들어 생물반응기에 남아 있을 수 있다. 예를 들어, 이것은 아데노바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터와 같이 세포내에서 생산되는 바이러스 벡터의 경우일 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터 생성물은 배양 용기, 예를 들어 생물반응기 밖으로 관류되고, 이어서 바이러스 벡터 생성물이 관류액으로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 이것은 바이러스 벡터 생산이 시작된 후 관류가 수행되는 경우 렌티바이러스 벡터와 같은 분비형 바이러스 벡터의 경우일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 방법은 관류 배양에서(예를 들어 관류 배양 시스템에서) 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 연속 관류 배양은 산출 역가 및 순도를 제한하는 불순물의 축적이 배지 교환에 의해 감소되기 때문에 바이러스 벡터 생산에서 배치 배양 또는 유가 배양보다 유리하다.
본 발명의 생산 방법은 바람직하게는 치료제로서 인간에게 투여하기에 적합한 임상 등급 제형을 생산하기 위한 대규모 공정이다. 본원에 기재된 바이러스 벡터 조성물은 바람직하게는 치료제로서 인간에게 투여하기에 적합하다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법은 세포 배양 용기에 포유동물 세포를 접종하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적합하게는, 세포 배양 용기에 포유동물 세포를 접종하는 단계는 포유동물 세포를 배양하는 단계(예를 들어, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계) 이전에 수행된다. "접종"은 세포를 배양 배지, 예를 들어 배양 용기 내의 배양 배지에 도입하는 것을 의미한다.
적합하게는, 포유동물 세포를 배양하는 단계(예를 들어, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계)는 세포 배양 용기에 포유동물 세포를 접종하는 단계 직후에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 세포를 접종하는 단계 후 및 세포를 형질감염시키는 단계 전에 신속한 배지 교환을 수행하는 단계를 추가로 포함하며, 바람직하게는 배지는 접종 후 약 20시간 내지 약 28시간 사이에 교환된다. 적합하게는, 배지는 접종 후 약 21시간(적합하게는 22, 23, 24, 25, 26 또는 27시간) 내지 약 28시간 사이에 교환될 수 있다. 적합하게는, 배지는 형질감염 전 약 21시간 내지 약 27시간, 22시간 내지 약 26시간, 또는 23시간 내지 약 25시간 사이에 교환될 수 있다. 적합하게는, 배지는 형질감염 전 약 24시간에 교환될 수 있다. 적합하게는, 배지는 접종 후 약 21시간 미만(적합하게는 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간 또는 약 28시간 미만)에 교환될 수 있다. 적합하게는, 포유동물 세포를 배양하는 단계는 적어도 하나의 신속한 배지 교환을 포함한다. 신속한 배지 교환을 사용하는 세포 배양은 관류 배양과 동일한 이유로, 즉 산출 역가 및 순도를 제한하는 불순물의 축적이 배지 교환에 의해 감소되기 때문에 바이러스 벡터 생산에서 배치 배양 또는 유가 배양보다 유리하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신속한 배지 교환"은 세포가 배양 용기, 예를 들어 생물반응기(본원에 기재된 바와 같음) 내부에 보유되는 한편 세포 배양 용기 작업 부피의 규정된 양이 제거되고 짧은 별개의 시간 기간 내에 세포 배양 용기에 규정된 부피의 신선한 배지가 도입되는, 바이러스 벡터 생산을 포함하는 생명공학 공정을 위한 운영 기술을 지칭한다. 따라서, 세포 대사에 의해 영양분이 고갈된 배지, 형질감염 시약과 같이 바이러스 벡터 생산에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 불순물 및 기타 제제가 제거되고 신선한 배지가 세포에 제공된다(신속한 배지 교환 동안). 신속한 배지 교환은 순차적인 과정이다(즉, 사용된 배지가 먼저 세포 배양 용기(예를 들어 생물반응기)로부터 제거되고 그 후 신선한 배지가 세포 배양 용기(예를 들어 생물반응기)에 도입된다). 세포 배양 용기에 도입되는 신선한 배지의 규정된 부피는 제거되는 세포 배양 용기 작업 부피의 규정된 양보다 더 크거나 더 작거나 이와 동등하거나 동일할 수 있다. 제거되는 불순물을 함유하는 영양분-고갈 배지의 부피는 전형적으로, 도입되는 신선한 배지의 부피와 동등하다. 규정된 양의 세포 배양 용기 작업 부피가 전형적으로 세포 배양 용기로부터 제거되고, 이어서 규정된 부피의 신선한 배지가 세포 배양 용기에 도입된다(즉, 세포 배양 용기의 작업 부피는 신선한 배지의 첨가 전에 신속한 배지 교환 동안 일시적으로 감소된다). 이것은 세포 배양 용기 작업 부피의 제거와 신선한 배지의 도입이 전형적으로 동시에 발생하는 전통적인 관류 공정과는 다르다. 신속한 배지 교환은 바이러스 벡터와 같은 생체 재료 또는 세포 생성물의 생산에서 상류 연속 프로세싱 기술이다.
적합하게는, 배양 용기는 생물반응기, 웨이브 백, 롤러 보틀 또는 플라스크일 수 있다. 바람직하게는, 배양 용기는 생물반응기이다.
일 실시 형태에서, 현탁 배양물은 생물반응기와 같은 배양 용기에 있을 수 있다. 생물반응기는 예를 들어 약 0.1 리터 내지 약 1000 리터, 예컨대 약 0.1 리터 내지 약 500 리터의 부피(예를 들어 작업 부피)를 가질 수 있다.
예를 들어, 작업 부피와 같은 부피는 약 0.1 리터 내지 약 0.25 리터, 약 0.5 리터 내지 약 250 리터, 약 1 리터 내지 약 200 리터, 약 5 내지 약 180 리터, 약 10 내지 약 150 리터, 약 15 내지 약 100 리터, 약 20 내지 약 80 리터, 또는 약 30 내지 약 50 리터일 수 있다.
일 실시 형태에서, 작업 부피와 같은 부피는 약 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000 또는 2000 리터일 수 있다.
일 실시 형태에서, 작업 부피는 약 2 리터 내지 약 100 리터일 수 있다.
일 실시 형태에서, 작업 부피는 약 5 리터일 수 있다.
일 실시 형태에서, 작업 부피는 약 50 리터일 수 있다.
일 실시 형태에서, 작업 부피는 약 200 리터일 수 있다.
일 실시 형태에서, 작업 부피는 약 1000 리터일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포는 HEK293T 세포이다.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포는 현탁-적응 포유동물 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "현탁-적응 세포"는 전형적으로 현탁 성장에 적응된 부착 방식으로 성장하는 세포를 지칭한다. 현탁에 세포를 적응시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 현탁 성장에 대한 적응은 세포 계대 동안 순차적인 혈청 감소에 의해 수행될 수 있다. 이는 무혈청 배지, 즉 소 태아 혈청(FBS)과 같은 혈청의 부재 하에 현탁 상태로 성장하는 현탁-적응 세포를 생성한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 형질감염, 도입 및/또는 배양 단계(들)는 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행된다.
본 발명의 방법은 현탁 시스템에서 배양된 부착성 세포에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 부착성 세포는 현탁 시스템에서 미세담체 상에서 배양될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 형질감염은 일시적 형질감염이다.
본원에 기재된 중합체/핵산 복합체의 방법 및 용액은 물질의 대규모 생산에 사용하기에 적합하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 대용량 배양 용기의 비제한적 예는 스피너 플라스크(최대 약 36 L의 부피), 웨이브 백(최대 약 100 L의 부피) 및 생물반응기(최대 약 10,000 L의 부피)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 형질감염, 도입 및/또는 배양 단계(들)는 적어도 50 L(적합하게는 적어도 60 L, 적어도 75 L, 적어도 100 L, 적어도 200 L)의 부피로 수행되고, 바람직하게는 형질감염, 도입 및 배양 단계는 적어도 50 L(적합하게는 적어도 60 L, 적어도 75 L, 적어도 100 L, 적어도 200 L)의 부피로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산은 형질감염 또는 전기천공법에 의해 포유동물 세포에 도입된다.
일부 실시 형태에서, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산은 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산에 의해 코딩되는 것이 아닌 다음으로부터 선택되는 임의의 바이러스 벡터 구성요소를 코딩한다:
a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
b) env 또는 이의 기능성 대체물;
c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 (i), (j) 및/또는 (k)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 (i), (j) 및 (k)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 (i) 및 (k)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 단계 (j) 및 (k)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 단계 (i), (j) 및/또는 (k)는 수 회 반복될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 관류 배양은 산출 역가 및 순도를 제한하는 불순물의 축적이 배지 교환에 의해 감소되기 때문에 바이러스 벡터의 생산에서 배치 배양 또는 유가 배양보다 유리하다. 이는 더 높은 세포 밀도에 도달될 수 있게 한다. 따라서, 관류 단계의 길이는 형질감염을 위한 표적 세포 밀도에 따라 달라질 수 있다. 적합하게는, 세포는 장기간 동안 관류 세포 배양 시스템에서 계속 배양될 수 있다. 적합하게는, 세포는 접종부터 형질감염 단계까지 또는 형질감염 단계 직전까지 관류 세포 배양 시스템에서 계속 배양될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계 전에 관류 배양 시스템에서 약 0.5시간 내지 약 168시간(적합하게는, 약 0.5시간 내지 약 156시간, 약 0.5시간 내지 약 144시간, 약 0.5시간 내지 약 132시간, 약 0.5시간 내지 약 120시간, 약 0.5시간 내지 약 108시간, 약 0.5시간 내지 약 96시간, 약 0.5시간 내지 약 84시간, 약 0.5시간 내지 약 72시간, 약 0.5시간 내지 약 60시간, 약 0.5시간 내지 약 48시간, 약 0.5시간 내지 약 36시간, 약 0.5시간 내지 약 32시간, 약 0.5시간 내지 약 28시간, 약 0.5시간 내지 약 24시간, 약 0.5시간 내지 약 22시간, 약 0.5시간 내지 약 20시간, 약 0.5시간 내지 약 18시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 16시간 동안) 동안 배양된다. 바람직하게는, 세포는 관류 배양 시스템에서 약 0.5시간 내지 약 24시간, 약 0.5시간 내지 약 22시간, 약 0.5시간 내지 약 20시간, 또는 약 0.5시간 내지 약 18시간, 예컨대 약 0.5시간 내지 약 20시간 동안 배양된다.
일부 실시 형태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계 전에 관류 배양 시스템에서 약 1시간 내지 약 168시간(적합하게는, 약 1시간 내지 약 156시간, 약 1시간 내지 약 144시간, 약 1시간 내지 약 132시간, 약 1시간 내지 약 120시간, 약 1시간 내지 약 108시간, 약 1시간 내지 약 96시간, 약 1시간 내지 약 84시간, 약 1시간 내지 약 72시간, 약 1시간 내지 약 60시간, 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 36시간, 약 1시간 내지 약 32시간, 약 1시간 내지 약 28시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 22시간, 약 1시간 내지 약 20시간, 약 1시간 내지 약 18시간, 또는 약 1시간 내지 약 16시간) 동안 배양된다. 바람직하게는, 세포는 관류 배양 시스템에서 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 22시간, 약 1시간 내지 약 20시간, 또는 약 1시간 내지 약 18시간, 예컨대 약 1시간 내지 약 20시간 동안 배양된다.
일부 실시 형태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계 전에 관류 배양 시스템에서 약 12시간 내지 약 168시간(적합하게는, 약 12시간 내지 약 156시간, 약 12시간 내지 약 144시간, 약 12시간 내지 약 132시간, 약 12시간 내지 약 120시간, 약 12시간 내지 약 108시간, 약 12시간 내지 약 96시간, 약 12시간 내지 약 84시간, 약 12시간 내지 약 72시간, 약 12시간 내지 약 60시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 32시간, 약 12시간 내지 약 28시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 22시간, 약 12시간 내지 약 20시간, 약 12시간 내지 약 18시간, 또는 약 12시간 내지 약 16시간) 동안 배양된다. 바람직하게는, 세포는 관류 배양 시스템에서 약 12시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 22시간, 약 12시간 내지 약 20시간, 또는 약 12시간 내지 약 18시간, 예컨대 약 12시간 내지 약 20시간동안 배양된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염 단계는 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계 직후에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염 단계는 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계 후 약 0.5시간 내지 약 24시간(적합하게는, 약 0.5시간, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간 또는 약 24시간, 바람직하게는 약 1시간) 후에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염 단계는 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계 후 적어도 약 0.5시간 내지 적어도 약 24시간(적합하게는, 적어도 약 0.5시간, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 7시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간 또는 적어도 약 24시간, 바람직하게는 적어도 약 1시간) 후에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 관류 배양은 전체 관류 배양 기간에 걸쳐 현탁 세포 배양 부피의 약 50% 내지 약 1000%(적합하게는, 약 50% 내지 약 900%, 약 50% 내지 약 800%, 약 50% 내지 약 700%, 약 50% 내지 약 600%, 약 50% 내지 약 500%, 약 50% 내지 약 400% 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 100%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000%)를 제거하고 적합한 부피의 신선한 배지를 현탁 세포 배양물에 도입함으로써 수행된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 관류 배양은 세포 배양 용기 작업 부피, 예를 들어 생물반응기 작업 부피의 약 50% 내지 약 1000%(적합하게는, 약 50% 내지 약 900%, 약 50% 내지 약 800%, 약 50% 내지 약 700%, 약 50% 내지 약 600%, 약 50% 내지 약 500%, 약 50% 내지 약 400% 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 100%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000%)를 제거하고, 적합한 부피의 신선한 배지를 세포 배양 용기, 예를 들어 생물반응기에 도입함으로써 수행된다. 적합하게는, 이 부피는 전체 관류 배양기간에 걸쳐 제거된다. 세포 배양 용기에 도입되는 신선한 배지의 부피는 관류 배양 동안 제거되는 세포 배양 용기 작업 부피보다 더 크거나 더 작거나 이와 동등하거나 동일할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 관류 배양 동안 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동등하다.
적합하게는, 현탁 세포 배양 부피의 약 50% 내지 약 1000%(적합하게는, 약 50% 내지 약 900%, 약 50% 내지 약 800%, 약 50% 내지 약 700%, 약 50% 내지 약 600%, 약 50% 내지 약 500%, 약 50% 내지 약 400% 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 100%, 약 100%, 약 150%, 약 200%)가 제거될 수 있고 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동등할 수 있다.
관류 배양 단계에서 제거되는 현탁 세포 배양 부피는 현탁 세포 배양 부피의 적어도 약 50%(적합하게는 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900% 또는 적어도 약 1000%)일 수 있다.
관류 배양 단계에서 제거되는 현탁 세포 배양 부피는 현탁 세포 배양 부피의 약 50% 미만(적합하게는 약 100% 미만, 약 150% 미만, 약 200% 미만, 약 250% 미만, 약 300% 미만, 약 400% 미만, 약 500% 미만, 약 600% 미만, 약 700% 미만, 약 800% 미만, 약 900% 미만 또는 약 1000% 미만)일 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 현탁 세포 배양 부피의 약 100% 내지 약 200%(적합하게는 약 150%)가 관류 배양 단계에서 제거되고 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동등할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 관류 배양은 일일 현탁 세포 배양 부피의 약 50% 내지 약 500%(적합하게는, 약 50% 내지 약 450%, 약 50% 내지 약 400%, 약 50% 내지 약 350%, 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 100%, 약 100%, 약 150%, 약 200%)의 유량을 사용하여 수행된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 관류 배양은 일일 세포 배양 용기 작업 부피, 예를 들어 생물반응기 작업 부피의 약 50% 내지 약 500%(적합하게는, 약 50% 내지 약 450%, 약 50% 내지 약 400%, 약 50% 내지 약 350%, 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 100%, 약 100%, 약 150%, 약 200%)의 유량을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 관류 배양은 일일 현탁 세포 배양 부피의 약 50% 내지 약 200%(적합하게는 약 50% 내지 약 150% 또는 약 50% 내지 100%)의 유량을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 관류 배양은 일일 현탁 세포 배양 부피의 약 200%, 약 150% 또는 약 100%의 유량을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 관류 배양은 일일 현탁 세포 배양 부피의 약 150%의 유량을 사용하여 수행된다.
상기 기재된 바와 같이, 산출 역가 및 순도를 제한하는 불순물의 축적이 배지 교환에 의해 감소되기 때문에, 신속한 배지 교환의 사용은 바이러스 벡터의 생산에서 배치 배양 또는 유가 배양보다 유리하다. 이는 더 높은 세포 밀도에 도달될 수 있게 한다.
일부 실시 형태에서, 신속한 배지 교환은 약 0.1 내지 약 8시간(적합하게는 약 0.2 내지 약 8시간, 약 0.3 내지 약 8시간, 약 0.4 내지 약 8시간, 약 0.5 내지 약 8시간, 약 1 내지 약 8시간, 약 1.5 내지 약 8시간, 약 2 내지 약 8시간, 약 2.5 내지 약 8시간, 약 3 내지 약 8시간, 약 4 내지 약 8시간, 약 5 내지 약 8시간) 이내에 완료된다.
신속한 배지 교환은 약 0.1 내지 약 5시간(적합하게는 약 0.2 내지 약 5시간, 약 0.3 내지 약 5시간, 약 0.4 내지 약 5시간, 약 0.5 내지 약 5시간, 약 1 내지 약 5시간, 약 1.5 내지 약 5시간, 약 2 내지 약 5시간, 약 2.5 내지 약 5시간, 약 3 내지 약 5시간, 약 4 내지 약 5시간) 이내에 완료될 수 있다. 신속한 배지 교환은 약 0.1 내지 약 3시간(적합하게는 약 0.2 내지 약 3시간, 약 0.3 내지 약 3시간, 약 0.4 내지 약 3시간, 약 0.5 내지 약 3시간, 약 1 내지 약 3시간, 약 1.5 내지 약 3시간, 약 2 내지 약 3시간, 약 2.5 내지 약 3시간) 이내에 완료될 수 있다.
신속한 배지 교환은 약 0.5시간 미만(적합하게는 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간 미만)의 시간 내에 완료될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 신속한 배지 교환은 현탁 세포 배양 부피의 약 50% 내지 약 99%를 제거하고 적합한 부피의 신선한 배지를 현탁 세포 배양에 도입함으로써 수행된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 신속한 배지 교환은 세포 배양 용기 작업 부피, 예를 들어 생물반응기 작업 부피의 약 50% 내지 약 99%를 제거하고 적합한 부피의 신선한 배지를 세포 배양 용기, 예를 들어 생물반응기에 도입함으로써 수행된다. 세포 배양 용기에 도입되는 신선한 배지의 부피는 신속한 배지 교환 동안 제거되는 세포 배양 용기 작업 부피보다 더 크거나 더 작거나 이와 동등하거나 동일할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 신속한 배지 교환 동안 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동일하다.
적합하게는, 현탁 세포 배양 부피의 약 55% 내지 약 99%(적합하게는 약 60% 내지 약 99%, 약 65% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%)가 신속한 배지 교환 동안 제거될 수 있고 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동등할 수 있다.
적합하게는, 현탁 세포 배양 부피의 약 55% 내지 약 95%(적합하게는 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85%)가 신속한 배지 교환 동안 제거될 수 있고 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동등할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 현탁 세포 배양 부피의 약 70% 내지 약 85%(적합하게는 약 75% 또는 약 80%)가 제거되고 현탁 세포 배양에 도입되는 신선한 배지의 부피는 제거되는 현탁 세포 배양 부피와 동등할 수 있다.
제거되는 현탁 세포 배양 부피는 적어도 약 50%(적합하게는 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%)일 수 있다.
제거되는 현탁 세포 배양 부피는 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 약 95% 미만, 약 99% 미만일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 신속한 배지 교환은 형질감염시키기 0 내지 약 24시간 전에(적합하게는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 1, 약 1.5, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23 내지 약 24시간 전에) 수행된다. 일부 실시 형태에서, 신속한 배지 교환은 형질감염시키기 0 내지 약 3시간 전에(적합하게는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 1, 약 1.5, 약 2 또는 약 2.5 내지 약 3시간 전에) 수행된다. 신속한 배지 교환은 형질감염시키기 0 내지 약 2시간 전에(적합하게는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 1 또는 약 1.5 내지 약 2시간 전에) 수행될 수 있다. 신속한 배지 교환은 형질감염시키기 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 1, 약 1.5, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5 , 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 또는 약 24시간 미만의 시간 전에 수행될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 신속한 배지 교환은 형질감염시키기 약 1시간 전에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 세포는 관류 배양 시 지수 성장기에 있을 수 있다. 세포는 관류 배양 단계 후 약 1x105개의 세포/mL 내지 약 1x109개의 세포/mL(적합하게는, 약 2x105개의 세포/mL 내지 약 5x108개의 세포/mL, 약 3x105개의 세포/mL 내지 약 1x108개의 세포/mL, 약 4x105개의 세포/mL 내지 약 5x107개의 세포/mL, 약 5x105개의 세포/mL 내지 약 1x107개의 세포/mL, 약 6x105개의 세포/mL 내지 약 5x106개의 세포/mL, 약 7x105개의 세포/mL 내지 약 1x106개의 세포/mL mL)의 최종 세포 밀도를 가질 수 있다. 세포는 관류 배양 단계 후 약 1x105개의 세포/mL 내지 약 5x107개의 세포/mL(적합하게는, 약 2x105개의 세포/mL 내지 약 1x107개의 세포/mL, 약 3x105개의 세포/mL 내지 약 5x106개의 세포/mL, 약 4x105개의 세포/mL 내지 약 1x106개의 세포/mL, 약 5x105개의 세포/mL 내지 약 1x106개의 세포/mL)의 최종 세포 밀도를 가질 수 있다. 세포수는 관류 배양 단계 동안 적어도 약 25%(적합하게는, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900% 또는 적어도 약 1000%) 증가할 수 있다. 세포수는 관류 배양 단계 동안 약 25%(적합하게는 약 50%, 약 70%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 350%, 약 400%, 약 450%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000%) 증가할 수 있다. 세포수는 관류 배양 단계 동안 약 0.5배(적합하게는 약 1배, 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배) 증가할 수 있다.
중합체/핵산 복합체 용액은 제한되지 않는 기간 동안 형질감염을 위해 세포와 접촉(즉, 세포와 함께 인큐베이션)될 수 있다. 예를 들어, 상기 기간은 약 20분 내지 약 24시간(적합하게는 약 30분 내지 약 20시간, 약 1시간 내지 약 16시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 약 3시간 내지 약 8시간)일 수 있다. 배양 배지는 세포에 대한 양이온성 중합체의 세포독성 효과를 감소시키기 위해 형질감염 후 신선한 배지로 대체될 수 있다.
세포는 중합체/핵산 복합체 용액과 접촉하기 전 또는 접촉 시점에 지수 성장기에 있을 수 있다. 세포는 중합체/핵산 복합체 용액과 접촉하기 전 또는 접촉 시점에 약 1x105개의 세포/mL 내지 약 1x108개의 세포/mL(적합하게는, 약 2x105개의 세포/mL 내지 약 5x106개의 세포/mL, 약 3x105개의 세포/mL 내지 약 4x106개의 세포/mL, 약 4x105개의 세포/mL 내지 약 3x106개의 세포/mL, 약 5x105개의 세포/mL 내지 약 2x106개의 세포/mL, 약 6x105개의 세포/mL 내지 약 1x106개의 세포/mL)의 세포 밀도를 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 형질감염 단계에서 사용되는 중합체/핵산 복합체:세포의 비는 1x106개의 세포당 약 0.1 μg의 DNA(적합하게는, 1x106개의 세포당 약 0.2 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.3 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.4 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.5 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.6 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.7 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.8 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 0.9 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 1 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 1.5 μg의 DNA 또는 1x106개의 세포당 2 μg의 DNA)이다. 바람직하게는, 형질감염 단계에서 사용되는 중합체/핵산 복합체:세포의 비는 1x106개의 세포당 약 0.6 μg의 DNA이다.
일부 실시 형태에서, 형질감염 단계에서 사용되는 중합체/핵산 복합체:세포의 비는 1x106개의 세포당 약 0.3 μg의 DNA(적합하게는, 1x106개의 세포당 약 0.6 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 약 1 μg의 DNA, 1x106개의 세포당 1.5 μg의 DNA 또는 1x106개의 세포당 2 μg의 DNA)이다. 바람직하게는, 형질감염 단계에서 사용되는 중합체/핵산 복합체:세포의 비는 1x106개의 세포당 약 0.6 μg의 DNA이다.
본 발명의 방법에서, 벡터 구성요소는 gag, env, rev 및/또는 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 포함할 수 있다. 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도의 일부 실시 형태에서, 적합한 생산 세포 또는 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 세포는 적절한 조건 하에 배양될 때 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포이다. 따라서, 세포는 전형적으로 gag, env, rev 및 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 포함할 수 있는 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적합한 세포주는 뮤린 섬유아세포 유래 세포주 또는 인간 세포주와 같은 포유동물 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이것은 일반적으로 인간 세포, 예를 들어 HEK293T, HEK293, CAP, CAP-T 또는 CHO 세포를 포함하는 포유동물 세포이지만, 예를 들어 SF9 세포와 같은 곤충 세포일 수 있다. 바람직하게는, 벡터 생산 세포는 인간 세포주로부터 유래된다. 따라서, 이러한 적합한 생산 세포는 본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 서열을 세포에 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 이전에 기술된 바 있다. 따라서, 분자 및 세포 생물학에서 통상적인 기술을 사용하여 gag, env, rev 및 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 포함하는 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 세포로 도입하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
안정적인 생산 세포는 패키징 또는 생산자 세포일 수 있다. 패키징 세포로부터 생산자 세포를 생성하기 위해 벡터 게놈 DNA 구축물을 안정적으로 또는 일시적으로 도입할 수 있다. 패키징/생산자 세포는 WO 2004/022761에 기재된 바와 같이 벡터의 구성요소 중 하나, 즉 게놈, gag-pol 구성요소 및 엔벨로프를 발현하는 레트로바이러스 벡터로 적합한 세포주를 형질도입함으로써 생성될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레오티드 서열로 세포를 형질감염시킬 수 있고 그 후 생산 세포 게놈 내로의 통합이 드물게 그리고 무작위로 발생한다. 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용한 형질감염 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 안정적인 형질감염 과정은 콘카테머화를 돕기 위해 엔지니어링된 구축물을 사용할 수 있다. 당업자는 뉴클레오티드 서열의 생산 세포로의 통합을 촉진하는 방법을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 핵산 구축물의 선형화가 자연적으로 원형인 경우 도움이 될 수 있다. 덜 무작위적인 통합 방법론은 내인성 게놈 내의 선택된 부위로의 통합을 안내하기 위해 포유동물 숙주 세포의 내인성 염색체와 공유된 상동성 영역으로 이루어진 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 또한 재조합 부위가 구축물에 존재하면 이를 표적화 재조합에 사용할 수 있다. 예를 들어, 핵산 구축물은 Cre 레콤비나아제와 조합될 때(즉, P1 박테리오파지로부터 유래된 Cre/lox 시스템을 사용하여) 표적화된 통합을 허용하는 loxP 부위를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 재조합 부위는 att 부위(예를 들어, λ 파지로부터)이고, 여기서, att 부위는 람다 인테그라아제의 존재 하에 부위 지향적 통합을 허용한다. 이는 렌티바이러스 유전자가 높은 및/또는 안정적인 발현을 가능하게 하는 숙주 세포 게놈 내의 유전자좌에 표적화되도록 할 것이다.
표적화된 통합의 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 게놈 DNA의 표적화 절단을 유도하는 방법을 사용하여 선택된 염색체 유전자좌에서 표적화된 재조합을 촉진할 수 있다. 이러한 방법은 종종 이중 가닥 파괴(DSB)를 유도하기 위한 방법 또는 시스템, 예를 들어, 비상동성 말단 연결(Non-Homologous End Joining; NHEJ)과 같은 생리학적 메커니즘에 의해 이중 가닥 파괴의 복구를 유도하기 위한 내인성 게놈 내에서의 닉(nick)의 사용을 포함한다. 절단은 Argonaute 시스템(예를 들어 티. 서모필루스(T. thermophilus)로부터)을 기반으로 하는 뉴클레아제를 사용하여, 및/또는 특정한 절단을 가이드하기 위해 엔지니어링된 crRNA/tracr RNA('단일 가이드 RNA')가 있는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, 엔지니어링된 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)와 같은 특정 뉴클레아제의 사용을 통해 발생할 수 있다.
패키징/생산자 세포주는 단지 렌티바이러스 형질도입 또는 단지 핵산 형질감염 방법을 사용하여 뉴클레오티드 서열의 통합에 의해 생성될 수 있거나, 이 둘의 조합이 사용될 수 있다.
생산 세포로부터 레트로바이러스 벡터를 생성하는 방법 및 특히 레트로바이러스 벡터의 프로세싱은 WO 2009/153563에 기재되어 있다.
일 실시 형태에서, 생산 세포는 RNA-결합 단백질(예를 들어, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질, TRAP) 및/또는 Tet 리프레서(TetR) 단백질 또는 대안적인 조절 단백질(예를 들어, CymR)을 포함할 수 있다.
생산 세포로부터의 렌티바이러스 벡터의 생산은 형질감염 방법을 통해, 유도 단계(예를 들어 독시사이클린 유도)를 포함할 수 있는 안정한 세포주로부터의 생산에 의해 또는 이 둘의 조합을 통해 이루어질 수 있다. 형질감염 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예는 이전에 기재된 바 있다.
생산 세포, 패키징 또는 생산자 세포주 또는 구성요소를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 일시적으로 형질감염된 것은 세포 및 바이러스 수 및/또는 바이러스 역가를 증가시키기 위해 배양된다. 세포 배양은 세포가 본 발명에 따라 대사, 및/또는 성장 및/또는 분열이 가능하도록 및/또는 관심 바이러스 벡터를 생산할 수 있도록 수행된다. 이는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어 적절한 배양 배지에서 세포에 영양분을 제공하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 방법은 표면에 부착된 상태로 성장, 현탁 상태로 성장, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양은 예를 들어 조직 배양 플라스크, 조직 배양 멀티웰 플레이트, 디쉬, 롤러 보틀, 웨이브 백에서 또는 생물반응기에서 배치식, 유가식, 연속식 시스템 등을 사용하여 행해질 수 있다. 세포 배양을 통한 바이러스 벡터의 대규모 생산을 달성하기 위해서는 현탁 상태로 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 당업계에서 바람직하다. 세포 배양에 적합한 조건은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley- Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9] 참조).
바람직하게는, 세포를 처음에 조직 배양 플라스크 또는 생물반응기에서 '벌크업'시키고, 그 후 다층 배양 용기 또는 대형 생물반응기(50 L 초과)에서 성장시켜 본 발명의 벡터 생산 세포를 생성한다.
바람직하게는, 세포를 부착 방식으로 성장시켜 본 발명의 벡터 생산 세포를 생성한다.
바람직하게는, 세포를 현탁 방식으로 성장시켜 본 발명의 벡터 생산 세포를 생성한다.
중합체/핵산 복합체 용액
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 시험관 내 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 중합체/핵산 복합체 용액을 제공한다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 및 염을 포함하는 용액을 제공하며, 여기서, 염 농도는 약 10 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 실시 형태에서, 염 농도는 약 50 mM 내지 약 500 mM이다.
추가 양태에서, 본 발명은 중합체/핵산 복합체 및 염을 포함하는 용액을 제공하며, 여기서, 염 농도는 약 0.1 mM 내지 약 49 mM이다. 일부 실시 형태에서, 염 농도는 약 10 mM 내지 약 49 mM이다.
일부 실시 형태에서, 염은 PBS이고 PBS 농도는 약 0.15X PBS 내지 약 3X PBS이다.
일부 실시 형태에서, PBS의 농도는 약 0.3X PBS 미만이다.
포유동물 세포를 형질감염시키는 방법
추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 포유동물 세포의 형질감염 방법을 제공한다:
a) 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
b) 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계.
일부 실시 형태에서, 포유동물 세포를 배양하는 단계는 관류 배양에서 수행된다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 포유동물 세포의 형질감염 방법을 제공한다:
a) 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
b) 본원에 기재된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계.
적합하게는, 포유동물 세포는 본원에 기재된 바와 같은 포유동물 세포이다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 단계 a) 및/또는 단계 b)는 적어도 50 L의 부피로 수행되며, 바람직하게는 단계 a) 및 단계 b)는 적어도 50 L의 부피로 수행된다.
일부 실시 형태에서, 형질감염은 일시적 형질감염이다.
적합하게는, 포유동물 세포를 배양하는 단계(예를 들어, 관류 배양에서) 및 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다.
레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터
바이러스 벡터는 벡터, 벡터 비리온 또는 벡터 입자로도 칭해질 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래될 수 있거나 유래가능할 수 있다. 다수의 상이한 레트로바이러스들이 확인되었다. 예는 다음을 포함한다: 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), Rous 육종 바이러스(RSV), Fujinami 육종 바이러스(FuSV), Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(Mo MLV) , FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), Moloney 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), Abelson 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수 세포종증 바이러스-29(MC29) 및 조류 적모세포증 바이러스(AEV). 레트로바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 찾을 수 있다.
레트로바이러스는 크게 두 카테고리, 즉 "단순"과 "복합"으로 나눌 수 있다. 레트로바이러스는 7개의 그룹으로 더 나눌 수도 있다. 이들 그룹 중 5개는 발암 가능성이 있는 레트로바이러스를 나타낸다. 나머지 두 그룹은 렌티바이러스와 스푸마바이러스이다. 이러한 레트로바이러스에 대한 리뷰는 상기 문헌[Coffin et al(1997)]에 제시되어 있다.
렌티바이러스는 더 큰 레트로바이러스 그룹의 일부이다. 렌티바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 찾을 수 있다. 간단히 말해서, 렌티바이러스는 영장류와 비영장류 그룹으로 나눌 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 자가면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 물질, 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV). 비영장류 렌티바이러스 그룹은 프로토타입 "슬로우 바이러스" visna/maedi 바이러스(VMV)와, 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), Maedi visna 바이러스(MVV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다. 일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna 렌티바이러스로부터 유래된다.
렌티바이러스 패밀리는 렌티바이러스가 분열 세포와 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력을 갖는다는 점에서 레트로바이러스와 다르다(문헌[Lewis et al (1992) EMBO J 11(8):3053-3058] 및 문헌[Lewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516]). 이와는 대조적으로, MLV와 같은 다른 레트로바이러스는 예를 들어 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 세포와 같은 느리게 분열하는 세포 또는 분열하지 않는 세포는 감염시킬 수 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 유래가능한 적어도 하나의 구성요소 부분을 포함하는 벡터이다. 바람직하게는, 그 구성요소 부분은 벡터가 표적 세포를 감염시키거나 형질도입하고 NOI를 발현하는 생물학적 메커니즘에 관여한다.
레트로바이러스 벡터는 시험관 내에서 양립가능한 표적 세포에서 NOI를 복제하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터를 시험관 내에서 양립가능한 표적 세포에 도입하고 NOI의 발현을 초래하는 조건 하에 표적 세포를 성장시킴으로써 시험관 내에서 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 표적 세포로부터 단백질 및 NOI를 회수할 수 있다. 적합한 표적 세포는 포유동물 세포주 및 기타 진핵 세포주를 포함한다.
일부 양태에서 벡터는 프로모터와 인핸서 사이의 상호 작용을 차단하고 인접 유전자로부터 리드-스루를 줄이는 장벽으로서의 역할을 하는 유전자 서열인 "인슐레이터"를 가질 수 있다.
일 실시 형태에서, 인슐레이터는 프로모터 간섭 및 인접 유전자로부터의 리드-스루를 방지하기 위해 하나 이상의 레트로바이러스 핵산 서열들 사이에 존재한다. 인슐레이터가 하나 이상의 레트로바이러스 핵산 서열들 사이에 벡터에 존재하면, 이러한 인슐레이팅된 유전자 각각은 개별 발현 단위로 배열될 수 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 게놈의 기본 구조는 5' LTR 및 3' LTR과 같은 많은 공통 특징부를 공유하며, 그 사이 또는 그 안에는 게놈이 패키징될 수 있도록 하는 패키징 신호, 프라이머 결합 부위, 표적 세포 게놈 내로의 통합을 가능하게 하는 통합 부위, 및 패키징 구성요소를 코딩하는 gag/pol 및 env 유전자가 위치하며, 이들은 바이러스 입자의 조립에 필요한 폴리펩티드이다. 렌티바이러스는 HIV의 RRE 서열 및 rev 유전자와 같은 추가 특징부를 갖는데, 이는 통합 프로바이러스의 RNA 전사체를 감염된 표적 세포의 핵으로부터 세포질로 효율적으로 엑스포트하는 것을 가능하게 한다.
프로바이러스에서, 이러한 유전자는 긴 말단 반복부(Long Terminal Repeat; LTR)로 칭해지는 영역이 양 말단에 측면에 있다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열 역할을 하며 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있다.
LTR 자체는 U3, R 및 U5로 칭해지는 3가지 요소로 나눌 수 있는 동일한 서열이다. U3은 RNA의 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양 말단에서 반복되는 서열로부터 유래되고 U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. 상기 3가지 요소의 크기는 서로 다른 레트로바이러스 간에 상당히 다를 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 전형적인 레트로바이러스 벡터에서, 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부는 바이러스로부터 제거될 수 있으며; 예를 들어 gag/pol 및 env가 부재하거나 기능성이 아닐 수 있다. 이것은 바이러스 벡터를 복제 결함성으로 만든다.
렌티바이러스 벡터는 영장류 렌티바이러스(예를 들어 HIV-1) 또는 비영장류 렌티바이러스(예를 들어 EIAV)로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 전형적인 레트로바이러스 벡터 생산 시스템은 필수적인 바이러스 패키징 기능으로부터 바이러스 게놈을 분리하는 것을 포함한다. 이러한 구성요소는 일반적으로 별개의 DNA 발현 카세트(대안적으로 플라스미드, 발현 플라스미드, DNA 구축물 또는 발현 구축물로 공지됨)에서 생산 세포에 제공된다.
벡터 게놈은 NOI를 포함한다. 벡터 게놈은 일반적으로 패키징 신호(ψ), NOI를 포함하는 내부 발현 카세트, (선택적으로) 전사 후 요소(PRE), 전형적으로 중앙 폴리퓨린 트랙트(cppt), 3'-ppu 및 자가-불활성화(SIN) LTR을 필요로 한다. R-U5 영역은 벡터 게놈 RNA와 NOI mRNA 둘 모두의 정확한 폴리아데닐화와, 역전사 과정에 필요하다. 벡터 게놈은 WO 2003/064665에 기재된 바와 같이 선택적으로 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있으며, 이는 rev의 부재 하에 벡터 생산을 가능하게 한다.
패키징 기능은 gag/pol 및 env 유전자를 포함한다. 이들은 생산 세포에 의한 벡터 입자의 생산에 필요하다. 이러한 기능을 게놈에 트랜스로 제공하면 복제 결함 바이러스 벡터의 생산이 용이해진다.
감마-레트로바이러스 벡터의 생산 시스템은 전형적으로 게놈, gag/pol 및 env 발현 구축물을 필요로 하는 3구성요소 시스템이다. HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터의 생산 시스템은 추가로, 부속 유전자 rev가 제공되고 벡터 게놈이 rev-응답 요소(RRE)를 포함할 것을 요구할 수 있다. EIAV 기반 렌티바이러스 벡터는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 게놈 내에 존재하는 경우 rev가 트랜스로 제공되는 것을 요구하지 않는다(WO 2003/064665 참조).
일반적으로 벡터 게놈 카세트 내에 코딩된 "외부" 프로모터(벡터 게놈 카세트를 구동) 및 "내부" 프로모터(NOI 카세트를 구동) 둘 모두는 다른 벡터 시스템 구성요소를 구동하는 것과 마찬가지로 강력한 진핵 또는 바이러스 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예는 CMV, EF1α, PGK, CAG, TK, SV40 및 유비퀴틴 프로모터를 포함한다. 강력한 '합성' 프로모터, 예컨대 DNA 라이브러리에 의해 생성된 것(예를 들어 JeT 프로모터)도 전사를 구동하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신(Rho), 로돕신 키나아제(RhoK), 콘-로드(cone-rod) 호메오박스 함유 유전자(CRX), 신경 망막-특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황형 황반부 이영양증 2(Vitelliform Macular Dystrophy 2; VMD2), 티로신 히드록실라아제, 뉴런-특이적 뉴런-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터, 성상 세포-특이적 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40 / hAlb 프로모터, SV40 / CD43, SV40 / CD45, NSE / RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 데스민 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터를 사용하여 전사를 구동할 수 있다.
레트로바이러스 벡터의 생산은 이러한 DNA 구성요소들을 이용한 생산 세포의 일시적 동시 형질감염 또는 모든 구성요소가 생산 세포 게놈 내에 안정적으로 통합되는 안정한 생산 세포주의 사용을 포함한다(예를 들어 문헌[Stewart HJ, Fong-Wong L, Strickland I, Chipchase D, Kelleher M, Stevenson L, Thoree V, McCarthy J, Ralph GS, Mitrophanous KA and Radcliffe PA. (2011). Hum Gene Ther. Mar; 22 (3):357-69]). 대안적인 접근법으로는 안정적인 패키징 세포(패키징 구성요소가 상기 세포에 안정적으로 통합됨)를 사용한 다음 필요에 따라 벡터 게놈 플라스미드 형태로 일시적으로 형질감염시키는 것이 있다(예를 들어 문헌[Stewart, H. J., M. A. Leroux-Carlucci, C. J. Sion, K. A. Mitrophanous and P. A. Radcliffe (2009). Gene Ther. Jun; 16 (6):805-14]). 또한 완벽하지는 않은 대안적인 패키징 세포주가 생성될 수 있고(단지 1개 또는 2개의 패키징 구성요소가 세포주에 안정적으로 통합됨), 벡터를 생성하기 위해 누락된 구성요소로 일시적으로 형질감염시킬 수 있다. 생산 세포는 또한 조절 단백질, 예컨대 전사 조절자의 tet 리프레서(TetR) 단백질 그룹의 구성원(예를 들어 T-Rex, Tet-On 및 Tet-Off), 전사 조절의 큐메이트 유도성 스위치 시스템 그룹의 구성원(예를 들어 큐메이트 리프레서(CymR) 단백질) 또는 RNA-결합 단백질(예를 들어 TRAP - 트립토판 활성화 RNA-결합 단백질)을 발현할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 EIAV로부터 유래된다. EIAV는 렌티바이러스의 가장 단순한 게놈 구조를 가지며 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직하다. gag/pol 및 env 유전자에 더하여, EIAV는 다음의 3가지 다른 유전자를 코딩한다: tat, rev, 및 S2. Tat는 바이러스 LTR의 전사 활성화자로서 작용하고(문헌[Derse and Newbold (1993) Virology 194(2):530-536] 및 문헌[Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642]) rev는 rev-응답 요소(RRE(rev-response)를 통한 바이러스 유전자의 발현을 조절하고 조율한다(문헌[Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111]). 이 두 단백질의 작용 메커니즘은 영장류 바이러스의 유사한 메커니즘과 광범위하게 유사한 것으로 생각된다(문헌[Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111]). S2의 기능은 알려져 있지 않다. 또한, EIAV 단백질, Ttm이 확인되었는데, 이는 막관통 단백질의 시작 부분에서 env 코딩 서열로 스플라이싱되는 tat의 첫 번째 엑손에 의해 코딩된다. 본 발명의 대안적인 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 HIV로부터 유래된다: HIV는 S2를 코딩하지 않는다는 점에서 EIAV와 다르지만 EIAV와는 달리 vif, vpr, vpu 및 nef를 코딩한다.
"재조합 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터"(RRV)라는 용어는 패키징 구성요소의 존재 하에 RNA 게놈을 표적 세포의 형질도입이 가능한 바이러스 입자로 패키징할 수 있도록 하기에 충분한 레트로바이러스 유전 정보를 가진 벡터를 지칭한다. 표적 세포의 형질도입은 역전사 및 표적 세포 게놈으로의 통합을 포함할 수 있다. RRV는 벡터에 의해 표적 세포로 전달될 비바이러스 코딩 서열을 운반한다. RRV는 표적 세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자를 생성하도록 독립적으로 복제하는 것이 불가능하다. 일반적으로 RRV에는 기능성 gag/pol 및/또는 env 유전자 및/또는 복제에 필수적인 기타 유전자가 결여되어 있다.
바람직하게는 본 발명의 RRV 벡터는 최소 바이러스 게놈을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "최소 바이러스 게놈"이라는 용어는 표적 세포를 감염시키고, 형질도입하고, 표적 세포에 NOI를 전달하기 위해 필요한 기능을 제공하는 데 필수적인 요소를 보유하면서 비필수 요소가 제거되도록 바이러스 벡터가 조작되었음을 의미한다. 이 전략에 대한 추가 세부 사항은 WO 1998/17815 및 WO 99/32646에서 찾을 수 있다. 최소 EIAV 벡터에는 tat, S2 유전자 및 선택적으로 rev가 결여되어 있으며, 생산 시스템에서 이들 유전자는 트랜스로 제공되지 않는다. 최소 HIV 벡터에는 vif, vpr, vpu, tat 및 nef가 결여되어 있다.
생산 세포 내에서 벡터 게놈을 생성하기 위해 사용되는 발현 플라스미드는 생산 세포/패키징 세포에서 게놈의 전사를 구동하기 위해 레트로바이러스 게놈에 작동가능하게 연결된 전사 조절 제어 서열을 포함할 수 있다. 모든 3세대 렌티바이러스 벡터는 5' U3 인핸서-프로모터 영역이 결실되고, 벡터 게놈 RNA의 전사는 아래에서 논의되는 바와 같이 이종 프로모터, 예컨대 다른 바이러스 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터에 의해 구동된다. 이 특징부는 tat와 독립적으로 벡터 생산을 가능하게 한다. 일부 렌티바이러스 벡터 게놈은 효율적인 바이러스 생산을 위해 추가 서열을 필요로 한다. 예를 들어, 특히 HIV의 경우 RRE 서열이 포함될 수 있다. 그러나, (별개의) GagPol 카세트 상의 RRE에 대한 요건(및 트랜스로 제공되는 rev에 대한 의존성)은 GagPol ORF의 코돈 최적화에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 이 전략에 대한 세부 사항은 WO 2001/79518에서 찾을 수 있다.
rev/RRE 시스템과 동일한 기능을 수행하는 대안적인 서열도 알려져 있다. 예를 들어, rev/RRE 시스템의 기능성 유사체는 Mason Pfizer 원숭이 바이러스에서 발견된다. 이는 구성적 수송 요소(CTE)로 알려져 있으며, 감염된 세포의 인자와 상호작용하는 것으로 여겨지는 게놈의 RRE 타입 서열을 포함한다. 상기 세포 인자는 rev 유사체로 생각될 수 있다. 따라서 CTE는 rev/RRE 시스템의 대안으로 사용될 수 있다. 알려진 또는 이용가능한 Rev 단백질의 임의의 다른 기능성 등가물이 본 발명과 관련될 수 있다. 예를 들어, HTLV-I의 Rex 단백질이 HIV-1의 Rev 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다는 것도 알려져 있다. Rev 및 RRE는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 벡터에 부재하거나 비기능성일 수 있으며; 대안적인 rev 및 RRE 또는 기능적으로 동등한 시스템에서는 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능성 대체물"은 다른 단백질 또는 서열과 동일한 기능을 수행하는 대체 서열을 갖는 단백질 또는 서열을 의미한다. 용어 "기능성 대체물"은 동일한 의미로 본원에서 "기능성 등가물" 및 "기능성 유사체"와 상호교환가능하게 사용된다.
SIN 벡터
본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터는 바이러스 인핸서 및 프로모터 서열이 결실된 자가-불활성화(SIN) 구성으로 사용될 수 있다. SIN 벡터가 생성될 수 있으며, 이는 비-SIN 벡터의 효능과 유사한 효능으로 생체 내에서, 생체 외에서 또는 시험관 내에서 비분열 표적 세포를 형질도입할 수 있다. SIN 프로바이러스에서 긴 말단 반복부(LTR)의 전사 불활성화는 vRNA의 동원을 방지해야 하며, 복제-적격 바이러스의 형성 가능성을 더욱 감소시키는 특징이다. 이것은 또한 LTR의 임의의 시스-작용 효과를 제거함으로써 내부 프로모터로부터의 유전자의 조절된 발현을 가능하게 해야 한다.
예를 들어, 자가-불활성화 레트로바이러스 벡터 시스템은 3' LTR의 U3 영역에서 전사 인핸서 또는 인핸서 및 프로모터를 결실시킴으로써 구축되었다. 일련의 벡터 역전사 및 통합 후, 이러한 변화는 5' 및 3' LTR 둘 모두에 카피되어 전사적으로 불활성인 '프로바이러스'를 생성한다. 그러나, 이러한 벡터에서 LTR 내부의 임의의 프로모터(들)는 여전히 전사적으로 활성일 것이다. 이 전략은 내부 배치 유전자의 전사에 대한 바이러스 LTR의 인핸서 및 프로모터의 영향을 제거하기 위해 사용되었다. 이러한 효과에는 증가된 전사 또는 전사 억제가 포함된다. 이 전략은 3' LTR로부터 게놈 DNA로의 하류 전사를 제거하는 데에도 사용될 수 있다. 이는 임의의 내인성 발암 유전자의 우발적 활성화를 방지하는 것이 중요한 인간 유전자 요법에서 특히 중요하다. 문헌[Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98]; 문헌[Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7]; 문헌[Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5]; 문헌[Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32]; 문헌[Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90]. SIN 렌티바이러스 벡터는 US 6,924,123 및 US 7,056,699에 기재되어 있다.
복제 결함 렌티바이러스 벡터
복제 결함 렌티바이러스 벡터의 게놈에서 gag/pol 및/또는 env의 서열은 돌연변이될 수 있고/있거나 기능성이 아닐 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 전형적인 렌티바이러스 벡터에서, 바이러스 복제에 필수적인 단백질에 대한 하나 이상의 코딩 영역의 적어도 일부는 벡터로부터 제거될 수 있다. 이것은 바이러스 벡터를 복제 결함성으로 만든다. 바이러스 게놈의 일부는 또한 비분열 표적 세포를 형질도입하고/하거나 그의 게놈을 표적 세포 게놈으로 통합할 수 있는 NOI를 포함하는 벡터를 생성하기 위해 NOI로 대체될 수 있다.
일 실시 형태에서 렌티바이러스 벡터는 WO 2006/010834 및 WO 2007/071994에 기재된 바와 같은 비통합 벡터이다.
추가 실시 형태에서 벡터는 바이러스 RNA가 없거나 결여된 서열을 전달하는 능력을 갖는다. 추가 실시 형태에서, 전달될 RNA 상에 위치한 이종성 결합 도메인(gag에 대해 이종성) 및 Gag 또는 GagPol 상의 동계 결합 도메인이 전달될 RNA의 패키징을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이들 벡터는 모두 WO 2007/072056에 기재되어 있다.
벡터 역가
당업자는 바이러스 벡터의 역가를 결정하는 다수의 상이한 방법이 있음을 이해할 것이다. 역가는 종종 형질도입 단위/mL(TU/mL)로 기재된다. 역가는 감염성 입자의 수를 증가시킴으로써 그리고 벡터 제제의 비활성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
NOI 및 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 본 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드가 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 폴리펩티드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용빈도를 반영하도록 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 일상적인 기술을 사용하여 만들 수 있음을 이해해야 한다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체 내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
DNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로, 합성에 의해 또는 당업자가 이용할 수 있는 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이것은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합적 수단을 사용하여, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술을 사용하여 생성될 것이다. 이것에는 클로닝하려는 표적 서열의 측면에 있는 한 쌍의 프라이머(예를 들어 약 15~30개 뉴클레오티드의 것)를 만들고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉하게 하고, 원하는 영역의 증폭을 일으키는 조건 하에 PCR을 수행하고, 증폭된 단편을 단리하고(예를 들어 반응 혼합물을 아가로스 겔로 정제함으로써), 증폭된 DNA를 회수하는 것이 포함된다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 벡터로 클로닝될 수 있도록 적합한 제한 효소 인식 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.
일반적인 레트로바이러스 벡터 요소
프로모터 및 인핸서
NOI 및 폴리뉴클레오티드의 발현은 제어 서열, 예를 들어 전사 조절 요소 또는 번역 억제 요소를 사용하여 제어될 수 있는데, 이는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 신호(예를 들어 tet 리프레서(TetR) 시스템) 또는 TRIP 시스템(Transgene Repression In vector Production cell system) 또는 본원에 기재된 NOI의 다른 조절자를 포함한다.
원핵 프로모터 및 진핵 세포에서 기능성인 프로모터가 사용될 수 있다. 조직-특이적 또는 자극-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 2가지 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 요소를 포함하는 키메라 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
적합한 프로모팅 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 레트로바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 유래되거나 이종성 포유동물 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터, EF1α, CAG, TK, SV40, 유비퀴틴, PGK 또는 리보솜 단백질 프로모터로부터 유래된 것을 포함하는 강력한 프로모터이다. 대안적으로, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신(Rho), 로돕신 키나아제(RhoK), 콘-로드 호메오박스 함유 유전자(CRX), 신경 망막-특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황형 황반부 이영양증 2(VMD2), 티로신 히드록실라아제, 뉴런-특이적 뉴런-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터, 성상 세포-특이적 신경아교 원섬유 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40 / hAlb 프로모터, SV40 / CD43, SV40 / CD45, NSE / RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 데스민 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터를 사용하여 전사를 구동할 수 있다.
NOI의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 더욱 증가될 수 있다. 인핸서는 상대적으로 방향- 및 위치-독립적이지만; SV40 인핸서 및 CMV 초기 프로모터 인핸서와 같은 진핵 세포 바이러스 유래의 인핸서를 사용할 수 있다. 인핸서는 프로모터에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱되어 들어갈 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
프로모터는 적합한 표적 세포에서의 발현을 보장하거나 증가시키는 특징부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 특징부는 보존된 영역, 예를 들어 Pribnow 박스 또는 TATA 박스일 수 있다. 프로모터는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준에 영향을 주기 위한(예컨대 상기 발현 수준을 유지하거나, 향상시키거나 감소시키기 위한) 다른 서열을 함유할 수 있다. 적합한 다른 서열은 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열에는 유도성 요소, 예컨대 온도, 화학물질, 광 또는 스트레스 유도성 요소가 포함된다. 또한, 전사 또는 번역을 향상시키기 위한 적합한 요소가 존재할 수 있다.
NOI의 조절자
레트로바이러스 패키징/생산자 세포주의 생성 및 레트로바이러스 벡터 생산에서의 복잡한 요인은 NOI 및 특정 레트로바이러스 벡터 구성요소의 구성적 발현이 세포독성이어서 이러한 구성요소를 발현하는 세포의 사멸 및 그에 따른 벡터 생산불능을 초래한다는 것이다. 따라서 이러한 구성요소(예를 들어 gag-pol 및 엔벨로프 단백질, 예컨대 VSV-G)의 발현이 조절될 수 있다. 다른 비-세포독성 벡터 구성요소, 예를 들어 rev의 발현은 또한 세포에 대한 대사 부담을 최소화하도록 조절될 수 있다. 따라서 본원에 기재된 바와 같은 세포 및/또는 벡터 구성요소를 코딩하는 모듈형 구축물 또는 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 조절 요소와 결부된 세포독성 및/또는 비-세포독성 벡터 구성요소를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 관련 유전자 또는 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있는(상기 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는) 임의의 요소를 지칭한다. 조절 요소에는 유전자 스위치 시스템, 전사 조절 요소 및 번역 억제 요소가 포함된다.
많은 원핵 조절 시스템이 포유동물 세포에서 유전자 스위치를 생성하도록 개조되었다. 많은 레트로바이러스 패키징 및 생산자 세포주를 유전자 스위치 시스템(예를 들어 테트라사이클린 및 큐메이트 유도성 스위치 시스템)을 사용하여 제어하여 벡터 생산 시 하나 이상의 레트로바이러스 벡터 구성요소의 발현이 스위칭될 수 있게 하였다. 유전자 스위치 시스템에는 전사 조절자의 (TetR) 단백질 그룹의 것(예를 들어 T-Rex, Tet-On 및 Tet-Off), 전사 조절자의 큐메이트 유도성 스위치 시스템 그룹의 것(예를 들어 CymR 단백질) 및 RNA-결합 단백질을 포함하는 것(예를 들어 TRAP)이 포함된다.
하나의 이러한 테트라사이클린 유도성 시스템으로는 T-REx™ 시스템을 기반으로 하는 테트라사이클린 리프레서(TetR) 시스템이 있다. 예로서, 이러한 시스템에서 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO2)는 첫 번째 뉴클레오티드가 인간 사이토메갈로바이러스 주요 극초기 프로모터(hCMVp)의 TATATAA 요소의 마지막 뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 10 bp가 되도록 위치에 배치되며, 그 후 TetR 단독은 리프레서로서 작용할 수 있다(문헌[Yao F, Svensjo T, Winkler T, Lu M, Eriksson C, Eriksson E., 1998, Hum Gene Ther; 9: 1939-1950]). 이러한 시스템에서 NOI의 발현은 TetO2 서열의 2개의 카피가 일렬로 삽입된 CMV 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 유도제(테트라사이클린 또는 그 유사체 독시사이클린[dox])의 부재 하에서 TetR 동종이량체는 TetO2 서열에 결합하고 상류 CMV 프로모터로부터의 전사를 물리적으로 차단한다. 유도제는, 존재하는 경우, TetR 동종이량체에 결합하여 이것이 더 이상 TetO2 서열에 결합할 수 없도록 알로스테릭 변화를 일으켜 유전자 발현을 초래한다. TetR 유전자는 코돈 최적화될 수 있으며, 그 이유는 이것이 번역 효율을 개선하여 TetO2 제어되는 유전자 발현을 더 엄격하게 제어하는 것으로 밝혀졌기 때문이다.
TRIP 시스템은 WO 2015/092440에 기재되어 있으며 벡터 생산 동안 생산 세포에서 NOI의 발현을 억제하는 또 다른 방법을 제공한다. 트랜스진을 구동시키는 구성적 및/또는 강력 프로모터(조직-특이적 프로모터를 포함)가 바람직한 경우 및 특히 생산 세포에서의 트랜스진 단백질의 발현이 트랜스진-유래 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 생체 내에서 면역 반응을 유발하고/하거나 벡터 역가를 감소시키는 경우, TRAP-결합 서열(예를 들어 TRAP-tbs) 상호작용은 레트로바이러스 벡터 생산을 위한 트랜스진 단백질 억제 시스템의 기초를 형성한다(문헌[Maunder et al, Nat Commun. (2017) Mar 27; 8]).
간략하게는, TRAP-tbs 상호작용은 번역 블록을 형성하여 트랜스진 단백질의 번역을 억제한다(문헌[Maunder et al, Nat Commun. (2017) Mar 27; 8]). 번역 블록은 생산 세포에서만 효과적이며, 따라서 DNA- 또는 RNA-기반 벡터 시스템을 방해하지 않는다. TRiP 시스템은 트랜스진 단백질이 단일 또는 다중 시스트론 mRNA로부터의 조직-특이적 프로모터를 포함하여 구성적 및/또는 강력 프로모터로부터 발현되는 경우 번역을 억제할 수 있다. 트랜스진 단백질의 조절되지 않은 발현이 벡터 역가를 감소시키고 벡터 생성물 품질에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다. 일시적인 그리고 안정적인 PaCL/PCL 벡터 생산 시스템 둘 모두에 대한 트랜스진 단백질의 억제는 다음과 같은 경우 생산 세포에 있어서 벡터 역가의 감소를 방지하는 데 유익하다: 독성 또는 분자 부담 문제가 세포 스트레스로 이어질 수 있는 경우; 트랜스진 단백질이 트랜스진-유래 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 생체 내에서 면역 반응을 유발하는 경우; 유전자-편집 트랜스진의 사용이 표적 온/오프(on/off)에 영향을 미칠 수 있는 경우; 트랜스진 단백질이 벡터 및/또는 엔벨로프 당단백질 배제에 영향을 미칠 수 있는 경우.
엔벨로프 및 슈도타이핑(Pseudotyping)
하나의 바람직한 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터는 슈도타이핑되었다. 이와 관련하여 슈도타이핑은 하나 이상의 장점을 부여할 수 있다. 예를 들어, HIV 기반 벡터의 env 유전자 산물은 이러한 벡터가 CD4로 칭해지는 단백질을 발현하는 세포만을 감염시키도록 제한한다. 그러나 이러한 벡터의 env 유전자가 다른 엔벨로프 바이러스의 env 서열로 치환된 경우에는 이것은 더 넓은 감염 스펙트럼을 가질 수 있다(문헌[Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242). 예로서, 작업자는 VSV 유래의 당단백질로 HIV 기반 벡터를 슈도타이핑하였다(문헌[Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242]).
또 다른 대안에서, Env 단백질은 돌연변이 또는 엔지니어링된 Env 단백질과 같은 변형된 Env 단백질일 수 있다. 표적화 능력을 도입하거나 독성을 감소시키거나 다른 목적을 위해 변형이 이루어지거나 선택될 수 있다(문헌[Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64]; 문헌[Nilson et al (1996) Gene Ther 3(4):280-286]; 및 문헌[Fielding et al (1998) Blood 91(5):1802-1809] 및 그 안에 인용된 참고문헌).
벡터는 선택된 임의의 분자로 슈도타이핑될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "env"는 본원에 기재된 바와 같이, 내인성 렌티바이러스 엔벨로프 또는 이종 엔벨로프를 의미할 것이다.
VSV-G
랍도바이러스인 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 엔벨로프 당단백질(G)은 특정 엔벨로프 바이러스 및 바이러스 벡터 비리온을 슈도타이핑할 수 있는 것으로 밝혀진 엔벨로프 단백질이다.
임의의 레트로바이러스 엔벨로프 단백질의 부재 하에 MoMLV 기반 레트로바이러스 벡터를 슈도타이핑하는 능력은 처음에 문헌[Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207]에 예시되었다. WO 1994/294440은 레트로바이러스 벡터가 VSV-G로 성공적으로 슈도타이핑될 수 있음을 교시한다. 이러한 슈도타이핑된 VSV-G 벡터는 광범위한 포유동물 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 더욱 최근에는 문헌[Abe et al. (1998) J Virol 72(8) 6356-6361]에 비감염성 레트로바이러스 입자가 VSV-G의 첨가에 의해 감염성이 될 수 있음이 교시되어 있다.
문헌[Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7]은 레트로바이러스 MLV를 VSV-G로 성공적으로 슈도타이핑했으며, 이는 천연 형태의 MLV와 비교하여 변경된 숙주 범위를 갖는 벡터를 생성하였다. VSV-G 슈도타이핑 벡터는 포유동물 세포뿐만 아니라 어류, 파충류 및 곤충으로부터 유래된 세포주도 감염시키는 것으로 나타났다(상기 문헌[Burns et al. (1993)]). 상기 벡터는 또한 다양한 세포주에 대해 전통적인 암포트로픽(amphotropic) 엔벨로프보다 더 효율적인 것으로 나타났다(문헌[Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9564-9568], 문헌[Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207]). VSV-G 단백질은 세포질 테일이 레트로바이러스 코어와 상호작용할 수 있기 때문에 특정 레트로바이러스를 슈도타이핑하는 데 사용할 수 있다.
VSV-G 단백질과 같은 비-레트로바이러스 슈도타이핑 엔벨로프의 제공은 벡터 입자가 감염성의 손실 없이 높은 역가까지 농축될 수 있다는 장점을 제공한다(문헌[Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5]). 레트로바이러스 엔벨로프 단백질은 명백하게 초웜심분리 동안 전단력을 견딜 수 없으며, 그 이유는 아마도 상기 단백질이 2개의 비공유적으로 연결된 서브유닛으로 이루어지기 때문일 것이다. 서브유닛 사이의 상호작용은 원심분리에 의해 파괴될 수 있다. 이에 비해 VSV 당단백질은 단일 단위로 구성된다. 따라서 VSV-G 단백질 슈도타이핑은 효율적인 표적 세포 감염/형질도입과 제조 공정 중에 잠재적인 장점을 제공할 수 있다.
WO 2000/52188은 막-결부 바이러스 엔벨로프 단백질로서 소포성 구내염 바이러스-G 단백질(VSV-G)을 갖는 안정한 생산자 세포주로부터의 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터의 생성을 기재하고 있으며, VSV-G 단백질에 대한 유전자 서열을 제공한다.
로스 리버(Ross River) 바이러스
로스 리버 바이러스 엔벨로프는 비영장류 렌티바이러스 벡터(FIV)를 슈도타이핑하는 데 사용되었으며 전신 투여 후 주로 간을 형질도입하였다(문헌[Kang et al., 2002, J. Virol., 76:9378-9388]). 효율은 VSV-G 슈도타이핑된 벡터로 얻어진 것보다 20배 더 큰 것으로 보고되었으며, 간독성을 시사하는 간 효소의 혈청 수준으로 측정했을 때 더 적은 세포독성을 야기하였다.
바큘로바이러스 GP64
바큘로바이러스 GP64 단백질은 임상 및 상업적 적용에 필요한 고역가 바이러스의 대규모 생산에 사용되는 바이러스 벡터를 위한 VSV-G의 대안인 것으로 나타났다(문헌[Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J (2003) Hum Gene Ther. 14(1):67-77]). VSV-G-슈도타이핑된 벡터와 비교하여 GP64-슈도타이핑된 벡터는 유사한 넓은 향성 및 유사한 천연 역가를 갖는다. GP64 발현은 세포를 죽이지 않기 때문에 GP64를 구성적으로 발현하는 HEK293T-기반 세포주가 생성될 수 있다.
대체 엔벨로프
EIAV를 슈도타이핑하는 데 사용될 때 합리적인 역가를 제공하는 다른 엔벨로프는 모콜라, 광견병, 에볼라 및 LCMV(림프구성 맥락수막염 바이러스)를 포함한다. 4070A로 슈도타이핑된 렌티마이러스의 마우스 내로의 정맥내 주입은 간에서 최대 유전자 발현을 초래하였다.
패키징 서열
본 발명의 문맥 내에서 이용되는 바와 같이, 용어 "패키징 신호"는 "패키징 서열" 또는 "psi"로서 상호교환가능하게 지칭되며, 바이러스 입자 형성 중에 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡시드화에 필요한 비코딩, 시스-작용 서열을 지칭하는 데 사용된다. HIV-1에서, 이 서열은 주요 스플라이스 공여 부위(SD)의 상류로부터 적어도 gag 시작 코돈(뉴클레오티드 688에 대한 gag의 5' 서열 중 일부 또는 전부가 포함될 수 있음)까지 연장되는 유전자좌에 매핑되었다. EIAV에서 패키징 신호는 R 영역이 Gag의 5' 코딩 영역 내에 있는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연장된 패키징 신호" 또는 "연장된 패키징 서열"은 gag 유전자 내로 추가로 확장된 psi 서열 주위의 서열의 사용을 지칭한다. 이러한 추가적인 패키징 서열의 포함은 벡터 RNA를 바이러스 입자 내로 삽입하는 효율을 증가시킬 수 있다.
고양이 면역결핍 바이러스(FIV) RNA 캡시드화 결정자들은 이산적이고 비연속적인 것으로 나타났으며, 이는 게놈 mRNA(R-U5)의 5' 말단에 있는 한 영역과 gag의 근위 311 nt 내에 매핑되는 또 다른 영역을 포함한다(문헌[Kaye et al., J Virol. Oct;69(10):6588-92 (1995)]).
내부 리보솜 진입 부위(IRES)
IRES 요소의 삽입은 단일 프로모터로부터의 다중 코딩 영역의 발현을 가능하게 한다(문헌[Adam et al(상기와 같음)]; 문헌[Koo et al (1992) Virology 186:669-675]; 문헌[Chen et al 1993 J. Virol 67:2142-2148]). IRES 요소는 바이러스 단백질의 캡-독립적 번역을 촉진하는 피코르나바이러스의 비번역 5' 말단에서 처음 발견되었다(문헌[Jang et al (1990) Enzyme 44: 292-309]). RNA의 오픈 리딩 프레임들 사이에 위치할 때 IRES 요소는 IRES 요소에서 리보솜의 진입을 촉진한 후 하류 번역 개시를 촉진하여 하류 오픈 리딩 프레임의 효율적인 번역을 허용한다.
IRES에 대한 리뷰가 문헌[Mountford and Smith (TIG May 1995 vol 11, No 5:179-184)]에 제시되어 있다. 다수의 상이한 IRES 서열이 공지되어 있으며, 이는 다음으로부터의 것을 포함한다: 뇌심근염 바이러스(EMCV)(문헌[Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991)]); BiP 단백질[Macejak and Sarnow, Nature 353 :91 (1991)], 초파리(Drosophila)의 Antennapedia 유전자(엑손 d 및 e)(문헌[Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)] 및 소아마비 바이러스(PV)의 것(문헌[Pelletier and Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988)]; 또한 문헌[Mountford and Smith, TIG 11, 179-184 (1985)] 참조].
PV, EMCV 및 돼지 수포병 바이러스 유래의 IRES 요소는 이전에 레트로바이러스 벡터에서 사용되었다(문헌[Coffin et al(상기와 같음)].
용어 "IRES"는 IRES로서 작용하거나 IRES의 기능을 개선하는 임의의 서열 또는 서열들의 조합을 포함한다. IRES(들)는 바이러스 기원(예를 들어 EMCV IRES, PV IRES 또는 FMDV 2A-유사 서열) 또는 세포 기원(예를 들어 FGF2 IRES, NRF IRES, Notch 2 IRES 또는 EIF4 IRES)일 수 있다.
IRES가 각 폴리뉴클레오티드의 번역을 개시할 수 있기 위해서는 이것은 모듈형 구축물에서 폴리뉴클레오티드 사이 또는 앞에 위치해야 한다.
안정적인 세포주 개발에 사용되는 뉴클레오티드 서열은 안정적인 통합이 발생한 세포를 선발하기 위한 선발가능 마커의 부가를 필요로 한다. 이러한 선발가능 마커는 뉴클레오티드 서열 내에서 단일 전사 단위로 발현될 수 있거나, 폴리시스트론 메시지에서 선발가능 마커의 번역을 개시하기 위해 IRES 요소를 사용하는 것이 바람직할 수 있다(문헌[Adam et al 1991 J. Virol. 65, 4985]).
유전자 방향 및 인슐레이터
핵산은 방향성이 있으며 이것이 궁극적으로 세포에서의 전사 및 복제와 같은 메커니즘에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 유전자는 동일한 핵산 구축물의 일부일 때 서로에 대해 상대적인 방향을 가질 수 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 세포 또는 구축물에서 동일한 유전자좌에 존재하는 적어도 2개의 핵산 서열은 역방향 및/또는 교대 방향일 수 있다. 환언하면, 본 발명의 특정 실시 형태에서 이 특정 유전자좌에서 순차적인 유전자들의 쌍은 동일한 방향을 갖지 않을 것이다. 이는 해당 영역이 숙주 세포의 동일한 물리적 위치 내에서 발현될 때 전사 및 번역 리드-스루 둘 모두를 방지하는 데 도움이 될 수 있다.
교대 방향을 갖는 것은 벡터 생산에 필요한 핵산이 세포 내의 동일한 유전자좌에 기반할 때 레트로바이러스 벡터 생산에 도움이 된다. 이는 다시, 복제-적격 레트로바이러스 벡터의 생성을 방지하는 데 있어서의 생성된 구축물의 안전성을 또한 향상시킬 수 있다.
핵산 서열이 역방향 및/또는 교대 방향인 경우 인슐레이터를 사용하면 유전적 환경으로부터의 NOI의 부적절한 발현 또는 침묵을 방지할 수 있다.
용어 "인슐레이터"는 인슐레이터-결합 단백질에 결합될 때 주변 조절자 신호로부터 유전자를 보호하는 능력을 갖는 DNA 서열 요소의 부류를 지칭한다. 인핸서 차단 기능과 염색질 장벽 기능의 두 가지 유형의 인슐레이터가 있다. 인슐레이터가 프로모터와 인핸서 사이에 위치할 때 인슐레이터의 인핸서 차단 기능은 인핸서의 전사-증강 영향으로부터 프로모터를 보호한다(문헌[Geyer and Corces 1992]; 문헌[Kellum and Schedl 1992]). 염색질 장벽 인슐레이터는 전사 활성 염색질 영역이 전사 불활성 염색질 영역으로 전환되어 유전자 발현의 침묵을 초래하는 근처의 응축된 염색질의 진행을 방지함으로써 기능한다. 헤테로크로마틴의 확산을 억제하고, 이에 따라 유전자 침묵을 억제하는 인슐레이터는 이 과정을 방지하기 위해 히스톤 변형에 관여하는 효소를 모집한다(문헌[Yang J, Corces VG. 2011;110:43-76]; 문헌[Huang, Li et al. 2007]; 문헌[Dhillon, Raab et al. 2009]). 인슐레이터는 이러한 기능 중 하나 또는 둘 모두를 가질 수 있으며 닭 β-글로빈 인슐레이터(cHS4)가 하나의 그러한 예이다. 이 인슐레이터는 가장 광범위하게 연구된 척추동물 인슐레이터이며, G+C가 매우 풍부하고 인핸서 차단 및 헤테로크로마틴 장벽 기능 둘 모두를 갖는다(문헌[Chung J H, Whitely M, Felsenfeld G. Cell. 1993;74:505-514]). 인핸서 차단 기능을 가진 다른 그러한 인슐레이터는 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 인간 β-글로빈 인슐레이터 5(HS5), 인간 β-글로빈 인슐레이터 1(HS1) 및 닭 β-글로빈 인슐레이터(cHS3)(문헌[Farrell　CM1,　West AG,　Felsenfeld G., Mol Cell Biol.　2002 Jun;22(11):3820-31]; 문헌[J Ellis et al. EMBO J. 1996 Feb 1; 15(3): 562-568]). 원하지 않는 원위 상호작용을 감소시키는 것에 더하여 인슐레이터는 또한, 인접한 레트로바이러스 핵산 서열들 사이의 프로모터 간섭(즉, 하나의 전사 단위로부터의 프로모터가 인접한 전사 단위의 발현을 손상시키는 경우)을 방지하는 데 도움을 준다. 각각의 레트로바이러스 벡터 핵산 서열 사이에 인슐레이터가 사용되는 경우 직접적 리드-스루의 감소는 복제-적격 레트로바이러스 벡터 입자의 형성을 방지하는 데 도움을 준다.
인슐레이터는 각각의 레트로바이러스 핵산 서열 사이에 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, 인슐레이터의 사용은, 프로모터-인핸서 상호작용이 벡터 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 하나의 NOI 발현 카세트가 다른 NOI 발현 카세트와 상호작용하지 못하게 한다.
인슐레이터가 벡터 게놈과 gag-pol 서열 사이에 존재할 수 있다. 따라서 이것은 복제-적격 레트로바이러스 벡터 및 RNA 전사체와 같은 '야생형'의 생산 가능성을 제한하여 구축물의 안전성 프로파일을 향상시킨다. 안정적으로 통합된 다중유전자 벡터의 발현을 개선하기 위한 인슐레이터 요소의 사용은 문헌[Moriarity et al, Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(8):e92]에 인용되어 있다.
벡터 역가
당업자는 렌티바이러스 벡터의 역가를 결정하는 다수의 상이한 방법들이 있음을 이해할 것이다. 역가는 종종 형질도입 단위/mL(TU/mL)로 기재된다. 역가는 벡터 입자의 수를 증가시킴으로써 그리고 벡터 제제의 비활성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
치료적 용도
본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 또는 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직은 의학에서 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터, 본 발명의 생산 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직은 관심 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 본 발명의 렌티바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포의 이러한 용도는 전술한 바와 같이 치료 또는 진단 목적을 위한 것일 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포가 제공된다.
"바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된 세포"는 바이러스 벡터 입자에 의해 운반된 핵산이 전달된 세포, 특히 표적 세포로 이해되어야 한다.
바람직한 실시 형태에서, 관심 뉴클레오티드는 치료 효과를 발생시킨다.
"표적 세포"는 NOI를 발현하고자 하는 세포로 이해되어야 한다. NOI는 본 발명의 바이러스 벡터를 사용하여 표적 세포에 도입될 수 있다. 표적 세포로의 전달은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
NOI는 치료적 또는 진단적 응용을 가질 수 있다. 적합한 NOI는 효소, 보조 인자, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 항산화제 분자, 엔지니어링된 면역글로불린-유사 분자, 단쇄 항체, 융합 단백질, 면역 공동자극 분자, 면역조절 분자, 키메라 항원 수용체, 표적 단백질의 트랜스도메인 음성 돌연변이체, 독소, 조건부 독소, 항원, 전사 인자, 구조 단백질, 리포터 단백질, 세포내 국소화(subcellular localization) 신호, 종양 억제 단백질, 성장 인자, 막 단백질, 수용체, 혈관활성 단백질 및 펩티드, 항바이러스 단백질 및 리보자임, 및 이들의 유도체(예컨대 관련 리포터 그룹을 갖는 유도체)를 코딩하는 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. NOI는 또한 마이크로-RNA를 코딩할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 마이크로-RNA의 프로세싱은 TRAP에 의해 억제될 것으로 여겨진다.
일 실시 형태에서, NOI는 신경퇴행성 장애의 치료에 유용할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 파킨슨병의 치료에 유용할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 도파민 합성에 관여하는 효소(들)을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 효소는 다음 중 하나 이상일 수 있다: 티로신 히드록실라아제, GTP-시클로히드롤라아제 I 및/또는 방향족 아미노산 도파 데카르복실라아제. 세 유전자 모두의 서열이 입수가능하다(각각 GenBank® 등록 번호 X05290, U19523 및 M76180).
또 다른 실시 형태에서, NOI는 소포 모노아민 수송체 2(VMAT2)를 코딩할 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 바이러스 게놈은 방향족 아미노산 도파 데카르복실라아제를 코딩하는 NOI 및 VMAT2를 코딩하는 NOI를 포함할 수 있다. 그러한 게놈은 특히 L-DOPA의 말초 투여와 함께 파킨슨병의 치료에 사용될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서 NOI는 치료용 단백질 또는 치료용 단백질들의 조합을 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 신경아교 세포 유래 신경영양 인자(GDNF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 인터루킨-1 베타(IL-1β), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인슐린 성장 인자-2, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C/VEGF-2, VEGF-D, VEGF-E, PDGF-A, PDGF-B, PDFG-A 및 PDFG-B의 헤테로- 및 호모-이량체로 이루어진 군으로부터 선택되 단백질(들)을 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 혈소판 인자 4, 색소 상피 유래 인자(PEDF), 태반 성장 인자, 레스틴, 인터페론-α, 인터페론-유도성 단백질, 그로-베타 및 튜브다운-1, 인터루킨(IL)-1, IL-12, 레틴산, 항-VEGF 항체 또는 이의 단편/변이체, 예컨대 애플리버셉트, 트롬보스폰딘, VEGF 수용체 단백질, 예컨대 US 5,952,199 및 US 6,100,071에 기재된 것, 및 항-VEGF 수용체 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항혈관형성 단백질(들)을 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 NF-kB 억제제, IL1베타 억제제, TGF베타 억제제, IL-6 억제제, IL-23 억제제, IL-18 억제제, 종양 괴사 인자 알파 및 종양 괴사 인자 베타, 림포톡신 알파 및 림포톡신 베타, LIGHT 억제제, 알파 시누클레인 억제제, Tau 억제제, 베타 아밀로이드 억제제, IL-17 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항염증 단백질, 항체 또는 단백질 또는 항체의 단편/변이체를 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서 NOI는 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자(CFTR)를 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서 NOI는 안구 세포에서 정상적으로 발현되는 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 광수용기 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포에서 정상적으로 발현되는 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, NOI는 RPE65, 아릴히드로카본-상호작용 수용체 단백질 유사 1(AIPL1), CRB1, 레시틴 레티날 아세틸트랜스퍼레이스(LRAT), 광수용체-특이적 호메오 박스(CRX), 레티날 구아닐레이트 사이클라아제(GUCY2D), RPGR 상호작용 단백질 1(RPGRIP1), LCA2, LCA3, LCA5, 디스트로핀, PRPH2, CNTF, ABCR/ABCA4, EMP1, TIMP3, MERTK, ELOVL4, MYO7A, USH2A, VMD2, RLBP1, COX-2, FPR, 하모닌, Rab 에스코트 단백질 1, CNGB2, CNGA3, CEP 290, RPGR, RS1, RP1, PRELP, 글루타티온 경로 효소 및 옵티신을 포함하는 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩할 수 있다.
다른 실시 형태에서, NOI는 인간 응고 인자 VIII 또는 인자 IX를 코딩할 수 있다.
다른 실시 형태에서, NOI는 페닐알라닌 히드록실라아제(PAH), 메틸말로닐 CoA 뮤타아제, 프로피오닐 CoA 카르복실라아제, 이소발레릴 CoA 데히드로게나아제, 분지쇄 케토산 데히드로게나아제 복합체, 글루타릴 CoA 데히드로게나아제, 아세틸 CoA 카르복실라아제, 프로피오닐 CoA 카르복실라아제, 3 메틸 크로토닐 CoA 카르복실라아제, 피루베이트 카르복실라아제, 카르바모일-포스페이트 신타아제, 암모니아, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제, 글루코실세라미다아제 베타, 알파 갈락토시다아제 A, 글루코실세라미다아제 베타, 시스티노신, 글루코사민(N-아세틸)-6-술파타아제, N-아세틸- 알파-글루코사미니다아제, N-술포글루코사민 술포히드롤라아제, 갈락토사민-6 술파타아제, 아릴술파타아제 A, 사이토크롬 B-245 베타, ABCD1, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제, 아르기니노숙시네이트 신타아제, 아르기니노숙시네이트 라이아제, 아르기나아제 1, 알라닌 글리옥실레이트 아미노 트랜스퍼라아제, ATP-결합 카세트, 서브패밀리 B 구성원을 포함하는 군으로부터 선택되는 대사에 관여하는 단백질(들)을 코딩할 수 있다.
다른 실시 형태에서, NOI는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 코딩할 수 있다. 일 실시 형태에서, CAR은 항-5T4 CAR이다. 다른 실시 형태에서, NOI는 B-세포 성숙 항원(BCMA), CD19, CD22, CD20, CD47, CD138, CD30, CD33, CD123, CD70, 전립선 특이 막 항원(PSMA), 루이스 Y 항원(LeY), 티로신-단백질 키나아제 막관통 수용체(ROR1), 뮤신 1, 세포 표면 결부(Muc1), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 내피 성장 인자 수용체(EGFR), 인슐린, 단백질 티로신 포스파타아제, 비-수용체 타입 22, 인터류킨 2 수용체 알파, 헬리카아제 C 도메인 1로 유도된 인터페론, 인간 표피 성장 인자 수용체(HER2), 글리피칸 3(GPC3), 디시알로강글리오시드(GD2), 메시오텔린, 소포 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2)를 코딩할 수 있다.
다른 실시 형태에서, NOI는 ULBP1, 2 및 3, H60, Rae-1a, b, g, d, MICA, MICB를 포함하는 군으로부터 선택되는 NKG2D 리간드에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩할 수 있다.
추가 실시 형태에서 NOI는 SGSH, SUMF1, GAA, 공통 감마 사슬(CD132), 아데노신 데아미나아제, WAS 단백질, 글로빈, 알파 갈락토시다아제 A, δ-아미노레불리네이트(ALA) 신타아제, δ-아미노레불리네이트 데히드라타아제(ALAD), 히드록시메틸빌란(HMB) 신타아제, 유로포르피리노겐(URO) 신타아제, 유로포르피리노겐(URO) 데카르복실라아제, 코프로포르피리노겐(COPRO) 옥시다아제, 프로토포르피리노겐(PROTO) 옥시다아제, 페로킬라타아제, α-L-이두로니다아제, 이두로네이트 술파타아제, 헤파란 술파미다아제, N-아세틸글루코사미니다아제, 헤파란-α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라아제, 3N-아세틸글루코사민 6-술파타아제, 갈락토스-6-술페이트 술파타아제, β-갈락토시다아제, N-아세틸갈락토사민-4-술파타아제, β-글루쿠로니다아제 및 히알루로니다아제를 코딩할 수 있다.
NOI에 더하여, 벡터는 또한 siRNA, shRNA 또는 조절된 shRNA를 포함하거나 코딩할 수 있다. (문헌[Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295], 문헌[Silva et al. (2005) Nature Genetics 37:1281-1288]).
적응증
본 발명에 따른, 레트로바이러스 및 AAV 벡터를 포함하는 벡터는 WO 1998/05635, WO 1998/07859, WO 1998/09985에 열거된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 NOI(들)를 전달하는 데 사용될 수 있다. 관심 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 그러한 질환의 예는 아래에 주어져 있다:
다음의 것에 반응하는 장애: 사이토카인 및 세포 증식/분화 활성; 면역억제 또는 면역자극 활성(예를 들어 림프구 성장의 조절, 인간 면역결핍 바이러스 감염을 포함한 면역 결핍의 치료; 암 및 많은 자가면역 질환의 치료를 위해, 그리고 이식 거부 예방 또는 종양 면역 유도를 위해); 조혈 조절(예를 들어 골수성 또는 림프성 질환의 치료); 뼈, 연골, 건, 인대 및 신경 조직의 성장 촉진(예를 들어 창상 치유, 화상, 궤양 및 치주 질환 및 신경퇴행의 치료를 위해); 난포 자극 호르몬의 억제 또는 활성화(생식력 조절); 화학주성/화학동력학 활성(예를 들어 손상 또는 감염 부위에 특정 세포 유형을 동원); 지혈 및 혈전 용해 활성(예를 들어 혈우병 및 뇌졸중의 치료를 위해); 항염증 활성(예를 들어, 패혈성 쇼크 또는 크론병의 치료를 위해); 대식세포 억제 및/또는 T 세포 억제 활성 및 이에 따른 항염증 활성; 항면역 활성(즉, 염증과 관련되지 않은 반응을 포함하는 세포 및/또는 체액성 면역 반응에 대한 억제 효과); 대식세포 및 T 세포가 세포외 매트릭스 구성요소 및 피브로넥틴에 부착하는 능력의 억제와, T 세포에서 상향 조절된 fas 수용체 발현.
암, 백혈병, 양성 및 악성 종양 성장, 침윤 및 확산, 혈관형성, 전이, 복수 및 악성 흉막 삼출을 포함하는 악성 질환.
류마티스 관절염을 포함한 관절염, 과민증, 알러지 반응, 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 콜라겐 질환 및 기타 질환을 포함하는 자가면역 질환.
동맥경화증, 죽상동맥경화성 심장 질환, 재관류 손상, 심정지, 심근 경색증, 혈관 염증 질환, 호흡 곤란 증후군, 심혈관 영향, 말초 혈관 질환, 편두통 및 아스피린 의존성 항혈전증, 뇌졸중, 뇌 허혈, 허혈성 심장 질환 또는 기타 질환을 포함하는 혈관 질환.
소화성 궤양, 궤양성 대장염, 크론병 및 기타 질환을 포함하는 위장관 질환.
간 섬유증, 간 경변증을 포함하는 간 질환.
페닐케톤뇨증 PKU, 윌슨병, 유기산혈증, 요소 순환 장애, 담즙 정체 및 기타 질환을 포함하는 유전성 대사 장애.
갑상선염 또는 기타 샘 질환, 사구체신염 또는 기타 질환을 포함하는 신장 및 비뇨기과 질환.
이염 또는 기타 이비후두 질환, 피부염 또는 기타 피부 질환을 포함하는 귀, 코 및 인후 장애.
치주 질환, 치주염, 치은염 또는 기타 치과/구강 질환을 포함하는 치과 및 구강 장애.
고환염 또는 부고환 고환염, 불임, 고환 외상 또는 기타 고환 질환을 포함하는 고환 질환.
태반 기능 이상, 태반 기능 부전, 습관성 유산, 자간증, 전자간증, 자궁 내막증 및 기타 부인과 질환을 포함하는 부인과 질환.
안과 장애, 예컨대 LCA10을 포함한 레베르 선천성 흑암시(LCA), 후포도막염, 중간포도막염, 전포도막염, 결막염, 맥락망막염, 포도망막염, 시신경염, 개방각 녹내장 및 소아 선천성 녹내장을 포함한 녹내장, 안내 염증, 예를 들어 망막염 또는 낭포성 황반 부종, 교감성 안염, 공막염, 색소성 망막염, 연령 관련 황반 변성(AMD)을 포함한 황반 변성 및 베스트병, 베스트 난황형 황반 변성, 스타가르트병, 어셔 증후군, 도인 허니콤 망막 이영양증(Doyne's honeycomb retinal dystrophy), 소르비 황반 이영양증을 포함한 청소년 황반 변성, 연소망막층간분리, 추간체 이영양증, 각막 이영양증, 푹씨 이영양증, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 유전성 시신경병증(LHON), 아디증후군, 오구치병, 퇴행성 폰두스병, 안구 외상, 감염에 의해 야기된 안구 염증, 증식 유리체 망막병증, 급성 허혈성 시신경병증, 과도한 반흔, 예를 들어 녹내장 여과 수술 후의 것, 안구 임플란트에 대한 반응, 각막 이식 이식편 거부 및 기타 안과 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐색증, RLBP1-관련 망막 이영양증, 맥락막 결손 및 색맹.
다음을 포함하는 신경계 및 신경퇴행성 장애: 파킨슨병, 파킨슨병 치료로 인한 합병증 및/또는 부작용, AIDS 관련 치매 복합 HIV 관련 뇌병증, 데빅병, 시덴햄 무도병, 알츠하이머병 및 기타 퇴행성 질환, CNS의 병태 또는 장애, 뇌졸중, 소아마비 후 증후군, 정신 장애, 척수염, 뇌염, 아급성 경화성 범뇌염, 뇌척수염, 급성 신경병증, 아급성 신경병증, 만성 신경병증, 파브리병, 고셔병, 시스틴증, 폼페병, 이색성 백질이영양증, 위스콧 알드리치 증후군, 부신백질이영양증 , 베타-지중해빈혈, 겸상 적혈구병, 길랭-바레 증후군, 시덴함 무도병, 중증 근무력증, 가성 뇌종양, 다운 증후군, 헌팅톤병, CNS 압박 또는 CNS 외상 또는 CNS의 감염, 근육 위축 및 이영양증, 중추 및 말초 신경계의 질환, 병태 또는 장애, 근위축성 측색 경화증을 포함한 운동 뉴런 질환, 척수성 근위축증, 척수 및 견열 손상.
기타 질환 및 병태, 예컨대 낭포성 섬유증, 다음을 포함한 점액다당류증: 산필리포 증후군 A, 산필리포 증후군 B, 산필리포 증후군 C, 산필리포 증후군 D, 헌터 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 모르퀴오 증후군, ADA-SCID, X-연관 SCID, X-연관 만성 육아종 질환, 포르피린증, 혈우병 A, 혈우병 B, 외상 후 염증, 출혈, 응고 및 급성기 반응, 악액질, 식욕 부진, 급성 감염, 패혈성 쇼크, 전염병, 진성 당뇨병, 수술 합병증 또는 부작용, 골수 이식 또는 기타 이식 합병증 및/또는 부작용, 천연 또는 인공 세포, 조직 및 기관, 예컨대 각막, 골수, 장기, 렌즈, 맥박 조정기, 천연 또는 인공 피부 조직을 이식하는 경우 이식 거부의 예방 및/또는 치료를 위해 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 억제 또는 저해하기 위한 유전자 요법의 합병증 및 부작용, 예를 들어 바이러스 캐리어 또는 AIDS로 인한 감염으로 인한 것.
siRNA, 마이크로-RNA 및 shRNA
특정한 다른 실시 형태에서, NOI는 마이크로-RNA를 포함한다. 마이크로-RNA는 유기체에서 자연적으로 생성되는 작은 RNA의 매우 큰 그룹으로, 이의 적어도 일부는 표적 유전자의 발현을 조절한다. 마이크로-RNA 패밀리의 창립 구성원은 let-7과 lin-4이다. let-7 유전자는 벌레 발생 동안 내인성 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 작고 고도로 보존된 RNA 종을 코딩한다. 활성 RNA 종은 처음에 대략 70 nt 전구체로 전사되며, 이는 성숙한 대략 21 nt 형태로 전사 후 프로세싱된다. let-7과 lin-4는 모두 헤어핀 RNA 전구체로 전사되며, 상기 전구체는 Dicer 효소에 의해 그의 성숙한 형태로 프로세싱된다.
NOI에 더하여, 벡터는 또한 siRNA, shRNA 또는 조절된 shRNA를 포함하거나 코딩할 수 있다(문헌[Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295], 문헌[Silva et al. (2005) Nature Genetics 37:1281-1288]).
이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 매개되는 전사 후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing; PTGS)은 외래 유전자의 발현을 제어하기 위한 보존된 세포 방어 메커니즘이다. 바이러스 또는 트랜스포존과 같은 요소의 무작위 통합은 상동성 단일 가닥 mRNA 또는 바이러스 게놈 RNA의 서열 특이적 분해를 활성화하는 dsRNA의 발현을 유발하는 것으로 생각된다. 침묵 효과는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려져 있다(문헌[Ralph et al. (2005) Nature Medicine 11:429-433]). RNAi의 메커니즘은 긴 dsRNA를 약 21~25개 뉴클레오티드(nt) RNA의 듀플렉스로 프로세싱하는 것을 포함한다. 이러한 생성물을 mRNA 분해의 서열 특이적 매개체인 작은 간섭 또는 침묵 RNA(siRNA)라고 한다. 분화된 포유동물 세포에서, dsRNA >30 bp는 인터페론 반응을 활성화시켜 단백질 합성의 차단 및 비특이적 mRNA 분해를 초래하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Stark et al., Annu Rev Biochem 67:227-64 (1998)]). 그러나 이 반응은 21 nt siRNA 듀플렉스를 사용함으로써 우회될 수 있으며(문헌[Elbashir et al., EMBO J. Dec 3;20(23):6877-88 (2001)], 문헌[Hutvagner et al., Science.Aug 3, 293(5531):834-8. Eupub Jul 12 (2001)]), 이는 배양된 포유동물 세포에서 유전자 기능을 분석할 수 있게 한다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된, 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 또는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 유전자 요법에 의해 개체를 치료하기 위한 제약 조성물을 제공하며, 여기서, 조성물은 치료적 유효량의 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 제약 조성물은 인간 또는 동물용일 수 있다.
조성물은 제약상 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아쥬반트를 포함할 수 있다. 제약적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 제약 관행과 관련하여 이루어질 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제에 더하여 임의의 적합한 결합제(들), 활택제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들) 및 표적 부위로의 벡터 진입을 돕거나 증가시킬 수 있는 기타 담체 제제(예를 들어, 지질 전달 시스템)를 포함할 수 있거나 이것일 수 있다.
적절한 경우, 조성물은 다음 중 임의의 하나 이상에 의해 투여될 수 있거나: 흡입에 의해; 좌약 또는 페서리 형태로; 로션, 용액, 크림, 연고 또는 환의의 형태로 국소적으로; 피부 패치의 사용에 의해; 전분 또는 유당과 같은 부형제를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독의 또는 부형제와 혼합된 캡슐 또는 오뷸 형태로, 또는 착향제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구적으로; 또는 이들은 비경구적으로, 예를 들어 해면내로, 정맥내로, 근육내로, 두개내로, 안구내로, 복강내로 또는 피하로 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있는 살균 수성 용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 협측 또는 설하 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지의 형태로 투여될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 외에서 표적 세포 또는 표적 조직을 형질도입한 후 상기 표적 세포 또는 조직을 이를 필요로 하는 환자에게 전달할 수 있다. 이러한 세포의 예는 자가 T 세포일 수 있고 이러한 조직의 예는 기증자 각막일 수 있다.
변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 단편
본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드에 더하여, 본 발명은 또한 이의 변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 단편의 사용을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 임의의 주어진 서열의 변이체는 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 그의 내인성 기능 중 적어도 하나를 유지하도록 하는 방식으로 잔기(아미노산 또는 핵산 잔기)의 특정 서열이 변경된 서열이다. 변이체 서열은 자연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 부가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체"는, 생성된 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 내인성 기능 중 적어도 하나를 유지한다면, 서열로부터의 또는 서열에의 하나(또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 및/또는 부가를 포함한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉 그것이 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 갖는 화학적 화합물을 포함한다.
전형적으로, 변형된 서열이 필요한 활성 또는 능력을 유지한다면 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 자연적으로 발생하지 않는 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 단백질은 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 단백질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 음으로 하전된 아미노산에는 아스파르트산과 글루탐산이 포함되며; 양으로 하전된 아미노산에는 라이신 및 아르기닌이 포함되며; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전 극성 헤드 기를 갖는 아미노산에는 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신이 포함된다.
예를 들어 아래 표에 따라 보존적 치환이 이루어질 수 있다. 두 번째 열의 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 열의 동일한 줄에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
용어 "상동체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 엔티티를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95%, 97 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 간주된다. 전형적으로, 상동체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)의 측면에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 간주된다. 상동성은 또한 유사성 측면에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 육안으로 또는 보다 일반적으로는 쉽게 입수가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이러한 구매가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 간의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.
상동성 백분율은 연접한 서열들에 대해 계산될 수 있는데, 즉 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 한 서열의 각 아미노산이 한 번에 하나의 잔기씩 다른 서열의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이를 "무갭(ungapped)" 정렬이라고 한다. 전형적으로 이러한 무갭 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이것은 매우 간단하고 일관성 있는 방법이지만, 예를 들어 동일한 쌍의 서열에서 뉴클레오티드 서열에서 하나의 삽입 또는 결실로 인해 다음 코돈이 정렬되지 않을 수 있다는 점을 고려하지 않으며, 이에 따라 전체 정렬이 수행될 때 상동성 퍼센트가 잠재적으로 크게 감소한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어에 과도하게 불이익을 주지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 설계되어 있다. 이는 국소 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나 이러한 보다 복잡한 방법은, 동일한 수의 동일 아미노산에 대해 가능한 한 적은 갭(비교되는 두 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영)으로 서열을 정렬하는 것이 많은 갭에 의한 것보다 더 높은 스코어를 받도록, 정렬에서 나타나는 각 갭에 대해 "갭 페널티"를 지정한다. "아핀(Affine) 갭 비용"이 전형적으로 사용되는데, 이는 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 비용을 청구하고 갭의 각 후속 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과한다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성한다. 대부분의 정렬 프로그램에서는 갭 페널티를 수정할 수 있다. 그러나 서열 비교를 위해 이러한 소프트웨어를 사용할 때는 기본값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용할 때 아미노산 서열에 대한 기본 갭 페널티는 갭에 대해 -12이고 각 확장에 대해 -4이다.
따라서 최대 상동성 백분율의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적의 정렬을 생성하는 것을 필요로 한다. 그러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(University of Wisconsin, U.S.A.; 문헌[Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387])이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(상기 문헌[Ausubel et al. (1999) - Ch. 18] 참조), FASTA(문헌[Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 403-410) 및 GENEWORKS 비교 도구 제품군을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. BLAST와 FASTA 둘 모두 오프라인 및 온라인 검색에 사용할 수 있다(상기 문헌[Ausubel et al.(1999), 페이지 7-58 내지 7-60] 참조). 그러나 일부 응용의 경우 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences라고 하는 또 다른 도구를 단백질 및 뉴클레오티드 서열 비교를 위해 사용할 수 있다(문헌[FEMS Microbiol Lett (1999) 174(2):247-50]; 문헌[FEMS Microbiol Lett (1999) 177(1):187-8] 참조).
최종 상동성 백분율은 동일성 측면에서 측정될 수 있지만 정렬 프로세스 자체는 전형적으로 전부/전무 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 하여 각 쌍별 비교에 스코어를 할당하는 스케일링된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예로는 BLAST 프로그램 제품군의 기본 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스가 있다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 기본값 또는 제공된 경우 사용자 지정 기호 비교표를 사용한다(추가의 상세 사항에 대해서는 사용자 매뉴얼을 참조). 일부 응용의 경우 GCG 패키지의 공개 기본값을 사용하거나 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 기본 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 소프트웨어가 최적의 정렬을 생성하면 상동성 백분율, 바람직하게는 서열 동일성 백분율을 계산할 수 있다. 상기 소프트웨어는 일반적으로 서열 비교의 일부로 이를 수행하고 수치적 결과를 생성한다.
"단편"은 또한 변이체이며 이 용어는 전형적으로, 기능적으로 또는 예를 들어 분석에서 관심 대상인 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 지칭한다. 따라서 "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.
이러한 변이체는 부위 지정 돌연변이유발과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어져야 하는 경우, 삽입 부위의 양쪽에 있는 자연 발생 서열에 상응하는 5' 및 3' 측면 영역과 함께 삽입물을 코딩하는 합성 DNA가 만들어질 수 있다. 측면 영역들은 자연 발생 서열의 부위에 상응하는 편리한 제한효소 부위를 포함하여 서열이 적절한 효소(들)로 절단될 수 있고 합성 DNA가 상기 브레이크(break) 내에 라이게이션될 수 있게 한다. 그 후 상기 DNA는 본 발명에 따라 발현되어 코딩된 단백질을 만든다. 이들 방법은 DNA 서열의 조작을 위한 당업계에 공지된 수많은 표준 기술의 예시일 뿐이며 다른 공지된 기술도 사용될 수 있다.
본 발명의 세포 및/또는 모듈형 구축물에 사용하기에 적합한 조절 단백질의 모든 변이체, 단편 또는 상동체는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 NOI의 동계 결합 부위에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
결합 부위의 모든 변이체, 단편 또는 상동체는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 동계 RNA-결합 단백질에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
코돈 최적화
본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드(NOI 및/또는 벡터 생산 시스템의 구성요소 포함)는 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 이전에 WO 1999/41397 및 WO 2001/79518에 기재되어 있다. 상이한 세포들은 특정 코돈의 사용이 상이하다. 이 코돈 편향은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 풍부도 편향에 상응한다. 서열의 코돈을 변경하여 상응하는 tRNA의 상대적 풍부도와 일치하도록 상기 코돈을 맞춤으로써 발현을 증가시킬 수 있다. 같은 이유로, 특정 세포 유형에서 상응하는 tRNA가 드문 것으로 알려진 코돈을 의도적으로 선택함으로써 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서 추가적인 정도의 번역 제어를 사용할 수 있다.
레트로바이러스를 포함한 많은 바이러스는 많은 수의 희귀 코돈을 사용하며, 일반적으로 사용되는 포유동물 코돈에 상응하도록 이들을 변경하여 포유동물 생산 세포에서 관심 유전자, 예를 들어 NOI 또는 패키징 구성요소의 발현 증가를 달성할 수 있다. 코돈 사용빈도 표는 포유동물 세포와, 다양한 다른 유기체에 대해 당업계에 공지되어 있다.
바이러스 벡터 구성요소의 코돈 최적화는 많은 다른 장점을 갖는다. 이들 서열의 변경으로 인해, 생산자 세포/패키징 세포에서 바이러스 입자의 조립에 필요한 바이러스 입자의 패키징 구성요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이들로부터 제거되는 RNA 불안정성 서열(INS)을 갖는다. 이와 동시에, 패키징 구성요소에 대한 아미노산 서열 코딩 서열은 서열들에 의해 코딩된 바이러스 구성요소들이 동일하거나 적어도 충분히 유사한 채로 남아 있어서 패키징 구성요소의 기능이 손상되지 않도록 유지된다. 렌티바이러스 벡터에서 코돈 최적화는 또한 엑스포트를 위한 Rev/RRE 요구 사항을 극복하여 최적화된 서열들이 Rev-독립적으로 되게 한다. 코돈 최적화는 또한 벡터 시스템 내에서 상이한 구축물들 간의(예를 들어 gag-pol 및 env 오픈 리딩 프레임의 중첩 영역들 간의) 상동 재조합을 감소시킨다. 따라서 코돈 최적화의 전반적인 효과는 바이러스 역가의 눈에 띄는 증가 및 향상된 안전성이다.
일 실시 형태에서 INS와 관련된 코돈만이 코돈 최적화된다. 그러나, 더욱 더 바람직하고 실용적인 실시 형태에서, 서열은 일부 예외, 예를 들어 gag-pol의 프레임시프트 부위를 포함하는 서열(하기 참조)을 제외하고는 전체가 코돈 최적화된다.
렌티바이러스 벡터의 gag-pol 유전자는 gag-pol 단백질을 코딩하는 2개의 중첩 리딩 프레임을 포함한다. 두 단백질의 발현은 번역 중 프레임시프트에 따라 달라진다. 이 프레임시프트는 번역 중 리보솜 "슬리피지(slippage)"의 결과로 발생한다. 이러한 슬리피지는 적어도 부분적으로는 리보솜-정지 RNA 이차 구조에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 그러한 이차 구조는 gag-pol 유전자에서 프레임시프트 부위의 하류에 존재한다. HIV의 경우 중첩 영역은 gag 시작 부분의 뉴클레오티드 1222 하류(여기서, 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A임)로부터 gag 끝(nt 1503)까지 확장된다. 결과적으로, 프레임시프트 부위와 두 리딩 프레임의 중첩 영역에 걸쳐 있는 281 bp 단편은 바람직하게는 코돈 최적화되지 않는다. 이 단편을 유지하면 Gag-Pol 단백질을 보다 효율적으로 발현시킬 수 있다. EIAV의 경우 상기 중첩의 시작은 nt 1262(여기서, 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A임)이고 상기 중첩의 끝은 nt 1461인 것으로 받아들여졌다. 프레임시프트 부위 및 gag-pol 중첩이 보존되도록 하기 위해, 야생형 서열은 nt 1156으로부터 1465까지 유지되었다.
예를 들어, 편리한 제한효소 부위를 수용하기 위해 최적의 코돈 사용빈도로부터의 도출이 이루어질 수 있고, 보존적 아미노산 변화가 Gag-Pol 단백질에 도입될 수 있다.
일 실시 형태에서, 코돈 최적화는 약하게 발현된 포유동물 유전자를 기반으로 한다. 세 번째, 때때로 두 번째 및 세 번째 염기가 변화될 수 있다.
유전자 코드의 축퇴 특성으로 인해 숙련된 작업자에 의해 수많은 gag-pol 서열이 달성될 수 있음을 알 것이다. 또한 코돈 최적화된 gag-pol 서열을 생성하기 위한 출발점으로 사용될 수 있는 많은 레트로바이러스 변이체가 설명되어 있다. 렌티바이러스 게놈은 상당히 가변적일 수 있다. 예를 들어, 여전히 기능성인 HIV-1의 준종(quasi-species)이 많이 있다. EIAV도 마찬가지이다. 이러한 변이체는 형질도입 과정의 특정 부분을 향상시키는 데 사용될 수 있다. HIV-1 변이체의 예는 http://hiv-web.lanl.gov에서 Los Alamos National Security, LLC가 운영하는 HIV 데이터베이스에서 찾을 수 있다. EIAV 클론의 세부 사항은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 있는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
코돈-최적화된 gag-pol 서열에 대한 전략은 임의의 레트로바이러스와 관련하여 사용될 수 있다. 이는 EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-1 및 HIV-2를 포함한 모든 렌티바이러스에 적용된다. 또한, 이 방법은 HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV 및 인간 내인성 레트로바이러스(HERV), MLV 및 기타 레트로바이러스로부터의 유전자의 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
코돈 최적화는 gag-pol 발현을 Rev-독립적으로 만들 수 있다. 그러나 렌티바이러스 벡터에서 항-rev 또는 RRE 인자의 사용을 가능하게 하기 위해서는 바이러스 벡터 생성 시스템을 전적으로 Rev/RRE-독립적으로 만드는 것이 필요할 것이다. 따라서 게놈도 변형되어야 한다. 이는 벡터 게놈 구성요소를 최적화하여 달성된다. 유리하게는, 이러한 변형은 또한 생산자 및 형질도입된 세포 둘 모두에서 모든 추가 단백질이 부재하는 보다 안전한 시스템의 생산을 초래한다.
본 발명은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 재료에 의해 제한되지 않으며, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 형태의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 모든 핵산 서열은 5'→3' 방향으로 좌측에서 우측으로 기재되며; 아미노산 서열은 각각 아미노→카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 기재된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의, 문맥에서 달리 명백하게 기술되지 않는 한 하한치의 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재 값도 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 임의의 명시된 값 또는 명시된 범위 내의 개재 값과 그 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 그 범위에 포함되거나 제외될 수 있고, 더 작은 범위 내에 어느 하나의 한계치가 포함되거나 어느 한계치도 포함되지 않거나 둘 다의 한계치가 포함되는 각각의 범위도 본 발명 내에 포함된다(명시된 범위 내에서의 임의의 구체적으로 제외된 한계치를 조건으로). 명시된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 모두의 한계치를 포함하는 경우, 포함된 한계치 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "~으로 구성되다"는 "포함하고 있는", "포함하고 있다" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어이며, 포괄적이거나 제한이 없고, 추가적인, 인용되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다. 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "~으로 구성된"은 또한 용어 "~으로 이루어진"을 포함한다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시를 위해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 그러한 간행물이 여기에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명은 이제 실시예에 의해 추가로 기술될 것이며, 실시예는 본 발명을 수행하는 데 있어서 당업자를 돕는 역할을 하기 위한 것으로서 본 발명의 범주를 어떠한 식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
재료 및 방법
PEIPro/DNA 복합체의 제조
표준 PEIpro 제조 방법은 다음과 같다:
1. "PEI 믹스"를 제조한다. PEIPro를 약 1:20의 비로 배양 배지에 첨가한다. 첨가가 완료된 후 휘젓는 방식으로 간단히 혼합한다.
2. "DNA 믹스"를 제조한다. DNA 플라스미드를 약 1:20의 비로 배지에 첨가한다.
3. PEI와 DNA의 믹스를 조합한다. 그 후 PEI 혼합물을 붓거나 펌핑함으로써 1:1의 비로 DNA 혼합물에 첨가한다. 그 후 형질감염 혼합물을 실온에서 인큐베이션하여 복합체를 형성한다.
수성 PEIpro 방법은 다음과 같다:
1. "PEI 믹스"를 제조한다. PEIPro를 약 1:20 비로 물에 첨가한다. 첨가가 완료된 후 휘젓는 방식으로 간단히 혼합한다. 첨가 시간도 시간 의존성이 아니고 첨가 후 인큐베이션 시간도 시간 의존성이 아니다.
2. "DNA 믹스"를 제조한다. DNA 플라스미드를 약 1:20의 비로 물에 첨가한다. 첨가 시간도 시간 의존성이 아니고 첨가 후 인큐베이션 시간도 시간 의존성이 아니다.
3. PEI와 DNA의 믹스를 조합한다. 그 후 PEI 혼합물을 붓거나 펌핑함으로써 1:1의 비로 DNA 혼합물에 첨가한다. 완료 후 혼합물을 짧게 휘젓는다. 첨가 시간도 시간 의존성이 아니고 첨가 후 인큐베이션 시간도 시간 의존성이 아니다.
4. PBS를 스파이킹한다. PBS의 최종 농도가 0.2X가 되도록 10X PBS를 최종 형질감염 부피까지 약 1:50의 10X PBS 비로 10X PBS를 첨가한다. 첨가 직후에 혼합물을 짧게 휘젓고, 타이머를 시작한다. 혼합물을 실온에서 인큐베이션하여 복합체를 형성한다.
상기 단계들에 이어서 형질감염이 뒤따를 수 있다. 생물반응기 실험을 위해, 30분의 인큐베이션 후에 핸드 펌프를 통해 형질감염 믹스를 생물반응기에 첨가하였다. 인큐베이션 기간은 시간 코스 실험이 실행되는 진탕 플라스크 연구에 대해 다양하였다.
진탕 플라스크 실험 조건
배양 배지에서 제조된 DNA/PEIPro 복합체를 사용하여 GFP 벡터 생산에 대한 형질감염 복합체 인큐베이션 시간의 영향을 조사하기 위해, 단일 형질감염 믹스를 상기 기재된 바와 같이 제조하고, 복합체화 후 실온에서 최대 60분 동안 방치하였다. 정의된 간격으로, 약 2 mL의 분취물을 벌크 형질감염 믹스에서 제거하고, HEK293T 세포가 접종된 개별 E125 삼각 플라스크를 형질감염시키는 데 사용하였다. 진탕 플라스크의 최종 부피는 40 mL이므로 형질감염 부피는 1:20 비를 나타냈다.
실시예 1 - 형질감염 믹스를 배지에서 제조하는 경우 가장 높은 역가를 생성하는 최적의 인큐베이션 시간이 너무 짧아서 GMP 제조에 적용할 수 없음
이 데이터는 DNA/PEIPro® 복합체의 인큐베이션 기간이 후속 형질감염 및 렌티바이러스 벡터 생산에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여준다(도 1). 데이터는 가장 높은 역가를 생성하는 최적의 인큐베이션 시간이 약 3분이며 이것은 인큐베이션 시간이 15분 또는 30분까지 연장되는 경우 급격히 감소함을 보여준다. 이것은 대규모 GMP 제조 목적을 위한 PEIPro® 공정 개발 측면에서 중요한 쟁점을 나타낸다. 최대 6시간의 복합체 안정성이 최소한의 시간 제한이 있는 강력한 공정을 허용하는 표준 리포펙타민 2000CD 기반 공정과 비교할 때, 복합체를 5분 이내에 제조하여 생물반응기에 첨가해야 한다는 요구 사항은 이 공정 자체에 상당한 시간 제한을 두는데, 이는 대규모 GMP 생산에는 실용적이지 않다.
실시예 2 - 물에서 형질감염 믹스를 제조하고 DNA/PEIPro® 복합체 형성을 시작하는 데 사용되는 PBS 농도를 변화시킴으로써 복합체 형성의 동역학을 변경할 수 있음
형질감염 복합체는 GFP 벡터를 사용하여 "PEIPro/DNA 복합체의 제조" 소제목 하에 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 벌크 형질감염 믹스를 물에서 제조하고 세 가지 방식으로 나누었다. PBS의 최종 농도가 1X가 되도록 형질감염 복합체의 일부를 소정 부피의 10X PBS로 스파이킹하였다. 최종 농도가 0.2X가 되도록 형질감염 믹스의 일부를 10X PBS로 스파이킹하였다. 나머지 형질감염 믹스는 손대지 않은 채로 두었고 PBS로 스파이킹하지 않았다. 그 후 PBS로 스파이킹된 상기 두 가지 준비물을 실온에서 최대 2시간 동안 인큐베이션하였다. 정의된 간격으로 약 2 mL의 분취물을 벌크 형질감염 믹스에서 제거하고 HEK293T 세포가 접종된 개별 E125 삼각 플라스크를 형질감염시키는 데 사용하였다. 진탕 플라스크의 최종 부피는 40 mL이므로 형질감염 부피는 1:20의 비를 나타냈다.
1X 스파이크 형질감염 믹스의 경우, 9개의 진탕 플라스크를 다음 시간 간격으로 형질감염시켰다: 1분; 2분; 3분; 4분; 5분; 6분; 7분; 15분; 30분 및 60분 및 120분. 추가의 12개의 진탕 플라스크를 1분; 2분; 3분; 4분; 6분; 10분; 15분; 20분; 25분; 30분 및 40분에 0.2X PBS 형질감염 믹스로 형질감염시켰다.
GFP 벡터 생산 공정의 마지막에 각 진탕 플라스크에서 샘플을 채취하고 유세포 분석 기반 형질도입 분석을 사용하여 기능적 역가를 결정하였다. 결과는 복합체 성장의 동역학이 PBS 농도의 변화에 의해 변경될 수 있음을 보여준다(도 2). 도 2a는 형질감염 복합체를 1X PBS로 스파이킹했을 때 3분의 인큐베이션 후 최적 역가가 달성되었음을 보여준다. 도 2b는 형질감염 복합체를 더 낮은 농도의 PBS로 스파이킹한 경우 인큐베이션 시간이 연장될 수 있음을 보여준다. 0.2X PBS로 스파이킹하면 최적의 인큐베이션 시간이 약 25분까지 연장된다. 음성 대조군으로서 복합체를 물에서 제조하고, 그 후 PBS를 이용한 스파이킹 없이 세포를 형질감염시키는 데 사용하였다. 벡터는 생산되지 않았으며, 이는 복합체 성장을 시작하기 위해 PBS가 필요함을 입증하였다.
실시예 3 - 형질감염 효율은 최대 12시간 동안 안정적이며 염 농도를 감소시키기 위해(및 복합체 성장을 중지시키기 위해) 형질감염 믹스를 희석한 후 잠재적으로 최대 일주일까지 안정적임
형질감염 믹스를 상기 기재된 바와 같이 제조하고, 0.2X PBS로 스파이킹하여 복합체 성장을 시작한 다음 30분 동안 인큐베이션하여 복합체의 최적 크기가 도달될 수 있도록 하였다. 그 후 PBS의 최종 농도가 0.1X가 되도록 형질감염 믹스를 무염 수성 용액(즉, H2O)을 사용하여 희석하였다. 그 후 형질감염 믹스를 4℃에서 최대 1주일 동안 보관하였다. 희석된 PEIPro®/DNA 복합체의 안정성을 테스트하기 위해, 희석 후 다양한 인큐베이션 시간 후 복합체를 사용하여 달성된 기능적 렌티바이러스 벡터 역가를 평가하였다. 그 후 형질감염 믹스의 분취물을 사용하여 GFP 렌티바이러스를 생성하고 생성된 기능적 역가를 측정하였다. 결과는 희석된 복합체의 형질감염 효율이 시간이 지나도 유지되고(도 3) 4℃에서 적어도 1주일 동안 안정적임을 보여준다. 특히, 그래프는 12시간의 인큐베이션 후, 형질감염 믹스가 "신선한" 형질감염 믹스와 비교하여 비견되는 기능적 역가를 생성하는 렌티바이러스 벡터를 생성하는 데 여전히 효율적임을 보여준다.
실시예 4 - DNA:PEIpro 복합체가 H 2 O에서 제조되는 경우 시간 경과에 따른 크기를 보여주는 동적 광산란 분석(Zetasizer Nanometer ZS Malvern Instrument, 영국 몰번 소재).
DNA/PEIpro 복합체를 상기 기재된 바와 같이 H2O에서 제조하고, 그 후 형질감염 믹스의 샘플을 60분의 기간에 걸쳐 2분 간격으로 제거하고 복합체 크기를 측정하기 위해 Zetasizer를 사용하여 분석하였다. 도 4는 복합체의 크기가 60분의 기간에 걸쳐 증가하지 않았음을 보여준다. 이것은 도 2b에 제시된 데이터와 상관 관계가 있으며, 이는 물만으로 만들어진 복합체가 벡터 생산으로 이어지지 않는다는 것을 보여주었다. DLS 측정과 함께 이 데이터는 80~86 nm의 크기 범위 내의 복합체가 성공적인 형질감염을 초래하기에는 너무 작음을 시사한다.
실시예 5 - 형질감염 믹스를 2배로 희석하면 최적의 입자 크기로의 성장이 중지됨.
DNA/PEIpro 복합체를 상기 기재된 바와 같이 H2O에서 구성하였고 입자 성장은 0.2X의 최종 농도까지 PBS를 첨가하여 시작하였다. 복합체를 실온에서 25분 동안 인큐베이션하였으며, 그 이유는 이것이 가장 높은 기능적 역가를 달성하기 위한 최적의 시간에 상응하기 때문이다(도 2b 참조). 그 후 복합체를 PBS 농도가 0.1X가 되도록 2배 희석하였다. 그 후 복합체 크기를 최대 45분 동안 시간 경과에 따라 측정하였다. DLS 측정은 형질감염 믹스의 2배 희석이 복합체의 성장을 중지시키는 것으로 밝혀졌고 크기가 600~800 nm 사이에 남아 있음을 보여준다(도 5). 이 데이터와, 상기 기재된 실시예 2 및 실시예 3에서 생성된 기능적 데이터의 상관 관계는 가장 높은 역가를 달성하는 최적의 복합체 크기가 600~800 nm 사이임을 시사한다.
실시예 6 - DLS 분석은 상이한 농도들의 PBS가 복합체 성장의 동역학에 영향을 미친다는 것을 보여줌.
DNA/PEIpro 복합체를 상기 기재된 바와 같이 물에서 구성하였고 입자 성장은 3가지 다른 농도의 PBS(0.1X; 0.15X 및 0.2X)의 첨가에 의해 시작하였고 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후 샘플을 2분마다 제거하고 Zetasizer(Zetasizer Nanometer ZS Malvern Instrument, 영국 몰번 소재)를 사용하여 분석하였다. 결과는 형질감염 믹스가 상이한 농도들의 PBS로 스파이킹될 때 형질감염을 위한 최적의 크기까지 복합체가 성장하는 속도가 첨가된 PBS의 농도에 따라 달라진다는 것을 보여준다. PBS의 농도가 <0.15X PBS보다 너무 낮으면 이것은 복합체 성장을 시작하기에 충분히 농축된 것이 아니다(도 6). 표 1은 최적의 크기에 도달하는 데 걸리는 시간에 대한 복합체 성장에 대한 상이한 PBS 농도들의 영향을 보여준다.
실시예 7 - 임의의 염을 사용하여 복합체 성장을 시작할 수 있음
DNA/PEIpro 복합체를 H2O에서 제조하고, 그 후 상이한 농도들의 NaCl 또는 MgCl2로 스파이킹하였다. 도 7a 및 표 2는 4가지 다른 농도의 NaCl(10 mM; 20 mM; 50 mM; 80 mM 및 100 mM)을 이용한 형질감염 믹스의 스파이킹의 영향을 보여준다. 80 mM 및 100 mM의 농도만이 복합체 성장을 시작하였다. 도 7b 및 표 3은 4가지 다른 농도의 MgCl2(10 mM; 20 mM; 50 mM; 80 mM; 100 mM)를 이용한 형질감염 믹스의 스파이킹의 영향을 보여준다. MgCl2는 더 높은 이온 강도를 갖기 때문에 더 낮은 농도에서 복합체 성장이 시작되고 최적의 복합체 크기에 도달하는 데 걸리는 시간이 NaCl보다 더 빨랐다.
실시예 8 - aqPEIPro 형질감염 방법을 사용하여 5 L 규모에서 얻은 기능적 역가 값은 양이온성 지질 기반 형질감염 방법을 사용하여 치료용 벡터 생성물을 생산할 때 얻은 값과 비교하여 유리함.
6개의 5 L 생물반응기를 이 연구에 사용하였고, 생물반응기 중 4개는 양이온성 지질 기반 형질감염 방법을 사용하여 일시적으로 형질감염시킨 반면, 나머지 2개 생물반응기는 설명된 aqPEIPro® 방법을 사용하여 형질감염시켰다. 두 생물반응기 모두는 5T4-CAR을 코딩하는 HIV-1 벡터 게놈으로 일시적으로 형질감염되었다. 이 치료용 벡터는 T-세포가 항원 5T4를 발현하는 종양 세포를 표적화하고 사멸시킬 수 있게 하는 유전자 변형을 위한 것이다(문헌[Owens, L.G ; Sheard, V.E et al J Immunother. 2018 Apr;41(3):130-140]).
생산 공정의 마지막에 샘플을 채취하고 형질도입 분석 및 유세포 분석을 통해 기능적 역가를 결정하였다.
이 연구에서 5 L 규모에서 얻은 기능적 역가 값은 양이온성 지질 기반 형질감염 방법을 사용하여 상기 생성물이 생산되었을 때 얻은 것과 비교하여 유리하며 데이터가 더 일관된 것으로 보였다(n = 2). 수성 PEIPro 방법을 사용하여 얻은 평균 미정제 수확 값은 양이온성 지질 기반 형질감염 방법을 사용할 경우 3.5375 x 105 TU/mL(표준 편차 = +/- 1.8 x 105TU/mL)과 비교하여 4.82.25 x 105 TU/mL(표준 편차 = +/- 6.8 x 104TU/mL)의 역가를 생성하였다(n = 4). 이는 aqPEIPro 형질감염 방법이 양이온성 지질 기반 형질감염 방법과 동일하게 잘 작동하고 5 L까지 확장가능함을 시사한다(도 8).
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화는 본 발명의 범주 및 사상을 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시 형태와 관련하여 설명되었지만, 청구된 발명은 이러한 특정 실시 형태에 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 설명된 방식의 다양한 변경은 하기 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (66)

  1. 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
    b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
    c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
    d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
    상기 염은 발프로산 염, 이소부티르산 염 또는 이소발레르산 염 이외의 것인, 방법.
  2. 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
    b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
    c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
    d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
    상기 염은 중합체/핵산 복합체 용액을 세포와 접촉시키기 전에만 첨가되는, 방법.
  3. 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
    b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
    c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
    d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
    단계 b)의 최종 염 농도는 약 10 mM 내지 약 100 mM인, 방법.
  4. 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
    b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
    c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
    d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하고,
    상기 염은 실질적 무염 수성 용액에서 0.95 이상의 해리도를 갖는, 방법.
  5. 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서,
    a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
    b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
    c) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
    d) 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 중합체/핵산 복합체 용액의 시험관 내 제조 방법으로서,
    a) 실질적 무염 수성 용액에서 핵산과 양이온성 중합체를 혼합하는 단계;
    b) 단계 a)에서 생성된 혼합물에 염을 첨가하여 염 용액을 형성하는 단계;
    c) 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계; 및/또는
    d) 선택적으로, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 희석하거나 단계 c)의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드 분자, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 핵산은 DNA, 바람직하게는 플라스미드 DNA인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 중합체는 중합체-기반 형질감염 시약인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI), 덴드리머, DEAE-덱스트란, 폴리프로필렌이민(PPI), 키토산[폴리(β-1/4)-2 -아미노-2-데옥시-D-글루코피라노스], 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 및 이들의 유도체로부터 선택되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 중합체는 PEI 또는 이의 유도체이고, 바람직하게는 선형 PEI, 분지형 PEI, 페길화(PEGylated) PEI, JetPEI, PEIPro®, PEI MAX 및 PTG1+로부터 선택되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 나트륨 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 인산 염 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 인산염 완충 식염수(PBS)인, 방법.
  14. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 PBS이고, PBS는 단계 b)에서 약 0.1X PBS 내지 약 1.0X PBS의 최종 농도까지 첨가되며, 바람직하게는 PBS는 약 0.1X PBS 내지 약 0.3X PBS의 최종 농도까지 첨가되는, 방법.
  15. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 단계 b)에서 약 10 mM 내지 약 100 mM의 최종 농도까지 첨가되고, 바람직하게는 염은 단계 b)에서 약 20 mM 내지 약 100 mM의 최종 농도까지 첨가되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)는 실질적 무염 수성 용액에서 복수의 핵산 분자와 복수의 양이온성 중합체 분자를 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 생성된 염 용액을 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제6항 또는 제17항에 있어서, 염 용액은 약 1분 내지 최대 약 2시간 동안 인큐베이션되고, 바람직하게는 염 용액은 약 20분 내지 약 90분 동안 인큐베이션되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 염 용액은 약 60분 동안 인큐베이션되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 생성된 염 용액 또는 상기 c) 단계의 인큐베이션 후 염 용액을 희석하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제5항 또는 제20항에 있어서, 염은 PBS이고 염 용액은 약 0.05X PBS 내지 약 0.15X PBS의 최종 농도까지 희석되며, 바람직하게는 염 용액은 약 0.1X PBS의 최종 농도까지 희석되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 레트로바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 벡터 구성요소는 다음으로부터 선택되는, 방법:
    a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
    b) env 또는 이의 기능성 대체물;
    c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
    d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    e) 선택적으로, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계;
    f) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
    g) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
    h) 선택적으로, 게놈 내에 통합된 핵산(들)을 갖는 포유동물 세포를 선발하는 단계;
    i) 선택적으로, 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계;
    j) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    k) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계는 약 10시간 내지 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 현탁-적응 포유동물 세포인, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염, 도입 및/또는 배양 단계(들)는 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행되는, 방법.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염은 일시적 형질감염인, 방법.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염, 도입 및/또는 배양 단계(들)는 50 L 이상의 부피에서 수행되고, 바람직하게는 형질감염, 도입 및 배양 단계는 50 L 이상의 부피에서 수행되는, 방법.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산을 형질감염 또는 전기천공법에 의해 포유동물 세포에 도입하는, 방법.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 핵산은 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산에 의해 코딩되는 것이 아닌, 다음으로부터 선택되는 임의의 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는, 방법:
    a) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
    b) env 또는 이의 기능성 대체물;
    c) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
    d) rev 또는 이의 기능성 대체물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 중합체/핵산 복합체 용액.
  40. 제39항에 있어서, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 중합체/핵산 복합체 용액.
  41. 중합체/핵산 복합체 및 염을 포함하는 용액으로서, 염 농도는 약 10 mM 내지 약 100 mM인, 중합체/핵산 복합체 용액.
  42. 제41항에 있어서, 염 농도는 약 90 mM 미만이거나 또는 염은 PBS이고 PBS의 농도는 약 0.3X PBS 미만인, 중합체/핵산 복합체 용액.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 핵산은 레트로바이러스 벡터를 생성하기 위한 구성요소를 코딩하고, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이며, 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 구성요소는 다음으로부터 선택되는, 중합체/핵산 복합체 용액.
    (i) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
    (ii) env 또는 이의 기능성 대체물;
    (iii) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
    (iv) rev 또는 이의 기능성 대체물.
  44. 제43항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna인, 중합체/핵산 복합체 용액.
  45. 핵산으로 세포를 형질감염시키기 위한 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 중합체/핵산 복합체 용액의 용도.
  46. 레트로바이러스 벡터의 제조 방법에 있어서의 제40항, 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 따른 중합체/핵산 복합체 용액의 용도.
  47. 레트로바이러스 벡터의 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a) 선택적으로, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계;
    b) 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액 또는 제40항, 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 따른 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계;
    c) 선택적으로, 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산과는 상이한 하나 이상의 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
    d) 선택적으로, 게놈 내에 통합된 바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 포유동물 세포를 선발하는 단계; 및
    e) 레트로바이러스 벡터가 생산되는 조건 하에 포유동물 세포를 배양하는 단계.
  48. 제47항에 있어서, 레트로바이러스 벡터를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 Visna인, 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 현탁-적응 세포인, 방법.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행되는, 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계는 약 10시간 내지 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a), 단계 b), 단계 c) 및/또는 단계 e)는 50 L 이상의 부피에서 수행되고, 바람직하게는 단계 a), 단계 b), 단계 c) 및 단계 e)는 50 L 이상의 부피에서 수행되는, 방법.
  57. 제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 단계 c)에서 형질감염 또는 전기천공법에 의해 세포에 도입되는, 방법.
  58. 제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염은 일시적 형질감염인, 방법.
  59. 제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 단계 b)에서 포유동물 세포에 도입되는 상기 하나 이상의 핵산은 중합체/핵산 복합체 용액의 핵산에 의해 코딩되는 것이 아닌, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 렌티바이러스 벡터 구성요소를 코딩하는, 방법:
    (i) 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈;
    (ii) env 또는 이의 기능성 대체물;
    (iii) gag-pol 또는 이의 기능성 대체물; 및/또는
    (iv) rev 또는 이의 기능성 대체물.
  60. 포유동물 세포의 형질감염 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    a) 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 중합체/핵산 복합체 용액 또는 제40항, 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 따른 중합체/핵산 복합체 용액을 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계.
  61. 제60항에 있어서, 관류 배양에서 포유동물 세포를 배양하는 단계는 약 10시간 내지 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293T 세포인, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 현탁-적응 세포인, 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지에서 현탁 상태로 수행되는, 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 및/또는 단계 b)는 50 L 이상의 부피에서 수행되고, 바람직하게는 단계 a) 및 단계 b)는 50 L 이상의 부피에서 수행되는, 방법.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염은 일시적 형질감염인, 방법.
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